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特許7057827グルテンを含まない小麦粉を得るためのグリアジンの分解プロセス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-12
(45)【発行日】2022-04-20
(54)【発明の名称】グルテンを含まない小麦粉を得るためのグリアジンの分解プロセス
(51)【国際特許分類】
A21D 8/04 20060101AFI20220413BHJP
C12N 9/62 20060101ALI20220413BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20220413BHJP
【ＦＩ】
A21D8/04
C12N9/62
C12N1/20 F
【請求項の数】
37
(21)【出願番号】P 2020523059
(86)(22)【出願日】2017-07-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-26
(86)【国際出願番号】 IB2017054218
(87)【国際公開番号】W WO2019012312
(87)【国際公開日】2019-01-17
【審査請求日】2020-07-10
(73)【特許権者】
【識別番号】520012242
【氏名又は名称】ハビエル・ゴンサレス・デ・ラ・トレ
【氏名又は名称原語表記】Ｊａｖｉｅｒ Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ルート・ペドロサ・イスラス
【審査官】吉海 周
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５３３２９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５１３１９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５３２５３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０５－２５２９３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２４８５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－２７１９７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２２３５０６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１３－００１９７２４（ＫＲ，Ａ）
【文献】Patricia Alvarez-Sieiro et.al.，Solubilization of gliadins for use as a source of nitrogen in the selection of bacteria with gliadinase activity.，Food Chemistry，2015年，vol.168，pp.439-444
【文献】RIZELLO, C. G. et al.，Highly Efficient Gluten Degradation by Lactobacilli and Fungal Proteases during Food Processing; New Perspectives for Celiac Desease，Applied and Environmental Microbiology，2007年，Vol.73, No.14，pp.4499-4507
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２１Ｄ
Ａ２３Ｌ
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＦＳＴＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
パン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法であって、小麦粉を水と混合する工程；混合工程で得られた混合物からのグリアジンを加水分解するための少なくとも1つの酵素加水分解工程；制御されたpH条件下で少なくとも1つの微生物を使用することにより、酵素加水分解工程で得られた混合物を発酵させる少なくとも1つの工程であって、微生物が、バチルス・アミロリケファシエンスのみ、またはバチルス・アミロリケファシエンスとラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・デルブルッキーとの組み合わせである工程；および乾燥してグリアジンを含まない小麦粉を得る工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項2】
酵素加水分解工程において真菌酵素を使用することをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項3】
アスペルギルス・ニガーおよび/またはアスペルギルス・オリゼからの酵素を使用することをさらに特徴とする、請求項２に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項4】
アスペルギルス・ニガーからの酵素およびアスペルギルス・オリゼからの酵素の両者を使用する場合に、両酵素が1：1の比率で存在することをさらに特徴とする、請求項３に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項5】
