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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-08
(45)【発行日】2022-04-18
(54)【発明の名称】Ｆｃガンマ受容体変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220411BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220411BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220411BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220411BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20220411BHJP
C07K 14/735 20060101ALI20220411BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220411BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220411BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220411BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220411BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220411BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
A61K38/17
A61K48/00
A61P37/06
C07K1/22
C07K14/735
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2019571392
(86)(22)【出願日】2018-09-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-09-24
(86)【国際出願番号】 KR2018010783
(87)【国際公開番号】W WO2019054782
(87)【国際公開日】2019-03-21
【審査請求日】2019-12-24
(31)【優先権主張番号】10-2017-0118769
(32)【優先日】2017-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2017-0118770
(32)【優先日】2017-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2017-0118771
(32)【優先日】2017-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2017-0132862
(32)【優先日】2017-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2017-0132863
(32)【優先日】2017-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2017-0132864
(32)【優先日】2017-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】512145572
【氏名又は名称】国民大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＯＫＩＭＩＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＡＣＡＤＥＭＹ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】７７， Ｊｅｏｎｇｎｅｕｎｇ－ｒｏ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，サン テク
(72)【発明者】
【氏名】ジョ，ミギャン
(72)【発明者】
【氏名】コ，サンファン
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ボラ
【審査官】中山 基志
(56)【参考文献】
【文献】特表２００２－５３１０８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５１０６８１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドであって、前記変異体は配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に置換され、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換され、１１９番目アミノ酸がバリン（Ｖ）に置換された配列を含むＦｃガンマ受容体変異体であることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項2】
Ｆｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドであって、前記変異体は配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に置換され、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換された配列を含むＦｃガンマ受容体変異体であり、
前記Ｆｃガンマ受容体変異体はバクテリア培養において発現し、野生型Ｆｃガンマ受容体と比較してヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上していることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項3】
Ｆｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドであって、前記変異体は配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に置換され、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換され、１１９番目アミノ酸がメチオニン（Ｍ）に置換された配列を含むＦｃガンマ受容体変異体であり、
前記Ｆｃガンマ受容体変異体は野生型Ｆｃガンマ受容体と比較してヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上していることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項4】
請求項３に記載のポリペプチドにおいて、さらに８６番目アミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）への置換、１２７番目アミノ酸のロイシン（Ｌ）への置換、及び１７１番目アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）への置換からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含むＦｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチド。
【請求項5】
請求項１に記載のポリペプチドにおいて、さらに５５番目アミノ酸のヒスチジン（Ｈ）への置換、及び１７１番目アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）への置換からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含むＦｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチド。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコーディングする、核酸分子。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項8】
請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載の核酸分子又は請求項７に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項10】
前記組成物は、試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を検出するためのものであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
請求項１０に記載の組成物を含む、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を検出するためのキット。
【請求項12】
前記組成物は免疫抑制用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項13】
前記組成物は、臓器移植反応抑制用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物は自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドと生理活性タンパク質又は生理活性ペプチドが結合されたタンパク質又はペプチド融合体であって、前記タンパク質又はペプチド融合体は体内持続性を維持することによって体内半減期が増加することを特徴とする、タンパク質又はペプチド融合体。
【請求項16】
下記の段階を含むＦｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドの製造方法。ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコーディングする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階、及び
ｂ）前記宿主細胞によって発現したポリペプチドを回収する段階。
【請求項17】
下記の段階を含む試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を精製する方法。ａ）ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を含む試料に請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドを混合して互いに結合させる段階、及び
ｂ）前記ポリペプチドが結合されたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を精製する段階。
【請求項18】
下記の段階を含むヒトＩｇＧ抗体又はヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上したＦｃガンマ受容体変異体をスクリーニングする方法。ａ）配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に置換され、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換された配列を含む人間Ｆｃガンマ受容体変異体ライブラリを構築する段階、及び
ｂ）前記ライブラリにおいて前記二つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体と比較してＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別する段階であり、前記二つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体は、バクテリア培養において発現するＦｃガンマ受容体変異体であり、野生型Ｆｃガンマ受容体と比較してヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上している、段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＩｇＧ抗体に対する結合力が向上したＦｃガンマ受容体変異体に関するものである。
【背景技術】
【0002】
人体兔疫細胞で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ）はＩｇＧ抗体Ｆｃ領域（ｌｏｗｅｒ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ及びｕｐｐｅｒ ＣＨ２ ｒｅｇｉｏｎ）に結合する。これらのＦｃガンマ受容体のうち、ＦｃγＲＩは血中ＩｇＧに最も高い親和度を持っているが、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）があまり良くなくて発現率が低いため、医療用に開発するか産業的適用を目的で開発するのに難しさがある。
【0003】
一方、ＦｃγＲＩＩａはマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）などの多様な兔疫細胞の表面で発現している細胞膜タンパク質で、ＩｇＧとの親和度は低い方にある受容体である（ＫＤ＝～１０－６）。ＦｃγＲＩＩａはＩｇＧ抗体Ｆｃ領域の上側部分（ｌｏｗｅｒ ｈｉｎｇｅｒ ｒｅｇｉｏｎとｕｐｐｅｒ ＣＨ２ ｒｅｇｉｏｎ）に結合し、細胞内部の信号伝逹メカニズムを介して該当兔疫細胞を活性化させる。
【0004】
体内に存在する野生型Ｆｃガンマ受容体よりＩｇＧに対して数等高い親和度を有する細胞外側領域に存在するＦｃガンマ受容体を溶解可能に生産して注入することができれば、自己細胞を抗原として認知した自己抗体が兔疫細胞の表面のＦｃガンマ受容体に結合することを効果的に阻害して、自己抗体（Ａｕｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ）が臓器に蓄積して自己細胞を外部の抗原として認知して炎症を引き起こす疾患である自己免疫疾患を治療するのに決定的に役立つことができる。
【0005】
また、一般に、抗体を除いた大部分のタンパク質医薬品は体内での持続時間が短く、血中半減期が２４時間を超えない。抗体ＩｇＧは飲作用（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって無作為に細胞内に入った後、弱酸性ｐＨの条件であるエンドソームでＦｃＲｎと結合して分解せずに中性ｐＨの血中に搬出されることにより約３週間体内に維持される特徴があり、Ｆｃガンマ受容体が抗体ＩｇＧと結合する過程を用いてタンパク質医薬品の血中半減期を増加させる融合パートナーとして開発可能である。
【0006】
ターゲット疾病に高い特異性と低い副作用を現すタンパク質医薬に対する需要が倦まず弛まず増加しており、これに応じてタンパク質医薬の効能及び安全性を改善するための研究が全世界的に活発に進んでいる。特に、タンパク質医薬の血中半減期（ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）は該当タンパク質の作用機序、副作用程度、治療効能、生産費用、投与回数などに決定的な役割をするため、世界的な先頭製薬企業とタンパク質工学の先導研究グループを中心にタンパク質医薬の半減期増加のための研究が活発に行われている。
【0007】
代表的に、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）高分子を用いてタンパク質を修飾するか目的タンパク質を抗体Ｆｃ又はアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）に融合させて血中半減期を増加させる技術が用いられている。
【0008】
ＰＥＧのような生体親和的高分子で目的タンパク質の特定部位に接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）させるか又は多くの部位に非特異的に結合させる場合、タンパク質分解酵素による分解を減らし、分子量増加によって腎臓からの排泄が減少し、血中維持時間が増加することができる。１９９０年にＥｎｚｏｎ社によって開発されたＰＥＧで修飾されたアデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）がＵＳ ＦＤＡで許可されて市販されて以来現在まで１０個以上の製品が市販されて臨床に用いられている。Ｒｏｃｈｅ社はＣ型肝炎の治療剤として使われるＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－αをＰＥＧ高分子で修飾（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）してＰＥＧＡＳＹＳという商品名で商業化し、Ａｍｇｅｎ社では白血球減少症を治療するために開発したＦｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）のＮ－末端に２０ｋＤａ ＰＥＧを修飾した持続型剤形であるＮｅｕｌａｓｔａを商業化して既存市場を拡大した。しかし、多量のタンパク質を注射する場合、体内でＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙの除去が遅くなり、分子量の高いＰＥＧを長期的に注射する場合に副作用の問題が引き起こされると報告されている。血中安全性はＰＥＧ分子量の大きさに密接した関係がある。分子量４０，０００Ｄａ以上のＰＥＧの製造が易しくなく、分子量が増加するほどタンパク質との反応性が低くて収率が低くなり、タンパク質自体の力価も急激に低下すると知られている。また、ＰＥＧ高分子は多様な分子量分布を有する重合体の混合物であるので、ＰＥＧに接合されたタンパク質治療剤は異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｅｔｙ）を有することになり、生産及び品質管理に難しさを引き起こす。したがって、タンパク質医薬品の血中半減期増加のためには、ＰＥＧのような高分子修飾と差別化する新しいタンパク質工学技術の開発が切実に要求されている状況である。
【0009】
薬理効果があるタンパク質医薬品の血中半減期向上のために、抗体Ｆｃと融合した多様なＦｃ－融合タンパク質医薬品が研究開発されており、治療用タンパク質に人間抗体Ｆｃ領域を融合して発現することで、ＦｃＲｎ受容体の結合によって細胞再循環機序を用いることができる。１９９８年にインターフェロン－α（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）とＦｃ切片をペプチドリンカーで連結する技術が開発され、２００３年には人間エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）をペプチドリンカーでＦｃと連結する融合タンパク質が開発された。代表的な例として、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））は関節炎を引き起こす主なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＴＮＦ－α阻害剤でＴＮＦ－α受容体のうち細胞外側部分に存在する部分を兔疫グロブリンＦｃ断片と融合させたタンパク質医薬品であり、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔを含めて現在１０個のＦｃ融合タンパク質がＵＳ ＦＤＡから許可されて臨床に用いられている。しかし、Ｆｃ切片が融合したタンパク質治療剤はＦｃ固有の機能である兔疫細胞活性化機能による細胞毒性の問題を克服しなければならない課題が台頭し、受容体介在性のクリアランス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）によって半減期が大きく増加しないという欠点がある。また、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）として存在するＦｃ断片と融合して発現しなければならないので、いつも二量体（ｄｉｍｅｒ）の形態に発現して目的タンパク質の薬理活性を変化させるという問題点がある。
【0010】
抗体Ｆｃ切片だけでなく人間血清に高濃度で存在するアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）を融合パートナーとして使って目的タンパク質治療剤の血中半減期を増加させる研究も遂行されている。アルブミン融合技術を保有しているＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社は、人間成長ホルモン、インターフェロンなどのタンパク質医薬にアルブミンを融合して現在臨床に用いている。アルブミンは分子量の大きな巨大タンパク質（分子量：６６．５ｋＤａ）であるから、融合タンパク質の形成時、目的タンパク質の活性を阻害する可能性を持っている。
【0011】
ＦｃγＲ変異体を用いる技術は現在まで試みたことがない新しい接近方法であり、発掘されるＦｃγＲ変異体を臨床に用いられている多様なタンパク質治療剤と新薬候補タンパク質に適用することによって血中半減期を大きく向上させることができると予想される。また、薬理学的効能は持っているが、体内で短い半減期と短い体内維持時間のため、臨床適用が難しい幾多のペプチド医薬品治療剤の開発にも発掘されたＦｃγＲ変異体融合によって血中半減期を大きく増加させることができる。したがって、薬物ターゲット組職で長時間の間に効能を発揮することができるようにすることにより、投与容量と頻度を画期的に減らすことができ、新薬開発費用の減少と新薬開発の可能性を大きく向上させることができると思われる。
