特許7055913質量分析法を用いた、特性評価および／または同定のための、液体培地に由来する抗酸菌を不活性化および抽出するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-08
(45)【発行日】2022-04-18
(54)【発明の名称】質量分析法を用いた、特性評価および／または同定のための、液体培地に由来する抗酸菌を不活性化および抽出するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20220411BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20220411BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20220411BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20220411BHJP
C12R 1/32 20060101ALN20220411BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 C
C12Q1/04
G01N27/62 V
C12M1/34 A
C12M1/34 B
C12R1:32
【請求項の数】
13
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021041681
(22)【出願日】2021-03-15
(62)【分割の表示】P 2018510063の分割
【原出願日】2016-07-15
(65)【公開番号】P2021097707
(43)【公開日】2021-07-01
【審査請求日】2021-04-12
(31)【優先権主張番号】62/306,390
(32)【優先日】2016-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/209,116
(32)【優先日】2015-08-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】502073946
【氏名又は名称】ビオメリュー・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(72)【発明者】
【氏名】パランパル デオル
(72)【発明者】
【氏名】エリック ミラー
(72)【発明者】
【氏名】エリック モレノ
(72)【発明者】
【氏名】ヘザー トッティ
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５１７３１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of clinical microbiology，2014年，Vol.52 No.10，p.3654-3659
【文献】培養関連製品、組織培養・濾過製品，三商研究実験用ガラス製品・機器総合カタログ，2014年，p.46
【文献】培養関連製品、組織培養・濾過製品，三商研究実験用ガラス製品・機器総合カタログ，2014年，p.44
【文献】Journal of clinical microbiology，2013年，Vol.51 No.12，p.4226-4229
【文献】Journal of clinical microbiology，2014年，Vol.52 No.1，p.130-138
【文献】European journal of clinical microbiology and infectious diseases，2015年04月，Vol.34 Vol.8，p.1527-1532
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ１／００－３／００
Ｃ１２Ｎ１／００－７／０８
Ｐｕｂｍｅｄ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の連続的な工程を含む、試験サンプル中のマイコバクテリアを不活性化および抽出するための方法：（ａ）試験サンプルを、液体血液培地中で培養された前記マイコバクテリアを含有する該液体血液培地から、５ｍＬの容積を有する第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；
（ｂ）前記凹型の先端中に前記マイコバクテリアをペレット化するために前記第１のチューブを遠心分離し、次いで、前記凹型の先端に前記マイコバクテリアのペレットを保持しながら、第１の上清の少なくとも９０％をデカントする工程；
（ｃ）第１懸濁液を生成するために、前記マイコバクテリアのペレットをアルコールに再懸濁する工程；
（ｄ）第２懸濁液を生成するために、前記第１懸濁液を、前記第１のチューブから、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；および
（ｅ）前記第２懸濁液中の塊を壊すため、および、マイコバクテリア細胞を破砕するために、前記第２のチューブをアジテートする工程；および
（ｆ）前記試験サンプル中の前記マイコバクテリアを不活性化して不活性化第２懸濁液を生成するために、少なくとも５分間、前記第２懸濁液をインキュベートする工程。
【請求項2】
さらに、以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：（ｇ）前記不活性化第２懸濁液を第３のチューブへと移し、前記不活性化したマイコバクテリアをペレット化するために、該第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程。
【請求項3】
さらに以下の工程を含む、請求項２に記載の方法：（ｈ）前記不活性化したマイコバクテリアを含む溶液を生成するために、前記不活性化したマイコバクテリアのペレットを再懸濁する工程；
（ｉ）不活性化したマイコバクテリアを含む前記溶液から細胞タンパク質を抽出し、前記細胞デブリスをペレット化するために、前記溶液を遠心分離する工程；
（ｊ）工程（ｉ）からの第３の上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移す工程；および
（ｋ）前記不活性化したマイコバクテリアのタンパク質プロファイルを、前記質量分析スライド上で、質量分析装置を用いて同定する工程。
【請求項4】
工程（ｇ）の前記ペレットを、ギ酸に再懸濁する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記再懸濁した不活性化したマイコバクテリアに、アセトニトリルを、３５％から６５％の最終濃度になるまで加える、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記マイコバクテリアのサンプルを、種、系統レベル、および／または、群／複合体まで同定する、請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記マイコバクテリアの１または２以上のマススペクトルを取得するために、前記スライド上の前記試験サンプルを質量分析法によって解析し、前記測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上の参照用マススペクトルと比較することによって、前記試験サンプル中の前記マイコバクテリアを特性評価および／または同定する工程をさらに含む、請求項３から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記サンプルは液体培地に由来し、かつ：工程（ａ）の前記試験サンプルは、液体培地であり；および
工程（ｆ）は前記第２懸濁液をアルコール中でインキュベートする工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記第１の上清の少なくとも９９％が、工程（ｂ）において取り除かれる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記アルコールは、エタノールである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
工程（ｅ）は、前記第２のチューブを、ビーズ式破砕装置またはボルテックスおよびビーズを用いてアジテートする工程を含み、該ビーズは０．５ｍｍのガラスビーズである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記方法は、工程（ｆ）の前記懸濁液を少なくとも１０分間、室温においてインキュベートする工程をさらに含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
以下の連続的な工程を含む、試験サンプル中のマイコバクテリアを不活性化および抽出するための方法：（ａ）３ｍＬの試験サンプルを、液体培地中で培養されたマイコバクテリアを含有する前記液体培地から、微生物の生育についての陽性の結果後２４時間以上７２時間以内に第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、５ｍＬの容積を有する本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；
（ｂ）前記凹型の先端中に前記マイコバクテリアをペレット化するために前記第１のチューブを遠心分離し、次いで、前記凹型の先端に前記マイコバクテリアのペレットを保持しながら、第１の上清の少なくとも９０％をデカントする工程；
（ｃ）余分な液体を取り除くために、前記第１のチューブをブロッティングする工程；
（ｄ）第１懸濁液を生成するために、前記マイコバクテリアのペレットをアルコールに再懸濁する工程；
（ｅ）第２懸濁液を生成するために、前記第１懸濁液を、前記第１のチューブから、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；
（ｆ）前記第２懸濁液中の塊を壊すため、および、マイコバクテリア細胞を破砕するために、前記第２のチューブをアジテートする工程；および
（ｇ）前記試験サンプル中の前記抗酸菌を不活性化して不活性化第２懸濁液を生成するために、少なくとも５分間、前記第２懸濁液をインキュベートする工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはノカルディア
属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）などの抗酸菌を、不活性化および抽出するための方法に関連する
。特に、本発明は、質量分析法を用いた、液体培地中で増殖したマイコバクテリウム属ま
たはノカルディア属の種の迅速な特性評価および／または同定のための方法を対象とする
。
属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）などの抗酸菌を、不活性化および抽出するための方法に関連する
。特に、本発明は、質量分析法を用いた、液体培地中で増殖したマイコバクテリウム属ま
たはノカルディア属の種の迅速な特性評価および／または同定のための方法を対象とする
。
【背景技術】
【0002】
Ｖｉｔｅｋ（登録商標）、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）、およびＭｉｃｒｏｓｃａｎ（登録
商標）システムなどの、従来の自動化表現型ＩＤ試験、またはＡＰＩなどの手動表現型試
験では、ロバストな結果を得るために、微生物が適切な増殖期にあり、かつ干渉する培地
および血液生成物を含まないことを必要とする。これらのシステムでは、プレート状培地
の上で１８から２４時間、陽性培養液から培養したコロニーを用いる。しかしながら、よ
り迅速な結果を得るための試みとして、これらのシステムを臨床サンプルから単離した微
生物とともに用いることが、いくつかの研究室から報告されている。臨床的に意義がある
結果を医者に提供するために、より迅速かつより幅広い特異的な試験が、緊急で必要とさ
れる。
商標）システムなどの、従来の自動化表現型ＩＤ試験、またはＡＰＩなどの手動表現型試
験では、ロバストな結果を得るために、微生物が適切な増殖期にあり、かつ干渉する培地
および血液生成物を含まないことを必要とする。これらのシステムでは、プレート状培地
の上で１８から２４時間、陽性培養液から培養したコロニーを用いる。しかしながら、よ
り迅速な結果を得るための試みとして、これらのシステムを臨床サンプルから単離した微
生物とともに用いることが、いくつかの研究室から報告されている。臨床的に意義がある
結果を医者に提供するために、より迅速かつより幅広い特異的な試験が、緊急で必要とさ
れる。
【0003】
液体培地中で培養した微生物を同定することは、サンプル容器中の微生物の濃度が低く
、および液体培地が質量分析法などの分析方法に干渉することから、特に難しい。
、および液体培地が質量分析法などの分析方法に干渉することから、特に難しい。
【0004】
質量分析法は、微生物の非常に迅速な同定を可能にする可能性を有するが、液体培地中
、および、痰、無菌の体液、またはそれらの組み合わせなどの臨床サンプル中に存在する
多くの化合物からの干渉に直面し得る。
、および、痰、無菌の体液、またはそれらの組み合わせなどの臨床サンプル中に存在する
多くの化合物からの干渉に直面し得る。
【0005】
微生物の特性評価および同定をするための他の方法が、以下を含む文献に記述されてい
る：
る：
【0006】
米国特許第６，１７７，２６６号は、細胞タンパク質抽出物または全細胞のいずれかを
、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－
ＭＳ）で分析することによって生成された、属、種、および系統特異的バイオマーカによ
る、細菌の化学分類学的特性評価のための方法を開示する。
、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－
ＭＳ）で分析することによって生成された、属、種、および系統特異的バイオマーカによ
る、細菌の化学分類学的特性評価のための方法を開示する。
【0007】
米国特許第８，７３５，０９１号は、固体および液体培地に由来する、マイコバクテリ
ウム属またはノカルディア属などの抗酸菌を、不活性化および抽出するための方法を開示
する。しかしながらこの‘０９１特許においては、液体培地中で増殖させた場合の、抗酸
菌のタンパク質抽出に伴う難しさが認識されていない。特に、‘０９１特許においては、
質量分析法を用いて同定するために、十分な量の微生物のバイオマスを液体培地から確保
することの難しさが認識されていない。さらに、‘０９１特許においては、質量分析法を
用いた同定に干渉する、不活性化溶液を取り除くことの難しさが認識されていない。‘０
９１特許においては、特定の大きさおよび／または形状を有するチューブ中で、不活性化
および抽出するために抗酸菌の十分なバイオマスを収集および保持することによる、予期
しない利益が認識されていない。最後に、‘０９１特許は、質量分析法を用いた同定のた
めに、ペレットを液体培地から分離して干渉を避けることの難しさに対処していない。
ウム属またはノカルディア属などの抗酸菌を、不活性化および抽出するための方法を開示
する。しかしながらこの‘０９１特許においては、液体培地中で増殖させた場合の、抗酸
菌のタンパク質抽出に伴う難しさが認識されていない。特に、‘０９１特許においては、
質量分析法を用いて同定するために、十分な量の微生物のバイオマスを液体培地から確保
することの難しさが認識されていない。さらに、‘０９１特許においては、質量分析法を
用いた同定に干渉する、不活性化溶液を取り除くことの難しさが認識されていない。‘０
９１特許においては、特定の大きさおよび／または形状を有するチューブ中で、不活性化
および抽出するために抗酸菌の十分なバイオマスを収集および保持することによる、予期
しない利益が認識されていない。最後に、‘０９１特許は、質量分析法を用いた同定のた
めに、ペレットを液体培地から分離して干渉を避けることの難しさに対処していない。
【0008】
したがって、当該技術分野において、後続の質量分析法による分析、特性評価、および
／または同定のために、液体培地に由来する微生物を不活性化および／または抽出するた
めの、効率がよく、かつ迅速なプロトコールに対する要求が残されている。特に、不活性
化または細胞死は、マイコバクテリウム属またはノカルディア属などの抗酸菌を、バイオ
セーフティレベル３（ＢＳＬ－３／Ｐ３）環境の外において続けて取り扱うためにしばし
ば必要である。
／または同定のために、液体培地に由来する微生物を不活性化および／または抽出するた
めの、効率がよく、かつ迅速なプロトコールに対する要求が残されている。特に、不活性
化または細胞死は、マイコバクテリウム属またはノカルディア属などの抗酸菌を、バイオ
セーフティレベル３（ＢＳＬ－３／Ｐ３）環境の外において続けて取り扱うためにしばし
