特許 7054675 網膜色素変性症１８と網膜色素変性症１３の処置のための組成物と方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-06

(45)【発行日】2022-04-14

(54)【発明の名称】網膜色素変性症１８と網膜色素変性症１３の処置のための組成物と方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220407BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20220407BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220407BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220407BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220407BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 ZNA

C12N15/33

A61K48/00

A61K31/7105

A61P27/02

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2018529240

(86)(22)【出願日】2016-12-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-01-10

(86)【国際出願番号】 US2016066684

(87)【国際公開番号】W WO2017106364

(87)【国際公開日】2017-06-22

【審査請求日】2019-12-13

(31)【優先権主張番号】62/267,261

(32)【優先日】2015-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504278156

【氏名又は名称】コールド スプリング ハーバー ラボラトリー

(73)【特許権者】

【識別番号】518195690

【氏名又は名称】ストーク セラピューティクス，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100122644

【弁理士】

【氏名又は名称】寺地 拓己

(72)【発明者】

【氏名】アズナレズ，イザベル

(72)【発明者】

【氏名】ナッシュ，ヒュー エム．

(72)【発明者】

【氏名】クライナー，エイドリアン

【審査官】古閑 一実

(56)【参考文献】

【文献】IOVS，Vol.56，2015年10月，p.6362-6375

【文献】実験医学，2008年，Vol.26, No.10，p.1590-1595

【文献】Human Molecular Genetics，2011年，Vol.20, No.11，p.2116-2130

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５１～３５３、３５５、３５７～３６０、４０１、４０４、４０９、及び４１０から選択される配列を含み、
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は保持されたイントロンを含み、
ＡＳＯのＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分との結合が、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞内で、保持されたイントロンをＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングさせることにより、細胞内で、ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は保持されたイントロン内にある、前記ＡＳＯ。

【請求項2】

保持されたイントロンがイントロン３１であり、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロン３１の５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロン３１の３’スプライス部位に対して－１６までの領域内にある、請求項１に記載のＡＳＯ。

【請求項3】

ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項１又は２に記載のＡＳＯ。

【請求項4】

ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載のＡＳＯ。

【請求項5】

ＡＳＯが、１８～５０の核酸塩基から成る、請求項１～４のいずれかに記載のＡＳＯ。

【請求項6】

ＡＳＯが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５１～３５３、３５５、３５７～３６０、４０１、４０４、４０９、及び４１０から選択される配列から成る、請求項１～４のいずれかに記載のＡＳＯ。

【請求項7】

ＰＲＰＦ８タンパク質が：
ｉ）同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態；又は
ｉｉ）同等の野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態、
で生成される、請求項１～６のいずれかに記載のＡＳＯ。

【請求項8】

ＡＳＯが、ホスホロチオエート結合若しくはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾；又は修飾された糖部若しくは糖アナログを含み、該修飾された糖部若しくは糖アナログが、必要に応じて、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、請求項１～７のいずれかに記載のＡＳＯ。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載のＡＳＯを含むポリヌクレオチドを連結させたウイルスベクター。

【請求項10】

被験体においてＰＲＰＦ８タンパク質の量または活性が不足していることを特徴とする疾患又は疾病を処置するための医薬組成物であって、請求項１～８のいずれか１項に記載のＡＳＯ又は請求項９に記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。

【請求項11】

疾患又は疾病が網膜色素変性症１３である、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

ＰＲＰＦ８タンパク質の量の不足は、ＰＲＰＦ８タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで被験体は、機能的なＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第１の対立遺伝子、及びＰＲＰＦ８タンパク質が生成されない第２の対立遺伝子又は非機能的なＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、ＡＳＯは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

被験体は、
（ａ）
（ｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成される、
（ｉｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が同等の野性型ＰＲＰＦ８タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成される、あるいは、
（ｉｉｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が生成されない、
第１の変異対立遺伝子と、
（ｂ）
（ｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成される、
（ｉｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が同等の野性型ＰＲＰＦ８タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成される、あるいは、
（ｉｉｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が生成されない、
第２の変異対立遺伝子とを有し、
ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子（ａ）（ｉｉｉ）を有するとき、第２の変異対立遺伝子は（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）であり、被験体が第２の変異対立遺伝子（ｂ）（ｉｉｉ）を有するとき、第１の変異対立遺伝子は（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）であり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）である第１の変異対立遺伝子、又は、（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）である第２の変異対立遺伝子から転写される、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射による投与用である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１５年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２６７，２６１号の利益を主張するものであり、当該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0002】

＜配列リストへの言及＞
本出願は配列表を包含しており、これは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。２０１６年１２月９日に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、４７９９１－７０９＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、２８０，６４３バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

網膜色素変性症（ＲＰ）は、同様の臨床表現型を有し、遺伝学的に異質的な原因に関連付けられる一群の疾患と記されている。ＲＰはしばしば夜間視力の喪失として現れ、トンネル状視野を引き起こす末梢神経性の失明に進行する可能性がある。障害が進行するにつれて、被験体は、視力障害を経験するよりも前に光受容体のかなりの部分を失うことがあり、最終的には完全に失明してしまうことがある。ＲＰに関連する遺伝子ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰＦ３１、およびＰＡＰ１は、スプライセオソームの組み立てに関与する。いくつかのＲＰに関連する遺伝子の機能的特徴は広範に研究されてきたが、遺伝子型と表現型との相関の理解は十分ではない。しかしながら、ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰＦ３１、およびＰＡＰ１遺伝子の疾患を引き起こす突然変異には顕性遺伝形式があることが知られている（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，３３５－３７５）。

【発明の概要】

【0004】

本明細書において、いくつかの実施形態では、被験体の細胞により標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させることによって被験体の網膜色素変性症１８（ＲＰ１８）と網膜色素変性症１３（ＲＰ１３）を処置する方法が開示され、ここで、該細胞は、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、該ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードし、該方法は、被験体の細胞を、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させる。

【0005】

同様に、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有している細胞によってＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８である標的タンパク質の発現を増加させる方法であって、該ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードし、該方法は、細胞を、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、細胞内で、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる。

【0006】

前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、上記方法がＲＰ１８を処置する方法であるとき、標的タンパク質はＰＲＰＦ３である。前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、上記方法がＲＰ１３を処置する方法であるとき、標的タンパク質はＰＲＰＦ８である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体内にあるか、または該被験体に由来する。

【0007】

前述の方法のいくつかの実施形態では、標的タンパク質の量の不足は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は、機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子、標的タンパク質が産生されない第２の対立遺伝子、または非機能的な標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する。いくつかの実施形態において、被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、ここで、被験体は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、（ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは、（ｉｉｉ）標的タンパク質が産生されない、第１の変異対立遺伝子と、（ｂ）（ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、（ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは、（ｉｉｉ）標的タンパク質が産生されない、第２の変異対立遺伝子とを有し、ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子（ａ）（ｉｉｉ）を有するとき、第２の変異対立遺伝子は（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）であり、ここで、被験体が第２の変異対立遺伝子（ｂ）（ｉｉｉ）を有するとき、第１の変異対立遺伝子は（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）であり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、（ａ）（ｉ）あるいは（ａ）（ｉｉ）である第１の変異対立遺伝子、および／または、（ｂ）（ｉ）あるいは（ｂ）（ｉｉ）である第２の変異対立遺伝子から転写される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で産生される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して十分に機能的な形態で産生される。

【0008】

前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６までの領域内の保持されたイントロンにある。

【0009】

前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、標的タンパク質はＰＲＰＦ３である。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。

【0010】

いくつかの実施形態において、標的タンパク質はＰＲＰＦ８である。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋１５６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１５６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４－４４５に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。

【0011】

前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋１００の領域；（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－１６から－１００の領域。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域；あるいは、（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域。

【0012】

前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、機能的ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシング、または野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって産生された。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、産生された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞において産生された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞において産生された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって産生された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって産生された標的タンパク質の総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する。

【0013】

前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む。いくつかの実施形態において、それぞれの糖部は修飾された糖部である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基からなる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である。

【0014】

前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する。いくつかの実施形態において、最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを産生するためにＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する。いくつかの実施形態において、２番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを産生するためにＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態では、疾病は疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害はＲＰ１８またはＲＰ１３である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、当該方法はタンパク質発現を評価する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、被験体はヒト以外の動物である。いくつかの実施形態において、被験体は胎児、胚、あるいは子供である。いくつかの実施形態では、細胞はエクスビボである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、被験体の硝子体内注射、網膜下注射、局所投与、移植、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、５’スプライス部位に隣接するエクソンの－３ｅ～－１ｅと、保持されたイントロンの＋１～＋６にある９つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンの－１５～－１と３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅにある１６のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。

【0015】

本明細書には、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法で使用されるアンチセンスオリゴマーが開示されている。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－４４５のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。

【0016】

さらにいくつかの実施形態では、前述のアンチセンスオリゴマーのいずれかと賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で開示される。

【0017】

いくつかの実施形態では、硝子体内注射、網膜下注射、局所投与、移植、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって前述の医薬組成物のいずれかを投与することにより、必要としている被験体を処置する方法が本明細書で開示される。

【0018】

いくつかの実施形態において、本明細書では、不足しているタンパク質あるいは不足している機能的ＲＮＡに関連付けられる被験体のＲＰ１８あるいはＲＰ１３を処置するために、細胞による標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させる方法で使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物が開示されており、ここで、不足しているタンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の構成的スプライシングを増強し、ここで、標的タンパク質は：不足しているタンパク質；あるいは、被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、ここで、機能的ＲＮＡは：不足しているＲＮＡ；あるいは、被験体の不足している機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償機能的ＲＮＡであり、ここでＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体において標的タンパク質または機能的ＲＮＡの産生または活性を増加させる。

【0019】

本明細書では、いくつかの実施形態において、被験体においてＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質に関連付けられる疾病を処置する方法で使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物が開示され、該方法は、被験体の細胞によってＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる工程を含み、ここで、細胞は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードし、該方法は、細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態において、標的タンパク質ＰＲＰＦ３はＮＭ＿００４６９８の配列によってコードされるか、あるいは、ＰＲＰＦ８はＮＭ＿００６４４５の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、疾病は疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害はＲＰ１８またはＲＰ１３である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、標的タンパク質はＰＲＰＦ３である。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、標的タンパク質はＰＲＰＦ８である。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋１５６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１５６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４－４４５に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とし、これは、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋１００の領域；（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－１６から－１００の領域。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部にある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域；あるいは（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域。

【0020】

前述の組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的ＲＮＡまたは機能的タンパク質の量を増加させない。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体、または野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって産生された。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、産生された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは律速イントロンである。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは上記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは上記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で２番目に豊富な保持されたイントロンである。

【0021】

前述の組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む。いくつかの実施形態において、それぞれの糖部は修飾された糖部である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基からなる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である。

【0022】

いくつかの実施形態では、前述の組成物のいずれかのアンチセンスオリゴマーと賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で開示される。

【0023】

いくつかの実施形態では、被験体の硝子体内注射、網膜下注射、局所投与、移植、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって前述の医薬組成物のいずれかを投与することにより、必要としている被験体を処置する方法が本明細書で開示される。

【0024】

本明細書には、幾つかの実施形態において、医薬組成物が開示され、該医薬組成物は、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマー；および薬学的に許容可能な賦形剤を含む。幾つかの実施形態では、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、保持されたイントロンにおいて、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－５００までの領域内にある。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３－４のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、または２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの修飾された糖部を含む。アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、または１２～１５の核酸塩基を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６－４４７から選択される配列内にある。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％配列同一性であるヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３から選択されるヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射または静脈内注射のために製剤される。

【0025】

本明細書には、幾つかの実施形態において、医薬組成物が開示され、該医薬組成物は、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマー；および薬学的に許容可能な賦形剤を含む。幾つかの実施形態では、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、保持されたイントロンにおいて、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－５００までの領域内にある。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３－４のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、または２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの修飾された糖部を含む。アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、または１２～１５の核酸塩基を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８から選択される配列内にある。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％配列同一性であるヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５から選択されるヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、硝子体内注射、網膜下注射、局所投与、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射のために製剤される。

【0026】

本明細書には、幾つかの実施形態において、ＰＲＰＦ３タンパク質の機能形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物を産生するために、保持されたイントロンの除去を促進するように不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物の処理を誘発する方法が開示され、該方法は、（ａ）アンチセンスオリゴマーを被験体の標的細胞と接触させる工程；（ｂ）アンチセンスオリゴマーを不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物にハイブリダイズする工程であって、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物が、ＰＲＰＦ３タンパク質の機能形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程；（ｃ）ＰＲＰＦ３タンパク質の機能形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物を産生するために、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程；および（ｄ）十分に処理されたＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物からＰＲＰＦ３タンパク質の機能形態を翻訳する工程を含む。幾つかの実施形態では、保持されたイントロンは、保持されたイントロン全体である。幾つかの実施形態では、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。

【0027】

本明細書には、幾つかの実施形態において、ＰＲＰＦ３タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体を処置する方法が開示され、該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む。

【0028】

本明細書には、幾つかの実施形態において、ＰＲＰＦ８タンパク質の機能形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物を産生するために、保持されたイントロンの除去を促進するように不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物の処理を誘発する方法が開示され、該方法は、（ａ）アンチセンスオリゴマーを被験体の標的細胞と接触させる工程；（ｂ）アンチセンスオリゴマーを不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物にハイブリダイズする工程であって、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物が、ＰＲＰＦ８タンパク質の機能形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程；（ｃ）ＰＲＰＦ８タンパク質の機能形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物を産生するために、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程；および（ｄ）十分に処理されたＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物からＰＲＰＦ８タンパク質の機能形態を翻訳する工程を含む。幾つかの実施形態では、保持されたイントロンは、保持されたイントロン全体である。幾つかの実施形態では、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。

【0029】

本明細書には、幾つかの実施形態において、ＰＲＰＦ８タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体を処置する方法が開示され、該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む。

【0030】

＜引用による組み込み＞
本明細書で言及されるすべての公報、特許、および特許出願は、個々の公報、特許、特許出願が引用によって組み込まれるように具体的且つ個々に示される程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

本発明の新規な特徴は、特に添付の請求項に明記されている。本発明の原則が利用される例示の実施形態について説明する以下の詳細な記載と、添付の図面を参照することで、本発明の特徴および利点についてのよりよい理解が得られるであろう。

【0032】

【図1】図１は、典型的な保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の概略図を示す。５’スプライス部位コンセンサス配列は、－３ｅから－１ｅおよび＋１から＋６（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）まで下線を引かれた文字（文字はヌクレオチドである；大文字：エクソン部分、および小文字：イントロン部分）で示されている。３’スプライス部位コンセンサス配列は、－１５から－１および＋１ｅ（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）まで下線を引かれた文字（文字はヌクレオチドである；大文字：エクソン部分、および小文字：イントロン部分）で示されている。ＡＳＯスクリ－ニングのためのイントロン標的領域は、保持されたイントロンの５’スプライス部位（左の矢印）に対するヌクレオチド＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位（右の矢印）に対するヌクレオチド－１６までを含む。実施形態では、ＡＳＯスクリ－ニングのためのイントロン標的領域は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋６から＋１００、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に対するヌクレオチド－１６から－１００を含む。エクソン標的部位は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから－４ｅ、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから－４ｅのヌクレオチドを含む。「ｎ」または「Ｎ」はヌクレオチドを表し、「ｙ」はピリミジンを表す。図示された配列は、哺乳動物のスプライス部位に対するコンセンサス配列を表わし、個々のイントロンおよびエクソンは、すべての位置でコンセンサス配列に一致する必要はなない。

