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特許7057976被験体において胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-13
(45)【発行日】2022-04-21
(54)【発明の名称】被験体において胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/155 20060101AFI20220414BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20220414BHJP
A61K 31/223 20060101ALI20220414BHJP
A61K 31/4174 20060101ALI20220414BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20220414BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220414BHJP
【ＦＩ】
A61K31/155
A61K31/198
A61K31/223
A61K31/4174
A61P9/14
A61P43/00 111
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2018566633
(86)(22)【出願日】2016-12-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-04-11
(86)【国際出願番号】 EP2016082925
(87)【国際公開番号】W WO2017153023
(87)【国際公開日】2017-09-14
【審査請求日】2019-12-25
(31)【優先権主張番号】16382103.6
(32)【優先日】2016-03-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】515057883
【氏名又は名称】セントロ ナショナル デ インベスティガシオネス カルディオバスキュラレス カルロス テルセーロ （エフェ．エセ．ペ．）
(73)【特許権者】
【識別番号】504339734
【氏名又は名称】コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス
(73)【特許権者】
【識別番号】518320797
【氏名又は名称】ウニベルシダ アウトノマ デ マドリード
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】レドンド モジャ ファン ミゲル
(72)【発明者】
【氏名】メンデス－バルベロ ネレア
(72)【発明者】
【氏名】オジェル ペドロサ ホルヘ
(72)【発明者】
【氏名】カンパネーロ ガルシア ミゲル ラモン
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】Vascular Pharmacology，2010年，Volume 52, No. 12，p. 37-45
【文献】Br J Pharmacol，2007年，Vol. 150，p. 1075-1083，doi: 10.1038/sj.bjp.0707181
【文献】Br J Pharmacol，2005年，Vol. 145, No. 3，p. 301-312，doi: 10.1038/sj.bjp.0706168.
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｐ ９／１４
Ａ６１Ｋ ３１／００
Ａ６１Ｋ ４５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者における胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療的な処置のために用いられるｉＮＯＳ阻害剤を含む組成物であって、前記ｉＮＯＳ阻害剤が、１４００Ｗ、Ｌ－ＮＡＭＥ、ＧＷ２７４１５０、ＧＷ２７３６２９、塩酸アミノグアニジン（ＡＧ）、Ｌ－ＮＩＬ、及びクロトリマゾールからなる群から選択される、前記組成物。
【請求項2】
前記患者が、大動脈二尖弁；マルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）等の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）、無症候性ＴＡＡ、又はＡｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる大動脈障害と関連する任意の他の疾患からなる一群から選択される疾患を患っている、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記患者が、マルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）等の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）、又は無症候群ＴＡＡからなる一群から選択される疾患を患っている、請求項１又は２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項4】
前記患者がマルファン症候群（ＭＦＳ）を患っている、請求項１又は２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記患者がヒト患者である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
ＴＡＡの進行が制限される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ＴＡＡの進行が復調される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記ｉＮＯＳ阻害剤が、ＧＷ２７４１５０である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記患者が、マルファン症候群を患っており、かつＴＡＡの進行が復調される、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、所与の疾患又は障害を同定するため及び該疾患又は障害を治療するため特異的バイオマーカーが使用される、オーダーメイド医療の分野に含まれ得る。特に、バイオマーカーＡＤＡＭＴＳ１は、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ：thoracic aortic aneurysm）を引き起こす疾患、好ましくはマルファン症候群を発症するリスクがあるヒト被験体を同定するため、本発明において使用される。
【背景技術】
【0002】
大動脈瘤（ＡＡ：Aortic aneurysm）は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ：vascular smooth muscle cell）の機能不全及び不利な細胞外マトリックスのリモデリングを特徴とし、それらが合わさって、血管壁の拡張、解離及び破損が起こりやすくなる。ＡＡは、しばしば破損するまで症状が無く、著しい罹患率及び死亡率をもたらす。少なくともより全身性の大動脈障害（aortopathy）がない状態において、腹部ＡＡ（ＡＡＡ：abdominal AA）の十分原因として単一の遺伝子又は遺伝子座は同定されていない。対照的に、胸部ＡＡ（ＴＡＡ：thoracic AA）は、家族性の遺伝性素因との関係が深く、高い浸透率（penetrance）を示す遺伝子変異体を伴う。家族性ＴＡＡ及び解離（ＦＴＡＡＤ：Familial TAA and dissections）は、全身性の結合組織障害（症候性ＦＴＡＡＤ）の特徴とは別に又はそれと共に現れる。マルファン症候群（ＭＦＳ）の患者及びマウスモデルは、骨格、肺、筋肉及び眼の異常を示す。
【0003】
症候性及び無症候性のＦＴＡＡＤは、ＴＧＦβシグナル伝達の増加と関連する。ＴＧＦβ活性化は、肥大し、脆くなった中膜（medial layer）、線維症、プロテオグリカン蓄積、並びに弾性線維の組織崩壊及び断裂を特徴とするＴＡＡの典型的な組織病理学的特徴である、大動脈中膜変性を引き起こすと提唱されている。しかしながら、ＴＧＦβ活性化がＦＴＡＡＤの原因であるのか又は結果であるのかは明らかではない。
【0004】
大動脈のサイズが大きくなるに従って大動脈の解離又は破裂のリスクが上昇することから、主な治療目標は、構造変化を大動脈の壁に制限し、動脈瘤の成長を遅くすることである。ＴＡＡにおけるＴＧＦβの病原性の役割と一致して、中和抗ＴＧＦβ抗体は大動脈の拡張を予防し、軽度ＭＦＳのマウスモデルにおいて弾性ラメラ断裂を抑制する。また同じモデルにおいて、これらのプロセスは、ＴＧＦβシグナル伝達を阻害するアンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ－ＩＩ）Ｉ型受容体（ＡＴ１Ｒ）アンタゴニストであるロサルタンによって阻害される。しかしながら、ロサルタンは重篤なＭＦＳモデルではそれほど有効ではなく、無作為化臨床試験では、ロサルタンは、大動脈起始部肥大の速度減少においてベータ遮断薬のアテノロールよりも有効ではなく、アテノロールとの二剤併用療法は追加的な利益を生まなかった。
【0005】
臨床試験におけるロサルタンの期待外れの成果にもかかわらず、Ａｎｇ－ＩＩ及びＡＴ１ＲはマウスモデルにおけるＴＡＡ及びＡＡＡの発症及び進行に関与することは明らかなようである。Ａｎｇ－ＩＩが動脈瘤を促進する機構についてはほとんど知られていない。しかしながら、本発明の発明者らは最近、Ａｎｇ－ＩＩ及び血管リモデリングと関連する他の刺激が、ＡＴ１ＲによってＡＤＡＭＴＳ１（トロンボスポンジンモチーフ１を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 1））の大動脈での発現を誘導するよう作用することを示した。プロテオグリカン分解性ＡＤＡＭＴＳメタロプロテイナーゼファミリーメンバーであるＡＤＡＭＴＳ１は、組織リモデリング、排卵、創傷治癒及び血管新生に関与する。ＡＤＡＭＴＳ１は、発生の間及び成年期の大動脈内皮及び血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ：vascular smooth muscle cell）、並びにアテローム性動脈硬化の病変で発現される。また、Ａｄａｍｔｓ１はＴＡＡ組織でも発現され、バーシカン及びアグリカンを切断する、正常な大動脈組織において活性である。Ａｄａｍｔｓ１－／－マウスは、先天性腎奇形及び高い周産期死亡率を有するが、血管表現型は報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
Ａｎｇ－ＩＩ誘導性ＡＡのメディエーターとしてのＡｄａｍｔｓ１の可能性のある役割を調査するため、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウス及び標的化ノックダウンに基づく大動脈Ａｄａｍｔｓ１欠損のモデルを使用した。本発明者らのデータは、予想外にも、Ａｄａｍｔｓ１欠損はＡｎｇ－ＩＩ誘導性動脈瘤を抑制せず、それどころか、全て大動脈セグメントを冒すＭＦＳに類似する重篤な大動脈障害を誘導することを示している。ＡＤＡＭＴＳ１はＭＦＳでは弱く発現され、ＭＦＳの大動脈表現型におけるＡｄａｍｔｓ１欠損に対する役目を示す。本明細書に示されるノックダウンモデルによる結果は、動脈瘤形成の病因において一酸化窒素（ＮＯ）に関する極めて重要な役割を明らかにし、ＭＦＳと関連付けたことから、ＴＡＡ及びＴＡＡ関連疾患に対する新たな治療方法を提供する。さらに、本発明は、ＴＡＡ関連疾患をマルファン症候群又はＦＴＡＡＤと診断するのに有用なデータを得るための解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）又はＴＡＡを引き起こす疾患を発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ、又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンを測定することと、
ｂ）スクリーニングされる被験体の少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の上記発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ、又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンを、既に確立されている発現パターン又は発現レベルと比較することと、
を含み、ここで、既に確立されている発現パターン又は発現レベルに対する比較において、少なくともＡＤＡＭＴＳ１、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ、及び／又はアグリカンネオエピトープの発現減少、及び／又は少なくともｉＮＯＳ、アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、及び／又はヘパリン結合ＥＧＦの過剰発現が、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）又はＴＡＡを引き起こす疾患の指標である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
（ａ）少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ、又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンを測定することと、
ｂ）スクリーニングされる被験体の少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の上記発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ、又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンを、既に確立されている発現パターン又は発現レベルと比較することと、
を含み、ここで、既に確立されている発現パターン又は発現レベルに対する比較において、少なくともＡＤＡＭＴＳ１、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ、及び／又はアグリカンネオエピトープの発現減少、及び／又は少なくともｉＮＯＳ、アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、及び／又はヘパリン結合ＥＧＦの過剰発現が、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）又はＴＡＡを引き起こす疾患の指標である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【0008】
さらに、本発明は、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療、予防又は抑制を必要とする被験体におけるかかる治療、予防又は抑制の方法であって、ｉＮＯＳ遮断薬又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを上記被験体に投与することを含む、方法に更に関する。
【0009】
最後に、本発明は、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療、予防又は抑制に有用な化合物を同定するスクリーニング方法であって、
１．ＮＯＳ阻害剤、特にｉＮＯＳ阻害剤として、より詳しくはｉＮＯＳ選択的阻害剤として作用し得る化合物又は化合物群を同定する工程と、
２．対応するｉｎ ｖｉｖｏ方法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって、上記１）において同定された選択化合物の胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）又はＴＡＡを引き起こす疾患の治療、予防又は抑制に対する有用性を判定する工程と、
を含む、スクリーニング方法に関する。
１．ＮＯＳ阻害剤、特にｉＮＯＳ阻害剤として、より詳しくはｉＮＯＳ選択的阻害剤として作用し得る化合物又は化合物群を同定する工程と、
２．対応するｉｎ ｖｉｖｏ方法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって、上記１）において同定された選択化合物の胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）又はＴＡＡを引き起こす疾患の治療、予防又は抑制に対する有用性を判定する工程と、
を含む、スクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】Ａｄａｍｔｓ１欠損による症候性ＴＡＡの誘導を示す図である。（ａ）指定のマウス（ｎ＝３）に由来する大動脈切片に対するＡｄａｍｔｓ１免疫染色の代表的な画像。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）２８日間に亘って対照で治療した又はＡｎｇ－ＩＩで治療したＡＲ、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの代表的な超音波画像。赤線は内腔境界を示し、黄色は管腔径である。スケールバー、１ｍｍ。（ｃ）対照で治療したＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス（ｎ＝１３）及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス（ｎ＝１５）、並びにＡｎｇＩＩで治療したＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス（ｎ＝１１）及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス（ｎ＝１４）に由来する指定の大動脈切片の最大径（平均±ＳＥＭ）。一元配置（One-way）ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ Ａｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／－；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１、＃＃＃ｐ＞０．００１、＃＃ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５ 対照対Ａｎｇ－ＩＩ。（ｄ）（ｃ）に示されるＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスのＡｎｇ－ＩＩ治療コホートの生存曲線。Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定、＊ｐ＜０．０５。（ｅ）同じコホートにおける動脈瘤の発生率。（ｆ）治療終了時の収縮期及び拡張期の血圧。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．００１ Ａｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／－；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対照対Ａｎｇ－ＩＩ。（ｇ）１０のＡｄａｍｔｓ１＋／＋及び７のＡｄａｍｔｓ１＋／－のガス注入した（insufflated）肺に由来する切片の代表的なＨ＆Ｅ染色。＊は、進行性の末梢気腔（distal airspace）の拡大を示す。スケールバー、５００μｍ（左）及び５０μｍ（右）。（ｈ）１６週齢～２０週齢のＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス（ｎ＝１０）及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス（ｎ＝９）の代表的な骨格ＰＥＴ ＣＴ画像。赤色点線、１．６７ｃｍ。脊柱後弯の発生が示される。２０匹のＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及び１７匹のＡｄａｍｔｓ１＋／－のマウスの（ｉ）胸郭の前後径及び横径（平均±ＳＥＭ）、並びに（ｊ）頭蓋、並びに（ｋ）上腕骨、大腿骨及び脛骨の長さの定量（平均±ＳＥＭ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｎｓ、有意差なし；＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図2】成体マウスの大動脈におけるＡｄａｍｔｓ１ノックダウンは、Ａｄａｍｔｓ１遺伝子欠損によって誘導されるものに類似する大動脈疾患を引き起こす。ＧＦＰと、ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１のいずれかとを発現するレンチウイルスを、頸静脈より８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに接種した。（ａ）実験タイムライン。白色三角形、Ｅｃｏ－ＢＰ：超音波及び血圧の分析；ＬＶｉ、レンチウイルス接種；Ａｎｇ ＩＩ、Ａｎｇ－ＩＩミニポンプ埋め込み。（ｂ）ＡｓＡｏの切片に対する代表的なＧＦＰ及びＡｄａｍｔｓ１の免疫染色。スケールバー、５０μｍ。（ｃ）形質導入され、指定の治療がなされたマウスに由来する大動脈試料におけるＡｄａｍｔｓ１免疫ブロット分析。Ｇａｐｄｈ発現をローディング対照として使用した。１２匹の対照ｓｉＣｔｌマウス、１６匹の対照ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス、１３匹のＡｎｇ－ＩＩ ｓｉＣｔｌマウス及び１６匹のＡｎｇ－ＩＩ ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウスにおける治療終了時の（ｄ）収縮期血圧及び拡張期血圧（平均±ＳＥＭ）、並びに最大大動脈径（平均±ＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．００１ ｓｉＣｔｌ対ｓｉＡｄａｍｔｓ１；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１、及び＃＃＃＃ｐ＜０．０００１、対照対Ａｎｇ－ＩＩ。Ｄ及びＥの結果は、２つの独立した実験からのプールドデータである。（ｆ）画像はマッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ Ｔ．）、エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）及びアルシアンブルーの染色を示す。スケールバー、５０μｍ。（ｇ、ｈ）図１並びに図２ｄ及び図２ｅに示されるマウスコホートに由来するＡｓＡｏ切片のエラスチン破断及びコラーゲン含有量の定量。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｓｉＣｔｌ対ｓｉＡｄａｍｔｓ１又はＡｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／－；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対照対Ａｎｇ－ＩＩ。（ｉ）対照又はＡｎｇ－ＩＩで治療したＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス（ｎ＝３）に由来するＡｓＡｏ切片の代表的なＴＧＦβ１、ｐＳＭＡＤ２及び全ＳＭＡＤ２／３の免疫組織化学検査。