ば必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】米国特許第６，１７７，２６６号
【文献】米国特許第８，７３５，０９１号
【発明の概要】
【発明を解決するための手段】
【0010】
一実施形態において、本発明は、液体培地に由来する試験サンプル中の抗酸菌（例えば
、マイコバクテリウム属またはノカルディア属の種）を不活性化および抽出するための方
法を対象とし、該方法は、以下の連続的な工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を
含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体
、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する
該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するために前
記第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、凹型の
先端で終わる円錐台形の部分は、第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、
抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；（ｃ）抗酸菌
のペレットをアルコールに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、第１のチューブから、ビー
ズを含む第２のチューブへと移す工程；（ｅ）塊を壊すため、および／または、第２のチ
ューブ中の抗酸菌細胞を破砕するために、第２のチューブをアジテートする工程；および
（ｆ）試験サンプル中の抗酸菌を不活性化するために、少なくとも５分間、懸濁液をイン
キュベートする工程。
、マイコバクテリウム属またはノカルディア属の種）を不活性化および抽出するための方
法を対象とし、該方法は、以下の連続的な工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を
含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体
、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する
該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するために前
記第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、凹型の
先端で終わる円錐台形の部分は、第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、
抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；（ｃ）抗酸菌
のペレットをアルコールに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、第１のチューブから、ビー
ズを含む第２のチューブへと移す工程；（ｅ）塊を壊すため、および／または、第２のチ
ューブ中の抗酸菌細胞を破砕するために、第２のチューブをアジテートする工程；および
（ｆ）試験サンプル中の抗酸菌を不活性化するために、少なくとも５分間、懸濁液をイン
キュベートする工程。
【0011】
一実施形態において、抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属
）ペレットは、工程（ｃ）において、約５０％から約１００％のエタノールに再懸濁する
ことができ、例えば、ペレットは、約７０％のエタノールに再懸濁することができる。方
法は、工程（ｅ）において、約１分間から約３０分間、ビーズ式破砕をする工程、および
／または、容器をボルテックスする工程を、さらに含み得る。一実施形態において、ビー
ズは、０．５ｍｍのガラスビーズである。一実施形態において、続くインキュベーション
工程（ｆ）は、少なくとも約３分間、または少なくとも約１０分間のインキュベーション
を含む。一実施形態において、工程（ｆ）におけるインキュベーションは、室温において
実施される。
）ペレットは、工程（ｃ）において、約５０％から約１００％のエタノールに再懸濁する
ことができ、例えば、ペレットは、約７０％のエタノールに再懸濁することができる。方
法は、工程（ｅ）において、約１分間から約３０分間、ビーズ式破砕をする工程、および
／または、容器をボルテックスする工程を、さらに含み得る。一実施形態において、ビー
ズは、０．５ｍｍのガラスビーズである。一実施形態において、続くインキュベーション
工程（ｆ）は、少なくとも約３分間、または少なくとも約１０分間のインキュベーション
を含む。一実施形態において、工程（ｆ）におけるインキュベーションは、室温において
実施される。
【0012】
他の実施形態においては、方法は、タンパク質抽出の一部として、以下の追加の連続的
な工程をさらに含む：（ｇ）懸濁液を第３のチューブへと移し、不活性化した抗酸菌をペ
レット化するために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；
および（ｈ）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌のペ
レットを再懸濁する工程。いくつかの実施形態においては、工程（ｈ）からの上清を直接
、または水懸濁液として、質量分析スライドまたはプレートへと適用することができる。
な工程をさらに含む：（ｇ）懸濁液を第３のチューブへと移し、不活性化した抗酸菌をペ
レット化するために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；
および（ｈ）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌のペ
レットを再懸濁する工程。いくつかの実施形態においては、工程（ｈ）からの上清を直接
、または水懸濁液として、質量分析スライドまたはプレートへと適用することができる。
【0013】
工程（ｇ）におけるペレットは、約５０％から約９０％のギ酸を用いて、再懸濁し得、
例えば、工程（ｈ）において、ペレットは、７０％のギ酸を用いて、再懸濁し得る。ペレ
ットを再懸濁する工程の後、アセトニトリルの最終濃度が約３５％から約６５％となるま
で、例えば、約５０％の最終濃度となるまで、アセトニトリルを加え得る。一実施形態に
おいて、ペレットは、工程（ｈ）において１０μＬのギ酸に再懸濁し得、および工程（ｈ
）においてペレットを再懸濁するために１０μＬのアセトニトリルを加え得る。いくつか
の実施形態においては、工程（ｉ）に示すように、細胞デブリスをペレット化するために
、懸濁液を遠心分離し得る。
例えば、工程（ｈ）において、ペレットは、７０％のギ酸を用いて、再懸濁し得る。ペレ
ットを再懸濁する工程の後、アセトニトリルの最終濃度が約３５％から約６５％となるま
で、例えば、約５０％の最終濃度となるまで、アセトニトリルを加え得る。一実施形態に
おいて、ペレットは、工程（ｈ）において１０μＬのギ酸に再懸濁し得、および工程（ｈ
）においてペレットを再懸濁するために１０μＬのアセトニトリルを加え得る。いくつか
の実施形態においては、工程（ｉ）に示すように、細胞デブリスをペレット化するために
、懸濁液を遠心分離し得る。
【0014】
本実施形態にしたがい、方法は、以下の追加の連続的な工程をさらに含み得る：（ｊ）
工程（ｉ）からの上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移し、マトリッ
クス溶液を加える工程；および（ｋ）抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得す
るために、不活性化した抗酸菌のタンパク質プロファイルを、質量分析スライド上で、質
量分析装置を用いて同定し、測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上の参
照用マススペクトルと比較することによって、試験サンプル中の抗酸菌を特性評価および
／または同定する工程。任意で、工程（ｊ）は、工程（ｉ）から得られた試験サンプルの
アリコート（例えば、１μＬ）を、質量分析スライドまたはプレートへと移す工程を含み
、これにより、アリコートを乾燥することができ、かつ次いでマトリックスを加える。任
意の公知のマトリックスを用いることができ、例えば、マトリックスは、アルファ‐シア
ノ‐４‐ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）であり得る。本発明にしたがって、抗酸菌を、質
量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて、科、属、種、系統レベル、
および／または、群／複合体まで同定することができる。
工程（ｉ）からの上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移し、マトリッ
クス溶液を加える工程；および（ｋ）抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得す
るために、不活性化した抗酸菌のタンパク質プロファイルを、質量分析スライド上で、質
量分析装置を用いて同定し、測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上の参
照用マススペクトルと比較することによって、試験サンプル中の抗酸菌を特性評価および
／または同定する工程。任意で、工程（ｊ）は、工程（ｉ）から得られた試験サンプルの
アリコート（例えば、１μＬ）を、質量分析スライドまたはプレートへと移す工程を含み
、これにより、アリコートを乾燥することができ、かつ次いでマトリックスを加える。任
意の公知のマトリックスを用いることができ、例えば、マトリックスは、アルファ‐シア
ノ‐４‐ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）であり得る。本発明にしたがって、抗酸菌を、質
量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて、科、属、種、系統レベル、
および／または、群／複合体まで同定することができる。
【0015】
一実施形態に関して記載された任意の１または２以上の態様または特徴は、それに関し
て具体的に記載されていないが、異なる実施形態に組み込むことができることに留意され
たい。すなわち、任意の実施形態のすべての実施形態および／または特徴は、任意の方法
および／または組み合わせで組み合わせることができる。出願人は、最初に提出した任意
の請求項を変更する、またはそれに応じて任意の新しい請求項を提出する権利を留保し、
それは、最初に提出した任意の請求項を、その様式において最初に請求項化されていなく
ても、任意の他の請求項の任意の特徴に従属する、および／または、任意の他の請求項の
任意の特徴を取りこむように、補正することができる権利を含む。本発明のこれらおよび
他の目的および／または態様を、以下に示す明細書において詳細に説明する。
て具体的に記載されていないが、異なる実施形態に組み込むことができることに留意され
たい。すなわち、任意の実施形態のすべての実施形態および／または特徴は、任意の方法
および／または組み合わせで組み合わせることができる。出願人は、最初に提出した任意
の請求項を変更する、またはそれに応じて任意の新しい請求項を提出する権利を留保し、
それは、最初に提出した任意の請求項を、その様式において最初に請求項化されていなく
ても、任意の他の請求項の任意の特徴に従属する、および／または、任意の他の請求項の
任意の特徴を取りこむように、補正することができる権利を含む。本発明のこれらおよび
他の目的および／または態様を、以下に示す明細書において詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
本開示の方法およびキットを、以下の添付の図と一緒に説明する：
【図4】図４は、ＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）中でインキュベートした、さまざまなマイコバクテリウム属の系統の同定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、異なる形態で実施することができ、本明細書に記載された実施形態に限定さ
れると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を徹底的かつ完全
にするため、および本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一
実施形態に関して説明された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、および特定の
実施形態に関して説明された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、
本明細書に示唆された実施形態に対する多くの変形および追加は、本開示に照らして当業
者には明らかであり、本発明から逸脱しない。
れると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を徹底的かつ完全
にするため、および本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一
実施形態に関して説明された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、および特定の
実施形態に関して説明された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、
本明細書に示唆された実施形態に対する多くの変形および追加は、本開示に照らして当業
者には明らかであり、本発明から逸脱しない。
【0018】
本譲受人らのＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳシステム（ビオメリュー・インコーポレイテ
ッド、ミズーリ州セントルイス）は、サンプルのタンパク質プロファイルを分析し、およ
び公知の生物のプロファイルのデータベースと一致させるために、マトリックス支援レー
ザー脱離イオン化法―飛行時間型（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）質量分析計を用いた、細菌の同
定のためのプラットフォームを提供する。サンプルをターゲットスライド上に置き、マト
リックス（例えば、ＣＨＣＡマトリックス（α‐シアノ‐４‐ヒドロキシ‐桂皮酸マトリ
ックス））によって覆い、およびそれから、質量分析計で処理した。
ッド、ミズーリ州セントルイス）は、サンプルのタンパク質プロファイルを分析し、およ
び公知の生物のプロファイルのデータベースと一致させるために、マトリックス支援レー
ザー脱離イオン化法―飛行時間型（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）質量分析計を用いた、細菌の同
定のためのプラットフォームを提供する。サンプルをターゲットスライド上に置き、マト
リックス（例えば、ＣＨＣＡマトリックス（α‐シアノ‐４‐ヒドロキシ‐桂皮酸マトリ
ックス））によって覆い、およびそれから、質量分析計で処理した。
【0019】
最も一般的な臨床的に意義のある微生物を、細胞を直接ＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳタ
ーゲットスライド上へと置くことによって分析することができる。分析のための抗酸菌（
例えば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）サンプルの調製は、バイオセーフ
ティレベル３（ＢＳＬ‐３／Ｐ３）環境の外でサンプルを安全に操作することができるよ
うにするために、不活性化工程が必要であるという点において、標準的な手順とは異なる
。さらに、液体培地由来のサンプルを分析することは、十分な量のバイオマスを確保する
こと、および同定に干渉する不活性化溶液を排除することへの挑戦につながる。
ーゲットスライド上へと置くことによって分析することができる。分析のための抗酸菌（
例えば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）サンプルの調製は、バイオセーフ
ティレベル３（ＢＳＬ‐３／Ｐ３）環境の外でサンプルを安全に操作することができるよ
うにするために、不活性化工程が必要であるという点において、標準的な手順とは異なる
。さらに、液体培地由来のサンプルを分析することは、十分な量のバイオマスを確保する
こと、および同定に干渉する不活性化溶液を排除することへの挑戦につながる。
【0020】