【図2A】図２Ａは、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）の典型的な概略図を示す。図２Ａは、核と細胞質の区画に分割された細胞を示す。核内では、エクソン（長方形）およびイントロン（接続線）から成る標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の転写産物が、ｍＲＮＡを産生するためにスプライシングを受け、このｍＲＮＡは、細胞質に輸送され、標的タンパク質に翻訳される。この標的遺伝子に関して、イントロン１のスプライシングは非効率的であり、保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ｍＲＮＡ前駆体は、主として核内に蓄積し、細胞質に輸送された場合は劣化し、標的タンパク質の産生にはつながらない。

【図2B】図２Ｂは、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）の典型的な概略図を示す。図２Ｂは、核と細胞質の区画に分割された図２Ａと同じ細胞の一例を示す。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）での処置は、イントロン１のスプライシングを促進し、結果としてｍＲＮＡの増加をもたらし、これは順に、高レベルの標的タンパク質に翻訳される。

【図3】図３は、イントロン１２を有するＰＲＰＦ３遺伝子中のイントロン保持を詳細に（ｄｅｔａｉｌ）示す。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を使用するＰＲＰＦ３遺伝子中のイントロン保持事象の特定は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて視覚化されて示される。上のパネルは、ＡＲＰＥ－１９（網膜上皮）細胞において発現され、細胞質（上）または核分画（下）のいずれかにおいて局在化された、ＰＲＰＦ３転写産物に対応する読み取り密度を示す。このパネルの下部には、ＰＲＰＦ３遺伝子のグラフ表示が、縮尺を合わせて示されている。読み取り密度は、ピークとして示される。最も高い読み取り密度は、エクソン（ブラックボックス）に対応し、一方で、細胞分画のいずれにおいてもイントロンの大多数（矢印の先端を有する線）に対する読み取りは観察されていない。細胞質分画と比較してより高い読み取り密度が、核分画のイントロン１２（矢印によって示される）に対して検知され、これはイントロン１２のスプライシング効率が低く、結果としてイントロン保持をもたらすことを示している。保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、核内に保持され、細胞質には輸送されない。腎臓の上皮細胞中のイントロン１２の読み取り密度は、下のパネルに詳細に示される。

【図4】図４は、２’－ＯＭｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用して、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＰＲＰＦ３ ＩＶＳ １２標的配列に対して実施されたＡＳＯウォーク（ｗａｌｋ）のグラフ表示を例示する。ＡＳＯは、（ＡＳＯ Ｐ３－ＩＶＳ１２＋２８を例外として）５つのヌクレオチドを一度にシフトすることによって、これらの領域をカバーするように設計された。ＰＲＰＦ３エクソン－イントロン構造は、縮尺を合わせて描かれている。

【図5】図５は、イントロン１３を有するＰＲＰＦ３遺伝子中のイントロン保持を示す。ＰＲＰＦ３遺伝子内のイントロン保持は、本明細書で実施例において記載されるように、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて視覚化されて、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって特定された。ＡＲＰＥ－１９細胞中のイントロン１３の読み取り密度は、下のパネルに詳細に示される。

【図6】図６は、２’－ＯＭｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用して、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＰＲＰＦ３ ＩＶＳ １３標的配列に対して実施されたＡＳＯウォークのグラフ表示を例示する。ＡＳＯは、（ＡＳＯ Ｐ３－ＩＶＳ１３＋１５、Ｐ３－ＩＶＳ１３＋３１、およびＰ３－ＩＶＳ１３－４７を例外として）５つのヌクレオチドを一度にシフトすることによって、これらの領域をカバーするように設計された。ＰＲＰＦ３エクソン－イントロン構造は、縮尺を合わせて描かれている。

【図7】図７は、イントロン３１の詳細を有するＰＲＰＦ８遺伝子中のイントロン保持を詳細に示す。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を使用するＰＲＰＦ８遺伝子中のイントロン保持事象の特定は、ＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて視覚化されて示される。上のパネルは、ＡＲＰＥ－１９（網膜上皮）細胞において発現され、細胞質（上）または核分画（下）のいずれかにおいて局在化された、ＰＲＰＦ８転写産物に対応する読み取り密度を示す。このパネルの下部には、ＰＲＰＦ８遺伝子のグラフ表示が、縮尺を合わせて示されている。読み取り密度は、ピークとして示される。最も高い読み取り密度は、エクソン（ブラックボックス）に対応し、一方で、細胞分画のいずれにおいてもイントロンの大多数（矢印の先端を有する線）に対する読み取りは観察されていない。細胞質分画と比較してより高い読み取り密度が、核分画のイントロン３１（矢印によって示される）に対して検知され、これはイントロン３１のスプライシング効率が低く、結果としてイントロン保持をもたらすことを示している。保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、核内に保持され、細胞質には輸送されない。腎臓の上皮細胞中のイントロン３１の読み取り密度は、下のパネルに詳細に示される。

【図8】図８は、２’－ＯＭｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用して、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＰＲＰＦ３ ＩＶＳ ３１標的配列に対して実施されたＡＳＯウォークのグラフ表示を例示する。ＡＳＯは、５つのヌクレオチドを一度でシフトすることによって、これらの領域をカバーするように設計された。ＰＲＰＦ８エクソン－イントロン構造は、縮尺を合わせて描かれている。

【図9】図９は、ＮＭ＿００４６９８に対応するＰＲＰＦ３に対するＲｅｆＳｅｑ遺伝子の概略図を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【図10】図１０は、偽処理した細胞と比較した、８０ｎＭの示されたＡＳＯで２４時間処置されたＡＲＰＥ－１９細胞におけるイントロン１２なしでのＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの発現レベルの平均（ｎ＝３）倍率変化を示して描かれる典型的なグラフを示す。データはＲＰＬ３２発現に正規化される。

【図11】図１１は、ＮＭ＿００４６９８に対応するＰＲＰＦ３に対するＲｅｆＳｅｑ遺伝子の概略図を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【図12】図１２は、偽処理した細胞と比較した、８０ｎＭの示されたＡＳＯで２４時間処置されたＡＲＰＥ－１９細胞におけるイントロン１３なしでのＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの発現レベルの平均（ｎ＝３）倍率変化を示す典型的なグラフを示す。データはＲＰＬ３２発現に正規化される。

【図13】図１３は、ＮＭ＿００６４４５に対応するＰＲＰＦ８に対するＲｅｆＳｅｑ遺伝子の概略図を示す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【図14】図１４は、偽処理した細胞と比較した、８０ｎＭの示されたＡＳＯで２４時間処置されたＡＲＰＥ－１９細胞におけるイントロン３１なしでのＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの発現レベルの平均（ｎ＝３）倍率変化を示して描かれる典型的なグラフを示す。データはＲＰＬ３２発現に正規化される。

【発明を実施するための形態】

【0033】

１つを超えるイントロンを有するタンパク質コード遺伝子の一次転写産物における個々のイントロンは、異なる効率性を有する一次転写産物からスプライシングされる。ほとんどの場合、完全にスプライシングされたｍＲＮＡだけが、続く細胞質での翻訳のために核膜孔を通って輸送される。スプライシングされていない及び部分的にスプライシングされた転写産物は、核内で検出可能である。完全にスプライシングされていない転写産物の核内蓄積が、タンパク質に翻訳され得る細胞質中の有害である可能性のあるｍＲＮＡの蓄積を防ぐメカニズムであると一般的に考えられる。幾つかの遺伝子に関して、最も効率性の低いイントロンのスプライシングは、細胞質中での翻訳に先立つ、遺伝子発現における転写後の律速の工程である。

【0034】

ＲＰ１８が不足しているＰＲＰＦ３タンパク質およびＲＰ１３が不足しているＰＲＰＦ８タンパク質をコードする、それぞれ、ＰＲＰＦ３およびＰＲＰＦ８の遺伝子の相当なレベルの部分的にスプライシングされた転写産物が、ヒト細胞の核内で発見された。これらのＰＲＰＦ３およびＰＲＰＦ８のｍＲＮＡ前駆体の種は、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む。本発明は、完全にスプライシングされた成熟ｍＲＮＡの安定した状態の産生を増加させる、およびそれ故、翻訳されたＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８のタンパク質レベルを増加させるために、遺伝子発現の核段階に対して律速的である、それぞれ、１つ以上の保持されたＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８のイントロンのスプライシングをアップレギュレートするための組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、核内に蓄積する保持されたイントロン含有ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ前駆体のイントロンスプライス部位で構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を活用する。したがって、実施形態では、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８のタンパク質不足によって引き起こされた疾病を処置するために本発明の方法を使用して、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８のタンパク質が増加される。他の実施形態では、本発明の方法は、必要とする被験体の症状を処置するためにＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８の産生を増大させるために使用される。実施形態では、被験体は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８が野性型と比べて必ずしも不足していない疾病を有するが、その場合、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８の増加は、それにもかかわらず疾病を軽減する。実施形態では、疾病は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８のハプロ不全によって引き起こされる。

【0035】

＜網膜色素変性症＞
網膜色素変性症（ＲＰ）は、ＰＲＰＦ３タンパク質の不足によって引き起こされたＲＰ１８およびＰＲＰＦ８タンパク質の不足によって引き起こされたＲＰ１３を含む、眼疾患の衰弱した群について説明するものである。ＲＰを有する被験体は、眼疾患の初期において夜間視力の損失を経験する。時間とともに、視力の損失が生じ始め、これは最終的にトンネル状視野につながる。この視力の損失は、杆体視細胞系における機能不全に起因し得る。眼疾患が進行するにつれ、罹患した患者は、視力の低下を経験する前に、錐体視細胞の大部分を失うかもしれない（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。

【0036】

ＲＰ疾患の全体的な有病率は、約１：３５００であると推測される。４０を超える遺伝子の突然変異が、遺伝の以下の３つのパターンを介してＲＰ疾患の発生率に相関した：常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖。ＲＰ疾患の進行に関係した遺伝子は、以下の５つの主要なカテゴリーに分類され得る：ｉ）光伝達、ｉｉ）網膜代謝、ｉｉｉ）組織の発達および維持、ｉｖ）細胞構造、およびｖ）スプライシング。スプライシングカテゴリー（ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰ３１およびＰＡＰ１）を含む遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体からイントロン配列を除去する役割のあるスプライソソームタンパク質複合体のアセンブリの要因である。試験は、ＲＰの少なくとも幾つかのケースの進行がハプロ不全が原因であることを示唆し、これは、単一の機能障害の対立遺伝子の存在が、対応するタンパク質の発現の縮小を結果としてもたらすことを意味している（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。

【0037】

＜ＰＲＰＦ３＞
１６のエクソンに及び、１ｑ２１．１に位置する、ＰＲＰＦ３遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子３（ＰＲＰＦ３）のタンパク質をコードする。ＰＲＰＦ３の基準ｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩ基準配列ＮＭ＿００４６９８で明記される。ＰＲＰＦ３は、スプライソソームのアセンブリに関係する、７７ｋＤ、６８２のアミノ酸タンパク質である。ＰＲＰＦ３の機能不全は、ＲＰ１８の進行に関係している。網膜に特異的なスプライシング要素が、ＰＲＰＦ３と相互作用し、杆体視細胞に特異的な表現型を産生し得ることが推測された。ＰＲＰＦ３のミスセンス変異Ｐ４９３ＳおよびＴ４９４Ｍが両方とも、ＲＰ１８表現型を表示することが示され、これによって、ＰＲＰＦ３の機能不全は、ＲＰ１８表現型に関連付けられる（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。ＲＰ１８およびＰＲＰＦ３遺伝子は、例えば、ＯＭＩＭ＃６１３０９５（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ， Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， １９６６－２０１５）によって記載され、これは引用により本明細書に組み込まれる。

【0038】

＜ＰＲＰＦ８＞
４２のエクソンに及び、１７ｐ１３．３に位置する、ＰＲＰＦ８遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子８（ＰＲＰＦ８）のタンパク質をコードする。ＰＲＰＦ８の基準ｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩ基準配列ＮＭ＿００６４４５で明記される。ＰＲＰＦ８は、スプライソソームのアセンブリに関係する、２２０ｋＤ、２，３３４のアミノ酸タンパク質である。ＰＲＰＦ８の機能不全は、ＲＰ１３の進行に関係している。ＰＲＰＦ８変異体Ｈ２３０９Ｐ、Ｈ２３０９Ｒ、Ｒ２３１０Ｋ、Ｐ２３０１Ｔ、Ｆ２３０４Ｌ、Ｒ２３１０ＧおよびＦ２３１４Ｌは、ＲＰ１３の臨床表現型に結果的につながることが分かり、これによって、ＰＲＰＦ８の機能不全は、ＲＰ１３に関連付けられる（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。ＲＰ１３およびＰＲＰＦ８遺伝子は、例えば、ＯＭＩＭ＃６０００５９（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ， Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， １９６６－２０１５）によって記載され、これは引用により本明細書に組み込まれる。

【0039】

＜保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）＞
実施形態では、本発明の方法は、細胞核内のＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８の遺伝子から転写された、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の存在を活用する。成熟した完全にスプライシングされたｍＲＮＡを産出するための特定されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の種のスプライシングは、保持されたイントロンのスプライシングアウトを刺激するＡＳＯを使用して誘発される。結果として生じる成熟ｍＲＮＡは、細胞質に輸送されて、翻訳され得、それによって患者の細胞中のＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質の量が増加し、それぞれ、ＲＰ１８またはＲＰ１３の症状が緩和される。以下にさらに詳述されるこの方法は、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）として知られている。

【0040】

＜ＰＲＰＦ３の核転写産物＞
本明細書で実施例において記載されるように、ＰＲＰＦ３遺伝子は、イントロン保持事象のために分析され、イントロン、例えばイントロン１２および１３の保持が観察された。ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化されたＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）は、ＡＲＰＥ－１９細胞において発現された及び細胞質または核分画のいずれかにおいて局在化されたＰＲＰＦ３転写産物を示した。いずれの分画においても、大多数のイントロンに対して読み取り観察されなかった。しかしながら、細胞質分画と比較して、核分画におけるイントロン１２および１３に対してより高い読み取り密度が検知され、これは、イントロン１２および１３のスプライシング効率が低く、結果としてイントロン保持をもたらすことを示している。保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、主として核内に蓄積し、ＰＲＰＦ３タンパク質には翻訳されない。イントロン１２および１３に対する読み取り密度は、それぞれ、２６％および３３％のイントロン保持を示した。イントロン１２に対するイントロン保持率（ＰＩＲ）の値は、４つの値（３７、３５、１６、および１５）を平均することによって得られた。イントロン１３に対するＰＩＲ値は、同様に、４つの値、３４、３３、３４、および３１を平均することによって得られた。各値は、４つの異なるアルゴリズムのうちの１つを使用して、ＡＲＰＥ－１９（網膜色素上皮）細胞において決定された。