酵素が懸濁液に対して0.01～0.1重量％の割合で混合物に添加されることをさらに特徴とする、請求項２に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項6】
酵素加水分解工程が35～37℃の温度で行われることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項7】
酵素加水分解工程が絶えず攪拌しながら行われることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項8】
加水分解時間が4～8時間であることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項9】
加水分解工程が完了した後にpH調整が行われることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項10】
pHが6.5～8に調整されることをさらに特徴とする、請求項９に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項11】
pH調整が塩基を添加することにより行われることをさらに特徴とする、請求項９に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項12】
塩基がK2CO3であることをさらに特徴とする、請求項１１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項13】
使用される微生物が、103～109CFU／小麦粉1gの量で混合物に添加されることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項14】
発酵工程が36～38℃の温度で行われることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項15】
発酵工程が4～8時間行われることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項16】
発酵工程が完了した後に第2のpH調整が行われることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項17】
pHが6.5～8に調整されることをさらに特徴とする、請求項１６に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項18】
第2のpH調整が塩基を添加することにより行われることをさらに特徴とする、請求項１６に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項19】
塩基がK2CO3であることをさらに特徴とする、請求項１８に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項20】
第2の酵素加水分解工程を含むことをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項21】
第2の酵素加水分解工程に真菌酵素を使用することをさらに特徴とする、請求項２０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項22】
第2の酵素加水分解工程にアスペルギルス・ニガーおよび/またはアスペルギルス・オリゼからの酵素を使用することをさらに特徴とする、請求項２１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項23】
アスペルギルス・ニガーからの酵素およびアスペルギルス・オリゼからの酵素の両者を使用する場合に、両酵素が1：1の比率で存在することをさらに特徴とする、請求項２２に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項24】
酵素が懸濁液に対して0.01～0.1重量％の割合で混合物に添加されることをさらに特徴とする、請求項２１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項25】
第2の酵素加水分解工程が35～37℃の温度で行われることをさらに特徴とする、請求項２０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項26】
第2の酵素加水分解工程が絶えず攪拌しながら行われることをさらに特徴とする、請求項２０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項27】
第2の酵素加水分解の時間が2～4時間であることをさらに特徴とする、請求項２０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項28】
第2の発酵工程を含むことをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項29】
pH制御条件下で少なくとも1つの微生物を使用することにより第2の発酵工程が行われることをさらに特徴とする、請求項２８に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項30】
第2の発酵工程において、微生物が、バチルス・アミロリケファシエンスのみ、またはバチルス・アミロリケファシエンスとラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・デルブルッキーとの組み合わせであることをさらに特徴とする、請求項２９に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項31】