【図3】Ａｄａｍｔｓ１ノックダウンは、ＴＧＦβ活性化と無関係に大動脈拡張、低血圧及び中膜変性を急速に誘導する。（ａ）実験タイムライン。ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１のレンチウイルスを８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに頸静脈より接種し、指定の時間に大動脈拡張及び血圧をモニターした。大動脈抽出物において、（ｂ）ＲＴ－ｑＰＣＲ及び（ｃ）免疫組織化学検査によって分析されたＡｄａｍｔｓ１発現。代表的な画像はＡｓＡｏ切片におけるＡｄａｍｔｓ１及びＧＦＰで示される。ｍＲＮＡ量をＧａｐｄｈ発現に対して正規化した（平均±ＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対ｓｉＣｔｌ。スケールバー、５０μｍ。ｓｉＣｔｒｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１のレンチウイルスで形質導入されたマウスの指定の時間における（ｄ）収縮期血圧；（ｅ）エラスチン破断；（ｆ）ＡｓＡｏ及び（ｇ）ＡｂＡｏの最大径；並びに（ｈ）コラーゲン含有量（平均±ＳＥＭ；ｎ＝５～１２）。同じ時間点において、（ｅ、ｈ）一元配置ＡＮＯＶＡ及び（ｄ、ｅ、ｇ）二元配置（two-way）ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対ｓｉＣｔｌ。（ｉ）ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１によるマウス（ｎ＝３）の形質導入から４日後に作製された大動脈抽出物中のＭｍｐ２及びＭｍｐ９の活性の代表的なザイモグラム分析。（ｊ）実験スキーム。１つの動物群は、レンチウイルス接種の３日前に中和抗ＴＧＦβ抗体の腹腔内注射を受け、注射を１週間当たり３回繰り返した。別の群を、レンチウイルス接種の直前に開始する、浸透ミニポンプ送達によってロサルタンで治療した。指定の実験群における、（ｋ）最大ＡｓＡｏ径の変化、並びに（ｌ）エラスチン破断及び（ｍ）大動脈切片中のコラーゲン含有量の実験終了時の定量（平均±ＳＥＭ）。１群当たりのマウスの数は、ｓｉＣｔｒｌ ８匹、ｓｉＣｔｒｌロサルタン ４匹、ｓｉＡｄａｍｔｓ１ ５匹、ｓｉＡｄａｍｔｓ１ロサルタン ７匹、及びｓｉＡｄａｍｔｓ１抗ＴＧＦβ ６匹であった。（ｋ）群平均の二元配置ＡＮＯＶＡ及び（ｌ、ｍ）一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対ｓｉ－Ｃｔｌ；ｎ．ｓ．、有意差なし。（ｂ、ｅ、ｈ）ｓｉＣｔｌの結果は実験期間中を通して安定し、データは、２日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目及び４９日目の読取りの平均である。（ｎ）ｓｉＣｔｌを発現する又はｓｉＡｄａｍｔｓ１を発現するレンチウイルスの接種から４日後のマウスに由来する大動脈切片におけるＭｍｐ９（赤色）、ＳＭＡ（白色）及びＦ４／８０（緑色）の免疫蛍光、エラスチン自家蛍光（緑色）、及びＤＡＰＩ染色核（青色）の代表的な画像。高脂肪食を給餌したＡｐｏｅ－／－マウスにおけるアテローム斑をＦ４／８０染色に対する陽性対照として使用した。スケールバー、５０μｍ。
【図4】Ａｄａｍｔｓ１欠損によって誘導される大動脈障害は、ＮＯによって媒介される。（ａ）実験計画。ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１のレンチウイルス接種の３日前に開始し、次の１４日間継続して、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに飲用水中のＮＯＳ阻害剤（Ｌ－ＮＡＭＥ）を与えた。（ｂ）指定時間でのＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの最大径、並びに大動脈切片における（ｃ）エラスチン破断及び（ｄ）コラーゲン含有量の実験終了時の定量（平均±ＳＥＭ；各群ｎ＝５）。（ｅ）Ｌ－ＮＡＭＥで治療したｓｉＡｄａｍｔｓ１形質導入マウスに由来する大動脈抽出物中のＭｍｐ２及びＭｍｐ９の活性の定量。（ｂ）群平均の二元配置ＡＮＯＶＡ、及び（ｃ～ｅ）一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対ｓｉＣｔｌ；＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ Ｌ－ＮＡＭＥ対対照；ｎｓ、有意差なし。（ｆ～ｈ）８週齢のＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスを２１日間に亘ってＬ－ＮＡＭＥで治療した。Ａｄａｍｔｓ１＋／＋マウス１２匹、Ａｄａｍｔｓ１＋／＋ Ｌ ＮＡＭＥマウス１３匹、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウス１４匹、及びＡｄａｍｔｓ１＋／－ Ｌ－ＮＡＭＥマウス１２匹における（ｆ）指定の時間点でのＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの最大径（平均±ＳＥＭ）、並びに実験終了時の（ｇ）収縮期血圧、（ｈ）エラスチン破断、及び（ｉ）コラーゲン含有量。（ｆ）二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対各時間点におけるＡｄａｍｔｓ１＋／－ Ｌ－ＮＡＭＥ。（ｇ～ｉ）一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ａｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／－；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１ Ｌ－ＮＡＭＥ対対照。
【図5】Ｎｏｓ２はＡｄａｍｔｓ１欠損によって誘導される大動脈障害の極めて重要なメディエーターである。（ａ）指定の時間点でのｓｉＣｔｌ及びｓｉＡｄａｍｔｓ１の形質導入マウスに由来する大動脈抽出物中のＮｏｓ２ ｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝４）、＊＊ｐ＜０．０１、対ｓｉＣｔｌ。図４のようにｓｉＣｔｌレベルを特定した。（ｂ）ｓｉＣｔｌマウス及びｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス（接種から１４日後）に由来する、並びに１２週齢のＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスに由来する大動脈切片におけるＮｏｓ２（赤色）、エラスチン自家蛍光（緑色）及びＤＡＰＩ染色核（青色）の代表的な蛍光免疫染色（ｎ＝３）。ＩｇＧを陰性対照として使用した。スケールバー、５０μｍ。（ｃ）実験計画。８週齢のＮｏｓ２－／－マウス及び野生型（ｗｔ）マウスにｓｉＣｔｌ及びｓｉＡｄａｍｔｓ１のレンチウイルスを接種し、大動脈の拡張及び血圧についてモニターした。（ｄ）指定の時間点での野生型ｓｉＣｔｌマウス６匹、野生型ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス９匹、Ｎｏｓ２－／－ ｓｉＣｔｌマウス４匹、及びＮｏｓ２－／－ ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス７匹におけるＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの最大径（平均±ＳＥＭ）。群平均の二元配置ＡＮＯＶＡ；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対Ｎｏｓ２－／－ ｓｉＡｄａｍｔｓ１；ｎｓ、有意差なし。同じ動物コホートにおける（ｅ）ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏのエラスチン破断、並びに（ｆ）ＡｂＡｏのコラーゲン含有量の実験終了時の定量。（ｇ）同じマウスコホートにおける指定の時間点での収縮期血圧（平均±ＳＥＭ）。群平均の二元配置ＡＮＯＶＡ；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対Ｎｏｓ２－／－ ｓｉＡｄａｍｔｓ１；ｎｓ、有意差なし。（ｈ）ｓｉＣｔｌマウス、ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス、及びＮｏｓ２－／－ ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス（接種から１４日後）に由来する、並びに１０週齢のＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス、及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスに由来する固定されていない大動脈組織切片におけるＮＯ産生（赤色）、エラスチン自家蛍光（緑色）及びＤＡＰＩ染色核（青色）の代表的な画像（ｎ＝３）。スケールバー、５０μｍ。（ｉ）ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１を発現するレンチウイルスを接種した（接種から４日後）１６週齢のＮｏｓ２－／－マウス、Ａｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス、並びに野生型マウス（１群当たりｎ＝４匹のマウス）に由来する大動脈切片におけるＮｏｓ２（赤色）及びＳＭＡ（白色）の免疫蛍光、エラスチン自家蛍光（緑色）、並びにＤＡＰＩ染色核（青色）の代表的な画像。スケールバー、５０μｍ。（ｊ）ｓｉＣｔｌ－ｏｒｓｉＡｄａｍｔｓ１発現レンチウイルスで治療した野生型マウス（１群当たりｎ＝５匹のマウス）の大動脈抽出物中の合計の及びリン酸化されたＡｋｔ及びｐ６５の代表的な免疫ブロット分析。各レーンはマウス１匹を表す。（ｉ～ｌ）指定の時間点におけるＡｓＡｏ（左）及びＡｂＡｏ（右）の最大径。
【図6】Ａｄａｍｔｓ１及びＮＯはマルファン症候群において極めて重要な役割を果たす。（ａ）実験スキーム。１２週齢の野生型マウス及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスに２１日間に亘って飲用水中のＬ－ＮＡＭＥを与えた。大動脈の拡張及び血圧を、指定の時間及び安楽死の前に特定した。野生型マウス９匹、野生型Ｌ－ＮＡＭＥマウス７匹、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス８匹、及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋ Ｌ－ＮＡＭＥマウス８匹における（ｂ）指定の時間でのＡｓＡｏ最大径（平均±ＳＥＭ）、及び（ｃ）実験終了時の収縮期血圧の定量。（ｂ）二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊＜０．０００１ 対Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋ Ｌ－ＮＡＭＥ。（ｃ）一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．０１ 対野生型対照；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対照対Ｌ－ＮＡＭＥ。（ｄ）野生型マウス６匹、野生型Ｌ－ＮＡＭＥマウス３匹、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス３匹、及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋ Ｌ－ＮＡＭＥマウス５匹におけるＡｓＡｏのエラスチン破断の実験終了時の定量。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、対野生型対照；＃＃ｐ＜０．０１ 対照対Ｌ－ＮＡＭＥ。（ｅ）野生型マウス６匹及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス３匹に由来する大動脈抽出物中のＮｏｓ２及びＮｏｓ３のｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｆ）野生型マウス及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスの大動脈横断切片のＮＯ産生（赤色）、Ｎｏｓ２免疫蛍光（赤色）、エラスチン自家蛍光（緑色）、及びＤＡＰＩ染色核（青色）の代表的な画像（ｎ＝３）。（ｇ）野生型マウス及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスに由来する大動脈切片における代表的なＡｄａｍｔｓ１免疫組織化学検査、及び大動脈抽出物中のＡｄａｍｔｓ１イムノブロット分析。ＩｇＧ染色は陰性対照としての役割を果たす。スケールバー、２０μｍ。対照ドナー５名及びＭＦＳ患者９名の（ｈ）ＡＤＡＭＴＳ１免疫蛍光（赤色；ｎ＝９）の代表的な中膜の画像、及び（ｉ）免疫組織化学染色切片におけるＡＤＡＭＴＳ１陽性領域の定量。対照ドナー５名及びＭＦＳ患者８名に由来する切片における（ｊ）ＮＯＳ２免疫蛍光（赤色；ｎ＝６）の代表的な中膜の画像、及び（ｋ）ＮＯＳ２陽性領域の定量。バー、２５μｍ。（ｈ、ｊ）エラスチン自家蛍光（緑色）及びＤＡＰＩ染色核（青色）も示される。（ｉ、ｋ）データは平均＋ＳＥＭとして提示される。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｌ）マルファン症候群における大動脈表現型、及びＡｄａｍｔｓ１欠損によって誘導される関連する大動脈障害に対するＮＯ及びＮＯＳ２の寄与を表すモデル。（ｍ）指定のマウス群（１群当たりｎ＝４匹のマウス）における指定の時間点におけるＡｓＡｏ最大径、実験終了時の収縮期血圧（１群当たりｎ＝４匹のマウス）。（ｎ）大動脈切片におけるＥＶＧ染色の代表的な画像（ｌと同じマウスコホート）。（ｏ）１６週間の（飲用水中の）１４００Ｗによる治療後の１２週齢のＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス及びＦｂｎ１＋／Ｃ１０３９Ｇマウス、並びそれらの対応する野生型同腹仔に由来する。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである。（ｐ、ｑ）２１日間に亘って飲用水中の１４００Ｗで治療された３６週齢のＦｂｎ１＋／Ｃ１０３９Ｇマウス及びそれらの野生型同腹仔における、指定の時間点でのＡｓＡｏ最大径（ｐ）及び実験終了時の収縮期血圧（ｋ）（ｎ＝５匹の対照又は１４００Ｗで治療した野生型マウス；ｎ＝７匹の対照Ｆｂｎ１＋／Ｃ１０３９Ｇマウス；ｎ＝６匹の１４００Ｗで治療したＦｂｎ１＋／Ｃ１０３９Ｇマウス）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍであるか（ｐ）、又は７５パーセンタイル及び２５パーセンタイルの箱ひげ図；バーは最大値及び最小値を表す（ｑ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１（対１４００Ｗで治療したＦｂｎ１＋／Ｃ１０３９Ｇマウス）；＊Ｐ＜０．０５（対野生型対照）；＃Ｐ＜０．０５（対治療した野生型）；群平均の反復計測二元配置ＡＮＯＶＡ（ｏ）又は二元配置ＡＮＯＶＡ（ｑ）による。
【図7】（ａ）指定の通り、２８日間に亘って治療したＡｄａｍｔｓ１＋／＋及びＡｄａｍｔｓ１＋／－におけるＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１ Ａｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／；＃＃＃ｐ＜０．００１ 対照Ａｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｎｇ－ＩＩ Ａｄａｍｔｓ１＋／＋。（ｂ）予測されたメンデル比に対する、離乳時に生存していたＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウス、及びＡｄａｍｔｓ１－／－マウスの割合（ｎ＝１５１）。（ｃ）３ヶ月齢～４ヶ月齢のＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス１０匹及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス７匹に由来する腎臓横断切片の代表的なヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色；＊は水腎症の空間（hydronephrotic space）を示す。スケールバー、５００μｍ。（ｄ）９週齢のＡｄａｍｔｓ１＋／＋マウス（ｎ＝５）及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス（ｎ＝６）における（ｄ）血漿尿素及び（ｅ）血漿クレアチニンのレベル（平均±ＳＥＭ）。
【図8】（ａ及びｂ）Ａｄａｍｔｓ１特異的ｓｉＲＮＡ（＃ｓｉ２７、＃ｓｉ５７、＃ｓｉ６９）又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｔｌ）をコードするレンチウイルスで血管平滑筋細胞を形質導入した。Ａｄａｍｔｓ１レベルを、これらの細胞に由来する抽出物における（ａ）ＲＴ－ｑＰＣＲ及び（ｂ）免疫ブロットによって分析した。ｍＲＮＡ量をＧａｐｄｈ発現（平均＋ＳＥＭ；ｎ＝３）に対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対非治療ｓｉＣｔｌ。チューブリン発現をローディング対照として使用した。（ｃ）ＡｂＡｏ切片に対する代表的なＧＦＰ及びＡｄａｍｔｓ１の免疫染色。ＩｇＧ染色は陰性対照としての役割を果たす。スケールバー、５０μｍ。（ｄ）２８日間に亘り、指定の通り治療したｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１で形質導入されたマウスに由来する大動脈試料中のＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡレベル。１群当たりのマウスの数は、対照ｓｉＣｔｌ １２匹、対照ｓｉＡｄａｍｔｓ１ １６匹、Ａｎｇ－ＩＩ ｓｉＣｔｌ １３匹、及びＡｎｇ－ＩＩ ｓｉＡｄａｍｔｓ１ １６匹であった。ｍＲＮＡ量をＧａｐｄｈ発現（平均＋ＳＥＭ）に対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対ｓｉＣｔｌ；＃＃＃ｐ＜０．００１ 対対照。（ｅ）指定されるマウス及び治療（ｎ＞６）に由来する大動脈試料中のＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡレベル。ｍＲＮＡ量をＧａｐｄｈ発現（平均＋ＳＥＭ）に対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対対照Ａｄａｍｔｓ１＋／＋；＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対対照ｓｉＣｔｌ；＆＆＆ｐ＜０．００１ Ａｄａｍｔｓ１＋／－対ｓｉＡｄａｍｔｓ１。（ｆ）（ｄ）と同じマウスコホートにおいて分析された実験終了時の大動脈の最大径（平均±ＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．００１ ｓｉＣｔｌ対ｓｉＡｄａｍｔｓ１；＃ｐ＜０．０５及び＃＃＃ｐ＜０．００１ 対照対Ａｎｇ－ＩＩ。
【図9】図２ｇに示されるマウスコホートに由来するＡｂＡｏ切片の（ａ）代表的なマッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ Ｔ）、エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）、及びアルシアンブルーの染色、並びに（ｂ）エラスチン破断及びコラーゲン含有量の定量。（ｃ～ｅ）（ｃ）ＡｂＡｏ切片及び（ｅ）ＡｓＡｏ切片に対する、代表的なマッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ Ｔ）、エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）、及びアルシアンブルーの染色、並びに（ｄ）図２ｈに示されるマウスコホートに由来するＡｂＡｏ切片のエラスチン破断及びコラーゲン含有量の定量。（ａ、ｃ、ｅ）スケールバー、５０μｍ。（ｂ、ｄ））一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｓｉＣｔｌ対ｓｉＡｄａｍｔｓ１又はＡｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／－－；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対照対Ａｎｇ－ＩＩ。
【図10】（ａ）指定の通り治療したｓｉＣｔｌ及びｓｉＡｄａｍｔｓ１の形質導入マウスに由来するＡｂＡｏ横断切片に対する代表的なｐＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ２／３の免疫染色（ｎ＝３）。スケールバー、５０μｍ。対照及びＡｎｇ－ＩＩで治療した（ｂ）ｓｉＣｔｌ及びｓｉＡｄａｍｔｓ１の形質導入マウス、並びに（ｃ）Ａｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスに由来する抽出物におけるＴｇｆｂ１、Ｃｔｇｆ、Ｃｏｌ１ａ１及びＰａｉ－１のｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｓｉＣｔｌ対ｓｉＡｄａｍｔｓ１；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１ 対照対Ａｎｇ－ＩＩ。（ｄ）Ａｄａｍｔｓ１＋／＋マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス。二元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｓｉＣｔｌ対ｓｉＡｄａｍｔｓ１；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１、対照対Ａｎｇ－ＩＩ。