【0041】

幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３イントロン番号は、ＮＭ＿００４６９８でのｍＲＮＡ配列に対応している。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、イントロン１２及び／又は１３内にある。実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位へのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、結果として、保持されたＰＲＰＦ３のイントロン１２または１３のスプライス部位（５’スプライス部位または３’スプライス部位）でのスプライシングの増強をもたらし、続いてＰＲＰＦ３タンパク質産生を増加させる。イントロンの番号付けが、異なるＰＲＰＦ３アイソフォーム配列を参照することで変化し得ることが理解される。当業者は、本明細書で提供されるイントロン配列に基づいて、あるいはＮＭ＿００４６９８でのｍＲＮＡ配列を参照して提供されるイントロン番号を使用することで、あらゆるＰＲＰＦ３アイソフォームにおいて対応するイントロン番号を決定することができる。当業者はまた、本明細書で提供されるイントロン配列に基づいて、あるいはＮＭ＿００４６９８でのｍＲＮＡ配列を参照して提供されるイントロン番号を使用することで、本発明の方法を使用して標的とするための、あらゆるＰＲＰＦ３アイソフォームにおける隣接しているエクソンの配列を決定することができる。実施形態では、本発明の組成物および方法は、例えば、Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１２９でのＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤのデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ８６００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ＵＳＡ ２０８９４によって運用されている、生物学的且つ科学的な情報のＮＣＢＩリポジトリ）に記載されるような、既知のＰＲＰＦ３アイソフォームの発現を増大させるために使用され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ８イントロンの番号付けはＮＭ＿００６４４５におけるｍＲＮＡ配列に相当する。実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位はイントロン３１にある。実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位へのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、結果として、保持されたＰＲＰＦ８イントロン３１の少なくとも１つのスプライス部位（５’スプライス部位あるいは３’スプライス部位）におけるスプライシングの増強と、その後のＰＲＰＦ８タンパク質産生の増大をもたらした。異なるＰＲＰＦ８アイソフォーム配列を参照することで、イントロンの番号付けは変化しうると解される。当業者であれば、本明細書で提供されるイントロン配列に基づき、またはＮＭ＿００６４４５におけるｍＲＮＡ配列を参照して得られるイントロン番号を使用することで、任意のＰＲＰＦ８アイソフォームにおける対応するイントロン番号を判定することができる。当業者はさらに、本明細書で提供されるイントロン配列に基づき、またはＮＭ＿００６４４５におけるｍＲＮＡ配列を参照して得られるイントロン番号を使用することで、本発明の方法を使用して標的化のための任意のＰＲＰＦ８アイソフォームにおける隣接するエクソンの配列を判定することができる。実施形態では、本発明の組成物および方法は、例えば、遺伝子ＩＤ１０５９４（生体情報および科学情報のＮＣＢＩリポジトリ）のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤデータベースにおいて記載されるように、任意の既知のＰＲＰＦ８アイソフォームの発現を増大させるために使用され、引用によって本明細書に組み込まれる

【0043】

＜ＰＲＰＦ３＞
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＰＲＰＦ３のゲノム配列（ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とする。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３のゲノム配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である。

【0044】

＜ＰＲＰＦ３：保持されたイントロン＞
いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、保持されたイントロン１２を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物が保持されたイントロン１２を含むとき、本明細書に開示されるＡＳＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７を標的とする。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物が保持されたイントロン１２を含むとき、ＡＳＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－２３９のいずれか１つにかかる配列を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１２を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（あるいは５’）のエクソン１２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（あるいは５’）の、約４～約９４の間のヌクレオチドのエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－２３のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン１２を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（あるいは３’）のイントロン１２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（あるいは３’）の、約６～約４９８の間のヌクレオチドのイントロン１２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４－１２１のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（あるいは５’）のイントロン１２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（あるいは５’）の、約１６～約４９６の間のヌクレオチドのイントロン１２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２－２１８のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のエクソン１３を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（あるいは３’）のエクソン１３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１２を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（あるいは３’）の、約２～約１０２の間のヌクレオチドのエクソン１３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９－２３９のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0049】

＜ＰＲＰＦ３：保持されたイントロン１３＞
いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、保持されたイントロン１３を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物が保持されたイントロン１３を含むとき、本明細書に開示されるＡＳＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６を標的とする。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物が保持されたイントロン１３を含むとき、ＡＳＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０－３２３のいずれか１つにかかる配列を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。

【0050】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１３を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（あるいは５’）のエクソン１３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（あるいは５’）の、約４～約９９の間のヌクレオチドのエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０－２５９のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0051】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン１３を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（あるいは３’）のイントロン１３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（あるいは３’）の、約６～約１４６の間のヌクレオチドのイントロン１３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０－２８６のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（あるいは５’）のイントロン１３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（あるいは５’）の、約１６～約１４６の間のヌクレオチドのイントロン１３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７－３１０のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のエクソン１４を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（あるいは３’）のエクソン１４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン１３を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（あるいは３’）の、約２～約６７の間のヌクレオチドのエクソン１４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１１－３２３のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0054】

＜ＰＲＰＦ８＞
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＰＲＰＦ８のゲノム配列（ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とする。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ８のゲノム配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４である。

【0055】

＜ＰＲＰＦ８：保持されたイントロン３１＞
いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、保持されたイントロン３１を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物が保持されたイントロン３１を含むとき、本明細書に開示されるＡＳＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８を標的とする。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物が保持されたイントロン３１を含むとき、ＡＳＯはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つにかかる配列を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。

【0056】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン３１を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（あるいは５’）のエクソン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（あるいは５’）の、約４～約１４４の間のヌクレオチドのエクソン配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－３５０のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0057】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン３１を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（あるいは３’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（あるいは３’）の、約６～約１５６の間のヌクレオチドのイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５１－３８１のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0058】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（あるいは５’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（あるいは５’）の、約１６～約１５６の間のヌクレオチドのイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２－４１０のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0059】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のエクソン３２を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（あるいは３’）のエクソン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＰＫＤ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（あるいは３’）の、約２～約１７２の間のヌクレオチドのエクソン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１１－４４５のいずれか１つにかかる配列を有する。

【0060】

＜タンパク質の発現＞
上記したように、ＲＰ疾患におけるＰＲＰＦ３とＰＲＰＦ８の突然変異は全タンパク質にわたって広まる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法が、機能的ＰＲＰＦ３タンパク質の産生を増加させるために使用される。他の実施形態では、本明細書において記載される方法が、機能的ＰＲＰＦ８タンパク質の産生を増加させるために使用される。他の実施形態では、本明細書において記載される方法が、機能的ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質の産生を増加させるために使用される。本明細書で使用されるように、用語「機能的な（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」は、ＲＰ疾患の１つ以上の疾病を除去するのに必要とされるＰＲＰＦ３もしくはＲＰＦ８のタンパク質の活性、または機能の量に言及している。いくつかの実施形態では、部分的に機能的なＰＲＰＦ３タンパク質の産生を増加させるために、前記方法が使用される。他の実施形態では、部分的に機能的なＰＲＰＦ８タンパク質の産生を増加させるために、前記方法が使用される。他の実施形態では、部分的に機能的なＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の産生を増加させるために、前記方法が使用される。本明細書で使用されるように、用語「部分的に機能的な（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」は、疾患の１つ以上の疾病を除去する又は防ぐのに必要とされる活性または機能の量未満である、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８のタンパク質の活性または機能の量に言及している。いくつかの実施形態では、部分的に機能的なタンパク質またはＲＮＡは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の、完全な機能的タンパク質またはＲＮＡに比してより小さな活性を持つだろう。

【0061】

複数の実施形態では、該方法は、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞によって、ＰＲＰＦ３タンパク質の発現を増大させる方法であり、ここで、被験体は、ＰＲＰＦ３タンパク質の活性量の不足に起因するＲＰ疾患を有し、そのＰＲＰＦ３タンパク質の量の不足は、ＰＲＰＦ３タンパク質のハプロ不全によって引き起こされる。そのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、ＰＲＰＦ３タンパク質を産生しない第２の対立遺伝子とを有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、非機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的に機能的なＰＲＰＦ３タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。これらの実施形態のいずれの場合でも、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子（機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に結合し、それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、かつ、機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡ量の増加と、被検体の細胞中のＰＲＰＦ３タンパク質発現の増加をもたらす。

【0062】

複数の実施形態では、該方法は、ＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞によって、ＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる方法であり、ここで、被験体は、ＰＲＰＦ８タンパク質の活性量の不足に起因するＲＰ疾患を有し、そのＰＲＰＦ８タンパク質の量の不足は、ＰＲＰＦ８タンパク質のハプロ不全によって引き起こされる。そのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ８ タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、ＰＲＰＦ８タンパク質を産生しない第２の対立遺伝子とを有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、非機能的ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的に機能的なＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。これらの実施形態のいずれの場合でも、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子（機能的ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に結合し、それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、かつ、機能的ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡ量の増加と、被検体の細胞中のＰＲＰＦ８タンパク質発現の増加をもたらす。

【0063】

いくつかの実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的に機能的なＰＲＰＦ３タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、第１の対立遺伝子（機能的ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位、あるいは第２の対立遺伝子（部分的に機能的なＰＲＰＦ３タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に、アンチセンスオリゴマーが結合する。それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡ量の増加と、被検体の細胞中の機能的あるいは部分的に機能的なＰＲＰＦ３タンパク質発現の増加をもたらす。

【0064】

他の実施形態では、被験体は、機能的ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的に機能的なＰＲＰＦ８タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、第１の対立遺伝子（機能的ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位、あるいは第２の対立遺伝子（部分的に機能的なＰＲＰＦ８タンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に、アンチセンスオリゴマーが結合する。それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、ＰＲＰＦ８タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡ量の増加と、被検体の細胞中の機能的あるいは部分的に機能的なＰＲＰＦ８タンパク質発現の増加をもたらす。

【0065】

関連する実施形態では、前記方法は、タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させるためにＡＳＯを用いる方法である。実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞中のＰＲＰＦ３タンパク質発現を増加させるためにＡＳＯを用い、ここでその被験体は、例えばＲＰ１８のようなＰＲＰＦ３タンパク質の量または機能が不足している。

【0066】

他の関連する実施形態では、前記方法は、タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させるためにＡＳＯを用いる方法である。実施形態では、ＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞中のＰＲＰＦ８タンパク質発現を増加させるために、ＡＳＯを用い、ここでその被験体は、例えばＲＰ１３のようなＰＲＰＦ８タンパク質の量または機能が不足している。

【0067】

実施形態では、疾患を引き起こすタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、本明細書に記載されるＡＳＯによって標的化される。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＡＳＯの標的とされる疾患の原因ではない。例えば、特定の経路における第１のタンパク質の突然変異または不足がもたらす疾患は、第２のタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とし、それによって第２のタンパク質産生が増加することで、改善しうる。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質の機能は、第１のタンパク質の突然変異または不足（それは疾患または疾病の原因である）を補うことができる。

【0068】

実施形態では、被験体は、
ａ．第１の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉ）ＰＲＰＦ３タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生される、
ｉｉ）ＰＲＰＦ３タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で産生される、または
ｉｉｉ）ＰＲＰＦ３タンパク質あるいは機能的なＲＮＡが産生されない、第１の変異対立遺伝子；および
ｂ．第２の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉ）ＰＲＰＦ３タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生される、
ｉｉ）ＰＲＰＦ３タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で産生される、または
ｉｉｉ）ＰＲＰＦ３タンパク質が産生されない、第２の変異対立遺伝子を有し、
ここでＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、第１の対立遺伝子および／または第２の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、ＡＳＯは、第１の対立遺伝子または第２の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に結合することで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの増加を引き起こし、被験体の細胞中の標的タンパク質または機能的なＲＮＡの発現の増加をもたらす。これらの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングの結果として、発現レベルの増加した標的タンパク質あるいは機能的なＲＮＡは、同等の野性型タンパク質（部分的に機能的な）と比較して機能が低い、あるいは同等の野性型タンパク質（完全に機能的な）と比較して十分な機能を有する、いずれの形態もありうる。

【0069】

実施形態では、被験体は、
ａ．第１の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生される、
ｉｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で産生される、または
ｉｉｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質あるいは機能的なＲＮＡが産生されない、第１の変異対立遺伝子；および
ｂ．第２の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉｖ）ＰＲＰＦ８タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生される、
ｖ）ＰＲＰＦ８タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で産生される、または
ｖｉ）ＰＲＰＦ８タンパク質が産生されない、第２の変異対立遺伝子を有し、
ここでＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、第１の対立遺伝子および／または第２の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、ＡＳＯは、第１の対立遺伝子または第２の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に結合することで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、ＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの増加を引き起こし、被験体の細胞中の標的タンパク質または機能的なＲＮＡの発現の増加をもたらす。これらの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングの結果として、発現レベルの増加した標的タンパク質あるいは機能的なＲＮＡは、同等の野性型タンパク質（部分的に機能的な）と比較して機能が低い、あるいは同等の野性型タンパク質（完全に機能的な）と比較して十分な機能を有する、いずれの形態もありうる。

【0070】

実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、例えば、アンチセンスオリゴマーで処置されない、あるいはＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位と結合しないアンチセンスオリゴマーによって処置された対照細胞中で産生されたＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルと比較した場合、１．１倍から１０倍に増加する。

【0071】

実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、ＡＳＯが標的とする保持されたイントロンの選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中の保持されたイントロンの選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。

【0072】

実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子から部分的に機能的なＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質を発現する。その部分的に機能的なＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質は、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、あるいは部分的な遺伝子欠失によってもたらされる。実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子から非機能的なＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質を発現する。その非機能的なＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質は、１つの対立遺伝子中のフレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、あるいは部分的な遺伝子欠失によってもたらされる。実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子にＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８の全遺伝子欠失を有する。

【0073】

いくつかの実施形態では、被験体はＰ４９３ＳおよびＴ４９４Ｍから選択されたＰＲＰＦ３ミスセンス変異を有する。他の実施形態において、被験体は、Ｈ２３０９Ｐ、Ｈ２３０９Ｒ、Ｒ２３１０Ｋ、Ｐ２３０１Ｔ、Ｆ２３０４Ｌ、Ｒ２３１０ＧおよびＦ２３１４Ｌから選択されたＰＲＰＦ８ミスセンス変異を有する。実施形態では、当技術分野において既知の、あるいは、例えば先に参照したＭｃＫｉｅ ｅｔ ａｌ ２００１の文献に記載された任意の突然変異を有する被験体が、本発明の方法および組成物を用いて処置される。

【0074】

＜タンパク質発現を増加させるためのＴＡＮＧＯの使用＞
前述したように、実施形態では、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）は、ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させるために、本発明の方法において使用される。これらの実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードする保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）は、細胞の核内にある。保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接するエクソン、および３’スプライス部位に隣接するエクソンは、ＰＲＰＦ３タンパク質またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードし、これらを含むＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する細胞は、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に対して相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させられる。ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位とハイブリダイズするＡＳＯは、保持されたイントロンのスプライス部位（５’スプライス部位あるいは３’スプライス部位）のスプライシングを強化し、その後の標的タンパク質産生を増加させる。

【0075】

「ｍＲＮＡ前駆体」と「ｍＲＮＡ前駆体の転写産物」の用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つのイントロンを含む任意のｍＲＮＡ前駆体種を指す。実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’－７－メチルグアノシンキャップ、および／またはポリＡ末端を含む。実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’－７－メチルグアノシンキャップおよびポリＡ末端の両方を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’－７－メチルグアノシンキャップ、および／またはポリＡ末端を含まない。タンパク質に翻訳されない場合（あるいは核から細胞質へと輸送される場合）、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は非増殖性のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である。

【0076】

明細書において使用されるように、「保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体」（「ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体」）は、少なくとも１つの保持されたイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、標的タンパク質をコードする。「標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体」は、完全にスプライシングされた場合に、標的タンパク質をコードすると解される。「保持されたイントロン」は、同じ遺伝子によってコードされた、隣接するイントロンのような１つ以上のイントロンが、同じｍＲＮＡ前駆体の転写産物からスプライシングアウトされた場合に、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物に存在する任意のイントロンである。いくつかの実施形態では、保持されたイントロンは、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中に最も豊富なイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞中の標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団に最も豊富なイントロンであり、そのＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団に最も豊富なイントロンを標的とするアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的にする、あるいは結合する保持されたイントロンを含む、集団中の２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。実施形態では、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡは、それにより産生される。「成熟ｍＲＮＡ」および「完全にスプライシングされたｍＲＮＡ」の用語は、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡ（例えば、核から細胞質へと輸送され、標的タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡ）、あるいは完全に処理された機能的なＲＮＡを指し、本明細書において区別なく使用される。「増殖性ｍＲＮＡ」の用語もまた、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡを指して使用することができる。実施形態では、標的領域は、ＰＲＰＦ３タンパク質および／またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に最も豊富に存在する保持されたイントロン中にある。実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団に最も保持されるイントロンは、イントロン１２である。実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団に最も保持されるイントロンは、イントロン１３である。いくつかの実施形態では、ＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団に最も保持されるイントロンは、イントロン３１である。