微生物がバチルス・アミロリケファシエンスとラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・デルブルッキーとの組み合わせであり、これら微生物が1：1：1の比率で存在することをさらに特徴とする、請求項３０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項32】
微生物が103～109CFU／小麦粉1gの量で混合物に添加されることをさらに特徴とする、請求項３０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項33】
第2の発酵工程が35～37℃の温度で行われることをさらに特徴とする、請求項２９に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項34】
第2の発酵工程が絶えず攪拌しながら行われることをさらに特徴とする、請求項３０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項35】
第2の発酵工程が4～12時間行われることをさらに特徴とする、請求項３０に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項36】
乾燥工程が噴霧乾燥工程であることをさらに特徴とする、請求項１に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【請求項37】
噴霧乾燥において、入口空気が150～180℃の温度であり、出口空気が70～90℃の温度であることをさらに特徴とする、請求項３６に記載のパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グルテンを含まない小麦粉の製造方法、より具体的には、グリアジンを分解してグルテンを含まない小麦粉を得る方法に関する。
【背景技術】
【0002】
セリアック病は、小麦、ライ麦、および大麦に含まれるタンパク質であるグルテンの摂取によって引き起こされる免疫系の遺伝的障害である。グルテンは、人間の上部消化管で十分に消化されない。グルテンは、グリアジンとグルテニンの2つの成分で構成されている。グリアジンはアルコールに可溶であり、セリアック病の人々にとって最大量の有毒成分を含んでいる(Green, P-H-R-およびCellier, C. 2007. Celiac disease. N. Engl. J. Med.; 357:1731-1743)。
【0003】
セリアック病の患者がグルテンを含む食物を食べると、彼らの免疫系は腸絨毛を損傷または破壊するように反応し、食物の栄養素が吸収されず、栄養不良を引き起こす。セリアック病の症状は患者の年齢によって異なり、下痢、腹部膨満、嘔吐、および体重減少が子供に最も多く見られるが、成人では一般的な症状はとりわけ鉄欠乏性貧血、疲労、骨痛、関節炎、骨粗鬆症である。
【0004】
最近まで、セリアック病はまれな疾患と考えられていたが、現在では最も一般的な不耐性の1つであり、新生児150人ごとに1人の世界的な有病率を持ち、診断されるのはわずか9％と推定されている。メキシコの国立医学科学栄養研究所サルバドール・ズビランが提供した統計によると、セリアック病の可能性のある人は約260万人いる。
【0005】
現在、セリアック病の唯一の受け入れられている治療法は、生涯グルテンを含まない食事に従うことである。Codex Alimentariusによると、グルテン濃度が20ppm未満のときに、その食品はグルテンを含まないとみなされる。しかしながら、これは、多糖類の摂取量が少なくなり、エネルギー摂取量が減少し、ヒトの健康に有益な腸内細菌叢が減少し、日和見病原体の存在が増加するなど、負の栄養学的意味を表す。グルテンを含まない食事によって減少した有益な腸内微生物叢は、免疫刺激活性に悪影響を及ぼし、抗炎症化合物の産生が減少する。
【0006】
このため、セリアック病患者に適したグルテンを含まない製品が必要であり、したがって、患者がより多くの種類の食品を摂取できるようになることで食事を改善することができる。
【0007】
人間の毎日の食事で最も重要な製品の1つは、主に小麦粉から作られたパンである。小麦生地の特性は、主にグルテンタンパク質類に依存する。近年、これらのタンパク質の品質を改善したりこれらのタンパク質を分解したりするために様々な処理が施されており、セリアック病の人が摂取できるベーカリー製品が得られている。
【0008】
パンの品質を改善するために最近開発された処理は、サワードウの生産である。前記生地は、一般に酵母およびラクトバチルス属に属する乳酸菌（LAB）によって発酵される小麦粉と水の混合物から得られる。サワードウを得るために発酵で使用されるLABは、パン製造中にグルテンの修飾を可能にし、それによりセリアック病患者に有毒なタンパク質画分の除去を可能にすることが見出された。この病状を患う人々にとって最も有害なタンパク質画分の1つはグリアジン画分であり、これはLABを使用することでも除去できる。
【0009】