【0012】
追加的に、自己免疫疾患は体内で生成される抗体が自己細胞を認識して免疫反応を引き起こす兔疫細胞が自己細胞を攻撃する疾病である。兔疫細胞は抗体と結合することができるＦｃγＲｓが存在し、抗体と結合すれば、ＡＤＣＣやＡＤＣＰのような免疫反応が起こることになる。したがって、可溶性ＦｃγＲＩＩａを投与することで、自己細胞を認識する抗体と結合することにより、自己細胞を認識しても兔疫細胞と結合することができないように遮断することができるから、自己免疫疾患治療剤にも開発可能な利点を有することができる。このような目的でＩｇＧ親和度が高くない野生型可溶性ＦｃγＲＩＩｂを用いて自己免疫疾患を抑制する薬物が現在人間を対象として臨床試験されている（参考文献、Sondermann et. al., Curr Opin Immunol, 2016）。
【0013】
前述した背景技術として説明した事項は本発明の背景に対する理解の増進のためのものであるだけ、当該技術分野で通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に相当することを認めるものとして受け入れてはいけないであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明者らは体内で短い半減期と短い体内維持時間のため臨床適用が難しい幾多のペプチド医薬品治療剤の血中半減期を延ばすことができるＦｃガンマ受容体変異体を捜そうと努力した。その結果、一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することにより、野生型に比べてＩｇＧ結合力が画期的に向上したＦｃガンマ受容体を確認して本発明を完成した。
【0015】
したがって、本発明の目的は、Ｆｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドを提供することにある。
【0016】
本発明の他の目的は、前記ポリペプチドをコーディングする核酸分子を提供することにある。
【0017】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。
【0018】
本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。
【0019】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチド、核酸分子又はベクターを含む組成物を提供することにある。
【0020】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチド又は核酸分子を含む組成物を提供することにある。
【0021】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチドを含むＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を検出するためのキットを提供することにある。
【0022】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチドと生理活性タンパク質又は生理活性ペプチドが結合されたタンパク質又はペプチド融合体を提供することにある。
【0023】
本発明のさらに他の目的は、Ｆｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【0024】
本発明のさらに他の目的は、試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位の存在を確認する方法を提供することにある。
【0025】
本発明のさらに他の目的は、試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を精製する方法を提供することにある。
【0026】
本発明のさらに他の目的は、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上した人間Ｆｃガンマ受容体変異体をスクリーニングする方法を提供することにある。
【0027】
本発明の他の目的及び利点は下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってより明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【0028】
本発明の一様態によれば、本発明はＦｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドを提供する。
【0029】
本発明者らは、体内での短い半減期と短い体内維持時間のため、臨床に適用しにくい幾多のペプチド医薬品治療剤の血中半減期を延ばすことができるＦｃガンマ受容体変異体を捜そうと努力した。その結果、一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することにより、野生型と比較してＩｇＧ結合力が画期的に向上したＦｃガンマ受容体を確認した。
【0030】
この明細書で、“Ｆｃガンマ受容体変異体”という用語はＦｃガンマ受容体のポリペプチドが野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）Ｆｃガンマ受容体とは違うものを意味する。このような違いとしては、免疫グロブリンの結合能の差、治療能力の差、アミノ酸組成又は溶解性などを挙げることができる。好ましくは、免疫グロブリン又はそのＦｃ部位（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）に結合することができる天然又は合成アミノ酸からなるＦｃガンマ受容体において一つ又はそれ以上のアミノ酸配列が変形されたものを意味し、前記変形はアミノ酸が置換、欠失又は挿入された形態を含む。
【0031】
免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＤのいずれか一つであってもよく、好ましくはＩｇＧであってもよい。免疫グロブリンは、人間、ラット、マウス、牛、羊、山羊、鶏、駝鳥又はラクダを含むいずれか動物来由のものであり得、好ましくは人間来由のものである。
【0032】
本発明の好適な具現例によれば、本発明のＦｃガンマ受容体変異体は野生型のＦｃガンマ受容体と比較して向上した特性を有する。
【0033】
この明細書で、“向上した特性”という用語は、野生型ガンマＦｃ受容体に比べて好ましい特性を得ることができることを意味する。この特性は、免疫グロブリン又はＦｃに対する結合能を増加又は促進させるか、免疫グロブリンのＦｃに結合して免疫機能を調節又は抑制させるか、治療剤として使われるポリペプチド又はタンパク質の血清中の半減期を増加させるか、目的とするポリペプチド又はタンパク質（例えば、免疫グロブリン）を検出することができるようにするか、これに対する検出正確度を向上させることであり得る。
【0034】
この明細書で、“免疫グロブリンとの結合能の変化”という用語は、本発明のＦｃガンマ受容体変異体が野生型のＦｃガンマ受容体の免疫グロブリン結合活性とは違う活性を有することを意味する。このようなものとしては、免疫グロブリンとの受容体の結合能、すなわち受容体を野生型のＦｃガンマ受容体と比較した場合、免疫複合体、凝集体、二量体又は単量体免疫グロブリンとの結合能が変化することを挙げることができる。
【0035】
この明細書で、“免疫グロブリンとの結合能に影響する一つ又はそれ以上のアミノ酸の変形”は野生型Ｆｃガンマ受容体と免疫グロブリンの結合に係わるアミノ酸残基又はアミノ酸残基の領域がＦｃガンマ受容体内で変化することを意味する。免疫グロブリンの結合に係わるアミノ酸は直接免疫グロブリンの結合に機能すること又は結合が発生するように受容体の構造上の一体性を維持することなどによって間接的に発生するものであり得る。このような変化は置換、欠失又は挿入された結果であり得る。
【0036】
本発明の一実施例によれば、本発明のＦｃガンマ受容体変異体は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）Ｆｃガンマ受容体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上する。前記変異したＦｃガンマ受容体変異体は、野生型Ｆｃガンマ受容体と比較して、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上結合力が向上するか、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）Ｆｃガンマ受容体と比較して、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上又は３０倍以上増加することができる（実施例２、８、１０、１１、１３、１５～１７及び１９）。
【0037】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）Ｆｃガンマ受容体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が３倍以上向上したものである。
【0038】
本発明の好適な具現例によれば、本発明のＦｃ受容体は単離された調剤物の形態を有し、これは他のタンパク質及び／又は非タンパク質性分子が除去されている程度に精製されるものを意味する。
【0039】
調剤物の純度は、重量、活性、アミノ酸の類似性、抗体の反応性又は他の既存の手段によって測定されたときの非Ｆｃ収容体形分子に比べ、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上のＦｃ受容体特性を示すものである。
【0040】
本発明のＦｃ受容体を含むポリペプチドは細胞膜又は支持体手段に結合させるか又は可溶性形態を有するものであり得る。薬剤学的組成物として使おうとするときは、前記ポリペプチドは可溶性であることが好ましい。
【0041】
前記ポリペプチドは、適当な条件の下で検出可能なシグナルを形成するリポーター分子で標識されることができる。このようなレポーター分子としては、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、化学発光分子、生物発光分子、蛍光分子又は酵素を挙げることができる。一般的に使われる酵素としては、何よりも西洋わさびのペルオキシダーゼ、ブドウ糖酸化酵素、β－ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼなどを挙げることができる。
【0042】
好ましくは、本発明のＦｃ受容体変異体は、野生型Ｆｃ受容体のアミノ酸の自然的又は人工的突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）又は誘導体を含む。前記突然変異体、変異体又は誘導体の基礎をなす野生型Ｆｃ受容体は人又は動物種来由であり得る。このような動物種は、マウス、ラット、兎、牛、羊、ラクダ又は山羊種などの哺乳動物種であることが好ましい。
【0043】
本発明のＦｃ受容体変異体を製造するためのアミノ酸変形、すなわち、欠損、挿入又は置換は既存の手段によって遂行される。Ｆｃ受容体変異体が組み換え体来由であるとき、この分子をコード化する核酸は１以上のアミノ酸の挿入又は置換に関連する適当なコードをその配列内に導入するかコーディング配列で適当に欠損させることもできる。収容体型分子をｄｅｎｏｖｏペプチド合成によって製造するときは、目的とするアミノ酸配列を導入することもできる。
【0044】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列の野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）Ｆｃガンマ受容体の配列において１１７番目アミノ酸及び１５９番目アミノ酸が変形されたものである。
【0045】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列の野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）Ｆｃガンマ受容体の配列において１１７番目アミノ酸、１１９番目アミノ酸及び１５９番目アミノ酸が変形、及び追加的に８６番目アミノ酸、１２７番目アミノ酸及び１７１番目アミノ酸からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸が変形されたものである。
【0046】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に置換され、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換された配列を含むＦｃガンマ受容体変異体である。
【0047】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は前記配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において前記１１７番目アミノ酸及び１５９番目アミノ酸が置換されるとともに、追加的に５５番目アミノ酸、８６番目アミノ酸、１１９番目アミノ酸、１２７番目アミノ酸及び１７１番目アミノ酸からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸が置換されたものである。
【0048】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において８６番目アミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）に、１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に、１１９番目アミノ酸がメチオニン（Ｍ）又はバリン（Ｖ）に、１２７番目アミノ酸がロイシン（Ｌ）に、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に、１７１番目アミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換された配列を含むＦｃガンマ受容体変異体である。
【0049】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は前記第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸及び１５９番目アミノ酸が置換されるとともに、追加的に５５番目アミノ酸がヒスチジン（Ｈ）に、８６番目アミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）に、１１９番目アミノ酸がメチオニン（Ｍ）又はバリン（Ｖ）に、１２７番目アミノ酸がロイシン（Ｌ）に、かつ１７１番目アミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換された群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸が置換されたものである。
【0050】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４４配列を含むものである。
【0051】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４５配列を含むものである。
【0052】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４６配列を含むものである。
【0053】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４７配列を含むものである。
【0054】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第４８配列を含むものである。
【0055】
本発明の好適な具現例によれば、前記変異体は配列リストの第５０配列を含むものである。
【0056】
本発明が含むＦｃガンマ受容体変異体は、多様な種類のＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）の変異体を含み、好ましくはＦｃガンマ受容体ＩＩａ変異体又はＦｃガンマ受容体ＩＩｂ変異体であり得る。
【0057】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は前記ポリペプチドをコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0058】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は下記の段階を含むＦｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドの製造方法を提供する。
【0059】
ａ）前記のポリペプチドをコーディングする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階、及び
ｂ）前記宿主細胞によって発現したポリペプチドを回収する段階。
ｂ）前記宿主細胞によって発現したポリペプチドを回収する段階。
【0060】
本発明の核酸分子は単離されたものであるか組み換えされたものであり得、一本鎖及び二重鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡだけでなく、対応する相補性配列が含まれる。“単離された核酸”は天然生成源泉から単離された核酸の場合、核酸が単離された個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手続で生成された核酸が単離された核酸分子に理解されることができる。単離された核酸分子は別途の断片の形態又はより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子を示す。核酸は他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡはポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーはポリペプチド配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結され、あるいはリボソーム結合部位は翻訳を促進するように配置されるとき、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に“作動可能に連結された”は連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合、隣接して同じリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は便利な制限酵素部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法で使用する。
【0061】
この明細書で、“ベクター”という用語は、核酸配列を複製することができる細胞への導入のために核酸配列を挿入することができる伝達体を意味する。核酸配列は外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を有することができるが、これに制限されない。当業者は標準的な組み換え技術によってベクターを構築することができる（Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 及びAusubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994など）。
【0062】
この明細書で、“発現ベクター”という用語は、転写される遺伝子産物の少なくとも一部をコーディングする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後にＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには多様な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列とともに、ベクター及び発現ベクターにはさらに他の機能も提供する核酸配列も含まれることができる。
【0063】
この明細書で、“宿主細胞”という用語は、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製することができるかベクターによってコーディングされる遺伝子を発現することができる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は前記ベクターによって形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されることができ、これは外因性核酸分子が宿主細胞内に伝達されるか導入される過程を意味する。
【0064】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は下記の段階を含む、試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位の存在を確認する方法を提供する。
【0065】
ａ）ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位の存在有無を判断しようとする試料を準備する段階、
ｂ）前記試料に記ポリペプチドを混合して互いに結合させる段階、及び