【0077】

実施形態では、保持されたイントロンは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、あるいは少なくとも約５０％の保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンはすなわち、約５％～約１００％、約５％～約９５％、約５％～約９０％、約５％～約８５％、約５％～約８０％、約５％～約７５％、約５％～約７０％、約５％～約６５％、約５％～約６０％、約５％～約６５％、約５％～約６０％、約５％～約５５％、約５％～約５０％、約５％～約４５％、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約１０％～約１００％、約１０％～約９５％、約１０％～約９０％、約１０％～約８５％、約１０％～約８０％、約１０％～約７５％、約１０％～約７０％、約１０％～約６５％、約１０％～約６０％、約１０％～約６５％、約１０％～約６０％、約１０％～約５５％、約１０％～約５０％、約１０％～約４５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１５％～約１００％、約１５％～約９５％、約１５％～約９０％、約１５％～約８５％、約１５％～約８０％、約１５％～約７５％、約１５％～約７０％、約１５％～約６５％、約１５％～約６０％、約１５％～約６５％、約１５％～約６０％、約１５％～約５５％、約１５％～約５０％、約１５％～約４５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約２０％～約１００％、約２０％～約９５％、約２０％～約９０％、約２０％～約８５％、約２０％～約８０％、約２０％～約７５％、約２０％～約７０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２０％～約５５％、約２０％～約５０％、約２０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２５％～約１００％、約２５％～約９５％、約２５％～約９０％、約２５％～約８５％、約２５％～約８０％、約２５％～約７５％、約２５％～約７０％、約２５％～約６５％、約２５％～約６０％、約２５％～約６５％、約２５％～約６０％、約２５％～約５５％、約２５％～約５０％、約２５％～約４５％、約２５％～約４０％、あるいは約２５％～約３５％の保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。ＥＮＣＯＤＥデータ（例えば、Ｔｉｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，「Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｓｈｏｗｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｔ ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｌｎｃＲＮＡｓ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（９）：１６１６－２５に記載される）は、保持されたイントロンの特定の補助のために使用され得る。

【0078】

本明細書で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、詳細に言及された特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合は、定義された核酸塩基配列）を含むが、他のいかなる特徴をも排除するものではないと解される。したがって、本明細書で使用されるように、用語「含んでいる」は包括的であり、詳細に言及されていない追加の特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、詳細に言及されていない追加の核酸塩基の存在）を除外しない。

【0079】

本明細書で提供される組成物及び方法の何れかの実施形態において、「含んでいる」は、「～から実質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と置き換えられ得る。「～から実質的に成る」という句は、請求項に係る発明の形質や機能に実質的に影響しない特徴と同様、特定の特徴（例えば核酸塩基配列）を要するように本明細書において使用される。本明細書で使用されるように、「成る」という用語は、詳細に言及された特徴（例えば核酸塩基配列）のみの存在を示すために使用される（よって、特定の核酸塩基配列から成るアンチセンスオリゴマーの場合には、詳細に言及されていない追加の核酸塩基の存在は除外される）。

【0080】

実施形態では、標的領域は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において２番目に豊富に存在するイントロンである、保持されたイントロン中にある。例えば、２番目に豊富な保持されたイントロンのヌクレオチド配列の独自性、特定のヌクレオチド配列を標的とするＡＳＯ設計の容易さ、及び／又はＡＳＯを持つイントロンの標的化から結果として生じるタンパク質産生の増加の量により、最も豊富な保持されたイントロンではなく、２番目に豊富な保持されたイントロンが標的とされ得る。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞中の標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団中において２番目に豊富なイントロンであり、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において２番目に豊富なアンチセンスオリゴマーに標的とされるアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とされるまたは結合する保持されたイントロンを含む集団において、２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。実施形態では、それにより標的タンパク質をコードする完全にスプライシングされた（成熟）ＲＮＡが産生される。実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において２番目に豊富に存在する保持されたイントロンは、イントロン１２である。実施形態では、ＰＲＰＦ３タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において２番目に豊富に存在する保持されたイントロンは、イントロン１３である。

【0081】

実施形態において、ＡＳＯは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中の保持されていないイントロン内にある、標的とされた領域に相補的である。実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対して＋６～＋１００の領域；または保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対して－１６～－１００の領域内にある。実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対して＋１００から、保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対して－１００の領域内にある。領域または配列の場所を特定するために使用されるように、「内（ｗｉｔｈｉｎ）」は、列挙された位置に残基を含むと理解される。例えば、＋６～＋１００の領域は、＋６および＋１００の位置に残基を含む。実施形態では、それにより標的タンパク質をコードする完全にスプライシングされた（成熟）ＲＮＡが産生される。

【0082】

実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の保持されたイントロンは非効率的にスプライシングされたイントロンである。本明細書で使用されるように「非効率的にスプライシングされた」は、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体における別のスプライス部位でのスプライシングの頻度と比較して、保持されたイントロン（５’スプライス部位または３’スプライス部位）に隣接しているスプライス部位での比較的少ない頻度のスプライシングを指し得る。用語「非効率的にスプライシングされた」はまた、スプライス部位でのスプライシングの相対速度または動力学を指し、ここでは、「非効率的にスプライシングされた」イントロンは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体における別のイントロンと比較して遅い速度でスプライシングまたは除去され得る。

【0083】

実施形態において、５’スプライス部位、および保持されたイントロンの＋１～＋６に隣接するエクソンの－３ｅ～－１ｅでの９つのヌクレオチド配列は、対応する野生型の配列と同一である。実施形態において、保持されたイントロンの－１５～－１、及び３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅでの１６のヌクレオチド配列は、対応する野生型の配列と同一である。本明細書で使用されるように、「野生型の配列」は、生物学および科学情報のＮＣＢＩリポジトリに寄託される公開された参照ゲノムにおけるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８遺伝子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用されるように、「野生型のＰＲＰＦ３配列」はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ９１２９で利用可能な正準配列を指す。本明細書で使用されるように、「野生型のＰＲＰＦ８配列」はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１０５９４で利用可能な正準配列を指す。本明細書で使用されるように、「ｅ」で表わされたヌクレオチド位置は、ヌクレオチドがエクソン（例えば５’スプライス部位に隣接するエクソンまたは３’スプライス部位に隣接するエクソン）の配列に存在することを示す。

【0084】

該方法は、細胞を、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体の一部に相補的なＡＳＯと接触させることを含み、その結果、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質それぞれの発現の増加がもたらされる。本明細書で使用されるように、細胞に「接触させること」または投与することは、ＡＳＯと細胞が相互に作用するように細胞に最も近づいた状態でＡＳＯを提供する方法を指す。ＡＳＯと接触される細胞は、細胞を取り入れ、または細胞にＡＳＯを運ぶ。該方法は、疾病または疾患に関連した或いは疾病または疾患に関係する細胞を、本明細書に記載のＡＳＯのいずれかと接触させる工程を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは更に修飾され、または別の分子と結合（例えば、共有結合）されることで細胞型に対しＡＳＯを標的とし、ＡＳＯと疾病または疾患に関連した或いは疾病または疾患に関係する細胞との接触を向上させ、またはＡＳＯの取り込みを向上させ得る。

【0085】

本明細書で使用されるように、用語「タンパク質産生を増加する」または「標的タンパク質の発現を増加する」は、細胞中のｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を増強することを意味する。「標的タンパク質」は発現／産生の増加が望まれる任意のタンパク質でもよい。

【0086】

ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞を、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に相補的なＡＳＯと接触させた結果、ｍＲＮＡ前駆体によりコードされるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質（例えば標的タンパク質）の量の測定可能な増加がもたらされる。タンパク質の産生を測定または検出する方法は、当業者に明白であり、例えば、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査、及びＥＬＩＳＡといった既知の方法を含む。

【0087】

実施形態では、細胞を、ＰＲＰＦ３及び／又はＰＲＰＦ８ ＲＩＣ前駆体の転写産物の標的部分に相補的なＡＳＯと接触させた結果、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞により産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または１０００％の、産生されたＰＲＰＦ３及び／又はＰＲＰＦ８タンパク質の量の増加がもたらされる。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触される細胞により産生されたＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の総量は、対照化合物により産生される標的タンパク質の量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍、増加する。対照化合物は、例えば、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的でないオリゴヌクレオチドでもよい。

【0088】

幾つかの実施形態では、細胞を、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に相補的なＡＳＯと接触させた結果、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡを含むＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８をコードするｍＲＮＡの量の増加がもたらされる。幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡの量、或いはＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの量は、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞により産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または１０００％増加される。実施形態では、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡの総量、或いはアンチセンスオリゴマーが接触された細胞において産生されたＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの総量は、未処置の細胞、例えば未処置の細胞または対照化合物で処置した細胞において産生される成熟ＲＮＡの量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、増加する。対照化合物は、例えば、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的でないオリゴヌクレオチドでもよい。

【0089】

＜ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシング＞
本明細書で提供される方法とアンチセンスオリゴヌクレオチドの組成物は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡ、或いはＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルの増加により、細胞、例えば、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の量または活性の不足により引き起こされるＲＰを患う被験体において、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させるのに有用である。特に、本明細書に記載されるような方法と組成物は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物からの保持されたイントロンの構成的なスプライシングを誘発し、それにより、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベル、或いはＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させ、且つＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる。

【0090】

ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的なスプライシングは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から保持されたイントロンを正しく除去し、ここで、保持されたイントロンには野生型スプライス配列がある。本明細書で使用されるように、構成的スプライシングは、遺伝子または対立遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシング或いは異常スプライシングを引き起こす突然変異を伴う、遺伝子または対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの、保持されたイントロンのスプライシングを包含しない。例えば、保持されたイントロンの構成的スプライシングは、本明細書で提供される方法とアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して誘発されるように、ｍＲＮＡ前駆体の異常スプライシングを調整せず、又はその選択的スプライシングに影響せず、その結果、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現の増加がもたらされる。

【0091】

実施形態では、構成的スプライシングは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から保持されたイントロンを正しく除去し、ここで、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、完全に機能的な標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする、野生型遺伝子または対立遺伝子、或いは多型遺伝子または対立遺伝子から転写され、及び、遺伝子または対立遺伝子には、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異がない。

【0092】

幾つかの実施形態では、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から保持されたイントロンを正しく除去し、ここで、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、標的遺伝子または機能的ＲＮＡが野生型対立遺伝子からの産生と比較して減少したレベルで産生される遺伝子または対立遺伝子から転写され、および、遺伝子または対立遺伝子には、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異がない。これら実施形態では、構成的にスプライシングされた保持されたイントロンの正確な除去の結果、同等の野生型タンパク質または機能的ＲＮＡと比較した時に機能的である標的タンパク質または機能的ＲＮＡの産生がもたらされる。

【0093】

他の実施形態では、構成的スプライシングは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から保持されたイントロンを正確に除去し、ここで、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、同等な野生型タンパク質または機能的ＲＮＡと比較して機能が低下した形態で産生される、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子または対立遺伝子から転写され、及び、遺伝子または対立遺伝子には、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異がない。これら実施形態では、構成的にスプライシングされた保持されたイントロンの正確な除去の結果、部分的に機能的な標的タンパク質、または、同等の野生型タンパク質または機能的ＲＮＡと比較した時に部分的に機能的である機能的ＲＮＡの産生がもたらされる。

【0094】

構成的なスプライシングによる保持されたイントロンの「正確な除去」は、エクソンのいかなる部分の除去も行わない、イントロン全体の除去を指す。

【0095】

実施形態において、本明細書に記載されるような、または本明細書に記載される任意の方法で使用されるアンチセンスオリゴマーは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節により、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡの量、或いはＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の量を増加しない。選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、例えばＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡ種の配列と長さを分析する既知の方法により、および本明細書と文献の中で別記された方法を使用して、測定され得る。実施形態では、選択的または異常なスプライシングの調節は、少なくとも１０％または１．１倍の対象のスプライシングされた種の量の増加或いは減少に基づいて決定される。実施形態では、調節は、本発明の方法でＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡの増加の決定に関して本明細書に記載されるように、少なくとも１０％から１００％または１．１から１０倍であるレベルでの増加または減少に基づいて決定される。

【0096】

実施形態では、該方法は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、野生型ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、方法は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、全長の野生型ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された。これらの実施形態では、全長のＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ前駆体は、野生型スプライス部位配列を有する保持されたイントロンのスプライシングと比較して、保持されたイントロンの正しいスプライシングを損なわない保持されたイントロンのスプライス部位に多型を有し得る。

【0097】

実施形態では、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである。これらの実施形態では、全長の成熟ｍＲＮＡは、野生型成熟ｍＲＮＡによってコードされたＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の活性と比較して、成熟ｍＲＮＡによってコードされた標的タンパク質または機能的ＲＮＡの活性に影響しない多型を有し得る。

【0098】

＜アンチセンスオリゴマー＞
本開示の一態様は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合することによってスプライシングを増強するアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。本明細書で使用されるように、用語「ＡＳＯ」および「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、ワトソン・クリック塩基対またはゆらぎ塩基対（Ｇ－Ｕ）によって標的核酸（例えば、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）配列にハイブリダイズする、核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドなどのオリゴマーを指す。ＡＳＯは、標的配列に相補的な又はほぼ相補的（例えば、標的配列に結合し、スプライス部位でスプライシングを増強させるのに十分な相補性）である正確な配列を有し得る。ＡＳＯは、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分）に結合し（ハイブリダイズし）、生理学的条件下でハイブリダイズされたままであるように設計されている。典型的に、ＡＳＯは、意図した（標的とされた）核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合、標的核酸でない限られた数の配列に（標的核酸以外の少数の部位に）ハイブリダイズする。ＡＳＯの設計は、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分の核酸配列、或いはゲノムまたは細胞のｍＲＮＡ前駆体またはトランスクリプトームにおける他の場所での十分に類似した核酸配列の発生を考慮に入れることができ、その結果、ＡＳＯが他の部位に結合し「オフターゲット」効果を引き起こす可能性は限定される。例えば、発明の名称「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｃａｙ」のＷＯ２０１５／０３５０９１として公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５４１５１におけるものなどの、当業者に既知のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に記載される方法を実施するために使用され得る。

【0099】

幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、標的核酸またはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に「特異的にハイブリダイズする」または「特異的」である。典型的に、そのようなハイブリダイゼーションは、３７℃より実質的に高い融解温度（Ｔｍ）で、好ましくは少なくとも５０℃で、および典型的に６０℃からおよそ９０℃の間で生じる。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、厳しいハイブリダイゼーション条件に対応している。与えられたイオン強度およびｐＨで、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。

【0100】

オリゴヌクレオチドなどのオリゴマーは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行構成で生じるときに、互いに「相補的」である。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖の１つと第２のポリヌクレオチドの鎖の１つとの間に生じる場合に、別のポリヌクレオチドに「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に容認された塩基対合則に従って、互いに水素結合を形成すると予期される対向する鎖における塩基の割合（例えばパーセンテージ）の点から数量化できる。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）の配列は、ハイブリダイズするその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はない。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的とされる標的核酸配列内の標的部位に対する、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の２０の核酸塩基のうちの１８が標的部位に相補的であり、それ故、特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、９０パーセントの相補性を表わす。この例において、残りの相補的でない核酸塩基は、ともにクラスター化され得るか、または相補的な核酸塩基と分散され（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）、互いに又は相補的な核酸塩基に隣接している必要はない。ＡＳＯの標的核酸の領域とのパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基礎的なローカルアライメント検索ツール）および当該技術分野で既知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）を慣例的に使用して判定され得る。