本出願において、アルコール中におけるインキュベーションを機械的破砕と組み合わせ
ることによって、抗酸菌の不活性化のための、効果的かつ迅速な方法がもたらされること
が見出された。アジテーションまたは機械的破砕の工程と、その後破砕したサンプルをア
ルコール中において室温で、少なくとも３分間、少なくとも５分間、または少なくとも１
０分間、インキュベートすることによる不活性化工程とを含むプロセスを用いるときに、
アルコールへの曝露が効果的であることを示した。いくつかの実施形態において、アルコ
ールはエタノールである。一実施形態において、機械的破砕は、ボルテックス、または、
サンプル、抽出溶媒、およびビーズ（例えば、ごく小さいガラスビーズ）を含む封をした
マイクロ遠心チューブをアジテートすることによって細胞を破砕するホモジナイザーであ
る、ビーズ式破砕装置（ＢｉｏＳｐｅｃ、オクハラマ州バートルズビル）を用いて実施す
る。典型的には、ビーズは、微量遠心チューブの中で細胞を破砕するために機能すること
ができる、任意の公知のビーズであり得る。例えば、ビーズは、ガラス、セラミック、ジ
ルコニア、シリコン、金属、スチール、タングステンカーバイド、ガーネット、砂、また
はサファイアビーズであり得る。一実施形態において、ビーズは、約０．１ｍｍから約１
ｍｍの大きさであり得、例えば、約０．５ｍｍの大きさであり得る。
ることによって、抗酸菌の不活性化のための、効果的かつ迅速な方法がもたらされること
が見出された。アジテーションまたは機械的破砕の工程と、その後破砕したサンプルをア
ルコール中において室温で、少なくとも３分間、少なくとも５分間、または少なくとも１
０分間、インキュベートすることによる不活性化工程とを含むプロセスを用いるときに、
アルコールへの曝露が効果的であることを示した。いくつかの実施形態において、アルコ
ールはエタノールである。一実施形態において、機械的破砕は、ボルテックス、または、
サンプル、抽出溶媒、およびビーズ（例えば、ごく小さいガラスビーズ）を含む封をした
マイクロ遠心チューブをアジテートすることによって細胞を破砕するホモジナイザーであ
る、ビーズ式破砕装置（ＢｉｏＳｐｅｃ、オクハラマ州バートルズビル）を用いて実施す
る。典型的には、ビーズは、微量遠心チューブの中で細胞を破砕するために機能すること
ができる、任意の公知のビーズであり得る。例えば、ビーズは、ガラス、セラミック、ジ
ルコニア、シリコン、金属、スチール、タングステンカーバイド、ガーネット、砂、また
はサファイアビーズであり得る。一実施形態において、ビーズは、約０．１ｍｍから約１
ｍｍの大きさであり得、例えば、約０．５ｍｍの大きさであり得る。
【0021】
明確かつ一貫したスペクトルをもたらすために、不活性化した細胞からの細胞タンパク
質の抽出を助けるための追加の処理工程を用いることができる。例えば、ギ酸による処置
工程に続いてアセトニトリルに曝す工程を用い、後の分析（例えば、質量分析法による）
用にタンパク質を抽出及び溶解してもよい。
質の抽出を助けるための追加の処理工程を用いることができる。例えば、ギ酸による処置
工程に続いてアセトニトリルに曝す工程を用い、後の分析（例えば、質量分析法による）
用にタンパク質を抽出及び溶解してもよい。
【0022】
本発明は、液体培地に由来する試験サンプル中の未知の抗酸菌を不活性化、抽出、特性
評価、および／または、同定する方法を提供する。本発明はまた、質量分析法を用いた、
液体培地に由来する試験サンプル中の抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノ
カルディア属）を迅速に特性評価および／または同定するための方法を対象とする。迅速
な方法によって、従来の技術に比べてより迅速に抗酸菌を特性評価および／または同定す
ることができ、試験サンプルのより迅速な診断および特性評価／同定につながる。サンプ
ルの取得から、抗酸菌のサンプルの特性評価／同定までの、本発明の方法に含まれる工程
は、臨床的に意義がある利用できる情報を得るために、とても短い時間枠において実行す
ることができる。特定の実施形態において、本発明の方法は、約１２０分間未満、たとえ
ば、約１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、また
は１０分間未満で、実行することができる。本発明の方法の迅速性は、従来の方法に対す
る改善を表す。
評価、および／または、同定する方法を提供する。本発明はまた、質量分析法を用いた、
液体培地に由来する試験サンプル中の抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノ
カルディア属）を迅速に特性評価および／または同定するための方法を対象とする。迅速
な方法によって、従来の技術に比べてより迅速に抗酸菌を特性評価および／または同定す
ることができ、試験サンプルのより迅速な診断および特性評価／同定につながる。サンプ
ルの取得から、抗酸菌のサンプルの特性評価／同定までの、本発明の方法に含まれる工程
は、臨床的に意義がある利用できる情報を得るために、とても短い時間枠において実行す
ることができる。特定の実施形態において、本発明の方法は、約１２０分間未満、たとえ
ば、約１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、また
は１０分間未満で、実行することができる。本発明の方法の迅速性は、従来の方法に対す
る改善を表す。
【0023】
本発明の一実施形態において、サンプルは、抗酸菌感染を有する、または有すると疑わ
れる被験者（たとえば、患者）から得られる。本明細書中で用いられる場合、用語「抗酸
菌」は、マイコバクテリウム属およびアクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）（
ノカルディア属、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄ
ｏｎｉａ）、ツカムレラ属（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、およびディエチア属（Ｄｉｅ
ｔｚｉａ））を包含するが、これらに限定されない任意の抗酸菌を包含する。
れる被験者（たとえば、患者）から得られる。本明細書中で用いられる場合、用語「抗酸
菌」は、マイコバクテリウム属およびアクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）（
ノカルディア属、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄ
ｏｎｉａ）、ツカムレラ属（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、およびディエチア属（Ｄｉｅ
ｔｚｉａ））を包含するが、これらに限定されない任意の抗酸菌を包含する。
【0024】
本明細書中で用いられる場合、用語「マイコバクテリア」または「マイコバクテリウム
属」は、マイコバクテリウム ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂ
ｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒ
ｏｔｉ）、マイコバクテリウム アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉ
ｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎ
ｅｔｔｉ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ
）、マイコバクテリウム イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒ
ａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム カンサシ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム マルモエンス（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウム マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム シミアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｉｍｉａｅ）、マイコバクテリウム テラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｅｒｒａｅ）、マイコバクテリウム ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌ
ｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム アブセッサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａ
ｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウム フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム ケロネー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム アルベイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｌｖｅｉ）、マイコバクテリウム ファルシノゲネス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム フォーチュイタム フォー
チュイタム亜種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ｓｓｐ ｆｏｒｔ
ｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム ハウストネンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｈ
ｏｕｓｔｏｎｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ペレグリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム ポルシナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｐｏｒｃｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム セネガレンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ゲナベンス（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ヘモフィルム（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、マイコバクテリウム イムノゲナム
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ）、マイコバクテリウム レン
ティフラバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｉｆｌａｖｕｍ）、マイコバクテ
リウム ムコゲニカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ）、マイ
コバクテリウム ツルガイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｚｕｌｇａｉ）、マイコバ
クテリウム ツベルクローシス複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）およびマイコバクテリウム ゴードナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）などの、迅速発育菌、または遅発育菌を包含するが、こ
れらに限定されない任意の公知のマイコバクテリウム属を含むことを意図している。いく
つかの実施形態において、Ｍ． アブセッサス（Ｍ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、Ｍ． フ
ォーチュイタム（Ｍ． ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ． ケロネー（Ｍ． ｃｈｅｌｏｎａ
ｅ）、およびＭ． スメグマチス（Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）などの迅速発育菌は、短
い時間で同定することができ、診断および処理を助ける。予期できなかったことに、遅発
育菌マイコバクテリウム属の種もまた、敏速に不活性化および抽出することができ、また
、図４～６に示すように、短い時間で同定できた。
属」は、マイコバクテリウム ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂ
ｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒ
ｏｔｉ）、マイコバクテリウム アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉ
ｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎ
ｅｔｔｉ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ
）、マイコバクテリウム イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒ
ａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム カンサシ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム マルモエンス（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウム マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム シミアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｉｍｉａｅ）、マイコバクテリウム テラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｅｒｒａｅ）、マイコバクテリウム ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌ
ｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム アブセッサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａ
ｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウム フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム ケロネー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム アルベイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｌｖｅｉ）、マイコバクテリウム ファルシノゲネス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム フォーチュイタム フォー
チュイタム亜種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ｓｓｐ ｆｏｒｔ
ｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム ハウストネンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｈ
ｏｕｓｔｏｎｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ペレグリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム ポルシナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｐｏｒｃｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム セネガレンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ゲナベンス（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ヘモフィルム（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、マイコバクテリウム イムノゲナム