ｃ）前記ポリペプチドが結合されたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位の存在を確認する段階。
ｂ）前記試料に記ポリペプチドを混合して互いに結合させる段階、及び
ｃ）前記ポリペプチドが結合されたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位の存在を確認する段階。
【0066】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は下記の段階を含む、試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を精製する方法を提供する。
【0067】
ａ）ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を含む試料に前記ポリペプチドを混合して互いに結合させる段階、及び
ｂ）前記ポリペプチドが結合されたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を精製する段階。
ｂ）前記ポリペプチドが結合されたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を精製する段階。
【0068】
上述したように、本発明のＦｃガンマ受容体変異体は、野生型Ｆｃガンマ受容体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する向上した結合力を有するから、前記特性を活用してＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位の存在を確認するか、これを検出するか、これを精製する用途に有用に活用することができる。
【0069】
ポリペプチドの分離及び精製は数種の公知技術のいずれか一つによって遂行されることができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、製造用ディスクゲル電気泳動法を有することができるが、これに限定されない。前記ポリペプチドの分離及び精製技術は通常的な方法によるポリペプチドの変形を要求することができる。例えば、ニッケルカラム精製の際、タンパク質にヒスチジンタグを付け加えることができる。他の変形としては、より高いかより低い活性を引き起こし、より高いタンパク質生産を許すか、タンパク質の精製を単純化することができる。他のタグとしては、フラグタグ（ｆｌａｇ－ｔａｇ）も含むことができる。このようなタグは好ましくは真核生物宿主に使われる。
【0070】
ポリペプチドを精製するための方法としては、溶解度の変化によるタンパク質精製方法として硫酸アンモニウム沈澱法を含む。このような方法は塩析法（ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）のような一般的な技術より特定のものである。硫酸アンモニウムは、その溶解度が高いので、高いイオン強度の塩溶液を許すことができるので、一般的に使われる。ポリペプチドの溶解度は前記溶液のイオン強度によって変わるので、塩濃度によって変化する。
【0071】
ポリペプチドの溶解度は高いイオン強度で著しく違うから、塩析法は特定のポリペプチドの精製に役立つ非常に有用な方法である。コスモトロピック硫酸アンモニウム（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）添加によって、解け及び異常折り畳みのようなフォルディング副産物だけではなく、宿主細胞来由の細胞壁成分のような不純物及びポリペプチドが沈澱される。沈澱濃度の増加につれて沈澱効果が増加するので、Ｆｃ受容体変異体が高濃度の硫酸アンモニウムでのような沈澱に対して抵抗するうちは高純度Ｆｃ受容体変異体製造物質を獲得することができる。
【0072】
前記沈澱されたポリペプチドは遠心分離によって除去され、溶液中に依然としてポリペプチド汚染物の最大量が残っているうち、硫酸アンモニウム濃度は大部分の関心ポリペプチドが沈積する値に増加する。ついで、精製段階のために前記沈澱された関心ポリペプチドは遠心分離によって回収され、新しいバッファーに溶解される。
【0073】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は下記の段階を含む、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上したＦｃガンマ受容体変異体をスクリーニングする方法を提供する。
【0074】
ａ）配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に置換され、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換された配列を含むＦｃガンマ受容体変異体ライブラリを構築する段階、及び
ｂ）前記ライブラリにおいて前記二つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別する段階。
ｂ）前記ライブラリにおいて前記二つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別する段階。
【0075】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は下記の段階を含む、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上したＦｃガンマ受容体変異体をスクリーニングする方法を提供する。
【0076】
ａ）配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に置換され、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換された配列を含み、追加的に８６番目アミノ酸、１２７番目アミノ酸及び１７１番目アミノ酸からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換を含むＦｃガンマ受容体変異体ライブラリを構築する段階、及び
ｂ）前記ライブラリにおいて前記１１７番目及び１５９番目の二つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別する段階。
ｂ）前記ライブラリにおいて前記１１７番目及び１５９番目の二つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別する段階。
【0077】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は下記の段階を含む、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力が向上したＦｃガンマ受容体変異体をスクリーニングする方法を提供する。
【0078】
ａ）配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において５５番目アミノ酸がヒスチジン（Ｈ）に、１１７番目アミノ酸がアスパラギン（Ｎ）に、１１９番目アミノ酸がバリン（Ｖ）に、１５９番目アミノ酸がグルタミン（Ｑ）に、１７１番目アミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換された配列を含むＦｃガンマ受容体変異体ライブラリを構築する段階、及び
ｂ）前記ライブラリにおいて前記５５番目、１１７番目、１１９番目、１５９番目及び１７１番目の五つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別する段階。
ｂ）前記ライブラリにおいて前記５５番目、１１７番目、１１９番目、１５９番目及び１７１番目の五つのアミノ酸配列の置換のみを含むＦｃガンマ受容体変異体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別する段階。
【0079】
本発明のスクリーニング方法を用いれば、Ｆｃガンマ受容体変異体と比較して、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を有用に選別することができる。
【0080】
本発明のスクリーニング方法によって選別された変異体は、下記のアミノ酸変形をさらに含むことができる。配列リストの第４３配列又は配列リストの第４９配列において５５番目アミノ酸、８６番目アミノ酸、１１９番目アミノ酸、１２７番目アミノ酸及び１７１番目アミノ酸からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸が置換。
【0081】
本発明の好適な具現例によれば、追加的に５５番目アミノ酸がヒスチジン（Ｈ）に、８６番目アミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）に、１１９番目アミノ酸がメチオニン（Ｍ）又はバリン（Ｖ）に、１２７番目アミノ酸がロイシン（Ｌ）に、かつ１７１番目アミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換された群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ酸が置換されたものである。
【0082】
本発明の一実施例によれば、前記スクリーニング方法により、ＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に対する結合力がより向上したＦｃガンマ受容体変異体を選別した（実施例７及び８）。
【0083】
本発明のスクリーニング方法は、蛍光標識細胞分離（ＦＡＣＳ）スクリーニング、又は他の自動化したフローサイトメトリー分析技術を用いることができる。フローサイトメトリー分析を実施するための機器は当業者に公知となっている。その機器の例としては、ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）、Ｅｐｉｃｓ Ｃ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）、ＭＯＦＬＯ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ｃｏｌｏ．）、ＭＯＦＬＯ－ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を挙げることができる。一般に、フローサイトメトリー分析技術には液体試料中の細胞又は他の粒子の分離が含まれる。典型的には、フローサイトメトリー分析の目的は、分離された粒子をその一つ以上の特性（例えば、標識されたリガンド又は他の分子の存在）に対して分析することである。粒子はセンサーによって一つずつ通過し、大きさ、屈折、光散乱、不透明度、照度、形状、蛍光などに基づいて分類される。
【0084】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記ポリペプチド、核酸分子又はベクターを含む組成物を提供する。
【0085】
本発明の好適な具現例によれば、本発明の組成物は、試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を検出するためのものである。
【0086】
この明細書で、“試料”という用語はＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を含む可能性がある物質を意味する。また、被検者から自然的又は人為的に分離されたものとして、体外に分離された糞便、細胞、血液、血漿、血清、毛髪又は尿などを用いることができる。
【0087】
この明細書で使われる“被検者”は、人間、チンパンジーを含む霊長類、犬、猫などの愛玩動物、牛、馬、羊、山羊などの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳動物を含む意味に解釈される。
【0088】
また、前記組成物はキットに含まれることができ、試料に含まれたＩｇＧ抗体又はＩｇＧ抗体のＦｃ部位を検出するか、被検者のＩｇＧ抗体の量を定量するか、患者（例えば、免疫過敏反応、自己免疫疾患、臓器移植による免疫の変化）の免疫能力関連状態を測定するか診断する用途に有用に活用できる。
【0089】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記ポリペプチドと生理活性タンパク質又は生理活性ペプチドが結合されたタンパク質又はペプチド融合体を提供する。
【0090】
本発明によるタンパク質又はペプチド融合体は、生理活性タンパク質又は生理活性ペプチドを前記Ｆｃガンマ受容体変異体と結合させて体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させたことを特徴とする。
【0091】
この明細書で、“タンパク質融合体（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）”という用語は一つ以上の生理活性を有するタンパク質をＦｃガンマ受容体変異体のＮ－末端又はＣ－末端に結合させた新しい分子構成を有するタンパク質融合体を意味することができる。また、“ペプチド融合体（ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）”は一つ以上の生理活性を有する低分子量のペプチドをＦｃガンマ受容体変異体のＮ－末端又はＣ－末端に結合させた新しい分子構成を有するペプチド融合体を意味する。
【0092】
前記生理活性タンパク質又は生理活性ペプチドは直接、又はアミノ酸からなるリンカーを介してＦｃガンマ受容体変異体に結合されることができる。
【0093】
前記生理活性タンパク質又は生理活性ペプチドとＦｃガンマ受容体変異体は遺伝子組み換え技術を用いて結合させることが好ましいが、当該分野に知られている架橋剤を使ってＦｃガンマ受容体変異体のＮ－末端、Ｃ－末端又は遊離基に結合させることができる。
【0094】
前記生理活性タンパク質は、ホルモン類及びその受容体、生物学的反応調節物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）及びその受容体、サイトカイン類及びその受容体、酵素類、抗体類、抗体断片類などを含むことができる。具体的には、前記生理活性タンパク質は、人間成長ホルモン（ｈＧＨ）、インスリン、卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、副甲状線ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＰＴＨ）、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン、マクロファージ（ｍａｒｏｐｈａｇｅ）活性化因子、腫瘍怪死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、血液凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ヒト骨形態形成タンパク質（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ２、ｈＢＭＰ２）、ケラチノサイト成長因子（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ－ガラクトシダーゼＡ（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａ）、アルファイズロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、ラクターゼ（ｌａｃｔａｓｅ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、キチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、イミグルセラーゼ（ｉｍｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、ウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、中性エンドペプチダーゼ（ｎｅｕｔｒａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、ボツリヌス毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、単クローン抗体、多クローン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄなどを含むが、これに限定されない。
【0095】
前記生理活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド－１（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）及びその類似体、エキセンディン及びその類似体、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）及びその類似体、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨＲＨ）作用剤及び拮抗剤、副腎皮質刺激ホルモン（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン放出ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、サイモシンアルファ－１（ｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ－１）、コルチコトロピン放出因子（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、バソプレシン誘導体（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎａｎ ａｌｏｇｕｅｓ）、及び生理活性タンパク質の断片などを含むが、これに限定されない。
【0096】
本発明のペプチドは他の生理活性タンパク質又はペプチドの体内半減期を増加させる目的で有用に活用されることができ、前記タンパク質又はペプチド融合体は体内持続性を維持することによって体内半減期が増加することができる。
【0097】
本発明の好適な具現例によれば、本発明の組成物は免疫抑制用薬剤学的組成物である。
【0098】
本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記ポリペプチド、これをコーディングする核酸分子又は前記核酸分子を含むベクター、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。
【0099】
本発明の好適な具現例によれば、本発明の組成物は臓器移植反応抑制用又は自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物である。
【0100】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は前記薬剤学的組成物を投与する段階を含む免疫又は臓器移植反応抑制方法を提供する。
【0101】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は前記薬剤学的組成物を投与する段階を含む自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0102】
この明細書で、“自己免疫疾患”という用語は“自己免疫障害”という用語と混用され、その自分の細胞、組職、臓器又はこれら対象の免疫学的反応によって引き起こされる細胞、組職、臓器又はこれらの損傷によって特定化した対象の状態を意味する。“炎症性疾患”という用語は“炎症性障害”という用語と混用され、炎症、好ましくは晩成的炎症によって特定化した状態を意味する。自己免疫疾患は炎症に関連することも、関連しないこともできる。また、炎症は自己免疫疾患を引き起こしても、引き起こさないこともできる。
【0103】
本発明の薬剤学的組成物によって予防又は治療可能な自己免疫疾患の例は、アロペシアグレアタ（ａｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン疾患、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎及び精巣炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ－ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アトピー性皮膚炎、喘息、鼻炎、慢性疲労免疫異常症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、チャーグストラウス症候群（Ｃｈｕｒｇ－Ｓｔｒａｕｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症侯群、寒冷凝集素疾患、クローン病、円盤状紅斑性狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ神経炎、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性連結組職疾患、多発性硬化症、タイプＩ又は免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、一次性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症侯群、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、スティフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑及びヴェグナー肉芽腫症を含むが、これに限定されるものではない。
