特許 7057390 補体成分ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-11

(45)【発行日】2022-04-19

(54)【発明の名称】補体成分ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220412BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220412BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220412BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220412BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220412BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 15/14 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 9/14 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20220412BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20220412BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220412BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20220412BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20220412BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K48/00

A61P43/00 111

A61P37/02

A61P37/06

A61P31/04

A61P27/02

A61P19/02

A61P25/00

A61P17/00

A61P15/14

A61P13/12

A61P11/06

A61P9/14

A61P9/10

A61P9/00

A61P3/02

A61P21/04

A61P21/00

A61P29/00 101

A61P17/06

A61P13/02

A61K47/54

A61K9/08

A61K47/26

A61K31/713

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2020091871

(22)【出願日】2020-05-27

(62)【分割の表示】P 2016538588の分割

【原出願日】2014-12-12

(65)【公開番号】P2020188768

(43)【公開日】2020-11-26

【審査請求日】2020-05-27

(31)【優先権主張番号】61/915,210

(32)【優先日】2013-12-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505369158

【氏名又は名称】アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】アナ・ボロドフスキー

(72)【発明者】

【氏名】ブライアン・ベッテンコート

【審査官】池上 京子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第０３／０６６８０５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２００９－５２１２３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０７４９７４（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞中の補体成分Ｃ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡが、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
前記センス鎖が、ヌクレオチド配列5’-CGUGGUCAAGGUCUUCUCUCU-3’（配列番号２２５）からの少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列5’-AGAGAGAAGACCUUGACCACGUA-3’(配列番号２６６)からの少なくとも１８連続ヌクレオチドを含み、
前記センス鎖が、１９－２１ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、１８－２３ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖の前記ヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドであり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
少なくとも１つの鎖が、１つまたはそれ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体であるリガンドにコンジュゲートされている、
ｄｓＲＮＡ剤。

【請求項2】

二本鎖領域が、１８－２１ヌクレオチド対長である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項3】

アンチセンス鎖が、１９－２３ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項4】

アンチセンス鎖が、１９－２１ヌクレオチド長である、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項5】

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル修飾、及びそれらの組合せからなる群から選択されるヌクレオチド修飾を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項6】

修飾ヌクレオチドの全てが、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項7】

ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’末端または３’末端の少なくとも１つが平滑末端である、請求項１～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項8】

ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’末端および３’末端の両方が平滑末端である、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項9】

少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項10】

前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の３’末端にある、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項11】

前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端及び３’末端の両方にある、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項12】

前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ剤。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する単離された細胞。

【請求項14】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、補体成分Ｃ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。

【請求項15】

ｄｓＲＮＡ剤が、緩衝液中に存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

ｄｓＲＮＡ剤が、非緩衝液中に存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項17】

細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害するインビトロでの方法であって、
（ａ）前記細胞を、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤と接触させる工程と；
（ｂ）工程（ａ）で産生される前記細胞を、Ｃ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって、前記細胞中の前記Ｃ３遺伝子の発現を阻害する工程と
を含む方法。

【請求項18】

補体成分Ｃ３（Ｃ３）の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置することにおいて使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。

【請求項19】

前記障害が、補体成分に関連する疾病である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記補体成分に関連する疾病が、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、乾癬、皮膚筋炎、水疱性類天疱瘡、非典型溶血性尿毒症症候群、志賀毒素産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関連する溶血性尿毒症症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、デンスデポジット糸球体腎炎、Ｃ３神経障害、加齢性黄斑変性症、寒冷凝集素症、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、液性及び血管性移植拒絶反応、移植片機能不全、心筋梗塞、移植の感作レシピエント、及び敗血症からなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記補体成分に関連する疾病が、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）または非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記対象への前記剤の前記投与が、溶血の減少及び／又はＣ３タンパク質蓄積の減少を引き起こす、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含む。２０１４年１２月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーの名称は、１２１３０１－０１１２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２６６，０８０バイトである。

【0002】

関連出願
本出願は、全内容が参照により本明細書に援用される、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２１０号の優先権の利益を主張するものである。

【背景技術】

【0003】

補体は、正常血清中に存在する耐熱性抗体による細菌の殺滅を補助するか又は「補完する」ことが判明したとき、１８９０年代に最初に発見された（非特許文献１）。補体系は、血液中に可溶性タンパク質として存在するか、又は膜結合タンパク質として存在する３０を超えるタンパク質からなる。補体の活性化は、補体活性化経路として公知の、酵素反応の連続カスケードをもたらし、化学誘引からアポトーシスに及ぶ多くの生理反応を引き起こす強力なアナフィラトキシンＣ３ａ及びＣ５ａの形成をもたらす。最初、補体は、強く迅速な反応が侵入病原体に対して行われる先天性免疫において大きな役割を果たすものと考えられていた。しかしながら、最近、補体は、病原体の再侵入を防ぐ免疫記憶を維持する際に、病原体の排除を助けるＴ細胞及びＢ細胞に関与する適応免疫にも重要な役割を果たし（非特許文献２；非特許文献３）、ヒトの病理的状態に関与する（非特許文献４；非特許文献５）ことがますます明らかになってきている。

【0004】

補体活性化は、主に不活性な酵素原として存在し、その後、順次、切断され、活性化されるタンパク質に関与する３つの異なる経路：代替経路、古典経路及びレクチン経路（図１）を介して行われることが知られている。

【0005】

古典経路は、多くの場合、抗体－抗原複合体又はＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）によって活性化され、それらは両方とも補体成分Ｃ１ｑと相互作用する。更に、古典経路は、免疫複合体の非存在下でアポトーシス小体中に存在するホスファチジルセリンによって活性化され得る。

【0006】

レクチン経路は、病原体の表面における複合糖質残基に結合するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）によって開始される。古典経路又はレクチン経路の活性化は、（Ｃ４ｂ２ｂ）Ｃ３転換酵素の活性化を引き起こす。

【0007】

代替経路は、標的化表面における、Ｃ３の加水分解によって自発的に生成される、Ｃ３ｂの結合によって活性化される。次に、この表面結合Ｃ３ｂは、Ｂ因子によって認識され、複合体Ｃ３ｂＢを形成する。Ｃ３ｂＢ複合体は、今度は、Ｄ因子によって切断されて、ＡＰのＣ３転換酵素の活性型（Ｃ３ｂＢｂ）が生じる。両方の型のＣ３転換酵素が、Ｃ３を切断し、Ｃ３ｂを形成する。次に、Ｃ３ｂは、更なるＢ因子に結合して、ＡＰ（いわゆる代替又は増幅ループ）を介した補体活性化を促進するか、又は活性Ｃ５転換酵素（Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ又はＣ４ｂＣ２ｂＣ３ｂ）の形成を引き起こし、活性Ｃ５転換酵素（Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ又はＣ４ｂＣ２ｂＣ３ｂ）は、Ｃ５を切断し、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）（Ｃ５ｂ－９）の形成をもたらす後の事象を引き起こす。

【0008】

補体系の不適切な活性化は、例えば、発作性夜間血色素尿症、非典型溶血性尿毒症症候群、関節リウマチ、虚血－再かん流傷害及び神経変性疾患を含む多くの様々な疾病における病変の伝播及び／又は開始の原因となる。

【0009】

これまで、Ｃ５－Ｃ５ａ軸を標的とする唯一の治療法である、抗Ｃ５抗体、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））が、補体成分に関連する疾病の治療に利用可能である。エクリズマブは、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）及び非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の治療に有効であることが示されており、更なる補体成分に関連する疾病の臨床試験においては現在評価されているが、エクリズマブ治療法は、高いコストで、週１回の高用量の注入と、その後の隔週の維持注入を必要とする。更に、エクリズマブで処置されたＰＮＨ対象の約５０％が、低レベルの溶血を有し、余分な輸血を必要とする（非特許文献６）。したがって、補体成分に関連する疾病に罹患している対象のための代替療法及び併用療法が当該技術分野において必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【文献】Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．Ｊ．（２００１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３４４：１０５８

【文献】Ｄｕｎｋｅｌｂｅｒｇｅｒ ＪＲ ａｎｄ Ｓｏｎｇ ＷＣ．（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０：３４

【文献】Ｍｏｌｉｎａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９３：３３５７

【文献】Ｑｕ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１８５

【文献】Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｆｒａｎｋ ＭＭ．（２０１０）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．９：４３

【文献】Ｈｉｌｌ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９５（４）：５６７－７３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、ＣＦＢ遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＣＦＢ遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。

【0012】

本発明は、Ｃ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物も提供する。Ｃ３遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。

【0013】

更に、本発明は、Ｃ９遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。Ｃ９遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。

【0014】

本発明は、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子の発現を阻害するためのＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を用いて、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る障害、例えば、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）及び非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）などの補体成分に関連する疾病に罹患している対象を処置するための方法及び併用療法も提供する。

【0015】

したがって、一態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１～５、２７、及び３０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号１２～１６、３３、及び３６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡを提供する。

【0016】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、表３及び４に列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含むｄｓＲＮＡを提供する。

【0017】

一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、ＡＤ－６０３０４、ＡＤ－６０３３１、及びＡＤ－６０３４４並びに表３及び４に列挙される薬剤のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む。

【0018】

一実施形態において、相補性の領域は、表３及び４のいずれか１つのアンチセンス配列の１つのヌクレオチド配列からなる。

【0019】

一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表３及び４のいずれか１つの配列から選択されるセンス鎖配列のヌクレオチド配列からなるセンス鎖と、表３及び４のいずれか１つの配列から選択されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖とを含む。

【0020】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分Ｃ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号６～８、２８、及び３１のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号１７～１９、３４、及び３７のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡを提供する。

【0021】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分Ｃ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、表５及び６に列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含むｄｓＲＮＡを提供する。

【0022】

一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、ＡＤ－６０１６９並びに表５及び６に列挙される薬剤のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む。

【0023】

一実施形態において、相補性の領域は、表５及び６のいずれか１つのアンチセンス配列の１つのヌクレオチド配列からなる。

【0024】

一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表５及び６のいずれか１つの配列から選択されるセンス鎖配列のヌクレオチド配列からなるセンス鎖と、表５及び６のいずれか１つの配列から選択されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖とを含む。

【0025】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分Ｃ９の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号９～１１、２９、及び３２のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２０～２２、３５、及び３８のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡを提供する。

【0026】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分Ｃ９の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、表７及び８に列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含むｄｓＲＮＡを提供する。

【0027】

一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、表７及び８に列挙される薬剤のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む。

【0028】

一実施形態において、相補性の領域は、表７及び８のいずれか１つのアンチセンス配列の１つのヌクレオチド配列からなる。

【0029】

一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表７及び８のいずれか１つの配列から選択されるセンス鎖配列のヌクレオチド配列からなるセンス鎖と、表７及び８のいずれか１つの配列から選択されるアンチセンス配列のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖とを含む。

【0030】

ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、コレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）ヌクレオチド、立体配座的に拘束されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシ－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－無水ヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドを含み得る。

【0031】

一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドである。別の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである。

【0032】

相補性の領域は、１９ヌクレオチド長、又は３０ヌクレオチド長以下などの少なくとも１７ヌクレオチド長であり得る。

【0033】

相補性の領域は、１９～２１ヌクレオチド長であり得る。

【0034】

ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチド、又は少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。

【0035】

ｄｓＲＮＡは、リガンドを更に含み得る。一実施形態において、リガンドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一実施形態において、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。一実施形態において、リガンドは、

【化1】

である。

【0036】

一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、以下の概略図

【化2】

に示されるように、リガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである。

【0037】

一実施形態において、ＸがＯである。

【0038】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＣＦＢをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ’、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0039】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ３をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ’、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0040】

更なる態様において、本発明は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ９をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ’、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0041】

一実施形態において、ｉが０であり；ｊが０であり；ｉが１であり；ｊが１であり；ｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。

【0042】

一実施形態において、ｋが０であり；ｌが０であり；ｋが１であり；ｌが１であり；ｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。

【0043】

一実施形態において、ＸＸＸが、Ｘ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹが、Ｙ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、ＺＺＺが、Ｚ’Ｚ’Ｚ’に相補的である。

【0044】

一実施形態において、ＹＹＹモチーフが、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。

【0045】

一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、５’末端のアンチセンス鎖の１１位、１２位及び１３位に存在する。

【0046】

一実施形態において、Ｙ’が、２’－Ｏ－メチルである。

【0047】

一実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩａ）
によって表される。

【0048】

一実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩｂ）
（式中、各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、１～５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。

【0049】

一実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩｃ）
（式中、各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、１～５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩｄ）
（式中、各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、１～５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。

【0050】

二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対長、１７～２３ヌクレオチド対長、１７～２５ヌクレオチド対長、２３～２７ヌクレオチド対長、１９～２１ヌクレオチド対長、又は２１～２３ヌクレオチド対長であり得る。

【0051】

一実施形態において、各鎖は、１５～３０のヌクレオチドを有する。

【0052】

一実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0053】

一実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾である。

【0054】

一実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。

【0055】

一実施形態において、リガンドは、

【化3】

である。

【0056】

一実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。

【0057】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図

【化4】

に示されるように、リガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである。

【0058】

一実施形態において、ＸがＯである。

【0059】

一実施形態において、この剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。

【0060】

一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の３’末端にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。

【0061】

別の実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。

【0062】

一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端及び３’末端の両方にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。

【0063】

一実施形態において、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である。

【0064】

一実施形態において、Ｙヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾を含む。

【0065】

一実施形態において、Ｙ’ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。

【0066】

一実施形態において、ｐ’＞０である。別の実施形態において、ｐ’＝２である。

【0067】

一実施形態において、ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、ｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに相補的である。

【0068】

別の実施形態において、ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、ｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに非相補的である。

【0069】

一実施形態において、センス鎖が、合計で２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が、合計で２３のヌクレオチドを有する。

【0070】

一実施形態において、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。別の実施形態において、全てのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。

【0071】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、表３及び４に列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤ＡＤ－６０３０４、ＡＤ－６０３３１、及びＡＤ－６０３４４の群から選択される。

【0072】

別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、表５及び６に列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される。

【0073】

更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、表７及び８に列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される。

【0074】

一態様において、本発明は、表３、５、及び７のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0075】

一態様において、本発明は、修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物を提供する。この剤は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害することが可能であり、表３に列挙される配列の群から選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、ポリヌクレオチドが、約１４～約３０ヌクレオチド長である。

【0076】

別の態様において、本発明は、修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物を提供する。この剤は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害することが可能であり、表５に列挙される配列の群から選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、ポリヌクレオチドが、約１４～約３０ヌクレオチド長である。

【0077】

更に別の態様において、本発明は、修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物を提供する。この剤は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害することが可能であり、表７に列挙される配列の群から選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、ポリヌクレオチドが、約１４～約３０ヌクレオチド長である。

【0078】

一態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＣＦＢをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ’、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0079】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＣＦＢをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0080】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＣＦＢをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0081】

更に他の態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＣＦＢをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0082】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＣＦＢをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩａ）
（式中：
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
ＹＹＹ及びＹ’Ｙ’Ｙ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0083】

一態様において、本発明は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ３をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ’、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0084】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ３をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0085】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ３をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0086】

更に別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ３をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0087】

一態様において、本発明は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ３をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩａ）
（式中：
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
ＹＹＹ及びＹ’Ｙ’Ｙ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0088】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ９をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｐ’、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0089】

一態様において、本発明は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ９をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる）
によって表される。

【0090】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ９をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0091】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ９をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ_ｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎ_ｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0092】

更なる態様において、本発明は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。この剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、Ｃ９をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’５’（ＩＩＩａ）
（式中：
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ、ｎ_ｑ、及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０～２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
ＹＹＹ及びＹ’Ｙ’Ｙ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される。

【0093】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１～５、２７、及び３０のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号１２～１６、３３、及び３６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖が、３’末端において分枝鎖状の二価又は三価リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0094】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分Ｃ３の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号６～８、２８、及び３１のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号１７～１９、３４、及び３７のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖が、３’末端において分枝鎖状の二価又は三価リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0095】

更に別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分Ｃ９の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号９～１１、２９、及び３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２０～２２、３５、及び３８のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖が、３’末端において分枝鎖状の二価又は三価リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。

【0096】

一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む。

【0097】

別の態様において、本発明は、本発明の剤を含有する細胞を提供する。

【0098】

一態様において、本発明は、本発明の剤の少なくとも１つの鎖をコードするベクターを提供する。

【0099】

別の態様において、本発明は、本発明のベクターを含む細胞を提供する。

【0100】

一態様において、本発明は、本発明の剤を含む、補体成分Ｂ因子遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。

【0101】

別の態様において、本発明は、本発明の剤を含む、補体成分Ｃ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。

【0102】

更に別の態様において、本発明は、本発明の剤を含む、補体成分Ｃ９遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。

【0103】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、非緩衝液中で投与される。

【0104】

一実施形態において、非緩衝液は、生理食塩水又は水である。

【0105】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、緩衝液とともに投与される。

【0106】

一実施形態において、緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝液又はそれらの任意の組合せを含む。

【0107】

一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

【0108】

一態様において、本発明は、細胞中の補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、本発明の剤又は本発明の医薬組成物と接触させる工程と、産生される細胞を、ＣＦＢ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって、細胞中のＣＦＢ遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。

【0109】

別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分３（Ｃ３）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、本発明の剤又は本発明の医薬組成物と接触させる工程と、産生される細胞を、Ｃ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって、細胞中のＣ３遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。

【0110】

更に別の態様において、本発明は、細胞中の補体成分９（Ｃ９）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、本発明の剤又は本発明の医薬組成物と接触させる工程と、産生される細胞を、Ｃ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって、細胞中のＣ９遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。

【0111】

一実施形態において、細胞は、対象中にある。

【0112】

一実施形態において、対象はヒトである。

【0113】

一実施形態において、ヒト対象は、補体成分に関連する疾病に罹患している。

【0114】

一実施形態において、補体成分に関連する疾病は、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、乾癬、皮膚筋炎、水疱性類天疱瘡、非典型溶血性尿毒症症候群、志賀毒素産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関連する溶血性尿毒症症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、デンスデポジット糸球体腎炎、Ｃ３神経障害、加齢性黄斑変性症、寒冷凝集素症、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、液性及び血管性移植拒絶反応、移植片機能不全、心筋梗塞、移植の感作レシピエント、及び敗血症からなる群から選択される。

【0115】

一実施形態において、補体成分に関連する疾病は、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）である。

【0116】

別の実施形態において、補体成分に関連する疾病は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である。

【0117】

一実施形態において、ＣＦＢの発現は、少なくとも約３０％阻害される。

【0118】

一実施形態において、Ｃ３の発現は、少なくとも約３０％阻害される。

【0119】

一実施形態において、Ｃ９の発現は、少なくとも約３０％阻害される。

【0120】

一実施形態において、この剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0121】

別の実施形態において、この剤は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0122】

一実施形態において、この剤は、皮下投与される。

【0123】

別の実施形態において、この剤は、静脈内投与される。

【0124】

一態様において、本発明は、補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、対象を処置する工程を含む。

【0125】

別の態様において、本発明は、補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。

【0126】

更に別の態様において、本発明は、補体成分Ｃ３（Ｃ３）の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、対象を処置する工程を含む。

【0127】

一態様において、本発明は、補体成分Ｃ３（Ｃ３）の発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。

【0128】

別の態様において、本発明は、補体成分Ｃ９（Ｃ９）の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、対象を処置する工程を含む。

【0129】

一態様において、本発明は、補体成分Ｃ９（Ｃ９）の発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。

【0130】

一実施形態において、障害は、補体成分に関連する疾病である。

【0131】

一実施形態において、補体成分に関連する疾病は、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、乾癬、皮膚筋炎、水疱性類天疱瘡、非典型溶血性尿毒症症候群、志賀毒素産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関連する溶血性尿毒症症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、デンスデポジット糸球体腎炎、Ｃ３神経障害、加齢性黄斑変性症、寒冷凝集素症、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、液性及び血管性移植拒絶反応、移植片機能不全、心筋梗塞、移植の感作レシピエント、及び敗血症からなる群から選択される。

【0132】

一実施形態において、補体成分に関連する疾病は、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）である。

【0133】

別の実施形態において、補体成分に関連する疾病は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である。

【0134】

一実施形態において、対象への剤の投与は、溶血の減少及び／又はＣＦＢタンパク質蓄積の減少を引き起こす。

【0135】

一実施形態において、対象への剤の投与は、溶血の減少及び／又はＣ３タンパク質蓄積の減少を引き起こす。

【0136】

一実施形態において、対象への剤の投与は、溶血の減少及び／又はＣ９タンパク質蓄積の減少を引き起こす。

【0137】

一実施形態において、本方法は、対象へのエクリズマブの投与を更に含む。

【0138】

別の実施形態において、本方法は、対象へのコンプスタチンの投与を更に含む。

【0139】

一実施形態において、この剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0140】

別の実施形態において、この剤は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0141】

更に別の実施形態において、この剤は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。

【0142】

一実施形態において、この剤は、週に１回、対象に投与される。

【0143】

別の実施形態において、この剤は、月に２回、対象に投与される。

【0144】

一実施形態において、本方法は、対象におけるＬＤＨレベルを測定する工程を更に含む。

【0145】

一態様において、本発明は、対象における補体Ｂ因子（ＣＦＢ）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、対象におけるＣＦＢの発現を阻害する工程を含む。

【0146】

別の態様において、本発明は、対象における補体成分Ｃ３（Ｃ３）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明の剤を対象に投与し、それによって、対象におけるＣ３の発現を阻害する工程を含む。

【0147】

更に別の態様において、本発明は、対象における補体成分Ｃ９（Ｃ９）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のいずれか１つの剤を対象に投与し、それによって、対象におけるＣ９の発現を阻害する工程を含む。

【0148】

一実施形態において、本方法は、エクリズマブを対象に投与する工程を更に含む。

【0149】

別の実施形態において、本方法は、コンプスタチンを対象に投与する工程を更に含む。

【0150】

一実施形態において、この剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0151】

別の実施形態において、この剤は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0152】

更に別の実施形態において、この剤は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。

【0153】

一実施形態において、この剤は、週に１回、対象に投与される。

【0154】

別の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、月に２回、対象に投与される。

【図面の簡単な説明】

【0155】

【図1】３つの補体経路：代替経路、古典経路、及びレクチン経路の概略図である。

【図2】示されるｉＲＮＡの単回の１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの投与の９６時間後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中に残っている補体Ｂ因子（ＣＦＢ）ｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。

【図3】ＡＤ－６０３３１の単回の１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの投与の７２時間後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中に残っている補体Ｂ因子（ＣＦＢ）ｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0156】

