特許 7057956 分析方法、吸着防止剤および分析用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-13

(45)【発行日】2022-04-21

(54)【発明の名称】分析方法、吸着防止剤および分析用キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/26 20060101AFI20220414BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20220414BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20220414BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20220414BHJP

【ＦＩ】

G01N30/26 A

G01N30/88 D

G01N30/72 C

G01N27/62 V

G01N27/62 X

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020553977

(86)(22)【出願日】2019-10-30

(86)【国際出願番号】 JP2019042574

(87)【国際公開番号】W WO2020090887

(87)【国際公開日】2020-05-07

【審査請求日】2021-04-13

(31)【優先権主張番号】P 2018207620

(32)【優先日】2018-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発／高生産性微生物創製に資する情報解析システムの開発に係る委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504150450

【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100093056

【弁理士】

【氏名又は名称】杉谷 勉

(74)【代理人】

【識別番号】100142930

【弁理士】

【氏名又は名称】戸高 弘幸

(74)【代理人】

【識別番号】100175020

【弁理士】

【氏名又は名称】杉谷 知彦

(74)【代理人】

【識別番号】100180596

【弁理士】

【氏名又は名称】栗原 要

(74)【代理人】

【識別番号】100195349

【弁理士】

【氏名又は名称】青野 信喜

(72)【発明者】

【氏名】藤戸 由佳

(72)【発明者】

【氏名】服部 考成

(72)【発明者】

【氏名】蓮沼 誠久

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５２８５４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６１－０４７５６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０１９９８４８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００８－３０９７７８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００ －３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１－２０／２９２

Ｇ０１Ｎ ２７／６０ －２７／９２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐための吸着防止剤を含む移動相を用いて液体クロマトグラフィを行うことと、
前記液体クロマトグラフィの溶出液を質量分析することと
を備え、
前記吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含む分析方法。

【請求項2】

請求項１に記載の分析方法において、
前記リン酸基を有する化合物は、核酸、ヌクレオチドおよびこれらの誘導体の少なくとも一つである分析方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の分析方法において、
前記試料は、細胞からの抽出物を含む分析方法。

【請求項4】

請求項１または２に記載の分析方法において、
前記シュウ酸またはその塩の濃度は、０．１ｍＭ以上５０ｍＭ以下である分析方法。

【請求項5】

請求項１または２に記載の分析方法において、
前記質量分析では、エレクトロスプレー法により前記試料がイオン化される分析方法。

【請求項6】

シュウ酸またはその塩を含み、
液体クロマトグラフィ／質量分析の移動相に添加され、
リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐための吸着防止剤。

【請求項7】

請求項６に記載の吸着防止剤を含む分析用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分析方法、吸着防止剤および分析用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

リン酸基を有する化合物は、細胞内等において重要な役割を果たしている。例えば、リン酸基を介したホスフォジエステル結合により核酸塩基が連結されてなる核酸は、遺伝情報をコードする。ヌクレオチドのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、リン酸基同士の結合に蓄えられたエネルギーを利用して、様々な反応に関与する。

【0003】

リン酸基を有する化合物の分析は、生体等の機能や疾患の原因となる異常の解析等に重要である。例えば、細胞の代謝物を定量することにより、細胞における物質の生成や分解についての情報を得ることができる。

【0004】

細胞の代謝物の分析のような、複数の化合物を含む試料の分析では、液体クロマトグラフィ／質量分析（以下、適宜ＬＣ／ＭＳと呼ぶ）により複数の化合物を分離して分析することが行われている。しかし、試料に含まれる一部の化合物が、液体クロマトグラフの配管等に金属吸着を起こし、このために検出の感度が低下する問題があった。例えば、非特許文献１には、テトラサイクリン系抗生物質が金属吸着により液体クロマトグラフィにおいてテーリングを引き起こすのを防ぐため、シュウ酸を移動相に加える点が記載されている。非特許文献１の方法では、大気圧化学イオン化によりシュウ酸を分解して質量分析計の汚染や目詰まりを防いでいる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】岡、外２名、「ＬＣ／ＭＳによる食品分析」、ＨＰＣニュース、林純薬工業株式会社、平成１４年１月１３日、第２８巻、ｐ．１－１１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