【0104】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常に用いられるもので、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【0105】
本発明の薬剤学的組成物は経口又は非経口で投与することができ、好ましくは非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与することができる。
【0106】
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様であり、普通に熟練した医師は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好適な具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。
【0107】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化して単位容量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に注入して製造されることができる。ここで、剤形はオイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態であるかエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であることができ、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【0108】
本発明の薬剤学的組成物は単独の療法で用いられることができるが、他の通常的な化学療法又は生物学的療法とともに用いられることもでき、このような並行療法を実施する場合にはより効果的に前記免疫関連疾患を治療することができる。
【発明の効果】
【0109】
本発明の特徴及び利点をまとめると次のようである。
【0110】
（ｉ）本発明はＦｃガンマ受容体変異体を含むポリペプチドを提供する。
【0111】
（ｉｉ）また、本発明は前記ポリペプチドの製造方法を提供する。
【0112】
（ｉｉｉ）本発明のＦｃガンマ受容体変異体はＦｃガンマ受容体の一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することにより、兔疫グロブリンに対する選択的結合力に優れて体内半減期増加、免疫グロブリンの検出及び精製、臓器移植反応抑制の用途又は自己免疫疾患の予防又は治療の用途に有用に活用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0113】
【図1】本発明のＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ構築に対する模式図を示す。
【図2】ヒト血清ＩｇＧに対して高い親和度を現すＳＨ２Ａ４０変異体の選別過程を示す。
【図3】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でＦｃγＲＩＩａタンパク質（３２ｋＤａ）が高純度に精製されたことを確認した結果を示す。
【図4】Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆが加わったＳＨ２Ａ４０のＦｃに対する結合力を野生型と比較したグラフである。
【図5】精製されたＳＨ２Ａ４０の収得過程を示した模式図である。
【図6】発現精製後に発掘したＳＨ２Ａ４０の活性を調べるためにＥＬＩＳＡを進めた結果を示す。
【図7】Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆが形成されないようにＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリを製作する過程の模式図である。
【図8】構築されたライブラリとフローサイトメトリー分析器を用いて選別した変異体（ＭＧ２Ａ２８及びＭＧ２Ａ４５）のＦｃに対する結合力を比較したグラフである。
【図9】発掘した変異体を精製した結果を示す。
【図10】発掘した変異体のＦｃに対する結合力を分析するためのＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図11】バイオレイヤー干渉法によるＦｃガンマ受容体変異体とリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）のＫＤ値を測定した結果を示す。
【図12】構築されたライブラリとフローサイトメトリー分析器を用いて選別した変異体（ＭＧ２Ａ２８．１及びＭＧ２Ａ４５．１）のＦｃに対する親和度を比較したグラフである。
【図13】発掘した変異体を精製した結果を示す。
【図14】発掘した変異体のＦｃに対する結合力を分析するためのＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図15】バイオレイヤー干渉法によるＦｃガンマ受容体変異体とリツキシマブのＫＤ値を測定した結果を示す。
【図16】Ｆｃガンマ受容体変異体のマウス血清ＩｇＧとの結合力をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す。
【図17】野生型ＦｃγＲＩＩｂとＭＧ２Ａ４５．１突然変異が導入されたＦｃγＲＩＩｂ（ＭＧ２Ｂ４５．１）のヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣに対する親和度比較結果を示す。
【図18】動物細胞で発現したＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１を示す。
【図19】ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１のＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖに対するＶＥＧＦ結合活性分析結果を示す。
【図20】ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１のＦｃγＲＩＩａに対するＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）結合活性分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0114】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないというのは当該分野で通常の知識を有する者に明らかであろう。
【0115】
［実施例］
［実施例１：ＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ製作］
ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ－ＦＬＡＧベクターに基づき、ＦｃγＲＩＩａ内に０．２％程度の無作為突然変異が生ずるようにプライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１を用いて無作為に突然変異が導入されたＦｃγＲＩＩａ遺伝子を製作した。また、ＦｃγＲＩＩａのＩｇＧ Ｆｃとの結合位置に縮退コドンであるＮＮＫを導入して多様なアミノ酸が導入されるようにｆｏｃｕｓｅｄ ｉｎｓｅｒｔをプライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１、ｐ７８８、ｐ７８９、ｐ７９０、ｐ７９１、ｐ７９２、ｐ７９３を用いて製作した（表１）。製作された２種のｉｎｓｅｒｔをＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理してベクターとライゲーションした。その後、大膓菌Ｊｕｄｅ１（（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑΔ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵ ｇａｌＫｒｐｓＬｅｎｄＡ１ｎｕｐＧ）に形質転換して巨大ＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ（ライブラリの大きさ：２．２×１０９）を構築した（図１）。
［実施例１：ＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ製作］
ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ－ＦＬＡＧベクターに基づき、ＦｃγＲＩＩａ内に０．２％程度の無作為突然変異が生ずるようにプライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１を用いて無作為に突然変異が導入されたＦｃγＲＩＩａ遺伝子を製作した。また、ＦｃγＲＩＩａのＩｇＧ Ｆｃとの結合位置に縮退コドンであるＮＮＫを導入して多様なアミノ酸が導入されるようにｆｏｃｕｓｅｄ ｉｎｓｅｒｔをプライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１、ｐ７８８、ｐ７８９、ｐ７９０、ｐ７９１、ｐ７９２、ｐ７９３を用いて製作した（表１）。製作された２種のｉｎｓｅｒｔをＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理してベクターとライゲーションした。その後、大膓菌Ｊｕｄｅ１（（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑΔ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵ ｇａｌＫｒｐｓＬｅｎｄＡ１ｎｕｐＧ）に形質転換して巨大ＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ（ライブラリの大きさ：２．２×１０９）を構築した（図１）。
【0116】
【表1】
【0117】
［実施例２：バクテリア培養及びフローサイトメトリー分析器（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いたＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ探索］
構築されたＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ細胞１ｍｌを３７℃、２５０ｒｐｍ振盪の条件で２％（ｗ／ｖ）グルコースにクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍｌ）が含まれたＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に入れ、４時間培養した。培養されたライブラリ細胞をＴＢ培地に１：１００で接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍ振盪の条件でＯＤ６００が０．６に到逹するまで培養した。その後、冷却のために２０分間２５℃で培養した後、１ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を入れて発現を誘導した。培養が終わった後、細胞を回収し、ＯＤ６００ノーマライゼーション（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）によって一定量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を収獲した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し、１分間遠心分離する洗浄する過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃、３０分間の回転によって細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を捨てた後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加し、再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣプローブ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）をともに入れ、常温で回転させてスフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）に蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、フローサイトメトリー分析器（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｓ３ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ））を用いて高い蛍光を現す上位３％の細胞を回収し、蛍光の高い細胞の純度を高めるために選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）された細胞を再選別（ｒｅｓｏｒｔｉｎｇ）した。再選別されたサンプルをプライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１及びＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）を用いてＰＣＲで遺伝子を増幅し、ＳｆｉＩ制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を介して選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総４ラウンドにかけて繰り返した後、４０個の個別クローンをそれぞれ分析して野生型ＦｃγＲＩＩａ（配列リストの第３５配列及び第４３配列）よりヒト血清ＩｇＧに対して高い親和度を現すＳＨ２Ａ４０変異体（配列リストの第３６配列及び第４４配列）を選別した（図２）。
構築されたＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ細胞１ｍｌを３７℃、２５０ｒｐｍ振盪の条件で２％（ｗ／ｖ）グルコースにクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍｌ）が含まれたＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に入れ、４時間培養した。培養されたライブラリ細胞をＴＢ培地に１：１００で接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍ振盪の条件でＯＤ６００が０．６に到逹するまで培養した。その後、冷却のために２０分間２５℃で培養した後、１ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を入れて発現を誘導した。培養が終わった後、細胞を回収し、ＯＤ６００ノーマライゼーション（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）によって一定量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を収獲した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し、１分間遠心分離する洗浄する過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃、３０分間の回転によって細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を捨てた後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加し、再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣプローブ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）をともに入れ、常温で回転させてスフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）に蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、フローサイトメトリー分析器（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｓ３ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ））を用いて高い蛍光を現す上位３％の細胞を回収し、蛍光の高い細胞の純度を高めるために選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）された細胞を再選別（ｒｅｓｏｒｔｉｎｇ）した。再選別されたサンプルをプライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１及びＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）を用いてＰＣＲで遺伝子を増幅し、ＳｆｉＩ制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を介して選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総４ラウンドにかけて繰り返した後、４０個の個別クローンをそれぞれ分析して野生型ＦｃγＲＩＩａ（配列リストの第３５配列及び第４３配列）よりヒト血清ＩｇＧに対して高い親和度を現すＳＨ２Ａ４０変異体（配列リストの第３６配列及び第４４配列）を選別した（図２）。
【0118】
［実施例３：発掘したＳＨ２Ａ４０変異体を動物細胞で発現するためのクローニング及び発現、精製］
発掘した変異体の中でＳＨ２Ａ４０をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現するために遺伝子をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＭＪ＃１６２、ＭＪ＃１６３を用いてＰＣＲで増幅した後、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションしてｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ（野生型）、ｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）（ＳＨ２Ａ４０）を製作した。動物細胞用発現ベクターであるｐＭＡＺでクローニングした遺伝子はＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液に対し、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルター（ｂｏｔｔｌｅ ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌ スラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。パススルー溶液（ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、５０ｍｌの１×ＰＢＳ、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２００μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出（溶出）は２５０ｍＭイミダゾールバッファー２．５ｍｌで遂行した。得られたタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を介してＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程でＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を介して精製されたタンパク質を確認した（図３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でＦｃγＲＩＩａタンパク質（３２ｋＤａ）が高純度に精製されたことが確認された。