発酵の間、LABsのタンパク質分解システムは、微生物の代謝活性を促進する低分子量ペプチドとアミノ酸を放出して、味覚形成の改善とアレルゲン性ペプチド含有量の減少に寄与し、主にグリアジン画分に敏感なセリアック病患者に大きな希望を与える。サワードウのパン生産に関して行われた研究は、特定の加工条件（長期および半液体発酵）でLABが小麦グリアジン画分を加水分解する能力があることを示した(Di Cagno, R., De Angelis, M., Auricchio, S., Greco, L., Clarke, C., De Vincenzi, M., & Minervini, F. (2004). Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Applied and environmental microbioiogy, 70(2), 1088-1096; Gobbetti, M., De Angelis, M., Corsetti, A., & Di Cagno, R. (2005). Biochemistry and physiology of sourdough lactic acid bacteria. Trends in Food Science & Technology, 16(1), 57-69.; Gobbetti, M., Rizzello, C. G., Di Cagno, R., & De Angelis, M. (2007). Sourdough lactobacilli and celiac disease, Food microbiology, 24(2), 187-196)。
【0010】
しかしながら、すべての乳酸菌が残留グルテン濃度をグルテン不耐症の人々（セリアック病患者）が許容できる用量まで減らすことができるわけではないため、LABのタイプを選択し、その適切な組み合わせを見出す必要がある。
【0011】
プロテアーゼもまた、グルテン画分を分解する能力を有している。これがグルテンの加水分解を助けるためにプロテアーゼが使用される理由である。
【0012】
Rizzello, C.G, De Angelis, M., Di Cagno, R., Camarca, A., Silano, M., Losito, I., ... ＆ Gianfrani, C.(2007)による論文（Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease, Applied and environmental microbiology, 73(14), 4499-4507）において、非商用のラクトバチルス属株（以前はグリアジンを加水分解する能力に基づいて選択された）と真菌プロテアーゼとの組み合わせの混合物をサワードウで使用して、比較的長い発酵中に小麦粉から毒性が除去された。ラクトバチルス属による加水分解の動態は、アルブミン、グロブリンおよびグリアジンの加水分解において非常に効率的であることが観察されたが、サワードウには20％のグルテニンが残留していた。
【0013】
同様に、米国特許出願公開US2008/0131556は、少なくとも6つの市販のLABおよび／またはビフィズス菌の種の混合物を開示している。この混合物は、サワードウの調製に使用できる。ベーカリーで一般的に使用される十分な量の微生物プロテアーゼがこれらの調製物に添加されると、発酵サワードウは約200ppmのグルテン濃度を有するため、グルテンは分解されるが、十分には分解されず、セリアック病患者の消費には適さない。さらに、この分解を達成する混合物は複雑である、なぜなら、より多くのLAB種を使用するとグリアジンのより大きな分解が観察できるため、多数の種を使用する必要があるからである。
【0014】
国際公開WO2010/073283は、１つまたはそれ以上の真菌プロテアーゼと組み合わせた2つのタイプのLABを含む混合物を開示している。使用されるLABは、グルテン分解度がより高くなるように特別に開発された株である。特定の反応条件下で特定の量のLABとプロテアーゼの上記の組み合わせにより、グリアジンとグルテニンの痕跡が検出できない程度にまで減少し、20ppm未満の残留グルテン濃度が達成された。グルテン分解プロセスの最後に、ベーカリー製品で使用するためのグルテンを含まない小麦粉が得られる。しかしながら、この場合の問題は、使用する微生物が市販されていないことである。
【0015】
また、国際公開WO2014/072758は、グルテンをサワードウに分解するためのマイクロカプセル化された細菌コンソーシアムを示している。前記発明は、必要に応じて接種物を調製する際の困難性を低減し、汚染のリスクおよび乳酸培養物の生存率を低減し、小麦生地の分解のプロセス効率を促進するという利点を有するが、前の場合のように、発酵プロセスに適応した特定の微生物を使用する必要がある。
【0016】
理解できるように、グルテン分解に関して従来技術で既に知られている細菌培養物は、市販の株の場合には（少なくとも6種の）複雑なLAB混合物の使用、またはむしろ特別に選択され設計された株の使用のような特定の欠点を持っており、これは浮遊培養物（接種物）を活性化し、再生し、洗浄し、および生地に追加する必要があることを意味し、その毎日の準備と汚染を避けるための高度に専門的な取り扱いが必要であり、同じ増殖段階でLAB種の適切な割合と十分な量（これは潜在的な汚染のリスクを表す）で活性に保ち、最後に、マイクロカプセル化された接種物による生地の処理（ベーキング工程への追加の工程を意味する）が必要である。
【0017】
また、最終製品としてベーキングフラワーを入手できるプロセスの場合、非常に特殊な細菌コンソーシアムを使用する必要があり、これには前述のように培養物の活性化、再生、および洗浄が含まれる。これらのタイプの培養の別の欠点は、非常に複雑なプロセスの開発を伴うことであり、これは小麦粉生産のコストの大幅な増加を意味し、それを実行不可能にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
従って、最新技術において、現在、効率的であり、市販の微生物を使用し、それによりグリアジン、したがってグルテンの含有量が非常に低い小麦粉を得ることができるグリアジン分解プロセスを開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0019】