液体クロマトグラフにおいて、従来のギ酸を含む移動相では、ヌクレオチド等のリン酸基を有する化合物が配管等で金属吸着を起こすことがあった。そのため、これらの化合物が分析カラムまで到達せず感度が低下したり、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）が悪化して精度が低下する問題があった。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の第１の態様によると、分析方法は、リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐための吸着防止剤を含む移動相を用いて液体クロマトグラフィを行うことと、前記液体クロマトグラフィの溶出液を質量分析することとを備え、前記吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含む。
本発明の第２の態様によると、第１の態様の分析方法において、前記リン酸基を有する化合物は、核酸、ヌクレオチドおよびこれらの誘導体の少なくとも一つであることが好ましい。
本発明の第３の態様によると、第１または第２の態様の分析方法において、前記試料は、細胞からの抽出物を含むことが好ましい。
本発明の第４の態様によると、第１から第３までのいずれかの態様の分析方法において、前記シュウ酸またはその塩の濃度は、０．１ｍＭ以上５０ｍＭ以下であることが好ましい。
本発明の第５の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の分析方法において、前記質量分析では、エレクトロスプレー法により前記試料がイオン化されることが好ましい。
本発明の第６の態様によると、吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含み、液体クロマトグラフィ／質量分析の移動相に添加され、リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐためのものである。
本発明の第７の態様によると、分析用キットは、第６の態様の吸着防止剤を含む。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、液体クロマトグラフィで分離されたヌクレオチド等のリン酸基を有する化合物を、質量分析において感度よく、または精度よく検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、一実施形態に係る分析装置を説明するための概念図である。

【図2】図２は、一実施形態に係る分析用キットを模式的に示す概念図である。

【図3】図３は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。

【図4】図４（Ａ）は、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）を含む試料に対し、ギ酸を含む移動相を用いて液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を行った際に得られたマススペクトルであり、図４（Ｂ）は、ＣＴＰを含む試料に対し、シュウ酸を含む移動相を用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った際に得られたマススペクトルである。

【図5】図５は、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）を含む試料、および、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）を含む試料に対し、ギ酸を含む移動相、および、シュウ酸を含む移動相を用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った際の試料の検出強度を示す表である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。

【0011】

－第１実施形態－
従来、細胞内の代謝物の分析等、複数の化合物を含む試料をＬＣ／ＭＳ（以下、「ＬＣ／ＭＳ」は２段階以上の質量分析を行う場合も含む）に供する際、イオン化を補助する目的でギ酸を含む移動相を用いていた。しかし、移動相にギ酸を用いる従来の方法では、上述のようにヌクレオチド等のリン酸基を有する化合物が配管等で金属吸着を起こす問題があった。本実施形態の分析方法では、シュウ酸を含む移動相を用いてＬＣ／ＭＳを行うことにより、リン酸基を有する化合物を感度よく分析するものである。

【0012】

（試料について）
試料は、リン酸基を有する化合物を含む試料であれば特に限定されない。当該化合物がリン酸基をより多く有する程、金属への吸着性が高まるため本実施形態の分析方法を好適に適用することができる。分析対象としての重要性から、試料に含まれるリン酸基を有する化合物としては、核酸、ヌクレオチドおよびこれらの誘導体の少なくとも一つが好ましい。当該誘導体は、リン酸基が存在すればその誘導体化の方法は特に限定されない。

【0013】

試料は、生物から採取されたものが、様々な物質を含みＬＣ／ＭＳによる分離分析が効果的に適用される点で好ましい。しかし、人工的に合成された核酸、ヌクレオチドまたはこれらの誘導体等、生物に由来しないものでもよい。試料は、細胞からの抽出物であることが、細胞に含まれる成分をＬＣ／ＭＳにより効果的に分離して分析できるためにより好ましい。試料は細胞の代謝物を含むことが、代謝反応に関わるリン酸基を有する化合物を好適に分析できるためにさらに好ましい。

【0014】

（前処理について）
試料の前処理の方法は、分析対象の成分を含むように分析用試料が調製され、ＬＣ／ＭＳが所望の精度で行われれば特に限定されない。前処理では、採取された試料から、分析対象の成分を含むように抽出や、濃縮等の精製が適宜行われる。試料が生物に由来する細胞や組織であって代謝物を分析する場合、例えば、破砕等により細胞質成分を分離した後、メタノール・クロロホルム抽出法等により親水性代謝物の抽出を行い、抽出された親水性代謝物の濃縮を行う。得られた溶液は適宜希釈されて液体クロマトグラフに導入される。