【図11】（ａ）ｓｉＣｔｌ及びｓｉＡｄａｍｔｓ１の形質導入マウスにおいて、指定時間に測定した拡張期血圧（平均±ＳＥＭ）。二元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５～１２）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対各時間点のｓｉＣｔｌ。（ｂ）同じマウスに由来するＡｂＡｏ横断切片におけるエラスチン破断。（ｃ）指定時間での同じマウスにおけるＴｇｆｂ１、Ｃｔｇｆ、Ｃｏｌ１ａ１及びＰａｉ－１の発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析。ｍＲＮＡ量をＧａｐｄｈ発現に対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対ｓｉＣｔｌ。（ｂ、ｃ）におけるｓｉＣｔｌの結果は実験期間を通して安定し、データは２日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目及び４９日目の読取りの平均である。ｓｉＣｔｌマウス８匹、ｓｉＣｔｌロサルタンマウス４匹、ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス５匹、ｓｉＡｄａｍｔｓ１ロサルタンマウス７匹、及びｓｉＡｄａｍｔｓ１抗ＴＧＦβマウス６匹における、（ｄ）指定時間でのＡｂＡｏ最大径（平均±ＳＥＭ）及び（ｅ）収縮期血圧（平均±ＳＥＭ）。群平均の二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対ｓｉＣｔｌ；ｎ．ｓ．、有意差なし。（ｆ）Ｔｇｆｂ１、Ｐａｉ－１、Ｃｔｇｆ、Ｃｏｌ１ａ１、及びＡｄａｍｔｓ１のｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。ｍＲＮＡ量をＧａｐｄｈ発現に対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対ｓｉＣｔｌ；＃＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図12】（ａ）指定の通りＬ－ＮＡＭＥで治療したｓｉＣｔｌ及びｓｉＡｄａｍｔｓ１の形質導入マウスにおける指定時間での収縮期及び拡張期の血圧（平均±ＳＥＭ；各群に対してｎ＝５）。群平均の二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 対照対Ｌ－ＮＡＭＥ。（ｂ）同じマウス群におけるＡｂＡｏ横断切片中のエラスチン破断の実験終了時の定量。（ｃ）図４ｇに示されるのと同じマウスコホートにおける実験終了時の拡張期血圧。（ｂ、ｃ）一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対非治療ｓｉＣｔｌ、又はＡｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／－；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１、Ｌ－ＮＡＭＥ、対非治療。
【図13】ｓｉＣｔｌ及びｓｉＡｄａｍｔｓ１の形質導入マウスに由来する大動脈抽出物における指定時間での（ａ）Ｎｏｓ３及び（ｂ）Ｅｎｄ１のｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析。ｍＲＮＡ量をＧａｐｄｈ発現に対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝４）、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対ｓｉＣｔｌ。（ｃ）図５ｇに示されるのと同じマウスコホートの拡張期血圧（平均±ＳＥＭ）。群平均の二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対Ｎｏｓ２－／－ ｓｉＡｄａｍｔｓ１；ｎｓ、有意差なし。（ｄ）ｓｉＣｔｌで治療した野生型マウス６匹、ｓｉＡｄａｍｔｓ１で治療した野生型マウス８匹、ｓｉＣｔｌで治療したＮｏｓ２－／－マウス５匹、及びｓｉＡｄａｍｔｓ１で治療したＮｏｓ２－／－マウス５匹のＡｂＡｏにおけるエラスチン破断の実験終了時の定量（平均±ＳＥＭ）。（ｅ）ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１で形質導入されたＶＳＭＣに由来する抽出物におけるＮｏｓ２ ｍＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析（平均±ＳＥＭ、１群当たりｎ＝３匹のマウス）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１。（ｆ）ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１で形質導入したＶＳＭＣに由来する抽出物におけるＮｏｓ２（１群当たりｎ＝４）、ｐ－Ａｋｔ－Ｓ４７３（１群当たりｎ＝３）、Ａｋｔ（１群当たりｎ＝３）、ｐ－ｐ６５－Ｓ５３６（１群当たりｎ＝３）及びｐ６５（１群当たりｎ＝３）の代表的な免疫ブロット分析。チューブリン（１群当たりｎ＝４）をローディング対照として使用した。（ｇ）ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１で形質導入され、指定のｍＴＯＲ阻害剤であるＡＺＤ８０５５で処理したＶＳＭＣに由来する抽出物におけるＮｏｓ２、ｐＡｋｔ－Ｓ４７３及びＡｋｔの代表的な免疫ブロット分析（１群当たりｎ＝３）。（ｈ）ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１で形質導入され、指定のＮｏｓ２阻害剤である１４００ｗで処理したＶＳＭＣに由来する順化培地中の亜硝酸塩及び硝酸塩（全ＮＯｘ）の定量。治療していないｓｉＣｔｌマウス８匹及び治療したｓｉＣｔｌマウス６匹、並びに治療していないｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス８匹及び治療したｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス６匹。（ｉ）ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１で形質導入され、指定のＮｏｓ２阻害剤である１４００ｗで処理した固定されていないＶＳＭＣ中のＮＯ産生（赤色）及びＧＦＰ蛍光（緑色）の代表的な画像（１群当たりｎ＝３）。バー、５０μｍ。
【図14】（ａ）野生型マウス９匹、野生型Ｌ－ＮＡＭＥマウス７匹、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス８匹、及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋ Ｌ－ＮＡＭＥマウス８匹における指定時間でのＡｂＡｏ最大径（平均±ＳＥＭ）。二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋ Ｌ－ＮＡＭＥ。（ｂ）同じマウスにおける拡張期血圧の実験終了時の定量。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＜０．０１ 対非治療野生型；＃＃ｐ＜０．０１ 対照対Ｌ－ＮＡＭＥ。野生型マウス６匹、野生型Ｌ－ＮＡＭＥマウス３匹、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス３匹及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋ Ｌ－ＮＡＭＥマウス５匹における（ｃ）ＡｂＡｏにおけるエラスチン破断、並びに（ｄ）ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏにおけるコラーゲン含有量の実験終了時の定量。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊＊＊ｐ＜０．００１、対非治療野生型；＃＃ｐ＜０．０１、非治療対Ｌ－ＮＡＭＥ。（ｅ）野生型マウス６匹及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス３匹に由来する大動脈抽出物中のＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡのＲＴｑＰＣＲ分析。（ｆ）健康なドナー５名及びＭＦＳ患者９名に由来するヒト試料の大動脈横断切片におけるＡＤＡＭＴＳ１免疫組織化学検査の代表的な中膜の画像。バー、２５μｍ。（ｇ）対照ドナー５名及びＭＦＳ患者８名に由来する切片におけるＮＯＳ２免疫蛍光（赤色；ｎ＝６）及びＤＡＰＩ染色核（青色）の代表的な中膜の画像。バー、２５μｍ。（ｈ）ＡＤＡＭＴＳ１－ＮＯＳ２軸は、ヒトＭＦＳの大動脈試料において調節されていない（deregulated）。１２週齢におけるＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋８名及びＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋；Ｎｏｓ２－／－１４名のＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの最大径（平均±ＳＥＭ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（ｉ）ＡＤＡＭＴＳ１－ＮＯＳ２軸は、ヒトＭＦＳの大動脈試料において調節されていない。対照ドナー５名及びＭＦＳ患者８名に由来する切片におけるＮＯＳ２（赤色）及びＳＭＡ（白色）の免疫蛍光、エラスチン自家蛍光（緑色）、及びＤＡＰＩ染色核（青色）の代表的な中膜の画像。バー、２５μｍ。
【図15】（ａ）Ｎｏｓ２阻害剤であるアミノグアニジン（ＡＧ）はＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスにおいて大動脈径を減少させる。ＡＧ（飲用水中、１．５ｇｒ／ｌ）で治療された又はＡＧで治療されていないＡｄａｍｔｓ１＋／＋（ｎ＝４）及びＡｄａｍｔｓ１＋／－（ｎ＝５）からの上行大動脈径及び腹部大動脈径（平均±ＳＥＭ）。反復計測二元配置ＡＮＯＶＡ ＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｂ）Ｎｏｓ２阻害剤であるアミノグアニジン（ＡＧ）は、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスにおいて大動脈径を減少させる。（ａ）に示されるマウスによる収縮期血圧（平均±ＳＥＭ）。一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対照Ａｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１＋／－；＃＃ｐ＜０．０１ ＡＧで治療したＡｄａｍｔｓ１＋／＋対Ａｄａｍｔｓ１。（ｃ）同じマウスにおける拡張期血圧の実験終了時の定量。二元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ 対非治療野生型；＃ｐ＜０．０５ ＃＃＃ｐ＜０．００１。（ｄ）同じ動物コホートにおけるエラスチン破断の定量（平均±ＳＥＭ）。スケールバー、５０μｍ。二元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ 対非治療野生型；＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図16】ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１のレンチウイルスで形質導入し、Ｎｏｓ２阻害剤、すなわち指定の通り、１４００Ｗ（２μｍ）、アミノグアニジン（ＡＧ）（１００μＭ）、ＧＷ２７３６２９（２０μｍ）、ｌ－ＮＩＬ（３ｍＭ）、クロトリマゾール（２０μＭ）で処理したＶＳＭＣに由来する順化培地中の亜硝酸塩及び硝酸塩（全ＮＯｘ）の定量。データは平均±ｓ．ｅ．ｍである；１群当たりｎ＝４；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（対対照－ｓｉＣＴＬ）、＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１（対対照－ｓｉＡｄａｍｔｓ１）。
【図17】ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１で形質導入され、指定されるＮｏｓ２阻害剤で処理された固定されていないＶＳＭＣにおけるＮＯ産生（赤色）及びＧＦＰ蛍光（緑色）の代表的な画像（ｎ＝４）。バー、５０μｍ。
【図18】ＮＯＳ２の構造、リガンド及び阻害剤結合部位の３Ｄ図である。ヒトＮＯＳ２のＡ鎖（緑色）及びＢ鎖（青色）をカートゥーン（cartoon）で示し、本来のリガンドを棒状部分（sticks：スティック）として示す（Ｈｅｍｏ及びＨ４Ｂは赤色、Ｌ－アルギニンは黄色）、（ａ）ヒトＮＯＳ２構造及び本来のリガンド、並びに（ｂ）ダイマー界面及びリガンド領域の拡大図。全ての阻害剤モデルは、リガンド領域のグアニジン部位（黄色の棒状部分）において結合する。（ｃ）ではＬ－ＮＡＭＥ、（ｄ）では１４００ｗ、（ｅ）ではアミノグアニジン、（ｆ）ではＧＷ２７３６２９、（ｇ）ではＬ－ＮＩＬ、及び（ｈ）ではクロトリマゾールに対する結合部位が示される。クロトリマゾールの場合、以前に報告されるように、ダイマー界面を修飾するＮＯＳ２のダイマー化を阻害する。
【発明を実施するための形態】
【0011】
定義
本明細書において同じ意味で使用される「一酸化窒素合成酵素」及び「ＮＯＳ」の用語は、ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳ及びｉＮＯＳを含む酵素である一酸化窒素合成酵素のいずれかのアイソフォームを指す。
本明細書において同じ意味で使用される「一酸化窒素合成酵素」及び「ＮＯＳ」の用語は、ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳ及びｉＮＯＳを含む酵素である一酸化窒素合成酵素のいずれかのアイソフォームを指す。
【0012】
本明細書において同じ意味で使用される「誘導型一酸化窒素合成酵素」、「ＮＯＳ－２」及び「ｉＮＯＳ」の用語は、Ｃａ＋２依存性誘導型アイソフォームの酵素である一酸化窒素合成酵素を指す。
【0013】
本明細書において同じ意味で使用される「一酸化窒素合成酵素阻害剤」及び「ＮＯＳ阻害剤」の用語は、一酸化窒素合成酵素の生理学的効果を減少させる化合物を意味する。かかる阻害剤は、一酸化窒素合成酵素の特定のアイソフォームに対して選択的であってもよく、又は実質的に選択的でなくてもよい、すなわち、一酸化窒素合成酵素の２以上のアイソフォームに対しておおむね有効であってもよい。
【0014】
「選択的一酸化窒素合成酵素阻害剤」及び「選択的ＮＯＳ阻害剤」の用語は、一酸化窒素合成酵素の他のアイソフォームに対して、一酸化窒素合成酵素の特定のアイソフォームの生理学的効果を優先的に減少させることができる化合物を意味する。
【0015】
「選択的誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤」、「選択的ＮＯＳ－２阻害剤」及び「選択的ｉＮＯＳ阻害剤」の用語は、一酸化窒素合成酵素の他のアイソフォームに対して、一酸化窒素合成酵素のカルシウムイオン非依存性アイソフォームの生理学的効果を優先的に減少させることができる化合物を意味する。一実施形態では、選択的ｉＮＯＳ阻害剤は、内皮型ＮＯＳ又は神経型ＮＯＳのいずれかと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ投与が１００ｍｇ／ｋｇ未満の有効性（ＥＤ５０）を生じるようにｉＮＯＳの選択的阻害をもたらす。別の実施形態では、選択的ｉＮＯＳ阻害剤は、内皮型ＮＯＳ又は神経型ＮＯＳのいずれかと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ投与が齧歯類エンドトキシンモデル）で１０ｍｇ／ｋｇ未満の有効性（ＥＤ５０）を生じるようにｉＮＯＳの選択的阻害をもたらす。更なる実施形態では、ｉＮＯＳ阻害剤は、平均動脈血圧の上昇によって測定されるように、ｅＮＯＳに関して約２０倍の選択性を示す。更に別の実施形態では、ｉＮＯＳ阻害剤は、平均動脈血圧の上昇によって測定されるように、ｅＮＯＳに関して１００倍以上の選択性を示す。更に別の実施形態では、ｉＮＯＳ阻害剤は、胃腸通過又は陰茎勃起の減少によって測定されるように、ｎＮＯＳに関しての約２０倍の選択性を示す。別の実施形態では、ｉＮＯＳ阻害剤は、胃腸通過又は陰茎勃起の減少によって測定されるように、ｎＮＯＳに関して約１００倍以上の選択性を示す。
【0016】
「スクリーニング」の用語は、健康な個体と診断未確定の胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）を患う又は上記適応症を患うリスクの高い人々とを区別する目的を持つ、一般集団に属する下記に定義される胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）を患うリスクがある個体群の検査又は試験として理解される。
【0017】
「胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）」の用語は、正常よりも少なくとも５０％超の大動脈壁の胸部セグメント（thoracic segment）の局所的な病的拡張としてＴＡＡを定義する広く受け入れられている医学的定義を含み、真性動脈瘤は血管壁の全ての層を含む。本発明は、マルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）等の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）；無症候性ＴＡＡ；又はＡｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる大動脈障害と関連する任意の他の疾患等のＴＡＡをもたらす疾患を含む。無症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）は、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）をもたらす症候群として理解されていない疾患を含む。また、本発明は大動脈二尖弁等のＴＡＡを生じる疾患を含み、ここで、Ａｄａｍｔｓ１ヌルマウスはほとんどの場合、大動脈二尖弁を発症する。
【0018】
「低侵襲生体試料」の表現は、患者から血液を採取するのに使用される細い針以外に有害な機器を使用する必要がなく、結果的に患者に対して害がない、患者身体から得られる任意の試料を指す。具体的には、本発明では、低侵襲生体試料は、血液試料、血清試料、又は血漿試料を指す。
【0019】
本発明に記載されるバイオマーカーのいずれか又はそれらの組み合わせの「上方制御」又は「過剰発現」の用語は、所与の「閾値」又は「カットオフ値」に関して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％超、少なくとも６５％超、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、又はそれよりも多いそれらの発現レベルの増加を指す。さらに、本発明に記載されるバイオマーカーのいずれか又はそれらの組み合わせの「上方制御」又は「過剰発現」の用語もまた、所与の「閾値」又は「カットオフ値」に関して、少なくとも約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約５０倍、又は約１００倍のそれら発現レベルの増加を指す。
【0020】
「Ａｄａｍｔｓ１」の用語は、トロンボスポンジンモチーフ１を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ、特にヒトにおいてＡＤＡＭＴＳ１遺伝子によってコードされる酵素を指す。
【0021】
本発明に記載されるバイオマーカーのいずれか又はそれらの組み合わせの「発現減少」の用語は、所与の「閾値」又は「カットオフ値」に関して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％超、少なくとも６５％超、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、又はそれよりも多いそれらの発現レベルの減少を指す。さらに、本発明に記載されるバイオマーカーのいずれか又はそれらの組み合わせの「発現減少」の用語もまた、所与の「閾値」又は「カットオフ値」に関して、少なくとも約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約５０倍、又は約１００倍のそれら発現レベルの減少を指す。
【0022】
「閾値」又は「カットオフ値」の用語は、本発明に記載されるＡｄａｍｔｓ１又はｉＮＯＳの発現レベルを指す場合、患者の発現レベルが該閾値若しくはカットオフ又は参照レベルを上回る又は下回る場合に、所与の感度及び特異性で被験体が症候性の又は無症候性の胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）を患う可能性があることを示す参照発現レベルを指す。本発明において、上記「閾値」又は「カットオフ値」は、健康な被験体から取得した参照発現レベルである。
【0023】
発現の閾値又はカットオフレベルを確立するための様々な統計学的及び数学的な方法が、従来技術において知られている。特定のバイオマーカーに対する閾値又はカットオフ発現レベルが選択され得る。当業者は、感度又は特異性に関する種々の値を得るために、例えば特定のバイオマーカー又はそれらの組み合わせに対するＲＯＣプロットに沿って移動させることによってこれらの閾値又はカットオフ発現レベルを変化させることができ、それにより全体的なアッセイ性能に影響を及ぼすことを理解する。例えば、臨床的な観点から見てロバストな診断方法を目的とする場合は、高い感度を持とうとするはずである。しかしながら、費用対効果の高い方法を目標とする場合は、高い特異性を得ようとするはずである。最良のカットオフは、最も優れた感度及び特異性をもたらす特定のバイオマーカーに対するＲＯＣプロットから得られた値を指す。感度及び特異性の値は、閾値（カットオフ）の範囲に亘って計算される。したがって、アッセイされた患者集団の少なくとも６０％において、又はアッセイされた患者集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、若しくは８０％において、感度及び／又は特異性が、少なくとも約７０％であるように、また例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも１００％となり得るように、閾値又はカットオフ値を選択することができる。
【0024】
本明細書で使用される「Ｃ１～６アルキル」の表現は、メチル基及びエチル基、並びに直鎖又は分岐鎖のプロピル基、ブチル基、ペンチル基及びヘキシル基を含む。特定のアルキル基は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル及びｔｅｒｔ－ブチルである。「Ｃ１～６アルコキシ」、「Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル」、「ヒドロキシＣ１～６アルキル」、「Ｃ１～６アルキルカルボニル」、「Ｃ１～６アルコキシカルボニルＣ１～６アルキル」、「Ｃ１－アルコキシカルボニル」、「アミノＣ１～６アルキル」、「Ｃ１～６アルキルカルバモイルＣ１～６アルキル」、「Ｃ１～６ジアルキルカルバモイルＣ１～６アルキル」、「モノ－又はジ－Ｃ１～６アルキルアミノＣ１～６アルキル」、「アミノＣ１～６アルキルカルボニル」、「ジフェニルＣ１～６アルキル」、「アリールＣ１～６アルキル」、「アリールカルボニルＣ１～６アルキル」、及び「アリールオキシＣ１～６アルキル」等の派生する表現は、適宜解釈される。
