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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-07
(45)【発行日】2022-04-15
(54)【発明の名称】ＫＩＲＲＥＬ２及びＫＩＲＲＥＬ２抑制剤の新規用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20220408BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220408BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220408BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220408BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713 ZNA
A61K39/395 D
A61P35/00
A61P37/04
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020538898
(86)(22)【出願日】2019-01-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-07-01
(86)【国際出願番号】 KR2019000511
(87)【国際公開番号】W WO2019139429
(87)【国際公開日】2019-07-18
【審査請求日】2020-10-06
(31)【優先権主張番号】62/616,776
(32)【優先日】2018-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520077986
【氏名又は名称】ゲノム アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ユン，キョン‐ワン
(72)【発明者】
【氏名】ソン，チンヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ユン・ヨン
(72)【発明者】
【氏名】イ，スロ
(72)【発明者】
【氏名】ホウ，ヨン・キュン
(72)【発明者】
【氏名】チュン，チュ‐ヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，アルム
【審査官】福山 則明
(56)【参考文献】
【文献】Nephrol Dial Transplant，2012年，Vol. 27，pp. 1737-1745
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ３３／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を有効成分として含み、ここで、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ２遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な様式で結合するｓｉＲＮＡであるか、もしくは、ＫＩＲＲＥＬ２タンパク質に特異的に結合する抗体である、がん治療または予防用の薬学的組成物。
【請求項2】
前記がんは、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、結腸癌、小腸癌、膵癌、脳癌、骨癌、黒色腫、乳癌、硬化性腺症、子宮癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、肉腫、前立腺癌、尿道癌、膀胱癌、血液癌、リンパ腫、または線維腺腫であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、がん細胞のＴ細胞回避機能を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を有効成分として含み、ここで、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ２遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な様式で結合するｓｉＲＮＡであるか、もしくは、ＫＩＲＲＥＬ２タンパク質に特異的に結合する抗体である、個体の免疫増強用の薬学的組成物。
【請求項5】
個体内のＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性を抑制してＴ－細胞媒介性免疫反応の水準を増大させることを特徴とする、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
免疫欠乏、免疫低下または免疫系損傷による疾患の予防、治療または改善を必要とする個体に使用することを特徴とする、請求項４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１８年１月１２日に出願された米国出願番号６２／６１６，７７６を優先権で主張し、その開示内容は、本明細書に全体として参照により挿入される。
【0002】
本発明は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を含むがん治療または予防用薬学的組成物、及びＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を個体に投与することでがんを治療または予防する方法に関する。また、本発明は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を含む免疫増強用薬学的組成物、及びＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を個体に投与することで免疫力を増加させる方法に関する。また、本発明は、ＫＩＲＲＥＬ２を利用した抗がん剤スクリーニング方法、及びがん予後分析に必要な情報を提供する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
過去数年間、がんに関する集中的な研究がなされたにもかかわらず、依然として、がんは、全世界的に主要な死亡原因である。多数のがん治療法が開発されたが、全てのがん腫に対して、そして全ての患者に対して効果的ではない。がんを治療するために、現在、ほとんど使用されている方法は、相対的に非選択的である。手術により疾病を持つ組織を除去したり、放射線治療により固形腫瘍の大きさを減少させたり、化学治療によりがん細胞を速く死滅させたりする。特に、化学治療は、薬物に対する耐性を発達させることがあり、一部の場合は、投与可能な容量を制限して、結局、潜在的に有効な薬物の使用を排除させる程度に深刻な副作用を引き起こす。従って、ターゲット特異的で、より効果的ながん治療の開発が急を要している。
【0004】