本発明は、補体成分遺伝子、即ち、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。

【0157】

本発明は、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を用いて、ＣＦＢ、Ｃ９、及び／又はＣ３遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る障害、例えば、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）及び非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）などの補体成分に関連する疾病に罹患している対象を処置するための方法及び併用療法も提供する。

【0158】

本発明は、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る障害、例えば、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）及び非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）などの補体成分に関連する疾病に罹患している対象の少なくとも１つの症状、例えば、溶血を予防するための方法も提供する。

【0159】

本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳動物の対応する遺伝子（ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子）のｍＲＮＡの標的化された分解を可能にする。非常に低い用量の本発明のｉＲＮＡは、特に、特異的に且つ効率的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し、対応する遺伝子（ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子）の発現のかなりの阻害をもたらし得る。細胞に基づいたアッセイを用いて、本発明者らは、これらの補体成分遺伝子を標的とするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを媒介し、補体遺伝子（即ち、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９）の発現のかなりの阻害をもたらし得ることを実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法及び組成物が、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）及び非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）などの補体成分に関連する疾病に罹患している対象を処置するのに有用である。

【0160】

以下の詳細な説明は、補体遺伝子（即ち、ＣＦＢ、Ｃ_３又はＣ９）の発現を阻害するためにｉＲＮＡを含有する組成物を作製し、使用する方法、並びにこれらの遺伝子の発現の阻害及び／又は低下から利益を得られ得る疾病及び障害に罹患している対象を処置するための組成物、使用、及び方法を開示する。

【0161】

Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。

【0162】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。

【0163】

「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定はされないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。

【0164】

「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。

【0165】

本明細書において使用される際、「ＣＦＢ」という用語と同義的に使用される「補体Ｂ因子」という用語は、当該技術分野において、ＡＨＵＳ、ＢＦ、ＣＦＡＢ、ＢＦＤ、ＦＢ、ＧＢＧ、ＦＢＩ１２、Ｂ因子、プロペルジン、Ｈ２－Ｂｆ、高グリシンβグリコプロテイン、Ｃ３プロアクセラレータ（Ｐｒｏａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）、プロペルジン２Ｂ因子、Ｃ３プロアクチベータ（Ｐｒｏａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＰＢＦ２、高グリシンβグリコプロテイン、Ｃ３／Ｃ５転換酵素、ＥＣ ３．４．２１、及びＥＣ ３．４．２１．４７３としても知られている周知の遺伝子及びポリペプチドを指す。「ＣＦＢ」という用語は、ヒトＣＦＢ（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１８９１８１７５６に見られる）；マウスＣＦＢ（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１８１５６２８８及びＧＩ：２１８１５６２９０に見られる）；ラットＣＦＢ（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２１８１５６２８４に見られる）；及びチンパンジーＣＦＢ（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５７１１４２０１に見られる）を含む。「ＣＦＢ」という用語は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＦＢ（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５４４４２８９１９及び遺伝子のエントリ、ＥＮＳＭＭＵＰ００００００００９８５（遺伝子座＝足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）３８８１：４７８３０：５３６２０）、マカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｍａｃａｑｕｅ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｐａｇｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）に見られる）も含む。ＣＦＢ ｍＲＮＡ配列の更なる例が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、及びマカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイトを用いて容易に利用可能である。

【0166】

例示的なＣＦＢヌクレオチド配列が、配列番号１～５、２７、及び３０にも見られる。配列番号１２～１６、３３、及び３６はそれぞれ、配列番号１～５、２７、及び３０のアンチセンス配列である。

【0167】

本明細書において使用される際の「ＣＦＢ」という用語は、ＣＦＢ遺伝子の天然のＤＮＡ配列変異も指す。ＣＦＢ遺伝子中の配列変異の非限定的な例は、エキソン１２における１５９８Ａ＞Ｇ（これにより、リジンが、アミノ酸残基５３３においてアルギニンに変化される）；エキソン６における８５８Ｃ＞Ｇ（これにより、フェニルアラニンが、アミノ酸残基２８６においてロイシンに変化される）；及びエキソン７における９６７Ａ＞Ｇ（これにより、リジンが、アミノ酸残基３２３においてアラニンに変化される）を含む（Ｔａｗａｄｒｏｕｓ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２５：９４７；Ｇｏｉｃｏｅｃｈｅａ ｄｅ Ｊｏｒｇｅ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：２４０）。本明細書において使用される際の「ＣＦＢ」という用語は、ＣＦＢ遺伝子における一塩基ヌクレオチド多型も指す。ＣＦＢ遺伝子中の多くの配列変異が、同定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ及びＵｎｉＰｒｏｔに見られる（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照）。

【0168】

本明細書において使用される際、「Ｃ３」という用語と同義的に使用される「補体成分３」という用語は、当該技術分野において、ＡＲＭＤ９、Ｃ３ａアナフィラトキシン、ＡＳＰ、補体成分Ｃ３ａ、Ｃ３ａ、補体成分Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂ、プレプロ－Ｃ３、アシル化刺激タンパク質切断産物、ＣＰＡＭＤ１、補体Ｃ３、Ｃ３及びＰＺＰ様α－２－マクログロブリンドメイン含有タンパク質１、補体成分Ｃ３、及びＡＨＵＳ５としても知られている周知の遺伝子及びポリペプチドを指す。「Ｃ３」という用語は、ヒトＣ３（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１１５２９８６７７に見られる）；マウスＣ３（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１２６５１８３１６に見られる）；及びラットＣ３（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１５８１３８５６０に見られる）を含む。「Ｃ３」という用語は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＦＢ（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５４４５０８１８２及び遺伝子のエントリ、ＥＮＳＰ０００００２４５９０７（遺伝子座＝ｃｈｒ１９：６９２１４１６：６９６３０３４）、マカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｍａｃａｑｕｅ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｐａｇｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）に見られる）も含む。Ｃ３ ｍＲＮＡ配列の更なる例が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、及びマカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイトを用いて容易に利用可能である。

【0169】

例示的なＣ３ヌクレオチド配列が、配列番号６～８、２８、及び３１にも見られる。配列番号１７～１９、３４、及び３７はそれぞれ、配列番号６～８、２８、及び３１のアンチセンス配列である。

【0170】

本明細書において使用される際の「Ｃ３」という用語は、Ｃ３遺伝子の天然のＤＮＡ配列変異も指す。Ｃ３遺伝子中の多くの配列変異が、同定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ及びＵｎｉＰｒｏｔに見られる（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照）。

【0171】

本明細書において使用される際、「Ｃ９」という用語と同義的に使用される「補体成分９」という用語は、周知の遺伝子及びポリペプチドを指す。「Ｃ９」という用語は、ヒトＣ９（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１８７６０８３４０に見られる）；マウスＣ９（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１５３７５３１１に見られる）；及びラットＣ９（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１６９２４００５に見られる）を含む。「Ｃ９」という用語は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＦＢ（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５４４４３６８６７及び遺伝子のエントリ、ｉｓｏｔｉｇ０５３６１（ｉｓｏｇｒｏｕｐ０３３５０長さ＝２９５５ ｎｕｍＣｏｎｔｉｇｓ＝１）、マカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｍａｃａｑｕｅ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｐａｇｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）に見られる）も含む。Ｃ３ ｍＲＮＡ配列の更なる例が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、及びマカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイトを用いて容易に利用可能である。

【0172】

例示的なＣ９ヌクレオチド配列が、配列番号９～１１、２９、及び３２にも見られる。配列番号２０～２２、３５、及び３８はそれぞれ、配列番号９～１１、２９、及び３２のアンチセンス配列である。

【0173】

本明細書において使用される際の「Ｃ９」という用語は、Ｃ９遺伝子の天然のＤＮＡ配列変異も指す。Ｃ９遺伝子中の多くの配列変異が、同定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ及びＵｎｉＰｒｏｔに見られる（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照）。

【0174】

本明細書において使用される際、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。一実施形態において、配列の標的部分は少なくとも、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該当部分で又はその近くでｉＲＮＡ指向性切断のための基質として働くのに十分な長さであろう。

【0175】

標的配列は、約９～３６ヌクレオチド長、例えば、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５～３０ヌクレオチド、１５－２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２ヌクレオチド長であり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0176】

本明細書において使用される際、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

【0177】

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）も指し得ることが理解されよう（例えば表２を参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換されてもよいことを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明において特徴づけられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換されてもよい。別の例では、オリゴヌクレオチド中のどこかのアデニン及びシトシンが、それぞれグアニン及びウラシルで置換されて、標的ｍＲＮＡとのＧ－Ｕゆらぎ塩基対合が形成され得る。このような置換部分を含有する配列は、本発明に取り上げられる組成物及び方法に好適である。

【0178】

本明細書において同義的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによってｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内での標的遺伝子の発現を調節する（例えば阻害する）。

【0179】

一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、すなわち、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のＲＮＡｉを指すために本明細書において使用される。

【0180】

別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞又は生物に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡであり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、これが、次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５～３０のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計及び試験が、米国特許第８，１０１，３４８号明細書及びＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載され、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかが、本明細書に記載されるような又はＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０；：８８３－８９４に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。

【0181】

別の実施形態において、本発明の組成物、使用及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。一般に、ｄｓＲＮＡ分子のそれぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用される際、「ＲＮＡｉ剤」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。

【0182】

本明細書において使用される際、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合、及び／又は修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、例えば、ヌクレオシド間結合、糖部分、又は核酸塩基への、官能基又は原子の置換、付加又は除去を包含する。本発明の剤に使用するのに好適な修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知の全ての型の修飾を含む。ｓｉＲＮＡ型の分子に使用されるいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の趣旨において「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。

【0183】

二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さのものであってもよく、約９～３６塩基対の長さ、例えば、約１５～３０塩基対の長さの範囲、例えば、約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２塩基対の長さなどの、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対の長さであり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0184】

二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個又はそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。

【0185】

ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合され得るが、共有結合されていなくてもよい。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。

【0186】

本明細書において使用される際、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延びるか又はその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか；あるいはオーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド又はそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せであり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端に存在し得る。

【0187】

一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１～１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１～１０のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ又は複数が、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。

【0188】

「平滑な」又は「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の該当する末端に不対ヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたって二本鎖である、即ち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤（即ち、１つのオーバーハング及び１つの平滑末端を有する剤）又は両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。

【0189】

「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」という用語は、例えば、標的配列、例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９ ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において使用される際、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９ヌクレオチド配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列と完全には相補的でない場合、その分子の内部領域又は末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端の５、４、３、又は２つのヌクレオチド中に存在する。

【0190】

本明細書において使用される際の「センス鎖」、又は「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。

【0191】

本明細書において使用される際、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的における、切断が生じる部位である。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した３つの塩基を含む。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した２つの塩基を含む。ある実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０及び１１によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２及び１３を含む。

【0192】

本明細書において使用される際、特に示されない限り、「相補的な」という用語は、当業者により理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載するのに使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄を含み得る（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。生物の内部で起こり得る生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができるであろう。

【0193】

本明細書に記載されるｉＲＮＡ中、例えば、ｄｓＲＮＡ中の相補的な配列は、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的な」と称され得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、又は、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二本鎖に対するハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つ又は複数であるが、一般に、５つ以下、４つ以下、３つ以下又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチと見なされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的のために、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、「完全に相補的」と称されてもよい。

【0194】

本明細書において使用される際の「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン－クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含むことができ、又はこのような塩基対から完全に形成され得る。このような非ワトソン－クリック塩基対としては、限定はされないが、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティーン型塩基対が挙げられる。

【0195】

本明細書における「相補的な」、「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」という用語は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。

【0196】

本明細書において使用される際、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、又は３’ＵＴＲを含む目的のｍＲＮＡ（例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＣＦＢをコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＣＦＢ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。

【0197】

一般に、それぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、「ｉＲＮＡ」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｉＲＮＡ分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」によって包含される。

【0198】

本発明の一態様において、本発明の方法及び組成物に使用するための薬剤は、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ中の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害し得る（Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照）。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１５～約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含み得る。

【0199】

本明細書において使用される際の「細胞を（ｄｓＲＮＡなどの）ＲＮＡｉ剤と接触させる」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させる工程を含む。細胞をＲＮＡｉ剤と接触させる工程は、細胞をｉＲＮＡとインビトロで接触させる工程又は細胞をｉＲＮＡとインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤は、方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、あるいは、ＲＮＡｉ剤は、それを後に細胞と接触させるのを可能にするか又はそれを後に細胞と接触させる状況に置かれてもよい。

【0200】

細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、ＲＮＡｉ剤とともに細胞をインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、ＲＮＡｉ剤が接触される細胞が位置する組織に後に到達するように、例えば、ＲＮＡｉ剤を、細胞が位置する組織中又は組織の近傍に注入することによって、又はＲＮＡｉ剤を、別の領域、例えば、血流又は皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、目的の部位、例えば、肝臓にＲＮＡｉ剤を指向するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３を含んでいてもよく、及び／又はそれに結合され得る。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。例えば、細胞はまた、ＲＮＡｉ剤とインビトロで接触され、その後、対象に移植されてもよい。

【0201】

本明細書において使用される際、「対象」は、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、及びチンパンジーなど）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、及びクジラなど）を含む哺乳動物、又は鳥類（例えば、アヒル又はガチョウ）などの動物である。一実施形態において、対象は、本明細書に記載されるように、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態について処置又は評価されているヒト；ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態のリスクがあるヒト；ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態に罹患しているヒト；及び／又はＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態について処置されているヒトなどのヒトである。

【0202】

本明細書において使用される際、「補体成分に関連する疾病」という用語は、補体活性化によって引き起こされるか又はそれに関連する疾病又は障害である。「補体成分に関連する疾病」という用語は、ＣＦＢ（即ち、「ＣＦＢに関連する疾病」）、Ｃ３（即ち、「Ｃ３に関連する疾病」）、及び／又はＣ９（即ち、「Ｃ９に関連する疾病」）の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害、又は病態を含む。このような疾病は、典型的に、炎症及び／又は免疫系活性化、例えば、膜侵襲複合体による溶解、アナフィラキシー、及び／又は溶血に関連している。補体成分に関連する疾病の非限定的な例としては、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、喘息、関節リウマチ（ＲＡ）；抗リン脂質抗体症候群；ループス腎炎；虚血－再かん流傷害；典型又は感染性溶血性尿毒症症候群（ｔＨＵＳ）；デンスデポジット糸球体腎炎（ＤＤＤ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）；多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）；多発性硬化症（ＭＳ）；黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ））；溶血、肝逸脱酵素上昇、及び血小板低下（ＨＥＬＬＰ）症候群；血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）；自然流産；微量免疫型血管炎；表皮水疱症；習慣性流産；妊娠高血圧腎症、外傷性脳損傷、重症筋無力症、寒冷凝集素症、皮膚筋炎、水疱性類天疱瘡、志賀毒素産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関連する溶血性尿毒症症候群、Ｃ３神経障害、抗好中球細胞質抗体関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症（以前にウェゲナー肉芽腫症として知られていた）、チャーグ・ストラウス症候群、及び顕微鏡的多発性血管炎）、液性及び血管性移植拒絶反応、移植片機能不全、心筋梗塞（例えば、心筋梗塞における組織損傷及び虚血）、同種移植、敗血症（例えば、敗血症における転帰不良）、冠動脈疾患、皮膚筋炎、グレーブス病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、全身性炎症反応敗血症、敗血症性ショック、脊髄損傷、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、１型糖尿病、乾癬、天疱瘡、自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、ＩＴＰ、グッドパスチャー症候群、ドゴー病、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、劇症型ＡＰＳ（ＣＡＰＳ）、心血管疾患、心筋炎、脳血管障害、末梢（例えば、筋骨格）血管障害、腎血管障害、腸間膜／腸血管障害、脈管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連性血管炎、関節リウマチに関連する血管炎、免疫複合体性血管炎、高安病、拡張型心筋症、糖尿病性血管症、川崎病（動脈炎）、静脈ガス塞栓症（ＶＧＥ）、及びステント留置後の再狭窄、回転性粥腫切除術、及び経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）が挙げられる（例えば、Ｈｏｌｅｒｓ（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２３：３００－３１６；Ｈｏｌｅｒｓ ａｎｄ Ｔｈｕｒｍａｎ（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４１：１４７－１５２；米国特許出願公開第２００７０１７２４８３号明細書を参照）。

【0203】

一実施形態において、補体成分に関連する疾病は、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）である。ＰＮＨは、古典的ＰＮＨ又は別の骨髄不全症候群及び／又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、例えば、血球減少症の場合のＰＮＨであり得る。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である。更に別の実施形態において、補体成分に関連する疾病は、関節リウマチである。

【0204】

本明細書において使用される際の「治療有効量」は、補体成分に関連する疾病に罹患している対象に投与される場合、（例えば、既存の疾病又は疾病の１つ又は複数の症状を軽減し、改善し、又は維持することによって）この疾病の処置を行うのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤又は抗体、又はその抗原結合フラグメント、薬剤が投与される方法、疾病及びその重症度並びに処置される対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。

【0205】

本明細書において使用される際の「予防的に有効な量」は、疾病の症状をまだ（又は現在のところ）生じても又は示してもいないが、補体成分に関連する疾病に罹患している対象、及び／又は補体成分に関連する疾病を発症するリスクがある対象、例えば、移植片及び／又は移植を有する対象、例えば、感作又は同種異系レシピエント、敗血症に罹患している対象、及び／又は心筋梗塞に罹患している対象に投与される場合、この疾病又はこの疾病の１つ又は複数の症状を予防又は改善するのに十分な、ｉＲＮＡ剤の量を含むことが意図される。疾病の改善は、この疾病の経過を遅らせること又は後から発症する疾病の重症度を軽減することを含む。「予防的に有効な量」は、ｉＲＮＡ剤、薬剤が投与される方法、疾病に罹患する危険度、並びに処置される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。

【0206】

「治療有効量」又は「予防的に有効な量」はまた、任意の処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比である所望の局所又は全身的作用を生じる、ＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法に用いられるｉＲＮＡ剤は、このような処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。

【0207】

本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、並びに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、尿、リンパ液、脳脊髄液、眼液、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、あるいはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。好ましい実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる血液又は血漿を指す。更なる実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる肝臓組織（又はその小部分（ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ））を指す。

【0208】

ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、補体成分遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨに罹患している対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物内の細胞などの細胞中のＣＦＢ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨに罹患している対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物内の細胞などの細胞中のＣ３遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。更なる実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨに罹患している対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物内の細胞などの細胞中のＣ９遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子、即ち、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、又は１８ヌクレオチド長以下）である。標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、ｉＲＮＡは、例えば、ＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法、あるいは例えば、ウエスタンブロット法又はフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによるタンパク質に基づいた方法によってアッセイした際に少なくとも約１０％、標的遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、又は鳥類のＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子）の発現を阻害する。

【0209】

ｄｓＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を含み、この２本のＲＮＡ鎖は、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズする。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的な、一般に完全に相補的な、相補性の領域を含む。標的配列は、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２本の鎖がハイブリダイズして、好適な条件下で組み合わされた際に二本鎖構造を形成するようになっている。本明細書のどこかに記載されるように、及び当該技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく、１つの核酸分子の自己相補的な領域として含まれることもある。

【0210】

一般に、二本鎖構造は、１５～３０塩基対の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２塩基対の長さである。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0211】

同様に、標的配列の相補性の領域は、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２ヌクレオチド長である。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。

【0212】

ある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１５～約２０ヌクレオチド長、又は約２５～約３０ヌクレオチド長である。一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を導くように、標的ＲＮＡ配列、即ち、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９標的ｍＲＮＡ配列と相互作用する２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として働くのに十分に長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒのための基質として働き得ることが当該技術分野において周知である。当業者がやはり認識するように、切断のために標的化されたＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子であることが多い）の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性の切断（即ち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）のための基質であるのが可能であるほど十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。

【0213】

二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約９～３６塩基対、例えば、約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２塩基対の二本鎖領域であることも当業者は認識するであろう。ここで、一実施形態において、所望のＲＮＡを切断のために標的とする例えば、１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる程度まで、ＲＮＡ分子又は３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中に生成されない。

【0214】

本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、又は４つのヌクレオチドを更に含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の同等物と比べて予想外に優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端上に存在し得る。

【0215】

ｄｓＲＮＡは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているものなど）の使用によって、更に後述されるように、当該技術分野において公知の標準的な方法によって合成され得る。

【0216】

本発明のｉＲＮＡ化合物は、２工程の手順を用いて調製され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別個に調製される。次に、構成要素の鎖はアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。

【0217】

一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列及びアンチセンス配列を含む。

【0218】

一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡの標的ＣＦＢは、表３及び４のいずれか１つに示される配列の群から選択されるセンス鎖を含み、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表３及び４のいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、ＣＦＢ遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、表３及び４のいずれか１つ中のセンス鎖として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表３及び４のいずれか１つ中のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として表される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。

【0219】

一実施形態において、Ｃ３を標的とする本発明のｄｓＲＮＡは、表５及び６のいずれか１つに示される配列の群から選択されるセンス鎖を含み、センス鎖の対応するアンチセンス鎖が、表５及び６のいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、Ｃ３遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、表５及び６のいずれか１つ中のセンス鎖として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表５及び６のいずれか１つ中のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として表される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。

【0220】

一実施形態において、Ｃ９を標的とする本発明のｄｓＲＮＡは、表７及び８のいずれか１つに示される配列の群から選択されるセンス鎖を含み、センス鎖の対応するアンチセンス鎖が、表７及び８のいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、Ｃ９遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、表７及び８のいずれか１つ中のセンス鎖として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表７及び８のいずれか１つ中のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として表される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。

【0221】

表３～８中の配列のいくつかが、修飾及び／又はコンジュゲート配列として表されるが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、本発明のｄｓＲＮＡは、表中に記載されるのと異なって、非修飾、非コンジュゲート、及び／又は修飾及び／又はコンジュゲートされる、表３～８に記載される配列のいずれか１つを含み得ることが理解されるであろう。

【0222】

当業者は、約２０～２３個の塩基対、例えば、２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であることが認められたことを十分に認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかしながら、他の当業者が、より短い又はより長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを見出した（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上記の実施形態において、表３～８のいずれか１つに示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小限の２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。一端又は両端におけるごくわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表３～８のいずれか１つの配列のうちの１つを有するより短い二本鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることが当然予測され得る。したがって、表３～８のいずれか１つの配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の連続するヌクレオチド配列を有するｄｓＲＮＡであって、標的遺伝子の発現を阻害する能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡとは約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害だけ異なるｄｓＲＮＡが、本発明の範囲内にあるものと考えられる。