【0025】
本明細書で使用される、「Ｃ２～６アルケニル」の表現は、エテニル基、並びに直鎖又は分岐鎖のプロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基及びヘキセニル基を含む。同様に、「Ｃ２～６アルキニル」の表現は、エチニル基及びプロピニル基、並びに直鎖又は分岐鎖のブチニル基、ペンチニル基及びヘキシニル基を含む。
【0026】
本明細書で使用される「アリール」は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インデニル、ペンタレニル、アズレニル、ビフェニレニル（biphenylenyl）等の炭素環式芳香族環系（carbocyclic aromatic ring system）を表す。また、アリールは、上に列挙される炭素環式芳香族環系の部分水素化誘導体を含むことが意図される。かかる部分水素化誘導体の非限定的な例は１，２，３，４－テトラヒドロナフチル、１，４－ジヒドロナフチル等である。
【0027】
本明細書で使用される「アリールオキシ」は、基－Ｏ－アリールを表し、ここで、アリールは上に定義される通りである。
【0028】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」（それ自体で、又は「ヘテロアリールオキシ」若しくは「ヘテロアリールアルキル」等の任意の組み合わせで）は、限定されないが、ピロール、ピラゾール、フラン、チオフェン、キノリン、イソキノリン、キナゾリニル、ピリジン、ピリミジン、オキサゾール、チアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、トリアゾール、イミダゾール、又はベンズイミダゾール等の１以上の環が、Ｎ、Ｏ又はＳからなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む、５員～１０員の芳香族環系である。
【0029】
本明細書で使用される「複素環又はヘテロシクリル」（それ自身で、又は「ヘテロシクリルアルキル」等の任意の組み合わせで）は、限定されないが、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、テトラヒドロピラン、又はイミダゾリジン等の１以上の環がＮ、Ｏ又はＳからなる群から選択される１以上のヘテロ原子を含む、飽和又は部分不飽和の４員～１０員の環系である。
【0030】
本明細書で使用される「Ｃ１～６パーフルオロアルキル」の表現は、上記アルキル基中の全ての水素原子がフッ素原子で置換されていることを意味する。実例として、トリフルオロメチル基及びペンタフルオロエチル基、並びに直鎖又は分岐鎖のヘプタフルオロプロピル基、ノナフルオロブチル基、ウンデカフルオロペンチル基及びトリデカフルオロヘキシル基が挙げられる。「Ｃ１～６パーフルオロアルコキシ」の派生する表現は、適宜解釈される。
【0031】
本明細書に使用される「Ｃ３～８シクロアルキル」の表現は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルを意味する。
【0032】
本明細書で使用される「Ｃ３～８シクロアルキルＣ１～６アルキル」の表現は、本明細書に定義されるＣ３～８シクロアルキルが本明細書に定義されるＣ１～６アルキルに更に付着されていることを意味する。代表例として、シクロプロピルメチル、１－シクロブチルエチル、２－シクロペンチルプロピル、シクロヘキシルメチル、２－シクロヘプチルエチル、及び２－シクロオクチルブチル等が挙げられる。
【0033】
本明細書で使用される「ハロゲン」又は「ハロ」は、クロロ、フルオロ、ブロモ及びヨードを意味する。
【0034】
本明細書で使用される「Ｃ１～６アルキルスルホニル」は、本発明において、基－Ｓ（＝Ｏ）２Ｃ１～６アルキルを示し、ここで、Ｃ１～６アルキルは上に定義される通りである。代表例として、限定されないが、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ－プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、ｉｓｏ－ブチルスルホニル、ｓｅｃ－ブチルスルホニル、ｔｅｒｔ－ブチルスルホニル、ｎ－ペンチルスルホニル、イソペンチルスルホニル、ネオペンチルスルホニル、ｔｅｒｔ－ペンチルスルホニル、ｎ－ヘキシルスルホニル、イソヘキシルスルホニル等が挙げられる。
【0035】
本明細書で使用される「アリールスルホニル」は基－Ｓ（＝Ｏ）２アリールを表し、ここで、アリールは上に定義される通りである。
【0036】
本明細書で使用される「ヘテロアリールスルホニル」は基－Ｓ（＝Ｏ）２ヘテロアリールを表し、ここで、ヘテロアリールは上に定義される通りである。
【0037】
本明細書で使用される「患者」は、例えばラット、マウス、イヌ、ネコ、モルモット、及びヒト等の霊長類等の温血動物を意味する。
【0038】
本明細書に使用される「薬学的に許容可能な担体」の表現は、無毒な溶媒、分散剤、賦形剤、アジュバント、又は医薬組成物、すなわち患者への投与が可能な剤形の形成を可能とするため本発明の化合物と混合される他の材料を意味する。かかる担体の１つの例は、非経口投与に典型的に使用される薬学的に許容可能な油である。
【0039】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な塩」の用語は、本発明の化合物の塩が医薬製剤において使用され得ることを意味する。しかしながら、他の塩が、本発明による化合物又はそれらの薬学的に許容可能な塩の作製に有用な場合がある。本発明の化合物の好適な薬学的に許容可能な塩として、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、グルタル酸、酢酸、サリチル酸、ケイ皮酸、２－フェノキシ安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、炭酸、又はリン酸等の薬学的に許容可能な酸の溶液と本発明による化合物の溶液とを混合することによって形成され得る酸付加塩が挙げられる。また、オルトリン酸一水素ナトリウム及び硫酸水素カリウム等の酸性金属塩も形成され得る。また、そのように形成される塩は、モノ－又はジ－酸性塩のいずれかとして存在し得て、また水和されて又は実質的に無水のいずれかで存在することができる。さらに、本発明の化合物が酸性部分を持つ場合、その好適な薬学的に許容可能な塩として、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩；及び好適な有機配位子と共に形成される塩、例えば第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【0040】
「置換、置換された」は、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６パーフルオロアルキル、ヒドロキシ、－ＣＯ２Ｈ、エステル、アミド、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６パーフルオロアルコキシ、－ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ、－ＮＨ－低級アルキル、及び－Ｎ（低級アルキル）２からなる群から独立して選択される１個～２個の置換基によって置換されていることを意味する。
【0041】
「治療的有効量」は、指定される障害又は状態を治療するのに有効な化合物の量を意味する。
【0042】
「含む、含んでいる」の用語は、「含む、含んでいる」の単語の前にあるもの全てを含むが、これらに限定されないことを意味する。したがって、「含む、含んでいる」の用語の使用は、列挙される要素が必要とされる又は必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
【0043】
「からなる」は、「からなる」の前にあるもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」の句は、列挙される要素が必要とされ、又は必須であり、他の要素は存在し得ないことを示す。
【0044】
また、本明細書に使用される「キット」の用語は、いかなる具体的な装置にも限定されず、限定されないがマイクロアレイ、バイオアレイ、バイオチップ、又はバイオチップアレイ等の本発明を実施するのに適した任意の装置を備えることに留意されたい。
【0045】
本明細書に実例として記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素（単数又は複数）、限定（単数又は複数）のない状態で好適に実施されてもよい。したがって、例えば、「含む、含んでいる（comprising）」、「含む、含んでいる、挙げられる（including）」、「含有する、含有している（containing）」等の用語は、拡大的に、限定なく読まれるものとする。さらに、本明細書で採用される用語及び表現は、限定ではなく説明する用語として使用されており、かかる用語及び表現の使用において、示され記載される特徴又はそれらの一部の任意の等価物を除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲において様々な修飾が可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される好ましい実施形態に具体化される本発明の任意の特徴、変更形態及び変形形態が当業者によって用いられてもよく、かかる変更形態及び変形形態は、本発明の範囲に含まれるものとすることが理解されるべきである。
【0046】
詳細な説明
本発明は、ＮＯ経路、特にｉＮＯＳをマウスモデルにおける大動脈疾患の必須のメディエーターとして同定し、胸部大動脈障害における、特にヒトＴＡＡにおける介入に対して可能な標的としてかかる経路を示唆する。さらに、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１が血管壁ホメオスタシスの重要なメディエーターであり、胸部大動脈瘤において、特に症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）において、より詳しくはＭＦＳにおいてその発現が減少されることを示す。実際、Ａｄａｍｔｓ１欠損マウスにおける大動脈障害のヒト症候性ＦＴＡＡＤに対する類似点は、ＭＦＳにおけるＡＤＡＭＴＳ１下方制御がＭＦＳ患者における大動脈表現型の土台となっている可能性があることを示唆する。
本発明は、ＮＯ経路、特にｉＮＯＳをマウスモデルにおける大動脈疾患の必須のメディエーターとして同定し、胸部大動脈障害における、特にヒトＴＡＡにおける介入に対して可能な標的としてかかる経路を示唆する。さらに、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１が血管壁ホメオスタシスの重要なメディエーターであり、胸部大動脈瘤において、特に症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）において、より詳しくはＭＦＳにおいてその発現が減少されることを示す。実際、Ａｄａｍｔｓ１欠損マウスにおける大動脈障害のヒト症候性ＦＴＡＡＤに対する類似点は、ＭＦＳにおけるＡＤＡＭＴＳ１下方制御がＭＦＳ患者における大動脈表現型の土台となっている可能性があることを示唆する。
【0047】
本発明の発明者らは、以前に、レンチウイルス指向性が投与経路に依存すること、及び頸静脈への注射が大動脈壁の安定的で効率的な形質導入をもたらすことを報告した。このアプローチは、大動脈全体に亘るＡｄａｍｔｓ１の長期的なサイレンシングを達成し、血管壁で発現される遺伝子の分析のためのゲノム改変された（genomically modified）マウスの使用に対する代替法を提供する。サイレンシングモデルは、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスのものと識別不能な大動脈表現型の変化及び症状をもたらす。レンチウイルスサイレンシングの主要な実験の利益は、遺伝子ターゲティングのタイミングの制御である。コンディショナルノックアウトのアプローチにより大動脈壁においてこれを達成することは、３つの主な細胞型に特異的なドライバー（drivers）の同時使用を必要とし、実行できないであろう。対照的に、単一のレンチウイルス型が全ての血管壁細胞の遺伝子発現をノックダウンする。さらに、タイムドノックダウン（timed knockdown）は、大動脈障害を研究するための特有のモデルを提供し、本発明者らが疾患に結び付く病的なシーケンスを明らかにすることを可能とする。すなわちｓｉＡｄａｍｔｓ１形質導入は、即時の低血圧及びエラスチン分解、その後、急速な大動脈拡張を引き起こすのに対し、ＴＧＦβ－Ｓｍａｄ経路はレンチウイルス感染から１週間後～２週間後まで活性化されなかった。
【0048】
大動脈の中膜変性及び拡張は、症候性及び無症候性の大動脈疾患におけるＴＧＦβ及びＡｎｇＩＩの経路の活性化と関連するが、これらの経路の遮断は、疾患において少なくとも最初の２週間はｓｉＡｄａｍｔｓ１媒介大動脈拡張、中膜変性又は低血圧に対して顕著な効果を有しなかった。それにもかかわらず、本発明者らのデータは、これらの経路の後期段階に対する役割と対応する。この点について、ＴＧＦβの中和もまた、重度の進行型のＭＦＳ（Ｆｂｎ１ｍｇＲ／ｍｇＲマウス）の初期段階における動脈瘤の進行を抑制することはできなかったが、後期段階では保護した。
【0049】
高血圧は、ＡＡにおける危険因子とされるが、本発明者らの結果は、Ｌ－ＮＡＭＥの昇圧効果がＡｄａｍｔｓ１＋／－マウス及びＭＦＳマウスにおける大動脈拡張の回復と対応することを示す。拡張の回復は著しく速く、１週間で完了した。これらのマウスにおける弾性線維及びコラーゲンの沈着はＮＯＳ阻害の３週間後に正常レベルまで戻り、大動脈壁からのコラーゲンクリアランス及びエラスチン合成の誘導に対する機構の活性化を示唆した。本発明者らは３ヶ月齢～４ヶ月齢のマウスにおいてＮＯＳ阻害剤を使用しており、より高齢のマウスにおけるそれらの治療効果はまだ特定されていない。それにもかかわらず、本発明者らの結果は、ＮＯが大動脈疾患の主要なトリガーであり、またそれらの症状が持続するのに必要であることを明白に示す。
【0050】
脳及び腹部のＡＡのマウスモデルにおいてＮＯを関係付ける先の報告では、しばしば、薬理学的な対（versus）標的化遺伝子欠失アプローチに関して矛盾するデータが与えられている。例えば、Ｎｏｓ２に対する抑制性又は賦活性の役割がＡＡＡのモデルで報告されている。脳動脈瘤では、薬理学的阻害剤による結果は、Ｎｏｓ２が疾患発症に非常に重要であることを示すが、Ｎｏｓ２－／－マウス及び野生型マウスは同様の脳動脈瘤の発生を有する。本発明者らの分析では、遺伝学的研究は、Ｌ－ＮＡＭＥで得られた結果、すなわちＮｏｓ２－／－マウスがｓｉＡｄａｍｔｓ１誘発性大動脈障害に抵抗性であったことを支持する。したがって、このモデルにおけるＮＯの病理学的役割はＮｏｓ２によって媒介され、これはＡｄａｍｔｓ１サイレンシングの２日後には誘導される。Ｎｏｓ２は静止細胞では通常発現されないが、一旦誘導されると、高い活性を維持することに注目することが重要である。本発明者らは、２種類のＡｄａｍｔｓ１欠損マウスモデルであるＭＦＳマウス、またより重要なことにはＭＦＳ患者の大動脈切片において高いＮｏｓ２タンパク質を示す。まとめると、本発明者らの結果は、ＮＯＳ２媒介ＮＯ産生が、ＴＡＡの病因において、特に症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の病因において、特にＭＦＳ及びＡｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる大動脈障害において必須の役割を果たすことを示す。
【0051】
したがって、本発明の第１の態様は、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療、予防又は抑制を必要とする被験体におけるかかる治療、予防又は抑制の方法に有用な組成物であって、該方法が、ｉＮＯＳ遮断薬／阻害剤、又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを該被験体に投与することを含む、組成物に関する。本発明の第１の態様の方法は、たとえ、被験体が本発明において後に記載される方法論によってＴＡＡ若しくはＴＡＡを発症するリスクがあると診断された場合であっても、又は被験体が任意の他の既知の臨床上有効な方法論によってＴＡＡ若しくはＴＡＡを発症するリスクがあると診断された場合であっても有用であることに注目することが重要である。
【0052】
さらに、ＴＡＡは、全身性の結合組織疾患の顕著な特徴を示す症候性症状（presentations）（マルファン症候群、ＡＤＥＳＡＤ（Ａｄａｍｔｓ１欠損誘発性症候性大動脈疾患（ＡＤＥＳＡＤ）等）及びロイス・ディーツ症候群（ＬＤＳ））と、ＴＡＡによる大動脈二尖弁及び単離家族性ＴＡＡ等の無症候性症状とに更に分類され得ることが注目される。本発明の発明者らは、本明細書を通して、特に図６ｍ及び図６ｏにおいて、ｉＮＯＳ阻害剤が、２つの症候性症状、特にマルファン及びＡＤＥＳＡＤにおける進行性ＴＡＡ拡大の予防、制限、及び復調を目的とする医学療法として有用であることを明確に説明した。さらに、症候性症状は、一般に、疾患の発症及びその後の進行に関して同様の性質を提示し、特にそれらが全て数ある特徴の中でも弾性線維の断裂を特徴とする中膜変性を伴って発症することが良く知られ、したがって、２つの症候性症状において、中膜変性等の共通する性質の復調に有効な医学的治療が、ロイス・ディーツ症候群（ＬＤＳ）等の他の症候性症状においても有効であろうことはもっともらしく見える（図４ｈ、図４ｉ（それぞれ、ＡＤＥＳＡＤにおけるエラスチン破断及び線維症）を参照されたい）（また図６ｏ、図６ｈ及び図６ｊも参照されたい）ということに注目されたい。ＴＡＡによる大動脈二尖弁及び単離家族性ＴＡＡ等の無症候性症状について本発明の発明者らは、該疾患の無症候性症状に対する動物モデルを作製した（このモデルにおける中膜変性及び大動脈拡張が示される、図２ｅ、図２ｆ、及び図２ｇを参照されたい）。さらに、図４ｂ、図４ｃ、図４ｄ、図５ｄ、図５ｅ及び図５ｆは、ｉＮＯＳ阻害剤による治療は、かかる無症候性症状モデルにおける大動脈拡張及び中膜変性を予防し、上記疾患の無症候性症状のｉＮＯＳノックアウトマウスが中膜変性又は大動脈拡張を発症しないことを説明する。
【0053】
したがって、本発明者らは、本明細書において提供される証拠は、疾患の症候性及び無症候性の症状における進行性ＴＡＡ拡大の予防、制限及び復調を目的とする医学療法としてのｉＮＯＳ阻害剤の有用性を実証すると信じている。結果的に、本発明の明細書は、ＴＡＡの治療におけるｉＮＯＳ阻害剤の有用性を実証する。
【0054】
本発明の好ましい態様では、ｉＮＯＳ阻害剤が、ヒトＮＯＳ２構造のＬ－アルギニンリガンド領域のグアニジン部位で結合することができ、Ｌ－アルギニンの存在下でヒトＮＯＳ２アイソフォームを阻害することができる。この意味では、本発明者らは、ヒトＮＯＳ２構造のＬ－アルギニンリガンド領域のグアニジン部位を結合する能力、及びＬ－アルギニンの存在下でヒトＮＯＳ２アイソフォームを阻害する能力により特徴付けることによって「ｉＮＯＳ阻害剤」の表現を更に表した。創薬の早い時期から、異なる構造型の分子が同じ生物学的作用を誘発し得ることが知られていたことに留意されたい。本発明の場合、及び明細書を通して説明されるように、構造上多様な化合物は、図１８に図示されるものと同じように共通の標的に結合し、１４００Ｗ、アミノグアニジン（図１５ａ及び図１５ｂ）、Ｌ－Ｎａｍｅ（図４ｂ）、ＧＷ２７３６２９、Ｌ－ＮＩＬ及びクロトリマゾール（図１６）について図１７又は図６ｌに図示されるように、それらの化合物はいずれもＬ－アルギニンの存在下でヒトＮＯＳ２アイソフォームを阻害し、ＮＯの発現を減少させた。結果的に、請求項２の範囲に含まれる全てのｉＮＯＳ阻害剤が本発明の実施に有用となるはずであるということは間違いない。
【0055】
第１の態様の別の好ましい実施形態では、ｉＮＯＳ阻害剤が、Ｒ２によって残りの化合物に共有結合される以下の化学部分を含む：
（式中、
Ｒ１はメチル基、メチルアミン基又はアミノ基であり、Ｒ２はアミノ基又はメチレン基である）。
【化1】
Ｒ１はメチル基、メチルアミン基又はアミノ基であり、Ｒ２はアミノ基又はメチレン基である）。
【0056】
ｉＮＯＳ遮断薬／遮断薬はｉＮＯＳ選択的阻害剤であることが好ましい。より好ましくは、ｉＮＯＳ阻害剤は、１４００Ｗ、Ｌ－ＮＡＭＥ、ＢＹＫ１９１０２３、ＧＷ２７４１５０、ＧＷ２７３６２９、ＭＥＧ（コハク酸ナトリウム）、塩酸アミノグアニジン（ＡＧ）、Ｌ－カナバニン、Ｓ－（２－アミノエチル）－ＩＴＵ二臭化水素酸塩、２－イミノピペリジン塩酸塩、１－アミノ－２－ヒドロキシグアニジン、ｐ－トルエンスルホン酸塩、１，３－ＢＰ－ＩＴＵ二臭化水素酸塩、２－アミノ－４－メチルピリジン、Ｓ－メチルイソチオ尿素硫酸塩、カナバニン硫酸塩、ＭＥＧ（硫酸塩）、ＡＭＴ塩酸塩、Ｌ－ＮＩＬ二塩酸塩、１，３－ＰＢＩＴＵ、二臭化水素酸塩、Ｓ－（３－アミノプロピル）－ＩＴＵ二臭化水素酸塩、Ｓ－イソプロピルイソチオ尿素臭化水素酸塩、プロペニル－Ｌ－ＮＩＯ（塩酸塩）、２－イミノ－４－メチルピペリジン酢酸塩、Ｎ－ベンジルアセトアミド臭化水素酸塩、２－イミノ－４，６－ジメチルピペリジン、クマリンからなる群から選択される、又は式：
（式中、Ｒ１はＣ１～４アルキル、Ｃ３～４シクロアルキル、Ｃ１～４ヒドロキシアルキル、及びＣ１～４ハロアルキル、又はその薬学的に許容可能な塩から選択される）によって表される。
【化2】
【0057】
上に言及される化合物の幾つかは、本明細書において以下で表される：
【化3】
【0058】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、上記ｉＮＯＳ阻害剤は、
Ｓ－（（Ｒ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｄ－システイン、
Ｓ－（（Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｄ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｄ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）ブチル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ，２－シクロプロピル）エチル）－Ｌ－システイン、及び、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ，３－ヒドロキシ）プロピル）－Ｌ－システイン、
又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは生理学的に機能性の誘導体からなる群から選択される。
Ｓ－（（Ｒ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｄ－システイン、