人体適応免疫体系は、がん細胞を特異的に除去できる非常に精巧なシステムである。特に、Ｔ細胞の場合、細胞性適応免疫を決定する役割を果たし、細胞が非自己または非正常な抗原に露出される場合、抗原を認知して除去する。Ｔ細胞の場合、１細胞当たり約２０，０００－４０，０００ＴＣＲ分子を発現し、ＡＰＣの１００，０００ｐＭＨＣ分子のうちいくつかの抗原（ペプチド配列により決定）を特異的に認知して信号伝達を開始するようになる。このようなＴＣＲ分子は、非常に精巧で、微妙な抗原変化を認知して信号を伝達しなければならない高感度センサとしての役割を果たさなければならない。このような細胞性適応免疫は、非常に精巧に作動されてがん細胞を効果的に除去できなければならない。仮に、抗原特異的適応免疫体系が正常に作動しなくなると、がん細胞除去機能に深刻な問題をもたらす。例えば、がん細胞の表面にあるタンパク質ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２がＴ細胞の表面にあるタンパク質ＰＤ－１と結合すると、Ｔ細胞は、がん細胞を攻撃できない。従って、効果的ながん治療のために、Ｔ細胞ががん細胞を除去するのに妨げられる要素を除去することが必要である。
【0005】
そこで、本発明者らは、人体免疫体系を利用したがん治療方法を見出すために研究を進行した結果、ＫＩＲＲＥＬ２の活性及び発現の阻害ががんの発達、成長、浸潤及び転移を顕著に抑制することを確認することで本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の一目的は、がん治療または予防用薬学組成物を提供することである。
【0007】
本発明の他の目的は、免疫増強用薬学的組成物に関するものである。
【0008】
本発明のまた他の目的は、抗がん剤スクリーニング方法を提供することである。
【0009】
本発明のまた他の目的は、がん予後分析に必要な情報を提供する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を有効成分として含む、がん治療または予防用薬学的組成物、及びＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を個体に投与することでがんを治療または予防する方法を提供する。
【0011】
用語「ＫＩＲＲＥＬ２（Ｋｉｎ ｏｆ ＩＲＲＥ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）」は、ＫＩＲＲＥＬ２遺伝子によりコーディングされるタンパク質であり、第１型膜貫通タンパク質及び細胞接着分子の免疫グロブリン上科（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属し、主に膵β細胞の接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に位置し、インスリン分泌を調節するものと知られている。前記ＫＩＲＲＥＬ２は、ＮＥＰＨタンパク質ファミリーの構成員であり、「ＮＥＰＨ３」とも命名される。
【0012】
前記ＫＩＲＲＥＬ２は、ヒト由来ＫＩＲＲＥＬ２であってよい。より具体的に、前記ＫＩＲＲＥＬ２のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩに開示されたＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿９５４６４９．３の配列を含むことができる。また、前記ＫＩＲＲＥＬ２のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿９５４６４９．３の配列と８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性を有する配列であってよいが、これに限定されるものではなく、ＫＩＲＲＥＬ２の特性または機能を示すアミノ酸配列であればいずれも含まれる。
【0013】
前記ＫＩＲＲＥＬ２の遺伝子は、ヒト由来ＫＩＲＲＥＬ２のアミノ酸配列をコーディングする核酸配列を含むか、またはＮＣＢＩに開示されたＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿１９９１８０．３の核酸配列を含むことができる。また、前記ＫＩＲＲＥＬ２の核酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿１９９１８０．３の配列と８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性を有する配列であってよいが、これに限定されるものではなく、ＫＩＲＲＥＬ２の特性または機能を示すアミノ酸を生産できる核酸配列であればいずれも含まれる。
【0014】
用語「ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤」は、ＫＩＲＲＥＬ２の活性または発現を阻害する物質を意味する。ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、好ましくは、がん細胞のＴ細胞回避機能を阻害できる。ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤ががん細胞に存在するＫＩＲＲＥＬ２の活性を遮断することで、Ｔ細胞がＫＩＲＲＥＬ２によりがん細胞を攻撃できなくなる作用機序を抑制し、またＴ細胞のがん細胞に対する免疫活性を維持させることができる。または、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ２タンパク質に特異的に結合してＫＩＲＲＥＬ２とＴ細胞の結合を妨害するか、またはＫＩＲＲＥＬ２の特定代謝経路を阻害してタンパク質発現を減少させるか活性を有することができないように変性させることができる。従って、本発明に係るＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、がん治療または予防に非常に効果的である。前記ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ２の活性または発現を阻害する物質であれば、化合物、タンパク質、融合タンパク質、抗体、アミノ酸、ペプチド、ウイルス、炭水化物、脂質、核酸、抽出物、分画物等を含むことができ、これに限定されるものではない。
【0015】
一具現例において、前記ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理されていないがん細胞に対比してがん細胞内のＫＩＲＲＥＬ２発現を減少させるものであってよい。前記ＫＩＲＲＥＬ２発現の減少は、ＫＩＲＲＥＬ２遺伝子から生成するｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の水準が減少したか除去されたことを意味し得る。前記ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、例えば、ＫＩＲＲＥＬ２遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム等を含むことができ、これに限定されるものではない。
【0016】
用語「アンチセンス核酸」は、特定ｍＲＮＡの配列に対して相補的な核酸配列を含有しているＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの断片または誘導体を意味し、ｍＲＮＡの配列に相補的に結合または混成化してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する作用をする。
【0017】