【0223】

更に、表３及び４のいずれか１つに示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣを介した切断を受けやすい、ＣＦＢ転写物における部位を特定する。同様に、表５及び６のいずれか１つに示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣを介した切断を受けやすい、Ｃ３転写物における部位を特定し、表７及び８のいずれか１つに示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣを介した切断を受けやすい、Ｃ９転写物における部位を特定する。したがって、本発明は、これらの部位の１つ内を標的とするｉＲＮＡを更に取り上げる。本明細書において使用される際、ｉＲＮＡが、その特定の部位内のいずれかの箇所で転写物の切断を促す場合、ｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とするとされている。このようなｉＲＮＡは、一般に、標的遺伝子中の選択された配列に隣接する領域から取られた更なるヌクレオチド配列に結合された、表３～８のいずれか１つに示される配列のうちの１つからの少なくとも約１５連続ヌクレオチドを含むであろう。

【0224】

標的配列は、一般に、約１５～３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性は様々である。本明細書に記載される様々なソフトウェアパッケージ及び指針は、任意の所与の遺伝子標的のために最適な標的配列の特定のための指針を与えるが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」又は「マスク」が、標的配列として働き得るサイズ範囲内の配列を特定するために、標的ＲＮＡ配列上に文字通りに又は比喩的に（例えば、インシリコを含む）置かれる、経験的手法を取ることもできる。完全な一連の可能な配列が、選択された任意の所与の標的サイズについて特定されるまで、初期の標的配列位置の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に配列「ウインドウ」を移動させることによって、次の潜在的な標的配列を特定することができる。このプロセスは、最適に機能する配列を特定するために（本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知のアッセイを用いて）特定された配列の系統的合成及び試験とともに、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化されるとき、標的遺伝子の発現の最良の阻害を仲介するＲＮＡ配列を特定することができる。したがって、例えば、表３～８のいずれか１つ中で特定される配列が、有効な標的配列を表すが、同等の又はより良好な阻害特性を有する配列を特定するために、所与の配列の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に「ウインドウを移動させる」ことによって、阻害効率の更なる最適化が達成され得ると考えられる。

【0225】

更に、例えば、表３～８のいずれか１つ中で特定される任意の配列について、より長い又はより短い配列を生成するためにヌクレオチドを系統的に加えるか又は除去し、より長い又は短いサイズのウインドウをその点から標的ＲＮＡの上方又は下方に移動させることによって生成される配列を試験することによって、更なる最適化が達成され得ると考えられる。また、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載される阻害アッセイにおいて、新規な候補標的を生成するためのこの手法を、それらの標的配列に基づいたｉＲＮＡの有効性の試験と結び付けることで、阻害の効率が更に向上され得る。更にまた、このような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの追加又は変更、あるいは発現阻害因子として分子を更に最適化するための当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に説明される他の修飾（例えば、血清安定性の又は循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜透過送達の向上、特定の位置又は細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加）によって調整され得る。

【0226】

本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つ又は複数のミスマッチを含み得る。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性の領域の中心に位置しないのが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチが、相補性の領域の５’末端又は３’末端のいずれかからの最後の５ヌクレオチド内に制限されるのが好ましい。例えば、２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤について、例えばＣＦＢ遺伝子の領域に相補的な鎖は、一般に、中央の１３個のヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載される方法又は当該技術分野において公知の方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むｉＲＮＡが標的遺伝子、例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。標的遺伝子の発現を阻害する際のミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、標的遺伝子における特定の相補性の領域が集団内に多型配列変異を有することが分かっている場合に重要である。

【0227】

ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、修飾されておらず、例えば、当該技術分野において公知の及び本明細書に記載される化学的修飾及び／又はコンジュゲートを含まない。別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性又は他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。本発明の特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される。本発明の他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾される。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」本発明のｉＲＮＡは、大部分は修飾されるが、完全に修飾されるわけではなく、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。

【0228】

本発明に取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ））又は３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去（非塩基性ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位又は４’位で）又は糖の置換；及び／又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾ＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。

【0229】

修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、及び、ヌクレオシド単位の隣接する対が、３’－５’～５’－３’又は２’－５’～５’－２’に結合する、反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。

【0230】

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６、２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0231】

内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成要素部分を有する他のものが挙げられる。

【0232】

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；５，同第２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0233】

他の実施形態において、好適なＲＮＡ模倣体が、ｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで、糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載されている。

【0234】

本発明に取り上げられるある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上述した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－－ＣＨ_２－－ＮＨ－－ＣＨ_２－、－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_３）－－Ｏ－－ＣＨ_２－－［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、－－ＣＨ_２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－、－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_３）－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－及び－－Ｎ（ＣＨ_３）－－ＣＨ_２－－ＣＨ_２－－［式中、天然のホスホジエステル骨格は、－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ_２－－として表される］、及び上述した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施形態において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上述した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。

【0235】

修飾ＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ_１～Ｃ_１０アルキル又はＣ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾は、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）．_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２を含み、式中、ｎ及びｍが、１～約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｉＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、又はｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。ある実施形態において、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても知られている２’－Ｏ－－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、即ち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られている２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、即ち、２’－Ｏ－－ＣＨ_２－－Ｏ－－ＣＨ_２－－Ｎ（ＣＨ_２）_２である。

【0236】

他の修飾は、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ_３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0237】

ｉＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野において多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書において使用される際、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、デオキシ－チミン（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ．８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン及びＮ－２、Ｎ－６及び０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換基が、核酸二本鎖安定性を０．６～１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、例示的な塩基置換であり、特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。

【0238】

上記の修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０号明細書；５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９４，１２１号明細書、同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第６，０１５，８８６号明細書；同第６，１４７，２００号明細書；同第６，１６６，１９７号明細書；同第６，２２２，０２５号明細書；同第６，２３５，８８７号明細書；同第６，３８０，３６８号明細書；同第６，５２８，６４０号明細書；同第６，６３９，０６２号明細書；同第６，６１７，４３８号明細書；同第７，０４５，６１０号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；及び同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0239】

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２個の原子の架橋によって修飾されるフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２個の炭素原子を結合する架橋を含み、それによって、二環式環系を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は、糖環の４’－炭素及び２’－炭素を結合する。したがって、ある実施形態において、本発明の剤は、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’－ｅｎｄｏ構造的立体配座におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’及び２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’－２’架橋を含む１つ又は複数の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’－２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」とも呼ばれる）及び４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば，米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（ここで、Ｒが、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、又は保護基である）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照）；及び４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0240】

ロックト核酸ヌクレオチドの調製を教示する更なる代表的な米国特許及び米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，５２５，１９１号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；同第７，３９９，８４５号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；同第７，５６９，６８６号明細書；同第７，７４１，４５７号明細書；同第８，０２２，１９３号明細書；同第８，０３０，４６７号明細書；同第８，２７８，４２５号明細書；同第８，２７８，４２６号明細書；同第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；及び米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0241】

例えば、α－Ｌ－リボフラノース及びβ－Ｄ－リボフラノースを含む１つ又は複数の立体化学的糖立体配置を有する上記の二環式ヌクレオシドのいずれかが調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。

【0242】

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書において使用される際、「拘束エチルヌクレオチド」又は「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックト核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれるＳ立体配座にある。

【0243】

本発明のｉＲＮＡはまた、１つ又は複数の「立体配座的に拘束されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’及びＣ４’炭素又はリボースのＣ３及び－Ｃ５’炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定立体配座へと固定し、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を高める。リンカーは、酸素を安定性及び親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さを有し、リボース環の歪み（ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を少なくする。

【0244】

上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な公報としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；及びＰＣＴ公報の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0245】

本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの１つ又は複数はまた、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドも含み得る。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、「アンロックト（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸」（「ＵＮＡ」）修飾とも呼ばれる非環式２’－３’－ｓｅｃｏ－ヌクレオチドである。

【0246】

ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；及び米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；同第２０１３／００１１９２２号明細書；及び同第２０１１／０３１３０２０号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。

【0247】

Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤としては、例えば、それぞれ全内容が参照により本明細書に援用される、２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１０／０６５６９１号明細書に開示される化学的修飾を有する薬剤が挙げられる。

【0248】

本明細書及び米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１０／０６５６９１号明細書に示されるように、より優れた結果が、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖中、特に、切断部位又はその近傍に導入することによって得られる。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、あるいは完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入により、存在する場合、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の修飾パターンが中断される。ＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖上で、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと任意選択でコンジュゲートされ得る。得られたＲＮＡｉ剤は、より優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。

【0249】

より詳細には、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを有するように完全に修飾される場合、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に向上されたことが意外にも発見された。

【0250】

したがって、本発明は、インビボでの標的遺伝子（即ち、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２～３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４～３０ヌクレオチド長、１７～３０ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長、又は２１～２３ヌクレオチド長であり得る。

【0251】

センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書において「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２～３０ヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、１４～３０ヌクレオチド対長、１７～３０ヌクレオチド対長、２７～３０ヌクレオチド対長、１７～２３ヌクレオチド対長、１７～２１ヌクレオチド対長、１７～１９ヌクレオチド対長、１９～２５ヌクレオチド対長、１９～２３ヌクレオチド対長、１９～２１ヌクレオチド対長、２１～２５ヌクレオチド対長、又は２１～２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７ヌクレオチド長から選択される。

【0252】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端において１つ又は複数のオーバーハング領域及び／又はキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１～６ヌクレオチド長、例えば、２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長、又は１～２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、１つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、又は同じ長さの２つの鎖が互い違いになっている結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。第１及び第２の鎖がまた、例えば、ヘアピンを形成するように更なる塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって結合され得る。

【0253】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、限定はされないが、２－Ｆ、２’－Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらの任意の組合せなどの、２’－糖修飾を含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。

【0254】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖における５’－又は３’－オーバーハングは、リン酸化され得る。ある実施形態において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態において、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において、この３’－オーバーハングは、センス鎖中に存在する。

【0255】

ＲＮＡｉ剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る１つのみのオーバーハングを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいは、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に制約されるのを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に働く。

【0256】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７位、８位、９位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0257】

別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８位、９位、１０位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0258】

更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0259】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖及び２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、２つのヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。２つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、３つのうちの２つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’－Ｏ－メチル又は３’－フルオロで修飾される。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡＣ_３）を更に含む。

【0260】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）を起点として、第１の鎖の１～２３位が、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドを起点として、センス鎖の１～２３位と対合される位置において少なくとも８つのリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、最大で６連続の３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、それによって、１～６つのヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合されない１０～３０連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０～３０個のヌクレオチド一本鎖５’オーバーハングを形成し；少なくともセンス鎖５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖が最大の相補性のために整列される場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合される塩基であり、それによって、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖の領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９個のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、モチーフのうちの少なくとも１つが、切断部位又はその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。

【0261】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５且つ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、３０ヌクレオチド長以下を有する第２の鎖とを含み；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３’末端で第１の鎖より１～４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２の鎖長の少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドを更に含む。

【0262】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。

【0263】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。

【0264】

１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０位、１１位及び１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は、アンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。

【0265】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖及びアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、センス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフ及びアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、即ち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、又は全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。

【0266】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位又はその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位又はその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、又は少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じか又は異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位又はその近傍の第１のモチーフに対して１つの端部に又はリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。

【0267】

センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つ又は複数のウイング修飾を含み得る。

【0268】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端に第１の１つ又は２つの末端ヌクレオチドを含まない。

【0269】

別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つ又は２つの対合ヌクレオチドを含まない。

【0270】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し得る。

【0271】

ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。

【0272】

一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素及び／又は結合リン酸酸素の１つ又は複数の一方又は両方の１つ又は複数の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾又は置換；及びリボース－リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。

【0273】

核酸が、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’又は５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよく、又はＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端又は両方の末端が、リン酸化され得る。

【0274】

例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、又は一本鎖オーバーハング、例えば、５’又は３’オーバーハング、又はその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある実施形態において、３’又は５’オーバーハング中の塩基の全て又は一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）又は２’－Ｏ－メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。

【0275】

一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、又は２’－フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロで修飾される。

【0276】

少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾、又は他のものであり得る。

【0277】

一実施形態において、Ｎ_ａ及び／又はＮ_ｂは、交互のパターンの修飾を含む。本明細書において使用される際の「交互のモチーフ」という用語は、１つ又は複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ又は３つおきのヌクレオチドに１つ、又は同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ及びＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。

【0278】

交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、即ち、１つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖又はアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」又は「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。

【0279】

一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」から開始され得る。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な又は部分的なシフトが存在する。

【0280】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、即ち、センス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾から開始してもよい。

【0281】

センス鎖及び／又はアンチセンス鎖への、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフの導入は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを導入することによる、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子の対する遺伝子サイレンシング活性を意外にも高める。

【0282】

一実施形態において、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・Ｎ_ａＹＹＹＮ_ｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎ_ａ」及び「Ｎ_ｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、Ｎ_ａ及びＮ_ｂは、同じか又は異なる修飾であり得る。あるいは、Ｎ_ａ及び／又はＮ_ｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在していても又は存在していなくてもよい。

【0283】

ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖又はアンチセンス鎖又は両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じか又は異なっていてもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端又は３’末端における少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

【0284】

一実施形態において、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも２、３、４、又は全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及び／又はアンチセンス鎖の５’末端に存在し得る。

【0285】

一実施形態において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。

【0286】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、又はそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る）を促進する傾向に基づいて評価され得る。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。

【0287】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、及び二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。

【0288】

一実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２又は３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。

【0289】

別の実施形態において、センス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。別の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。一実施形態において、デオキシ－チミンヌクレオチドの短配列、例えば、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端における２つのｄＴヌクレオチドが存在する。

【0290】

一実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉ）
（式中：
ｉ及びｊがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ及びｑがそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａが、独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂが、独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ_ｐ及びｎ_ｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ及びＹが、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ及びＺＺＺがそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。好ましくは、ＹＹＹが、全て２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。

【0291】

一実施形態において、Ｎ_ａ及び／又はＮ_ｂは、交互のパターンの修飾を含む。

【0292】

一実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在し得る（例えば：６位、７位、８位、７位、８位、９位、８位、９位、１０位、９位、１０位、１１位、１０位、１１位、１２位又は１１位、１２位、１３位に存在し得る）。

【0293】

一実施形態において、ｉが１であり、ｊが０であり、又はｉが０であり、ｊが１であり、又はｉ及びｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉｃ）；又は
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉｄ）。

【0294】

センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0295】

センス鎖が、式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎ_ｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0296】

センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎ_ｂは、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0297】

Ｘ、Ｙ及びＺのそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。

【0298】

他の実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’（Ｉａ）。

【0299】

センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

【0300】

一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｋ－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｌ－Ｎ’_ａ－ｎ_ｐ’３’（ＩＩ）
（式中：
ｋ及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ’及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ’が、独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ’が、独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ_ｐ’及びｎ_ｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎ_ｂ’及びＹ’が、同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。

【0301】

一実施形態において、Ｎ_ａ’及び／又はＮ_ｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。

【0302】

Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。

【0303】

一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。

【0304】

一実施形態において、ｋが１であり、ｌが０であり、又はｋが０であり、ｌが１であり、又はｋ及びｌの両方が１である。

【0305】

したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎ_ｐ’３’（ＩＩｃ）；又は
５’ｎ_ｑ’－Ｎ_ａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｐ’３’（ＩＩｄ）。

【0306】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎ_ｂ ^’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0307】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎ_ｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0308】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎ_ｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎ_ｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。

【0309】

他の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎ_ｐ’－Ｎ_ａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ’－ｎ_ｑ’３’（Ｉａ）。

【0310】

アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎ_ａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0311】

Ｘ’、Ｙ’及びＺ’のそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。

【0312】

センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、又は２’－フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾又は２’－フルオロ修飾を表し得る。

【0313】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１のヌクレオチドである場合、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９位、１０位及び１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでいてもよく；Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフ又はＺＺＺモチーフを更に含んでいてもよく；ＸＸＸ及びＺＺＺはそれぞれ、独立して、２’－ＯＭｅ修飾又は２’－Ｆ修飾を表す。

【0314】

一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでいてもよく；Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフ又はＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを更に含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ、独立して、２’－ＯＭｅ修飾又は２’－Ｆ修飾を表す。

【0315】

上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、及び（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。

【0316】

したがって、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－（ＸＸＸ）_ｉ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－（ＺＺＺ）_ｊ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
アンチセンス：３’ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）_ｋ－Ｎ_ｂ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ ^’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）_ｌ－Ｎ_ａ ^’－ｎ_ｑ ^’５’
（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎ_ａ及びＮ_ａ ^’が、独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ ^’が、独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで、
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎ_ｐ’、ｎ_ｐ、ｎ_ｑ’、及びｎ_ｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。

【0317】

一実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり；又はｉが１であり、ｊが０であり；又はｉが０であり、ｊが１であり；又はｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。別の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり；又はｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であり；又はｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。

【0318】

ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式を含む：
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ ^’ｎ_ｑ ^’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ ^’ｎ_ｑ ^’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ａ ^’－ｎ_ｑ ^’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎ_ｐ－Ｎ_ａ－ＸＸＸ－Ｎ_ｂ－ＹＹＹ－Ｎ_ｂ－ＺＺＺ－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ３’
３’ｎ_ｐ ^’－Ｎ_ａ ^’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ_ｂ ^’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ_ａ－ｎ_ｑ ^’５’
（ＩＩＩｄ）

【0319】

ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0320】

ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎ_ｂは、独立して、１～１０、１～７、１～５又は１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0321】

ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

【0322】

ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎ_ｂ、Ｎ_ｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎ_ａ、Ｎ_ａ ^’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎ_ａ、Ｎ_ａ’、Ｎ_ｂ及びＮ_ｂ ^’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。

【0323】

式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）中のＸ、Ｙ及びＺのそれぞれは、互いに同じか又は異なり得る。

【0324】

ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＹヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0325】

ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＺヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0326】

ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）又は（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＸヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

【0327】

一実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、及び／又はＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。

【0328】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる（以下に記載）。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。

【0329】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎ_ａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎ_ｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎ_ｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。

【0330】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

【0331】

一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

【0332】

一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、及び３’末端の一方又は両方で互いに結合され、任意選択で、リガンドにコンジュゲートされる。ＲＮＡｉ剤のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又はＲＮＡｉ剤のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

【0333】

様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。このような刊行物としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられ、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0334】

以下により詳細に説明されるとおり、ＲＮＡｉ剤に対する１つ又は複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つ又は複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合される。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ又は複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは環状の）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、即ち、全ての環原子が、炭素原子であり、又は複素環系、即ち、１つ又は複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、又は２つ以上の環、例えば縮合環を含み得る。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、又は１つ又は複数の二重結合を含み得る。

【0335】

リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは、２つの「骨格結合点」及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー結合点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書において使用される際の「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、リン酸塩、又は修飾リン酸塩、例えば、硫黄を含有する、リボ核酸の骨格中への担体の組み込みに利用可能であり且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」（ＴＡＰ）は、ある実施形態において、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子と異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在するテザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、又は一般に、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込み又は連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を提供する。

【0336】

ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基又は環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル（ｐｙｒｉｄａｚｉｎｏｎｙｌ）、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。

【0337】

ある特定の実施形態において、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、表３～８のいずれか１つに列挙される薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドを更に含み得る。

【0338】

ＩＶ．リガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数のリガンド、部分又はコンジュゲートをＲＮＡに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）などの脂質部分が挙げられる。

【0339】

一実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドのない種と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞又は細胞型）、区画（例えば、細胞又は器官の区画）、身体の組織、器官又は領域に対する向上した親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合に関与しない。

【0340】

リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン又はヒアルロン酸）；又は脂質などの天然の物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの、組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はα－へリックスペプチドが挙げられる。

【0341】

リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、又はＲＧＤペプチド、又はＲＧＤペプチド模倣体又はアプタマーであり得る。

【0342】

リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）、アクリジン－イミダゾール複合体、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。

【0343】

リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ－ｌｉｇａｎｄ）、又は抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含んでもよい。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、又は多価マンノース、多価フコース又はアプタマーなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ－κＢの活性化因子であり得る。

【0344】

リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。

【0345】

ある実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されたリガンドは、薬物動態学的調節剤（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（ＰＫ調節剤）として働く。ＰＫ調節剤としては、親油性物質（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンド（例えばＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。更に、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに好適である。

【0346】

本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの結合分子の結合から誘導されるものなどの反応性のペンダント官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る（後述される）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、又は結合部分が結合されたリガンドと直接反応されてもよい。

【0347】

本発明のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に及び日常的に作製され得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段が、それに加えて又はその代わりに用いられてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも公知である。

【0348】

本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体、あるいは結合部分を既に有するヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド－ヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、あるいは非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、好適なＤＮＡ合成装置において組み立てられ得る。

【0349】

結合部分を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いる場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が、典型的に、完了されてから、リガンド分子が、結合部分と反応されて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが形成される。ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に通例使用される市販の、標準的なホスホロアミダイト及び非標準的なホスホロアミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されるホスホロアミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。

【0350】

Ａ．脂質コンジュゲート
一態様において、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、及び／又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。

【0351】

脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。

【0352】

好ましい実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ－リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。

【0353】

別の好ましい実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。

【0354】

別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミンあるいは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＡＳ及び低比重リポタンパク（ＬＤＬ）も含まれる。

【0355】

Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤（ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔ又はアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びＤ－アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα－へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。

【0356】

リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ペプチド及びペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、例えば細胞認識及び吸収を強化することにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５～５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。

【0357】

ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号９）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１０）も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１２）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４、１９９１）。細胞標的の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、又はＲＧＤ模倣体などのペプチドである。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。

【0358】

本発明の組成物及び方法において使用するためのＲＧＤペプチド部分は、直鎖状又は環状であり得、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾、例えば、グリコシル化又はメチル化されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を使用し得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１又はＶＥＧＦを標的とする。

【0359】

「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、あるいはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α－へリックス直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ－３７又はＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシン又はバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、又は１つ若しくは２つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９又はインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。

【0360】

Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のある実施形態において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物を更に含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載されるように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書において使用される際、「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状又は環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；又はその一部として、１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、単糖単位の各々が、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状又は環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖及び約４、５、６、７、８、又は９つの単糖単位を含むオリゴ糖）、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）の糖が挙げられ；二糖及び三糖としては、２つ又は３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）を有する糖が挙げられる。