Ｓ－（（Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｄ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）プロピル）－Ｄ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ）ブチル）－Ｌ－システイン、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ，２－シクロプロピル）エチル）－Ｌ－システイン、及び、
Ｓ－（（Ｒ／Ｓ）－２－（１－イミノエチルアミノ，３－ヒドロキシ）プロピル）－Ｌ－システイン、
又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは生理学的に機能性の誘導体からなる群から選択される。
【0059】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、ｉＮＯＳ阻害剤は、以下からなる群から選択される：
式Ｉを有する化合物
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、及び任意に１以上のハロによって置換され得るアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ハロ及び任意に１以上のハロによって置換され得るアルキルからなる群から選択され、
但し、Ｒ１又はＲ２の少なくとも一方がハロを含み、
Ｒ７は、Ｈ及びヒドロキシからなる群から選択され、
Ｊは、ヒドロキシ、アルコキシ及びＮＲ３Ｒ４からなる群から選択され、
ここで、
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、低級アルキレニル及び低級アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、及び環の少なくとも１つのメンバーが炭素であり、１個～約４個のヘテロ原子が独立して酸素、窒素及び硫黄から選択される複素環からなる群から選択され、該複素環は、任意に、ヘテロアリールアミノ、Ｎ－アリール－Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ－ヘテロアリールアミノ－Ｎ－アルキルアミノ、ハロアルキルチオ、アルカノイルオキシ、アルコキシ、ヘテロアラルコキシ、シクロアルコキシ、シクロアルケニルオキシ、ヒドロキシ、アミノ、チオ、ニトロ、低級アルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルチオアルキル、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリールチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルアミノスルホニル、アミドスルホニル、モノアルキルアミドスルホニル、ジアルキルアミドスルホニル、モノアリールアミドスルホニル、アリールスルホンアミド、ジアリールアミドスルホニル、モノアルキルモノアリールアミドスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、アルカノイル、アルケノイル、アロイル、ヘテロアロイル、アラルカノイル、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアルカノイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレンジオキシ、ハロアルキレンジオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、低級シクロアルキルアルキル、低級シクロアルケニルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシハロアルキル、ヒドロキシアラルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシヘテロアラルキル、ハロアルコキシアルキル、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールオキシアルキル、飽和ヘテロシクリル、部分飽和ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、シアノアルキル、ジシアノアルキル、カルボキサミドアルキル、ジカルボキサミドアルキル、シアノカルボアルコキシアルキル、カルボアルコキシアルキル、ジカルボアルコキシアルキル、シアノシクロアルキル、ジシアノシクロアルキル、カルボキサミドシクロアルキル、ジカルボキサミドシクロアルキル、カルボアルコキシシアノシクロアルキル、カルボアルコキシシクロアルキル、ジカルボアルコキシシクロアルキル、ホルミルアルキル、アシルアルキル、ジアルコキシホスホノアルキル、ジアラルコキシホスホノアルキル、ホスホノアルキル、ジアルコキシホスホノアルコキシ、ジアラルコキシホスホノアルコキシ、ホスホノアルコキシ、ジアルコキシホスホノアルキルアミノ、ジアラルコキシホスホノアルキルアミノ、ホスホノアルキルアミノ、ジアルコキシホスホノアルキル、ジアラルコキシホスホノアルキル、グアニジノ、アミジノ、及びアシルアミノで置換され得る）；
式ＩＩに対応する構造を有する化合物
（式中、
Ｘは－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、及び－Ｓ（Ｏ）２－からなる群から選択され、Ｒ１２はＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ－Ｃ１アルキル、及びＣ１～Ｃ５アルキルチオ－Ｃ１アルキルからなる群から選択され、ここで、これらの基はそれぞれ、任意に－ＯＨ、アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される１以上の置換基によって置換され、Ｒ１８は－ＯＲ２４及び－Ｎ（Ｒ２５）（Ｒ２６）からなる群から選択され、Ｒ１３は－Ｈ、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ２７、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ２８、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ２９からなる群から選択され、又はＲ１８は－Ｎ（Ｒ３０）－であり、Ｒ１３は－Ｃ（Ｏ）－であり、ここで、Ｒ１８及びＲ１３はそれらが付着する原子と共に環を形成し、又は、Ｒ１８は－Ｏ－であり、Ｒ１３は－Ｃ（Ｒ３１）（Ｒ３２）－であり、ここで、Ｒ１８及びＲ１３はそれらが付着する原子と共に環を形成し、ここで、Ｒ１３が－Ｃ（Ｒ３２１）（Ｒ３２）－である場合、Ｒ１４は－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３３であり、そうでなければ、Ｒ１４は－Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７は独立して、－Ｈ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル及びＣ１～Ｃ５アルコキシ－Ｃ１アルキルからなる群から選択され、Ｒ１９及びＲ２０は独立して、－Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル及びＣ１～Ｃ５アルコキシ－Ｃ１アルキルからなる群から選択され、Ｒ２１は－Ｈ、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３４、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ３５からなる群から選択され、Ｒ２２は－Ｈ、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３６、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ３７からなる群から選択され、又はＲ２１は－Ｏ－であり、Ｒ２２は－Ｃ（Ｏ）－であり、ここで、Ｒ２１及びＲ２２はそれらが付着される原子と共に環を形成し、又はＲ２１は－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ２２は－Ｏ－であり、ここで、Ｒ２１及びＲ２２はそれらが付着される原子と共に環を形成し、Ｒ２３はＣ１アルキルであり、Ｒ２４は－Ｈ及びＣ１～Ｃ６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｒ２４がＣ１～Ｃ６アルキルである場合、Ｒ２４は、任意にシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択される１以上の部分によって置換され、Ｒ２５は－Ｈ、アルキル、及びアルコキシからなる群から選択され、Ｒ２６は－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アルコキシ、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３８、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３９、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ４０からなる群から選択され、ここで、Ｒ２５及びＲ２６が独立してアルキル又はアルコキシである場合、Ｒ２５及びＲ２６は独立して、任意にシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される１以上の部分で置換され、又はＲ２５は－Ｈであり、Ｒ２６は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９及びＲ４０は、独立して－Ｈ及びアルキルからなる群から選択され、ここで、アルキルは任意にシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される１以上の部分によって置換され、ここで、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、及びＲ４０のいずれかが、独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択される部分である場合、該部分は、任意に－ＯＨ、アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される１以上の置換基で置換される）；
式ＩＩＩによって表される化合物
（式中、
Ｒ４１は、Ｈ又はメチルであり、
Ｒ４２は、Ｈ又はメチルである）；
式ＩＶの化合物
式Ｖの化合物
（式中、
Ｒ４３は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４４は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４５は、Ｃ１～Ｃ５アルキル、又はアルコキシ若しくは１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルである）；
式ＶＩの化合物
（式中、
Ｒ４６は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式ＶＩＩの化合物
（式中、
Ｒ４７は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４８は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４９は、Ｃ１～Ｃ５アルキル、又はアルコキシ若しくは１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルである）；
式ＶＩＩＩの化合物
（式中、
Ｒ５０は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式ＩＸの化合物
（式中、
Ｒ５０は、水素、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５１は、水素、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５２は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５３は、水素、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５４は、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式Ｘの化合物
（式中、
Ｒ５５は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式ＸＩを有する化合物
２Ｓ－アミノ－６－［（１－イミノエチル）アミノ］－Ｎ－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）ヘキサンアミド、水和物、二塩酸塩ＸＩ
式ＸＩＩの化合物：
（式中、
Ｒ７９は、Ｃ１～４アルキル、Ｃ３～４シクロアルキル、Ｃ１～４ヒドロキシアルキル、及びＣ１～４ハロアルキルから選択される）；
式ＸＩＩＩ、式ＸＩＶ又は式ＸＶの化合物：
（式中、
Ａは－Ｒ５６、－ＯＲ５６、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、Ｐ（Ｏ）［Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７］２、－Ｎ（Ｒ５６）Ｃ（Ｏ）Ｒ５７、－Ｎ（Ｒ７６）Ｃ（Ｏ）ＯＲ５６、－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７６、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔＲ５６、－ＳＯ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ５６、－ＮＨＳＯ２Ｒ７７、－ＳＯ２ＮＨ（Ｒ５６）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＳＯ２Ｒ７７、及び－ＣＨ＝ＮＯＲ５６であり、
Ｘ、Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＮ又はＣ（Ｒ１９）であり、
ＵはそれぞれＮ又はＣ（Ｒ６０）であり、
但し、ＸがＮであり、Ｚ及びＹがＣＲ７４である場合のみＵはＮであり、
ＶはＮ（Ｒ５９）、Ｓ、Ｏ又はＣ（Ｒ５９）Ｈであり、
ＷはそれぞれＮ又はＣＨであり、
Ｑは、直接結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｎ－Ｒ５６）－、Ｓ（Ｏ）ｔ、及び－Ｎ（Ｒ６１）－からなる群から選択され、
ｍは０又は１～４の整数であり、
ｎは０又は１～３の整数であり、
ｑは０又は１であり、
ｒは０又は１であり、
但し、Ｑ及びＶがヘテロ原子である場合、ｍ、ｑ及びｒはいずれも０であり得ず、
Ａが－ＯＲ５６、Ｎ（Ｒ５６）Ｃ（Ｏ）Ｒ５７、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ５７、－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７６、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔＲ５６（ｔが０である場合）、又は－ＮＨＳＯ２Ｒ７７である場合、ｎ、ｑ及びｒはいずれも０であり得ず、
Ｑがヘテロ原子であり、Ａが－ＯＲ５６、Ｎ（Ｒ５６）Ｃ（Ｏ）Ｒ５７、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ５７、－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７６、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔＲ５６（ｔが０である場合）、又は－ＮＨＳＯ２Ｒ７７である場合、ｍ及びｎはどちらも０にはなり得ず、
ｔは、０、１又は２であり、
は、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
は、任意に置換されたカルボシクリル又は任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
Ｒ５６及びＲ５７はそれぞれ独立して、水素、任意に置換されたＣ１～Ｃ２０アルキル、任意に置換されたシクロアルキル、－［Ｃ０～Ｃ８アルキル］－Ｒ６４、－［Ｃ２～Ｃ８アルケニル］－Ｒ６４、－［Ｃ２～Ｃ８アルキニル］－Ｒ６４、－［Ｃ２～Ｃ８アルキル］－Ｒ６５（任意にヒドロキシによって置換された）、－［Ｃ１～Ｃ８］－Ｒ６６（任意にヒドロキシによって置換された）、任意に置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
又はＲ５６及びＲ５７はそれらが付着される窒素原子と共に、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
Ｒ５８は、水素、アルキル、シクロアルキル、任意に置換されたアリール、ハロアルキル、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６３、－［Ｃ２～Ｃ８アルキル］－Ｒ６５、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６６、及びヘテロシクリル（任意にハロ、アルキル、アルコキシ及びイミダゾリルからなる群から選択される１以上の置換基によって置換される）からなる群から選択され、
又は、Ｑが－Ｎ（Ｒ５８）－である、若しくはＲ５８に直接結合される場合、Ｒ５８は更に、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、及び－Ｃ（＝ＮＲ７３）－ＮＨ２であり得て、
又は－Ｑ－Ｒ５８は共に－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、若しくは、
を表し、
Ｒ５９は、水素、アルキル、アリール、アラルキル及びシクロアルキルからなる群から選択され、
但し、Ａが－Ｒ５６又は－ＯＲ５６である場合、Ｒ５９は水素になり得ず、ＶがＣＨである場合、更にＲ５９はヒドロキシであり得て、
Ｒ６０は、水素、アルキル、アリール、アラルキル、ハロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアリール、－ＯＲ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔ－Ｒ７１、Ｎ（Ｒ７１）Ｒ７６、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ７１、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｒ７１、－［Ｃ０～Ｃ８アルキル］－Ｃ（Ｈ）［Ｃ（Ｏ）Ｒ７１］２、及び－［Ｃ０～Ｃ８アルキル］－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１からなる群から選択され、
Ｒ６１は、水素、アルキル、シクロアルキル、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６３、－［Ｃ２～Ｃ８］アルキル］－Ｒ６５、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６６、アシル、－Ｃ（Ｏ）Ｒ６３、－Ｃ（Ｏ）－、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６３、アルコキシカルボニル、任意に置換されたアリールオキシカルボニル、任意に置換されたアラルコキシカルボニル（aralkoxycarbonyl）、アルキルスルホニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、アルコキシカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、任意に置換されたアリールスルホニル、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、任意に置換されたアリールアミノカルボニル、アミノスルホニル、モノアルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、アリールスルホニルアミノカルボニル、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリル、－Ｃ（＝ＮＨ）－Ｎ（ＣＮ）Ｒ５６、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７８－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７８－Ｃ（Ｏ）ＯＲ５６からなる群から選択され、
Ｒ６３及びＲ６４はそれぞれ独立して、ハロアルキル、（ハロ、シアノ、アルキル、又はアルコキシで任意に置換された）シクロアルキル、（ハロ、アルキル、及びアルコキシからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換された）カルボシクリル、及び（アルキル、アラルキル又はアルコキシで任意に置換された）ヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ６５はそれぞれ独立して、ハロ、アルコキシ、任意に置換されたアリールオキシ、任意に置換されたアラルコキシ、任意に置換された－Ｓ（Ｏ）ｔ－Ｒ７７、アシルアミノ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、（トリフェニルメチル）アミノ、ヒドロキシ、メルカプト、アルキルスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｒ６６はそれぞれ独立して、シアノ、ジ（アルコキシ）アルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、及びジアルキルアミノカルボニルからなる群から選択され、
Ｒ６７、Ｒ６８、Ｒ６９、Ｒ７０、Ｒ７２及びＲ７５はそれぞれ独立して水素又はアルキルであり、
Ｒ７１はそれぞれ独立して、水素、アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアラルキル、又はシクロアルキルであり、
Ｒ７３は、水素、ＮＯ２又はトルエンスルホニルであり、
Ｒ７４はそれぞれ独立して、水素、（任意にヒドロキシで置換された）アルキル、シクロプロピル、ハロ、又はハロアルキルであり、
Ｒ７６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアラルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７７、又は－ＳＯ２Ｒ７７であり、
又は、Ｒ７６と、Ｒ５６及びそれらが付着される窒素は共に、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
又はＲ７６と、Ｒ７１及びそれらが付着される窒素は共に、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