【0015】

（分析装置について）
本実施形態の分析方法における液体クロマトグラフィおよび質量分析は、液体クロマトグラフ－質量分析計を分析装置として行われることが好ましいが、別々に制御された液体クロマトグラフおよび質量分析計を用いた場合でも分析を行うことは可能である。

【0016】

図１は、本実施形態の分析方法に係る分析装置の構成を示す概念図である。分析装置１は、測定部１００と、情報処理部４０とを備える。測定部１００は、液体クロマトグラフ１０と、質量分析計２０とを備える。

【0017】

液体クロマトグラフ１０は、移動相容器１１ａ，１１ｂと、送液ポンプ１２ａ，１２ｂと、試料導入部１３と、分析カラム１４とを備える。質量分析計２０は、イオン化部２１１を備えるイオン化室２１と、イオンレンズ２２１を備える第１真空室２２ａと、イオン化室２１から第１真空室２２ａへイオンを導入する管２１２と、イオンガイド２２２を備える第２真空室２２ｂと、第３真空室２２ｃとを備える。第３真空室２２ｃは、第１質量分離部２３と、コリジョンセル２４と、第２質量分離部２５と、検出部３０とを備える。コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０とＣＩＤガス導入口２４１とを備える。

【0018】

情報処理部４０は、入力部４１と、通信部４２と、記憶部４３と、出力部４４と、制御部５０とを備える。制御部５０は、装置制御部５１と、解析部５２と、出力制御部５３とを備える。

【0019】

液体クロマトグラフ１０は、導入された試料Ｓを液体クロマトグラフィにより分離する。液体クロマトグラフ１０は、所望の精度で試料を分離することができれば特にその種類は限定されない。液体クロマトグラフ１０として、ナノＬＣ、マイクロＬＣ、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）および超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）等を用いることができる。

【0020】

移動相容器１１ａおよび１１ｂは、バイアルやボトル等の液体を格納可能な容器を備え、それぞれ異なる組成の移動相を格納する。移動相容器１１ａおよび１１ｂに格納されている移動相をそれぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂと呼ぶ。

【0021】

移動相Ａおよび移動相Ｂの少なくとも一方は、シュウ酸を含む。移動相Ａまたは移動相Ｂに含まれるシュウ酸の濃度は、０．１ｍＭ以上が好ましく、０．５ｍＭ以上がより好ましい。シュウ酸の濃度が高い程、リン酸基を有する化合物の金属吸着を大きく抑制することができる。言い換えれば、シュウ酸は、リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐための吸着防止剤として機能する。シュウ酸の濃度が高すぎると質量分析における感度が低下するため、移動相Ａまたは移動相Ｂに含まれるシュウ酸の濃度は、５０ｍＭ以下が好ましく、１０ｍＭ以下がより好ましい。移動相Ａおよび移動相Ｂのシュウ酸の濃度が略同一であることが好ましい。
なお、移動相は、シュウ酸の塩を含んでもよい。

【0022】

移動相Ａおよび移動相Ｂの溶媒の種類は特に限定されず、水系溶媒と有機溶媒との比が移動相Ａと移動相Ｂとで異なるように移動相の組成が定められる。例えば、移動相Ａの溶媒を水とし、移動相Ｂの溶媒をアセトニトリルとすることができる。

【0023】

送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂを所定の流量になるように送液する。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂからそれぞれ出力された移動相Ａおよび移動相Ｂは、流路の途中で混合され、試料導入部１３へと導入される。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂの流量を変化させることにより、時間によって分析カラム１４に導入される移動相の組成を変化させる。

【0024】

試料Ｓの導入等の分析の開始に対応する時点からの各時間における、移動相の組成を示す情報をグラジエントプログラムと呼ぶ。グラジエントプログラムに基づいて送液ポンプ１２ａおよび１２ｂが制御され、設定された組成の移動相が分析カラム１４に導入される。グラジエントプログラムに対応するデータは、記憶部４３に記憶されており、装置制御部５１が当該データを参照して送液ポンプ１２ａおよび１２ｂを制御する。