用語「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」は、特定ｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を通してＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導できる短い二重鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、遺伝子ノックダウン方法または遺伝子治療方法等に使用される。
【0018】
用語「ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）」は、一本鎖ＲＮＡであって、水素結合により二本鎖部分を形成するステム（ｓｔｅｍ）部分と、環状を帯びるループ（ｌｏｏｐ）部分とに区分され、Ｄｉｃｅｒ等のタンパク質によりプロセシングされてｓｉＲＮＡに変換され、ｓｉＲＮＡと同じ機能を果たすことができる。
【0019】
用語「ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）」は、標的ＲＮＡの分解を促進させるか、またはこれらの翻訳を抑制させることで遺伝子発現を転写後に調節する２１～２３個の非コーディングＲＮＡをいう。
【0020】
用語「リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」は、特定塩基配列を認識して自体的にそれを切断する酵素のような機能を有するＲＮＡ分子を意味する。リボザイムは、ターゲットメッセンジャーＲＮＡ鎖の相補的な塩基配列に特異性を有して結合する領域と、ターゲットＲＮＡを切断する領域とで構成される。
【0021】
前記ＫＩＲＲＥＬ２遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム等は、ＫＩＲＲＥＬ２のｍＲＮＡの翻訳、細胞質内への転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）または他の任意のＫＩＲＲＥＬ２の生物学的機能に対する必須な活性を阻害できる。
【0022】
一具現例において、前記ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理されていないがん細胞と比較してがん細胞内のＫＩＲＲＥＬ２機能を不活性化させるか活性を減少させるものであってよい。前記ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、例えば、ＫＩＲＲＥＬ２タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、融合タンパク質、抗体、アプタマー等を含むことができ、これに限定されるものではない。
【0023】
用語「特異的」は、細胞内で他のタンパク質に影響を及ぼさず、標的タンパク質にのみ結合する能力を意味する。
【0024】
用語「抗体」は、単一クローン抗体、キメラ抗体、多クローン抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を含み、新規抗体の他に既に当該技術の分野において公知または市販の抗体も含まれる。前記抗体は、ＫＩＲＲＥＬ２に特異的に結合する限り、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む全長の形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含む。前記抗体分子の機能的な断片は、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、ここには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等が含まれ得るが、これに限定されるものではない。
【0025】
用語「ペプチドミメティクス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、ＫＩＲＲＥＬ２活性を誘導するＫＩＲＲＥＬ２タンパク質の結合ドメインを抑制するペプチドまたは非ペプチドである。
【0026】
用語「アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）」は、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）を意味する。
【0027】
本発明の薬学的組成物に含まれるＫＩＲＲＥＬ２の活性または発現を阻害する物質は、ＫＩＲＲＥＬ２がＴ細胞の機能を抑制することを阻害することができ、これによって、Ｔ細胞ががん細胞を攻撃できる機能を維持または促進させる作用をすることができる。ここで、ＫＩＲＲＥＬ２の活性または発現を阻害する物質で処理した群において、Ｔ細胞のがん細胞攻撃能力は、非処理群に比して５％～２００％増加し得る。従って、本発明の薬学的組成物は、がんの予防または治療に有用に使用され得る。
【0028】
本発明の薬学的組成物が治療または予防できるがんには、例えば、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、結腸癌、小腸癌、膵癌、脳癌、骨癌、黒色腫、乳癌、硬化性腺症、子宮癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎癌、肉腫、前立腺癌、尿道癌、膀胱癌、血液癌、白血病、リンパ腫、線維腺腫等が含まれ、これに限定されるものではない。
【0029】
本発明に係る薬学的組成物は、前記有効成分を単独で含有するか、または一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤、保存剤等をさらに含有することができる。
【0030】
薬学的に許容される担体は、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体を含むことができる。前記経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等を含むことができる。前記非経口投与用担体は、水、適した油、食塩水、水性グルコース、グリコール等を含むことができる。薬学的に許容される安定化剤は、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤等がある。薬学的に許容される保存剤は、塩化ベンザルコニウム、メチル－またはプロピル－パラベン、クロロブタノール等がある。その他の薬学的に許容される担体としては、文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に記載されているものを参考にすることができる。
【0031】
本発明の薬学的組成物は、ヒト等の動物に任意の方法で、例えば、経口または非経口的に投与できる。前記非経口的投与方法としては、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下、直腸内投与等であってよく、これに限定されない。
【0032】
本発明の薬学的組成物は、上述したような投与経路によって経口投与用製剤または非経口投与用製剤に剤形化することができる。
【0033】