Ｒ７７は、それぞれ独立してアルキル、シクロアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたアラルキルであり、
Ｒ７８はアミノ酸残基である）、及び、
、又は上記誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤のいずれかの薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグ。
式Ｉを有する化合物
【化4】
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、及び任意に１以上のハロによって置換され得るアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ハロ及び任意に１以上のハロによって置換され得るアルキルからなる群から選択され、
但し、Ｒ１又はＲ２の少なくとも一方がハロを含み、
Ｒ７は、Ｈ及びヒドロキシからなる群から選択され、
Ｊは、ヒドロキシ、アルコキシ及びＮＲ３Ｒ４からなる群から選択され、
ここで、
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、低級アルキレニル及び低級アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、及び環の少なくとも１つのメンバーが炭素であり、１個～約４個のヘテロ原子が独立して酸素、窒素及び硫黄から選択される複素環からなる群から選択され、該複素環は、任意に、ヘテロアリールアミノ、Ｎ－アリール－Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ－ヘテロアリールアミノ－Ｎ－アルキルアミノ、ハロアルキルチオ、アルカノイルオキシ、アルコキシ、ヘテロアラルコキシ、シクロアルコキシ、シクロアルケニルオキシ、ヒドロキシ、アミノ、チオ、ニトロ、低級アルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルチオアルキル、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリールチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホンアミド、アルキルアミノスルホニル、アミドスルホニル、モノアルキルアミドスルホニル、ジアルキルアミドスルホニル、モノアリールアミドスルホニル、アリールスルホンアミド、ジアリールアミドスルホニル、モノアルキルモノアリールアミドスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、アルカノイル、アルケノイル、アロイル、ヘテロアロイル、アラルカノイル、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアルカノイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレンジオキシ、ハロアルキレンジオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、低級シクロアルキルアルキル、低級シクロアルケニルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシハロアルキル、ヒドロキシアラルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシヘテロアラルキル、ハロアルコキシアルキル、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールオキシアルキル、飽和ヘテロシクリル、部分飽和ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、シアノアルキル、ジシアノアルキル、カルボキサミドアルキル、ジカルボキサミドアルキル、シアノカルボアルコキシアルキル、カルボアルコキシアルキル、ジカルボアルコキシアルキル、シアノシクロアルキル、ジシアノシクロアルキル、カルボキサミドシクロアルキル、ジカルボキサミドシクロアルキル、カルボアルコキシシアノシクロアルキル、カルボアルコキシシクロアルキル、ジカルボアルコキシシクロアルキル、ホルミルアルキル、アシルアルキル、ジアルコキシホスホノアルキル、ジアラルコキシホスホノアルキル、ホスホノアルキル、ジアルコキシホスホノアルコキシ、ジアラルコキシホスホノアルコキシ、ホスホノアルコキシ、ジアルコキシホスホノアルキルアミノ、ジアラルコキシホスホノアルキルアミノ、ホスホノアルキルアミノ、ジアルコキシホスホノアルキル、ジアラルコキシホスホノアルキル、グアニジノ、アミジノ、及びアシルアミノで置換され得る）；
式ＩＩに対応する構造を有する化合物
【化5】
Ｘは－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、及び－Ｓ（Ｏ）２－からなる群から選択され、Ｒ１２はＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ－Ｃ１アルキル、及びＣ１～Ｃ５アルキルチオ－Ｃ１アルキルからなる群から選択され、ここで、これらの基はそれぞれ、任意に－ＯＨ、アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される１以上の置換基によって置換され、Ｒ１８は－ＯＲ２４及び－Ｎ（Ｒ２５）（Ｒ２６）からなる群から選択され、Ｒ１３は－Ｈ、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ２７、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ２８、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ２９からなる群から選択され、又はＲ１８は－Ｎ（Ｒ３０）－であり、Ｒ１３は－Ｃ（Ｏ）－であり、ここで、Ｒ１８及びＲ１３はそれらが付着する原子と共に環を形成し、又は、Ｒ１８は－Ｏ－であり、Ｒ１３は－Ｃ（Ｒ３１）（Ｒ３２）－であり、ここで、Ｒ１８及びＲ１３はそれらが付着する原子と共に環を形成し、ここで、Ｒ１３が－Ｃ（Ｒ３２１）（Ｒ３２）－である場合、Ｒ１４は－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３３であり、そうでなければ、Ｒ１４は－Ｈであり、Ｒ１１、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７は独立して、－Ｈ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル及びＣ１～Ｃ５アルコキシ－Ｃ１アルキルからなる群から選択され、Ｒ１９及びＲ２０は独立して、－Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル及びＣ１～Ｃ５アルコキシ－Ｃ１アルキルからなる群から選択され、Ｒ２１は－Ｈ、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３４、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ３５からなる群から選択され、Ｒ２２は－Ｈ、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３６、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ３７からなる群から選択され、又はＲ２１は－Ｏ－であり、Ｒ２２は－Ｃ（Ｏ）－であり、ここで、Ｒ２１及びＲ２２はそれらが付着される原子と共に環を形成し、又はＲ２１は－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ２２は－Ｏ－であり、ここで、Ｒ２１及びＲ２２はそれらが付着される原子と共に環を形成し、Ｒ２３はＣ１アルキルであり、Ｒ２４は－Ｈ及びＣ１～Ｃ６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｒ２４がＣ１～Ｃ６アルキルである場合、Ｒ２４は、任意にシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択される１以上の部分によって置換され、Ｒ２５は－Ｈ、アルキル、及びアルコキシからなる群から選択され、Ｒ２６は－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アルコキシ、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ３８、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ３９、及び－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－Ｒ４０からなる群から選択され、ここで、Ｒ２５及びＲ２６が独立してアルキル又はアルコキシである場合、Ｒ２５及びＲ２６は独立して、任意にシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される１以上の部分で置換され、又はＲ２５は－Ｈであり、Ｒ２６は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９及びＲ４０は、独立して－Ｈ及びアルキルからなる群から選択され、ここで、アルキルは任意にシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される１以上の部分によって置換され、ここで、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、及びＲ４０のいずれかが、独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択される部分である場合、該部分は、任意に－ＯＨ、アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される１以上の置換基で置換される）；
式ＩＩＩによって表される化合物
【化6】
Ｒ４１は、Ｈ又はメチルであり、
Ｒ４２は、Ｈ又はメチルである）；
式ＩＶの化合物
【化7】
【化8】
Ｒ４３は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４４は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４５は、Ｃ１～Ｃ５アルキル、又はアルコキシ若しくは１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルである）；
式ＶＩの化合物
【化9】
Ｒ４６は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式ＶＩＩの化合物
【化10】
Ｒ４７は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４８は、水素、ハロ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、及びアルコキシ又は１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４９は、Ｃ１～Ｃ５アルキル、又はアルコキシ若しくは１以上のハロによって置換されたＣ１～Ｃ５アルキルである）；
式ＶＩＩＩの化合物
【化11】
Ｒ５０は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式ＩＸの化合物
【化12】
Ｒ５０は、水素、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５１は、水素、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５２は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５３は、水素、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換され、
Ｒ５４は、ハロ及びＣ１～Ｃ５アルキルからなる群から選択され、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式Ｘの化合物
【化13】
Ｒ５５は、Ｃ１～Ｃ５アルキルであり、該Ｃ１～Ｃ５アルキルは、任意にハロ又はアルコキシによって置換され、該アルコキシは、任意に１以上のハロによって置換される）；
式ＸＩを有する化合物
【化14】
式ＸＩＩの化合物：
【化15】
Ｒ７９は、Ｃ１～４アルキル、Ｃ３～４シクロアルキル、Ｃ１～４ヒドロキシアルキル、及びＣ１～４ハロアルキルから選択される）；
式ＸＩＩＩ、式ＸＩＶ又は式ＸＶの化合物：
【化16】
Ａは－Ｒ５６、－ＯＲ５６、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、Ｐ（Ｏ）［Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７］２、－Ｎ（Ｒ５６）Ｃ（Ｏ）Ｒ５７、－Ｎ（Ｒ７６）Ｃ（Ｏ）ＯＲ５６、－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７６、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔＲ５６、－ＳＯ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ５６、－ＮＨＳＯ２Ｒ７７、－ＳＯ２ＮＨ（Ｒ５６）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＳＯ２Ｒ７７、及び－ＣＨ＝ＮＯＲ５６であり、
Ｘ、Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＮ又はＣ（Ｒ１９）であり、
ＵはそれぞれＮ又はＣ（Ｒ６０）であり、
但し、ＸがＮであり、Ｚ及びＹがＣＲ７４である場合のみＵはＮであり、
ＶはＮ（Ｒ５９）、Ｓ、Ｏ又はＣ（Ｒ５９）Ｈであり、
ＷはそれぞれＮ又はＣＨであり、
Ｑは、直接結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｎ－Ｒ５６）－、Ｓ（Ｏ）ｔ、及び－Ｎ（Ｒ６１）－からなる群から選択され、
ｍは０又は１～４の整数であり、
ｎは０又は１～３の整数であり、
ｑは０又は１であり、
ｒは０又は１であり、
但し、Ｑ及びＶがヘテロ原子である場合、ｍ、ｑ及びｒはいずれも０であり得ず、
Ａが－ＯＲ５６、Ｎ（Ｒ５６）Ｃ（Ｏ）Ｒ５７、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ５７、－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７６、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔＲ５６（ｔが０である場合）、又は－ＮＨＳＯ２Ｒ７７である場合、ｎ、ｑ及びｒはいずれも０であり得ず、
Ｑがヘテロ原子であり、Ａが－ＯＲ５６、Ｎ（Ｒ５６）Ｃ（Ｏ）Ｒ５７、－Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ５７、－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７６、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔＲ５６（ｔが０である場合）、又は－ＮＨＳＯ２Ｒ７７である場合、ｍ及びｎはどちらも０にはなり得ず、
ｔは、０、１又は２であり、
【化17】
【化18】
Ｒ５６及びＲ５７はそれぞれ独立して、水素、任意に置換されたＣ１～Ｃ２０アルキル、任意に置換されたシクロアルキル、－［Ｃ０～Ｃ８アルキル］－Ｒ６４、－［Ｃ２～Ｃ８アルケニル］－Ｒ６４、－［Ｃ２～Ｃ８アルキニル］－Ｒ６４、－［Ｃ２～Ｃ８アルキル］－Ｒ６５（任意にヒドロキシによって置換された）、－［Ｃ１～Ｃ８］－Ｒ６６（任意にヒドロキシによって置換された）、任意に置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
又はＲ５６及びＲ５７はそれらが付着される窒素原子と共に、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
Ｒ５８は、水素、アルキル、シクロアルキル、任意に置換されたアリール、ハロアルキル、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６３、－［Ｃ２～Ｃ８アルキル］－Ｒ６５、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６６、及びヘテロシクリル（任意にハロ、アルキル、アルコキシ及びイミダゾリルからなる群から選択される１以上の置換基によって置換される）からなる群から選択され、
又は、Ｑが－Ｎ（Ｒ５８）－である、若しくはＲ５８に直接結合される場合、Ｒ５８は更に、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、及び－Ｃ（＝ＮＲ７３）－ＮＨ２であり得て、
又は－Ｑ－Ｒ５８は共に－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、若しくは、
【化19】
Ｒ５９は、水素、アルキル、アリール、アラルキル及びシクロアルキルからなる群から選択され、
但し、Ａが－Ｒ５６又は－ＯＲ５６である場合、Ｒ５９は水素になり得ず、ＶがＣＨである場合、更にＲ５９はヒドロキシであり得て、
Ｒ６０は、水素、アルキル、アリール、アラルキル、ハロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアリール、－ＯＲ７１、－Ｓ（Ｏ）ｔ－Ｒ７１、Ｎ（Ｒ７１）Ｒ７６、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ７１、Ｎ（Ｒ７１）Ｃ（Ｏ）Ｒ７１、－［Ｃ０～Ｃ８アルキル］－Ｃ（Ｈ）［Ｃ（Ｏ）Ｒ７１］２、及び－［Ｃ０～Ｃ８アルキル］－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７１からなる群から選択され、
Ｒ６１は、水素、アルキル、シクロアルキル、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６３、－［Ｃ２～Ｃ８］アルキル］－Ｒ６５、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６６、アシル、－Ｃ（Ｏ）Ｒ６３、－Ｃ（Ｏ）－、－［Ｃ１～Ｃ８アルキル］－Ｒ６３、アルコキシカルボニル、任意に置換されたアリールオキシカルボニル、任意に置換されたアラルコキシカルボニル（aralkoxycarbonyl）、アルキルスルホニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、アルコキシカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、任意に置換されたアリールスルホニル、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、任意に置換されたアリールアミノカルボニル、アミノスルホニル、モノアルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、アリールスルホニルアミノカルボニル、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリル、－Ｃ（＝ＮＨ）－Ｎ（ＣＮ）Ｒ５６、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７８－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ５７、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ５６）Ｒ７８－Ｃ（Ｏ）ＯＲ５６からなる群から選択され、
Ｒ６３及びＲ６４はそれぞれ独立して、ハロアルキル、（ハロ、シアノ、アルキル、又はアルコキシで任意に置換された）シクロアルキル、（ハロ、アルキル、及びアルコキシからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換された）カルボシクリル、及び（アルキル、アラルキル又はアルコキシで任意に置換された）ヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ６５はそれぞれ独立して、ハロ、アルコキシ、任意に置換されたアリールオキシ、任意に置換されたアラルコキシ、任意に置換された－Ｓ（Ｏ）ｔ－Ｒ７７、アシルアミノ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、（トリフェニルメチル）アミノ、ヒドロキシ、メルカプト、アルキルスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｒ６６はそれぞれ独立して、シアノ、ジ（アルコキシ）アルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、及びジアルキルアミノカルボニルからなる群から選択され、
Ｒ６７、Ｒ６８、Ｒ６９、Ｒ７０、Ｒ７２及びＲ７５はそれぞれ独立して水素又はアルキルであり、
Ｒ７１はそれぞれ独立して、水素、アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアラルキル、又はシクロアルキルであり、
Ｒ７３は、水素、ＮＯ２又はトルエンスルホニルであり、
Ｒ７４はそれぞれ独立して、水素、（任意にヒドロキシで置換された）アルキル、シクロプロピル、ハロ、又はハロアルキルであり、
Ｒ７６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアラルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒ７７、又は－ＳＯ２Ｒ７７であり、
又は、Ｒ７６と、Ｒ５６及びそれらが付着される窒素は共に、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
又はＲ７６と、Ｒ７１及びそれらが付着される窒素は共に、任意に置換されたＮ－ヘテロシクリルであり、
Ｒ７７は、それぞれ独立してアルキル、シクロアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたアラルキルであり、
Ｒ７８はアミノ酸残基である）、及び、
【化20】
【0060】
本発明の第１の態様の更に別の好ましい実施形態では、ｉＮＯＳ阻害剤はクマリンであり、式（ＸＶＩ）：
（式中、
ＡはＯであり、
Ｒは（ＣＨ２）ｎＮＲ１Ｒ２からなる群から選択され、
ここで、Ｒ１及びＲ２は同一であるか又は異なり、水素、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２及びＣ１～Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは２～５の整数であり、