【0101】

ＡＳＯは、標的配列におけるすべての核酸塩基にハイブリダイズする必要はなく、それがハイブリダイズする核酸塩基は、隣接しているか又は隣接していないかもしれない。ＡＳＯは、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし得、その結果、介在する又は隣接するセグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関係しない（例えば、ループ構造またはヘアピン構造が形成され得る）。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的ｍＲＮＡ前駆体の転写産物において隣接していない核酸塩基にハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯは、ＡＳＯがハイブリダイズしない１つ以上の核酸塩基によって分離される、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物における核酸塩基にハイブリダイズすることができる。

【0102】

本明細書に記載されるＡＳＯは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に存在する核酸塩基に相補的である核酸塩基を含む。用語「ＡＳＯ」は、オリゴヌクレオチド、および標的ｍＲＮＡ上の相補的な核酸塩基にハイブリダイズすることができる核酸塩基を含むが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの糖部を含まない、他のオリゴマー分子を具体化する。ＡＳＯは、自然発生のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾されたヌクレオチド、またはそれらの２つ又は３つの任意の組み合わせを含み得る。用語「自然発生のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾された又は置換された糖類及び／又は修飾された骨格を有するヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯのヌクレオチドのすべてが、修飾されたヌクレオチドである。本明細書に記載される方法および組成物と適合性のあるＡＳＯの化学修飾およびＡＳＯの成分は、当業者に明白であり、例えば、米国特許第８，２５８，１０９号Ｂ２、米国特許第５，６５６，６１２号、米国特許公開番号２０１２／０１９０７２８、およびＤｉａｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００２，３４７－３５５で見ることができ、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。

【0103】

ＡＳＯの核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどの自然発生の未修飾の核酸塩基、または標的ｍＲＮＡ前駆体上に存在する核酸塩基との水素結合が可能であるように未修飾の核酸塩基に十分に類似している合成または修飾された核酸塩基であり得る。修飾された核酸塩基の例としては、限定されないが、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、および５－ヒドロキシメチルシトシンが挙げられる。

【0104】

本明細書に記載されるＡＳＯはまた、オリゴマーの成分に結合する骨格構造を含む。用語「骨格構造」および「オリゴマー結合」は、交換可能に使用され、ＡＳＯの単量体間の結合を指し得る。自然発生のオリゴヌクレオチドでは、骨格は、オリゴマーの糖部を結合する３’－５’ホスホジエステル結合を含む。本明細書に記載されるＡＳＯの骨格構造またはオリゴマー結合は、（限定されないが）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などを含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９ １９９１；Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７－１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）を参照。幾つかの実施形態では、ＡＳＯの骨格構造は、亜リン酸を含有していないが、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはカルバミン酸塩、アミド、および直鎖および環式の炭化水素基を含む連結基において、ペプチド結合を含有している。幾つかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）結合である。幾つかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホラミデート結合である。

【0105】

実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間の結合の各々での立体化学は、ランダムである。実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間の結合の各々での立体化学は、制御され、ランダムではない。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１９４６１０「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」は、核酸オリゴマーにおいて各リン原子でキラリティーの掌性（ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ）を独立して選択する方法について記載している。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、ランダムでないリンヌクレオチド間の結合を有するＡＳＯを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、純粋なジアステレオマーＡＳＯを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、約９０％から約１００％、約９１％から約１００％、約９２％から約１００％、約９３％から約１００％、約９４％から約１００％、約９５％から約１００％、約９６％から約１００％、約９７％から約１００％、約９８％から約１００％、または約９９％から約１００％のジアステレオマー純度を有するＡＳＯを含む。

【0106】

実施形態では、ＡＳＯは、そのリンヌクレオチド間の結合でＲｐおよびＳｐの構成のランダムでない混合物を有している。例えば、良好な活性とヌクレアーゼの安定性のバランスを達成するために、ＲｐとＳｐの混合がアンチセンスオリゴヌクレオチドに求められることが示唆されてきた（Ｗａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２）：１３４５６－１３４６８，参照により本明細書に組み込まれる）。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５～１００％のＲｐ、少なくとも約５％のＲｐ、少なくとも約１０％のＲｐ、少なくとも約１５％のＲｐ、少なくとも約２０％のＲｐ、少なくとも約２５％のＲｐ、少なくとも約３０％のＲｐ、少なくとも約３５％のＲｐ、少なくとも約４０％のＲｐ、少なくとも約４５％のＲｐ、少なくとも約５０％のＲｐ、少なくとも約５５％のＲｐ、少なくとも約６０％のＲｐ、少なくとも約６５％のＲｐ、少なくとも約７０％のＲｐ、少なくとも約７５％のＲｐ、少なくとも約８０％のＲｐ、少なくとも約８５％のＲｐ、少なくとも約９０％のＲｐ、または少なくとも約９５％のＲｐと、残りのｓｐ、或いは、約１００％のＲｐを含む。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％から約１００％のＲｐ、約１５％から約１００％のＲｐ、約２０％から約１００％のＲｐ、約２５％から約１００％のＲｐ、約３０％から約１００％のＲｐ、約３５％から約１００％のＲｐ、約４０％から約１００％のＲｐ、約４５％から約１００％のＲｐ、約５０％から約１００％のＲｐ、約５５％から約１００％のＲｐ、約６０％から約１００％のＲｐ、約６５％から約１００％のＲｐ、約７０％から約１００％のＲｐ、約７５％から約１００％のＲｐ、約８０％から約１００％のＲｐ、約８５％から約１００％のＲｐ、約９０％約１００％のＲｐ、または約９５％から約１００％のＲｐ、約２０％から約８０％のＲｐ、約２５％から約７５％のＲｐ、約３０％から約７０％のＲｐ、約４０％から約６０％のＲｐ、または約４５％から約５５％のＲｐと、残りのＳｐを含む。

【0107】

実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５～１００％のＳｐ、少なくとも約５％のＳｐ、少なくとも約１０％のＳｐ、少なくとも約１５％のＳｐ、少なくとも約２０％のＳｐ、少なくとも約２５％のＳｐ、少なくとも約３０％のＳｐ、少なくとも約３５％のＳｐ、少なくとも約４０％のＳｐ、少なくとも約４５％のＳｐ、少なくとも約５０％のＳｐ、少なくとも約５５％のＳｐ、少なくとも約６０％のＳｐ、少なくとも約６５％のＳｐ、少なくとも約７０％のＳｐ、少なくとも約７５％のＳｐ、少なくとも約８０％のＳｐ、少なくとも約８５％のＳｐ、少なくとも約９０％のＳｐ、または少なくとも約９５％のＳｐと、残りのＲｐ、あるいは約１００％のＳｐを含む。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％から約１００％のＳｐ、約１５％から約１００％のＳｐ、約２０％から約１００％のＳｐ、約２５％から約１００％のＳｐ、約３０％から約１００％のＳｐ、約３５％から約１００％のＳｐ、約４０％から約１００％のＳｐ、約４５％から約１００％のＳｐ、約５０％から約１００％のＳｐ、約５５％から約１００％のＳｐ、約６０％から約１００％のＳｐ、約６５％から約１００％のＳｐ、約７０％から約１００％のＳｐ、約７５％から約１００％のＳｐ、約８０％から約１００％のＳｐ、約８５％から約１００％のＳｐ、約９０％から約１００％のＳｐ、または約９５％から約１００％のＳｐ、約２０％から約８０％のＳｐ、約２５％から約７５％のＳｐ、約３０％から約７０％のＳｐ、約４０％から約６０％のＳｐ、または約４５％から約５５％のＳｐと、残りのＲｐを含む。

【0108】

本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかは、自然発生のヌクレオチド中に存在するような、リボースまたはデオキシリボースを含む糖部、あるいはモルホリン環を含む、修飾された糖部または糖アナログを含有し得る。修飾された糖部の限定しない例は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノエチル、２’Ｆ；Ｎ３’－＞Ｐ５’ホスホラミデート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’－グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｄｉｕｍ）、２’－Ｏ－グアニジニウムエチル、カルバミン酸塩修飾した糖、および二環式修飾した糖などの、２’置換基が挙げられる。幾つかの実施形態では、糖部修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’Ｆ、および２’ＭＯＥから選択される。幾つかの実施形態では、糖部修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）におけるような追加の架橋結合である。幾つかの実施形態では、糖アナログは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）などのモルホリン環を含有している。幾つかの実施形態では、糖部は、リボフラノシルまたは２’デオキシリボフラノシルの修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、２’４’抑制された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）２’Ｏ－メチルオキシエチル（ｃＭＯＥ）修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、ｃＥｔ ２’，４抑制された２’－ＯエチルＢＮＡ修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、エチレン核酸（ＥＮＡ）修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、ＭＣＥ修飾を含む。修飾は当該技術分野で既知であり、文献、例えば、Ｊａｒｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１４「Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４（１）：３７－４７に記載され、これは、この目的のための引用によって本明細書に組み込まれる。

【0109】

幾つかの例では、ＡＳＯの各単量体は、同じ方法で修飾され、例えば、ＡＳＯの骨格の各結合はホスホロチオエート結合を含み、または各リボース糖部は２’Ｏ－メチル修飾を含む。ＡＳＯの単量体成分の各々の上に存在する、そのような修飾は、「均一な修飾」と呼ばれる。幾つかの例では、異なる修飾の組み合わせが望まれ得、例えば、ＡＳＯは、ホスホロジアミデート結合とモルホリン環を含む糖部（モルホリノ）との組み合わせを含み得る。ＡＳＯへの異なる修飾の組み合わせは、「混合修飾」または「混合化学作用」と呼ばれる。

【0110】

幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の糖部修飾を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾および１つ以上の糖部修飾を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、２’ＭＯＥ修飾およびホスホロチオエート骨格を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。本明細書に記載されるＡＳＯのいずれか又はＡＳＯの成分（例えば、核酸塩基、糖部、骨格）は、ＡＳＯの望ましい特性または活性を達成するために或いはＡＳＯの望ましくない特性または活性を減少させるために修飾されてもよい。例えば、ＡＳＯまたは任意のＡＳＯの１つ以上の成分は、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物上の標的配列への結合親和性を増強する；非標的配列への結合を減少させる；細胞のヌクレアーゼ（つまり、ＲＮａｓｅ Ｈ）による分解を減少させる；細胞および／または細胞の核へのＡＳＯの取り込みを改善する；ＡＳＯの薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）または薬力（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）を変更する；およびＡＳＯの半減期を調節するために修飾され得る。

【0111】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで構成される。そのようなヌクレオチドで構成されたＡＳＯは、特に、本明細書で開示される方法によく適しており、そのような修飾を有しているオリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する著しく増強された耐性および増加したバイオアベイラビリティを有すると示されており、これによって、例えば、本明細書に記載される幾つかの実施形態における経口送達に適するようになる。例えば、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００１；２９６（３）：８９０－７；Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００１；２９６（３）：８９８－９０４を参照。

【0112】

ＡＳＯを合成する方法は当業者に既知である。代替的に又は加えて、ＡＳＯは商用源から得られ得る。

【0113】

他に明記されない限り、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯなど）配列の左端は、５’末端であり、一本鎖または二本鎖の核酸配列の左方向は、５’方向と呼ばれる。同様に、核酸配列（一本鎖または二本鎖）の右端または右方向は、３’末端または３’方向である。一般に、核酸中の基準点に対する５’にある領域または配列は、「上流」として言及され、核酸中の基準点に対する３’にある領域または配列は、「下流」として言及される。一般に、ｍＲＮＡの５’方向または５’末端は、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）が位置する場所であり、一方で、３’末端または３’方向は、終止コドンが位置する場所である。幾つかの態様では、核酸中の基準点の上流にあるヌクレオチドは、負の数によって指定され、基準点の下流にあるヌクレオチドは、正の数によって指定され得る。例えば、基準点（例えば、ｍＲＮＡ中のエクソン－エクソン連結）は「ゼロ」部位として指定され得、基準点に直接隣接し且つその上流にあるヌクレオチドは、「マイナス１」、例えば「－１」と指定され、一方で、基準点に直接隣接し且つその下流にあるヌクレオチドは、「プラス１」、例えば「＋１」と指定される。

【0114】

他の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流（３’の方向）であるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分（例えば、５’スプライス部位に対して、正の数で示された方向）に対して相補的である（および、結合する）（図１）。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、＋６から約＋１００の領域内にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、５’スプライス部位に対して＋１から＋５までのヌクレオチド（５’スプライス部位の下流に位置付けられた最初の５つのヌクレオチド）に対して相補的でない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から＋５０のヌクレオチドの領域内にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的であり得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋９０、＋６から＋８０、＋６から＋７０、＋６から＋６０、＋６から＋５０、＋６から＋４０、＋６から＋３０、または＋６から＋２０の領域内にある標的部分に相補的である。

【0115】

幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流（５’の方向）にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的領域（例えば負の数で指定された方向）に対して相補的である（図１）。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６から－５０の領域内にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位に対して－１から－１５までのヌクレオチド（３’スプライス部位の上流に位置付けられた最初の１５のヌクレオチド）に対して相補的でない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６から－５０の領域内にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６から－９０、－１６から－８０、－１６から－７０、－１６から－６０、－１６から－５０、－１６から－４０、または－１６から－３０の領域内にある標的部分に相補的である。

【0116】

実施形態において、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋１００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－１００までの領域内に存在する。

【0117】

幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン内（上流）にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である（図１）。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソンにおける＋２ｅから－４ｅの領域内にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド－１ｅから－３ｅに相補的ではない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、－４ｅから－１００ｅ、－４ｅから－９０ｅ、－４ｅから－８０ｅ、－４ｅから－７０ｅ、－４ｅから－６０ｅ、－４ｅから－５０ｅ、－４ｅから－４０ｅ、－４ｅから－３０ｅ、または－４ｅから－２０ｅの領域内にある、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。

【0118】

幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン内（下流）にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である（図１）。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンにおける＋２ｅから－４ｅの領域内にあるＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１ｅに相補的ではない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して、＋２ｅから＋１００ｅ、＋２ｅから＋９０ｅ、＋２ｅから＋８０ｅ、＋２ｅから＋７０ｅ、＋２ｅから＋６０ｅ、＋２ｅから＋５０ｅ、＋２ｅから＋４０ｅ、＋２ｅから＋３０ｅ、または＋２ｅから＋２０ｅの領域内にある、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。ＡＳＯは、スプライシングの特異的結合および効果的な増強作用に適する任意の長さでもよい。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは８から５０の核酸塩基から成る。例えば、ＡＳＯは、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４５または５０の核酸塩基であってもよい。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは５０よりも多い核酸塩基から成る。アンチセンスオリゴマーは、８から５０の核酸塩基、８から４０の核酸塩基、８から３５の核酸塩基、８から３０の核酸塩基、８から２５の核酸塩基、８から２０の核酸塩基、８から１５の核酸塩基、９から５０の核酸塩基、９から４０の核酸塩基、９から３５の核酸塩基、９から３０の核酸塩基、９から２５の核酸塩基、９から２０の核酸塩基、９から１５の核酸塩基、１０から５０の核酸塩基、１０から４０の核酸塩基、１０から３５の核酸塩基、１０から３０の核酸塩基、１０から２５の核酸塩基、１０から２０の核酸塩基、１０から１５の核酸塩基、１１から５０の核酸塩基、１１から４０の核酸塩基、１１から３５の核酸塩基、１１から３０の核酸塩基、１１から２５の核酸塩基、１１から２０の核酸塩基、１１から１５の核酸塩基、１２から５０の核酸塩基、１２から４０の核酸塩基、１２から３５の核酸塩基、１２から３０の核酸塩基、１２から２５の核酸塩基、１２から２０の核酸塩基、または１２から１５の核酸塩基、１３から５０の核酸塩基、１３から４０の核酸塩基、１３から３５の核酸塩基、１３から３０の核酸塩基、１３から２５の核酸塩基、１３から２０の核酸塩基、１４から５０の核酸塩基、１４から４０の核酸塩基、１４から３５の核酸塩基、１４から３０の核酸塩基、１４から２５の核酸塩基、１４から２０の核酸塩基、１５から５０の核酸塩基、１５から４０の核酸塩基、１５から３５の核酸塩基、１５から３０の核酸塩基、１５から２５の核酸塩基、１５から２０の核酸塩基、２０から５０の核酸塩基、２０から４０の核酸塩基、２０から３５の核酸塩基、２０から３０の核酸塩基、２０から２５の核酸塩基、２５から５０の核酸塩基、２５から４０の核酸塩基、２５から３５の核酸塩基、または２５から３０の核酸塩基の長さである。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１８のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１５のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２５のヌクレオチドである。