【0025】

試料導入部１３は、オートサンプラー等の試料導入装置を備え、前処理により調製された分析用の試料Ｓを移動相に導入する（矢印Ａ１）。試料導入部１３により導入された試料Ｓは、適宜不図示のガードカラムを通過して分析カラム１４に導入される。

【0026】

分析カラム１４は、固定相を備え、導入された試料Ｓに含まれる各成分を、当該成分の移動相と固定相とに対する親和性の違いを利用して異なる保持時間に溶出させる。分析カラム１４の種類は、所望の精度で試料Ｓの各成分を分離することができれば特に限定されないが、ＰＦＰＰ（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｐｏｐｙｌ）カラムが塩基、窒素またはアミン等を好適に分離する観点から好ましい。ＰＦＰＰカラムは、固定相にペンタフルオロフェニルプロピル基を含むカラムである。分析カラム１４は、充填剤に金属を含むものが試料の金属吸着を起こしやすく、本実施形態の分析方法が好適に適用されるため好ましい。

【0027】

分析カラム１４から溶出された溶出液は、質量分析計２０のイオン化部２１１に導入される。分析カラム１４の溶出液は、分析装置１のユーザー（以下、単に「ユーザー」と呼ぶ）による分注等の操作を必要とせず、オンライン制御により質量分析計２０に入力されることが好ましい。

【0028】

質量分析計２０は、分析カラム１４から導入された溶出試料に対してタンデム質量分析を行い試料の各成分、特にリン酸基を有する化合物に対応するイオンを分析対象として検出する。溶出試料がイオン化されて得られた試料イオンＳｉの経路を、一点鎖線の矢印Ａ２により模式的に示した。ここで、試料イオンＳｉは、試料イオンＳｉの解離により生じたイオンも含んで指すこととする。
なお、質量分析計２０の各部の構成は、試料イオンＳｉを所望の精度で検出可能であれば特に限定されない。

【0029】

質量分析計２０のイオン化部２１１は、導入された溶出試料をイオン化する。イオン化の方法は、所望の精度で分析対象の成分が検出される程度に溶出試料がイオン化されれば特に限定されないが、本実施形態のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行う場合にはエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）が好ましく、以下の実施形態でもＥＳＩを行うものとして説明する。イオン化部２１１から出射され生成された試料イオンＳｉは、イオン化室２１と第１真空室２２ａとの間の圧力差等により移動し、管２１２を通過して第１真空室２２ａに入射する。

【0030】

第１真空室２２ａ、第２真空室２２ｂおよび第３真空室２２ｃは、不図示の真空ポンプによりそれぞれ排気され、この順に真空度が高くなっており、第３真空室２２ｃでは例えば１０^－２Ｐａ以下等の高真空まで排気されている。第１真空室２２ａに入射したイオンは、イオンレンズ２２１を通過して第２真空室２２ｂに導入される。第２真空室２２ｂに入射したイオンは、イオンガイド２２２の間を通過して第３真空室２２ｃに導入される。第３真空室２２ｃに導入されたイオンは、第１質量分離部２３へと出射される。第１質量分離部２３に入射するまでの間に、イオンレンズ２２１やイオンガイド２２２等は、通過するイオンを電磁気学的作用により収束させる。

【0031】

第１質量分離部２３は、四重極マスフィルタを備え、四重極マスフィルタに印加される電圧に基づく電磁気学的作用により、設定されたｍ／ｚ（一定の係数の違いを除き質量電荷比に対応）を有するイオンをプリカーサーイオンとして選択的に通過させてコリジョンセル２４に向けて出射する。第１質量分離部２３は、分析対象の試料イオンＳｉをプリカーサーイオンとして選択的に通過させる。

【0032】

コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０によりイオンの移動を制御しながら、衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）により分析対象の試料イオンＳｉを解離させ、フラグメントイオンを生成する。ＣＩＤの際にイオンが衝突させられるアルゴンや窒素等を含むガス（以下、ＣＩＤガスと呼ぶ）は、コリジョンセル内で所定の圧力になるようにＣＩＤガス導入口２４１から導入される（矢印Ａ３）。生成されたフラグメントイオンを含む試料イオンＳｉは、第２質量分離部２５に向けて出射される。