Ｘ１は水素であり、
Ｘ２は水素であり、
Ｘ３はハロゲンであり、
Ｘ４は水素であり、
Ｘ５は水素であり、
但し、ｎが２である場合、Ｒ１とＲ２はどちらかが水素ではなく又はどちらかがエチルではなく、Ｘ３は塩素である）の化合物、並びにその薬学的に許容可能な塩及び光学異性体からなる群から選択される。
【化21】
ＡはＯであり、
Ｒは（ＣＨ２）ｎＮＲ１Ｒ２からなる群から選択され、
ここで、Ｒ１及びＲ２は同一であるか又は異なり、水素、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２及びＣ１～Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ｎは２～５の整数であり、
Ｘ１は水素であり、
Ｘ２は水素であり、
Ｘ３はハロゲンであり、
Ｘ４は水素であり、
Ｘ５は水素であり、
但し、ｎが２である場合、Ｒ１とＲ２はどちらかが水素ではなく又はどちらかがエチルではなく、Ｘ３は塩素である）の化合物、並びにその薬学的に許容可能な塩及び光学異性体からなる群から選択される。
【0061】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、式ＸＶＩの化合物を指し、式中、
ＡはＯであり、
Ｒは（ＣＨ２）ｎＮＲ１Ｒ２であり、
Ｘ３はハロゲンである。
ＡはＯであり、
Ｒは（ＣＨ２）ｎＮＲ１Ｒ２であり、
Ｘ３はハロゲンである。
【0062】
Ｒ１Ｒ２は、水素、Ｃ１～６アルキル、及びＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２からなる群から選択されることが好ましい。
【0063】
Ｘ３は、臭素及び塩素からなる群から選択されることがより好ましい。
【0064】
化合物は、
６－クロロ－４－（３－アミノプロポキシ）－１－ベンゾピラン－２－オン、
６－クロロ－４－（３－メチルアミノ－プロポキシ）－１－ベンゾピラン－２－オン、
４－（２－アミノ－エトキシ）－６－クロロ－１－ベンゾピラン－２－オン、
４－（３－アミノ－プロポキシ）－６－ブロモ－１－ベンゾピラン－２－オン、
４－（３－アミノ－プロポキシ）－６－フルオロ－１－ベンゾピラン－２－オン、
６－クロロ－４－（３－ジメチルアミノ－プロポキシ）－１－ベンゾピラン－２－オン、
Ｎ－［３－（６－クロロ－２－オキソ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－４－イルオキシ）－プロピル］－グアニジン、
Ｎ－［３－（６－クロロ－２－オキソ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－４－イルオキシ）－プロピル］－アセトアミド、
４－（５－アミノ－ペンチルオキシ）－６－クロロ－１－ベンゾピラン－２－オン、
又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは生理学的に機能性の誘導体からなる群から選択される。
６－クロロ－４－（３－アミノプロポキシ）－１－ベンゾピラン－２－オン、
６－クロロ－４－（３－メチルアミノ－プロポキシ）－１－ベンゾピラン－２－オン、
４－（２－アミノ－エトキシ）－６－クロロ－１－ベンゾピラン－２－オン、
４－（３－アミノ－プロポキシ）－６－ブロモ－１－ベンゾピラン－２－オン、
４－（３－アミノ－プロポキシ）－６－フルオロ－１－ベンゾピラン－２－オン、
６－クロロ－４－（３－ジメチルアミノ－プロポキシ）－１－ベンゾピラン－２－オン、
Ｎ－［３－（６－クロロ－２－オキソ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－４－イルオキシ）－プロピル］－グアニジン、
Ｎ－［３－（６－クロロ－２－オキソ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－４－イルオキシ）－プロピル］－アセトアミド、
４－（５－アミノ－ペンチルオキシ）－６－クロロ－１－ベンゾピラン－２－オン、
又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは生理学的に機能性の誘導体からなる群から選択される。
【0065】
本発明の第１の態様による又はその好ましい実施形態のいずれかによる方法では、被験体は大動脈二尖弁；マルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）等の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）；無症候性ＴＡＡ；又はＡｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる大動脈障害と関連する任意の他の疾患を有する又はそれを患っている。
【0066】
本発明の第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかによる方法では、ｉＮＯＳ選択的阻害薬、又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを投与することが、１日当たり少なくとも１回の投薬で、経口的に、吸入によって、腸内で、又は非経口的に被験体に投与することを含む。
【0067】
本発明の第２の態様は、ＴＡＡ、又は大動脈二尖弁；又はマルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）等の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）；又は無症候性ＴＡＡ；又はＡｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる大動脈障害と関連する任意の他の疾患の治療、予防、又は抑制を必要とする患者における、かかる治療、予防又は抑制に使用される組成物であって、一定量のｉＮＯＳ選択的阻害剤、又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを含む、組成物に関する。好ましくは、かかるｉＮＯＳ選択的阻害剤は、本発明の第１の態様で定義され、又はその好ましい実施形態のいずれかで定義される。本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、上記組成物は、１日当たり少なくとも１回の投薬で、経口的に、吸入によって、腸内で、又は非経口的に被験体に投与される。
【0068】
本発明の第２の態様の別の好ましい実施形態では、被験体はマルファン症候群を有する、又はマルファン症候群を患う。
【0069】
一方、上記治療方法に加えて、本発明の発明者らは、マウス又はヒトにおけるＡｄａｍｔｓ１欠損が胸部大動脈表現型、特に症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）、より詳しくはＭＦＳを有する又はそれを患っている被験体又は患者の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）と明らかな相関を有することも見出した（実施例を参照されたい）。
【0070】
したがって、本発明の第３の態様は、ＴＡＡを発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）スクリーニングされる被験体の単離された生体試料から得られた、少なくともトロンボスポンジンモチーフ１を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１：A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 1）の発現パターン又は発現レベルを測定することと、（ｂ）スクリーニングされる被験体の少なくともＡＤＡＭＴＳ１の上記発現パターン又は発現レベルを、既に確立された発現パターン又は発現レベルと比較することとを含み、ここで、少なくともＡＤＡＭＴＳ１の発現減少が胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の指標である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【0071】
また、ＡＤＡＭＴＳ１基質は、本発明の第３の態様の目的にも使用され得ることに注目されたい。したがってこの意味で、本発明の第３の態様に記載される方法に代えて又はそれに加えて、本発明の第４の態様は、ＴＡＡを発症するリスクがある被験体をスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）スクリーニングされる被験体の単離された生体試料において、少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンを測定することと、
（ｂ）スクリーニングされる被験体の少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の上記発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンと、既に確立されている発現パターン又は発現レベルとを比較することと、
を含み、ここで、少なくともＡＤＡＭＴＳ１、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ及び／又はアグリカンネオエピトープの発現減少、並びに少なくともｉＮＯＳ、アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α及び／又はヘパリン結合ＥＧＦの過剰発現が胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の指標である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。好ましくは、本発明の第３又は第４の態様の方法は、大動脈二尖弁；又はマルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）等の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）；又は無症候性ＴＡＡ；又はＡｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる動脈障害と関連する任意の他の疾患（以下、ＴＡＡ及びこの段落で参照される疾患の一覧に含まれる任意の他の疾患は、本明細書で「ＴＡＡ関連疾患（"TAA related diseases" or "TAA related disease"）」と称される）等のＴＡＡを引き起こす疾患を発症するリスクがある被験体をスクリーニングする。
（ａ）スクリーニングされる被験体の単離された生体試料において、少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンを測定することと、
（ｂ）スクリーニングされる被験体の少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の上記発現パターン若しくは発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ又はアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンと、既に確立されている発現パターン又は発現レベルとを比較することと、
を含み、ここで、少なくともＡＤＡＭＴＳ１、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ及び／又はアグリカンネオエピトープの発現減少、並びに少なくともｉＮＯＳ、アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α及び／又はヘパリン結合ＥＧＦの過剰発現が胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の指標である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。好ましくは、本発明の第３又は第４の態様の方法は、大動脈二尖弁；又はマルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）等の症候性胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）；又は無症候性ＴＡＡ；又はＡｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる動脈障害と関連する任意の他の疾患（以下、ＴＡＡ及びこの段落で参照される疾患の一覧に含まれる任意の他の疾患は、本明細書で「ＴＡＡ関連疾患（"TAA related diseases" or "TAA related disease"）」と称される）等のＴＡＡを引き起こす疾患を発症するリスクがある被験体をスクリーニングする。
【0072】
本発明の第５の態様は、本発明の第３又は第４の態様のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）と、任意に（ｃ）臨床検査によって疾患の存在を確認する工程とを含む、ＴＡＡ関連疾患を患っていることが疑われる被験体を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【0073】
本発明の第６の態様は、本発明の第３又は第４の態様のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）を含む、ＴＡＡ関連疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断に有用なデータを得る方法に関する。
【0074】
本発明の第７の態様は、本発明の第３又は第４の態様のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）を含む、被験者を健康な被験体として又はＴＡＡ関連疾患を患っている被験者として分類するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【0075】
本発明の第８の態様は、本発明の第３又は第４の態様のいずれかの工程ａ）及び工程ｂ）を含む、ＴＡＡ関連疾患を患っている被験体において、治療に対する反応をモニターする又はＴＡＡ関連疾患の進行をモニターするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【0076】
本発明の第９の態様は、ＴＡＡ関連疾患を患っている患者を治療する方法であって、本発明の第３又は第４の態様のいずれかの工程ａ）又は工程ｂ）と、（ｃ）上記疾患と診断された患者を治療する工程とを含む、方法に関する。好ましくは、上記治療はｉＮＯＳ阻害剤、より好ましくは本発明の第１の態様に定義される又はその好ましい実施形態のいずれかに定義されるｉＮＯＳ阻害剤によるものである。代替的には、本発明は、本発明の第３又は第４の態様のいずれかの工程ａ）及び工程）を含む方法による、ＴＡＡ関連疾患と診断された患者での該疾患の治療に使用されるｉＮＯＳ阻害剤を含む組成物に関する。好ましくは、上記治療は選択的ｉＮＯＳ阻害剤、より好ましくは本発明の第１の態様に定義される又はその好ましい実施形態のいずれかに定義されるｉＮＯＳ阻害剤によるものである。
【0077】
好ましい実施形態、第３～第９のいずれかの態様の方法又は組成物では、ＴＡＡ関連疾患は、マルファン症候群、血管型エーラス・ダンロス、ロイス・ディーツ症候群（１型及び２型）、Ａｄａｍｔｓ１欠損によって引き起こされる大動脈障害、並びに家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）からなる群から選択され、好ましくはマルファン症候群である。
【0078】
別の好ましい実施形態、先のいずれかの態様の方法又は組成物では、生体試料は、スクリーニングされる被験体の生検試料（大動脈生検試料等）、又は血漿試料、血液試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料若しくは血清試料等の低侵襲生体試料からなる群から選択される。
【0079】
本発明の第１０の態様は、単離された生体試料において、少なくともＡＤＡＭＴＳ１及び／又は少なくとも誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の（タンパク質、ペプチド又はヌクレオチドの）差次的発現レベル、及び／又は少なくとも以下のＡＤＡＭＴＳ１基質：アグリカン、バーシカン、組織因子経路インヒビター－２（ＴＦＰＩ－２）、セマフォリン３Ｃ、ニドゲン－１、ニドゲン－２、デスモコリン－３、ディストログリカン、ｍａｃ－２、Ｉ型コラーゲン、アンフィレギュリン、ＴＧＦ－α、ヘパリン結合ＥＧＦ、シンデカン４、バーシカンネオエピトープ及びアグリカンネオエピトープのいずれかの発現パターンを特定するための、被験体がＴＡＡ関連疾患を患う又はそれを有するリスクをｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するためのバイオマーカー検出試薬を備えるキットのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。上記キットは、家族性胸部大動脈瘤及び解離（家族性ＴＡＡＤ）又はマルファン症候群（ＭＦＳ）等のＴＡＡ関連疾患を患うリスクを同定するために使用されることがより好ましい。
【0080】
好ましくは、本発明の第１０の態様は、単離された生体試料における少なくともＡＤＡＭＴＳ１の差次的発現レベルを特定するためのバイオマーカー検出試薬を備えるキットのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関し、ここで、少なくともＡＤＡＭＴＳ１の発現減少は、被験体がＴＡＡ関連疾患を患う又はそれを有するリスクをｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するためのＴＡＡ関連疾患の指標である。
【0081】
本発明の第１０の態様の別の好ましい実施形態では、上記キットは、少なくともＡｄａｍｔｓ１及び任意に一酸化窒素合成酵素２の検出のため少なくとも以下のヌクレオチド：
Ａｄａｍｔｓ１（ＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴ、ＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣ）、
Ｎｏｓ２（ＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴ、ＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＴＣＧ）、
を備える。
Ａｄａｍｔｓ１（ＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴ、ＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣ）、
Ｎｏｓ２（ＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴ、ＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＴＣＧ）、
を備える。
【0082】
上記のキットはｑＰＣＲ反応の実施に特に好適であり、そのための追加の試薬を含むことが好ましい。これらの反応は、製造業者のガイドラインに従ってＳＹＢＲマスターミックス（Applied Biosystems）により３反復（triplicate）で行われることが好ましい。
【0083】
本発明の第１０の態様の更に好ましい実施形態では、上記キットは、本発明の第１０の態様のキットにおいて定義されるペプチド又はタンパク質のいずれかを検出するため、抗体又はそのフラグメント等の好適な試薬を備える。
【0084】
本発明の第１０の態様の更なる好ましい実施形態では、単離された生体試料は、スクリーニングされる被験体の生検試料（大動脈生検試料等）、又は血漿試料、血液試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料若しくは血清試料等の低侵襲生体試料からなる群から選択される。
【0085】
本発明は、第３～第９の態様のいずれかに記載される方法のいずれかのコンピューターによって実施されるプロセスと並んで、かかるプロセスの実施に使用されるデバイスに更に関することに注意されたい。
【0086】
最後に、本発明がマウスモデルにおける大動脈疾患の必須のメディエーターとしてＮＯ経路、特にｉＮＯＳを同定し、かかる経路を胸部大動脈障害における介入に対する可能性のある標的として示唆するという事実によって、本発明の発明者らは、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療、予防又は抑制に有用な化合物を同定する新たなスクリーニング方法を設計した。胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療、予防又は抑制に有用な化合物を同定する上記スクリーニング方法は、以下の工程を含む。
１．ＮＯＳ阻害剤、特にｉＮＯＳ阻害剤として作用し得る化合物又は化合物群の同定。この目的のために、本発明を限定するものではないが、通常、一酸化窒素代謝産物を測定する確実な方法が必要とされる。ＮＯは、電気化学プローブ（しかしながら、これらは多くの制限を受ける）、電子常磁性共鳴分光法及び蛍光画像診断の直接のｉｎ ｖｉｖｏでの使用によって特定され得る。亜硝酸塩は、グリース反応及びその誘導体の使用、クロマトグラフィー及び化学発光によって特定され得る。また、Ｓ－ニトロソチオールも化学発光によって定量され得て、タンパク質上のそれらの場所の特定は、例えばビオチンスイッチ技術又はその誘導体によってＳ－ニトロソ化の部位にタグ付けすることを必要とする。本発明を限定しない、ＮＯＳ阻害剤として作用し得る化合物又は化合物群を同定する他の方法は、一酸化窒素が可溶性グアニリルシクラーゼを刺激して細胞ｃＧＭＰレベルを増加させるかどうかを判定することによる。この意味で、キナーゼ活性を、ケンプチド（kemptide）８μｇを含む反応において組み換えＰＫＧ１タンパク質３５ｎｇにより化学分析することができる。反応を、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）４０ｍＭ、ケンプチド（Sigma-Aldrich）８μｇ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＡＴＰ ６０μＭ、３２Ｐ－ｇ－ＡＴＰ ０．６μＣｉ、及び可変量のｃＧＭＰ（０ｎＭ～３０００ｎＭ）中、３０℃で５分間行う。反応を、Ｐ８１ホスホセルロース紙上のスポッティングによって停止し、液体シンチレーション計数によって活性を測定する。最後に、ｉＮＯＳ阻害剤の計算上のデザインもまた、本発明の一部をなす。