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ）、マイコバクテリウム レン
ティフラバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｉｆｌａｖｕｍ）、マイコバクテ
リウム ムコゲニカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ）、マイ
コバクテリウム ツルガイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｚｕｌｇａｉ）、マイコバ
クテリウム ツベルクローシス複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）およびマイコバクテリウム ゴードナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）などの、迅速発育菌、または遅発育菌を包含するが、こ
れらに限定されない任意の公知のマイコバクテリウム属を含むことを意図している。いく
つかの実施形態において、Ｍ． アブセッサス（Ｍ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、Ｍ． フ
ォーチュイタム（Ｍ． ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ． ケロネー（Ｍ． ｃｈｅｌｏｎａ
ｅ）、およびＭ． スメグマチス（Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）などの迅速発育菌は、短
い時間で同定することができ、診断および処理を助ける。予期できなかったことに、遅発
育菌マイコバクテリウム属の種もまた、敏速に不活性化および抽出することができ、また
、図４～６に示すように、短い時間で同定できた。
【0025】
本明細書中で用いられる場合、用語「ノカルディア属」は、ノカルディア アエロコロ
ニゲネス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）、ノカルディア アフ
リカーナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ノカルディア アルゼンティネンシ
ス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ）、ノカルディア アステロイデス
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ノカルディア ブラックウェルイー（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ｂｌａｃｋｗｅｌｌｉｉ）、ノカルディア ブラジリエンシス（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア ブレビカテナ（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ｂｒｅｖｉｃａｔｅｎａ）、ノカルディア カメア（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｍｅａ
）、ノカルディア カヴィエ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｖｉａｅ）、ノカルディア セラ
ドエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｅｒｒａｄｏｅｎｓｉｓ）ノカルディア コラリナ（
Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ノカルディア シリアシジョージカ（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ ｃｙｒｉａｃｉｇｅｏｒｇｉｃａ）、ノカルディア ダソンヴィレイ（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ノカルディア エレガンス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、ノカルディア ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉ
ｎｉｃａ）、ノカルディア ナイジイタンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｎｉｇｉｉｔａｎｓ
ｉｓ）、ノカルディア ノヴァ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｎｏｖａ）、ノカルディア オパカ
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｐａｃａ）、ノカルディア オティティジス－キャビアルム（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓ－ｃａｖａｒｉｕｍ）、ノカルディア パウシボラン
ス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ノカルディア シュードブラシリエ
ンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐｓｅｕｄｏｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア
ルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ）、ノカルディア セリオラエ（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、ノカルディア トランスバレンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｔｒ
ａｎｓｖｅｌｅｎｃｅｓｉｓ）、ノカルディア ユニフォルミス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｕ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ノカルディア ヴァシニ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｖａｃｃｉｎｉｉ）
、およびノカルディア ベテラナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｖｅｔｅｒａｎａ）を包含するが
、これらに限定されない任意の公知のノカルディア属を包含することを意図している。
ニゲネス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）、ノカルディア アフ
リカーナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ノカルディア アルゼンティネンシ
ス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ）、ノカルディア アステロイデス
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ノカルディア ブラックウェルイー（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ｂｌａｃｋｗｅｌｌｉｉ）、ノカルディア ブラジリエンシス（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア ブレビカテナ（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ｂｒｅｖｉｃａｔｅｎａ）、ノカルディア カメア（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｍｅａ
）、ノカルディア カヴィエ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｖｉａｅ）、ノカルディア セラ
ドエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｅｒｒａｄｏｅｎｓｉｓ）ノカルディア コラリナ（
Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ノカルディア シリアシジョージカ（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ ｃｙｒｉａｃｉｇｅｏｒｇｉｃａ）、ノカルディア ダソンヴィレイ（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ノカルディア エレガンス（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、ノカルディア ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉ
ｎｉｃａ）、ノカルディア ナイジイタンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｎｉｇｉｉｔａｎｓ
ｉｓ）、ノカルディア ノヴァ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｎｏｖａ）、ノカルディア オパカ
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｐａｃａ）、ノカルディア オティティジス－キャビアルム（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓ－ｃａｖａｒｉｕｍ）、ノカルディア パウシボラン
ス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ノカルディア シュードブラシリエ
ンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐｓｅｕｄｏｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア
ルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ）、ノカルディア セリオラエ（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、ノカルディア トランスバレンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｔｒ
ａｎｓｖｅｌｅｎｃｅｓｉｓ）、ノカルディア ユニフォルミス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｕ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ノカルディア ヴァシニ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｖａｃｃｉｎｉｉ）
、およびノカルディア ベテラナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｖｅｔｅｒａｎａ）を包含するが
、これらに限定されない任意の公知のノカルディア属を包含することを意図している。
【0026】
本明細書で用いられる場合、「特性評価」は、生物学的粒子の幅広いカテゴリ化、また
は分類、および／または、抗酸菌の科、属、種、および／または系統レベルまたは群／複
合体の実際の同定を包含する。分類は、抗酸菌の表現型および／または形態上の特性の判
定を含んでもよい。例えば、細菌の特性評価は、構造、形、大きさ、着色、クラスタリン
グ、および／または代謝などの観察できる違いに基づいて達成されてもよい。
は分類、および／または、抗酸菌の科、属、種、および／または系統レベルまたは群／複
合体の実際の同定を包含する。分類は、抗酸菌の表現型および／または形態上の特性の判
定を含んでもよい。例えば、細菌の特性評価は、構造、形、大きさ、着色、クラスタリン
グ、および／または代謝などの観察できる違いに基づいて達成されてもよい。
【0027】
本明細書で使用される場合、「同定」とは、これまで未知とされてきた抗酸菌（例えば
、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）が、どの科、属、種、系統、または群／
複合体に属するかを決定することを意味する。例えば、これまで未知とされてきた抗酸菌
を、科、属、種、系統レベル、および／または、群／複合体まで同定することなどである
。
、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）が、どの科、属、種、系統、または群／
複合体に属するかを決定することを意味する。例えば、これまで未知とされてきた抗酸菌
を、科、属、種、系統レベル、および／または、群／複合体まで同定することなどである
。
【0028】
実施態様において、本発明は、液体培地中に含まれる抗酸菌の不活性化方法を対象とす
る。一実施形態においては、方法は以下の工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を
含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体
、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する
該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するために第
１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、凹型の先端
で終わる円錐台形の部分は、第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、抗酸
菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；（ｃ）抗酸菌のペ
レットをアルコールに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、ビーズを含む第２のチューブへ
と移す工程；（ｅ）第２のチューブ中の塊を壊すため、および／または、抗酸菌細胞を破
砕するために、第２のチューブをアジテートする工程；および（ｆ）試験サンプル中の抗
酸菌を不活性化するために、少なくとも５分間、懸濁液をインキュベートする工程。
る。一実施形態においては、方法は以下の工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を
含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体
、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する
該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するために第
１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、凹型の先端
で終わる円錐台形の部分は、第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、抗酸
菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；（ｃ）抗酸菌のペ
レットをアルコールに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、ビーズを含む第２のチューブへ
と移す工程；（ｅ）第２のチューブ中の塊を壊すため、および／または、抗酸菌細胞を破
砕するために、第２のチューブをアジテートする工程；および（ｆ）試験サンプル中の抗
酸菌を不活性化するために、少なくとも５分間、懸濁液をインキュベートする工程。
【0029】
一実施形態においては、取得した液体培養サンプルは、約０．５ｍＬから約１０ｍＬ、
約１ｍＬから約５ｍＬ、約１ｍＬから約３ｍＬ、または約１、２、３、４、もしくは５ｍ
Ｌであり得る。例示的な実施形態においては、陽性の液体培地から取得したサンプルは、
約３ｍＬである。液体培養サンプルからの少なくとも約３ｍＬを含むサンプルは、質量分
析法による正確な同定をもたらすために十分な微生物を有することが見出されている。
約１ｍＬから約５ｍＬ、約１ｍＬから約３ｍＬ、または約１、２、３、４、もしくは５ｍ
Ｌであり得る。例示的な実施形態においては、陽性の液体培地から取得したサンプルは、