【0361】

一実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態において、単糖は、

【化5】

などのＮ－アセチルガラクトサミンである。

【0362】

別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

からなる群から選択される。

【0363】

本明細書に記載される実施形態に使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、限定はされないが、

【化11】

が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。

【0364】

ある実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、限定はされないが、ＰＫ調節剤及び／又は細胞透過性ペプチドなどの、上述したような１つ又は複数の更なるリガンドを更に含む。

【0365】

Ｄ．リンカー
ある実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は切断不可能であり得る様々なリンカーを用いて、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。

【0366】

「リンカー」又は「結合基」という用語は、化合物の２つの部分を接続し、例えば、化合物の２つの部分を共有結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨなどの単位、又は、限定はされないが、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（１つ又は複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換の複素環式により中断又は終端され得る）などの原子の鎖を含み；ここでＲ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換された脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８個の原子、７－１７、８～１７、６～１６、７～１６、又は８～１６個の原子である。

【0367】

切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を解放するものである。好ましい実施形態において、切断可能な結合基は、標的細胞内又は第一の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下で、対象の血液中、又は第二の参照条件（例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下の少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍又はそれ以上、又は少なくとも約１００倍速く切断される。

【0368】

切断可能な結合基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清又は血液中と比較して細胞内部に広く存在し、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解剤の例としては、例えば、細胞内に存在する酸化若しくは還元酵素又は還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できるメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択され又は基質特異性を有さない酸化還元剤、；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を形成可能な薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらす薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な結合基を加水分解又は分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。

【0369】

ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４である一方、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５．０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドからカチオン性脂質を放出し、又は細胞の所望の区画内へ放出するであろう。

【0370】

リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、カチオン性脂質に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞型としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。

【0371】

ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などの、ペプチダーゼに富んだ細胞型を標的とする際に使用することができる。

【0372】

一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤（又は分解条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、又は他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補結合基が切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。したがって、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内又は生体液、例えば血液又は血清中での切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内若しくは組織培養物中、又は全動物内で行うことができる。無細胞又は培養物条件内で最初の評価を行い、全動物内での更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く切断される。

【0373】

ｉ．酸化還元切断可能な結合基
一実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定の標的化剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は当該技術分野において公知の試薬を用いた他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察され得る切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価され得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で約１０％以下切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、血液中（又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。

【0374】

ｉｉ．リン酸塩ベースの切断可能な結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、リン酸塩ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸塩ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸塩ベースの結合基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0375】

ｉｉｉ．酸切断可能な結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態において、酸切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、又はそれ以下）のｐＨを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの、特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－ＯＣ（Ｏ）で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはｔ－ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0376】

ｉｖ．エステルベースの結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例としては、限定はされないが、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、又は－ＯＣ（Ｏ）－で表される。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0377】

ｖ．ペプチドベースの切断基
更に別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－で表され、式中、ＲＡ及びＲＢは、隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

【0378】

一実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物とコンジュゲートされる。本発明の組成物及び方法のリンカーとのｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、限定はされないが、

【化12】

【化13】

が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。

【0379】

本発明の組成物及び方法の特定の実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。

【0380】

一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）～（ＸＸＸＩＶ）：

【化14】

のいずれかに示される構造の群から選択される二価又は三価の分枝鎖状リンカーにコンジュゲートされ、
式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、０～２０を表し、繰返し単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ^２Ａ、Ｐ^２Ｂ、Ｐ^３Ａ、Ｐ^３Ｂ、Ｐ^４Ａ、Ｐ^４Ｂ、Ｐ^５Ａ、Ｐ^５Ｂ、Ｐ^５Ｃ、Ｔ^２Ａ、Ｔ^２Ｂ、Ｔ^３Ａ、Ｔ^３Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^４Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^５Ｂ、Ｔ^５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＮＨ又はＣＨ_２Ｏであり；
Ｑ^２Ａ、Ｑ^２Ｂ、Ｑ^３Ａ、Ｑ^３Ｂ、Ｑ^４Ａ、Ｑ^４Ｂ、Ｑ^５Ａ、Ｑ^５Ｂ、Ｑ^５Ｃが、出現するごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで１つ又は複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ^Ｎ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ”）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終端されてもよく；
Ｒ^２Ａ、Ｒ^２Ｂ、Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ、Ｒ^４Ｂ、Ｒ^５Ａ、Ｒ^５Ｂ、Ｒ^５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒ^ａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒ^ａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、

【化15】

又はヘテロシクリルであり；
Ｌ^２Ａ、Ｌ^２Ｂ、Ｌ^３Ａ、Ｌ^３Ｂ、Ｌ^４Ａ、Ｌ^４Ｂ、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５Ｂ及びＬ^５Ｃが、リガンドを表し；即ち、それぞれ、出現するごとに独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒ^ａが、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、ＲＮＡｉ剤とともに使用されて、式（ＸＸＸＶ）：

【化16】

のものなどの標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用であり、
式中、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５Ｂ及びＬ^５Ｃが、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。

【0381】

ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝鎖状結合基の例としては、限定はされないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、及びＸＩＩＩとして上に列挙される構造が挙げられる。

【0382】

ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な特許としては、限定はされないが、米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１号、５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３号、５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５９９，９２３号；５，５９９，９２８号及び５，６８８，９４１号；６，２９４，６６４号；６，３２０，０１７号；６，５７６，７５２号；６，７８３，９３１号；６，９００，２９７号；７，０３７，６４６号；８，１０６，０２２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0383】

所与の化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中に又は更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。

【0384】

本発明の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物又は「キメラ」は、少なくとも１つのモノマー単位、即ち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｉＲＮＡ化合物、好ましくは、ｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、少なくとも１つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加をｉＲＮＡに与えるように修飾される。ｉＲＮＡの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質として働き得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大幅に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡによって同等の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、及び必要に応じて、当該技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通例検出され得る。

【0385】

場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させるためにｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲートを行うための手順は、科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分は、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分を含んでいた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的なコンジュゲートプロトコルは、配列の１つ又は複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング剤又は活性化試薬を用いて、アミノ基をコンジュゲートされた分子と反応させる。コンジュゲート反応は、固体担体に依然として結合されたＲＮＡを用いて、又は溶液相中のＲＮＡの切断の後に行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、典型的に、純粋なコンジュゲートが得られる。

【0386】

Ｖ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象（例えば、本明細書に記載される補体成分に関連する疾患に罹患している対象などの、ｉＲＮＡ剤を必要とする対象）などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。あるいは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。

【0387】

一般に、核酸分子を（インビトロ又はインビボで）送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４及び国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照）。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入又は移植によって、あるいは製剤を局所的に投与することによって、最小限に抑えられ得る。処置部位への局所投与は、剤の局所濃度を最大にし、剤によって悪影響を受け得るか又は剤を分解し得る、全身組織への剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子の総投与量を少なくすることができる。いくつかの研究が、ｉＲＮＡが局所投与される場合の遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルの硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）及びマウスの網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）は両方とも、加齢性黄斑変性症の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。更に、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与が腫瘍容積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、担癌マウスの生存を延長することができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）及び鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）による成功も示している。疾病の処置のためにｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡは、修飾され得るか、あるいは薬剤送達システムを用いて送達され得；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐ働きをする。ＲＮＡ又は医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与し、肝臓及び空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを得た（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲートは、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を仲介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、又はカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜における相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、又はポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、又はｉＲＮＡを包む小胞又はミセル（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照）を形成するように誘導され得る。小胞又はミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、上記参照；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）、上記を参照）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。ある実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法及びｉＲＮＡｓ及びシクロデキストリンの医薬組成物が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出され得る。

【0388】

Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１４号パンフレット、及びＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照）。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的（およそ数時間から数週間）であるか又は持続され得る（数週間から数カ月又はそれ以上）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。

【0389】

ｉＲＮＡの個々の１つ又は複数の鎖は、発現ベクターにおけるプロモーターから転写され得る。２本の別個の鎖が発現されて、例えば、ｄｓＲＮＡを生成する場合、２つの別個の発現ベクターが、（例えば、トランスフェクション又は感染によって）標的細胞中に共導入され得る。あるいは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖が、同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ステム・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。

【0390】

ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。通常、所望の核酸セグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から移植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などによる全身送達であり得る。

【0391】

ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）又は非カチオン性の脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞中にトランスフェクトされ得る。１週間以上の期間にわたる標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするｉＲＮＡを介したノックダウンのための複数回の脂質のトランスフェクションも、本発明によって想定される。宿主細胞中へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて監視され得る。例えば、一過性のトランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いて示され得る。エクスビボでの細胞の安定したトランスフェクションは、トランスフェクト細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの、特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬剤）に対する耐性を与えるマーカーを用いて確実にすることができる。

【0392】

本明細書に記載される方法及び組成物とともに用いられ得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）、例えば、ワクシニアウイルスベクター又は鳥ポックス、例えばカナリア痘又は鶏痘などのポックスウイルスベクター；及び（ｊ）ヘルパー依存性又は弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれないであろう。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクター及び構築物について考慮される他の態様が、更に後述される。

【0393】

ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞又は組織におけるｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサーなど）を含むであろう。調節要素は、構成的発現又は調節性／誘導性発現のいずれかを提供するように選択され得る。

【0394】

ｉＲＮＡの発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、血中グルコースレベル、又はホルモンに対して感受性がある誘導性調節配列を使用することによって、正確に調節され得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０－２４）。細胞又は哺乳動物におけるｄｓＲＮＡの発現の制御に好適なこのような誘導性発現系は、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、及びイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節を含む。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の目的とする使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。

【0395】

ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用され得る。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１－５９９（１９９３）を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの適切なパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を促進する、１つ又は複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターについての更なる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１－３０２（１９９４）に見出すことができ、これには、造血幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示す他の参照文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４－６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７－１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９－１４１（１９９３）；及びＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０－１１４（１９９３）である。使用のために考えられるレンチウイルスベクターとしては、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；同第５，６６５，５５７号明細書；及び同第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶに基づいたベクターが挙げられる。

【0396】

アデノウイルスも、本発明のｉＲＮＡの送達における使用のために考えられる。アデノウイルスは、例えば、呼吸上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、本来、呼吸上皮に感染し、軽度の疾病を引き起こす。アデノウイルスに基づいた送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞に感染することが可能であるという利点がある。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９－５０３（１９９３）には、アデノウイルスに基づいた遺伝子療法の概説が示されている。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０（１９９４）は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移送するアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５－２３４（１９９３）；ＰＣＴ公報の国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５－７８３（１９９５）に見出すことができる。本発明に取り上げられるｉＲＮＡを発現するのに好適なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６－１０１０に記載されている。

【0397】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも、本発明のｉＲＮＡを送達するのに使用され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９－３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組み換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明に取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するのに好適なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、全開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６－３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０－５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願番号国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；及び国際特許出願番号国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載されている。

【0398】

本発明のｉＲＮＡの送達に好適な別のウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）又はＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、鶏痘又はカナリア痘などの鳥ポックスなどのポックスウイルスである。

【0399】

ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質又は他のウイルスからの他の表面抗原を用いてベクターをシュードタイピングする（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）ことによって、又は異なるウイルスカプシドタンパク質を必要に応じて置換することによって、改変され得る。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質を用いてシュードタイピングされ得る。ＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにこのベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とするように作製され得る。例えば、全開示内容が参照により本明細書に援用されるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１－８０１を参照。

【0400】

ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中のベクターを含むことができ、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、組み換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターが無傷で産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ又は複数の細胞を含むことができる。

【0401】

ＶＩ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物及び製剤も含む。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物も本明細書に提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子の発現又は活性に関連する疾病又は障害、例えば、本明細書に記載される補体成分に関連した疾病を処置するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介した、例えば、皮下（ＳＣ）又は静脈内（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続性ポンプ注入などによる脳への注入による、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。本発明の医薬組成物は、Ｃ５遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たりレシピエントの体重１キログラムにつき約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、一般に、１日当たり体重１キログラムにつき約１～５０ｍｇの範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、又は約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。

【0402】

例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８．８、９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0403】

別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0404】

例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0405】

別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0406】

例えば、対象に、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの単一治療量のｉＲＮＡを、例えば皮下又は静脈内に、投与してもよい。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0407】

ある実施形態において、対象には、例えば、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇの用量などの、治療量のｉＲＮＡが、複数回投与で皮下又は静脈内投与される。複数回投与の投薬計画は、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、又はそれ以上などにわたって毎日の治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。

【0408】

他の実施形態において、対象には、例えば、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇの用量などの、治療量のｉＲＮＡが、反復投与で皮下又は静脈内投与される。反復投与の投薬計画は、１日おき、３日ごと、４日ごと、週に２回、週に１回、隔週、又は月に１回などの、定期的な治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。

【0409】

医薬組成物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１、２２、２３、２４分間、又は約２５分間などの期間にわたって、静脈内注入によって投与され得る。投与は、例えば、毎週、隔週（即ち、２週間ごと）で１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間又はそれ以上などにわたって、定期的に繰り返され得る。最初の処置計画の後、治療剤は、より少ない頻度で投与され得る。例えば、毎週又は隔週で３ヶ月間の投与後、投与は、月に１回で６ヶ月間又は１年間又はそれ以上にわたって繰り返され得る。

【0410】

医薬組成物は、一日１回投与することができ、又はｉＲＮＡは、１日を通して適切な間隔で、２、３以上のサブ用量として投与され、又は更には、連続注入若しくは徐放製剤を介した送達を用いて投与されてもよい。その場合、各サブ用量に含まれるｉＲＮＡは、総一日投与量を達成するように、対応してより少量である必要がある。投与単位はまた、例えば数日間の期間に亘るｉＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間に亘る送達用に配合されてもよい。持続放出製剤は当技術分野にて周知であり、薬剤を特定の部位に送達するのに特に有用であるため、本発明の薬剤と共に使用することができる。この実施形態において、投与単位は、一日用量の対応する倍数を含む。

【0411】

他の実施形態において、医薬組成物の単回投与は、長続きすることができるため、その後の用量は、３、４、又は５日以下の間隔、あるいは１、２、３、又は４週間以下の間隔で投与される。本発明のある実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、週に１回投与される。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、２ヶ月に１回（ｂｉ－ｍｏｎｔｈｌｙ）投与される。

【0412】

当業者は、非限定的に疾病又は疾患の重篤さ、以前の処置、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾病を含む所定の因子が対象を効果的に処置するのに必要な投与量及び時間に影響し得ることを認識するであろう。更に、治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。本発明により包含される個々のｉＲＮＡに関する有効な投与量、及びインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、又は、本明細書の他の箇所に記載されるような適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて概算することができる。

【0413】

マウス遺伝学の進歩により、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９の発現の低下から利益を得られ得る障害などの、様々なヒトの疾病の研究用の多くのマウスモデルが生成された。このようなモデルは、ｉＲＮＡのインビボ試験のために、並びに治療に有効な用量を決定するために使用され得る。好適なマウスモデルは、当該技術分野において公知であり、これらとしては、例えば、コラーゲン誘導関節炎マウスモデル（Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８３，６６６－６６８）、心筋虚血（Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ ＪＷ ａｎｄ Ｌｕｃｃｈｅｓｉ ＢＲ（１９９４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３４：１７－４０）、オボアルブミン誘導喘息マウスモデル（例えば、Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，５７９２－５８００）、（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１、ＭＲＬ／Ｆａｓ^ｌｐｒ（ＭＲＬ／ｌｐｒ）及びＢＸＳＢマウスモデル（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｎ．ａｎｄ Ｋｏｎｏ，Ｄ．Ｈ．１９９９．Ｍｕｒｉｎｅ ｌｕｐｕｓ ｍｏｄｅｌｓ：ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ Ｌａｈｉｔａ Ｒ．Ｇ．，ｅｄ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，３ｒｄ ｅｄｎ，ｐ．１４５．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、マウスａＨＵＳモデル（Ｇｏｉｃｏｅｃｈｅａ ｄｅ Ｊｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｄｅｐｅｄｓ ｏｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ５，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２２：１３７－１４５が挙げられる。

【0414】

本発明の医薬組成物は、局所的又は全身的処置が必要かどうか及び処置される部位に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所投与（例えば、経皮パッチによる）、例えば、噴霧器などによる、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による経肺投与；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口又は非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与；又は例えば、実質内、髄腔内若しくは脳室内投与による頭蓋内投与が挙げられる。

【0415】

ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織を標的とするように送達され得る。

【0416】

局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり、又は所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入されることができ、又はリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成することができる。代替的に、ｉＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸及びエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ_１～２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる）。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。

【0417】

Ａ．膜分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物及び方法に使用するためのｉＲＮＡは、膜分子集合体、例えば、リポソーム又はミセル中の送達用に製剤化され得る。本明細書において使用される際、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層又は複数の二重層に配置された両親媒性の脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料及び水性内部から形成される膜を有する単層及び多層小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性外部から水性内部を分離し、通常、ｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては、含むことがある。リポソームは、作用部位への活性成分の移送及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造が類似しているため、リポソームが組織に付着されると、リポソームの二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の融合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物が、細胞に送達され、ここで、ｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ｉＲＮＡを特定の細胞型に指向するように、特異的に標的化される。

【0418】

ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製され得る。一例において、リポソームの脂質成分は、ミセルが脂質成分で形成されるように、洗剤に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性のカチオン性脂質又は脂質コンジュゲートであり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、ＲＮＡｉ剤の調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質におけるカチオン性基は、ＲＮＡｉ剤と相互作用し、ＲＮＡｉ剤の周りで縮合して、リポソームを形成する。縮合の後、洗剤は、例えば透析によって除去されて、ＲＮＡｉ剤のリポソーム製剤が得られる。

【0419】

必要に応じて、縮合を補助する担体化合物が、例えば、制御添加によって、縮合反応中に加えられ得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。縮合を補助するためにｐＨも調整され得る。

【0420】

送達ビヒクルの構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成するための方法が、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに更に記載されている。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つ又は複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質集合体を調製するための一般的に使用される技術としては、超音波処理ならびに凍結融解及び押し出しが挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照）。一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）且つ比較的均一な集合体が所望される場合、顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が使用され得る（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、ＲＮＡｉ剤の調製物をリポソームにパッケージングするのに容易に適合される。

【0421】

リポソームは、２つの大きなクラスに分かれる。陽イオン性リポソームは、負に帯電された核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に帯電されたリポソームである。正に帯電された核酸／リポソーム複合体は負に帯電された細胞表面に結合し、エンドソーム内に移行される。エンドソーム内の酸性ｐＨによって、リポソームが破裂され、それらの内容物を細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０－９８５）。

【0422】

ｐＨ感受性かつ負に帯電されたリポソームは、核酸と複合するのではなく、核酸を捕捉する。核酸及び脂質の両方は同様に帯電されるため、複合体形成ではなく反発が起こる。にも係わらず、いくつかの核酸はこれらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養物中の細胞単層に送達するよう使用されている。標的細胞内で外来遺伝子の発現が検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９～２７４）。

【0423】

リポソーム組成物の主要な一タイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、陰イオン性膜融合リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。他のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。

【0424】

リポソームを細胞中にインビトロ及びインビボで導入するための他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；及びＳｔｒａｕｓｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。

【0425】

非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系も試験されて、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性が決定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン－Ａをマウス皮膚の真皮に送達した。結果はそのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層中へのシクロスポリン－Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４（６）４６６）。

【0426】

リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、本明細書で使用されるこの用語は、１つ又は複数の特定化脂質を含むリポソームを指し、該特定化脂質は、リポソームに組み込まれた際、そのような特定化脂質を欠いたリポソームと比較して増強された循環寿命をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１などの１つ又は複数の糖脂質を含むもの、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ又は複数の親水性ポリマーにより誘導体化されているものである。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ－誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの低下に由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。

【0427】

１つ又は複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野にて既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．により詳説されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）。両方ともＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４，８３７，０２８号明細書及び国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧ_Ｍ１又は硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。

【0428】

一実施形態において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームには、細胞膜に融合することができるという利点がある。非カチオン性リポソームは、それほど効率的に細胞膜と融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。

【0429】

リポソームの更なる利点としては以下が挙げられる：天然のリン脂質から得られるリポソームは、生体適合性があり且つ生分解性可能であり；リポソームは、広範囲の水溶性及び脂溶性薬剤を組み込むことができ；リポソームは、その内部の区画中に封入されたＲＮＡｉ剤を代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの水性容積である。

【0430】

正に帯電した合成カチオン性脂質である、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を用いて、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、ＲＮＡｉ剤の送達をもたらすことが可能な脂質－核酸複合体を形成する、小さいリポソームを形成することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７、及びＤＯＴＭＡ及びＤＮＡとのその使用の説明については米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照）。

【0431】

ＤＯＴＭＡ類似体である、１，２－ビス（オレイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡ複合小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して、複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生体組織培養細胞中に高度にアニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味電荷も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、細胞膜と融合し、機能性核酸を、例えば、組織培養細胞中に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１，２－ビス（オレイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなく、エステルによって結合された点でＤＯＴＭＡとは異なる。

【0432】

他の報告されているカチオン性脂質化合物としては、２つのタイプの脂質のうちの１つにコンジュゲートされ、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物を含む、例えば、カルボキシスペルミンを含む様々な部分にコンジュゲートされたものが挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照）。

【0433】

別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．及びＨｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されるリポポリリジンは、血清の存在下におけるトランスフェクションに有効であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質が、国際公開第９８／３９３５９号パンフレット及び国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。

【0434】

リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与される薬剤の高い全身性吸収率に関連する副作用の減少、所望の標的における投与される薬剤の蓄積の増加、及びＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。ある実施において、ＲＮＡｉ剤を表皮細胞に送達するために、また、真皮組織、例えば、皮膚へのＲＮＡｉ剤の浸透を促進するために、リポソームが使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用され得る。リポソームとして製剤化される薬剤の皮膚への局所送達が報告されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５－４１０及びｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２：２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６，１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２－５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５，１９８７を参照）。

【0435】

また、非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系は、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を決定するために調べられた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮に薬剤を送達するのに使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を処置するのに有用である。

【0436】

ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に作製され得る。このような変形性は、リポソームが、リポソームの平均半径より小さい孔を透過するのを可能にし得る。例えば、トランスフェルソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なリポソームの一種である。トランスフェルソームは、表面縁活性化因子、通常、界面活性剤を、標準的なリポソーム組成物に加えることによって作製され得る。ＲＮＡｉ剤を含むトランスフェルソームは、皮膚のケラチノサイトにＲＮＡｉ剤を送達するために、例えば、皮下感染によって送達され得る。無傷の哺乳動物皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、５０ｎｍ未満の直径をそれぞれ有する一連の微細孔を透過しなければならない。更に、脂質特性のため、これらのトランスフェロソームは、自己最適化（例えば、毛穴の形状に適応可能）、自己修復性であり得、多くの場合、破砕せずにそれらの標的に到達し、多くの場合、自己充填性（ｓｅｌｆ－ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。