前記経口投与用製剤は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等の形態に当業界に公知になった方法によって本発明の組成物を剤形化したものであってよい。例えば、本発明の有効成分を賦形剤と配合し、適した補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することで、経口投与のための錠剤または糖衣錠剤を収得することができる。前記賦形剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトール等を含む糖類と、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン及びジャガイモデンプン等を含むデンプン類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル－セルロース等を含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤が含まれ得るが、これに限定されるものではない。選択的に、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム等を崩壊剤として添加できる。また、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤等をさらに含むことができる。
【0034】
前記非経口投与用製剤は、注射剤、ゲル剤、エアロゾル、鼻腔吸入剤の形態に当業界に公知になった方法によって本発明の組成物を剤形化したものであってよい。
【0035】
これらの剤形は、文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒの記載内容を参考にすることができる。
【0036】
本発明に係る薬学的組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で個体に投与され得、または多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与され得る。
【0037】
本発明の薬学的組成物の適切な有効投与量または有効成分の含量は、投与経路、投与回数、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率等の多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量を考慮し、当該分野における通常の知識を有する者が決定できるだろう。例えば、本発明の薬学的組成物の全容量は、１日当たり、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ～１，０００ｍｇ、または０．１μｇ～１００ｍｇであってよい。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路、投与方法に特に制限されない。
【0038】
また、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を有効成分として含む、個体の免疫増強用薬学的組成物を提供する。
【0039】
本発明の薬学的組成物を免疫増強を必要とする個体に投与する場合、個体内のＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性を全体または部分的に減少させ、Ｔ－細胞媒介性免疫反応の水準を増大させることができる。
【0040】
これによって、本発明の薬学的組成物は、免疫増強の用途に使用することができる。例えば、免疫欠乏、免疫低下または免疫系損傷による疾患の予防、治療または改善を必要とする個体に使用することができる。
【0041】
また、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を個体に投与するステップを含む、がん治療または予防方法を提供する。また、本発明の一様態は、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を個体に投与するステップを含む、個体の免疫増強方法を提供する。これらの方法において、特に断りのない限り、関連用語は、先に薬学的組成物で説明された用語と同じ意味を有するものと理解される。
【0042】
また、本発明の一様態は、下記ステップを含む抗がん剤スクリーニング方法を提供する。
（ａ）抗がん剤候補物質でがん細胞を処理するステップ、及び、
（ｂ）前記がん細胞内のＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性を測定するステップ。
（ａ）抗がん剤候補物質でがん細胞を処理するステップ、及び、
（ｂ）前記がん細胞内のＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性を測定するステップ。
【0043】
選択的に、前記抗がん剤スクリーニング方法は、抗がん剤候補物質で処理していない群に比して抗がん剤候補物質で処理した群でＫＩＲＲＥＬ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準が減少するか、またはＫＩＲＲＥＬ２によるＴ細胞の活性抑制水準が減少する場合、前記抗がん剤候補物質を抗がん剤であるものと判断するステップをさらに含むことができる。ここで、前記水準が減少するということは、有意的に減少することを意味し得る。例えば、前記水準が減少することまたは有意的に減少することは、５％～９５％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％）減少した量を意味するものであってよい。前記抗がん剤候補物質で処理していない群は、何の物質も添加されていないがん細胞であるか、またはＫＩＲＲＥＬ２の活性または発現抑制物質でない抗がん剤等の他の物質で処理されたがん細胞であってよい。
【0044】
用語「スクリーニング」は、タンパク質、融合タンパク質、抗体、ペプチド、抗生物質、酵素、化合物等の物質に対して感受性または活性等の特定性質を有している特定物質を見つけることを意味する。
【0045】
用語「抗がん剤候補物質」は、通常の選定方式によってＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性を抑制できるものと推定されるか、または無作為に選定された核酸、タンパク質、抗体、化合物、抽出物または天然物等であってよい。前記抗がん剤候補物質は、好ましくは、ＫＩＲＲＥＬ２の発現及び／または活性を阻害する物質であってよい。
【0046】
前記ＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性の測定は、ＫＩＲＲＥＬ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定するか、またはＫＩＲＲＥＬ２によるＴ細胞の活性抑制程度を測定することにより遂行され得る。
【0047】
前記ＫＩＲＲＥＬ２のｍＲＮＡの発現水準を測定する方法は、当該技術の分野において公知になった方法を利用することができ、例えば、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロット、ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ等を利用することができるが、これに制限されない。
【0048】
前記ＫＩＲＲＥＬ２のタンパク質の発現水準を測定する方法は、当該技術の分野において公知になった方法を利用することができ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析法、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ等を利用することができるが、これに制限されない。