約３ｍＬである。液体培養サンプルからの少なくとも約３ｍＬを含むサンプルは、質量分
析法による正確な同定をもたらすために十分な微生物を有することが見出されている。
【0030】
いくつかの実施形態においては、抗酸菌を含有する液体培地は、抗酸菌について陽性の
試験結果が得られたサンプル容器である。たとえば、サンプル容器は、被験者からの生物
学的サンプルを培養し得る。被験者が抗酸菌について陽性であるとき、サンプル容器は、
たとえば容器内のセンサによって、陽性と認定される。一実施形態においては、液体培養
サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、少なくとも約２４時間後に取得される
。いくつかの実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定され
た後、約２４時間から７２時間の間に、取得される。さらなる実施形態においては、液体
培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、１時間、２時間、４時間、６時間
、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４時間後に、取得される
。さらに他の実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定され
た後、４８時間よりも遅くに取得される。いくつかの実施形態においては、陽性と認定さ
れた後もサンプル容器をインキュベートし続けることによって、サンプル容器内の微生物
の個体数が増加する。たとえば、いくつかの実施形態においては、抗酸菌についての必要
とされるバイオマスとして、最低濃度の１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬがサンプル中に存在
する。このようにして、液体培養サンプル中の微生物の濃度はより多くなり、かつ、質量
分析により正確に同定できる可能性がより増加する。さらに、いくつかの研究室において
は、日または週の間に、サンプル容器を評価することができない時が存在し得る。本方法
は、時間の長さに融通がきき、サンプル容器が陽性と認定された後、サンプル容器をイン
キュベートし得る。
試験結果が得られたサンプル容器である。たとえば、サンプル容器は、被験者からの生物
学的サンプルを培養し得る。被験者が抗酸菌について陽性であるとき、サンプル容器は、
たとえば容器内のセンサによって、陽性と認定される。一実施形態においては、液体培養
サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、少なくとも約２４時間後に取得される
。いくつかの実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定され
た後、約２４時間から７２時間の間に、取得される。さらなる実施形態においては、液体
培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、１時間、２時間、４時間、６時間
、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４時間後に、取得される
。さらに他の実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定され
た後、４８時間よりも遅くに取得される。いくつかの実施形態においては、陽性と認定さ
れた後もサンプル容器をインキュベートし続けることによって、サンプル容器内の微生物
の個体数が増加する。たとえば、いくつかの実施形態においては、抗酸菌についての必要
とされるバイオマスとして、最低濃度の１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬがサンプル中に存在
する。このようにして、液体培養サンプル中の微生物の濃度はより多くなり、かつ、質量
分析により正確に同定できる可能性がより増加する。さらに、いくつかの研究室において
は、日または週の間に、サンプル容器を評価することができない時が存在し得る。本方法
は、時間の長さに融通がきき、サンプル容器が陽性と認定された後、サンプル容器をイン
キュベートし得る。
【0031】
説明したように、いくつかの実施形態においては、方法は、本体、開口部を有する本体
の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する本体の第２の端を有する
チューブの中で、サンプルを遠心分離する工程を含む。図２について簡単に説明すると、
説明した例示的なチューブが示されている。図２においては、チューブ２００は、チュー
ブ２００の縦軸２１０にそって、本体２０２、本体２０２の第１の端における開口部２０
４、および本体２０２の第２の端における凹型の先端２０８で終わる円錐台形の部分２０
６を含む。一実施形態において、本体は、約５ｍＬの容積を有する。たとえば、本体は、
３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、または７ｍＬの容積を有する。本明細書中で用いられ
る場合、「円錐台形」は、円錐の錐台の形状を意味する。円錐の錐台は、土台に対して並
行な面で上部を切ることによって形成された、円錐の土台部分である。いくつかの実施形
態においては、チューブ２００は、チューブ２００の内容物を保持するために何度も封が
できるキャップ２１２を含み、チューブ２００の内容物は、さらにセーフティロックによ
って保持されてもよい。いくつかの実施形態においては、何度も封ができるキャップは、
スクリューキャップであり得る。この実施形態においては、スクリューキャップは、第１
のチューブ中に微生物を封じることによってユーザを保護する。たとえば、スクリューキ
ャップは、感染の機会を減少させるために、気密な封を形成してもよい。さらなる実施形
態においては、何度も封ができるキャップは、スナップフィットキャップであり得、Ｏリ
ングシールまたはツイストロックのような特徴を含んでもよい。
の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する本体の第２の端を有する
チューブの中で、サンプルを遠心分離する工程を含む。図２について簡単に説明すると、
説明した例示的なチューブが示されている。図２においては、チューブ２００は、チュー
ブ２００の縦軸２１０にそって、本体２０２、本体２０２の第１の端における開口部２０
４、および本体２０２の第２の端における凹型の先端２０８で終わる円錐台形の部分２０
６を含む。一実施形態において、本体は、約５ｍＬの容積を有する。たとえば、本体は、
３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、または７ｍＬの容積を有する。本明細書中で用いられ
る場合、「円錐台形」は、円錐の錐台の形状を意味する。円錐の錐台は、土台に対して並
行な面で上部を切ることによって形成された、円錐の土台部分である。いくつかの実施形
態においては、チューブ２００は、チューブ２００の内容物を保持するために何度も封が
できるキャップ２１２を含み、チューブ２００の内容物は、さらにセーフティロックによ
って保持されてもよい。いくつかの実施形態においては、何度も封ができるキャップは、
スクリューキャップであり得る。この実施形態においては、スクリューキャップは、第１
のチューブ中に微生物を封じることによってユーザを保護する。たとえば、スクリューキ
ャップは、感染の機会を減少させるために、気密な封を形成してもよい。さらなる実施形
態においては、何度も封ができるキャップは、スナップフィットキャップであり得、Ｏリ
ングシールまたはツイストロックのような特徴を含んでもよい。
【0032】
いくつかの実施形態においては、円錐台形の部分２０６の縦軸２１０からの角度は、４
５度より小さい。たとえば、円錐台形の部分２０６の縦軸からの角度は、約３０度、約２
５度、約２０度、約１５度、約１０度、または約５度であり得る。円錐台形の部分２０６
の縦軸２１０に対する角度は、ペレット化された微生物を凹型の先端中に保持しながら、
チューブから上清をデカントすることを助ける。いくつかの実施形態においては、凹型の
先端は、上清（たとえば、液体培地など）をデカントする際に、抗酸菌のペレットを保持
するように構成されている。
５度より小さい。たとえば、円錐台形の部分２０６の縦軸からの角度は、約３０度、約２
５度、約２０度、約１５度、約１０度、または約５度であり得る。円錐台形の部分２０６
の縦軸２１０に対する角度は、ペレット化された微生物を凹型の先端中に保持しながら、
チューブから上清をデカントすることを助ける。いくつかの実施形態においては、凹型の
先端は、上清（たとえば、液体培地など）をデカントする際に、抗酸菌のペレットを保持
するように構成されている。
【0033】
いくつかの実施形態においては、第１のチューブを少なくとも約１０分間遠心分離し、
たとえば、第１のチューブを、５分間、１０分間、１５分間など、遠心分離し得る。一実
施形態においては、チューブの底にペレットを、かつペレットの上部に上清を生成するた
めに、第１のチューブを３，０００×ｇにおいて遠心分離する。第１のチューブは、当業
者の決定に従い、より速い、またはより遅い速度で遠心され得る。
たとえば、第１のチューブを、５分間、１０分間、１５分間など、遠心分離し得る。一実
施形態においては、チューブの底にペレットを、かつペレットの上部に上清を生成するた
めに、第１のチューブを３，０００×ｇにおいて遠心分離する。第１のチューブは、当業
者の決定に従い、より速い、またはより遅い速度で遠心され得る。
【0034】
いくつかの実施形態においては、第１のチューブ中でサンプルを遠心分離した後、遠心
分離によって生じた第１の上清を第１のチューブからデカントし、ここで、凹型の先端で
終わる円錐台形の部分は、抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されて
いる。いくつかの実施形態においては、少なくとも約９０％の第１の上清がデカントされ
る。たとえば、９０％、９５％、９９％、または９９．９％の上清が第１のチューブから
デカントされる。上清の除去およびペレット化された微生物の保持は、質量分析法を用い
た微生物の正確な同定のために重要である。生物学的サンプル中の過剰な上清が、質量分
析計を用いて生成されたスペクトルに干渉し得ることから、上清の除去は重要である。質
量分析計による分析のために十分な微生物が利用できることを保証するために、ペレット
化された微生物の保持は重要である。いくつかの実施形態においては、デカントする工程
は、第１のチューブを吸い取り紙によって乾かす工程、および／または、上清が開口部か
ら出ていくことができるように、第１のチューブを一定時間さかさまにする工程を含む。
分離によって生じた第１の上清を第１のチューブからデカントし、ここで、凹型の先端で
終わる円錐台形の部分は、抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されて
いる。いくつかの実施形態においては、少なくとも約９０％の第１の上清がデカントされ
る。たとえば、９０％、９５％、９９％、または９９．９％の上清が第１のチューブから
デカントされる。上清の除去およびペレット化された微生物の保持は、質量分析法を用い
た微生物の正確な同定のために重要である。生物学的サンプル中の過剰な上清が、質量分
析計を用いて生成されたスペクトルに干渉し得ることから、上清の除去は重要である。質
量分析計による分析のために十分な微生物が利用できることを保証するために、ペレット
化された微生物の保持は重要である。いくつかの実施形態においては、デカントする工程
は、第１のチューブを吸い取り紙によって乾かす工程、および／または、上清が開口部か
ら出ていくことができるように、第１のチューブを一定時間さかさまにする工程を含む。
【0035】
遠心分離工程（ｂ）の後、工程（ｃ）において、約１０μＬから約１ｍＬ、または約５
０μＬから約７５０μＬ、約１００μＬから約５００μＬ、または約５００μＬのアルコ
ールによって、第１のチューブ中で抗酸菌のペレットを再懸濁することができる。ペレッ
トを懸濁するために用いるアルコールは、約５０％から約１００％のアルコール、約６０
％から約９０％のアルコール、または約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％
のアルコールであり得る。例示的な実施形態においては、アルコールはエタノールである
。
０μＬから約７５０μＬ、約１００μＬから約５００μＬ、または約５００μＬのアルコ
ールによって、第１のチューブ中で抗酸菌のペレットを再懸濁することができる。ペレッ
トを懸濁するために用いるアルコールは、約５０％から約１００％のアルコール、約６０
％から約９０％のアルコール、または約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％
のアルコールであり得る。例示的な実施形態においては、アルコールはエタノールである
。
【0036】
いくつかの実施形態においては、方法は、第１のチューブから、ビーズを含む第２のチ
ューブへと懸濁液を移す工程を含む。いくつかの実施形態においては、方法は、塊を壊す
ため、および／または、抗酸菌細胞を破砕するために、懸濁液をアジテートする工程を含
む。たとえば、抗酸菌試験サンプルを、ボルテックス、または、サンプル、抽出溶媒、お
よびビーズを含む封をしたマイクロ遠心チューブをアジテートすることによって細胞を破
砕するホモジナイザーである、ビーズ式破砕装置（たとえば、ＢｉｏＳｐｅｃ社（オクラ
ホマ州バートルズビル）のビーズ式破砕装置）を用いて、機械的に破砕する。典型的には
、ビーズは、容器または微量遠心チューブの中で細胞を破砕するために機能する、任意の
公知のビーズであり得る。例えば、ビーズは、ガラス、セラミック、ジルコニア、シリコ
ン、金属、スチール、タングステンカーバイド、ガーネット、砂、またはサファイアビー
ズであり得る。一実施形態において、ビーズは、約０．１ｍｍから約１ｍｍの大きさであ
り得、例えば、約０．５ｍｍの大きさであり得る。一実施形態において、ビーズは、０．
５ｍｍのガラスビーズである。典型的には、工程（ｅ）において、約１分間から約３０分
間、約５分間から約２０分間、約５分間から約１０分間、または約５分間または１０分間
、ビーズ式破砕、または容器をボルテックスすることにより、チューブに破砕を施す。さ
らなる実施形態においては、ボルテックスを用いて、チューブを一定時間アジテートする
。たとえば、チューブを少なくとも約１５分間ボルテックスし得る。いくつかの実施形態
においては、チューブを１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、またはそれより長く
、ボルテックスする。
ューブへと懸濁液を移す工程を含む。いくつかの実施形態においては、方法は、塊を壊す
ため、および／または、抗酸菌細胞を破砕するために、懸濁液をアジテートする工程を含
む。たとえば、抗酸菌試験サンプルを、ボルテックス、または、サンプル、抽出溶媒、お
よびビーズを含む封をしたマイクロ遠心チューブをアジテートすることによって細胞を破
砕するホモジナイザーである、ビーズ式破砕装置（たとえば、ＢｉｏＳｐｅｃ社（オクラ
ホマ州バートルズビル）のビーズ式破砕装置）を用いて、機械的に破砕する。典型的には
、ビーズは、容器または微量遠心チューブの中で細胞を破砕するために機能する、任意の
公知のビーズであり得る。例えば、ビーズは、ガラス、セラミック、ジルコニア、シリコ
ン、金属、スチール、タングステンカーバイド、ガーネット、砂、またはサファイアビー
ズであり得る。一実施形態において、ビーズは、約０．１ｍｍから約１ｍｍの大きさであ
り得、例えば、約０．５ｍｍの大きさであり得る。一実施形態において、ビーズは、０．
５ｍｍのガラスビーズである。典型的には、工程（ｅ）において、約１分間から約３０分
間、約５分間から約２０分間、約５分間から約１０分間、または約５分間または１０分間
、ビーズ式破砕、または容器をボルテックスすることにより、チューブに破砕を施す。さ
らなる実施形態においては、ボルテックスを用いて、チューブを一定時間アジテートする
。たとえば、チューブを少なくとも約１５分間ボルテックスし得る。いくつかの実施形態
においては、チューブを１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、またはそれより長く
、ボルテックスする。
【0037】
試験サンプル中の抗酸菌を破砕した後、チューブ、およびすなわち試験サンプル中の抗
酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を、容器を少なくとも３
分間インキュベートすることによって、不活性化する。一実施形態においては、インキュ
ベーション工程（ｆ）は、少なくとも５分間または少なくとも１０分間であり得る。他の