【0437】

本発明に適した他の製剤が、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された同第６１／０４７，０８７号明細書及び２００８年５月８日に出願された同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書にも、本発明に適した製剤が記載されている。

【0438】

トランスファーソームは、リポソームの更なる別の一タイプであり、薬物送達ビヒクルの候補として魅力的な、高く変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質小滴として記載することもでき、この脂質小滴は、高く変形可能であるため、小滴よりも小さい孔内を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば自己最適性（皮膚内の孔の形状に適応する）であり、自己修復性であり、しばしば細分化することなくそれらの標的に到達し、また多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するためには、通常は界面活性剤である表面縁部活性化因子を標準的なリポソーム組成物に加えることが可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに使用されている。トランスファーソーム仲介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。

【0439】

界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームなどの製剤に広い用途を見出している。天然及び合成の両方の多数の異なるタイプの界面活性剤を分類及び順位付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても既知）の性質は、製剤中に使用される異なる界面活性剤を類別する最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

【0440】

界面活性剤分子がイオン化されていない場合、この界面活性剤は非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬及び美容製品に広い用途を見出し、広い範囲のｐＨ値に亘って使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミド、及び、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどのエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。

【0441】

界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に負電荷を保有する場合、この界面活性剤は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、せっけんなどのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェート及びエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが挙げられる。陰イオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルフェート及びせっけんである。

【0442】

界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に正電荷を保有する場合、この界面活性剤は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、最も使用されているこのクラスのメンバーである。

【0443】

界面活性剤分子が正又は負電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、この界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。

【0444】

薬物製品、製剤及びエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

【0445】

本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、分子の全ての疎水性部分が内側を向いて、親水性部分を周囲の水相と接触したままにするように、両親媒性分子が球体構造で配置される、特定のタイプの分子集合体として本明細書において定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。

【0446】

経皮膜を介した送達に好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液、アルカリ金属Ｃ_８～Ｃ_２２アルキル硫酸塩、及びミセル形成化合物を混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン及びその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル及びその類似体、ポリドカノールアルキルエーテル及びその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、及びそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に又はその後に加えられてもよい。混合ミセルは、成分の実質的に任意の種類の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合で形成される。

【0447】

一方法において、ｓｉＲＮＡ組成物及び少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成される。別の方法において、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩及びミセル形成化合物の少なくとも１つを混合し、続いて、激しく混合しながら残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。

【0448】

フェノール及び／又はｍ－クレゾールが、混合ミセル組成物に加えられて、製剤を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。あるいは、フェノール及び／又はｍ－クレゾールは、ミセル形成成分とともに加えられてもよい。グリセリンなどの等張剤も、混合ミセル組成物の形成後に加えられてもよい。

【0449】

スプレーとしてのミセル製剤の送達では、製剤は、エアロゾルディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーに噴射剤が充填される。圧力下にある噴射剤は、ディスペンサー中で液体形態である。成分の比率は、水相及び噴射剤相が１つになるように、すなわち、１つの相が存在するように調整される。２つの相が存在する場合、例えば、定量弁によって、内容物の一部を投薬する前にディスペンサーを振とうする必要がある。医薬品の投薬用量は、微細なスプレー状で定量弁から噴射される。

【0450】

噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル及びジエチルエーテルを含み得る。特定の実施形態において、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用されてもよい。

【0451】

必須成分の特定の濃度は、比較的単純な実験によって決定され得る。口腔を介した吸収では、注射又は胃腸管を介した投与のための投与量の、例えば、少なくとも２倍又は３倍に増加させることが望ましいことが多い。

【0452】

Ｂ．脂質粒子
本発明のｉＲＮＡすなわちｄｓＲＮＡは、脂質製剤中、例えばＬＮＰ中に完全に封入されてもよく、又は他の核酸－脂質粒子を形成してもよい。

【0453】

本明細書で使用される用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的には、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環寿命を有し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。ＬＮＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、ｐＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開第国際公開第００／０３６８３号パンフレットに示されているように、封入された縮合剤－核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均粒径を有し、かつ実質的に無毒である。加えて、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸－脂質粒子、及びそれらの調製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書及びＰＣＴ公開国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。

【0454】

一実施形態において、脂質対薬物の比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡの比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲内であろう。上記の範囲の中間の範囲も、本発明の一部であるものと考えられる。

【0455】

陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、又は３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザネジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、又はこれらの混合物であってもよい。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％からなり得る。

【0456】

別の実施形態において、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランが、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するのに使用され得る。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、参照により本明細書に援用される、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載されている。

【0457】

一実施形態において、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、６３．０±２０ｎｍの粒度及び０．０２７ｓｉＲＮＡ／脂質比を有する。

【0458】

イオン性／非陽イオン性脂質は、非限定的にジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ）エタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はこれらの混合物を含む陰イオン性脂質又は中性脂質とすることができる。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又は約５８ｍｏｌ％であってもよい。

【0459】

粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、非限定的にＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質とすることができる。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ_２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ_４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ_６）、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］_８）とすることができる。粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する全脂質の０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、又は２ｍｏｌ％とすることができる。

【0460】

いくつかの実施形態において、核酸－脂質粒子は更に、粒子中に存在する全脂質の例えば約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％又は約４８ｍｏｌ％のコレステロールを含む。

【0461】

一実施形態において、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（参照により本明細書に援用される、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＥＧ－Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）が、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するのに使用され得る。エタノール中のそれぞれの原液が、以下のとおりに調製され得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ－Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次に、ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ－Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６原液は、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせられ得る。組み合わされた脂質溶液は、最終的なエタノール濃度が約３５～４５％であり、最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭであるようにｄｓＲＮＡ水溶液（例えば酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中）と混合され得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、通常、混合時に自然に形成される。所望の粒度分布に応じて、得られるナノ粒子混合物が、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を用いて、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通して押し出され得る。場合によっては、押し出し工程は省略され得る。エタノール除去及び同時の緩衝液交換は、例えば、透析又は接線流ろ過によって達成され得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換され得る。

【化17】

【0462】

ＬＮＰ０１製剤が、例えば、参照により本明細書に援用される国際出願公開番号国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。

【0463】

更なる例示的な脂質－ｄｓＲＮＡ製剤が、表１に記載される。

【0464】

【表1】

【0465】

【表2】

【0466】

【表3】

【0467】

ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＰＥＧ－ジジミリストイル（ｄｉｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）グリセロール（Ｃ１４－ＰＥＧ、又はＰＥＧ－Ｃ１４）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ－ＤＳＧ：ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール（Ｃ１８－ＰＥＧ、又はＰＥＧ－Ｃ１８）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１，２－ジミリスチルオキシプロピルアミン（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＳＮＡＬＰ（ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤が、参照により本明細書に援用される、２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されている。

【0468】

ＸＴＣを含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１月２９日出願の米国特許仮出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日出願の米国特許仮出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願第 号明細書；２００９年７月２４日出願の米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号明細書２００９年９月３日出願米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号明細書、及び２０１０年１月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載されている。

【0469】

ＭＣ３を含む製剤が、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載されている。

【0470】

ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書に記載されている。

【0471】

Ｃ１２－２００を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年５月５日出願の米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号明細書及び２０１０年５月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載されている。

【0472】

イオン性／カチオン性脂質の合成
本発明の核酸－脂質粒子に使用される、例えば、カチオン性脂質などの化合物のいずれも、実施例により詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術によって調製され得る。全ての置換基は、特に示されない限り、以下に定義されるとおりである。

【0473】

「アルキル」は、１～２４個の炭素原子を含有する、直鎖状又は分枝鎖状、非環状又は環状の、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖状アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどを含む一方；飽和分枝鎖状アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチルなどを含む。代表的な飽和環状アルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む一方；不飽和環状アルキルは、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルなどを含む。

【0474】

「アルケニル」は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるアルキルを意味する。アルケニルは、シス及びトランス異性体の両方を含む。代表的な直鎖状及び分枝鎖状アルケニルは、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどを含む。

【0475】

「アルキニル」は、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合を更に含有する、上で定義される任意のアルキル又はアルケニルを意味する。代表的な直鎖状及び分枝鎖状アルキニルは、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニルなどを含む。

【0476】

「アシル」は、結合点における炭素が以下に規定されるオキソ基で置換される、任意のアルキル、アルケニル、又はアルキニルを意味する。例えば、－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、及び－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。

【0477】

「複素環」は、飽和、不飽和、又は芳香族のいずれかであり、且つ窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１又は２つのヘテロ原子（ここで、窒素及び硫黄ヘテロ原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されていてもよい）を含有する５員～７員の単環式、又は７員～１０員の二環式の複素環を意味し、この複素環には、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に縮合された二環式の環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して結合され得る。複素環は、以下に規定されるヘテロアリールを含む。複素環は、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどを含む。

【0478】

「任意選択で置換されるアルキル」、「任意選択で置換されるアルケニル」、「任意選択で置換されるアルキニル」、「任意選択で置換されるアシル」、及び「任意選択で置換される複素環」という用語は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が置換基で置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置換される。これに関して、置換基は、オキソ、ハロゲン、複素環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ及び－ＳＯｎＮＲｘＲｙを含み、式中、ｎが、０、１又は２であり、Ｒｘ及びＲｙが、同じか又は異なっており、独立して、水素、アルキル又は複素環であり、前記アルキル及び複素環置換基のそれぞれが、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、複素環、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ及び－ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ又は複数で更に置換され得る。

【0479】

「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。

【0480】

ある実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照）。簡潔には、本発明の文脈における保護基は、官能基の望ましくない反応性を低下させるか又はなくす任意の基である。保護基は、官能基に加えられて、特定の反応中のその反応性を遮蔽し、その後、除去されることで、元の官能基が現れ得る。ある実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低下させるか又はなくす任意の基である。保護基は、当該技術分野において周知の技術を用いて、加えられ、除去され得る。

【0481】

式Ａの合成
ある実施形態において、本発明の核酸－脂質粒子は、式Ａ：

【化18】

のカチオン性脂質を用いて製剤化され、式中、Ｒ１及びＲ２が、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、それぞれが任意選択で置換されていてもよく、Ｒ３及びＲ４が、独立して、低級アルキルであり、又はＲ３及びＲ４が、一緒になって、任意選択で置換される複素環を形成することができる。ある実施形態において、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。一般に、上の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１又は２によって作製され得、ここで、全ての置換基は、特に示されない限り、上で定義されるとおりである。

【0482】

【化19】

脂質Ａ（式中、Ｒ１及びＲ２が、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、それぞれが任意選択で置換されていてもよく、Ｒ３及びＲ４が、独立して、低級アルキルであり、又はＲ３及びＲ４が、一緒になって、任意選択で置換される複素環を形成することができる）は、スキーム１にしたがって調製され得る。ケトン１及び臭化物２は、購入されるか又は当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。１及び２の反応により、ケタール３が得られる。アミン４によるケタール３の処理により、式Ａの脂質が得られる。式Ａの脂質は、式５（式中、Ｘが、ハロゲン、水酸化物、ホスフェート、サルフェートなどから選択されるアニオン対イオンである）の有機塩を用いて、対応するアンモニウム塩に転化され得る。

【0483】

【化20】

あるいは、ケトン１の出発材料は、スキーム２にしたがって調製され得る。グリニャール試薬６及びシアン化物７は、購入されるか又は当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。６及び７の反応により、ケトン１が得られる。式Ａの対応する脂質へのケトン１の転化は、スキーム１に表される。

【0484】

ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は以下のとおりであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。溶液を、希塩酸で洗浄し、続いて、希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を回転蒸発器において除去した。残渣を、１～５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いてシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製された生成物を含有する画分を組み合わせて。溶媒を除去し、無色油（０．５４ｇ）を得た。ＡＬＮＹ－１００の合成

【0485】

ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を、スキーム３にしたがって行った：

【化21】

【0486】

５１５の合成
二口丸底フラスコ（１Ｌ）中で、２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ_４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で、００Ｃでゆっくりと加えた。完全に加えた後、反応混合物を室温まで温め、次に、４時間加熱還流させた。反応の進行をＴＬＣによって監視した。（ＴＬＣによる）反応の完了後、混合物を００Ｃに冷却し、飽和Ｎａ_２ＳＯ_４溶液の慎重な添加によってクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、ろ過して取り除いた。残渣をＴＨＦで十分に洗浄した。ろ液及び洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサン及び２６ｍＬの濃ＨＣｌで希釈し、室温で２０分間撹拌した。揮発性物質を、減圧下で取り除いて、白色の固体として５１５の塩酸塩を得た。収量：７．１２ｇ ^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ）、５．６８（ｓ，２Ｈ）、３．７４（ｍ，１Ｈ）、２．６６～２．６０（ｍ，２Ｈ）、２．５０～２．４５（ｍ，５Ｈ）。

【0487】

５１６の合成
２５０ｍＬの二口丸底フラスコ中で、１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ_３を加え（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくりと加えた後、反応混合物を、室温まで温めた。反応（ＴＬＣによって２～３時間）の完了後、混合物を、１ＮのＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（１×５０ｍＬ）で連続して洗浄した。次に、有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗材料を得て、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、粘着性の塊として５１６を得た。収量：１１ｇ（８９％）。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６～７．２７（ｍ，５Ｈ）、５．６９（ｓ，２Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、４．９６（ｂｒ．，１Ｈ）２．７４（ｓ，３Ｈ）、２．６０（ｍ，２Ｈ）、２．３０～２．２５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］－２３２．３（９６．９４％）。

【0488】

５１７Ａ及び５１７Ｂの合成
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、５００ｍＬの一口丸底フラスコ中で、２２０ｍＬのアセトン及び水（１０：１）の溶液に溶解させ、それに、Ｎ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）、続いて、４．２ｍＬの、ｔｅｒｔ－ブタノール中のＯｓＯ_４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）の７．６％溶液を室温で加えた。反応（約３時間）の完了の後、混合物を、固体Ｎａ_２ＳＯ_３の添加によってクエンチし、得られた混合物を、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、続いて、飽和ＮａＨＣＯ_３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）及び最後に塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製により、ジアステレオマーの混合物を得て、それを、分取ＨＰＬＣによって分離した。収量：－６ｇの粗５１７Ａ－ピーク－１（白色の固体）、５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９～７．３１（ｍ，５Ｈ）、５．０４（ｓ，２Ｈ）、４．７８～４．７３（ｍ，１Ｈ）、４．４８～４．４７（ｄ，２Ｈ）、３．９４～３．９３（ｍ，２Ｈ）、２．７１（ｓ，３Ｈ）、１．７２～１．６７（ｍ，４Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ－［Ｍ＋Ｈ］－２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］－２８３．５存在、ＨＰＬＣ－９７．８６％。Ｘ線により確認された立体化学。

【0489】

５１８の合成
化合物５０５の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色油として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５～７．３３（ｍ，４Ｈ）、７．３０～７．２７（ｍ，１Ｈ）、５．３７～５．２７（ｍ，８Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、４．５８～４．５７（ｍ，２Ｈ）、２．７８～２．７４（ｍ，７Ｈ）、２．０６～２．００（ｍ，８Ｈ）、１．９６～１．９１（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，４Ｈ）、１．４８（ｍ，２Ｈ）、１．３７～１．２５（ｂｒ ｍ，３６Ｈ）、０．８７（ｍ，６Ｈ）。ＨＰＬＣ－９８．６５％。

【0490】

化合物５１９の合成のための一般的な手順
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷した溶液に滴下して加えた。完全に加えた後、混合物を、０．５時間にわたって４０℃で加熱し、次に、氷浴上で再度冷却した。混合物を、飽和Ｎａ_２ＳＯ_４水溶液を用いて慎重に加水分解し、次に、セライトを通してろ過し、還元して油にした。カラムクロマトグラフィーにより、純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）が得られ、これは、無色油として得られた。^１３Ｃ ＮＭＲ δ＝１３０．２、１３０．１（×２）、１２７．９（×３）、１１２．３、７９．３、６４．４、４４．７、３８．３、３５．４、３１．５、２９．９（×２）、２９．７、２９．６（×２）、２９．５（×３）、２９．３（×２）、２７．２（×３）、２５．６、２４．５、２３．３、２２６、１４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ_４４Ｈ_８０ＮＯ_２についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６５４．６、実測値６５４．６。

【0491】

標準的な又は押し出しフリー（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ）方法のいずれかにより調製された製剤は、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、製剤は典型的には視認検査により特徴付けられる。製剤は凝集体又は沈殿物を含まない白みがかった半透明溶液である筈である。脂質－ナノ粒子の粒子サイズ及び粒子サイズ分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用した光散乱により測定することができる。粒子は、そのサイズが約２０～３００ｎｍ、例えば４０～１００ｎｍである必要がある。粒子サイズ分布は、単峰形である必要がある。製剤中の総ｄｓＲＮＡ濃度、及び捕捉された割合は、色素排除アッセイを用いて概算される。処方されたｄｓＲＮＡのサンプルは、製剤崩壊界面活性剤、例えば０．５％トリトン－Ｘ１００の存在又は不在下、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合染料と共にインキュベートされてもよい。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準的な曲線に対する界面活性剤を含むサンプルからの信号により決定され得る。捕捉された割合は、総ｄｓＲＮＡ含有量から「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性剤の不在下で信号により測定した）を減算することにより決定される。捕捉されたｄｓＲＮＡのパーセントは、典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、及び少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ～少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ～少なくとも約１００ｎｍ、又は少なくとも約８０ｎｍ～少なくとも約９０ｎｍである。

【0492】

経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤、又は水若しくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、所望され得る。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種又は複数種の透過促進剤界面活性剤及びキレート剤と共に投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸及び／若しくはエステル又はその塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはモノグリセリド、ジグリセリド、又はこれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、又はマイクロ若しくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達され得る。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ－誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミン及びＤＥＡＥ－デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤、及びそれらの製剤は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書及び米国特許第６，７４７，０１４号明細書に記載されている。

【0493】

非経口、実質内（脳内へ）、くも膜下腔内、脳室内又は肝内投与用の組成物及び製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、該無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤、並びに、非限定的に浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤などの他の好適な添加剤も含み得る。

【0494】

本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に予め形成された液剤、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成され得る。肝癌腫などの肝疾患を処置する際、肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。

【0495】

単位剤形にて都合よく存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉化固体担体又は両方と均一かつ親密に関連させた後、必要であれば、製品を成形することにより調製される。

【0496】

本発明の組成物は、非限定的に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬、及び浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水性縣濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液はまた、安定剤を含み得る。

【0497】

Ｃ．更なる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、１つの液体が、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、該構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。

【0498】

エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏ベース及びクリームの場合のように半固体又は固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。

【0499】

表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製の際の界面活性剤の分類及び選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、すなわち、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。

【0500】

エマルション製剤中に使用される、天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収ベースは、無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を取り入れてｗ／ｏエマルションを形成するが、尚それらの半固体稠度を維持する親水性特性を所有する。微粉化固体は、特に界面活性剤の組み合わせ中、及び粘稠な製剤中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤粘土、顔料、及び炭素などの非極性固体又はトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。

【0501】

非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。

【0502】

親水性コロイド又は親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グァーガム、カラヤガム、及びトラガカント）などの天然に存在するゴム及び合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散し又は水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。

【0503】

エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えられて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。

【0504】

皮膚、経口及び非経口経路を介したエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収及び生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。鉱油基剤の緩下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤が、ｏ／ｗ型エマルションとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。

【0505】

ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１８５－２１５）。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む３～５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプ又は水中油（ｏ／ｗ）タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｐａｃｋｉｎｇ）とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。

【0506】

状態図を用いる現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルションを製剤化する方法についての広範な知識を当業者に与えている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。

【0507】

マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で又は補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１－プロパノール、及び１－ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体とすることができる。油相は、非限定的にＣａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などの材料を含むことができる。

【0508】

マイクロエマルションは、薬物可溶化及び薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティの向上に提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性及び透過性の変更に起因する薬物吸収の可能な向上、調製の容易さ、固体剤形を超える経口投与の容易さ、臨床的効能の改善、及び毒性の低下の利点を提供する（例えば例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、マイクロエマルションの構成成分が周囲温度で一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチド又はｉＲＮＡを処方する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた美容及び医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤が胃腸管からのｉＲＮＡ及び核酸の全身吸収の増大、並びにｉＲＮＡ及び核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。

【0509】

本発明のマイクロエマルションはまた、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、及び透過促進剤などの追加の構成成分及び添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、かつ本発明のｉＲＮＡ及び核酸の吸収を向上させ得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類され得る－－界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は、上記に論じられている。

【0510】

ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組合せを含む他の方法によって生成されてもよい。

【0511】

ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。

【0512】

浸透促進剤は、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上記の種類のそれぞれが、以下により詳細に記載される。

【0513】

界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液に溶解されると、溶液の表面張力又は水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化学物質である。胆汁塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）；及びＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。

【0514】

浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ_１～２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ－ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照）。

【0515】

胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照）。様々な天然の胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシデート（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐｐ．７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照）。

【0516】

本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのキレート剤の使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するという更なる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。好適なキレート剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチレート及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９及びβ－ジケトンのＮ－アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照）。

【0517】

本明細書において使用される際、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてのわずかな活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照）。この種類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１－アルキル－及び１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。

【0518】

細胞レベルにおけるｉＲＮＡの取り込みを促進する剤も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に加えられ得る。例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）などのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジンなどのポリカチオン性分子（ＬｏｌｌｏらのＰＣＴ出願の国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、特に、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓ^ａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。

【0519】

エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２－ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む、他の剤を用いて、投与される核酸の浸透を促進することができる。

【0520】

ｖ．担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性（即ち、生物学的活性ｐｅｒｓｅを所有しない）であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）又は４－アセトアミド－４’イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３。

【0521】

ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。

【0522】

核酸と有害に反応しない、非－非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤も本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

【0523】

核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌及び非無菌水性溶液、非水性溶液、又は液体若しくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非－非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤を使用し得る。

【0524】

薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

【0525】

ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤などの更なる、適合可能な、医薬的に活性な材料を含有することができ、又は、染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料及び／又は芳香性物質などと混合される。