【0049】
前記ＫＩＲＲＥＬ２によるＴ細胞の活性抑制程度を測定する方法は、当該技術の分野において公知になった方法を利用することができ、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ等を利用することができるが、これに制限されない。
【0050】
また、本発明のスクリーニング方法において、ＫＩＲＲＥＬ２活性抑制確認は、ＫＩＲＲＥＬ２タンパク質と候補物質を反応させた後、活性を測定する方法、酵母二重混成法（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）、ＫＩＲＲＥＬ２タンパク質に結合するファージディスプレイペプチドクローン（ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｌｏｎｅ）の検索、天然物及び化学物質ライブラリ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）等を利用したＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、ドラッグヒットＨＴＳ（ｄｒｕｇ ｈｉｔ ＨＴＳ）、細胞基盤スクリーニング（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、またはＤＮＡアレイ（ＤＮＡ ａｒｒａｙ）を利用するスクリーニング法等を使用することができる。
【0051】
前記抗がん剤スクリーニング方法は、イン・ビトロまたはイン・ビボで全て可能である。イン・ビボの場合、前記抗がん剤候補物質でがん細胞を処理するステップは、抗がん剤候補物質をがん細胞を持つ個体またはがん疾患を持っている個体に投与することで遂行され得る。前記個体は、例えば、ヒト、マウス等のような動物であってよい。
【0052】
前記抗がん剤スクリーニング方法は、ＫＩＲＲＥＬ２の活性または発現を抑制すると、がん細胞のＴ細胞回避機能を阻害できるという本発明において新規で明らかにした点に基づく。本発明のスクリーニング方法によれば、新規抗がん剤を安価で簡単な方法で容易に開発できるので非常に有利である。
【0053】
また、本発明の一様態は、個体から分離した細胞または組織でＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性を測定するステップを含むがん予後分析に必要な情報を提供する方法を提供する。
【0054】
前記方法において、ＫＩＲＲＥＬ２の発現または活性及びその測定と関連した用語は、特に断りのない限り、前記組成物及び前記スクリーニング方法において説明したものと同一である。
【0055】
用語「予後」は、疾病の進行、疾病の改善、疾病の再発、転移及び死亡可能性の側面での予測を指す。例えば、本発明における予後は、がん患者の疾病が完治するか、患者の状態が改善される可能性を意味する。
【0056】
前記個体から分離した細胞または組織は、がん細胞であるか、またはがんが発生したか、がん細胞が存在する組織であってよい。
【0057】
前記がん予後分析に必要な情報を提供する方法は、がん細胞のＫＩＲＲＥＬ２の活性または発現水準が低いほどＴ細胞の活性が高くなり、これによってがん治療効果が高くなり得るという点に基づく。
【0058】
本明細書において使用される単数は、文法的に一つまたは複数を指すものである。例えば、「成分」は、一つの成分または一つより多くの成分を意味する。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】ＫＩＲＲＥＬ２により阻害されるＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図2】ＫＩＲＲＥＬ２により阻害されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖率（％）を示す。
【図3A】肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図3B】肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図3C】肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図3D】肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図4A】結腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図4B】結腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図4C】結腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図4D】結腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図5A】乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図5B】乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図5C】乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図5D】乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図6A】胃癌細胞株ＭＫＮ－７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図6B】胃癌細胞株ＭＫＮ－７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図6C】胃癌細胞株ＭＫＮ－７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図6D】胃癌細胞株ＭＫＮ－７４とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図7A】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図7B】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図7C】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図7D】白血病細胞株Ｕ９３７とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したとき、ＰＢＭＣの細胞毒性（％）を示したものである。
【図8A】ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したマウスで腫瘍の大きさの変化を示したものである。
【図8B】ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤で処理したマウスで腫瘍の大きさの変化を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0060】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例】