実施形態において、インキュベーション工程（ｆ）は、約５分間から約３０分間、約１０
分間から約２０分間、または約５、１０、１５、２０、２５または３０分間であり得る。
一実施形態においては、インキュベーション工程（ｆ）は、室温において実施される。他
の実施形態において、インキュベーション工程（ｆ）は、より高い温度、たとえば、３０
℃、３７℃、または５５℃において実施される。
酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を、容器を少なくとも３
分間インキュベートすることによって、不活性化する。一実施形態においては、インキュ
ベーション工程（ｆ）は、少なくとも５分間または少なくとも１０分間であり得る。他の
実施形態において、インキュベーション工程（ｆ）は、約５分間から約３０分間、約１０
分間から約２０分間、または約５、１０、１５、２０、２５または３０分間であり得る。
一実施形態においては、インキュベーション工程（ｆ）は、室温において実施される。他
の実施形態において、インキュベーション工程（ｆ）は、より高い温度、たとえば、３０
℃、３７℃、または５５℃において実施される。
【0038】
他の様態において、本発明は、抗酸菌試験サンプルのタンパク質抽出のためのさらなる
工程を対象とする。一実施形態において、本発明の抽出工程にさらされる抗酸菌試験サン
プルは、上述した不活性化のための方法から得られた試験サンプルであり得る（すなわち
、上述した不活性化した抗酸菌試験サンプル）。
工程を対象とする。一実施形態において、本発明の抽出工程にさらされる抗酸菌試験サン
プルは、上述した不活性化のための方法から得られた試験サンプルであり得る（すなわち
、上述した不活性化した抗酸菌試験サンプル）。
【0039】
抽出方法は、以下の工程を含み得る：（ｇ）懸濁液を第３のチューブへと移し、不活性
化した抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）をペレット化す
るために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；および（ｈ
）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌のペレットを再
懸濁する工程。いくつかの実施形態においては、不活性化した抗酸菌のペレットを、ギ酸
および／またはアセトニトリルに再懸濁する。任意で、方法は、細胞タンパク質を抽出し
（工程（ｉ））、細胞デブリスをペレット化するために、工程（ｈ）の後に容器中の試験
サンプルの遠心分離を、さらに含む。たとえば、第３のチューブは、１６，０００×ｇに
おいて２分間、遠心分離することができる。
化した抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）をペレット化す
るために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；および（ｈ
）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌のペレットを再
懸濁する工程。いくつかの実施形態においては、不活性化した抗酸菌のペレットを、ギ酸
および／またはアセトニトリルに再懸濁する。任意で、方法は、細胞タンパク質を抽出し
（工程（ｉ））、細胞デブリスをペレット化するために、工程（ｈ）の後に容器中の試験
サンプルの遠心分離を、さらに含む。たとえば、第３のチューブは、１６，０００×ｇに
おいて２分間、遠心分離することができる。
【0040】
これらの実施形態にしたがって、約５０％から約１００％のギ酸、約６０％から約９０
％のギ酸、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のギ酸を
用いて、ペレットを再懸濁し得る。いくつかの実施形態においては、ペレットを再懸濁し
た後、アセトニトリルを、約３５％から約６５％の最終濃度まで、約４０％から約６０％
の最終濃度まで、またはアセトニトリルの最終濃度が、約３５％、４０％、５０％、６０
％、または６５％となるまで、加える。一実施形態においては、この工程において１００
％アセトニトリルを用いるが、他の濃度のアセトニトリルを用いてもよい。
％のギ酸、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のギ酸を
用いて、ペレットを再懸濁し得る。いくつかの実施形態においては、ペレットを再懸濁し
た後、アセトニトリルを、約３５％から約６５％の最終濃度まで、約４０％から約６０％
の最終濃度まで、またはアセトニトリルの最終濃度が、約３５％、４０％、５０％、６０
％、または６５％となるまで、加える。一実施形態においては、この工程において１００
％アセトニトリルを用いるが、他の濃度のアセトニトリルを用いてもよい。
【0041】
一実施形態においては、ペレットを少なくとも３、５、または１０μＬのギ酸に再懸濁
し得、および再懸濁したペレットに、少なくとも３、５、または１０μＬのアセトニトリ
ルを加えることができる。他の実施形態においては、ペレットを、約３μＬから約１００
μＬのギ酸、約５μＬから約８０μＬのギ酸、約１０μＬから約５０μＬのギ酸、または
約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、また
は１００μＬのギ酸を用いて再懸濁し得る。他の実施形態においては、ペレットを再懸濁
した後、少なくとも約３、５、または１０μＬのアセトニトリルを、再懸濁したペレット
に加える。たとえば、約３μＬから約１００μＬのアセトニトリル、約５μＬから約８０
μＬのアセトニトリル、１０μＬから約５０μＬのアセトニトリル、または約３、５、１
０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μＬ
のアセトニトリルを、再懸濁したサンプルに加え得る。
し得、および再懸濁したペレットに、少なくとも３、５、または１０μＬのアセトニトリ
ルを加えることができる。他の実施形態においては、ペレットを、約３μＬから約１００
μＬのギ酸、約５μＬから約８０μＬのギ酸、約１０μＬから約５０μＬのギ酸、または
約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、また
は１００μＬのギ酸を用いて再懸濁し得る。他の実施形態においては、ペレットを再懸濁
した後、少なくとも約３、５、または１０μＬのアセトニトリルを、再懸濁したペレット
に加える。たとえば、約３μＬから約１００μＬのアセトニトリル、約５μＬから約８０
μＬのアセトニトリル、１０μＬから約５０μＬのアセトニトリル、または約３、５、１
０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μＬ
のアセトニトリルを、再懸濁したサンプルに加え得る。
【0042】
本発明は、質量分析法を用いた、たとえば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛
行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐質量分析法）を用いた、未知の抗酸菌（たと
えば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を特性評価、および／または、同定
するための方法もまた提供する。本発明にしたがって、特性評価および／または同定工程
は、上述した不活性化および抽出工程の後に行い得る。
行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐質量分析法）を用いた、未知の抗酸菌（たと
えば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を特性評価、および／または、同定
するための方法もまた提供する。本発明にしたがって、特性評価および／または同定工程
は、上述した不活性化および抽出工程の後に行い得る。
【0043】
この実施形態にしたがって、方法は、以下の追加の工程をさらに含み得る：工程（ｊ）
からの上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移し、上清へマトリックス
溶液を加える工程；および（ｋ）抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得するた
めに、質量分析法によって、質量分析スライド上において、第３の上清中の不活性化した
抗酸菌のタンパク質プロファイルを同定し、測定した１または２以上のスペクトルを１ま
たは２以上の参照用マススペクトルと比較することによって、試験サンプル中の抗酸菌を
、特性評価および／または同定する工程。任意で、移したアリコートは、約０．５μＬか
ら約２．５μＬ、または約１μＬであり得る。当該技術分野においてよく知られているよ
うに、アリコートは、典型的には乾燥することができ、かつ次いで、マトリックス溶液を
加える。一般的に、当該技術分野における任意の公知のマトリックスを用いることができ
る。たとえば、一実施形態においては、マトリックスは、アルファ‐シアノ‐４‐ヒドロ
キシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）である。本発明にしたがって、抗酸菌（たとえば、マイコバクテ
リウム属またはノカルディア属）は、さらに以下で記載するように、たとえばＭＡＬＤＩ
－ＴＯＦ質量分析法を用いて、科、属、種、系統レベル、または、群／複合体まで同定す
ることができる。
からの上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移し、上清へマトリックス
溶液を加える工程；および（ｋ）抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得するた
めに、質量分析法によって、質量分析スライド上において、第３の上清中の不活性化した
抗酸菌のタンパク質プロファイルを同定し、測定した１または２以上のスペクトルを１ま
たは２以上の参照用マススペクトルと比較することによって、試験サンプル中の抗酸菌を
、特性評価および／または同定する工程。任意で、移したアリコートは、約０．５μＬか
ら約２．５μＬ、または約１μＬであり得る。当該技術分野においてよく知られているよ
うに、アリコートは、典型的には乾燥することができ、かつ次いで、マトリックス溶液を
加える。一般的に、当該技術分野における任意の公知のマトリックスを用いることができ
る。たとえば、一実施形態においては、マトリックスは、アルファ‐シアノ‐４‐ヒドロ
キシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）である。本発明にしたがって、抗酸菌（たとえば、マイコバクテ
リウム属またはノカルディア属）は、さらに以下で記載するように、たとえばＭＡＬＤＩ
－ＴＯＦ質量分析法を用いて、科、属、種、系統レベル、または、群／複合体まで同定す
ることができる。
【0044】
質量分析プレートまたはスライドを準備した後、スライドまたはプレートを質量分析計
に挿入する。試料のポンプダウン時間が終わった後（すなわち、１０－５から１０－７Ｔ
ｏｒｒの雰囲気下になるように大気ガスを試料から除去する）、試料を質量分析計のイオ
ン化室に導入する。試料を装置に合わせて並べる。最適配置が得られたら、窒素レーザー
を照射する。マトリックスはレーザーエネルギーを吸収し、蓄積した高エネルギーにより
プレート表面から気化する。副次的効果として、本工程においては、抗酸菌細胞の一部（
たとえばタンパク質）も蒸発してイオン化される。これらのイオンは、プレートと、質量
分析計の飛行管への入り口との間における静電界の発生により、既知の運動エネルギーに
まで加速される。質量にかかわらず、すべての一価イオンは、飛行管の入り口で同じ運動
エネルギーを有するが、その質量に反比例した速度を有する。飛行管の入り口から、イオ
ンは、飛行管を移動して検出器に向かい、かつ、より軽いイオンは、より重いイオンの前
に達する（飛行管は質量／電荷識別器である）。検出器は、イオンが検出器に衝突するた
びに電荷を発生する。検出器の出力はデジタル化され、その出力は、一方の座標軸に質量
／電荷比、もう一方の座標軸に衝突回数を表示する。一実施形態においては、スライドま
たはプレート上の抗酸菌のタンパク質プロファイルは、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法、
脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）質量分析法、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）
質量分析法、液体クロマトグラフ（ＬＣ）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（Ｅ
ＳＩ）質量分析法、及び選択イオンフローチューブ（ＳＩＦＴ）分析法などの、任意の公
知の質量分析技術、或いは、他の質量分析技術を用いて、解析することができる。
に挿入する。試料のポンプダウン時間が終わった後（すなわち、１０－５から１０－７Ｔ
ｏｒｒの雰囲気下になるように大気ガスを試料から除去する）、試料を質量分析計のイオ
ン化室に導入する。試料を装置に合わせて並べる。最適配置が得られたら、窒素レーザー
を照射する。マトリックスはレーザーエネルギーを吸収し、蓄積した高エネルギーにより
プレート表面から気化する。副次的効果として、本工程においては、抗酸菌細胞の一部（
たとえばタンパク質）も蒸発してイオン化される。これらのイオンは、プレートと、質量
分析計の飛行管への入り口との間における静電界の発生により、既知の運動エネルギーに
まで加速される。質量にかかわらず、すべての一価イオンは、飛行管の入り口で同じ運動
エネルギーを有するが、その質量に反比例した速度を有する。飛行管の入り口から、イオ
ンは、飛行管を移動して検出器に向かい、かつ、より軽いイオンは、より重いイオンの前
に達する（飛行管は質量／電荷識別器である）。検出器は、イオンが検出器に衝突するた
びに電荷を発生する。検出器の出力はデジタル化され、その出力は、一方の座標軸に質量
／電荷比、もう一方の座標軸に衝突回数を表示する。一実施形態においては、スライドま
たはプレート上の抗酸菌のタンパク質プロファイルは、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法、
脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）質量分析法、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）
質量分析法、液体クロマトグラフ（ＬＣ）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（Ｅ
ＳＩ）質量分析法、及び選択イオンフローチューブ（ＳＩＦＴ）分析法などの、任意の公
知の質量分析技術、或いは、他の質量分析技術を用いて、解析することができる。
【0045】
一実施形態においては、対照測定値（ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）を
既知の抗酸菌に対して取ることで、測定した試験データと調査対象の抗酸菌の特性評価と
の相関付けを様々な数学的方法を使用して行うことが可能となる。例えば、ソフトウェア
システムを活用して、サンプルからのデータを、基準または対照測定値と比較し得る。よ
り詳細には、データを多数の多変量解析法、例えば、一般判別分析（ＧＤＡ）、部分最小
二乗法判別分析（ＰＬＳＤＡ）、部分最小二乗回帰、主成分分析（ＰＣＡ）、平行因子分
析（ＰＡＲＡＦＡＣ）、ニューラルネットワーク分析（ＮＮＡ）及び／またはサポートベ
クターマシン（ＳＶＭ）によって分析し得る。これらの方法を使用することにより、調査
対象の未知の抗酸菌（例えば、マイコバクテリア属またはノカルディア属）を、既存の命
名法に基づいて関連群に、及び／または、有機体の代謝、病原性及び／若しくは毒性に基
づいて、天然群に分類することができる。一実施形態においては、抗酸菌の１または２以
上のマススペクトルを取得した後、その１または２以上のスペクトルを「ＳＡＲＡＭＩＳ
」微生物同定ソフトウェア（ビオメリュー社、ミズーリ州セントルイス）に入力し、抗酸
菌の解析、つまり特性評価及び／または同定を実施する。
既知の抗酸菌に対して取ることで、測定した試験データと調査対象の抗酸菌の特性評価と
の相関付けを様々な数学的方法を使用して行うことが可能となる。例えば、ソフトウェア
システムを活用して、サンプルからのデータを、基準または対照測定値と比較し得る。よ
り詳細には、データを多数の多変量解析法、例えば、一般判別分析（ＧＤＡ）、部分最小
二乗法判別分析（ＰＬＳＤＡ）、部分最小二乗回帰、主成分分析（ＰＣＡ）、平行因子分