【0526】

水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。縣濁液は、安定剤も含み得る。

【0527】

ある実施形態において、本発明に取り上げられる医薬組成物は、（ａ）１つ又は複数のｉＲＮＡ化合物と、（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能し、溶血性疾患を処置するのに有用な１つ又は複数の剤とを含む。このような剤の例としては、限定はされないが、抗炎症剤、抗脂肪症剤、抗ウイルス剤、及び／又は抗線維症剤が挙げられる。更に、シリマリンなどの、肝臓を保護するのに一般的に使用される他の物質も、本明細書に記載されるｉＲＮＡとともに使用され得る。肝疾患を処置するのに有用な他の剤としては、テルビブジン、エンテカビル、及びテラプレビルなどのプロテアーゼ阻害剤ならびに、例えば、Ｔｕｎｇらの米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、同第２００４／０１６７１１６号明細書、及び同第２００３／０１４４２１７号明細書；及びＨａｌｅらの米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書に開示されている他の剤が挙げられる。

【0528】

このような化合物の毒性及び処置効果は、例えば、ＬＤ_５０（個体群の５０％の致死量）及びＥＤ_５０（個体群の５０％に治療に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と処置効果との間の用量比は、処置指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表され得る。高い処置指数を示す化合物が好ましい。

【0529】

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性を伴わずにＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に取り上げられる方法に使用される任意の化合物では、治療に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、又は、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

【0530】

上記に述べたそれらの投与に加えて、本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９発現により仲介される病理過程の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、観察された結果に基づいて、当技術分野にて既知の又は本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を使用して、ｉＲＮＡの量及び投与時間を調整することができる。

【0531】

ＶＩＩ．補体成分の発現を阻害するための方法
本発明は、本明細書に記載される補体成分の発現を阻害する方法を提供する。一態様において、本発明は、細胞中のＣＦＢの発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、細胞中のＣＦＢの発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させ、それによって、細胞中のＣＦＢの発現を阻害する工程を含む。

【0532】

本発明は、細胞中のＣ３の発現を阻害する方法も提供する。本方法は、細胞を、細胞中のＣ３の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させ、それによって、細胞中のＣ３の発現を阻害する工程を含む。

【0533】

更に、本発明は、細胞中のＣ９の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、細胞中のＣ９の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させ、それによって、細胞中のＣ９の発現を阻害する工程を含む。

【0534】

細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させる工程は、インビトロ又はインビボで行われ得る。細胞をＲＮＡｉ剤とインビボで接触させる工程は、対象、例えば、ヒト対象内の細胞又は細胞群を、ＲＮＡｉ剤と接触させる工程を含む。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。接触は、上述されるように、直接又は間接的に行われ得る。更に、細胞を接触させる工程は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の任意のリガンドを含む標的化リガンドによって行われ得る。好ましい実施形態において、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ_３リガンド、又はＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば、対象の肝臓に指向する任意の他のリガンドである。

【0535】

本明細書において使用される際の「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。

【0536】

「ＣＦＢの発現を阻害する」という語句は、任意のＣＦＢ遺伝子（例えば、マウスＣＦＢ遺伝子、ラットＣＦＢ遺伝子、サルＣＦＢ遺伝子、又はヒトＣＦＢ遺伝子など）並びにＣＦＢ遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。したがって、ＣＦＢ遺伝子は、野生型ＣＦＢ遺伝子、突然変異体ＣＦＢ遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、又は生物の文脈におけるトランスジェニックＣＦＢ遺伝子であり得る。

【0537】

「ＣＦＢ遺伝子の発現を阻害する」という語句は、ＣＦＢ遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＣＦＢ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＣＦＢ遺伝子の発現は、ＣＦＢ遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化、例えば、ＣＦＢ ｍＲＮＡレベル、ＣＦＢタンパク質レベル、又は例えば、全溶血性補体の尺度としてのＣＨ_５０活性、補体の代替経路の溶血活性を測定するためのＡＨ_５０、及び／又は血管内溶血の尺度としての乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベル、及び／又はヘモグロビンレベルに基づいて評価され得る。Ｃ３、Ｃ９、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、及び可溶性Ｃ５ｂ－９複合体のレベルも、ＣＦＢの発現を評価するために測定され得る。阻害は、対照のレベルと比較したこれらの変数の１つ又は複数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン（ｐｒｅ－ｄｏｓｅ ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル、又は非処理又は対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。

【0538】

「Ｃ３の発現を阻害する」という語句は、任意のＣ３遺伝子（例えば、マウスＣ３遺伝子、ラットＣ３遺伝子、サルＣ３遺伝子、又はヒトＣ３遺伝子など）並びにＣ３遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。したがって、Ｃ３遺伝子は、野生型Ｃ３遺伝子、突然変異体Ｃ３遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、又は生物の文脈におけるトランスジェニックＣ３遺伝子であり得る。

【0539】

「Ｃ３遺伝子の発現を阻害する」は、Ｃ３遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、Ｃ３遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。Ｃ３遺伝子の発現は、Ｃ３遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化、例えば、Ｃ３ ｍＲＮＡレベル、Ｃ３タンパク質レベル、又は例えば、全溶血性補体の尺度としてのＣＨ_５０活性、補体の代替経路の溶血活性を測定するためのＡＨ_５０、及び／又は血管内溶血の尺度としての乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベル、及び／又はヘモグロビンレベルに基づいて評価され得る。ＣＦＢ、Ｃ９、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、及び可溶性Ｃ５ｂ－９複合体のレベルも、Ｃ３の発現を評価するために測定され得る。阻害は、対照のレベルと比較したこれらの変数の１つ又は複数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースラインレベル、又は非処理又は対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。

【0540】

「Ｃ９の発現を阻害する」という語句は、任意のＣ９遺伝子（例えば、マウスＣ９遺伝子、ラットＣ９遺伝子、サルＣ９遺伝子、又はヒトＣ９遺伝子など）並びにＣ９遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。したがって、Ｃ９遺伝子は、野生型Ｃ９遺伝子、突然変異体Ｃ９遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、又は生物の文脈におけるトランスジェニックＣ９遺伝子であり得る。

【0541】

「Ｃ９遺伝子の発現を阻害する」は、Ｃ９遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、Ｃ９遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。Ｃ９遺伝子の発現は、Ｃ９遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化、例えば、Ｃ９ｍ ＲＮＡレベル、Ｃ９タンパク質レベル、又は例えば、全溶血性補体の尺度としてのＣＨ_５０活性、補体の代替経路の溶血活性を測定するためのＡＨ_５０、及び／又は血管内溶血の尺度としての乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベル、及び／又はヘモグロビンレベルに基づいて評価され得る。ＣＦＢ、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、及び可溶性Ｃ５ｂ－９複合体のレベルも、Ｃ９の発現を評価するために測定され得る。阻害は、対照のレベルと比較したこれらの変数の１つ又は複数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースラインレベル、又は非処理又は対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。

【0542】

本発明の方法のある実施形態において、標的遺伝子、例えばＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％．少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％だけ阻害される。

【0543】

標的遺伝子、例えばＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９遺伝子の発現の阻害は、標的遺伝子が転写され、標的遺伝子の発現が阻害されるように（例えば、１つ又は複数の細胞を、本発明のＲＮＡｉ剤と接触させることによって、又は本発明のＲＮＡｉ剤を、細胞が存在する又は存在していた対象に投与することによって）処理されている第１の細胞又は細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した際の低下に現れる。好ましい実施形態において、阻害は、以下の式を用いて、対照細胞中のｍＲＮＡのレベルにおけるパーセンテージとして、処理された細胞中のｍＲＮＡのレベルを表すことによって評価される。

【数1】

【0544】

あるいは、Ｃ５遺伝子の発現の阻害は、例えば、組織内又は血清内の、Ｃ５遺伝子の発現、へプシジン遺伝子若しくはタンパク質発現、又は鉄レベルなどの、Ｃ５タンパク質の発現に機能的に関連するパラメータの低下に関して評価され得る。Ｃ５遺伝子サイレンシングは、構造的に又はゲノム工学によって、及び当該技術分野において公知の任意のアッセイによって、Ｃ５を発現する任意の細胞中で測定され得る。肝臓は、Ｃ５発現の主要部位である。発現の他の実質的な部位は、腎臓及び子宮を含む。

【0545】

補体成分タンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞群によって発現されるタンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中で発現されるタンパク質のレベル）の低下に現れる。ｍＲＮＡの抑制の評価について上で説明されるように、処理された細胞又は細胞群中のタンパク質の発現レベルの阻害は、対照細胞又は細胞群中のタンパク質のレベルにおけるパーセンテージとして同様に表され得る。

【0546】

標的遺伝子の発現の阻害を評価するのに使用され得る対照細胞又は細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触されていない細胞又は細胞群を含む。例えば、対照細胞又は細胞群は、ＲＮＡｉ剤による対象の処理の前に、個々の対象（例えば、ヒト又は動物対象）から得られる。細胞又は細胞群によって発現されるＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡの発現を評価するために当該技術分野において公知の任意の方法を用いて測定され得る。一実施形態において、試料中のＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチド、又はその一部、例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって測定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸ遺伝子（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用を含む、ＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸のハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ－ｏｎ ａｓｓａｙ）、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ分析が挙げられる。

【0547】

一実施形態において、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現のレベルは、核酸プローブを用いて測定される。本明細書において使用される際の「プローブ」という用語は、特定のＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９に選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成可能であり、又は適切な生物学的調製から得られる。プローブは、標識されるように特に設計され得る。プローブとして用いられ得る分子の例としては、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられる。

【0548】

単離されたｍＲＮＡは、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアッセイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用され得る。ｍＲＮＡレベルを測定するための一方法は、単離されたｍＲＮＡを、例えば、特にＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９ ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させる工程を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、固体表面に固定され、例えば、アガロースゲル上に単離されたｍＲＮＡを流し、ゲルからニトロセルロースなどの膜へとｍＲＮＡを転写することによって、プローブと接触される。代替的な実施形態において、プローブは、固体表面に固定され、ｍＲＮＡは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイ中で、プローブと接触される。当業者は、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９ ｍＲＮＡのレベルを測定するのに使用するための公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。

【0549】

試料中のＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現のレベルを測定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－βレプリカーゼ（Ｑ－Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉらの米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は任意の他の核酸増幅方法による、例えば、試料中のｍＲＮＡの（ｃＤＮＡを調製するための）核酸増幅及び／又は逆転写酵素のプロセス、続いて、当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。本発明の特定の態様において、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現のレベルは、定量的な蛍光性ＲＴ－ＰＣＲ（即ち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）によって測定される。

【0550】

ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されるものなど）、又はマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズ又は繊維（又は結合された核酸を含む任意の固体担体）を用いて監視され得る。参照により本明細書に援用される、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書及び同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＰＣＳＫ９発現レベルの測定は、溶液中での核酸プローブの使用も含み得る。

【0551】

好ましい実施形態において、ｍＲＮＡの発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書に提供される実施例に記載され、例示される。

【0552】

ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９タンパク質の発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて測定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体又はゲル内沈降素反応、吸光分光法、比色分析法、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、（単純又は二重）免疫拡散法、免疫電気泳動、ウエスタンブロット法、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。

【0553】

本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、ならびに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、眼液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、あるいはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は、例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。好ましい実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる血液又は血漿を指す。更なる実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる肝臓組織を指す。

【0554】

本発明の方法のある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤が対象内の特定の部位に送達されるように、対象に投与される。ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現の阻害は、対象内の特定の部位からの体液又は組織に由来する試料中のＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９ ｍＲＮＡ、及び／又はＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９タンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を用いて評価され得る。好ましい実施形態において、部位は肝臓である。部位はまた、上記の部位のいずれか１つからの細胞の小区分（ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ）又は部分群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）であり得る。部位は、特定のタイプの受容体を発現する細胞も含み得る。

【0555】

ＶＩＩＩ．補体成分に関連する疾病を処置又は予防するための方法
本発明は、本明細書に記載される補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ又はａＨＵＳに罹患している対象に、本発明のｉＲＮＡ剤、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物、又はｉＲＮＡを含むベクターを投与する工程を含む処置及び予防方法を提供する。

【0556】

本発明の方法のいずれも、本発明の単一のｉＲＮＡ剤又は本発明のｉＲＮＡ剤の組合せを用いて実施され得ることが理解されるべきである。例えば、ある態様において、本発明の方法（及び使用）は、ＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤及びＣ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を使用することを含む。ある態様において、本発明の方法（及び使用）は、ＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤及びＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を使用することを含む。ある態様において、本発明の方法（及び使用）は、Ｃ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤及びＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を使用することを含む。他の態様において、本発明の方法（及び使用）は、ＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、Ｃ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、及びＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を使用することを含む。本発明のある態様において、本発明の単一のｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤の組合せのいずれかを含む方法は、（更に後述されるように）例えば、Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）などの１つ又は複数の更なる治療剤を対象に投与する工程を更に含む。

【0557】

一態様において、本発明は、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、「補体成分に関連する疾病」、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象を処置する方法を提供する。本発明の処置方法（及び使用）は、治療有効量の、ＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤又はＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を、対象、例えば、ヒトに投与し、それによって、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する工程を含む。

【0558】

別の態様において、本発明は、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、「補体成分に関連する疾病」、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象を処置する方法を提供する。本発明の処置方法（及び使用）は、治療有効量の、Ｃ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤又はＣ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を、対象、例えば、ヒトに投与し、それによって、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する工程を含む。

【0559】

更なる態様において、本発明は、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、「補体成分に関連する疾病」、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象を処置する方法を提供する。本発明の処置方法（及び使用）は、治療有効量の、Ｃ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤又はＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を、対象、例えば、ヒトに投与し、それによって、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する工程を含む。

【0560】

一態様において、本発明は、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はベクターを対象に投与し、それによって、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。例えば、本発明は、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象における溶血を予防するための方法を提供する。

【0561】

一態様において、本発明は、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はベクターを対象に投与し、それによって、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。例えば、本発明は、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象における溶血を予防するための方法を提供する。

【0562】

一態様において、本発明は、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はベクターを対象に投与し、それによって、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。例えば、本発明は、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象における溶血を予防するための方法を提供する。

【0563】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0564】

更なる態様において、本発明は、対象、例えば、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0565】

更に別の態様において、本発明は、対象、例えば、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0566】

更に別の態様において、本発明は、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象などの、対象、例えば、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための薬剤の製造における、ＣＦＢ遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ又はＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。

【0567】

更なる態様において、本発明は、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象などの、対象、例えば、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための薬剤の製造における、Ｃ３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ又はＣ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。

【0568】

更に他の態様において、本発明は、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象などの、対象、例えば、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための薬剤の製造における、Ｃ９遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ又はＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。

【0569】

別の態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、本発明のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの使用を提供する。

【0570】

別の態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、本発明のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの使用を提供する。

【0571】

別の態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、本発明のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの使用を提供する。

【0572】

更なる態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための薬剤の製造における、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0573】

更なる態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための薬剤の製造における、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0574】

更なる態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための薬剤の製造における、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0575】

本発明のある態様において、本発明の単一のｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤の組合せのいずれかを含む方法は、１つ又は複数の更なる治療剤を対象に投与する工程を更に含む。

【0576】

ある態様において、更なる治療剤は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８２，５３１号明細書、２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８３７，３９９１号明細書、及び２０１３年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９０４，５７９号明細書に記載されているものなどの、Ｃ５遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤であり、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0577】

他の態様において、更なる治療剤は、抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）である。エクリズマブは、高い親和性で補体成分Ｃ５と特異的に結合し、Ｃ５～Ｃ５ａ及びＣ５ｂの切断を阻害し、それによって、終末補体複合体Ｃ５ｂ－９の生成を阻害するヒト化モノクローナルＩｇＧ２／４、κ軽鎖抗体である。エクリズマブは、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第６，３５５，２４５号明細書に記載されている。

【0578】

更に他の態様において、更なる治療剤は、Ｃ３ペプチド阻害剤、又はその類似体である。一実施形態において、Ｃ３ペプチド阻害剤は、コンプスタチンである。コンプスタチンは、強力で且つ選択的なＣ３阻害活性を有する環状トリデカペプチドである。コンプスタチン、及びその類似体は、米国特許第７，８８８，３２３号明細書、同第７，９８９，５８９号明細書、及び同第８，４４２，７７６号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１７８６９４号明細書及び同第２０１３／００５３３０２号明細書、並びにＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１７４０５５号パンフレット、国際公開第２０１２／２１７８０８３号パンフレット、国際公開第２０１３／０３６７７８号パンフレットに記載されており、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

【0579】

したがって、一態様において、本発明は、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、治療有効量の、ＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤又はＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤を、対象、例えば、ヒトに投与し、それによって、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する工程を含む方法を提供する。

【0580】

別の態様において、本発明は、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、治療有効量の、Ｃ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤又はＣ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤を、対象、例えば、ヒトに投与し、それによって、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する工程を含む方法を提供する。

【0581】

別の態様において、本発明は、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象を処置する方法であって、治療有効量の、Ｃ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤又はＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤を、対象、例えば、ヒトに投与し、それによって、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する工程を含む方法を提供する。

【0582】

別の態様において、本発明は、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はベクター、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤を対象に投与し、それによって、ＣＦＢの発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。

【0583】

別の態様において、本発明は、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はベクター、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤を対象に投与し、それによって、Ｃ３の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。

【0584】

別の態様において、本発明は、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチに罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はベクター、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤を対象に投与し、それによって、Ｃ９の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。

【0585】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤の使用を提供する。

【0586】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤の使用を提供する。

【0587】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ剤及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤の使用を提供する。

【0588】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチを処置するための、抗補体成分ＣＦＢ抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤と併用するための薬剤の製造における、ＣＦＢ遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ又はＣＦＢ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。

【0589】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチを処置するための、抗補体成分Ｃ３抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤と併用するための薬剤の製造における、Ｃ３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ又はＣ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。

【0590】

別の態様において、本発明は、対象、例えば、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチを処置するための、抗補体成分Ｃ９抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤と併用するための薬剤の製造における、Ｃ９遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ又はＣ９遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。

【0591】

更に別の態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤の使用を提供する。

【0592】

更に別の態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤の使用を提供する。

【0593】

更に別の態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、及び抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤の使用を提供する。

【0594】

更なる態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、ＣＦＢの発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤と併用するための薬剤の製造における、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0595】

更なる態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤と併用するための薬剤の製造における、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0596】

更なる態様において、本発明は、補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチなどの、Ｃ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、抗補体成分Ｃ５抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、エクリズマブ）、補体成分Ｃ５を標的とするｉＲＮＡ剤、及び／又はＣ３ペプチド阻害剤（例えば、コンプスタチン）などの更なる治療剤と併用するための薬剤の製造における、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。

【0597】

一実施形態において、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９を標的とするｉＲＮＡ剤は、例えば、対象の細胞、組織、血液、尿又は他の組織若しくは体液中のＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９レベルが、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％又はそれ以上だけ低下されるように、本明細書に記載される補体成分に関連する疾病に罹患している対象に投与され、その後、更なる治療剤が、対象に投与される。

【0598】

更なる治療剤は、抗補体成分Ｃ５抗体、又は抗原結合フラグメント又はその誘導体であり得る。一実施形態において、抗補体成分Ｃ５抗体は、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））、又は抗原結合フラグメント又はその誘導体である。

【0599】

対象への本発明のｉＲＮＡ剤及びエクリズマブの投与を含む本発明の方法は、対象への髄膜炎菌ワクチンの投与を更に含み得る。

【0600】

更なる治療剤、例えば、エクリズマブ及び／又は髄膜炎菌ワクチンは、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９（及び／又はＣ５）を標的とするｉＲＮＡ剤と同時に又は異なる時点で対象に投与され得る。

【0601】

更に、更なる治療剤、例えば、エクリズマブは、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９（及び／又はＣ５）を標的とするｉＲＮＡ剤と同じ製剤中で、又はＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９（及び／又はＣ５）を標的とするｉＲＮＡ剤と異なる製剤中で対象に投与され得る。

【0602】

エクリズマブ投薬計画は、例えば、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））の添付文書及び米国特許出願公開第２０１２／０２２５０５６号明細書に記載されており、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。補体成分に関連する疾病、例えば、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、又は関節リウマチを処置するための本発明の例示的な方法において、例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、又はＣ９を標的とするｉＲＮＡ剤は、まず、対象におけるＣ５レベルが、（例えば、少なくとも約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％又はそれ以上だけ）低下されるように、対象に（例えば、皮下）投与され、その後、エクリズマブは、ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標）の添付文書に記載されている用量より低い用量で投与される。例えば、エクリズマブは、４週間にわたって約６００ｍｇ未満の用量で週に１回、その後、５回目の投与は約１週間後に約９００ｍｇ未満、その後、約２週間ごとに約９００ｍｇ未満の用量で、対象に投与され得る。エクリズマブはまた、４週間にわたって約９００ｍｇ未満の用量で週に１回、その後、５回目の投与は約１週間後に約１２００ｍｇ未満、その後、約２週間ごとに約１２００ｍｇ未満の用量で、対象に投与され得る。対象が、１８歳未満である場合、エクリズマブは、４週間にわたって約９００ｍｇ未満の用量で週に１回、その後、５回目の投与は約１週間後に約１２００ｍｇ未満、その後、約２週間ごとに約１２００ｍｇ未満の用量で、対象に投与されてもよく；又は対象が、１８歳未満である場合、エクリズマブは、２週間にわたって約６００ｍｇ未満の用量で週に１回、その後、３回目の投与は約１週間後に約９００ｍｇ未満、その後、約２週間ごとに約９００ｍｇ未満の用量で、対象に投与されてもよく；又は対象が、１８歳未満である場合、エクリズマブは、２週間にわたって約６００ｍｇ未満の用量で週に１回、その後、３回目の投与は約１週間後に約６００ｍｇ未満、その後、約２週間ごとに約６００ｍｇ未満の用量で、対象に投与されてもよく；又は対象が、１８歳未満である場合、エクリズマブは、１週間にわたって約６００ｍｇ未満の用量で週に１回、その後、２回目の投与は約１週間後に約３００ｍｇ未満、その後、約２週間ごとに約３００ｍｇ未満の用量で、対象に投与されてもよく；又は対象が、１８歳未満である場合、エクリズマブは、１週間にわたって約３００ｍｇ未満の用量で週に１回、その後、２回目の投与は約１週間後に約３００ｍｇ未満、その後、約２週間ごとに約３００ｍｇ未満の用量で、対象に投与され得る。対象が、プラスマフェレーシス即ち血漿交換を受けている場合、エクリズマブは、約３００ｍｇ未満（例えば、エクリズマブの直近の投与が、約３００ｍｇであった場合）又は約６００ｍｇ未満（例えば、エクリズマブの直近の投与が、約６００ｍｇ以上であった場合）の用量で、対象に投与され得る。対象が、血漿注入を受けている場合、エクリズマブは、約３００ｍｇ未満（例えば、エクリズマブの直近の投与が、約３００ｍｇ以上であった場合）の用量で対象に投与され得る。低用量のエクリズマブは、エクリズマブの皮下又は静脈内投与を可能にする。