【0033】

第２質量分離部２５は、四重極マスフィルタを備え、四重極マスフィルタに印加される電圧に基づく電磁気学的作用により、設定されたｍ／ｚを有するフラグメントイオンを選択的に通過させて検出部３０に向けて出射する。

【0034】

検出部３０は、二次電子増倍管や光電子増倍管等のイオン検出器を備え、入射したフラグメントイオンを検出する。検出モードは正イオンを検出する正イオンモードと、負イオンを検出する負イオンモードとのいずれでもよい。フラグメントイオンを検出して得た検出信号は不図示のＡ／Ｄ変換器によりＡ／Ｄ変換され、デジタル信号となって情報処理部４０の制御部５０に測定データとして入力される（矢印Ａ４）。

【0035】

情報処理部４０は、電子計算機等の情報処理装置を備え、適宜ユーザーとのインターフェースとなる他、様々なデータに関する通信、記憶、演算等の処理を行う。情報処理部４０は、測定部１００の制御や、解析、表示の処理を行う情報処理装置となる。
なお、情報処理部４０は、液体クロマトグラフ１０および質量分析計２０と一体になった一つの装置として構成してもよい。また、本実施形態の分析方法に用いるデータの一部は遠隔のサーバ等に保存してもよく、当該分析方法で行う演算処理の一部は遠隔のサーバ等で行ってもよい。測定部１００の各部の動作の制御は、情報処理部４０が行ってもよいし、各部を構成する装置がそれぞれ行ってもよい。

【0036】

情報処理部４０の入力部４１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、検出するイオンのｍ／ｚの値等の制御部５０が行う処理に必要な情報等を、ユーザーから受け付ける。

【0037】

情報処理部４０の通信部４２は、インターネット等のネットワークを介して無線や有線の接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部４２は、測定部１００の測定に必要なデータを受信したり、解析部５２の解析結果等の制御部５０が処理したデータを送信したり、適宜必要なデータを送受信する。

【0038】

情報処理部４０の記憶部４３は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部４３は、測定部１００から出力された測定データ、および制御部５０が処理を実行するためのプログラム等を記憶する。

【0039】

情報処理部４０の出力部４４は、出力制御部５３により制御され、液晶モニタ等の表示装置およびプリンターの少なくとも一つを含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、解析部５２の解析結果に対応する情報等を、表示装置に表示したり印刷媒体に印刷して出力する。

【0040】

情報処理部４０の制御部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成される。制御部５０は、測定部１００の制御や、測定部１００から出力された測定データを解析する等、記憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行う。

【0041】

処理部５０の装置制御部５１は、入力部４１を介した入力等に応じて設定された分析条件等に基づいて、測定部１００の測定動作を制御する。装置制御部５１は、送液ポンプ１２ａおよび１２ｂの流量を制御したり、コリジョンセル２４での解離を制御したり、第１質量分離部２３および第２質量分離部２５で選択的に通過させるイオンのｍ／ｚ値を制御したり等する。

【0042】

解析部５２は、測定部１００から出力された測定データに基づいて試料における分析対象の成分の定量等の解析を行う。解析部５２は、検出部３０から出力された測定データから分析対象の成分に対応する検出強度を取得して記憶部４３等に記憶させる。

【0043】

解析部５２は、内部標準を測定した場合、分析対象の成分に対応する検出強度を、内部標準に対応する検出強度で割った比に、導入された当該内部標準の濃度を掛けた値を、各成分の量として算出する。内部標準を用いない場合は、基準となる物質または物質群の検出強度で規格化等した規格化強度を算出してもよい。また、解析部５２は、保持時間と検出強度とを対応させたクロマトグラムに対応するデータを作成する。
なお、解析部５２による解析の方法は特に限定されない。

【0044】

出力制御部５３は、分析条件についての情報や、解析部５２の解析により得られた情報等を含む出力画像を作成し、出力部４４に出力させる。

【0045】

（分析用キット）
図２は、本実施形態の分析方法に用いられる分析用キットを模式的に示す図である。分析用キット９は、リン酸基を有する化合物を含む試料Ｓの金属への吸着を防ぐための吸着防止剤９０を備え、吸着防止剤９０は、シュウ酸またはその塩を含む。吸着防止剤９０は、バイアル９１に格納されているが、吸着防止剤９０を格納する容器の種類、大きさおよび形状は特に限定されない。
なお、分析用キット９は、吸着防止剤９０の他に液体クロマトグラフィや質量分析に用いられる任意の消耗品等を含むことができる。