【0061】
実施例１．Ｔ細胞活性に対するＫＩＲＲＥＬ２の抑制能
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ２がＴ細胞の増殖及び活性を阻害してがん細胞がＴ－細胞媒介免疫システムを回避するようにするか否かを確認しようとした。
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ２がＴ細胞の増殖及び活性を阻害してがん細胞がＴ－細胞媒介免疫システムを回避するようにするか否かを確認しようとした。
【0062】
１．１．ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の準備
ヒト血液をＥＤＴＡ（またはヘパリン）でコーティングされた１０ｍＬチューブに入れ、１：１の比率でＰＢＳと混合した。それから５０ｍＬチューブにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを入れ、前記血液試料を添加した。遠心分離した後、ヒトＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を回収した。回収された結果物を遠心分離し、上澄みを除去した。次いで、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ（１×）を添加し、ピペッティングした後、アイスで３分間保管した。次いで、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０ ５０ｍｌを添加し、混合物を遠心分離して上澄みを除去した。それから、ＦＡＣＳバッファを添加し、上澄みを遠心分離により除去した。その後、５０ｍｌのＭＡＣＳバッファ（０．５％ ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ包含ＰＢＳ）を添加し、細胞数をカウンティングし、遠心分離により上澄みを除去した。
ヒト血液をＥＤＴＡ（またはヘパリン）でコーティングされた１０ｍＬチューブに入れ、１：１の比率でＰＢＳと混合した。それから５０ｍＬチューブにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを入れ、前記血液試料を添加した。遠心分離した後、ヒトＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を回収した。回収された結果物を遠心分離し、上澄みを除去した。次いで、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ（１×）を添加し、ピペッティングした後、アイスで３分間保管した。次いで、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０ ５０ｍｌを添加し、混合物を遠心分離して上澄みを除去した。それから、ＦＡＣＳバッファを添加し、上澄みを遠心分離により除去した。その後、５０ｍｌのＭＡＣＳバッファ（０．５％ ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ包含ＰＢＳ）を添加し、細胞数をカウンティングし、遠心分離により上澄みを除去した。
【0063】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を１×１０７細胞数基準４０μｌ ＭＡＣＳバッファを利用して再懸濁させ、チューブにそれぞれ入れた後、５分間冷蔵庫に保管した。その後、１×１０７細胞数基準ＭＡＣＳバッファ３０μｌを前記生成物に添加し、抗－ビオチンマイクロビーズ２０μｌを添加して混合した。次いで、ＬＳカラムを利用してＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、細胞数をカウンティングした。
【0064】
このように準備されたＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を２×１０６細胞数基準ＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）１μｌと混合し、３７℃で３分間保管した。それからＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞をそれぞれ含有しているチューブにＦＢＳを添加し、１０分間アイスで保管した。その後、遠心分離により上澄みを除去した。生成物にＦＡＣＳバッファ３０ｍｌを添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。それから１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０を添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。その後、生成物を１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０ １０ｍｌと混合した後、細胞数をカウンティングした。
【0065】
１．２．Ｔ細胞の活性測定
組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０－ＨＧ）及び組換えヒトＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１ Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６－Ｂ７）をＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓで購入し、組換えヒトＫＩＲＲＥＬ２ Ｆｃ Ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６７４－Ｈ０２Ｈ）をＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌで購入した。
組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０－ＨＧ）及び組換えヒトＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１ Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６－Ｂ７）をＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓで購入し、組換えヒトＫＩＲＲＥＬ２ Ｆｃ Ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６７４－Ｈ０２Ｈ）をＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌで購入した。
【0066】
これらのｐｒｏｔｅｉｎそれぞれの１０μｇ／ｍｌをＰＢＳ中ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３２５）１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、または６．０μｇ／ｍｌと混合した。生成した混合物で９６－ウェルプレートを４℃でコーティングし、ＰＢＳで３回洗浄した。
【0067】