発掘した変異体の中でＳＨ２Ａ４０をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現するために遺伝子をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＭＪ＃１６２、ＭＪ＃１６３を用いてＰＣＲで増幅した後、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションしてｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ（野生型）、ｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）（ＳＨ２Ａ４０）を製作した。動物細胞用発現ベクターであるｐＭＡＺでクローニングした遺伝子はＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液に対し、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルター（ｂｏｔｔｌｅ ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌ スラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。パススルー溶液（ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、５０ｍｌの１×ＰＢＳ、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２００μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出（溶出）は２５０ｍＭイミダゾールバッファー２．５ｍｌで遂行した。得られたタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を介してＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程でＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を介して精製されたタンパク質を確認した（図３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でＦｃγＲＩＩａタンパク質（３２ｋＤａ）が高純度に精製されたことが確認された。
【0119】
［実施例４：動物細胞培養によって生産したＦｃγＲＩＩａタンパク質の活性及び結合力分析のためにＩｇＧ１サブクラスからなるリツキシマブを用いて遂行したＥＬＩＳＡ］
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａタンパク質を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつを添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつを入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、リツキシマブのＦｃ部分と野生型ＦｃγＲＩＩａ、ＳＨ２Ａ４０に対する結合力を比較分析することができた。その結果、ＳＨ２Ａ４０が新しいＮ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆが追加されたから、ＷＴ ＦｃγＲＩＩａにほぼ同じ結合力を現した（図４）。
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａタンパク質を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつを添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつを入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、リツキシマブのＦｃ部分と野生型ＦｃγＲＩＩａ、ＳＨ２Ａ４０に対する結合力を比較分析することができた。その結果、ＳＨ２Ａ４０が新しいＮ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆが追加されたから、ＷＴ ＦｃγＲＩＩａにほぼ同じ結合力を現した（図４）。
【0120】
［実施例５：ＭＢＰ－ＦｃγＲＩＩａタンパク質発現のためのクローニング及び大腸菌での発現及び精製］
選別されたＳＨ２Ａ４０を可溶性タンパク質形態に生産するために該当遺伝子をＩＩａ＿Ｆｗ＿ＮｄｅＩ、ＩＩａ＿Ｒｖ＿ＨｉｎｄＩＩＩプライマーでＰＣＲした後、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）処理を行った。その後、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ一ｐＥＴ２２ｂ－ＭＢＰ－ＴＥＶ ｓｉｔｅ－Ｈｉｓベクターとライゲーションした後、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。該当細胞を３７℃で２５０ｒｐｍ振盪の条件で２％（ｗ／ｖ）グルコースにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が含まれたＴＢ培地に入れて前培養した。培養された細胞をＴＢ培地に１：１００で接種した後、３７℃で２５０ｒｐｍの振盪によってＯＤ６００が０．６に到逹するまで培養した。その後、冷却のために２０分間１８℃で培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧを入れ、１４時間の間に発現を誘導した。培養が終わった後、７，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞を収獲した。細胞破砕のために超音波処理（５秒オン／１０秒オフ、１００回繰り返し）し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。濾過された上澄み液をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に結合させ、１００ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、１００ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファーで洗浄した後、５０ｍＭイミダゾールバッファー４ｍｌで溶出した。溶出されたサンプルを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで緩衝液交換した後、ＴＥＶ－ＧＳＴを用いてＭＢＰ－ＳＨ２Ａ４０をＭＢＰとＳＨ２Ａ４０で切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）した後、ＧＳＴ樹脂とアミロース樹脂でＴＥＶ－ＧＳＴとＭＢＰタンパク質を除去して純粋なＳＨ２Ａ４０のみ得た（図５）。
選別されたＳＨ２Ａ４０を可溶性タンパク質形態に生産するために該当遺伝子をＩＩａ＿Ｆｗ＿ＮｄｅＩ、ＩＩａ＿Ｒｖ＿ＨｉｎｄＩＩＩプライマーでＰＣＲした後、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）処理を行った。その後、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ一ｐＥＴ２２ｂ－ＭＢＰ－ＴＥＶ ｓｉｔｅ－Ｈｉｓベクターとライゲーションした後、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。該当細胞を３７℃で２５０ｒｐｍ振盪の条件で２％（ｗ／ｖ）グルコースにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が含まれたＴＢ培地に入れて前培養した。培養された細胞をＴＢ培地に１：１００で接種した後、３７℃で２５０ｒｐｍの振盪によってＯＤ６００が０．６に到逹するまで培養した。その後、冷却のために２０分間１８℃で培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧを入れ、１４時間の間に発現を誘導した。培養が終わった後、７，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞を収獲した。細胞破砕のために超音波処理（５秒オン／１０秒オフ、１００回繰り返し）し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。濾過された上澄み液をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に結合させ、１００ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、１００ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファーで洗浄した後、５０ｍＭイミダゾールバッファー４ｍｌで溶出した。溶出されたサンプルを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで緩衝液交換した後、ＴＥＶ－ＧＳＴを用いてＭＢＰ－ＳＨ２Ａ４０をＭＢＰとＳＨ２Ａ４０で切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）した後、ＧＳＴ樹脂とアミロース樹脂でＴＥＶ－ＧＳＴとＭＢＰタンパク質を除去して純粋なＳＨ２Ａ４０のみ得た（図５）。
【0121】
［実施例６：大膓菌で発現したＦｃγＲＩＩａ変異体のＩｇＧ１との結合力をＥＬＩＳＡで分析］
発現精製後に発掘したＳＨ２Ａ４０の活性を調べるためにＥＬＩＳＡを行った。０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブを５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの４％脱脂乳（ＧｅｎｏｍｉｃＢａｓｅ）（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を行った後、１％脱脂乳（０．０５％ＰＢＳＴ）で順次希釈されたＷＴ ＦｃγＲＩＩａとＳＨ２Ａ４０を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ｓｉｇｍａ社）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図６）。
発現精製後に発掘したＳＨ２Ａ４０の活性を調べるためにＥＬＩＳＡを行った。０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブを５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの４％脱脂乳（ＧｅｎｏｍｉｃＢａｓｅ）（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を行った後、１％脱脂乳（０．０５％ＰＢＳＴ）で順次希釈されたＷＴ ＦｃγＲＩＩａとＳＨ２Ａ４０を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ｓｉｇｍａ社）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図６）。
【0122】
［実施例７：Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆが形成されないようにＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリ製作］
ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＳＨ２Ａ４０：Ｋ１１７Ｎ、Ｌ１５９Ｑ）に形成されたＮ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ（Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ）を除去しながらＩｇＧ Ｆｃとの親和度の高いＦｃγＲＩＩａ変異体を探索するためにライブラリを製作した。このライブラリはＳＨ２Ａ４０でＮ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆが形成されたＶ１１６、Ｋ１１７、Ｔ１１９位置に集中して製作した。ライブラリのテンプレートとしてはＳＨ２Ａ４０をテンプレートとして製作し、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｃｙｃを予防するために、Ｃｙｓが生じないようにｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｄｏｎを用いた（図７）。
ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＳＨ２Ａ４０：Ｋ１１７Ｎ、Ｌ１５９Ｑ）に形成されたＮ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ（Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ）を除去しながらＩｇＧ Ｆｃとの親和度の高いＦｃγＲＩＩａ変異体を探索するためにライブラリを製作した。このライブラリはＳＨ２Ａ４０でＮ－ｌｉｎｋｅｄ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆが形成されたＶ１１６、Ｋ１１７、Ｔ１１９位置に集中して製作した。ライブラリのテンプレートとしてはＳＨ２Ａ４０をテンプレートとして製作し、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｃｙｃを予防するために、Ｃｙｓが生じないようにｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｄｏｎを用いた（図７）。
【0123】
１．Ｓｕｂ－ｌｉｂｒａｒｙ－１：１１７番位置にＡｓｎ、Ｃｙｓが生じないように製作
ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ（ＳＨ２Ａ４０）－ＦＬＡＧをテンプレートとし、１１６番、１１９番位置は２０個のアミノ酸がコーディングされるようにＮＮＫ縮退コドンを使い、１１７番位置はＮＮＧ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｄｏｎを用いて１３個アミノ酸をコーディングし、５個の残りのアミノ酸（Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ）はそれぞれコーディングするプライマーを製作して同量で混合してから使った。プライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１１２とベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ遺伝子の１１６番の前部分である断片－１（ｆｒａｇｍｅｎｔ－１）を増幅し、後側の断片－２を増幅するときはＭＪ＃１１３－ＭＪ＃１１８を同一のアミノ酸の比率で交ぜた混合物とＭＪ＃１６１を使った。準備された２個の断片はベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）でアセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）制限酵素処理した。
ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ（ＳＨ２Ａ４０）－ＦＬＡＧをテンプレートとし、１１６番、１１９番位置は２０個のアミノ酸がコーディングされるようにＮＮＫ縮退コドンを使い、１１７番位置はＮＮＧ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｄｏｎを用いて１３個アミノ酸をコーディングし、５個の残りのアミノ酸（Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ）はそれぞれコーディングするプライマーを製作して同量で混合してから使った。プライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１１２とベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ遺伝子の１１６番の前部分である断片－１（ｆｒａｇｍｅｎｔ－１）を増幅し、後側の断片－２を増幅するときはＭＪ＃１１３－ＭＪ＃１１８を同一のアミノ酸の比率で交ぜた混合物とＭＪ＃１６１を使った。準備された２個の断片はベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）でアセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）制限酵素処理した。
【0124】
２．Ｓｕｂ－ｌｉｂｒａｒｙ－２：１１９番位置にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓが生じないように製作
ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ（ＳＨ２Ａ４０）－ＦＬＡＧをテンプレートとし、１１６番、１１７番位置は２０個アミノ酸がコーディングされるようにＮＮＫ縮退コドンを使い、１１９番位置はＮＷＫ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｄｏｎを用いて１２個アミノ酸をコーディングし、５個の残りのアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ）はそれぞれコーディングするプライマーを製作し、同量で混合してから使った。プライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１１２とベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ遺伝子の１１６番の前部分である断片－１を増幅し、後側の断片－２を増幅するときはＭＪ＃１１９－ＭＪ＃１２４を同一のアミノ酸の比率で交ぜた混合物とＭＪ＃１６１を使った。準備された２個の断片はベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）でアセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）制限酵素処理した。
ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ（ＳＨ２Ａ４０）－ＦＬＡＧをテンプレートとし、１１６番、１１７番位置は２０個アミノ酸がコーディングされるようにＮＮＫ縮退コドンを使い、１１９番位置はＮＷＫ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｄｏｎを用いて１２個アミノ酸をコーディングし、５個の残りのアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ）はそれぞれコーディングするプライマーを製作し、同量で混合してから使った。プライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１１２とベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ遺伝子の１１６番の前部分である断片－１を増幅し、後側の断片－２を増幅するときはＭＪ＃１１９－ＭＪ＃１２４を同一のアミノ酸の比率で交ぜた混合物とＭＪ＃１６１を使った。準備された２個の断片はベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）でアセンブル（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）制限酵素処理した。
【0125】
制限酵素処理された２個のｓｕｂ－ｌｉｂｒａｒｙ遺伝子は同量でライゲーション過程を経てＪｕｄｅ１に形質転換してＦｃγＲＩＩａライブラリを製作した（理論的ライブラリの大きさ：４．３×１０４、実験的ライブラリの大きさ：６．３×１０８）。
【0126】
［実施例８：構築されたライブラリとフローサイトメトリー分析器によるスクリーニング及びＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５などの変異体選別（ヒト血清ＩｇＧに対する親和度分析）］
構築されたライブラリは、２５０ｍｌフラスコでＴＢ＋２％グルコース培地２５ｍｌに１ｖｉａｌ（１ｍｌ）を溶かし、３７℃で４時間培養した後、１００ｍｌのＴＢ培地が収容された５００ｍｌフラスコで１：１００接種してＯＤ６００＝０．６まで培養した。直ちに２５℃、２５０ｒｐｍで２０分間冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２５℃、２５０ｒｐｍで５時間過発現した。過発現後、ＯＤ６００値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を回収した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し１分間遠心分離する洗浄過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃で３０分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加し、再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）プローブを一緒に入れ、常温で回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳに２０倍希釈し、Ｓ３ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）装備を用いて上位３％の蛍光信号を出す細胞のみ分離して取った。より効率的なスクリーニングのために、分離した細胞はもう一度選別して再選別作業を遂行した。選別された細胞はＭＪ＃１、ＭＪ＃２プライマーとＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）を用い、ＰＣＲで遺伝子を増幅し、ＳｆｉＩ制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を経て選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総３ラウンドにかけて繰り返した後、５０余個の個別クローンの塩基配列分析によってヒト血清ＩｇＧのＦｃ部分と高い親和度を現す変異体を選別した（図８）。