【0119】

幾つかの実施形態では、異なる化学的性質を有するが、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の同じ標的部分に相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。幾つかの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の異なる標的部分に相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。

【0120】

実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的部分または他の抱合体に化学的に連結される。そのような部分は、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分のような脂質部分、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシルの残留物、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸を含む。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えばマンノース６－リン酸）、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む部分と結合する。抱合体は、例えばリンカーを使用して、当技術分野において理解され、文献中に記載されるように、糖、塩基またはリン酸基上の幾つかの位置のいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドの１つ以上に連結され得る。リンカーは二価または三価の分枝リンカーを含み得る。実施形態では、抱合体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される。オリゴヌクレオチド抱合体を調製する方法は、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0121】

幾つかの実施形態では、ＡＳＯによって標的とされる核酸は、真核細胞などの細胞内に発現したＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体である。幾つかの実施形態では、用語「細胞」は、細胞の集団を指し得る。幾つかの実施形態では、細胞は被験体内に存在する。幾つかの実施形態では、細胞は被験体から分離されている。幾つかの実施形態では、細胞はエクスビボにある。幾つかの実施形態では、細胞は、疾病または疾患関連の細胞または細胞株である。幾つかの実施形態では、細胞はインビトロに（例えば、細胞培養液中に）ある。

【0122】

＜医薬組成物＞
記載された組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、上記方法のいずれかにおいて使用するための医薬組成物または医薬製剤は、医薬品産業において周知の従来技術に従って調製することができ、且つ公開文献にも記載されている。実施形態では、被験体を処置するための医薬組成物または製剤は、上述のような有効量のアンチセンスオリゴマー、あるいはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、またはエステル、および薬学的に許容可能な希釈剤を含む。医薬製剤のアンチセンスオリゴマーはさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含み得る。

【0123】

薬学的に許容可能な塩は、過度の毒性反応、刺激反応、アレルギー反応等を持たないヒトおよび下等動物の組織に接する使用に適しており、かつ適切なベネフィット・リスク比に相応している（例えば、この目的のための参照によって本明細書に組み込まれた、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９ （１９７７）を参照）。その塩は、化合物の最終的な分離および精製中に、または別々に遊離塩基の官能基を適切な有機酸と反応させることによって、インサイチュで調製され得る。薬学的に許容可能で無毒な酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸か、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸か、またはイオン交換などの他の文書で立証された方法を用いることによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属の塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらに薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルのスルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成された、無毒なアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンのカチオンを含む。

【0124】

実施形態において、組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸剤などの多くの考えられる剤形のいずれかに製剤される。実施形態において、組成物は、水性培地、非水性培地、または混合培地状の懸濁液として製剤される。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ソルビトールおよび／またはデキストラン）を含む懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含むこともある。その懸濁液は、安定化剤も含むこともある。実施形態において、本発明の医薬製剤または医薬組成物は、限定されないが、溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、発泡体またはリポソーム含有製剤（例えばカチオンリポソームまたは非カチオンリポソーム）を含む。

【0125】

本発明の医薬組成物または医薬製剤は、当業者にとって適当でありかつ周知である、または公開文献に記載されている、１つ以上の透過促進剤、担体、賦形剤、または他の活性成分あるいは非活性成分を含むこともある。実施形態において、リポソームは立体的に安定したリポソーム、例えば１つ以上の特定の脂質を含むリポソームも含む。これらの特定の脂質は、循環寿命が増強されたリポソームを結果としてもたらす。実施形態において、立体的に安定したリポソームは、１つ以上の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親油性ポリマーを用いて誘導体化される。実施形態において、界面活性剤は医薬製剤または医薬組成物中に含まれる。薬物製品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。実施形態では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達を達成する、例えば、細胞膜にわたる拡散を助ける及び／又は脂溶性薬物の浸透性を増強するために、浸透促進剤を利用する。実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、または非キレート性の非界面活性剤である。

【0126】

実施形態において、医薬製剤は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは他の薬物または治療剤と組み合わせて投与される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において既知の任意の方法によって、血液脳関門を介する対象のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる１つ以上の薬剤と共に投与される。例えば、筋組織内の運動ニューロンへアデノウイルスベクターを投与することによる薬剤の送達は、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６３２，４２７号「Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ－ｖｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ」に記載されている。脳、例えば、線条体、視床、海馬、または黒質への直接のベクターの送達は、例えば、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，７５６，５２３号「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｂｒａｉｎ」に記載される。

【0127】

実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい薬理学的性質または薬力学的性質を提供する薬剤に結合されるか抱合される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門を介する浸透または輸送を促進すると当技術分野において知られている物質、例えばトランスフェリン受容体の抗体に結合される。実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス化合物をより効果的にするために、または血液脳関門を介する輸送を増加させるためにウイルスベクターに結合される。実施形態では、浸透性の血液脳関門の破壊は、糖、例えば、メソ－エリトリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（－）フルクトース、Ｄ（－）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（－）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（－）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（－）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（－）フコース、Ｄ（－）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、およびＬ（－）リキソース、あるいは、例えばグルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンなどのアミノ酸、の注入によって助けられる。血液脳関門浸透を増強する方法および材料は、例えば、それぞれが引用により本明細書に組み込まれた、米国特許第４，８６６，０４２号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、米国特許第６，２９４，５２０号「Ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｐａｓｓａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、および米国特許第６，９３６，５８９号「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載されている。

【0128】

実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的部分または他の抱合体に化学的に連結される。そのような部分は、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分のような脂質部分、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシルの残留物、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸を含む。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えばマンノース６－リン酸）、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む部分と結合する。抱合体は、例えばリンカーを使用して、当技術分野において理解され、文献中に記載されるように、糖、塩基またはリン酸基上の幾つかの位置のいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドの１つ以上に連結され得る。リンカーは二価または三価の分枝リンカーを含み得る。実施形態では、抱合体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される。オリゴヌクレオチド抱合体を調製する方法は、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。

【0129】

＜被験体の処置＞
本明細書に提供される組成物のうちのいずれかが個体に投与されうる。「個体」は、「被験体」または「患者」と交換可能に使用されてもよい。個体は哺乳動物でもよく、例えば人間、または、人類以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ラット、マウス、馬、ロバ、ヤギ、猫、犬、雌牛、ブタ、あるいは羊などの動物である。実施形態では、個体はヒトである。実施形態では、個体は胎児、胚、または小児である。他の実施形態では、個体は植物などの別の真核生物であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される化合物は細胞にエクスビボで投与される。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、疾病または障害を処置する方法として個体に投与される。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記述された疾病のいずれかなどの遺伝病を有する。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記述された疾病のいずれかなどの疾病を有するリスクがある。いくつかの実施形態では、個体は、不十分な量のタンパク質または不十分な活性のタンパク質により引き起こされる疾病または障害を有するリスクが増大している。個体が、不十分な量のタンパク質または不十分な活性のタンパク質により引き起こされる疾病または障害を有するリスクが増大している場合、方法は防止的または予防的な処置を含む。例えば、個体は、その疾病の家族健康歴のために、そのような疾病または障害を有するリスクが増大している場合がある。典型的には、そのような疾病または障害を有するリスクが増大している個体は、予防的処置（例えば、疾病または障害の発症または悪化を予防するかまたは遅らせることによる）から利益を受ける。

【0131】

本発明のＡＳＯの投与に適切な経路は、ＡＳＯの送達が所望される細胞型に応じて変わりうる。目はＲＰ１３とＲＰ１８の最も著しく影響を受ける組織である。したがって、本発明のＡＳＯは、硝子体内注射、網膜下注射、または眼への局所適用によって被験体に投与することができる。実施形態では、本発明のＡＳＯは、インプラント、例えば、眼に埋め込まれるカプセル化された薬物、を介して被験体に投与される。実施形態では、本発明のＡＳＯでエクスビボで処置されたＲＰＥ細胞は、例えば、カプセル化された形態で眼に埋め込まれる。実施形態では、治療は、例えば、経口アセタゾラミド、カルシウムチャンネルブロッカー、ルテインまたはゼアキサンチン、経口バルプロ酸、または免疫抑制剤などＲＰの既存の処置と併せて投与される。実施形態では、ＡＳＯは非経口的に投与される。実施形態では、本発明のＡＳＯは、経口的に、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって、被験体に投与されてもよい。実施形態では、胎児は、例えば胎児にＡＳＯ組成物を直接的または間接的に（例えば母親を介して）投与することによって、子宮内で処置される。

【0132】

実施形態では、本方法および組成物を用いて処置された被験体は、当該技術分野で公知および記載されている任意の方法を用いて症状の改善について評価される。

【0133】

＜スプライシングを増強する追加のＡＳＯを特定する方法＞
本発明の範囲内にはまた、特異的に標的イントロンでのＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを増強する追加のＡＳＯを特定する（判定する）方法がある。ｍＲＮＡ前駆体の標的領域内で様々なヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、標的イントロンのスプライシングの速度および／または程度を改善するＡＳＯを特定する（判定する）ためにスクリーニングされてもよい。いくつかの実施形態では、ＡＳＯはスプライシング抑制因子／サイレンサーの結合部位をブロックまたは妨害することがある。当該技術分野において既知の任意の方法が、イントロンの標的領域にハイブリダイズされた時に所望の効果（例えばスプライシング、タンパク質または機能的なＲＮＡ生産の向上）をもたらすＡＳＯを特定する（判定する）ために使用されてもよい。これらの方法はまた、保持されたイントロンに隣接するエクソン中、または保持されていないイントロン中の標的領域へ結合することにより、保持されたイントロンのスプライシングを増強するＡＳＯの特定のために使用することができる。使用されうる方法の一例が下記に提供される。

【0134】

ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを用いて、ＡＳＯ「ウォーク」（ｗａｌｋ）と呼ばれる、一ラウンドのスクリーニングを行いうる。例えば、ＡＳＯウォークに使用されるＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド上流（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの上流に位置するエクソンの配列の一部）から、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流まで、および／または、保持されたイントロンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド上流から、標的とされた／保持されたイントロンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの下流に位置するエクソンの配列の一部）まで、５つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。例えば、１５ヌクレオチドの長さの第１のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対しヌクレオチド＋６から＋２０に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。第２のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１１から＋２５に特異的にハイブリダイズするように設計されている。ＡＳＯは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域に及ぶように設計されている。実施形態では、ＡＳＯは、より密に、例えば、１、２、３、または４つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。さらに、ＡＳＯは、５’スプライス部位の１００ヌクレオチド下流から、３’スプライス部位の１００ヌクレオチド上流まで敷き詰められ得る。

【0135】

１つ以上のＡＳＯ、または１つの対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズするとは予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）は、例えばトランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体（例えば、本明細書で別記されるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を発現する疾患関連の細胞株へと送達される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の特定」を参照）。対照ＡＳＯ処理された細胞と比較して、ＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して産生されたＲＴ－ＰＣＲ産物が減少または欠如することは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。いくつかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないｍＲＮＡ前駆体に対するスプライシングされたｍＲＮＡ前駆体の割合、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して改善され得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコードされるタンパク質または機能的ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが所望の効果（例えば、タンパク質産生の増加）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価し及び／又は定量するための、当該技術分野で既知の方法も使用することができる。

【0136】

ＡＳＯ「ミクロウォーク」（ｍｉｃｒｏ－ｗａｌｋ）と呼ばれる第２ラウンドのスクリーニングは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実行され得る。ＡＳＯミクロウォークに使用されるＡＳＯは、ＡＳＯでハイブリダイズされたときに結果的にスプライシングを増強させるｍＲＮＡ前駆体のヌクレオチド酸配列をさらに改良する（ｒｅｆｉｎｅ）ために、１つのヌクレオチドごとに敷き詰められる。

【0137】

標的イントロンのスプライシングを促進するＡＳＯによって定義される領域は、１－ｎｔステップ（１－ｎｔ ｓｔｅｐｓ）で配置されたＡＳＯ、ならびに、典型的には１８－２５ｎｔである、より長いＡＳＯを含む、ＡＳＯ「ミクロウォーク」によって、より詳細に調査される。

【0138】

上記でＡＳＯウォークに関して記載されたように、１つ以上のＡＳＯ、または対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズすると予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）を、例えばトランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体を発現する疾患関連細胞株へと送達することにより、ＡＳＯミクロウォークが実行される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の特定」を参照）。対照ＡＳＯ処理された細胞と比較して、ＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して産生されたＲＴ－ＰＣＲ産物が減少または欠如することは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。いくつかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないｍＲＮＡ前駆体に対するスプライシングされたｍＲＮＡ前駆体の割合、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して改善され得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコードされるタンパク質または機能的ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが所望の効果（例えば、タンパク質産生の増加）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価し及び／又は定量するための、当該技術分野で既知の方法も使用することができる。

【0139】

ｍＲＮＡ前駆体の領域にハイブリダイズされたときに、結果的にスプライシングを増強させ、タンパク質産生を増加させるＡＳＯは、動物モデル、例えば、全長ヒト遺伝子がノックインされたトランスジェニックマウスモデルまたは疾患のヒト化マウスモデルを使用して、インビボで試験され得る。ＡＳＯの投与に適した経路は、ＡＳＯの送達が望まれる疾患及び／又は細胞型に応じて変化し得る。したがって、本発明のＡＳＯは、硝子体内注射、網膜下注射、眼への局所適用、または、眼に埋め込まれるカプセル化された薬物、によって被験体に投与することができる。投与後に、モデル動物の細胞、組織、及び／又は臓器は、当該技術分野に既知の方法および本明細書に記載される方法によって、例えば、スプライシング（効率、速度、程度）およびタンパク質産生を評価することにより、ＡＳＯ処置の効果を判定するために評価され得る。動物モデルはまた、疾患または疾患重症度の表現型の徴候または行動的な徴候であり得る。