【0603】

エクリズマブを含む本発明の併用療法において、エクリズマブは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇの用量で、対象に、例えば皮下投与され得る。例えば、エクリズマブは、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１３．５ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１４．５ｍｇ／ｋｇ、又は１５ｍｇ／ｋｇの用量で、対象に、例えば皮下投与され得る。

【0604】

本発明の方法及び使用は、標的ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９（及び／又はＣ５）遺伝子の発現が、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間などにわたって低下されるように、本明細書に記載される組成物を投与することを含む。一実施形態において、標的遺伝子の発現は、例えば、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間又はそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は約４週間又はそれ以上の長期間にわたって低下される。

【0605】

本発明の方法及び使用に係るｄｓＲＮＡの投与は、補体成分に関連する疾病の患者における、このような疾病又は障害の重症度、兆候、症状、及び／又はマーカーを低下させ得る。この文脈における「低下」とは、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％であり得る。

【0606】

疾病の処置又は予防の有効性は、例えば、疾病の進行、疾病の寛解、症状の重症度、痛みの減少、クオリティ・オブ・ライフ、処置効果を持続させるのに必要な薬剤の用量、疾病マーカーのレベル、又は処置されている若しくは予防にターゲティングされる所定の疾病に適切な、測定可能な任意の他のパラメータを測定することによって評価され得る。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組合せを測定することによって処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。例えば、溶血性疾患の処置の有効性は、例えば、ＬＤＨ及びＣＨ_５０レベルの定期的な監視によって評価され得る。初期の読み取り値と後の読み取り値との比較は、処置が有効かどうかの指標を医師に与える。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組合せを測定することによって処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９を標的とするｉＲＮＡ又はその医薬組成物の投与と関連して、補体成分に関連する疾病「に対して有効」は、臨床的に適切な方法での投与が、症状の改善、治癒、疾病の軽減、寿命の延長、クオリティ・オブ・ライフの改善、又は補体成分に関連する疾病及び関連する原因の処置に精通した医師によって好ましいと一般に認識される他の効果などの、少なくとも統計的に有意な割合の患者に対する有益な効果をもたらすことを示す。

【0607】

処置又は予防の効果は、疾病状態の１つ又は複数のパラメータの統計的に有意な改善がある場合、又は悪化若しくは本来予想されていた症状が発生しないことにより明らかである。一例として、疾病の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上の好ましい変化は、有効な処置を示し得る。所定のｉＲＮＡ薬剤又はその薬剤の製剤の有効性も、当該技術分野において公知であるように、所定の疾病に関して実験動物モデルを用いて判断することができる。実験動物モデルを用いる場合、処置の有効性は、マーカー又は症状の統計的に有意な低下が観察された場合に証明される。

【0608】

あるいは、有効性は、一例を挙げれば関節リウマチ重症度分類（ＲＡＳＳ）などの、臨床的に許容される疾病の重症度の評価尺度に基づいて診断の当業者により決定された疾病の重症度の低減により測定することができる。適切な尺度を使用して測定された、例えば疾病の重症度の減少をもたらす任意の正の変化は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ又はｉＲＮＡ製剤を用いた十分な処置を表す。

【0609】

対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、又は約５０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0610】

特定の実施形態において、例えば、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及び脂質を含む場合、対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約９．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇなどの、治療量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0611】

例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0612】

他の実施形態において、例えば、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及びＮ－アセチルガラクトサミンを含む場合、対象には、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量などの、治療量のｉＲＮＡが投与され得る。一実施形態において、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及びＮ－アセチルガラクトサミンを含む場合、対象には、治療量の約１０～約３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0613】

例えば、対象には、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの、治療量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。

【0614】

本発明の特定の実施形態において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、修飾（例えば、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフ）（剤の切断部位又はその近傍における１つのこのようなモチーフを含む）、６つのホスホロチオエート結合、及びリガンドを含む場合、このような剤は、約０．０１～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２～約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２～約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３～約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３～約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４～約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４～約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ～約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ～約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ～約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ～約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．０８ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。上記の記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ～約０．４５ｍｇ／ｍｇの用量で、対象に投与され得る。

【0615】

例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば、医薬組成物中のＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。上記の記載される値の中間の値も、本発明の一部であることが意図される。

【0616】

ｉＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は約２５分間などの所定の期間にわたって、静脈内注入によって投与され得る。投与は、例えば、毎週、隔週（即ち、２週間ごと）で１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間又はそれ以上などにわたって、定期的に繰り返され得る。最初の処置計画の後、治療剤は、より少ない頻度で投与され得る。例えば、毎週又は隔週で３ヶ月間の投与後、投与は、月に１回で６ヶ月間又は１年間又はそれ以上にわたって繰り返され得る。

【0617】

ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又他の区画におけるＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９（及び／又はＣ５）レベルを、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％又はそれ以上だけ低下させ得る。

【0618】

ｉＲＮＡの完全用量を投与する前に、５％の注入などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの有害作用を監視してもよい。別の例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α又はＩＮＦ－α）レベルの増大などの好ましくない免疫賦活作用に関して患者を観察してもよい。

【0619】

ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現の阻害効果により、本発明に係る組成物又はそれから調製される医薬組成物は、クオリティ・オブ・ライフを向上させ得る。

【0620】

本発明のｉＲＮＡは、「裸の（ｎａｋｅｄ）」形態で、又は「遊離ｉＲＮＡ」として投与され得る。裸のｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下で投与される。裸のｉＲＮＡは、好適な緩衝液中にあり得る。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、又はリン酸塩、又はそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨ及び浸透圧は、対象に投与するのに好適なように調整され得る。

【0621】

あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。

【0622】

ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象は、本明細書に記載される補体成分に関連する疾病又は障害に罹患している対象である。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、喘息に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、関節リウマチに罹患している。更に別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、全身性エリテマトーデスに罹患している。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、糸球体腎炎に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、乾癬に罹患している。更に別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、皮膚筋炎、水疱性類天疱瘡に罹患している。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、非典型溶血性尿毒症症候群に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、志賀毒素産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関連する溶血性尿毒症症候群に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、重症筋無力症に罹患している。更に別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、視神経脊髄炎に罹患している。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、デンスデポジット糸球体腎炎に罹患している。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、Ｃ３神経障害に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、加齢黄斑変性症に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、寒冷凝集素症に罹患している。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、抗好中球細胞質抗体関連血管炎に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、液性及び血管性移植拒絶反応を有する。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、移植片機能不全を有する。一実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、心筋梗塞に罹患している。別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、移植の感作レシピエントである。更に別の実施形態において、補体成分に関連する疾病に罹患している対象は、敗血症に罹患している。

【0623】

ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象の処置は、治療及び予防（例えば、対象は、感作（又は同種異系）移植手術を受ける予定である処置を含む。

【0624】

本発明は、本発明の標的遺伝子、例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、及びＣ９の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、補体成分Ｃ５に関連する疾病に罹患している対象を処置するための、他の医薬品及び／又は他の治療方法、例えば、これらの障害を処置するのに現在用いられているものなどの公知の医薬品及び／又は公知の治療方法と組み合わされた、ｉＲＮＡ剤又はその医薬組成物の方法及び使用（ｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤及び追加の治療剤、例えば、抗補体成分Ｃ５抗体を含む、又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の方法及び使用を含む）を更に提供する。例えば、特定の実施形態において、ＣＦＢを標的とするｉＲＮＡは、例えば、本明細書のどこかに記載される補体成分に関連する疾病を処置するのに有用な薬剤と組み合わされて投与される。

【0625】

例えば、ＣＦＢ、Ｃ３、及び／又はＣ９の発現の低下から利益を得られ得る対象、例えば、補体成分に関連する疾病に罹患している対象を処置するのに好適な更なる治療剤及び治療方法としては、プラスマフェレーシス、血栓溶解療法（例えば、ストレプトキナーゼ）、抗血小板薬、葉酸、コルチコステロイド；免疫抑制剤；エストロゲン、メトトレキサート、６－ＭＰ、アザチオプリン、スルファサラジン、メサラジン、オルサラジン、クロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、金チオリンゴ酸塩（筋肉内及び経口）、アザチオプリン、コルヒチン、コルチコステロイド（経口、吸入及び局所注射）、β－２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリク酸塩、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウム及びオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬、ＴＮＦ－α又はＩＬ－１などの炎症誘発性サイトカインによるシグナル伝達に干渉する薬剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ－１β転化酵素阻害剤、ＴＮＦα転化酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロティナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６－メルカプトプリン、アンジオテンシン転化酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５又はｐ７５ ＴＮＦ受容体及び誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標）及びｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））、ｓＩＬ－１ＲＩ、ｓＩＬ－１ＲＩＩ、及びｓＩＬ－６Ｒ）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３及びＴＧＦβ）、セレコキシブ、葉酸、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシモノクローナル抗体（ｉｎｆｌｉｘｉｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ナプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、メロキシカム、酢酸メチルプレドニゾロン、金チオリンゴ酸ナトリウム、アスピリン、トリアムシノロンアセトニド、プロポキシフェンナプシレート／ａｐａｐ、葉酸塩、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、オキシコドン塩酸塩、重酒石酸ヒドロコドン／ａｐａｐ、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組換え体、トラマドール塩酸塩、サルサラート、スリンダク、シアノコバラミン／葉酸／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロン酸ナトリウム、プレドニゾロン、モルヒネ硫酸塩、リドカイン塩酸塩、インドメタシン、グルコサミン硫酸塩（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｕｌｆ）／コンドロイチン、アミトリプチリン塩酸塩、スルファジアジン、オキシコドン塩酸塩／アセトアミノフェン、オロパタジン塩酸塩、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、シクロホスファミド、リツキシモノクローナル抗体（ｒｉｔｕｘｉｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＩＬ－１ ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４－ＩＧ、ＩＬ－１８ ＢＰ、抗ＩＬ－１８、抗ＩＬ１５、ＢＩＲＢ－７９６、ＳＣＩＯ－４６９、ＶＸ－７０２、ＡＭＧ－５４８、ＶＸ－７４０、ロフルミラスト、ＩＣ－４８５、ＣＤＣ－８０１、メソプラム、シクロスポリン、サイトカイン抑制抗炎症性薬剤（ＣＳＡＩＤ）；ＣＤＰ－５７１／ＢＡＹ－１０－３３５６（ヒト化抗ＴＮＦα抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；ｃＡ２／インフリキシモノクローナル抗体（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；７５ ｋｄＴＮＦＲ－ＩｇＧ／エタネルセプト（７５ ｋＤ ＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ；例えば、（１９９４）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３７：Ｓ２９５；（１９９６）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．４４：２３５Ａを参照）；５５ ｋｄＴＮＦ－ＩｇＧ（５５ ｋＤ ＴＮＦ受容体－ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｍａｎｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）；ＩＤＥＣ－ＣＥ９．１／ＳＢ ２１０３９６（非消失性（ｎｏｎ－ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）霊長類化抗ＣＤ４抗体；ＩＤＥＣ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；例えば、（１９９５）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３８：Ｓ１８５を参照）；ＤＡＢ ４８６－ＩＬ－２及び／又はＤＡＢ ３８９－ＩＬ－２（ＩＬ－２融合タンパク質；Ｓｅｒａｇｅｎ；例えば、（１９９３）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．３６：１２２３を参照）；抗Ｔａｃ（ヒト化抗ＩＬ－２Ｒα；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ／Ｒｏｃｈｅ）；ＩＬ－４（抗炎症性サイトカイン；ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ－１０（ＳＣＨ ５２０００；組み換えＩＬ－１０、抗炎症性サイトカイン；ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ－４；ＩＬ－１０及び／又はＩＬ－４アゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）；ＩＬ－１ＲＡ（ＩＬ－１受容体アンタゴニスト；Ｓｙｎｅｒｇｅｎ／Ａｍｇｅｎ）；アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）／Ａｍｇｅｎ）；ＴＮＦ－ｂｐ／ｓ－ＴＮＦ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質；例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺））：Ｓ２８４；（１９９５）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．－Ｈｅａｒｔ及びＣｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：３７－４２を参照）；Ｒ９７３４０１（ＩＶ型ホスホジエステラーゼ阻害剤；例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８２を参照）；ＭＫ－９６６（ＣＯＸ－２阻害剤；例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ８１を参照）；イロプロスト（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ８２を参照）；メトトレキサート；サリドマイド（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８２を参照）及びサリドマイド関連薬剤（例えば、Ｃｅｌｇｅｎ）；レフルノミド（抗炎症及びサイトカイン阻害剤；例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ１３１；（１９９６）Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４５：１０３－１０７を参照）；トラネキサム酸（プラスミノーゲン活性化の阻害剤；例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８４を参照）；Ｔ－６１４（サイトカイン阻害剤；例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８２を参照）；プロスタグランジンＥ１（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８２を参照）；テニダップ（非ステロイド性抗炎症薬；例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８０を参照）；ナプロキセン（非ステロイド性抗炎症薬；例えば、（１９９６）Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｐｏｒｔ ７：１２０９－１２１３を参照）；メロキシカム（非ステロイド性抗炎症薬）；イブプロフェン（非ステロイド性抗炎症薬）；ピロキシカム（非ステロイド性抗炎症薬）；ジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症薬）；インドメタシン（非ステロイド性抗炎症薬）；スルファサラジン（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８１を参照）；アザチオプリン（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２８１を参照）；ＩＣＥ阻害剤（酵素インターロイキン－１β転化酵素の阻害剤）；ｚａｐ－７０及び／又はｌｃｋ阻害剤（チロシンキナーゼｚａｐ－７０又はｌｃｋの阻害剤）；ＶＥＧＦ阻害剤及び／又はＶＥＧＦ－Ｒ阻害剤（血管内皮細胞増殖因子又は血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤；血管新生の阻害剤）；コルチコステロイド抗炎症剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）；ＴＮＦ－転換酵素阻害剤；抗ＩＬ－１２抗体；抗ＩＬ－１８抗体；インターロイキン－１１（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ２９６を参照）；インターロイキン－１３（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ３０８を参照）；インターロイキン－１７阻害剤（例えば、（１９９６）Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３９（９（補遺）：Ｓ１２０を参照）；金；ペニシラミン；クロロキン；クロラムブシル；ヒドロキシクロロキン；シクロスポリン；シクロホスファミド；全身リンパ節照射法；抗胸腺細胞グロブリン；抗ＣＤ４抗体；ＣＤ５－トキシン；経口投与されるペプチド及びコラーゲン；ロベンザリット二ナトリウム；サイトカイン調節剤（ＣＲＡ）ＨＰ２２８及びＨＰ４６６（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＣＡＭ－１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０；Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；プレドニゾン；オルゴテイン；硫酸化グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）；ミノサイクリン；抗ＩＬ２Ｒ抗体；海産及び植物脂質（魚及び植物種子脂肪酸；例えば、ＤｅＬｕｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２１：７５９－７７７を参照）；オーラノフィン；フェニルブタゾン；メクロフェナム酸；フルフェナム酸；静脈内免疫グロブリン；ジレウトン；アザリビン；ミコフェノール酸（ＲＳ－６１４４３）；タクロリムス（ＦＫ－５０６）；シロリムス（ラパマイシン）；アミプリロース（セラフェクチン）；クラドリビン（２－クロロデオキシアデノシン）；メトトレキサート；ｂｃｌ－２阻害剤（Ｂｒｕｎｃｋｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５０（４）：６４１－６６２を参照）；抗ウイルス薬及び免疫調節剤、ＫＤＲの小分子阻害剤、Ｔｉｅ－２の小分子阻害剤；メトトレキサート；プレドニゾン；セレコキシブ；葉酸；ヒドロキシクロロキン硫酸塩；ロフェコキシブ；エタネルセプト；インフリキシモノクローナル抗体；レフルノミド；ナプロキセン；バルデコキシブ；スルファサラジン；メチルプレドニゾロン；イブプロフェン；メロキシカム；酢酸メチルプレドニゾロン；金チオリンゴ酸ナトリウム；アスピリン；アザチオプリン；トリアムシノロンアセトニド；プロポキシフェンナプシレート／ａｐａｐ；葉酸塩；ナブメトン；ジクロフェナク；ピロキシカム；エトドラク；ジクロフェナクナトリウム；オキサプロジン；オキシコドンｈｃｌ；重酒石酸ヒドロコドン／ａｐａｐ；ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール；フェンタニル；アナキンラ、ヒト組換え体；トラマドールｈｃｌ；サルサラート；スリンダク；シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン；アセトアミノフェン；アレンドロン酸ナトリウム；プレドニゾロン；モルヒネ硫酸塩；リドカイン塩酸塩；インドメタシン；グルコサミン硫酸塩／コンドロイチン；シクロスポリン；アミトリプチリン塩酸塩；スルファジアジン；オキシコドンｈｃｌ／アセトアミノフェン；オロパタジンｈｃｌ；ミソプロストール；ナプロキセンナトリウム；オメプラゾール；ミコフェノール酸モフェチル；シクロホスファミド；リツキシモノクローナル抗体；ＩＬ－１ ＴＲＡＰ；ＭＲＡ；ＣＴＬＡ４－ＩＧ；ＩＬ－１８ ＢＰ；ＩＬ－１２／２３；抗ＩＬ １８；抗ＩＬ １５；ＢＩＲＢ－７９６；ＳＣＩＯ－４６９；ＶＸ－７０２；ＡＭＧ－５４８；ＶＸ－７４０；ロフルミラスト；ＩＣ－４８５；ＣＤＣ－８０１；メソプラム、アルブテロール、サルメテロール／フルチカゾン、モンテルカストナトリウム、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド、プレドニゾン、サルメテロールキシナホ酸塩、レバブテロールｈｃｌ、アルブテロール硫酸塩／イプラトロピウム、リン酸プレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、イプラトロピウム臭化物、アジスロマイシン、酢酸ピルブ
テロール、プレドニゾロン、無水テオフィリン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、クラリスロマイシン、ザフィルルカスト、フマル酸ホルモテロール、インフルエンザウイルスワクチン、メチルプレドニゾロン、アモキシシリン三水和物、フルニソリド、アレルギー注射、クロモリンナトリウム、塩酸フェキソフェナジン、フルニソリド／メントール、アモキシシリン／クラブラン酸塩、レボフロキサシン、吸入支援装置、グアイフェネシン、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、モキシフロキサシンｈｃｌ、ドキシサイクリンヒクレート、グアイフェネシン／ｄ－メトルファン、ｐ－エフェドリン／ｃｏｄ／クロルフェニル（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｒ）、ガチフロキサシン、塩酸セチリジン、フランカルボン酸モメタゾン、サルメテロールキシナホ酸塩、ベンゾナテート、セファレキシン、ｐｅ／ヒドロコドン／クロルフェニル（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｒ）、セチリジンｈｃｌ／プソイドエフェド（ｐｓｅｕｄｏｅｐｈｅｄ）、フェニレフリン／ｃｏｄ／プロメタジン、コデイン／プロメタジン、セフプロジル、デキサメタゾン、グアイフェネシン／プソイドエフェドリン、クロルフェニラミン／ヒドロコドン、ネドクロミルナトリウム、テルブタリン硫酸塩、エピネフリン、メチルプレドニゾロン、硫酸メタプロテレノール、アスピリン、ニトログリセリン、酒石酸メトプロロール、エノキサパリンナトリウム、ヘパリンナトリウム、クロピドグレル二硫酸塩、カルベジロール、アテノロール、モルヒネ硫酸塩、コハク酸メトプロロール、ワルファリンナトリウム、リシノプリル、一硝酸イソソルビド、ジゴキシン、フロセミド、シンバスタチン、ラミプリル、テネクテプラーゼ、エナラプリルマレイン酸塩、トルセミド、レタバーゼ（ｒｅｔａｖａｓｅ）、ロサルタンカリウム、キナプリルｈｃｌ／ｍａｇ ｃａｒｂ、ブメタニド、アルテプラーゼ、エナラプリラト、アミオダロン塩酸塩、チロフィバンｈｃｌ ｍ－水和物、ジルチアゼム塩酸塩、カプトプリル、イルベサルタン、バルサルタン、プロプラノロール塩酸塩、フォシノプリルナトリウム、リドカイン塩酸塩、エプチフィバチド、セファゾリンナトリウム、アトロピン硫酸塩、アミノカプロン酸、スピロノラクトン、インターフェロン、ソタロール塩酸塩、塩化カリウム、ドキュセートナトリウム、ドブタミンｈｃｌ、アルプラゾラム、プラバスタチンナトリウム、アトルバスタチンカルシウム、ミダゾラム塩酸塩、メペリジン塩酸塩、二硝酸イソソルビド、エピネフリン、ドーパミン塩酸塩、ビバリルジン、ロスバスタチン、エゼチミブ／シンバスタチン、アバシミブ、及びカリポリドが挙げられる。

【0626】

ｉＲＮＡ剤（及び／又は抗補体成分Ｃ５抗体）及び更なる治療剤及び／又は処置剤は、同時に及び／又は同じ組み合わせで、例えば、非経口的に投与されてもよく、又は更なる治療剤が、別個の組成物の一部として、又は別の時点で、及び／又は当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される別の方法によって、投与され得る。

【0627】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明を特徴付けるｉＲＮＡ及び方法の実践又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料は下記に記載されている。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。

【実施例】

【0628】

実施例１．ｉＲＮＡ合成
試薬供給源
本明細書に試薬供給源が特に示されていない場合、このような試薬は、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から、分子生物学における用途のための品質／純度基準で得ることができる。

【0629】

転写物
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；以後、「カニクイザル（ｃｙｎｏ）」）、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、及びラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））転写物を標的とするｓｉＲＮＡを特定するために、ｓｉＲＮＡ設計を行った。一般に、二本鎖の設計には、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）において注釈付けされた、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからのヒト、マウス、及びラット転写物を使用した。カニクイザルの場合、設計には、カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ゲノムプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｍａｃａｑｕｅ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｐａｇｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ）からダウンロードされる転写物及び／又は肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから得られる転写物のいずれかを使用した。

【0630】

ＣＦＢ ｓｉＲＮＡの設計には、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの以下の転写物を使用した：ヒト－ＮＭ＿００１７１０；カニクイザル（カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ゲノムプロジェクトから）－ＥＮＳＭＭＵＰ００００００００９８５（遺伝子座＝足場３８８１：４７８３０：５３６２０）；マウス－ＮＭ＿００１１４２７０６及びＮＭ＿００８１９８；及びラット－ＮＭ＿２１２４６６．３。