構築されたライブラリは、２５０ｍｌフラスコでＴＢ＋２％グルコース培地２５ｍｌに１ｖｉａｌ（１ｍｌ）を溶かし、３７℃で４時間培養した後、１００ｍｌのＴＢ培地が収容された５００ｍｌフラスコで１：１００接種してＯＤ６００＝０．６まで培養した。直ちに２５℃、２５０ｒｐｍで２０分間冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２５℃、２５０ｒｐｍで５時間過発現した。過発現後、ＯＤ６００値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を回収した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し１分間遠心分離する洗浄過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃で３０分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加し、再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）プローブを一緒に入れ、常温で回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳに２０倍希釈し、Ｓ３ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）装備を用いて上位３％の蛍光信号を出す細胞のみ分離して取った。より効率的なスクリーニングのために、分離した細胞はもう一度選別して再選別作業を遂行した。選別された細胞はＭＪ＃１、ＭＪ＃２プライマーとＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）を用い、ＰＣＲで遺伝子を増幅し、ＳｆｉＩ制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を経て選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総３ラウンドにかけて繰り返した後、５０余個の個別クローンの塩基配列分析によってヒト血清ＩｇＧのＦｃ部分と高い親和度を現す変異体を選別した（図８）。
【0127】
［実施例９：発掘した変異体を動物細胞で発現するためのクローニング及び発現精製］
発掘した変異体の中でＭＧ２Ａ２８（配列リストの第３７配列及び第４５配列）、ＭＧ２Ａ４５（配列リストの第３８配列及び第４６配列）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現するために遺伝子をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＭＪ＃１６２、ＭＪ＃１６３を使ってＰＣＲで増幅した後、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションしてｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ２８）、ｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ４５）を製作した。動物細胞用発現ベクターであるｐＭＡＺにクローニングした遺伝子はＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入し、３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液は２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌのスラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。パススルー溶液（ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、５０ｍｌの１×ＰＢＳ、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２００μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は２５０ｍＭイミダゾールバッファー２．５ｍｌで遂行した。得られたタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を介してＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程を経てＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を介して精製されたタンパク質を確認した（図９）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でＦｃγＲＩＩａタンパク質（３２ｋＤａ）が高純度に精製されたことが確認された。
発掘した変異体の中でＭＧ２Ａ２８（配列リストの第３７配列及び第４５配列）、ＭＧ２Ａ４５（配列リストの第３８配列及び第４６配列）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現するために遺伝子をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＭＪ＃１６２、ＭＪ＃１６３を使ってＰＣＲで増幅した後、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションしてｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ２８）、ｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ４５）を製作した。動物細胞用発現ベクターであるｐＭＡＺにクローニングした遺伝子はＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入し、３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液は２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌのスラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。パススルー溶液（ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、５０ｍｌの１×ＰＢＳ、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２００μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は２５０ｍＭイミダゾールバッファー２．５ｍｌで遂行した。得られたタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を介してＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程を経てＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を介して精製されたタンパク質を確認した（図９）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でＦｃγＲＩＩａタンパク質（３２ｋＤａ）が高純度に精製されたことが確認された。
【0128】
［実施例１０：ＩｇＧ１サブクラスからなるリツキシマブを用いた変異体のＦｃに対する結合力を分析するためのＥＬＩＳＡ］
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ１８０μｌで４回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａ変異体を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつを添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図１０）。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、リツキシマブのＦｃ部分とＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＳＨ２Ａ４０、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５）に対する結合力を比較分析することができた。
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ１８０μｌで４回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａ変異体を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつを添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図１０）。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、リツキシマブのＦｃ部分とＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＳＨ２Ａ４０、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５）に対する結合力を比較分析することができた。
【0129】
［実施例１１：バイオレイヤー干渉法によるＦｃγＲＩＩａ変異体とリツキシマブのＫＤ値測定］
ヒト血清の約７０％以上を占め、各種の抗体医薬品に主に使われるＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１のＦｃとの結合力を測定するために、リツキシマブを用いてＦｃγＲＩＩａ変異体の親和度測定を遂行した。Ｂｌｉｔｚ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ変異体の結合力を測定した。安定的な分析のために、Ａｍｉｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ） ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）に酢酸ナトリウムｐＨ５．０溶液に４０μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブ抗体を固定化し、１×キネティックバッファー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）で順次希釈したＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型ＳＨ２Ａ４０、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５）をそれぞれ反応させて結合力を分析した（図１１）。平衡結合定数（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ＫＤ）を計算するために、Ｂｌｉｔｚ Ｐｒｏ １．２ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を活用した（表３）。その結果、この研究によって発掘したＳＨ２Ａ４０とＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５は野生型と比較してＦｃに対する結合力がそれぞれ３．５７倍、６．１６倍、８．２６倍増加したことを確認することができた。
ヒト血清の約７０％以上を占め、各種の抗体医薬品に主に使われるＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１のＦｃとの結合力を測定するために、リツキシマブを用いてＦｃγＲＩＩａ変異体の親和度測定を遂行した。Ｂｌｉｔｚ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ変異体の結合力を測定した。安定的な分析のために、Ａｍｉｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ） ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）に酢酸ナトリウムｐＨ５．０溶液に４０μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブ抗体を固定化し、１×キネティックバッファー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）で順次希釈したＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型ＳＨ２Ａ４０、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５）をそれぞれ反応させて結合力を分析した（図１１）。平衡結合定数（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ＫＤ）を計算するために、Ｂｌｉｔｚ Ｐｒｏ １．２ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を活用した（表３）。その結果、この研究によって発掘したＳＨ２Ａ４０とＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５は野生型と比較してＦｃに対する結合力がそれぞれ３．５７倍、６．１６倍、８．２６倍増加したことを確認することができた。
【0130】
［実施例１２：親和性成熟（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５に基づくＦｃγＲＩＩａ ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲライブラリ構築］
ＭＧ２Ａ２８とＭＧ２Ａ４５に基づくＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリを製作するために、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ（ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５）－ＦＬＡＧをテンプレートとして変異性（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを進めた。ＦｃγＲＩＩａ部分に無作為な点突然変異を加えるための方法としてＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いた変異性ＰＣＲ技法を用いた。ライブラリにＭＧ２Ａ２８とＭＧ２Ａ４５の２種の変異体が５０％ずつ同じ比率で存在するようにするためにそれぞれＰＣＲを進め、プライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１を使って全てのＦｃγＲＩＩａ遺伝子で０．３％のヌクレオチドに点突然変異が導入されるようにした。その後、ＳｆｉＩ制限酵素処理及びライゲーション過程を経てＪｕｄｅ１に形質転換してＦｃγＲＩＩａライブラリを製作した（ライブラリの大きさ：２．６×１０９、実験誤差率（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）：０．３２％）。大膓菌の内膜にＦｃγＲＩＩａ変異体がディスプレイされるライブラリを構築した。
ＭＧ２Ａ２８とＭＧ２Ａ４５に基づくＦｃγＲＩＩａ変異体ライブラリを製作するために、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩａ（ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５）－ＦＬＡＧをテンプレートとして変異性（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを進めた。ＦｃγＲＩＩａ部分に無作為な点突然変異を加えるための方法としてＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いた変異性ＰＣＲ技法を用いた。ライブラリにＭＧ２Ａ２８とＭＧ２Ａ４５の２種の変異体が５０％ずつ同じ比率で存在するようにするためにそれぞれＰＣＲを進め、プライマーＭＪ＃１６０、ＭＪ＃１６１を使って全てのＦｃγＲＩＩａ遺伝子で０．３％のヌクレオチドに点突然変異が導入されるようにした。その後、ＳｆｉＩ制限酵素処理及びライゲーション過程を経てＪｕｄｅ１に形質転換してＦｃγＲＩＩａライブラリを製作した（ライブラリの大きさ：２．６×１０９、実験誤差率（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）：０．３２％）。大膓菌の内膜にＦｃγＲＩＩａ変異体がディスプレイされるライブラリを構築した。
【0131】
［実施例１３：構築されたライブラリとフローサイトメトリー分析器によるスクリーニング及びＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１などの変異体選別（ヒト血清ＩｇＧに対する親和度分析）］
構築されたライブラリは、２５０ｍｌフラスコでＴＢ＋２％グルコース培地２５ｍｌに１ｖｉａｌ（１ｍｌ）を溶かし、３７℃で４時間培養した後、１００ｍｌのＴＢ培地が収容された５００ｍｌフラスコで１：１００で接種してＯＤ６００＝０．６まで培養した。直ちに２５℃、２５０ｒｐｍで２０分間冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２５℃、２５０ｒｐｍで５時間過発現した。過発現後、ＯＤ６００値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を回収した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し、１分間遠心分離する洗浄過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃で３０分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加して再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）プローブを一緒に入れ、常温で回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした（１及び２ラウンド：２０ｎＭ、３ラウンド：５ｎＭ）。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳに２０倍希釈し、Ｓ３ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）装備を用いて上位３％の蛍光信号を出す細胞のみ分離して取った。より効率的なスクリーニングのために、分離した細胞をもう一度選別して再選別作業を遂行した。選別された細胞はＭＪ＃１、ＭＪ＃２プライマーとＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）を用いてＰＣＲで遺伝子を増幅し、ＳｆｉＩ制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を介して選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総５ラウンドにかけて繰り返した後、７０余個の個別クローンのＩｇＧ－ＦＩＴＣとの結合による蛍光信号強度を分析した。これにより、ヒト血清ＩｇＧのＦｃ部分と高い親和度を現す変異体を選別し、塩基配列分析によってＭＧ２Ａ２８に基づく変異体とＭＧ２Ａ４５に基づく変異体がそれぞれ１種類ずつ分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）されたことが確認された（図１２）。
構築されたライブラリは、２５０ｍｌフラスコでＴＢ＋２％グルコース培地２５ｍｌに１ｖｉａｌ（１ｍｌ）を溶かし、３７℃で４時間培養した後、１００ｍｌのＴＢ培地が収容された５００ｍｌフラスコで１：１００で接種してＯＤ６００＝０．６まで培養した。直ちに２５℃、２５０ｒｐｍで２０分間冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２５℃、２５０ｒｐｍで５時間過発現した。過発現後、ＯＤ６００値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を回収した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し、１分間遠心分離する洗浄過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃で３０分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加して再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）プローブを一緒に入れ、常温で回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした（１及び２ラウンド：２０ｎＭ、３ラウンド：５ｎＭ）。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳに２０倍希釈し、Ｓ３ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）装備を用いて上位３％の蛍光信号を出す細胞のみ分離して取った。より効率的なスクリーニングのために、分離した細胞をもう一度選別して再選別作業を遂行した。選別された細胞はＭＪ＃１、ＭＪ＃２プライマーとＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ社製）を用いてＰＣＲで遺伝子を増幅し、ＳｆｉＩ制限酵素処理、ライゲーション、形質転換過程を介して選別された細胞の遺伝子が増幅されたサブライブラリを製作した。この過程を総５ラウンドにかけて繰り返した後、７０余個の個別クローンのＩｇＧ－ＦＩＴＣとの結合による蛍光信号強度を分析した。これにより、ヒト血清ＩｇＧのＦｃ部分と高い親和度を現す変異体を選別し、塩基配列分析によってＭＧ２Ａ２８に基づく変異体とＭＧ２Ａ４５に基づく変異体がそれぞれ１種類ずつ分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）されたことが確認された（図１２）。