先に実施例１．１において準備したＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞を９６－ウェルプレートのウェル毎に２００μｌずつ２×１０６個添加し、インキュベーションした。
【0068】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体により７２時間の間活性化させた。ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ染色の程度により確認することができ、それは、ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してフローサイトメトリーにより分析した。
【0069】
【0070】
ＰＤ－Ｌ１で処理した対照群は、ＩｇＧ１で処理した対照群に比してＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖が全て抑制された。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞表面にあるタンパク質ＰＤ－１と結合し、Ｔ細胞の増殖を抑制する。これによって、Ｔ細胞ががん細胞を攻撃し、殺傷する機能を低下させる結果をもたらす。
【0071】
ＫＩＲＲＥＬ２で処理した群は、ＩｇＧ１で処理した対照群及びＰＤ－Ｌ１で処理した対照群の全てに対比してＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖が顕著に抑制された。これは、ＫＩＲＲＥＬ２がＴ細胞の増殖を抑制する機能がＰＤ－Ｌ１よりもさらに大きいということを意味する。従って、ＫＩＲＲＥＬ２をブロッキングするかノックダウンさせることで中和させればＫＩＲＲＥＬ２のＴ細胞増殖抑制能を低下させることができるようになる。その結果、効率的ながん治療が可能となる。
【0072】
実施例２．ＰＢＭＣ細胞毒性アッセイ
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ２をＫＩＲＲＥＬ２抑制剤により利用して中和させたとき、ＰＢＭＣのがん細胞に対する細胞毒性、即ち、殺傷能を増加させることができるか否かを確認しようとした。
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ２をＫＩＲＲＥＬ２抑制剤により利用して中和させたとき、ＰＢＭＣのがん細胞に対する細胞毒性、即ち、殺傷能を増加させることができるか否かを確認しようとした。
【0073】
２．１．ＰＢＭＣの準備
ヒト血液をＥＤＴＡ（またはヘパリン）でコーティングされた１０ｍＬチューブに入れ、１：１の比率でＰＢＳと混合した。それから５０ｍＬチューブにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを入れ、前記血液試料を添加した。遠心分離した後、ヒトＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を回収した。回収された結果物を遠心分離し、上澄みを除去した。次いで、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ（１×）を添加し、ピペッティングした後、アイスで３分間保管した。次いで、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０ ５０ｍｌを添加し、混合物を遠心分離して上澄みを除去した。それから、ＦＡＣＳバッファを添加し、上澄みを遠心分離により除去した。その後、５０ｍｌのＭＡＣＳバッファ（０．５％ ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ包含ＰＢＳ）を添加し、細胞数をカウンティングし、遠心分離により上澄みを除去した。
ヒト血液をＥＤＴＡ（またはヘパリン）でコーティングされた１０ｍＬチューブに入れ、１：１の比率でＰＢＳと混合した。それから５０ｍＬチューブにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを入れ、前記血液試料を添加した。遠心分離した後、ヒトＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を回収した。回収された結果物を遠心分離し、上澄みを除去した。次いで、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ（１×）を添加し、ピペッティングした後、アイスで３分間保管した。次いで、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０ ５０ｍｌを添加し、混合物を遠心分離して上澄みを除去した。それから、ＦＡＣＳバッファを添加し、上澄みを遠心分離により除去した。その後、５０ｍｌのＭＡＣＳバッファ（０．５％ ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ包含ＰＢＳ）を添加し、細胞数をカウンティングし、遠心分離により上澄みを除去した。
【0074】
９６－ウェルプレートを４℃でＰＢＳ中ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３２５）１．０μｇ／ｍｌでコーティングした。９６－ウェルプレートのウェルは、ＰＢＭＣを添加する前にＰＢＳで３回洗浄した。先に収得したＰＢＭＣを１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０と混合し、９６－ウェルプレートの各ウェル毎に６×１０５個を１００μｌずつ添加した。ＰＢＭＣは、７２時間の間、ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体により活性化させた。
【0075】
２．２．がん細胞の準備
肺癌細胞株Ｈ１１２９、結腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、胃癌細胞株ＭＫＮ－７４、及び白血病細胞株Ｕ９３７をそれぞれ１μｌのＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）と混合し、３７℃で３分間保管した。その後、それぞれの細胞株を含有したチューブにＦＢＳを添加し、１０分間ｉｃｅで保管した。次いで、上澄みを遠心分離により除去した。これによって収得された生成物にＦＡＣＳバッファ３０ｍｌを添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。それから１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０を添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。これによって収得された生成物を１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０ １０ｍｌと混合した後、細胞数をカウンティングした。