上記の最新技術の問題および欠点を考慮し、本発明の目的は、酵素加水分解および微生物発酵によるパン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法を提供することである。
【0020】
本発明のパン製造用小麦粉中のグリアジンの分解方法は、最新技術で言及されている問題および欠点を解決する。
【0021】
本発明は、パン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法であって、小麦粉を水と混合する工程；混合工程で得られた混合物からのグリアジンを加水分解するための少なくとも1つの酵素加水分解工程；制御されたpH条件下で少なくとも1つの微生物を使用することにより、酵素加水分解工程で得られた混合物を発酵させる少なくとも1つの工程；および乾燥してグリアジンを含まない小麦粉を得る工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【0034】
背景技術で記載したように、グルテン画分、特にグリアジンの分解は、セリアック病患者に適した製品を作るために非常に重要である。この課題を解決するために、少なくとも1つの酵素加水分解工程および乳酸菌を用いた少なくとも1つの発酵工程からなるプロセスにより、ベーキングフラワーに含まれるグリアジンの完全な分解が達成されることがわかった。
【0035】
微生物および酵素の作用が阻害されるため、小麦粉を発酵および酵素加水分解によって処理する際に起こる培地の酸性化プロセスは、小麦粉におけるグリアジン分解の程度に悪影響を与えることが観察されている。このことが、グリアジンが最適に分解された小麦粉を得るために、細菌のコンソーシアムおよび反応条件を慎重に選択する必要があるだけでなく、微生物活性を最適化し酵素阻害を回避する特定の順序でこれらの各プロセスを実行する必要がある理由である。
【0036】
したがって、本発明のパン製造用小麦粉中のグリアジンを分解する方法は、最新技術で言及されている課題および欠点を解決する。
【0037】
上記に従って、本発明は、パン製造用の小麦粉中のグリアジンの分解方法であって、小麦粉を水と混合する工程；混合工程で得られた混合物からのグリアジンを加水分解するための少なくとも1つの酵素加水分解工程；制御されたpH条件下で少なくとも1つの微生物を使用することにより、酵素加水分解工程で得られた混合物を発酵させる少なくとも1つの工程；およびグリアジンを含まない小麦粉を得るための乾燥工程を含む方法に関する。
【0038】
パン製造用の小麦粉は、パン製品を製造するのに適した特性を有するものすべてである。それらは、高いグルテン含量を有することにより特徴付けられ、それにより、前記小麦粉が良好な吸水能、凝集性、粘性、および弾性を有することが可能になる。パン製造用の小麦粉のいくつかの例は、小麦、ライ麦、大麦、オートミール、およびライ小麦由来の小麦粉である。
【0039】
前記方法の最初の工程は、パン製造用の小麦粉を水と混合することを含む。
【0040】
本発明の好ましい実施形態では、酵素加水分解工程において真菌酵素を使用することが好ましい。より好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）および/またはアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）からの酵素。前記酵素は、好ましくは1：1の比率で存在し、懸濁液に対して0.01～0.1重量％の割合で混合物に添加される。酵素加水分解工程は、絶えず攪拌しながら、35～37℃の温度で行われることが好ましい。加水分解時間は、好ましくは4～8時間である。 この最初の工程で、当初の小麦粉に含まれる約88％のグリアジンの分解が達成される。
【0041】
前記のように、培地は酵素加水分解により酸性化される傾向があり、酵素活性は酸性pHで低下する傾向があることが知られている。このことが、本発明の任意の実施形態において、加水分解工程が完了した後にpH調整が行われる理由である。好ましくは、6.5～8のpHが求められる。前記pH調整を実施するため、塩基、好ましくはK2CO3が、必要なpHに達するのに十分な量で添加される。
【0042】
記載の加水分解工程中に、グリアジンの加水分解およびグルテン分子に存在する標的ペプチドの分解が達成される。酵素加水分解プロセスによって生成されたペプチドおよびアミノ酸は、一部のLABによって効率的に分解され得る。このことが、グリアジンの分解プロセスの後続の工程が、pH制御条件下で少なくとも1つのLABを使用することにより、酵素加水分解工程で得られた混合物を発酵させる工程である理由である。
【0043】
発酵工程に関して、本発明の好ましい実施形態では、微生物としてバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuterii）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）またはそれらの混合物を使用することにより行われる。使用される微生物は、103～109CFU／小麦粉1gの量で混合物に添加されることが好ましい。好ましくは、発酵工程は、36～38℃の温度で4～8時間行われる。当該発酵工程において、初期グリアジンのさらに最大10％が分解され、残りの小麦粉には約2％のグリアジンが含まれることになる。
【0044】
加水分解工程と同様に、発酵工程中にpHのかなりの低下が観察されるので、本発明の任意の実施形態では、第2のpH調整が行われる。好ましくは、6.5～8のpHが求められる。前記pH調整を実施するため、塩基、好ましくはK2CO3が、必要なpHに達するのに十分な量で添加される。
【0045】