析（ＰＡＲＡＦＡＣ）、ニューラルネットワーク分析（ＮＮＡ）及び／またはサポートベ
クターマシン（ＳＶＭ）によって分析し得る。これらの方法を使用することにより、調査
対象の未知の抗酸菌（例えば、マイコバクテリア属またはノカルディア属）を、既存の命
名法に基づいて関連群に、及び／または、有機体の代謝、病原性及び／若しくは毒性に基
づいて、天然群に分類することができる。一実施形態においては、抗酸菌の１または２以
上のマススペクトルを取得した後、その１または２以上のスペクトルを「ＳＡＲＡＭＩＳ
」微生物同定ソフトウェア（ビオメリュー社、ミズーリ州セントルイス）に入力し、抗酸
菌の解析、つまり特性評価及び／または同定を実施する。
【0046】
また別の実施形態では、検出時間および増殖率などの検出システムからの非分光測定値
を、試験サンプルに由来する抗酸菌の特性評価及び／または同定を助けるために用いるこ
とができる。
を、試験サンプルに由来する抗酸菌の特性評価及び／または同定を助けるために用いるこ
とができる。
【0047】
本発明のいくつかの実施形態においては、試験サンプル中の抗酸菌の特性評価及び／ま
たは同定において、正確な種の同定を行う必要はない。特性評価は、単一の種の実際の同
定だけでなく、生物学的粒子の幅広いカテゴリ化または分類も包含し得る。本明細書で使
用される場合、「同定」とは、これまで未知とされてきた抗酸菌が、どの科、属、種、系
統レベル、または、群／複合体に属するのか決定することを意味する。例えば、これまで
未知とされてきた抗酸菌を、科、属、種、系統レベル、または群／複合体まで同定する。
たは同定において、正確な種の同定を行う必要はない。特性評価は、単一の種の実際の同
定だけでなく、生物学的粒子の幅広いカテゴリ化または分類も包含し得る。本明細書で使
用される場合、「同定」とは、これまで未知とされてきた抗酸菌が、どの科、属、種、系
統レベル、または、群／複合体に属するのか決定することを意味する。例えば、これまで
未知とされてきた抗酸菌を、科、属、種、系統レベル、または群／複合体まで同定する。
【0048】
ここで図１を参照すると、一様態において、液体試験サンプル中の抗酸菌の不活性化、
抽出、および同定のための方法１００を提供する。一実施形態において、方法は、以下の
工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと
移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、およ
び凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹
型の先端中に抗酸菌をペレット化するために第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の
上清をデカントする工程；（ｃ）懸濁液を生成するために、抗酸菌のペレットをアルコー
ルに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、機械的破砕のために、ビーズを含む第２のチュー
ブへと移す工程；（ｅ）抗酸菌を不活性化するために、アルコール中の懸濁液をインキュ
ベートする工程；（ｆ）懸濁液を、第３のチューブへと移す工程；（ｇ）不活性化した抗
酸菌をペレット化するために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除
く工程；（ｈ）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌の
ペレットを再懸濁する工程；（ｉ）不活性化した抗酸菌を含む溶液から細胞タンパク質を
抽出し、前記細胞デブリスをペレット化するために、前記溶液を遠心分離する工程；（ｇ
）工程（ｉ）からの第３の上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移す工
程；および（ｈ）抗酸菌のタンパク質プロファイルの１または２以上のマススペクトルを
取得するために、質量分析法によって、前記質量分析ターゲットスライドを解析し、測定
した１または２以上のスペクトルを１または２以上のタンパク質プロファイルの参照用マ
ススペクトルと比較することによって、前記試験サンプル中の前記抗酸菌を特性評価およ
び／または同定する工程。
抽出、および同定のための方法１００を提供する。一実施形態において、方法は、以下の
工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと
移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、およ
び凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹
型の先端中に抗酸菌をペレット化するために第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の
上清をデカントする工程；（ｃ）懸濁液を生成するために、抗酸菌のペレットをアルコー
ルに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、機械的破砕のために、ビーズを含む第２のチュー
ブへと移す工程；（ｅ）抗酸菌を不活性化するために、アルコール中の懸濁液をインキュ
ベートする工程；（ｆ）懸濁液を、第３のチューブへと移す工程；（ｇ）不活性化した抗
酸菌をペレット化するために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除
く工程；（ｈ）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌の
ペレットを再懸濁する工程；（ｉ）不活性化した抗酸菌を含む溶液から細胞タンパク質を
抽出し、前記細胞デブリスをペレット化するために、前記溶液を遠心分離する工程；（ｇ
）工程（ｉ）からの第３の上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移す工
程；および（ｈ）抗酸菌のタンパク質プロファイルの１または２以上のマススペクトルを
取得するために、質量分析法によって、前記質量分析ターゲットスライドを解析し、測定
した１または２以上のスペクトルを１または２以上のタンパク質プロファイルの参照用マ
ススペクトルと比較することによって、前記試験サンプル中の前記抗酸菌を特性評価およ
び／または同定する工程。
【0049】
ここでブロック１０２を参照すると、いくつかの実施形態において、方法は、陽性の液
体培地から、陽性の結果後２４～７２時間の間に、３．０ｍＬのサンプルを取得する工程
を含む。説明したように、サンプルの容積は、質量分析装置を用いて、受容し得るスペク
トルを取得するために、十分な微生物がサンプル中に存在することを保証することを助け
る。同様に、陽性の液体培地から、陽性の結果後２４～７２時間の間に、サンプルを取得
することによって、液体培地中の微生物の数を増加させる。いくつかの実施形態において
は、陽性の液体培地からサンプルを、２４時間より短い時間内で取得する。たとえば、マ
イコバクテリウム属の多くの系統が、陽性のわずか２時間後に同定され得ることを示す図
４～６を参照されたい。
体培地から、陽性の結果後２４～７２時間の間に、３．０ｍＬのサンプルを取得する工程
を含む。説明したように、サンプルの容積は、質量分析装置を用いて、受容し得るスペク
トルを取得するために、十分な微生物がサンプル中に存在することを保証することを助け
る。同様に、陽性の液体培地から、陽性の結果後２４～７２時間の間に、サンプルを取得
することによって、液体培地中の微生物の数を増加させる。いくつかの実施形態において
は、陽性の液体培地からサンプルを、２４時間より短い時間内で取得する。たとえば、マ
イコバクテリウム属の多くの系統が、陽性のわずか２時間後に同定され得ることを示す図
４～６を参照されたい。
【0050】
ブロック１０４においては、いくつかの実施形態においては、サンプルを、凹型の先端
で終わる円錐台形の部分を有するチューブ（たとえば、５．０ｍＬのチューブ）中に入れ
、それから遠心分離する。たとえば、ペレットを凹型の先端中に、かつ上清をペレットの
上に生成するために、チューブを３，０００×ｇにおいて１０分間遠心分離することがで
きる。それから上清を、デカントする工程によって捨てる。たとえば、チューブを逆さま
にし、上清を開口部を通して捨て、それから過剰な液体を取り除くために、チューブを吸
い取り紙によって乾かし得る。
で終わる円錐台形の部分を有するチューブ（たとえば、５．０ｍＬのチューブ）中に入れ
、それから遠心分離する。たとえば、ペレットを凹型の先端中に、かつ上清をペレットの
上に生成するために、チューブを３，０００×ｇにおいて１０分間遠心分離することがで
きる。それから上清を、デカントする工程によって捨てる。たとえば、チューブを逆さま
にし、上清を開口部を通して捨て、それから過剰な液体を取り除くために、チューブを吸
い取り紙によって乾かし得る。
【0051】
ブロック１０６においては、ペレットをアルコールに再懸濁する。いくつかの実施形態
においては、ペレットを５００μＬの７０％エタノールに再懸濁し、および一実施形態に
おいては、懸濁液を０．５ｍｍのガラスビーズを含む第２のチューブに移す。いくつかの
実施形態においては、ガラスビーズを元のチューブに加える。いくつかの実施形態におい
ては、アルコールは微生物を不活性化しはじめるが、細胞は懸濁液中で塊になったままで
ある。結果として、はじめのアルコール処理は、アジテーション後の処理と同じくらい効
果的ではない。
においては、ペレットを５００μＬの７０％エタノールに再懸濁し、および一実施形態に
おいては、懸濁液を０．５ｍｍのガラスビーズを含む第２のチューブに移す。いくつかの
実施形態においては、ガラスビーズを元のチューブに加える。いくつかの実施形態におい
ては、アルコールは微生物を不活性化しはじめるが、細胞は懸濁液中で塊になったままで
ある。結果として、はじめのアルコール処理は、アジテーション後の処理と同じくらい効
果的ではない。
【0052】
ブロック１０８において、一実施形態においては、チューブをビーズ式破砕し、それか
らインキュベートする。たとえば、５分間チューブをビーズ式破砕し得、それから１０分
間インキュベートし得る。アジテーションおよびインキュベーションの組み合わせは、微
生物を不活性化する。或いは、ブロック１１０に示すように、いくつかの実施形態におい
ては、チューブをボルテックスしてからインキュベートし、たとえば１５分間ボルテック
スしてから１０分間インキュベートする。議論したように、インキュベーションは室温に
おいて、またはより高い温度において実施され得る。
らインキュベートする。たとえば、５分間チューブをビーズ式破砕し得、それから１０分
間インキュベートし得る。アジテーションおよびインキュベーションの組み合わせは、微
生物を不活性化する。或いは、ブロック１１０に示すように、いくつかの実施形態におい
ては、チューブをボルテックスしてからインキュベートし、たとえば１５分間ボルテック
スしてから１０分間インキュベートする。議論したように、インキュベーションは室温に
おいて、またはより高い温度において実施され得る。
【0053】
ここで、ブロック１１２を参照すると、いくつかの実施形態においては、アジテーショ
ンおよびインキュベーションの後にチューブ中に存在する不活性化した抗酸菌を、ボルテ
ックスし、懸濁液を空のチューブに移す。ブロック１１４においては、懸濁液を遠心分離
し、エタノールの上清を取り除き、不活性化した抗酸菌をチューブ中でペレット化したま
ま残す。
ンおよびインキュベーションの後にチューブ中に存在する不活性化した抗酸菌を、ボルテ
ックスし、懸濁液を空のチューブに移す。ブロック１１４においては、懸濁液を遠心分離
し、エタノールの上清を取り除き、不活性化した抗酸菌をチューブ中でペレット化したま
ま残す。
【0054】
ブロック１１６および１１８においては、細胞タンパク質を、１０μＬの７０％ギ酸を
加え、その後１０μＬのアセトニトリルを加えることによって抽出する。いくつかの実施
形態においては、細胞デブリスをペレット化するために、ギ酸および／またはアセトニト
リルを加えた後にチューブをボルテックスする。
加え、その後１０μＬのアセトニトリルを加えることによって抽出する。いくつかの実施
形態においては、細胞デブリスをペレット化するために、ギ酸および／またはアセトニト
リルを加えた後にチューブをボルテックスする。
【0055】
ブロック１２０においては、１μＬの懸濁液を質量分析ターゲットスライド上に播種し
、ブロック１２２においてマトリックスをターゲットスライドに加え、およびブロック１
２４においてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法を用いて微生物を同定する。この方法におい
ては、液体培地から同定を行うことの難しさに対処する特定の工程を用いることによって
、液体培地に由来する微生物の同定における予期しない改善を表す。
、ブロック１２２においてマトリックスをターゲットスライドに加え、およびブロック１
２４においてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法を用いて微生物を同定する。この方法におい
ては、液体培地から同定を行うことの難しさに対処する特定の工程を用いることによって
、液体培地に由来する微生物の同定における予期しない改善を表す。
【0056】
ここで話を図３に移すと、チューブの外形の比較３００を提供する。図３に示すように
、チューブＡは、凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する。この外形は、チューブＢ
、Ｃ、Ｄ、およびＥと対照的である。チューブＡは、質量分析法を用いた微生物の同定を
助けるために、上清の多くの割合をデカントする際に、ペレットを凹型の先端に保持する
ことが見出された。チューブＢは、たとえば、ペレットのいくらか、またはすべてが上清
をデカントする工程の間に失われてしまうため、同定に適さない。チューブＣは、デカン
トする工程の間に、保持された上清を減らすが、ペレットを保持するように設計されてい
ない。かわりに、先端の形によって、上清はペレットの下および周囲に保持される。同様
に、チューブＤは、ペレットを保持するが、ペレットの下の角のある先端中に液体もまた
保持する。たとえば、チューブＡをデカントした後に、一実験においてはたった１０～２
０μＬの培地のみがチューブ中に保持されていたが、チューブＤにおいてはデカントした
後に、２００～４００μＬの培地がチューブ中に残っていた。チューブＥは、デカントす
る工程の間に、ペレットのいくらか、またはすべての損失につながった。予期できなかっ
たことに、チューブＡは、液体培地を用いることの難しさに対処しながら、質量分析装置
を用いた微生物の同定において、著しく改善した結果を示す。
、チューブＡは、凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する。この外形は、チューブＢ
、Ｃ、Ｄ、およびＥと対照的である。チューブＡは、質量分析法を用いた微生物の同定を
助けるために、上清の多くの割合をデカントする際に、ペレットを凹型の先端に保持する
ことが見出された。チューブＢは、たとえば、ペレットのいくらか、またはすべてが上清
をデカントする工程の間に失われてしまうため、同定に適さない。チューブＣは、デカン
トする工程の間に、保持された上清を減らすが、ペレットを保持するように設計されてい
ない。かわりに、先端の形によって、上清はペレットの下および周囲に保持される。同様
に、チューブＤは、ペレットを保持するが、ペレットの下の角のある先端中に液体もまた
保持する。たとえば、チューブＡをデカントした後に、一実験においてはたった１０～２
０μＬの培地のみがチューブ中に保持されていたが、チューブＤにおいてはデカントした
後に、２００～４００μＬの培地がチューブ中に残っていた。チューブＥは、デカントす
る工程の間に、ペレットのいくらか、またはすべての損失につながった。予期できなかっ
たことに、チューブＡは、液体培地を用いることの難しさに対処しながら、質量分析装置
を用いた微生物の同定において、著しく改善した結果を示す。
【0057】
図４においては、ＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システム中でインキ
ュベートした、ＡＴＣＣおよび臨床的に単離したマイコバクテリウム属の種の、多数の系
統の同定結果を提供する。この図においては、２８の異なるマイコバクテリウム属の系統
を、ＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システム中でインキュベートした。
各系統をサンプル容器中でＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システムを用
いてインキュベートし、サンプル容器が微生物の増殖について陽性であるとシステムが表