肺癌細胞株Ｈ１１２９、結腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、胃癌細胞株ＭＫＮ－７４、及び白血病細胞株Ｕ９３７をそれぞれ１μｌのＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）と混合し、３７℃で３分間保管した。その後、それぞれの細胞株を含有したチューブにＦＢＳを添加し、１０分間ｉｃｅで保管した。次いで、上澄みを遠心分離により除去した。これによって収得された生成物にＦＡＣＳバッファ３０ｍｌを添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。それから１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０を添加した後、ピペッティングし、遠心分離して上澄みを除去した。これによって収得された生成物を１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０ １０ｍｌと混合した後、細胞数をカウンティングした。
【0076】
前記がん細胞を、先に実施例２．１において準備した９６－ウェルプレートのＰＢＭＣ含有ウェル毎に１００μｌずつ３×１０４個添加し、インキュベーションした。
【0077】
２．３．がん細胞株に対するＰＢＭＣの細胞毒性の測定
先に実施例２．２においてＰＢＭＣ及びがん細胞株の混合物が準備された。これらの混合物をａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＫＩＲＲＥＬ２抗体１０μｇ／ｍＬまたはＫＩＲＲＥＬ２に対するｓｉＲＮＡ ５０ｎＭと共に２４時間の間、インキュベーションした。
先に実施例２．２においてＰＢＭＣ及びがん細胞株の混合物が準備された。これらの混合物をａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＫＩＲＲＥＬ２抗体１０μｇ／ｍＬまたはＫＩＲＲＥＬ２に対するｓｉＲＮＡ ５０ｎＭと共に２４時間の間、インキュベーションした。
【0078】
ＫＩＲＲＥＬ２をブロッキングするために６種の中和抗体を使用した実験群１乃至６と無処理対照群は、下記表１に示した。
【0079】
【表1】
【0080】
また、ＫＩＲＲＥＬ２をノックダウンするために３種のｓｉＲＮＡを使用した実験群７乃至９と無処理対照群は、下記表２に示した。
【0081】
【表2】
【0082】
ＰＢＭＣ及び細胞株の混合物とＫＩＲＲＥＬ２中和抗体またはＫＩＲＲＥＬ２ ｓｉＲＮＡをインキュベーションし、３日後に溶菌された細胞を確認するために、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で細胞を染色した。ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してＦＬ－１（ＣＦＳＥ）及びＦＬ－３（７－ＡＡＤ）に対する染色を測定することでがん細胞株に対するＰＢＭＣの細胞溶解能を確認した。
【0083】
２．４．結果
肺癌細胞株Ｈ１１２９に対する実験結果を図３Ａ乃至図３Ｄに示した。肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２中和抗体で処理したとき、図３Ａ乃至図３Ｃから見られるように、抗体の種類によって程度の差はあるが、無処理対照群に比して肺癌細胞殺傷能が有意的に増加したことを確認することができる。また、図３Ｄから見られるように、肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣの混合物をＫＩＲＲＥＬ２ ｓｉＲＮＡで処理した場合にも肺癌細胞殺傷能が有意的に増加したことが確認された。
肺癌細胞株Ｈ１１２９に対する実験結果を図３Ａ乃至図３Ｄに示した。肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣをＫＩＲＲＥＬ２中和抗体で処理したとき、図３Ａ乃至図３Ｃから見られるように、抗体の種類によって程度の差はあるが、無処理対照群に比して肺癌細胞殺傷能が有意的に増加したことを確認することができる。また、図３Ｄから見られるように、肺癌細胞株Ｈ１１２９とＰＢＭＣの混合物をＫＩＲＲＥＬ２ ｓｉＲＮＡで処理した場合にも肺癌細胞殺傷能が有意的に増加したことが確認された。
【0084】
結腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６に対する実験結果を図４Ａ乃至図４Ｄに示し、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する実験結果を図５Ａ乃至図５Ｄに示し、胃癌細胞株ＭＫＮ－７４に対する実験結果を図６Ａ乃至図６Ｄに示し、白血病細胞株Ｕ９３７に対する実験結果を図７Ａ乃至図７Ｄに示した。抗体またはｓｉＲＮＡを利用してＫＩＲＲＥＬ２を中和させたとき、肺癌に対するＰＢＭＣの殺傷能が増加する結果は、図４Ａ乃至図７Ｄから見られるように、結腸癌、乳癌、胃癌、白血病においても同様に確認された。
【0085】
実施例３．腫瘍マウスモデル実験
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ２をＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を利用して中和させたとき、マウス腫瘍の成長が抑制されるか否かをイン・ビボで確認しようとした。
本実施例においては、ＫＩＲＲＥＬ２をＫＩＲＲＥＬ２抑制剤を利用して中和させたとき、マウス腫瘍の成長が抑制されるか否かをイン・ビボで確認しようとした。
【0086】
３．１．腫瘍マウスモデル構築
Ｃ５７ＢＬ６結腸腺癌腫細胞に由来したＭＣ３８細胞株を５０μｌＰＢＳ中に２．０×１０５細胞数濃度で再懸濁させ、６週齢雌Ｃ５７ＢＬ６マウスの横腹に皮下注射した。
Ｃ５７ＢＬ６結腸腺癌腫細胞に由来したＭＣ３８細胞株を５０μｌＰＢＳ中に２．０×１０５細胞数濃度で再懸濁させ、６週齢雌Ｃ５７ＢＬ６マウスの横腹に皮下注射した。
【0087】
下記表３にＫＩＲＲＥＬ２をノックダウンするために２種のｓｉＲＮＡを使用した実験群１０及び１１と無処理対照群を示した。
【0088】
【表3】
【0089】
実験群１０及び１１は、ＭＣ３８細胞株を注射して１１日目になる日からマウスＫＩＲＲＥＬ２をターゲットするｓｉＲＮＡを５日間隔で計３回マウスの腫瘍に注射した。具体的に、ｓｉＲＮＡ１０μｇをＰＢＳ中オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）７．５μｌと製造会社の指示に従って混合した後、マウスに誘導した腫瘍組織に直接０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した。
【0090】
【0091】
無処理対照群は、マウスで腫瘍が生成した以降、持続的に成長することを確認することができた。これに対して、実験群１０及び１１のいずれにおいてもマウスの腫瘍は無処理対照群に比してその成長速度が顕著に抑制されることが分かる。これは、ＫＩＲＲＥＬ２をブロッキングまたはノックダウンさせてその活性または発現を抑制する場合、がんの発達が遅延または中止され、がんの発生が抑制されるということを示すものである。従って、ＫＩＲＲＥＬ２抑制剤は、がんを予防するために有用に使用され得る。
【0092】
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定具現例に対する多数の均等物を認知するか、または通常の実験だけで確認することができるだろう。このような均等物は、下記の請求項に含まれるものと意図される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【配列表】