【0132】
［実施例１４：発掘した変異体を動物細胞で発現するためのクローニング及び発現精製］
発掘した変異体の中でＭＧ２Ａ２８．１（配列リストの第３９配列及び第４７配列）、ＭＧ２Ａ４５．１（配列リストの第４０配列及び第４８配列）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現するために、遺伝子をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＭＪ＃１６２、ＭＪ＃１６３を使ってＰＣＲで増幅した後、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションしてｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ２８．１）、ｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ４５．１）を製作した。動物細胞用発現ベクターであるｐＭＡＺにクローニングした遺伝子はＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入し、３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液は、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌスラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。パススルー溶液（ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、５０ｍｌの１×ＰＢＳ、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２００μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は２５０ｍＭイミダゾールバッファー２．５ｍｌで遂行した。得られたタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を介してＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程によってＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で精製されたタンパク質を確認した（図１３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でＦｃγＲＩＩａタンパク質（３２ｋＤａ）が高純度に精製されたことが確認された。
発掘した変異体の中でＭＧ２Ａ２８．１（配列リストの第３９配列及び第４７配列）、ＭＧ２Ａ４５．１（配列リストの第４０配列及び第４８配列）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現するために、遺伝子をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＭＪ＃１６２、ＭＪ＃１６３を使ってＰＣＲで増幅した後、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションしてｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ２８．１）、ｐＭＡＺ－ＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ４５．１）を製作した。動物細胞用発現ベクターであるｐＭＡＺにクローニングした遺伝子はＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入し、３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養の終わった培養液は、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った。ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌスラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。パススルー溶液（ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を取り、もう一度樹脂に流して結合させた後、５０ｍｌの１×ＰＢＳ、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２００μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は２５０ｍＭイミダゾールバッファー２．５ｍｌで遂行した。得られたタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を介してＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程によってＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で精製されたタンパク質を確認した（図１３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でＦｃγＲＩＩａタンパク質（３２ｋＤａ）が高純度に精製されたことが確認された。
【0133】
［実施例１５：ＩｇＧ１サブクラスからなるリツキシマブを用いた変異体のＦｃに対する結合力を分析するためのＥＬＩＳＡ］
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）で４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａ変異体を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図１４）。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、リツキシマブのＦｃ部分とＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５、ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）に対する結合力を比較分析することができた。
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）で４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａ変異体を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図１４）。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、リツキシマブのＦｃ部分とＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５、ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）に対する結合力を比較分析することができた。
【0134】
［実施例１６：バイオレイヤー干渉法によるＦｃγＲＩＩａ変異体とリツキシマブのＫＤ値測定］
ヒト血清の約７０％以上を占め、各種の抗体医薬品に主に使われるＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１のＦｃとの結合力を測定するために、リツキシマブを用いてＦｃγＲＩＩａ変異体の親和度測定を遂行した。Ｂｌｉｔｚ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ変異体の結合力を測定した。安定的な分析のために、Ａｍｉｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ） ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）に酢酸ナトリウムｐＨ５．０溶液に４０μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブ抗体を固定化し、１×キネティックバッファー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）で順次希釈したＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）をそれぞれ反応させて結合力を分析した（図１５）。平衡結合定数（ＫＤ）を計算するために、Ｂｌｉｔｚ Ｐｒｏ １．２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を活用した（表４）。その結果、この研究によって発掘したＭＧ２Ａ２８．１とＭＧ２Ａ４５．１は野生型と比較してＦｃに対する結合力がそれぞれ５．３９倍、３２．０９倍増加したことを確認することができた。
ヒト血清の約７０％以上を占め、各種の抗体医薬品に主に使われるＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１のＦｃとの結合力を測定するために、リツキシマブを用いてＦｃγＲＩＩａ変異体の親和度測定を遂行した。Ｂｌｉｔｚ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を使ってＦｃγＲＩＩａ変異体の結合力を測定した。安定的な分析のために、Ａｍｉｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ） ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）に酢酸ナトリウムｐＨ５．０溶液に４０μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブ抗体を固定化し、１×キネティックバッファー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）で順次希釈したＦｃγＲＩＩａ変異体（ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）をそれぞれ反応させて結合力を分析した（図１５）。平衡結合定数（ＫＤ）を計算するために、Ｂｌｉｔｚ Ｐｒｏ １．２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を活用した（表４）。その結果、この研究によって発掘したＭＧ２Ａ２８．１とＭＧ２Ａ４５．１は野生型と比較してＦｃに対する結合力がそれぞれ５．３９倍、３２．０９倍増加したことを確認することができた。
【0135】
［実施例１７：マウスモデルを用いた動物実験のためにマウス血清ＩｇＧとの結合力をＥＬＩＳＡで分析］
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したマウス血清ＩｇＧをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５、ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図１６）。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、マウス血清ＩｇＧとＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５、ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）に対する結合力を比較分析することができた。ＭＧ２Ａ２８を除いた全ての変異体は野生型と比較して同等乃至高い親和度でマウス血清ＩｇＧと結合するということが分かり、その中でＭＧ２Ａ４５とＭＧ２Ａ４５．１変異体がマウス血清ＩｇＧと最も高い親和度で結合することを確認した。
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したマウス血清ＩｇＧをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で２時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄を進めた後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５、ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）を５０μｌの各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて分析した（図１６）。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、マウス血清ＩｇＧとＦｃγＲＩＩａ変異体（野生型、ＭＧ２Ａ２８、ＭＧ２Ａ４５、ＭＧ２Ａ２８．１、ＭＧ２Ａ４５．１）に対する結合力を比較分析することができた。ＭＧ２Ａ２８を除いた全ての変異体は野生型と比較して同等乃至高い親和度でマウス血清ＩｇＧと結合するということが分かり、その中でＭＧ２Ａ４５とＭＧ２Ａ４５．１変異体がマウス血清ＩｇＧと最も高い親和度で結合することを確認した。
【0136】
［実施例１８：ＦｃγＲＩＩａと約９６％の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有するＦｃγＲＩＩｂのＦｃに対する親和度に及ぶ影響を確認するための点突然変異導入］
発掘した点突然変異のＦｃγＲＩＩｂ（配列リストの第４１配列及び第４９配列）に対する影響を分析するための実験を遂行した。このために、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩｂ－ＦＬＡＧプラスミドをテンプレートとして使い、ＦｃγＲＩＩｂ遺伝子部分にＭＧ２Ａ４５．１点突然変異（Ｒ５５Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ｔ１１９Ｖ、Ｌ１５９Ｑ、Ｖ１７１Ｅ）のうちＲ５５ＨとＬ１５９Ｑを導入するために、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）技法を用いた。各点突然変異の導入のために、ＭＪ＃２００とＭＪ＃２０１、ＭＪ＃２０２とＭＪ＃２０３プライマーを使い、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてＰＣＲを行った後、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）制限酵素処理のために、３７℃で３時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。準備された遺伝子は、形質転換した後、塩基配列分析によって点突然変異が成功的に挿入されたことを確認した。また、Ｋ１１７Ｎ、Ｔ１１９Ｖ、Ｖ１７１Ｅの３種の点突然変異を導入するために、ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ技法を活用した。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓによってＲ５５ＨとＬ１５９Ｑが導入されているプラスミドをテンプレートとし、ＭＪ＃１６０とＭＪ＃１９７、ＭＪ＃１９８とＭＪ＃１９９プライマーとベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて２個の断片を増幅し、ＭＪ＃１６０とＭＪ＃１９９でアセンブルした。その後、ＳｆｉＩ制限酵素処理及びライゲーション、形質転換過程を経て塩基配列を分析して、ＭＧ２Ａ４５．１の５個の点突然変異が全て挿入されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩｂ（ＭＧ２Ｂ４５．１）－ＦＬＡＧ遺伝子の製作を完了した。
発掘した点突然変異のＦｃγＲＩＩｂ（配列リストの第４１配列及び第４９配列）に対する影響を分析するための実験を遂行した。このために、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩｂ－ＦＬＡＧプラスミドをテンプレートとして使い、ＦｃγＲＩＩｂ遺伝子部分にＭＧ２Ａ４５．１点突然変異（Ｒ５５Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ｔ１１９Ｖ、Ｌ１５９Ｑ、Ｖ１７１Ｅ）のうちＲ５５ＨとＬ１５９Ｑを導入するために、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）技法を用いた。各点突然変異の導入のために、ＭＪ＃２００とＭＪ＃２０１、ＭＪ＃２０２とＭＪ＃２０３プライマーを使い、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてＰＣＲを行った後、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）制限酵素処理のために、３７℃で３時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。準備された遺伝子は、形質転換した後、塩基配列分析によって点突然変異が成功的に挿入されたことを確認した。また、Ｋ１１７Ｎ、Ｔ１１９Ｖ、Ｖ１７１Ｅの３種の点突然変異を導入するために、ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ技法を活用した。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓによってＲ５５ＨとＬ１５９Ｑが導入されているプラスミドをテンプレートとし、ＭＪ＃１６０とＭＪ＃１９７、ＭＪ＃１９８とＭＪ＃１９９プライマーとベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて２個の断片を増幅し、ＭＪ＃１６０とＭＪ＃１９９でアセンブルした。その後、ＳｆｉＩ制限酵素処理及びライゲーション、形質転換過程を経て塩基配列を分析して、ＭＧ２Ａ４５．１の５個の点突然変異が全て挿入されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦｃγＲＩＩｂ（ＭＧ２Ｂ４５．１）－ＦＬＡＧ遺伝子の製作を完了した。
【0137】
［実施例１９：野生型ＦｃγＲＩＩｂとＭＧ２Ａ４５．１突然変異が導入されたＦｃγＲＩＩｂ（ＭＧ２Ｂ４５．１）のヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣに対する親和度比較］
ＦｃγＲＩＩｂ変異体（ＭＧ２Ｂ４５．１）（配列リストの第４２配列及び第５０配列）はヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣに対する親和度を野生型ＦｃγＲＩＩｂと比較分析した。５ｍｌのＴＢ＋２％グルコース培地で前培養した接種材料（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を５ｍｌのＴＢ培地に１：１００で接種してＯＤ６００＝０．６まで培養した。直ちに２５℃、２５０ｒｐｍで２０分間冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍで５時間過発現した。過発現後、ＯＤ６００値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を回収した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し１分間遠心分離する洗浄過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃で３０分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加して再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）プローブを一緒に入れ、常温で１時間回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、Ｇｕａｖａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）装備を用いてＦｃγＲＩＩｂに結合されたヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣによる蛍光信号を分析した（図１７）。