グリアジンの残りの2％を分解するために、第2の加水分解工程を実行してよい。したがって、本発明のさらに好ましい実施形態では、好ましくは真菌酵素を使用することにより、第2の酵素加水分解工程が実施される。より好ましくは、アスペルギルス・ニガーおよび/またはアスペルギルス・オリゼからの酵素。前記酵素は、好ましくは1：1の比率で存在し、懸濁液に対して0.02～0.08重量％の割合で混合物に添加される。第2の酵素加水分解工程は、絶えず攪拌しながら、35～37℃の温度で実施することが好ましい。加水分解時間は、好ましくは2～4時間である。
【0046】
さらに、第2の加水分解工程の後、第2の発酵工程を実行して、グリアジンの最大限の分解を達成できる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、第2の酵素加水分解工程で得られた混合物を発酵させる第2の工程は、pH制御条件下で少なくとも1つの微生物を使用することにより行われる。好ましくは、第2の発酵工程は、微生物としてバチルス・アミロリケファシエンス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ヘルベティカスまたはそれらの混合物を使用することにより行われる。好ましくは、バチルス・アミロリケファシエンスと、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・デルブリュッキ、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトバチルス・ヘルベティカスから選択される少なくとも2つの乳酸菌との混合物が使用される。好ましくは、微生物は1：1：1の比率で存在する。好ましくは、微生物は、103～109CFU／小麦粉1gの量で混合物に添加される。好ましくは、第2の発酵工程は、絶えず攪拌しながら、35～37℃の温度で4～12時間行われる。
【0047】
最後に、ベーカリー製品の製造に使用できる最終製品を得るために、本発明の方法は、グリアジンを含まない小麦粉を得るための追加の乾燥工程を含む。
【0048】
好ましい実施形態では、乾燥工程は噴霧乾燥工程である。好ましくは、噴霧乾燥では、入口空気は150～180℃の温度であり、出口空気は70～90℃の温度である。
【0049】
本発明は、上記の詳細な説明に基づいて実施可能な他の図示されていない実施形態がないことを意味することなく、本発明の好ましい実施形態の完全な理解を可能にするために例示のみを目的とする以下の実施例からよりよく理解されるであろう。
【実施例1】
【0050】
様々な方法でグリアジンの分解を観察するため、いくつかの研究を行った。
【0051】
第一の研究では、タンパク質分解工程と発酵工程とからなるプロセスを行った。この研究のため、水中小麦粉の懸濁液を作り、この懸濁液を37℃の温度で絶えず攪拌し続けた。タンパク質分解工程では、小麦粉1kgあたり酵素HTProteolyticRの1gを添加し、5時間加水分解させた。その後、発酵工程（9時間続けた）のため、109CFUの乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・サンフランシセンシスを加えた。
【0052】
第二の研究では、前記のアッセイを繰り返したが、酵素によるタンパク質分解時間を5時間から10時間に変更した。
【0053】
第三の研究では、発酵工程を行い、そのために水中小麦粉懸濁液を作成し、109CFUのラクトバチルス・ジョンソニを前記懸濁液に添加した。懸濁液を、37℃の温度で24時間絶えず攪拌し続けた。
【0054】
第四の研究は、タンパク質分解プロセスからなり、このプロセスのため、33.3gの小麦粉と130mlの水からなる懸濁液を作り、小麦粉1kgあたり1gの酵素HTProteolitic200Rを懸濁液に加えた。前記懸濁液を、37℃で10時間、絶えず攪拌しながら維持した。
【0055】
第五の研究では、タンパク質分解プロセスを行い、このプロセスのため、33.3gの小麦粉と130mlの水の懸濁液を作成し、小麦粉1kgあたり1.2gの酵素HarizymeGRを懸濁液に加えた。懸濁液を、37℃で10時間、絶えず攪拌しながら維持した。
【0056】
各実験の最後に、小麦粉を液体クロマトグラフィーで分析した。結果を表1に示す。図1～5のそれぞれで、小麦粉Hoja de PlataRの液体クロマトグラムを文字「A」で示し、本発明の方法で処理した小麦粉のクロマトグラムは文字「B」で示す。また、分析したグリアジン含有量を示すクロマトグラムの位置は、各図の円で示す。
【0057】
【0058】
表1とそれぞれの図に示された結果から、最も効率的なグルテン分解プロセスは、タンパク質分解を行った後に続いて乳酸菌発酵の工程を行うプロセスであると結論付けられる。
【実施例2】
【0059】
酵素N1000Rを使用した5時間のタンパク質分解工程、乳酸菌を使用した発酵工程、およびHTProteolitic200Rを使用した追加のタンパク質分解工程を含むプロセスによるグリアジンの分解を観察するアッセイを実施した。
【0060】
このアッセイでは、水中小麦粉懸濁液を作成し、小麦粉1kgあたり0.4gの酵素N-1000Rを懸濁液に加える第一の実験を実施した。懸濁液を37℃の温度で5時間、絶えず攪拌し続けた。その後、109CFUのラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・サンフランシセンシスを加え、37℃の温度で9時間絶えず攪拌し続けた。最後に、小麦粉1kgあたり1gの酵素HTProteolitic200Rを加え、懸濁液を37℃の温度で5時間絶えず攪拌し続けた。
【0061】
実験を繰り返したが、2回目のタンパク質分解時間のみを10時間に変更した。
【0062】