【0046】

図３は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、分析者やユーザー等により、試料Ｓが用意される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、分析者やユーザー等により、試料の前処理が行われる。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。

【0047】

ステップＳ１００５において、液体クロマトグラフ１０は、シュウ酸またはその塩を含む移動相を用いて、試料Ｓを液体クロマトグラフィにより分離する。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、質量分析計２０は、液体クロマトグラフィに供した試料Ｓを質量分析する。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。

【0048】

ステップＳ１００９において、解析部５２は、質量分析により得られた測定データの解析を行う。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。ステップＳ１０１１において、出力部４４は、解析により得られた情報を出力する。ステップＳ１０１１が終了したら、処理が終了される。

【0049】

上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の分析方法は、リン酸基を有する化合物を含む試料Ｓの金属への吸着を防ぐための吸着防止剤を含む移動相を用いて液体クロマトグラフィを行うことと、液体クロマトグラフィの溶出液を質量分析することとを備え、吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含む。これにより、液体クロマトグラフィにおいてヌクレオチド等のリン酸基を有する化合物の金属吸着を抑制し、質量分析において感度よく、または精度よくこれらの化合物を検出することができる。

【0050】

（２）本実施形態の分析方法において、質量分析では、エレクトロスプレー法により試料Ｓがイオン化される。これにより、生体等に含まれる様々な分子量の分子を、壊さずに好適にイオン化することができる。

【0051】

（３）本実施形態に係る吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含み、液体クロマトグラフィ／質量分析の移動相に添加され、リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐためのものである。これにより、液体クロマトグラフィにおいてヌクレオチド等のリン酸基を有する化合物の金属吸着を抑制し、質量分析において感度よくまたは精度よくこれらの化合物を検出することができる。

【0052】

（４）本実施形態に係る分析用キットは、吸着防止剤９０を含む。これにより、上述の分析を迅速に行うことができる。

【0053】

次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。以下の変形例において、上述の実施形態と同様の構造、機能を示す部位に関しては、同一の符号で参照し、適宜説明を省略する。
（変形例１）
上述の実施形態の分析装置１はトリプル四重極質量分析計としたが、質量分析部２０の構成は特に限定されない。質量分析部２０は、１つの質量分析器からなる質量分離部を備えてもよいし、上述の実施形態とは異なる組合せの２以上の質量分析器からなる質量分離部を備えてもよい。例えば、分析装置１は、イオントラップや飛行時間型の質量分離部を含んで構成することができる。

【0054】

解離の方法も上述のＣＩＤに限定されず、光誘起解離、電子捕獲解離、または電子移動解離等、分析装置１の種類や分析対象の分子の特性に合わせて適宜選択することができる。

【0055】

本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。

【実施例】

【0056】

以下の実施例では、既知の濃度のヌクレオチドを含む試料に対し、ギ酸を含む移動相およびシュウ酸を含む移動相をそれぞれ用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った結果が説明される。
なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。

【0057】

（比較例１）
比較例１では、０．１体積％のギ酸が添加された移動相を用いて、０．１μＭ ＣＴＰ溶液を分析した。

【0058】

液体クロマトグラフィの条件
分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：ＮｅｘｅｒａＸ２（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
分析カラム： Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｆ５－３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径３μｍ）
注入量： ３μＬ
カラム温度： ４０℃
移動相：
（Ａ）０．１％ギ酸（水に溶解）
（Ｂ）０．１％ギ酸（アセトニトリルに溶解）
流速： ０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分） 移動相Ｂの濃度（％）
０ ０
２ ０
５ ２５
１１ ３５
１５ ９５
２０ ９５
２０．１ ０
３５ ０

【0059】

質量分析の条件
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム：ＬＣＭＳ－８０５０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
イオン化の方法： エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード： 多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
温度：
脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度： ２５０℃
ヒートブロック温度： ４００℃
インターフェイス温度： ３００℃
ガス流量：
ネブライザーガス流量： ３．０Ｌ／ｍｉｎ
ドライングガス流量： １０．０Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量： １０．０Ｌ／ｍｉｎ