ＦｃγＲＩＩｂ変異体（ＭＧ２Ｂ４５．１）（配列リストの第４２配列及び第５０配列）はヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣに対する親和度を野生型ＦｃγＲＩＩｂと比較分析した。５ｍｌのＴＢ＋２％グルコース培地で前培養した接種材料（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を５ｍｌのＴＢ培地に１：１００で接種してＯＤ６００＝０．６まで培養した。直ちに２５℃、２５０ｒｐｍで２０分間冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍで５時間過発現した。過発現後、ＯＤ６００値を測定し、ノーマライゼーションされた量ずつ１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を回収した。１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して細胞を再懸濁し１分間遠心分離する洗浄過程を２回繰り返した。１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］で再懸濁し、３７℃で３０分間回転させて細胞外膜を除去した。遠心分離して上澄み液を除去した後、１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を添加して再懸濁及び遠心分離を行った。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して再懸濁した後、３７℃で１５分間回転させてペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後、上澄み液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳとヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）プローブを一緒に入れ、常温で１時間回転させてスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリング後、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、Ｇｕａｖａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）装備を用いてＦｃγＲＩＩｂに結合されたヒト血清ＩｇＧ－ＦＩＴＣによる蛍光信号を分析した（図１７）。
【0138】
［実施例２０：血中半減期増加検証のためのベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ） ｓｃＦｖとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ変異体クローニング］
Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの重鎖をテンプレートとして、ベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＢＲ＃１、ＢＲ＃２を用いてＶＨ遺伝子を増幅し、軽鎖をテンプレートとして、プライマーＢＲ＃４、ＢＲ＃５を用いてＶＬ遺伝子を増幅した。それぞれ増幅された遺伝子はプライマーＢＲ＃３に導入されたＧＳリンカーを用いてアセンブルし、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーション過程を経て動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにクローニングしてＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖを製作した。ＦｃγＲＩＩａ野生型とＦｃγＲＩＩａ変異体はプライマーＢＲ＃６、ＢＲ＃７を用いてそれぞれ増幅した。増幅されたＦｃγＲＩＩａ遺伝子はＢＲ＃６に導入されたＧＳリンカーを用いてアセンブルしてＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１遺伝子をそれぞれ増幅した。増幅された遺伝子はＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションし、動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにクローニングしてｐＭＡＺ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、ｐＭＡＺ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型、ｐＭＡＺ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１をそれぞれ製作した。本実施例で用いられたプライマーについての情報は表２の通りである。
Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの重鎖をテンプレートとして、ベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）とプライマーＢＲ＃１、ＢＲ＃２を用いてＶＨ遺伝子を増幅し、軽鎖をテンプレートとして、プライマーＢＲ＃４、ＢＲ＃５を用いてＶＬ遺伝子を増幅した。それぞれ増幅された遺伝子はプライマーＢＲ＃３に導入されたＧＳリンカーを用いてアセンブルし、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーション過程を経て動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにクローニングしてＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖを製作した。ＦｃγＲＩＩａ野生型とＦｃγＲＩＩａ変異体はプライマーＢＲ＃６、ＢＲ＃７を用いてそれぞれ増幅した。増幅されたＦｃγＲＩＩａ遺伝子はＢＲ＃６に導入されたＧＳリンカーを用いてアセンブルしてＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１遺伝子をそれぞれ増幅した。増幅された遺伝子はＢｓｓＨＩＩ、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で制限酵素処理、ライゲーションし、動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにクローニングしてｐＭＡＺ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、ｐＭＡＺ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型、ｐＭＡＺ－Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１をそれぞれ製作した。本実施例で用いられたプライマーについての情報は表２の通りである。
【0139】
【表2】
【0140】
［実施例２１：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ変異体の発現及び精製］
製作された遺伝子はＥｘｐｉ ２９３Ｆ細胞に３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養が終わった後、７５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った後、ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌのスラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。その後、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２５０μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は２５０ｍＭイミダゾールバッファー４ｍｌで遂行した。得られたタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によってＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程を経てＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）によって精製されたタンパク質を確認した（図１８）。
製作された遺伝子はＥｘｐｉ ２９３Ｆ細胞に３００ｍｌの規模で臨時発現した。培養が終わった後、７５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を除去し、上澄み液を取り、２５×ＰＢＳを用いて平衡を保った後、ボトルトップフィルターを用いて０．２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。ＰＢＳで平衡を保ったＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）１ｍｌのスラリーを添加し、４℃で１６時間撹拌した後、ポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に流した。その後、２５ｍｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、２５ｍｌの２０ｍＭイミダゾールバッファー、２５０μｌの２５０ｍＭイミダゾールバッファーの順に洗浄した。溶出は２５０ｍＭイミダゾールバッファー４ｍｌで遂行した。得られたタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によってＰＢＳにバッファーを交替した後、濃縮過程を経てＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）によって精製されたタンパク質を確認した（図１８）。
【0141】
［実施例２２：動物細胞培養によって生産したＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ変異体のＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖの活性及び結合力分析のためにＶＥＧＦを用いて遂行したＥＬＩＳＡ］
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に５００ｎｇ／ｍｌに希釈したＶＥＧＦ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）をそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で１時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ－野生型、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１タンパク質を５０μｌずつ各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるａｎｔｉ－Ｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）のＦｃ ｄｏｍａｉｎとＦｃγＲＩＩａの架橋結合（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ）を防止するために、２０μｇ／ｍｌのヒト血清ＩｇＧを５０μｌずつ各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程を経た後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を分析した。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、ＦｃγＲＩＩａ変異体が融合したＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖのＶＥＧＦに対する結合活性を分析することができた。その結果、ＦｃγＲＩＩａ野生型とＦｃγＲＩＩａ変異体であるＭＧ２Ａ４５．１がＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖに融合してもＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ固有の特性であるＶＥＧＦ結合が正常になされることを確認した（図１９）。また、ＦｃγＲＩＩａが非共有結合によって二量体を成す性質があるから（Maxwell, K. F., M. S. Powell, M. D. Hulett, P. A. Barton, I. F. McKenzie, T. P. Garrett, and P. M. Hogarth. 1999. Crystal structure of the human leukocyte Fc receptor, FcγRIIa. Nat. Struct. Biol.6: 437-442）ＦｃγＲＩＩａが融合したタンパク質がＥＬＩＳＡ上で親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）によって結合力が一層高く現れたことを確認することができた。
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に５００ｎｇ／ｍｌに希釈したＶＥＧＦ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）をそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で１時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ １８０μｌで４回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ－野生型、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１タンパク質を５０μｌずつ各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるａｎｔｉ－Ｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）のＦｃ ｄｏｍａｉｎとＦｃγＲＩＩａの架橋結合（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ）を防止するために、２０μｇ／ｍｌのヒト血清ＩｇＧを５０μｌずつ各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程を経た後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ５０μｌずつを用いて常温で１時間抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を分析した。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進め、ＥＬＩＳＡ結果、ＦｃγＲＩＩａ変異体が融合したＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖのＶＥＧＦに対する結合活性を分析することができた。その結果、ＦｃγＲＩＩａ野生型とＦｃγＲＩＩａ変異体であるＭＧ２Ａ４５．１がＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖに融合してもＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ固有の特性であるＶＥＧＦ結合が正常になされることを確認した（図１９）。また、ＦｃγＲＩＩａが非共有結合によって二量体を成す性質があるから（Maxwell, K. F., M. S. Powell, M. D. Hulett, P. A. Barton, I. F. McKenzie, T. P. Garrett, and P. M. Hogarth. 1999. Crystal structure of the human leukocyte Fc receptor, FcγRIIa. Nat. Struct. Biol.6: 437-442）ＦｃγＲＩＩａが融合したタンパク質がＥＬＩＳＡ上で親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）によって結合力が一層高く現れたことを確認することができた。
【0142】
［実施例２３：動物細胞培養によって生産したＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ変異体のＦｃγＲＩＩａ活性及び結合力分析のためにリツキシマブを用いて遂行したＥＬＩＳＡ］
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で１時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ１８０μｌで４回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１タンパク質を５０μｌずつ各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間の間に抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて吸光度を分析した。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進めた。ＥＬＩＳＡ結果、ＦｃγＲＩＩａのないＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖを除いたＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型とＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ－ＭＧ２Ａ４５．１のＩｇＧ１ Ｆｃから構成されたリツキシマブに対する結合力がいずれも正常に維持されることを確認した。また、Ｆｃとの結合力が向上したＭＧ２Ａ４５．１を融合したタンパク質のリツキシマブに対する結合力がもっと増加したことが現れることから、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖを融合しても野生型ＦｃγＲＩＩａとその変異体であるＭＧ２Ａ４５．１がその特性を維持していることを確認した（図２０）。
０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６に４μｇ／ｍｌに希釈したリツキシマブをそれぞれ５０μｌずつＦｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ ９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間固定化した後、１００μｌの５％ＢＳＡ（０．０５％ＰＢＳＴ）で常温で１時間ブロッキングした。０．０５％ＰＢＳＴ１８０μｌで４回ずつ洗浄した後、ブロッキング溶液で順次希釈されたＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＭＧ２Ａ４５．１タンパク質を５０μｌずつ各ｗｅｌｌに分株し、常温で１時間反応させた。洗浄過程後、ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌずつを用いて常温で１時間の間に抗体反応を進め、洗浄過程を遂行した。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５０μｌずつ添加して発色した後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μｌずつ入れて反応を終了させた後、Ｅｐｏｃｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて吸光度を分析した。各実験はいずれもｄｕｐｌｉｃａｔｅで進めた。ＥＬＩＳＡ結果、ＦｃγＲＩＩａのないＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖを除いたＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ野生型とＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖ－ＦｃγＲＩＩａ－ＭＧ２Ａ４５．１のＩｇＧ１ Ｆｃから構成されたリツキシマブに対する結合力がいずれも正常に維持されることを確認した。また、Ｆｃとの結合力が向上したＭＧ２Ａ４５．１を融合したタンパク質のリツキシマブに対する結合力がもっと増加したことが現れることから、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｓｃＦｖを融合しても野生型ＦｃγＲＩＩａとその変異体であるＭＧ２Ａ４５．１がその特性を維持していることを確認した（図２０）。
【0143】
以上で本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術はただ好適な具現例であるだけ、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付の請求範囲及びその等価物によって定義されると言える。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】