前記実験から、図6のクロマトグラムが得られ、ここで、異なる濃度の小麦粉Hoja de PlataRのクロマトグラムを文字「A」で示し、本発明の方法で処理した小麦粉のクロマトグラムは文字「B」で示す。同じ図で、分析した小麦粉のグリアジン含有量を示すクロマトグラムの位置を円で示す。
【0063】
【実施例3】
【0064】
3つの発酵プロセスを行った。各プロセスにおいて、水中小麦粉懸濁液を作成し、109CFUの微生物を前記懸濁液に加えた。第一の実験では微生物はラクトバチルス・ブレビスであり、第二の実験では、選択した微生物はラクトバチルス・サンフランシセンシスであり、第三の実験では、バチルス・アミロリケファシエンスであった。各発酵は、絶えず攪拌し続けながら37℃で24時間続けた。その後、分解したグリアジンを液体クロマトグラフィーで定量化した。結果は、ラクトバチルス・サンフランシセンシスについては図7、ラクトバチルス・ブレビスについては図8、バチルス・アミロリケファシエンスについては図9に見ることができる。図中、「A」線はグリアジン標準を示し、「B」線は各微生物によって発酵された小麦粉中のグリアジン濃度を示す。
【0065】
図から明らかなように、グリアジンを分解するのに最適な微生物はバチルス・アミロリケファシエンスである。
【実施例4】
【0066】
酵素加水分解を行うのに必要な操作時間を決定するために研究を行った。この研究では、それぞれ異なるプロテアーゼを使用した2つの小麦グルテン加水分解プロセス中にチロシン放出を定量化した。この実験の目的は、チロシンが定常状態に達するまで、すなわち、停止するまでに必要な加水分解時間を決定することであった。
【0067】
これらの実験では、小麦粉懸濁液中のチロシン含有量を加水分解プロセスで15～30分ごとに定量化した。第一の実験では、130mlの水に4.3gの小麦粉を入れた懸濁液を使用し、0.4gのプロテアーゼN-1000Rを前記懸濁液に加えた。第二の実験では、130mlの水に4.3gのグルテンを含む懸濁液を使用し、1gのプロテアーゼProteolitic200RHTをこの懸濁液に加えた。
【0068】
得られた結果は、プロテアーゼN-1000Rについては図10に、プロテアーゼProteolitic200RHTについては図11にそれぞれ見ることができる。これらの図において、経時的なチロシン濃度が示されており、懸濁液中のチロシン濃度が平均して加水分解の4～8時間で定常状態に達することがはっきりと見てとれる。
【実施例5】
【0069】
本発明のグリアジン分解プロセスにより処理された後の小麦粉に存在するグリアジン濃度を決定するため、前記実施例で言及されたものと同等の条件下でアッセイを行った。
【0070】
この研究では、水中小麦粉懸濁液を作成し、最初に酵素ENZECOR PROTEASE FNPおよびENZECOR FUNGAL PROTEASEを使用した酵素加水分解工程により、ついでバチルス・アミロリケファシエンスを使用した発酵工程により、続いてプロテアーゼENZECOR PROTEASE FNPおよびENZECOR FUNGAL PROTEASEを使用した別の酵素加水分解工程により、最後にラクトバチルス・ブレビスおよびラクトバチルス・デルブルッキーと組み合わせたバチルス・アミロリケファシエンスを使用した第二の発酵により処理した。すべての工程は、絶えず攪拌しながら37℃で行った。
【0071】
加水分解された小麦粉試料は、四分割法によって得た。各レプリカについて200mgの試料を採取し、抽出を改善するためにガラスビーズの付いたFalconチューブに入れた。
【0072】
タンパク質抽出は、70％エタノール溶液で3回洗浄することにより行った。各洗浄は、3mlのエタノール溶液を試料およびガラスビーズ含有チューブに加えて行い、70-RPMの回転インキュベーターで1時間攪拌した。試料を遠心分離した後、ボルテックスを使用して溶媒で再懸濁した。チューブを2500RPMで10分間遠心分離した後、溶媒中の可溶性部分をデカントし、最後に3回の洗浄を組み合わせた別のFalconチューブに抽出物を入れた。
【0073】
各試料の抽出液3mlを0.22μmのメンブレンでろ過し、グリアジン濃度をHPLCで分析した。
【0074】
試料抽出物を、2つの移動相を使用して50℃の温度でHPLC装置に通し、第一の移動相は、99％の水と0.001％トリフルオロ酢酸および1％の水との混合物からなる溶液Aの名前であった。試料の注入後、移動相の流量は0.6ml/分であり、最初の20分間は27％Bから50％Bの勾配で、30分間までは50％Bから75％Bの勾配であり、相Aでの洗浄を10分間行った。100μmの試料またはA相を分析中に注入し、それぞれ洗浄した。210nmに存在するペプチドシグナルは、図12に示すUV検出器を使用して検出され、図中、標準的な小麦粉の液体クロマトグラムは文字「A」で示され、開示した方法により処理した小麦粉の液体クロマトグラムは文字「B」で示されている。
【0075】
図12から、異なるグリアジンに対応する画分（12～17分のRF）は、本発明の方法により処理された小麦粉を有する試料において明らかに消失することが見てとれる。
【0076】
上記に従って、上記に例示した製パン用の小麦粉中のグリアジンの分解方法の好ましい実施形態は、例示のみを目的として記載されており、本発明を限定するものではないことは当業者には明らかであろう、なぜなら、本発明の原理に従って設計されている限り、当業者は、それに多数の変更を加えることができるからである。
【0077】
したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に従って、本明細書に含まれる概念から当業者が提起することができるすべての実施形態を含む。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