【0631】

Ｃ３ ｓｉＲＮＡの設計には、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの以下の転写物を使用した：ヒト－ＮＭ＿００００６４；カニクイザル（カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ゲノムプロジェクトから）－ＥＮＳＰ０００００２４５９０７（遺伝子座＝ｃｈｒ１９：６９２１４１６：６９６３０３４）；マウス－ＮＭ＿００９７７８；及びラット－ＮＭ＿０１６９９４。

【0632】

Ｃ９ ｓｉＲＮＡ設計には、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの以下の転写物を使用した：ヒト－ＮＭ＿００１７３７；カニクイザル（肝臓ｃＤＮＡライブラリーから）－ｉｓｏｔｉｇ０５３６１；マウス－ＮＭ＿０１３４８５；及びラット－ＮＭ＿０５７１４６。

【0633】

限定はされないが、ヒト転写物のみ；ヒト及びカニクイザル転写物；ヒト、カニクイザル、及びマウス転写物；及びヒト、カニクイザル、マウス、及びラット転写物と一致する二本鎖を含むバッチを含むいくつかのバッチで、ｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。各設計バッチ（上記）において考慮される、列挙されるヒト転写物及び他の種の転写物と１００％の同一性を共有する大部分のｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。しかしながら、場合によっては、アンチセンス鎖：標的ｍＲＮＡ相補的塩基対が、ＧＣ又はＣＧ対である場合、最初のアンチセンス（最後のセンス）位置における二本鎖とｍＲＮＡ標的とのミスマッチを有するｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した（例えば表５を参照、標識Ｇ２１Ｕ、Ｇ２１Ａ、Ｃ２１Ａ、Ｇ２１Ａを有するオリゴ）。これらの場合、最初のアンチセンス：最後のセンス対におけるＵＡ又はＡＵ塩基対を有する二本鎖を設計した。したがって、二本鎖は相補性を維持したが、標的に対してミスマッチであった（Ｕ：Ｃ、Ｕ：Ｇ、Ａ：Ｃ、又はＡ：Ｇ）。

【0634】

ｓｉＲＮＡ設計、特異性、及び有効性の予測
全ての可能な１９量体（１９ｍｅｒ）の予測される特異性を、各配列から予測した。次に、７ヌクレオチドより長い反復がない候補１９量体を選択した。

【0635】

以下の組の候補ｓｉＲＮＡを、パイソンスクリプト「ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ」で実施される包括的な「力まかせ（ｂｒｕｔｅ－ｆｏｒｃｅ）」アルゴリズムを用いて、適切なトランスクリプトーム（ヒト、マウス、又はラットＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿及びＸＭ＿レコードのセット、及びＮＣＢＩヌクレオチド中のカニクイザルトランスクリプトームセットとして定義される）に対する包括的検索に使用した。

【0636】

Ｃ３：４６ヒト／カニクイザル／マウス／ラット、８０ヒト／カニクイザル／マウス、２３８４ヒト／カニクイザル。

【0637】

Ｃ９：７ヒト／カニクイザル／マウス／ラット、１２ヒト／カニクイザル／マウス、８１６ヒト／カニクイザル。

【0638】

ＣＦＢ：２３ヒト／カニクイザル／マウス、１２３２ヒト／カニクイザル。

【0639】

次に、スクリプトが、転写物－オリゴのアライメントを解析して、ｓｉＲＮＡと、あらゆる可能性のある「オフターゲット」転写物とのミスマッチの位置及び数に基づいてスコアを生成する。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の５’末端から２～９位にある、ｓｉＲＮＡの「シード」領域の差異を強調する。

【0640】

力まかせ探索（ｂｒｕｔｅ－ｆｏｒｃｅ ｓｅａｒｃｈ）による各オリゴ－転写物対に、個々のミスマッチスコアを合計することによってミスマッチスコアを与え；２～９位にあるミスマッチを、２．８とみなし、切断部位１０～１１位にあるミスマッチを、１．２とみなし、領域１２～１９のミスマッチを、１．０とみなした。更なるオフターゲット予測を、各オリゴの３つの異なる、シード指向性の６量体から誘導される７量体及び８量体の頻度を比較することによって行った。５’開始点に対して２～７位からの６量体を用いて、２つの７量体及び１つの８量体を生成した。３’－Ａを６量体に加えることによって「７量体１」を生成し；５’－Ａを６量体に加えることによって「７量体２」を生成し；Ａを６量体の５’及び３’末端の両方に加えることによって、８量体を生成した。ヒト、アカゲザル、マウス、又はラット３’－ＵＴＲｏｍｅ（コード領域「ＣＤＳ」の末端が明確に定義されたＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分列として定義される）における８量体及び７量体の頻度を予め計算した。８量体の頻度の範囲からの中央値を用いて、８量体の頻度を７量体の頻度に対して標準化した。次に、「ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ」を、（（３×標準化された８量体の数値）＋（２×７量体２の数値）＋（１×７量体１の数値））の和を計算することによって計算した。

【0641】

両方のｓｉＲＮＡ鎖を、計算されたスコアにしたがって、特異性のカテゴリーに割り当てた：３を超えるスコアは、高度の特異性があり、３に等しいスコアは、特異性があり、２．２～２．８のスコアは中程度の特異性があるとみなす。二本鎖を、アンチセンス鎖の特異性によって並べ替え、アンチセンスオリゴが、１番目の位置でＧＣを欠き、１３及び１４番目の位置の両方でＧを欠き、シード領域における３以上のＵｓ又はＡｓを有する二本鎖を選択した。

【0642】

ＧａｌＮａＣコンジュゲート二本鎖について、アンチセンス１９量体（上記）を、標的と相補的な配列（ｔａｒｇｅｔ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の２３ヌクレオチドへと伸長することによって、センス２１量体（２１ｍｅｒ）及びアンチセンス２３量体（２３ｍｅｒ）オリゴを設計した。設計バッチに含まれる全ての種の転写物の相補性を調べた。少なくとも２つの種で１００％の配列相補性を保った２３量体のみを使用した。各二本鎖について、センス２１量体を、アンチセンス鎖の最初の２１ヌクレオチドの逆補体として特定した。

【0643】

ｓｉＲＮＡ配列の選択
ＧａｌＮａｃコンジュゲート設計のための以下の２１／２３量体（２１／２３ｍｅｒ）二本鎖セットを合成し、二本鎖に形成した。

【0644】

Ｃ３：２０のセンス及び２０のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／マウス／ラットオリゴ対（最初のアンチセンス位置がＵＡ（上記）に交換された６つを含む）；１０のセンス及び１０のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／マウスオリゴ対（最初のアンチセンス位置がＵＡ（上記）に交換された３つを含む）；１２のセンス及び１２のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザルオリゴ対。

【0645】

Ｃ９：１つのセンス及び１つのアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／マウス／ラットオリゴ対；２つのセンス及び２つのアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／マウスオリゴ対；１つのセンス及び１つのアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／ラットオリゴ対；１９のセンス及び１９のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザルオリゴ対。

【0646】

ＣＦＢ：９つのセンス及び９つのアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／マウスオリゴ対（最初のアンチセンス位置がＵＡ（上記）に交換された４つを含む）；２３のセンス及び２３のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザルオリゴ対。

【0647】

ＣＦＢセンス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表３～４に示される。

【0648】

Ｃ３センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表５～６に示される。

【0649】

Ｃ９センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表７～８に示される。

【0650】

ｓｉＲＮＡの合成
一般的な小規模及び中規模のＲＮＡ合成手順
標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルにしたがって、市販されている、ウリジンの５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－ｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホロアミダイトモノマー、４－Ｎ－アセチルシチジン、６－Ｎ－ベンゾイルアデノシン及び２－Ｎ－イソブチリルグアノシン及び対応する２’－Ｏ－メチル及び２’－フルオロホスホロアミダイトを用いて、０．２～５００μｍｏｌの規模で、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。アミダイト溶液を、０．１～０．１５Ｍの濃度で調製し、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（アセトニトリル中０．２５～０．６Ｍ）を、活性剤として使用した。酸化工程のために、ルチジン：アセトニトリル（１：１）（ｖ；ｖ）中の０．２Ｍのフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）又はピリジン中の０．１Ｍの３－（ジメチルアミノメチレン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）を用いて、合成中にホスホロチオエート骨格修飾を導入した。合成の完了後、配列を固体担体から切断し、メチルアミン、続いてトリエチルアミン．３ＨＦを用いて脱保護して、存在する２’－Ｏ－ｔ－ブチルジメチルシリル保護基を除去した。

【0651】

５～５００μｍｏｌの規模の合成及び完全２’修飾配列（２’－フルオロ及び／又は２’－Ｏ－メチル又はその組合せ）の場合、３５℃で１６時間又は５５℃で５．５時間のいずれかで３：１（ｖ／ｖ）のエタノール及び濃縮（２８～３２％）アンモニア水溶液を用いて、オリゴヌクレオチドを脱保護した。アンモニア脱保護の前に、オリゴヌクレオチドを、固体担体上で２０分間にわたってアセトニトリル中０．５Ｍのピペリジンで処理した。粗製のオリゴヌクレオチドを、ＬＣ－ＭＳ及びアニオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によって分析した。２０ｍＭのリン酸塩、１０％～１５％のＡＣＮ、ｐＨ＝８．５（緩衝液Ａ）及び２０ｍＭのリン酸塩、１０％～１５％のＡＣＮ、１ＭのＮａＢｒ、ｐＨ＝８．５（緩衝液Ｂ）を用いて、ＩＥＸ ＨＰＬＣによって、オリゴヌクレオチドの精製を行った。分析的ＨＰＬＣによって、画分の純度を分析した。好適な純度を有する生成物含有画分をプールし、脱塩の前にロータリーエバポレータにおいて濃縮した。試料を、サイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、凍結乾燥した。等モル量のセンス鎖及びアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳ緩衝液中でアニールして、対応するｓｉＲＮＡ二本鎖を調製した。

【0652】

小規模（０．２～１μｍｏｌ）の場合、９６ウェルフォーマットでＭｅｒＭａｄｅ １９２合成装置で合成を行った。完全２’－修飾配列（２’－フルオロ及び／又は２’－Ｏ－メチル又はその組合せ）の場合、オリゴヌクレオチドを、室温で３０～６０分間にわたってメチルアミンを用いて脱保護し、続いて、６０℃で３０分間又は室温で３０～６０分間にわたって３：１（ｖ／ｖ）のエタノール及び濃縮（２８～３２％）アンモニア水溶液を用いてインキュベートし、続いて、４０℃で１．５時間インキュベートした。次に、粗製のオリゴヌクレオチドを、アセトニトリル：アセトン（９：１）の溶液中で沈殿させ、遠心分離及び上清のデカントによって単離した。粗製のオリゴヌクレオチドペレットを、２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁させ、ＬＣ－ＭＳ及びアニオン交換ＨＰＬＣによって分析した。粗製のオリゴヌクレオチド配列を、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の９６ディープウェルプレートにおいて脱塩した。各ウェル中、個々の配列に対応する約１．５ｍＬの試料を採取した。これらの精製された脱塩オリゴヌクレオチドを、ＬＣ－ＭＳ及びアニオン交換クロマトグラフィーによって分析した。Ｔｅｃａｎ製ロボットにおいて等モル量のセンス及びアンチセンス配列をアニールすることによって、二本鎖を調製した。二本鎖の濃度を、１×ＰＢＳ緩衝液中１０μＭに調整した。

【0653】

インビボ分析のためのＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴヌクレオチドの合成
３’末端でＧａｌＮＡｃリガンドとコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド合成のための４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護第一級ヒドロキシ基を有するＹ字型のリンカー及びテザーを介して結合されたＧａｌＮＡｃリガンドが予め充填された固体担体を用いて、０．２～５００μｍｏｌの規模で合成した。

【0654】

５～５００μｍｏｌの規模のＧａｌＮＡｃコンジュゲートの合成の場合、ＲＮＡのための上記の合成プロトコルの後、以下の適応を行った：ポリスチレンベースの合成担体の場合、トルエン中５％のジクロロ酢酸を、合成中、ＤＭＴ切断に使用した。担体からの切断及び脱保護を、上述したように行った。ホスホロチオエートに富んだ配列（通常、５つを超えるホスホロチオエート）を、最終的な５’－ＤＭＴ基を除去せずに合成し（「ＤＭＴ－ｏｎ」）、上記の切断及び脱保護の後、水中５０ｍＭの酢酸アンモニウム（緩衝液Ａ）及び８０％のアセトニトリル中の５０ｍＭの酢酸アンモニウム（緩衝液Ｂ）を用いて逆相ＨＰＬＣによって精製した。分析的ＨＰＬＣ及び／又はＬＣ－ＭＳによって、画分の純度を分析した。好適な純度を有する生成物含有画分をプールし、ロータリーエバポレータにおいて濃縮した。ＤＭＴ基を、水中２０％～２５％の酢酸を用いて、完了するまで除去した。試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、凍結乾燥した。等モル量のセンス鎖及びアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳ緩衝液中でアニールして、対応するｓｉＲＮＡ二本鎖を調製した。

【0655】

複数のホスホロチオエート結合を有する配列を含む、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（０．２～１μｍｏｌ）の小規模合成の場合、ＭｅｒＭａｄｅプラットフォームにおけるＲＮＡ又は完全２’－Ｆ／２’－ＯＭｅ－含有配列の合成のための上記のプロトコルを適用した。ＧａｌＮＡｃ官能化制御多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）担体を含む予め充填されたカラムにおいて合成を行った。

【0656】

実施例２．インビトロスクリーニング
細胞培養及びトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン、及びグルタミン（ＡＴＣＣ）が補充されたイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＡＴＣＣ）中、５％のＣＯ２の雰囲気下、３７℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によりプレートから解放した。細胞を洗浄し、０．２５×１０^６個の細胞／ｍｌで再懸濁させた。トランスフェクションの際、細胞を、ウェル当たり約２０，０００個の細胞を含む９６ウェルプレート上に平板培養した。

【0657】

初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）を、トランスフェクションの１時間未満前にＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から新たに単離し、初代肝細胞培地中で増殖させた。細胞を、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ Ｒａｔ（平板培養）培地（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ｓ０１４９４）中で、０．１１×１０^６個の細胞／ｍｌで再懸濁させた。トランスフェクションの際、細胞を、ウェル当たり１０，０００個の細胞のＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ ９６ウェルコラーゲンプレート（ＢＤ、３５６４０７）上に平板培養し、５％のＣＯ_２の雰囲気中、３７℃でインキュベートした。

【0658】

Ｈｅｐ３Ｂ及びＰＭＨの場合、ウェル当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ及び０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）を、９６ウェルプレート中の個々のウェルへの５μｌの各ｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによって、トランスフェクションを行った。次に、混合物を、室温で２０分間インキュベートした。次に、適切な細胞数を含む、抗生物質なしの８０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を２４時間インキュベートした。

【0659】

単回用量実験を、ＧａｌＮＡｃ修飾配列については１ｎＭ及び０．０１ｎＭの最終二本鎖濃度で行った。用量反応実験を、初代マウス肝細胞については３、１、０．３、０．１、０．０３７、０．０１２３、０．００４１２、及び０．００１３７ｎＭの最終二本鎖濃度で行い、Ｈｅｐ３Ｂ細胞については３、１、０．３、０．１、０．０３７、０．０１２３、０．００４１２、０．００１３７、０．０００４６、０．０００１５、０．００００５、及び０．００００１７ｎＭの最終二本鎖濃度で行った。

【0660】

ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ ＃：６１０－１２）を用いた総ＲＮＡ単離
細胞を採取し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中に溶解させた後、エッペンドルフサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）を用いて、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、プロセス全体を通して同一であった）。１０マイクロリットルの磁気ビーズ及び８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、１分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清の除去後、溶解した細胞を残りのビーズに加え、５分間混合した。上清の除去後、磁気ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。最後に、ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を加え、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁石上で５分間捕捉した。４５μｌの上清を除去し、別の９６ウェルプレートに加えた。

【0661】

ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
反応当たり２μｌの１０倍緩衝液、０．８μｌの２５倍ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮアーゼ阻害剤及び３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを調製した。等体積のマスターミックス及びＲＮＡを、インビトロスクリーニング試料のために１２μｌ又はインビボスクリーニング試料のために２０μｌの最終体積になるように混合した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ－１０００又はＳ－１０００サーモサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、以下の工程によってｃＤＮＡを生成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、及び４℃で保持。

【0662】

リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）中、ウェル当たり、２μｌのＨ_２Ｏ、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｅｐ３Ｂ細胞についてはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号４３２６３１７Ｅ、初代マウス肝細胞についてはカタログ番号３５２３３９Ｅ又はカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）初代肝細胞についてはカスタムプローブ）、０．５μｌの適切なＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｅｐ３Ｂ細胞についてはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｈｓ００１５６１９７＿ｍ１又は初代マウス肝細胞についてはｍｍ００４３９２７５＿ｍ１又はカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）初代肝細胞についてはカスタムプローブ）及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに加えた。リアルタイムＰＣＲを、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、Ｒｏｃｈｅ ＬＣ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）において行った。インビトロスクリーニングの場合、特に断りのない限り、各二本鎖を、２回の生物学的反復（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）で試験し、各リアルタイムＰＣＲを、２回の技術的反復（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）で行った。インビボスクリーニングの場合、各二本鎖を、１回又は複数回の実験（群当たり３匹のマウス）で試験し、各リアルタイムＰＣＲを、二回の技術的反復で行った。

【0663】

ｍＲＮＡレベルの相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５でトランスフェクトした細胞、又は疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを用いて４パラメータ適合モデルを用いてＩＣ_５０を計算し、ＡＤ－１９５５でトランスフェクトした細胞に対して、同じ用量範囲にわたって正規化し、又はそれ自体の最低用量に対して正規化した。

【0664】

ＡＤ－１９５５のセンス及びアンチセンス配列は以下のとおりである：
センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号３９）；
アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号４０）．

【0665】

表９は、示されるＣＦＢ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データが、非処理の細胞に対して残るメッセージのパーセントとして表される。

【0666】

表１０は、示されるＣＦＢ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトした初代マウス肝細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データが、非処理の細胞に対して残るメッセージのパーセントとして表される。

【0667】

表１１は、示されるＣＦＢ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における用量反応を示す。示されるＩＣ_５０値が、非処理の細胞に対するＩＣ_５０値を表す。

【0668】

表１２は、示されるＣＦＢ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトした初代マウス肝細胞における用量反応を示す。示されるＩＣ_５０値が、非処理の細胞に対するＩＣ_５０値を表す。

【0669】

表１３は、示されるＣ９ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトした初代マウス肝細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データが、非処理の細胞に対して残るメッセージのパーセントとして表される。

【0670】

表１４は、示されるＣ３ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトした初代マウス肝細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データが、非処理の細胞に対して残るメッセージのパーセントとして表される。

【0671】

表１５は、示されるＣ３ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データが、非処理の細胞に対して残るメッセージのパーセントとして表される。

【0672】

表１６は、示されるＣ３ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトした初代マウス肝細胞における用量反応を示す。示されるＩＣ_５０値が、非処理の細胞に対するＩＣ_５０値を表す。

【0673】

表１７は、示されるＣ３ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における用量反応を示す。示されるＩＣ_５０値が、非処理の細胞に対するＩＣ_５０値を表す。

【0674】

【表4】

【0675】

【表5】

【0676】

【表6】

【0677】

【表7】

【0678】

【表8】

【0679】

【表9】

【0680】

【表10】

【0681】

【表11】

【0682】

【表12】

【0683】

【表13】

【0684】

【表14】

【0685】

【表15】

【0686】

【表16】

【0687】

【表17】

【0688】

【表18】

【0689】

【表19】

【0690】

【表20】

【0691】

【表21】

【0692】

【表22】

【0693】

【表23】

【0694】

【表24】

【0695】

【表25】

【0696】

【表26】

【0697】

【表27】

【0698】

実施例３．インビボスクリーニング
３つのＣＦＢ ＧａｌＮＡＣコンジュゲートｉＲＮＡのサブセット、ＡＤ－６０３０４、ＡＤ－６０３３１、及びＡＤ－６０３４４を、更なるインビボ評価のために選択した。これらのｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、表１８に示される。表１９に示されるように、ＡＤ－６０３０４のヌクレオチド配列は、マウス及びラットヌクレオチド配列と完全に一致する。ＡＤ－６０３３１のヌクレオチド配列及びＡＤ－６０３４４のヌクレオチド配列は、マウス遺伝子に対するヌクレオチドミスマッチ（「ＭＭ」；太字で、下線を引かれたヌクレオチドを参照）を有するが、マウス肝細胞における活性を有する。

【0699】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たりＮ＝３）に、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃコンジュゲート二本鎖又は等体積の１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ＃ １４０４０１３３）を皮下注射した。９６時間後、マウスを安楽死させ、肝臓を解剖し、液体窒素中で急速冷凍した。肝臓を、２０００ Ｇｅｎｏ／Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）において粉砕した。試料当たり約１０ｍｇの肝臓粉末をＲＮＡ単離に使用した。試料を、まず、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において均質化し、次に、ＲＮＡを、真空／回転技術を用いて、製造業者のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｃａｔ＃７４８８１）を用いて抽出した。ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）によって測定し、１００ｎｇ／μｌに調整した。ｃＤＮＡを調製し、ＲＴ－ＰＣＲを、上述したように行った。

【0700】

図２は、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量でＣＦＢ ｍＲＮＡを阻害するＣＦＢ ｉＲＮＡの有効性を示す。１０ｍｇ／ｋｇの用量で、平均して約８０％のサイレンシングが、試験される全ての３つのｉＲＮＡについて観察された。１ｍｇ／ｋｇの用量で、平均して約３０％のサイレンシングが、ＡＤ－６０３３１及びＡＤ－６０３４４について観察された。

【0701】

また、インビボでのＣＦＢ ｍＲＮＡの発現を抑制するＡＤ－６０３３１の能力を、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの単回投与を用いて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、上記の用量を皮下注射し、７０時間後、マウスを安楽死させた。動物の肝臓からのＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製、及びＲＴ－ＰＣＲを、上述したように行った。図３は、ＡＤ－６０３３１が、約２．５ｍｇ／ｋｇのＥＤ_５０で、用量反応的にＣＦＢ ｍＲＮＡを減少させることを示す。ヒト対象に導入される場合、配列の設計を与えられたこれらのｉＲＮＡが、更により有効であることが予測される。

【0702】

【表28】

【0703】

【表29】

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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