示したときに取り除き、追加の時間、サンプル容器中でインキュベートし、およびマイコ
バクテリウム属の細胞からのタンパク質を不活性化かつ抽出するために、サンプル容器か
らのサンプルを、本明細書中で開示した方法によって、断続的に処理した。陽性後のサン
プルが、正確なマススペクトルを生じるために、十分なバイオマスを有し、かつコンタミ
ネーションを欠いているかどうかを決定するために、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法によ
って、マイコバクテリアのタンパク質を分析した。図４に示す結果は、本明細書に開示し
た方法が、サンプル容器が微生物の増殖について陽性であるとシステムが判定した後、短
い時間で、マイコバクテリアのタンパク質を不活性化および抽出することができ、および
、正確にスペクトルを生成することができ、予期された種レベルの同定に対して、９９．
９％の一致度で合致することを実証する。陽性の後、３６時間以内に処理したとき、試験
したすべての系統が正確に同定され、かつ、３つの系統を除いてすべてが２４時間以内に
同定された。驚くべきことに、Ｍ． ａｖｉｕｍ（Ｍ． アビウム）およびＭ． ｉｎｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（Ｍ． イントラセルラーレ）などの高い普及率の系統を含む多
くの系統は、陽性後、１２時間以内に処理したとき、正確に同定された。
ュベートした、ＡＴＣＣおよび臨床的に単離したマイコバクテリウム属の種の、多数の系
統の同定結果を提供する。この図においては、２８の異なるマイコバクテリウム属の系統
を、ＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システム中でインキュベートした。
各系統をサンプル容器中でＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システムを用
いてインキュベートし、サンプル容器が微生物の増殖について陽性であるとシステムが表
示したときに取り除き、追加の時間、サンプル容器中でインキュベートし、およびマイコ
バクテリウム属の細胞からのタンパク質を不活性化かつ抽出するために、サンプル容器か
らのサンプルを、本明細書中で開示した方法によって、断続的に処理した。陽性後のサン
プルが、正確なマススペクトルを生じるために、十分なバイオマスを有し、かつコンタミ
ネーションを欠いているかどうかを決定するために、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法によ
って、マイコバクテリアのタンパク質を分析した。図４に示す結果は、本明細書に開示し
た方法が、サンプル容器が微生物の増殖について陽性であるとシステムが判定した後、短
い時間で、マイコバクテリアのタンパク質を不活性化および抽出することができ、および
、正確にスペクトルを生成することができ、予期された種レベルの同定に対して、９９．
９％の一致度で合致することを実証する。陽性の後、３６時間以内に処理したとき、試験
したすべての系統が正確に同定され、かつ、３つの系統を除いてすべてが２４時間以内に
同定された。驚くべきことに、Ｍ． ａｖｉｕｍ（Ｍ． アビウム）およびＭ． ｉｎｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（Ｍ． イントラセルラーレ）などの高い普及率の系統を含む多
くの系統は、陽性後、１２時間以内に処理したとき、正確に同定された。
【0058】
図５は、Ｂａｃｔｅｃ（商標） ＭＧＩＴ（商標）９６０マイコバクテリア検出システ
ム中でインキュベートした、さまざまなマイコバクテリウム属の系統の同定結果を示す。
図４と同様に、図５は、本方法が陽性の後迅速に、マイコバクテリアのタンパク質を不活
性化、抽出、および同定することができることを実証する。たとえば、２つ以外のすべて
の系統は、２４時間以内で、予期された種レベルの同定に対して、９９．９％の一致度で
合致するサンプルスペクトルを有していた。残りの２つの系統は、４０時間以内で、予期
された種レベルの同定に対して、９９．９％の一致度で合致した。マイコバクテリアのタ
ンパク質のこの迅速な不活性化、抽出、および同定は、マイコバクテリアに関連する感染
症の治療に衝撃を与えるだろう。
ム中でインキュベートした、さまざまなマイコバクテリウム属の系統の同定結果を示す。
図４と同様に、図５は、本方法が陽性の後迅速に、マイコバクテリアのタンパク質を不活
性化、抽出、および同定することができることを実証する。たとえば、２つ以外のすべて
の系統は、２４時間以内で、予期された種レベルの同定に対して、９９．９％の一致度で
合致するサンプルスペクトルを有していた。残りの２つの系統は、４０時間以内で、予期
された種レベルの同定に対して、９９．９％の一致度で合致した。マイコバクテリアのタ
ンパク質のこの迅速な不活性化、抽出、および同定は、マイコバクテリアに関連する感染
症の治療に衝撃を与えるだろう。
【0059】
図６においては、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ装置中でインキュベートした
マイコバクテリウム属のさまざまな系統の同定結果を提供する。再度、サンプルをサンプ
ル容器中でインキュベートし、装置はサンプルが微生物の増殖について陽性となったとき
を判定し、および開示した方法によって、試験のために、サンプルを陽性のサンプル容器
から、断続的に取得する。この例において、すべての系統は、２４時間以内で、予期され
た種レベルの同定に対して、９９．９％合致するサンプルスペクトルを有していた。
マイコバクテリウム属のさまざまな系統の同定結果を提供する。再度、サンプルをサンプ
ル容器中でインキュベートし、装置はサンプルが微生物の増殖について陽性となったとき
を判定し、および開示した方法によって、試験のために、サンプルを陽性のサンプル容器
から、断続的に取得する。この例において、すべての系統は、２４時間以内で、予期され
た種レベルの同定に対して、９９．９％合致するサンプルスペクトルを有していた。
【0060】
他の様態においては、図１および本明細書の他の場所で記載した、方法とともに用いる
ためのキットを提供する。一実施形態においては、キットは、本体、開口部を有する該本
体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を有
する第１のチューブであって、第１のチューブは少なくとも５ｍＬの容積を有する、第１
のチューブ；アルコールの溶液；ギ酸の溶液；およびアセトニトリルの溶液を含む。さら
なる実施形態においては、キットは０．５ｍｍのガラスビーズおよび／または吸い取り紙
を含み得る。同様に、キットは、第１のチューブをデカントするためのスタンド、または
本明細書中で記載し、およびキットがそのために用いるように設計された方法のための使
用説明書を含み得る。
ためのキットを提供する。一実施形態においては、キットは、本体、開口部を有する該本
体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を有
する第１のチューブであって、第１のチューブは少なくとも５ｍＬの容積を有する、第１
のチューブ；アルコールの溶液；ギ酸の溶液；およびアセトニトリルの溶液を含む。さら
なる実施形態においては、キットは０．５ｍｍのガラスビーズおよび／または吸い取り紙
を含み得る。同様に、キットは、第１のチューブをデカントするためのスタンド、または
本明細書中で記載し、およびキットがそのために用いるように設計された方法のための使
用説明書を含み得る。
【0061】
図面において、線の厚さ、層、特徴、構成要素および／または領域は、明確化のために
誇張され得る。加えて、動作（または工程）の配列は、特に指示がない限り、特許請求の
範囲に示された順序に限定されない。
誇張され得る。加えて、動作（または工程）の配列は、特に指示がない限り、特許請求の
範囲に示された順序に限定されない。
【0062】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発
明を限定するものではない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」およ
び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことが意図
される。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／また
は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された特徴、工程、動作、要素および／ま
たは構成要素の存在を特定するが、１または２以上の他の特徴、工程、動作、要素、構成
要素、および／またはそれらの群の存在または追加を排除しない。「含む」という用語は
、本明細書で使用することができるが、要素を「含む」と呼ばれる目的語は、要素「から
なる」または「から本質的になる」ことでもあり得ることが理解されるべきである。本明
細書中で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の
うちの１つまたは２以上の任意のおよびすべての組み合わせを含む。同様の番号は、全体
を通して同様の要素を指す。本明細書中で使用される場合、「ＸとＹとの間」および「約
ＸとＹとの間」などの語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使
用する場合、「約ＸとＹとの間」などの語句は、「約Ｘと約Ｙとの間」を意味する。本明
細書中で使用する場合、「約ＸからＹまで」などの語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味
する。
明を限定するものではない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」およ
び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことが意図
される。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／また
は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された特徴、工程、動作、要素および／ま
たは構成要素の存在を特定するが、１または２以上の他の特徴、工程、動作、要素、構成
要素、および／またはそれらの群の存在または追加を排除しない。「含む」という用語は
、本明細書で使用することができるが、要素を「含む」と呼ばれる目的語は、要素「から
なる」または「から本質的になる」ことでもあり得ることが理解されるべきである。本明
細書中で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の
うちの１つまたは２以上の任意のおよびすべての組み合わせを含む。同様の番号は、全体
を通して同様の要素を指す。本明細書中で使用される場合、「ＸとＹとの間」および「約
ＸとＹとの間」などの語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使
用する場合、「約ＸとＹとの間」などの語句は、「約Ｘと約Ｙとの間」を意味する。本明
細書中で使用する場合、「約ＸからＹまで」などの語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味
する。
【0063】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての用語（技術用語および科学用語
を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を
有する。一般的に使用される辞書に定義された用語などの用語は、明細書および関連技術
の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、および、本明細書
中において明確にそのように定義されない限り、理想化された、または過度に正式な意味
で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。周知の機能または構成は、
簡潔さ、および／または明確さのために、詳細には説明されない場合がある。
を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を
有する。一般的に使用される辞書に定義された用語などの用語は、明細書および関連技術
の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、および、本明細書
中において明確にそのように定義されない限り、理想化された、または過度に正式な意味
で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。周知の機能または構成は、
簡潔さ、および／または明確さのために、詳細には説明されない場合がある。
【0064】
本発明は、部分的に、本発明の実施形態に係る方法、装置（システム）およびコンピュ
ータプログラム製品のフローチャート図および／またはブロック図を参照して説明される
。フローチャート図および／またはブロック図の各ブロック、およびフローチャート図お
よび／またはブロック図のブロックの組み合わせは、コンピュータプログラムの命令によ
って実施できることが理解されるであろう。これらのコンピュータプログラムの命令は、
汎用コンピュータ、特殊目的コンピュータ、または他のプログラマブルデータプロセシン
グ装置のプロセッサに提供されて機械を生成することができ、コンピュータまたは他のプ
ログラマブルデータプロセシング装置のプロセッサを介して実行される命令は、フローチ
ャートおよび／またはブロック図のブロックで指定された機能／動作を実施するための手
段を作成する。
ータプログラム製品のフローチャート図および／またはブロック図を参照して説明される
。フローチャート図および／またはブロック図の各ブロック、およびフローチャート図お
よび／またはブロック図のブロックの組み合わせは、コンピュータプログラムの命令によ
って実施できることが理解されるであろう。これらのコンピュータプログラムの命令は、
汎用コンピュータ、特殊目的コンピュータ、または他のプログラマブルデータプロセシン
グ装置のプロセッサに提供されて機械を生成することができ、コンピュータまたは他のプ
ログラマブルデータプロセシング装置のプロセッサを介して実行される命令は、フローチ
ャートおよび／またはブロック図のブロックで指定された機能／動作を実施するための手
段を作成する。
【0065】
本明細書の一部の図面のフローチャートおよびブロック図は、本発明の実施形態の可能
な実施の例示的なアーキテクチャ、機能性、および動作を示す。いくつかの代替的な実施
形態においては、ブロックに記載された工程は、図に示された順序から外れることがある
ことに留意されたい。例えば、関連する機能目的に依存して、連続して示された２つのブ
ロックは、実際には実質的に同時に実行されてもよく、またはブロックは時には逆の順序
で実行されてもよく、または２つまたは３つ以上のブロックが結合されていてもよい。
な実施の例示的なアーキテクチャ、機能性、および動作を示す。いくつかの代替的な実施
形態においては、ブロックに記載された工程は、図に示された順序から外れることがある
ことに留意されたい。例えば、関連する機能目的に依存して、連続して示された２つのブ
ロックは、実際には実質的に同時に実行されてもよく、またはブロックは時には逆の順序
で実行されてもよく、または２つまたは３つ以上のブロックが結合されていてもよい。
【0066】
例えば、上記に示した２つのブロックは、本発明を説明するものであり、および本発明
を限定するものではない。本発明の少しの例示的な実施形態を記述したが、本発明の新規
な教示および利点から実質的に逸脱することなく、例示的な実施形態において多くの変更
が可能であることを、当業者は容易に理解するであろう。したがって、そのような変更の
全ては、特許請求の範囲に定義されるように、本発明の範囲内に含まれることが意図され
る。本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物がその
中に含まれる。
を限定するものではない。本発明の少しの例示的な実施形態を記述したが、本発明の新規
な教示および利点から実質的に逸脱することなく、例示的な実施形態において多くの変更
が可能であることを、当業者は容易に理解するであろう。したがって、そのような変更の
全ては、特許請求の範囲に定義されるように、本発明の範囲内に含まれることが意図され
る。本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物がその
中に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】