【0060】

ＣＴＰに対応するイオンとして、ｍ／ｚ ４８３．９０のプリカーサーイオンを分離し、ＣＩＤに供した後、ｍ／ｚ １１２．２０のプロダクトイオンを分離して検出した。

【0061】

図４（Ａ）は、比較例１の質量分析により得られたマスクロマトグラムである。各ピークの強度は非常に小さく、実質的にＣＴＰを検出することはできなかった。

【0062】

（実施例１）
実施例１では、１０ｍＭのシュウ酸が添加された移動相を用いて、０．１μＭ ＣＴＰ溶液を分析した。

【0063】

液体クロマトグラフィの条件
分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：ＮｅｘｅｒａＸ２（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
分析カラム： Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｆ５－３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径３μｍ）
注入量： ３μＬ
カラム温度： ４０℃
移動相：
（Ａ）１０ｍＭシュウ酸（水に溶解）
（Ｂ）１０ｍＭシュウ酸（アセトニトリルに溶解）
流速： ０．３ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分） 移動相Ｂの濃度（％）
０ ０
３ ０
９ １００
１３ １００
１３．０１ ０
１７ ０

【0064】

質量分析の条件
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム：ＬＣＭＳ－８０５０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
イオン化の方法： エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード： ＭＲＭ
温度：
脱溶媒管（ＤＬ）温度： ２５０℃
ヒートブロック温度： ４００℃
インターフェイス温度： ３００℃
ガス流量：
ネブライザーガス流量： ３．０Ｌ／ｍｉｎ
ドライングガス流量： １０．０Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量： １０．０Ｌ／ｍｉｎ

【0065】

ＣＴＰに対応するイオンとして、ｍ／ｚ ４８３．９０のプリカーサーイオンを分離し、ＣＩＤに供した後、ｍ／ｚ １１２．２０のプロダクトイオンを分離して検出した。

【0066】

図４（Ｂ）は、実施例１の質量分析により得られたマスクロマトグラムである。実施例１では、比較例１の各ピークに比べると非常に大きな、ＣＴＰに対応するピークを検出することができた。また、実施例１ではノイズの顕著な増加も観察されず、Ｓ／Ｎ比も上昇した。

【0067】

（比較例２）
比較例２では、０．１体積％のギ酸が添加された移動相を用い、比較例１の場合と略同様の条件で、０．１μＭ シチジン二リン酸（ＣＤＰ）溶液および０．１μＭ グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）溶液をそれぞれ分析した。質量分析ではＣＤＰおよびＧＤＰをそれぞれ検出するようにトランジションを設定した。

【0068】

（実施例２）
実施例２では、１０ｍＭのシュウ酸が添加された移動相を用い、実施例１の場合と略同様の条件で、０．１μＭ ＣＤＰ溶液および０．１μＭ ＧＤＰ溶液をそれぞれ分析した。質量分析ではＣＤＰおよびＧＤＰをそれぞれ検出するようにトランジションを設定した。

【0069】

図５は、比較例２および実施例２の結果を示す表である。試料の検出強度として、バックグラウンドを除去した後の試料に対応するピークの面積を示した。ＣＤＰおよびＧＤＰは、リン酸基の数がＡＴＰよりも少なく、金属吸着による悪影響もより少ないと考えられるが、これらの分子を試料とした場合でも、シュウ酸系移動相を用いることでギ酸系移動相を用いた場合よりも感度を高くすることができた。

【0070】

次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
日本国特許出願２０１８年第２０７６２０号（２０１８年１１月２日出願）

【符号の説明】

【0071】

１…分析装置、９…分析用キット、１０…液体クロマトグラフ、１１ａ，１１ｂ…移動相容器、１４…分析カラム、２０…質量分析計、２１…イオン化室、２３…第１質量分離部、２４…コリジョンセル、２５…第２質量分離部、３０…検出部、４０…情報処理部、５０…制御部、５１…装置制御部、５２…解析部、５３…出力制御部、９０…吸着防止剤、１００…測定部、２１１…イオン化部、Ｓ…試料、Ｓｉ…試料イオン。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】