【0140】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載された一方、そのような実施形態が一例としてのみ提供されていることは当業者にとって明白である。多くの変更、変化および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその同等物の範囲内の方法および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
本明細書は、発明の以下の態様を包含する。
［１］
被験体の細胞により標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させることによって被験体の網膜色素変性症１８（ＲＰ１８）または網膜色素変性症１３（ＲＰ１３）を処置する方法であって、
ここで、前記細胞は、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードし、
前記方法は、
被験体の細胞を、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させる、方法。
［２］
保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有している細胞によって、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８である標的タンパク質の発現を増加させる方法であって、
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードし、
前記方法は、
細胞を、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、細胞内で、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる、方法。
［３］
ＲＰ１８を処置する方法であって標的タンパク質がＰＲＰＦ３である、またはＲＰ１３を処置する方法であって、標的タンパク質がＰＲＰＦ８である、［１］に記載の方法。
［４］
標的タンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的ＲＮＡである、［１］に記載の方法。
［５］
細胞は、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体内にあるか又は被験体に由来する、［２］に記載の方法。
［６］
標的タンパク質の量の不足は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は、機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子、標的タンパク質が産生されない第２の対立遺伝子、または非機能的な標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する、［１］－［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］
被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、
ここで、被験体は、
ａ．
ｉ．標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
ｉｉ．標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは、
ｉｉｉ．標的タンパク質が産生されない、
第１の変異対立遺伝子と、
ｂ．
ｉ．標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
ｉｉ．標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、あるいは、
ｉｉｉ．標的タンパク質が産生されない、
第２の変異対立遺伝子とを有し、
ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子ａ．ｉｉｉ．を有するとき、第２の変異対立遺伝子はｂ．ｉ．あるいはｂ．ｉｉ．であり、ここで、被験体が第２の変異対立遺伝子ｂ．ｉｉｉ．を有するとき、第１の変異対立遺伝子はａ．ｉ．あるいはａ．ｉｉ．であり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ａ．ｉ．あるいはａ．ｉｉ．である第１の変異対立遺伝子、および／または、ｂ．ｉ．あるいはｂ．ｉｉ．である第２の変異対立遺伝子から転写される、［１］－［５］のいずれか１つに記載の方法。
［８］
標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で産生される、［７］に記載の方法。
［９］
標的タンパク質は、同等な野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態で産生される、［７］に記載の方法。
［１０］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにある、［１］－［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６までの領域内の保持されたイントロンにある、［１］－［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］
標的タンパク質はＰＲＰＦ３である、［１］－［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６までの領域内の保持されたイントロンにある、［１２］に記載の方法。
［１４］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％相補的である配列を含む、［１２］または［１３］に記載の方法。
［１５］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６の少なくとも８の隣接する核酸を含む領域に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［１２］－［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］
ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［１２］－［１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１７］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む、［１３］－［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１８］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、［１３］－［１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１９］
標的タンパク質がＰＲＰＦ８である、［１］－［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［２０］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋１５６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１５６までの領域内の保持されたイントロンにある、［１９］に記載の方法。
［２１］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％相補的である配列を含む、［１９］または［２０］に記載の方法。
［２２］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８の少なくとも８の隣接する核酸に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［１９］－［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］
ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４－４４５のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［１９］－［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［２４］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む、［２０］－［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、［２０］－［２４］のいずれか１つに記載の方法。
［２６］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から＋１００の領域、あるいは、
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６から－１００の領域、の内部の保持されたイントロンにある、［１］－［９］および［１２］－［２５］のいずれか１つに記載の方法。
［２７］
アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流の領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする、［１］－［９］および［１２］－［２５］のいずれか１つに記載の方法。
［２８］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅから－４ｅの領域、あるいは、
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅから－４ｅの領域、
の内部の保持されたイントロンである、［１］－［９］および［１２］－［２５］のいずれか１つに記載の方法。
［２９］
アンチセンスオリゴマーは、機能的ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない、［１］－［２８］のいずれか１つに記載の方法。
［３０］
アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない、［１］－［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３１］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシング、または野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって産生された、［１］－［３０］のいずれか１つに記載の方法。
［３２］
標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである、［１］－［３１］のいずれか１つに記載の方法。
［３３］
産生された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、［１］－［３２］のいずれか１つに記載の方法。
［３４］
アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞において産生された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞において産生された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１から約１０倍、約１．５から約１０倍、約２から約１０倍、約３から約１０倍、約４から約１０倍、約１．１から約５倍、約１．１から約６倍、約１．１から約７倍、約１．１から約８倍、約１．１から約９倍、約２から約５倍、約２から約６倍、約２から約７倍、約２から約８倍、約２から約９倍、約３から約６倍、約３から約７倍、約３から約８倍、約３から約９倍、約４から約７倍、約４から約８倍、約４から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍増加する、［１］－［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３５］
アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって産生された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって産生された標的タンパク質の総量と比較して、約１．１から約１０倍、約１．５から約１０倍、約２から約１０倍、約３から約１０倍、約４から約１０倍、約１．１から約５倍、約１．１から約６倍、約１．１から約７倍、約１．１から約８倍、約１．１から約９倍、約２から約５倍、約２から約６倍、約２から約７倍、約２から約８倍、約２から約９倍、約３から約６倍、約３から約７倍、約３から約８倍、約３から約９倍、約４から約７倍、約４から約８倍、約４から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する、［１］－［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３６］
アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、［１］－［３５］のいずれか１つに記載の方法。
［３７］
アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、［１］－［３６］のいずれか１つに記載の方法。
［３８］
アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの修飾された糖部を含む、［１］－［３７］のいずれか１つに記載の方法。
［３９］
それぞれの糖部は修飾された糖部である、［３８］に記載の方法。
［４０］
アンチセンスオリゴマーは、８から５０の核酸塩基、８から４０の核酸塩基、８から３５の核酸塩基、８から３０の核酸塩基、８から２５の核酸塩基、８から２０の核酸塩基、８から１５の核酸塩基、９から５０の核酸塩基、９から４０の核酸塩基、９から３５の核酸塩基、９から３０の核酸塩基、９から２５の核酸塩基、９から２０の核酸塩基、９から１５の核酸塩基、１０から５０の核酸塩基、１０から４０の核酸塩基、１０から３５の核酸塩基、１０から３０の核酸塩基、１０から２５の核酸塩基、１０から２０の核酸塩基、１０から１５の核酸塩基、１１から５０の核酸塩基、１１から４０の核酸塩基、１１から３５の核酸塩基、１１から３０の核酸塩基、１１から２５の核酸塩基、１１から２０の核酸塩基、１１から１５の核酸塩基、１２から５０の核酸塩基、１２から４０の核酸塩基、１２から３５の核酸塩基、１２から３０の核酸塩基、１２から２５の核酸塩基、１２から２０の核酸塩基、あるいは１２から１５の核酸塩基からなる、［１］－［３９］のいずれか１つに記載の方法。
［４１］
アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、［１］－［４０］のいずれか１つに記載の方法。
［４２］
細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する、［１］－［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４３］
最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを産生するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、［４６］に記載の方法。
［４４］
細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する、［１］－［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４５］
２番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを産生するためにＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、［４４］に記載の方法。
［４６］
疾病は疾患または障害である、［５］－［４５］のいずれか１つに記載の方法。
［４７］
疾患または障害はＲＰ１８またはＲＰ１３である、［４６］に記載の方法。
［４８］
標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＲＰＦ３遺伝子またはＰＲＰＦ８遺伝子によってコードされる、［４７］に記載の方法。
［４９］
前記方法はタンパク質発現を評価する工程をさらに含む、［１］－［４８］のいずれか１つに記載の方法。
［５０］
被験体はヒトである、［１］－［４９］のいずれか１つに記載の方法。
［５１］
被験体はヒト以外の動物である、［１］－［４９］のいずれか１つに記載の方法。
［５２］
被験体は胎児、胚、あるいは子供である、［１］－［５０］のいずれか１つに記載の方法。
［５３］
細胞はエクスビボである、［１］－［５１］のいずれか１つに記載の方法。
［５４］
アンチセンスオリゴマーは、被験体の硝子体内注射、網膜下注射、局所投与、移植、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される、［１］－［５１］のいずれか１つに記載の方法。
［５５］
５’スプライス部位に隣接するエクソンの－３ｅから－１ｅと、保持されたイントロンの＋１から＋６にある９つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、［１］－［５４］のいずれか１つに記載の方法。
［５６］
保持されたイントロンの－１５から－１と３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅにある１６のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、［１］－［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７］
［１］－［５６］のいずれか１つの方法に使用されるアンチセンスオリゴマー。
［５８］
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－４４５のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含むアンチセンスオリゴマー。
［５９］
［５７］または［５８］のアンチセンスオリゴマーと賦形剤を含む医薬組成物。
［６０］
硝子体注射、網膜下注射、局所投与、移植、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射により、［５８］記載の医薬組成物を投与することによって、必要としている被験体を処置する方法。
［６１］
不足しているタンパク質または不足している機能的ＲＮＡに関係する、必要としている被験体のＲＰ１８またはＲＰ１３を処置するために細胞によって標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させる方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
ここで、不足しているタンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の構成的スプライシングを増強し、
ここで、標的タンパク質は、
（ａ）不足しているタンパク質、あるいは、
（ｂ）被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、
ここで、機能的ＲＮＡは、
（ａ）不足しているＲＮＡ、あるいは、
（ｂ）被験体において不足している機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償機能的ＲＮＡであり、
ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体において標的タンパク質または機能的ＲＮＡの産生または活性を増加させる、組成物。
［６２］
必要としている被験体においてＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質に関係する疾病を処置する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
該方法は、被験体の細胞によってＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる工程であって、細胞が保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体がＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードする、工程と、細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させる工程であって、それによって、保持されたイントロンは、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８タンパク質の発現を増加させる、工程を含む、組成物。
［６３］
標的タンパク質ＰＲＰＦ３は、ＮＭ＿００４６９８の配列によってコードされる、またはＰＲＰＦ８はＮＭ＿００６４４５の配列によってコードされる、［６２］に記載の組成物。
［６４］
疾病は疾患または障害である、［６２］または［６３］に記載の組成物。
［６５］
疾患または障害はＲＰ１８またはＲＰ１３である、［６５］に記載の組成物。
［６６］
標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＰＲＰＦ３またはＰＲＰＦ８遺伝子によってコードされる、［６５］に記載の組成物。
［６７］
アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする、［６１］－［６６］のいずれか１つに記載の組成物。
［６８］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６の領域内の保持されたイントロンにある、［６１］－［６７］のいずれか１つに記載の組成物。
［６９］
標的タンパク質はＰＲＰＦ３である、［６１］－［６８］のいずれか１つに記載の組成物。
［７０］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋４９８から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－４９６の領域内の保持されたイントロンにある、［６９］に記載の組成物。
［７１］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％相補的である配列を含む、［６９］または［７０］に記載の組成物。
［７２］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６の少なくとも８つの隣接する核酸を含む領域に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［６９］－［７２］のいずれか１つに記載の組成物。
［７３］
ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［６９］－［７０］のいずれか１つに記載の組成物。
［７４］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［７０］－［７３］のいずれか１つに記載の組成物。
［７５］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、［７０］－［７４］のいずれか１つに記載の組成物。
［７６］
標的タンパク質はＰＲＰＦ８である、［６１］－［６８］のいずれか１つに記載の組成物。
［７７］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋１５６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１５６の領域内の保持されたイントロンにある、［７６］に記載の組成物。
［７８］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％相補的な配列を含む、［７６］または［７７］に記載の組成物。
［７９］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８の少なくとも８の隣接する核酸を含む領域に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［７６］－［７８］のいずれか１つに記載の組成物。
［８０］
ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４－４４５のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［７６］－［７９］のいずれか１つに記載の組成物。
［８１］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、［７７］－［８０］のいずれか１つに記載の組成物。
［８２］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、［７７］－［８１］のいずれか１つに記載の組成物。
［８３］
アンチセンスオリゴマーはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とし、これは、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から＋１００の領域、あるいは
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６から－１００の領域、の内部の保持されたイントロンにある、［６１］－［６６］および［６９］－［８２］のいずれか１つに記載の組成物。
［８４］
アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする、［６１］－［６６］および［６９］－［８２］のいずれか１つに記載の組成物。
［８５］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅから－４ｅの領域、あるいは、
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅから－４ｅの領域、
の内部にある、［６１］－［６６］および［６９］－［８２］のいずれか１つに記載の組成物。
［８６］
アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない、［６１］－［８５］のいずれか１つに記載の組成物。
［８７］
アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的ＲＮＡまたは機能的タンパク質の量を増加させない、［６１］－［８６］のいずれか１つに記載の組成物。
［８８］
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体、または野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって産生された、［６１］－［８７］のいずれか１つに記載の組成物。
［８９］
標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである、［６１］－［８８］のいずれか１つに記載の組成物。
［９０］
産生された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、［６１］－［８９］のいずれか１つに記載の組成物。
［９１］
保持されたイントロンは律速イントロンである、［６１］から［９０］のいずれか１つに記載の組成物。
［９２］
前記保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである、［６１］－［９１］のいずれか１つに記載の組成物。
［９３］
保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で２番目に豊富な保持されたイントロンである、［６１］－［９１］のいずれか１つに記載の組成物。
［９４］
アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、［６１］－［９３］のいずれか１つに記載の組成物。
［９５］
前記アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、［６１］－［９４］のいずれか１つに記載の組成物。
［９６］
アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、［６１］－［９５］のいずれか１つに記載の組成物。
［９７］
アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、［６１］－［９６］のいずれか１つに記載の組成物。
［９８］
それぞれの糖部は修飾された糖部である、［９７］に記載の組成物。
［９９］
アンチセンスオリゴマーは、８から５０の核酸塩基、８から４０の核酸塩基、８から３５の核酸塩基、８から３０の核酸塩基、８から２５の核酸塩基、８から２０の核酸塩基、８から１５の核酸塩基、９から５０の核酸塩基、９から４０の核酸塩基、９から３５の核酸塩基、９から３０の核酸塩基、９から２５の核酸塩基、９から２０の核酸塩基、９から１５の核酸塩基、１０から５０の核酸塩基、１０から４０の核酸塩基、１０から３５の核酸塩基、１０から３０の核酸塩基、１０から２５の核酸塩基、１０から２０の核酸塩基、１０から１５の核酸塩基、１１から５０の核酸塩基、１１から４０の核酸塩基、１１から３５の核酸塩基、１１から３０の核酸塩基、１１から２５の核酸塩基、１１から２０の核酸塩基、１１から１５の核酸塩基、１２から５０の核酸塩基、１２から４０の核酸塩基、１２から３５の核酸塩基、１２から３０の核酸塩基、１２から２５の核酸塩基、１２から２０の核酸塩基、あるいは１２から１５の核酸塩基からなる、［６１］－［９８］のいずれか１つに記載の組成物。
［１００］
アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、［６１］－［９９］のいずれか１つに記載の組成物。
［１０１］
［６１］－［１００］に記載の組成物のいずれかのアンチセンスオリゴマーおよび賦形剤を含む医薬組成物。
［１０２］
被験体の硝子体内注射、網膜下注射、局所投与、移植、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射により、［１０１］に記載の医薬組成物を投与することによって必要としている被験体を処置する方法。
［１０３］
不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマーと、
薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、
医薬組成物。
［１０４］
不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１０５］
ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－５００までの領域内の保持されたイントロンにある、［１０３］または［１０４］に記載の医薬組成物。
［１０６］
ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、［１０３］または［１０４］に記載の医薬組成物。
［１０７］
ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３－４のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む、［１０３］－［１０４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０８］
アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１０９］
アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１１０］
アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１１１］
アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１１２］
アンチセンスオリゴマーは、８から５０の核酸塩基、８から４０の核酸塩基、８から３５の核酸塩基、８から３０の核酸塩基、８から２５の核酸塩基、８から２０の核酸塩基、８から１５の核酸塩基、９から５０の核酸塩基、９から４０の核酸塩基、９から３５の核酸塩基、９から３０の核酸塩基、９から２５の核酸塩基、９から２０の核酸塩基、９から１５の核酸塩基、１０から５０の核酸塩基、１０から４０の核酸塩基、１０から３５の核酸塩基、１０から３０の核酸塩基、１０から２５の核酸塩基、１０から２０の核酸塩基、１０から１５の核酸塩基、１１から５０の核酸塩基、１１から４０の核酸塩基、１１から３５の核酸塩基、１１から３０の核酸塩基、１１から２５の核酸塩基、１１から２０の核酸塩基、１１から１５の核酸塩基、１２から５０の核酸塩基、１２から４０の核酸塩基、１２から３５の核酸塩基、１２から３０の核酸塩基、１２から２５の核酸塩基、１２から２０の核酸塩基、あるいは１２から１５の核酸塩基を含む、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１１３］
アンチセンスオリゴマーは、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、［１０３］または［１０４］に記載の医薬組成物。
［１１４］
ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６－４４７から選択される配列内にある、［１０３］または［１０４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１１５］
アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１１６］
アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３から選択されたヌクレオチド配列を含む、［１０３］に記載の医薬組成物。
［１１７］
医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射のために製剤される、［１０３］－［１１６］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１１８］
不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマーと、
薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、
医薬組成物。
［１１９］
不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である、［１１８］に記載の医薬組成物。
［１２０］
ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－５００までの領域内の保持されたイントロンにある、［１１８］または［１１９］に記載の医薬組成物。
［１２１］
ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、［１１８］または［１１９］に記載の医薬組成物。
［１２２］
ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３－４のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む、［１１８］または［１１９］に記載の医薬組成物。
［１２３］
アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、［１１８］に記載の医薬組成物。
［１２４］
アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、に記載の医薬組成物。
［１２５］
アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、［１１８］に記載の医薬組成物。
［１２６］
アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、［１１８］に記載の医薬組成物。
［１２７］
アンチセンスオリゴマーは、８から５０の核酸塩基、８から４０の核酸塩基、８から３５の核酸塩基、８から３０の核酸塩基、８から２５の核酸塩基、８から２０の核酸塩基、８から１５の核酸塩基、９から５０の核酸塩基、９から４０の核酸塩基、９から３５の核酸塩基、９から３０の核酸塩基、９から２５の核酸塩基、９から２０の核酸塩基、９から１５の核酸塩基、１０から５０の核酸塩基、１０から４０の核酸塩基、１０から３５の核酸塩基、１０から３０の核酸塩基、１０から２５の核酸塩基、１０から２０の核酸塩基、１０から１５の核酸塩基、１１から５０の核酸塩基、１１から４０の核酸塩基、１１から３５の核酸塩基、１１から３０の核酸塩基、１１から２５の核酸塩基、１１から２０の核酸塩基、１１から１５の核酸塩基、１２から５０の核酸塩基、１２から４０の核酸塩基、１２から３５の核酸塩基、１２から３０の核酸塩基、１２から２５の核酸塩基、１２から２０の核酸塩基、あるいは１２から１５の核酸塩基を含む、［１１８］に記載の医薬組成物。
［１２８］
アンチセンスオリゴマーは、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、［１１８］または［１１９］に記載の医薬組成物。
［１２９］
ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８から選択される配列内にある、［１１８］または［１１９］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１３０］
アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む、［１１８］に記載の医薬組成物。
［１３１］
アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５から選択されるヌクレオチド配列を含む、［１１８］に記載の医薬組成物。
［１３２］
医薬組成物は、硝子体内注射、網膜下注射、局所投与、移植、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射のために製剤される、［１１８］から［１３１］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１３３］
ＰＲＰＦ３タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡ転写産物を産生するべく、保持されたイントロンの除去を促すために不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡ転写産物の処理を誘発する方法であって、
前記方法は、
（ａ）被験体の標的細胞へアンチセンスオリゴマーを接触させる工程と、
（ｂ）アンチセンスオリゴマーを不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物にハイブリダイズする工程であって、不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物が、ＰＲＰＦ３タンパク質の機能形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程と、
（ｃ）ＰＲＰＦ３タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡ転写産物を産生するために不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡ転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程と、
（ｄ）十分に処理されたＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物からＰＲＰＦ３タンパク質の機能形態を翻訳する工程を含む、方法。
［１３４］
保持されたイントロンは保持されたイントロン全体である、［１３３］に記載の方法。
［１３５］
不足しているＰＲＰＦ３ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ３ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である、［１３３］または［１３４］に記載の方法。
［１３６］
ＰＲＰＦ３タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体を処置する方法であって、
前記方法は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－３２３のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む、方法。
［１３７］
ＰＲＰＦ８タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ転写産物を産生するべく、保持されたイントロンの除去を促すために不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ転写産物の処理を誘発する方法であって、
前記方法は、
（ａ）被験体の標的細胞へアンチセンスオリゴマーを接触させる工程と、
（ｂ）アンチセンスオリゴマーを不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物にハイブリダイズする工程であって、不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物が、ＰＲＰＦ８タンパク質の機能形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程と、
（ｃ）ＰＲＰＦ８タンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ転写産物を産生するために不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡ転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程と、
（ｄ）十分に処理されたＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物からＰＲＰＦ８タンパク質の機能形態を翻訳する工程を含む、方法。
［１３８］
保持されたイントロンは保持されたイントロン全体である、［１３７］に記載の方法。
［１３９］
不足しているＰＲＰＦ８ ｍＲＮＡの転写産物は、ＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である、［１３７］または［１３８］に記載の方法。
［１４０］
ＰＲＰＦ８タンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体を処置する方法であって、
前記方法は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４－４４５のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む、方法。

【0141】

＜実施例＞
本発明は、以下の実施例によってより具体的に例示されるだろう。しかしながら、本発明がどんな方法でもこれらの実施例によって制限されていないことが理解されるべきである。

【0142】

実施例１：次世代配列決定を用いたＲＮＡｓｅｑによるＰＲＰＦ３転写産物のイントロン保持事象の特定
イントロン保持事象を特定するためにＰＲＰＦ３遺伝子によって産生された転写産物のスナップショットを明らかにするために、次世代配列決定を使用して、全トランスクリプトームのショットガン配列決定を実行した。このために、ＡＲＰＥ－１９（網膜上皮）細胞の核および細胞質の分画からのｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを分離し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリＰｒｅｐキットを用いてｃＤＮＡライブラリを構築した。ライブラリを対末端配列決定（ｐａｉｒ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）し、結果として、ヒトゲノム（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）にマッピングされた１００ヌクレオチドの読み取りをもたらした。ＰＲＰＦ３についての配列決定の結果を、図３に示す。簡潔に言うと、図３は、（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，１１５６ Ｈｉｇｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ ９５０６４）によって操作され、かつ、例えばＲｏｓｅｎｂｌｏｏｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，「Ｔｈｅ ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｄａｔａｂａｓｅ： ２０１５ ｕｐｄａｔｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１１７７に記載された）ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取り密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークをＰＲＰＦ３エクソン領域およびイントロン領域に一致させられるように、（読み取りシグナルの下に）ＵＣＳＣゲノムブラウザによってＰＲＰＦ３の模式図（縮尺通りに描かれている）が提供される。このディスプレイに基づいて、ＰＲＰＦ３中の２つのイントロン（１２および１３、矢印で示され、ＮＭ＿００４６９８はイントロン１２に、ＮＭ＿００４６９８はイントロン１３に、それぞれ対応する）と、ＰＲＰＦ８における１つのイントロン（３１、矢印によって示され、ＮＭ＿００６４４５に対応する、イントロン３１）（図７）を特定し、これはＡＲＰＥ－１９細胞の核分画において高い読み取り密度を有するが、これらの細胞の細胞質分画においては読み込みが非常に低いか無い（図３の下図のイントロン１２、図５の下図の１３、図５の下図のイントロン３１について示されているとおりである）。これは、イントロンが保持されたこと、および、イントロン１２、イントロン１３、およびイントロン３１含有転写産物が核内に残っていることを示し、かつ、これらの保持されたＰＲＰＦ３およびＰＲＰＦ８ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、細胞質に排出されないので、それぞれ非生産的であることを示唆している。

【0143】

実施例２：保持されたイントロンを標的とするＡＳＯウォークの設計
ＡＳＯウォークは、本明細書に記載の方法を用いてＰＲＰＦ３のイントロン１２を標的化するように設計された（図４）。ヌクレオチド＋６から＋４９８に及ぶイントロン１２の５’スプライス部位のすぐ下流の領域と、ヌクレオチド－１６から－４９６に及ぶイントロン１２の３’スプライス部位のすぐ上流の領域とが、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、５ヌクレオチド間隔で移動させた１８ｍｅｒ ＡＳＯ（ＡＳＯ Ｐ３－ＩＶＳ１２＋２８を除く）で標的とされた。

【0144】

ＡＳＯウォークは、本明細書に記述された方法を使用して、ＰＲＰＦ３のイントロン１３を標的とするように設計された（図６）。ヌクレオチド＋６から＋１４６に及ぶイントロン１３の５’スプライス部位のすぐ下流の領域と、ヌクレオチド－１６から－４９６に及ぶイントロン１３の３’スプライス部位のすぐ上流の領域とが、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、５ヌクレオチド間隔でシフトした１８ｍｅｒ ＡＳＯ（ＡＳＯｓ Ｐ３－ＩＶＳ１３＋１５、Ｐ３－ＩＶＳ１３＋３１、および Ｐ３－ＩＶＳ１３－４７を除く）で標的とされた。

【0145】

ＡＳＯウォークは、本明細書に記述された方法を使用して、ＰＲＰＦ８のイントロン３１を標的とするように設計された（図８）。ヌクレオチド＋６から＋１５６に及ぶイントロン３１の５’スプライス部位のすぐ下流の領域と、ヌクレオチド－１６から－１５６に及ぶイントロン３１の３’スプライス部位のすぐ上流の領域とが、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、５ヌクレオチド間隔でシフトした１８ｍｅｒ ＡＳＯで標的とされた。

【0146】

表１は、設計された例示的なＡＳＯおよびそれらの標的配列を列挙する。

【0147】

【表1】

【0148】

実施例３：ＰＲＰＦ３イントロン１２のＡＳＯ標的化による改善したスプライシング効率は転写レベルを増加させる
標的遺伝子イントロンスプライシング効率の増加がＡＳＯで達成できるかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法を用いた。ＡＲＰＥ－１９細胞、すなわちヒトの網膜の上皮細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），ＵＳＡ）を偽トランスフェクト（ｍｏｃｋ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）し、または表１に記載の標的化ＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、供給元の仕様書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクトする。簡潔に述べると、ＡＳＯを９６ウェル組織培養プレートに播種し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈したＲＮＡｉＭａｘと組み合わせる。トリプシンを用いて細胞を剥離し、完全培地に再懸濁し、約２５，０００個の細胞をＡＳＯトランスフェクション混合物に加える。トランスフェクション実験は三通りのプレート複製において実行される。最終的なＡＳＯ濃度は８０ｎＭであった。供給元の仕様書に従って、培地をトランスフェクションの６時間後に交換し、細胞をＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ溶解試薬を用い、ＤＮＡｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で試薬を補充し、２４時間で採取する。供給元の仕様書に従い、ｃＤＮＡはＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ ＲＴ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で産生される。対象のイントロンでのスプライシングの量を定量化するために、対応するエクソン－エクソン連結（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に及ぶプローブでＴａｑｍａｎアッセイを用いて、定量ＰＣＲを実行する。Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で、供給元の仕様書に従い実行される。標的遺伝子アッセイ値を、ＲＰＬ３２（ｄｅｌｔａＣｔ）およびプレート一致偽トランスフェクションサンプル（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して正規化し、モック定量（２＾－（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して倍率変化を産生する。３つのプレート複製のモック（ｍｏｃｋ）に対する平均倍率変化をプロットする（図１０）。標的遺伝子発現を増加させるいくつかのＡＳＯが特定され、図１０に示される通り、その標的イントロンでのスプライシングの増加が示唆された。標的イントロン（図９）の保持を確認する全トランスクリプトームデータと共に、これらの結果は、ＡＳＯが律速イントロンのスプライシング効率を改善し得ることを確認する。

【0149】

実施例４：ＰＲＰＦ３イントロン１３のＡＳＯ標的化による改善したスプライシング効率は転写レベルを増加させる
標的遺伝子イントロンスプライシング効率の増加がＡＳＯで達成できるかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法を用いた。ＡＲＰＥ－１９細胞、すなわちヒトの網膜の上皮細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），ＵＳＡ）を偽トランスフェクト（ｍｏｃｋ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）し、または表１に記載の標的化ＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、供給元の仕様書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクトする。簡潔に述べると、ＡＳＯを９６ウェル組織培養プレートに播種し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈したＲＮＡｉＭａｘと組み合わせる。トリプシンを用いて細胞を剥離し、完全培地に再懸濁し、約２５，０００個の細胞をＡＳＯトランスフェクション混合物に加える。トランスフェクション実験は三通りのプレート複製において実行される。最終的なＡＳＯ濃度は８０ｎＭであった。供給元の仕様書に従って、培地をトランスフェクションの６時間後に交換し、細胞をＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ溶解試薬を用い、ＤＮＡｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で試薬を補充し、２４時間で採取する。供給元の仕様書に従い、ｃＤＮＡはＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ ＲＴ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で産生される。対象のイントロンでのスプライシングの量を定量化するために、対応するエクソン－エクソン連結（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に及ぶプローブでＴａｑｍａｎアッセイを用いて、定量ＰＣＲを実行する。Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で、供給元の仕様書に従い実行される。標的遺伝子アッセイ値を、ＲＰＬ３２（ｄｅｌｔａＣｔ）およびプレート一致偽トランスフェクションサンプル（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して正規化し、モック定量（２＾－（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して倍率変化を産生する。３つのプレート複製のモック（ｍｏｃｋ）に対する平均倍率変化をプロットする（図１０、図１２）。標的遺伝子発現を増加させるいくつかのＡＳＯが特定され、図１２に示される通り、その標的イントロンでのスプライシングの増加が示唆された。標的イントロン（図１１）の保持を確認する全トランスクリプトームデータと共に、これらの結果は、ＡＳＯが律速イントロンのスプライシング効率を改善し得ることを確認する。

【0150】

実施例５：ＰＲＰＦ８イントロン３１のＡＳＯ標的化による改善したスプライシング効率は転写レベルを増加させる
標的遺伝子イントロンスプライシング効率の増加がＡＳＯで達成できるかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法を用いた。ＡＲＰＥ－１９細胞、すなわちヒトの網膜の上皮細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），ＵＳＡ）を偽トランスフェクト（ｍｏｃｋ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）し、または表１に記載の標的化ＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、供給元の仕様書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクトする。簡潔に述べると、ＡＳＯを９６ウェル組織培養プレートに播種し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈したＲＮＡｉＭａｘと組み合わせる。トリプシンを用いて細胞を剥離し、完全培地に再懸濁し、約２５，０００個の細胞をＡＳＯトランスフェクション混合物に加える。トランスフェクション実験は三通りのプレート複製において実行される。最終的なＡＳＯ濃度は８０ｎＭであった。供給元の仕様書に従って、培地をトランスフェクションの６時間後に交換し、細胞をＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ溶解試薬を用い、ＤＮＡｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で試薬を補充し、２４時間で採取する。供給元の仕様書に従い、ｃＤＮＡはＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ ＲＴ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で産生される。対象のイントロンでのスプライシングの量を定量化するために、対応するエクソン－エクソン連結（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に及ぶプローブでＴａｑｍａｎアッセイを用いて、定量ＰＣＲを実行する。Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で、供給元の仕様書に従い実行される。標的遺伝子アッセイ値を、ＲＰＬ３２（ｄｅｌｔａＣｔ）およびプレート一致偽トランスフェクションサンプル（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して正規化し、モック定量（２＾－（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して倍率変化を産生する。３つのプレート複製のモック（ｍｏｃｋ）に対する平均倍率変化をプロットする（図１４）。標的遺伝子発現を増加させるいくつかのＡＳＯが特定され、図１４に示される通り、その標的イントロンでのスプライシングの増加が示唆された。標的イントロン（図１３）の保持を確認する全トランスクリプトームデータと共に、これらの結果は、ＡＳＯが律速イントロンのスプライシング効率を改善し得ることを確認する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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