２．対応するｉｎ ｖｉｖｏ方法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法による、例えば、可変量の選択阻害剤に曝露された正常な線維芽細胞に由来するタンパク質抽出物の免疫ブロッティングでリン酸化ＲＬＣ（ｐＲＬＣ）のレベルを特定することによる、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療、予防又は抑制に対する、上記１）で同定された選択化合物の有用性の判定。これらのレベルを全ＲＬＣレベルに対して正規化する。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウス及びマルファン症候群のＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスモデルを含むマウスモデルにおける検証のため、ｐＲＬＣ／ＲＬＣ比を増加させる化合物を選択する。血圧を上昇させずに上行胸部大動脈の直径を減少させる化合物は、臨床試験に対する候補物質である。
１．ＮＯＳ阻害剤、特にｉＮＯＳ阻害剤として作用し得る化合物又は化合物群の同定。この目的のために、本発明を限定するものではないが、通常、一酸化窒素代謝産物を測定する確実な方法が必要とされる。ＮＯは、電気化学プローブ（しかしながら、これらは多くの制限を受ける）、電子常磁性共鳴分光法及び蛍光画像診断の直接のｉｎ ｖｉｖｏでの使用によって特定され得る。亜硝酸塩は、グリース反応及びその誘導体の使用、クロマトグラフィー及び化学発光によって特定され得る。また、Ｓ－ニトロソチオールも化学発光によって定量され得て、タンパク質上のそれらの場所の特定は、例えばビオチンスイッチ技術又はその誘導体によってＳ－ニトロソ化の部位にタグ付けすることを必要とする。本発明を限定しない、ＮＯＳ阻害剤として作用し得る化合物又は化合物群を同定する他の方法は、一酸化窒素が可溶性グアニリルシクラーゼを刺激して細胞ｃＧＭＰレベルを増加させるかどうかを判定することによる。この意味で、キナーゼ活性を、ケンプチド（kemptide）８μｇを含む反応において組み換えＰＫＧ１タンパク質３５ｎｇにより化学分析することができる。反応を、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）４０ｍＭ、ケンプチド（Sigma-Aldrich）８μｇ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＡＴＰ ６０μＭ、３２Ｐ－ｇ－ＡＴＰ ０．６μＣｉ、及び可変量のｃＧＭＰ（０ｎＭ～３０００ｎＭ）中、３０℃で５分間行う。反応を、Ｐ８１ホスホセルロース紙上のスポッティングによって停止し、液体シンチレーション計数によって活性を測定する。最後に、ｉＮＯＳ阻害剤の計算上のデザインもまた、本発明の一部をなす。
２．対応するｉｎ ｖｉｖｏ方法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法による、例えば、可変量の選択阻害剤に曝露された正常な線維芽細胞に由来するタンパク質抽出物の免疫ブロッティングでリン酸化ＲＬＣ（ｐＲＬＣ）のレベルを特定することによる、胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）の治療、予防又は抑制に対する、上記１）で同定された選択化合物の有用性の判定。これらのレベルを全ＲＬＣレベルに対して正規化する。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウス及びマルファン症候群のＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスモデルを含むマウスモデルにおける検証のため、ｐＲＬＣ／ＲＬＣ比を増加させる化合物を選択する。血圧を上昇させずに上行胸部大動脈の直径を減少させる化合物は、臨床試験に対する候補物質である。
【0087】
本発明は、本明細書において広く包括的に記載される。また、包括的な開示に含まれるより狭い下位概念（species）及び下位（sub-generic）分類の各々が本発明の一部をなす。これは、削除されるものが具体的に本明細書に列挙されるかどうかにかかわらず、但し書き又は否定的な限定を伴って、上位概念（genus）から任意の主題を除く本発明の包括的な記載を含む。
【0088】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲及び非限定的な実施例に含まれる。さらに、本発明の特徴又は態様が群によって記載される場合、当業者は、任意の個々のメンバー又はその群のメンバーのサブグループによっても本発明が説明されることを認識する。
【実施例】
【0089】
実施例１．実験手順
動物の処置
動物の処置は、ＣＮＩＣ倫理委員会によって承認され、動物の飼育及び実験的使用に関する欧州連合ガイドライン（European Union guidelines for the care and experimental use of animals）に準拠した。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスは、欧州マウス突然変異体アーカイブ（European Mouse Mutant Archive）［(EM:02291)B6;129P2-Adamts1<tm1Dgen>/H］から得られ、Ａｄａｍｔｓ１標的アレルのエクソン１とエクソン２の間のゲノム配列（ｃ７７８４）を置換するためのＬａｃＺ－Ｎｅｏカセットを保有した。Ｆｂｎ１遺伝子中に突然変異を持つＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス（Judge et al., 2004）、及びＮｏｓ２－／－マウス（Laubach et al., 1995）をJackson Laboratoriesから得た（それぞれ、ＪＡＸマウスストック０１２８８５番及び００７０７２番）。これらの３系統を先に９世代超に亘ってＣ５７ＢＬ／６に戻し交雑した。以下のプライマーを使用する尾部試料のＰＣＲによって全てのマウスの遺伝子型を特定した：Ａｄａｍｔｓ１マウス（５’－ＧＣＣＡＴＣＧＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧ－３’、５’－ＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ／ＧＧＴＴＧＴＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧ－３’；Ｎｏｓ２－／－マウス（５’ＡＣＡＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＣＣＧＧ３’；５’ＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣ３’、５’ＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＣＴＣＧ３’）；Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス（５’ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＴＧ３’、５’ＧＣＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＡ３’）。別段の定めがない限り、野生型の同腹子を対照として使用した。マウスを、皮下浸透ミニポンプ（Alzet Corp）を使用して、１μｇ／ｋｇ／分のＡｎｇ－ＩＩ（Sigma-Aldrich）又は１０ｍｇ／ｋｇ／日のロサルタン（Sigma Aldrich）で治療した。ＴＧＦβ１、２、３に対するモノクローナルｐａｎ抗体（pan-antibody）のクローン１Ｄ１１（BioXcell）を１週間当たり３回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。Ｎω－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル塩酸塩（Ｌ－ＮＡＭＥ、Sigma-Aldrich）を、飲用水中０．５ｍｇ／ｍｌで２１日間（及び感染したマウスにおけるＬＶｉ接種前の追加の３日間）に亘りマウスに与えた。
動物の処置
動物の処置は、ＣＮＩＣ倫理委員会によって承認され、動物の飼育及び実験的使用に関する欧州連合ガイドライン（European Union guidelines for the care and experimental use of animals）に準拠した。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスは、欧州マウス突然変異体アーカイブ（European Mouse Mutant Archive）［(EM:02291)B6;129P2-Adamts1<tm1Dgen>/H］から得られ、Ａｄａｍｔｓ１標的アレルのエクソン１とエクソン２の間のゲノム配列（ｃ７７８４）を置換するためのＬａｃＺ－Ｎｅｏカセットを保有した。Ｆｂｎ１遺伝子中に突然変異を持つＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス（Judge et al., 2004）、及びＮｏｓ２－／－マウス（Laubach et al., 1995）をJackson Laboratoriesから得た（それぞれ、ＪＡＸマウスストック０１２８８５番及び００７０７２番）。これらの３系統を先に９世代超に亘ってＣ５７ＢＬ／６に戻し交雑した。以下のプライマーを使用する尾部試料のＰＣＲによって全てのマウスの遺伝子型を特定した：Ａｄａｍｔｓ１マウス（５’－ＧＣＣＡＴＣＧＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧ－３’、５’－ＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ／ＧＧＴＴＧＴＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧ－３’；Ｎｏｓ２－／－マウス（５’ＡＣＡＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＣＣＧＧ３’；５’ＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣ３’、５’ＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＣＴＣＧ３’）；Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス（５’ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＴＧ３’、５’ＧＣＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＣＡ３’）。別段の定めがない限り、野生型の同腹子を対照として使用した。マウスを、皮下浸透ミニポンプ（Alzet Corp）を使用して、１μｇ／ｋｇ／分のＡｎｇ－ＩＩ（Sigma-Aldrich）又は１０ｍｇ／ｋｇ／日のロサルタン（Sigma Aldrich）で治療した。ＴＧＦβ１、２、３に対するモノクローナルｐａｎ抗体（pan-antibody）のクローン１Ｄ１１（BioXcell）を１週間当たり３回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。Ｎω－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル塩酸塩（Ｌ－ＮＡＭＥ、Sigma-Aldrich）を、飲用水中０．５ｍｇ／ｍｌで２１日間（及び感染したマウスにおけるＬＶｉ接種前の追加の３日間）に亘りマウスに与えた。
【0090】
血圧測定及びｉｎ ｖｉｖｏ画像化
自動ＢＰ－２０００血圧分析システム（米国ノースカロライナ州アペックスのVisitech Systems）を使用して、マウス尾部で動脈血圧（ＢＰ：blood pressure）を測定した。要するに、マウスを１週間の間毎日、血圧測定のため訓練した。訓練後、各マウスコホートにおけるベースライン血圧値を決定するため、治療の１日前又はレンチウイルス感染前に血圧を測定した。実験の間、測定を数回繰り返した。温めた表面（３７℃）上のｔａｉｌ－ｃｕｆｆ保定器に置いたマウスにおいて血圧測定結果を記録した。連続して１５回の収縮期及び拡張期の血圧測定を行い、マウス１匹当たり最後の１０回の読取り値を記録し、平均した。
自動ＢＰ－２０００血圧分析システム（米国ノースカロライナ州アペックスのVisitech Systems）を使用して、マウス尾部で動脈血圧（ＢＰ：blood pressure）を測定した。要するに、マウスを１週間の間毎日、血圧測定のため訓練した。訓練後、各マウスコホートにおけるベースライン血圧値を決定するため、治療の１日前又はレンチウイルス感染前に血圧を測定した。実験の間、測定を数回繰り返した。温めた表面（３７℃）上のｔａｉｌ－ｃｕｆｆ保定器に置いたマウスにおいて血圧測定結果を記録した。連続して１５回の収縮期及び拡張期の血圧測定を行い、マウス１匹当たり最後の１０回の読取り値を記録し、平均した。
【0091】
ｉｎ ｖｉｖｏ超音波画像について、ＶＥＶＯ ２１００超音波検査装置（カナダ、トロントのVisualSonics）による高周波の超音波によってイソフルオランで麻酔をかけたマウス（２％イソフルオラン）において、大動脈径をモニターした。ＶＥＶＯ ２１００ソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ１．５．０を使用して大動脈の画像の最大内径を測定した。記録は全て、動物の遺伝子型及び治療を知らされていない心臓病専門医及び検査技師によって行われた。ベースライン径を決定するため、レンチウイルスの投与又は対応する治療の前に測定を行い、実験の間、測定を数回繰り返した。
【0092】
ナノＰＥＴ－ＣＴスキャナ（ブダペストのMediso Medical Imaging Systems）に統合されたＸ線ＣＴシステムを使用し、麻酔（１．５％～２％イソフルオラン）をかけたマウスにおいて全身骨格を画像化した。５５Ｋｖ、５００ｍＡ／秒、Ｒｘ回転当たり３６０フレーム、及びピッチ＝１で画像を得た。Ｍｅｄｉｓソフトウェア（オランダのMedis）を用いて骨格３Ｄ再構成を行った。
【0093】
細胞の処置
マウス血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、記載される通りに（Esteban et al., 2011）単離し、生育させた。全ての実験を３継代～７継代の間行った。５時間に亘り、感染多重度（ＭＯＩ）＝３でＶＳＭＣに感染させた。その後、１０％ＦＢＳで補足した新鮮なＤＭＥＭで培地を置き換え、細胞を更に３日間培養し、４８時間に亘って血清飢餓状態におき、その後、タンパク質アッセイのため６時間、又はｍＲＮＡ発現分析のため４時間に亘ってＡｎｇ－ＩＩで刺激した。
マウス血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、記載される通りに（Esteban et al., 2011）単離し、生育させた。全ての実験を３継代～７継代の間行った。５時間に亘り、感染多重度（ＭＯＩ）＝３でＶＳＭＣに感染させた。その後、１０％ＦＢＳで補足した新鮮なＤＭＥＭで培地を置き換え、細胞を更に３日間培養し、４８時間に亘って血清飢餓状態におき、その後、タンパク質アッセイのため６時間、又はｍＲＮＡ発現分析のため４時間に亘ってＡｎｇ－ＩＩで刺激した。
【0094】
ｓｉＲＮＡをコードするレンチウイルスの産生及び感染
ＧＦＰ、及びマウスＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを発現するレンチウイルスをABM-GOODから購入した。ｓｉＲＮＡ配列は以下の通りであった：
＃ｓｉＲＮＡ２７（ＧＧＡＡＡＧＡＡＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡ）；
＃ｓｉＲＮＡ５７（ＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＧＧＡＧＡＧ）；
＃ｓｉＲＮＡ６９（ＣＴＴＣＣＧＡＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡ）。
ｓｉＣｔｌ（ＧＧＧＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＧＡＡ）を対照として使用した。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の一時的なリン酸カルシウムトランスフェクションによって偽型（Pseudo-typed）レンチウイルス産生を得た。リン酸カルシウム沈殿の除去から４８時間後にレンチウイルス粒子を含む上清を収集し、２６０００ｒｐｍで２時間、超遠心分離（ウルトラクリアチューブ、ＳＷ２８ローター、及びＯｐｔｉｍａ Ｌ－１００ ＸＰ超遠心分離機；Beckman）を行った。ウイルスを無菌ＰＢＳの冷たい溶液に懸濁し、４８時間に亘ってＪｕｒｋａｔ細胞の形質導入によって滴定した。形質導入効率（ＧＦＰ発現細胞）及び細胞死（ヨウ化プロピジウム染色）をフローサイトメトリーによって定量した。
ＧＦＰ、及びマウスＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを発現するレンチウイルスをABM-GOODから購入した。ｓｉＲＮＡ配列は以下の通りであった：
＃ｓｉＲＮＡ２７（ＧＧＡＡＡＧＡＡＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡ）；
＃ｓｉＲＮＡ５７（ＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＧＧＡＧＡＧ）；
＃ｓｉＲＮＡ６９（ＣＴＴＣＣＧＡＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡ）。
ｓｉＣｔｌ（ＧＧＧＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＧＡＡ）を対照として使用した。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の一時的なリン酸カルシウムトランスフェクションによって偽型（Pseudo-typed）レンチウイルス産生を得た。リン酸カルシウム沈殿の除去から４８時間後にレンチウイルス粒子を含む上清を収集し、２６０００ｒｐｍで２時間、超遠心分離（ウルトラクリアチューブ、ＳＷ２８ローター、及びＯｐｔｉｍａ Ｌ－１００ ＸＰ超遠心分離機；Beckman）を行った。ウイルスを無菌ＰＢＳの冷たい溶液に懸濁し、４８時間に亘ってＪｕｒｋａｔ細胞の形質導入によって滴定した。形質導入効率（ＧＦＰ発現細胞）及び細胞死（ヨウ化プロピジウム染色）をフローサイトメトリーによって定量した。
【0095】
ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入実験のため、動物に麻酔をかけ（ケタミン／キシラジン）、小さく切開して右頸静脈を露出させた（Esteban et al., 2011）。ウイルス溶液（１００μｌ、ＰＢＳ中１０９粒子／ｍｌ）を、Ａｎｇ－ＩＩミニポンプ埋め込みの３週間前又は大動脈拡張のモニタリングの１日前に右頸静脈に直接に接種した。ＧＦＰ及びＡｄａｍｔｓ１に対する免疫組織化学検査によって大動脈試料中で形質導入効率を分析した。
【0096】
大動脈組織学検査
ＣＯ２で誘導した安楽死の後、マウス大動脈を生理食塩水で灌流し、単離して、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定した。固定した大動脈からの５μｍパラフィン横断切片を、マッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ：Masson's trichrome）、アルシアンブルー若しくはヴァーヘフ・エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ：Verhoeff elastic-van Gieson）で染色するか、又は免疫組織化学検査若しくは免疫蛍光法に対して使用した。脱パラフィン切片を再水和し、沸騰させ、抗原を回収し（１０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ６）、ＰＢＳ中の１０％ヤギ血清と２％ＢＳＡで４５分間ブロックした。免疫組織化学検査又は免疫蛍光のため、以下の抗体と共に試料をインキュベートした：抗Ａｄａｍｔｓ１（１／１００；Santa Cruz）、抗ＧＦＰ（１／１００；Invitrogen）、抗ｐＳＭＡＤ２（１／５０ Cell Signaling）、抗ｐＳＭＡＤ２，３（１／１００ Santa Cruz）、抗ＴＧＦβ１（１／１００；Abcam ａｂ９２４８６）、ＮＯＳ２（１／１００ マウスについてはSanta Cruz、及びヒトについてはMillipore）。一次抗体を無関係なＩｇＧ（Santa Cruz）で置換することにより、特異性を判定した。免疫組織化学検査について、ＤＡＢ（Vector Laboratories）により発色させ、切片をヘマトキシリンで対比染色してＤＰＸ（Fluka）に封入した。２０倍、４０倍又は６３倍のＨＣＸ ＰＬ Ｆｌｕｏｔａｒ対物レンズを備えるＬｅｉｃａ ＤＭ２５００顕微鏡、及びＬｅｉｃａ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎスイートＶ３．５．０取得ソフトウェアのもとで画像を取得した。免疫蛍光について、二次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６複合化ヤギ抗ウサギ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７複合化ヤギ抗ウサギ（BD Phramigen）であった。ＤＡＰＩを含むＣｉｔｉｆｌｕｏｒ ＡＦ４封入剤（Aname）に切片を封入した。２０倍又は４０倍の油浸レンズを備えるＬｅｉｃａ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して、１０２４×１０２４ピクセル、８ビットで画像を取得した。
ＣＯ２で誘導した安楽死の後、マウス大動脈を生理食塩水で灌流し、単離して、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定した。固定した大動脈からの５μｍパラフィン横断切片を、マッソン・トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ：Masson's trichrome）、アルシアンブルー若しくはヴァーヘフ・エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ：Verhoeff elastic-van Gieson）で染色するか、又は免疫組織化学検査若しくは免疫蛍光法に対して使用した。脱パラフィン切片を再水和し、沸騰させ、抗原を回収し（１０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ６）、ＰＢＳ中の１０％ヤギ血清と２％ＢＳＡで４５分間ブロックした。免疫組織化学検査又は免疫蛍光のため、以下の抗体と共に試料をインキュベートした：抗Ａｄａｍｔｓ１（１／１００；Santa Cruz）、抗ＧＦＰ（１／１００；Invitrogen）、抗ｐＳＭＡＤ２（１／５０ Cell Signaling）、抗ｐＳＭＡＤ２，３（１／１００ Santa Cruz）、抗ＴＧＦβ１（１／１００；Abcam ａｂ９２４８６）、ＮＯＳ２（１／１００ マウスについてはSanta Cruz、及びヒトについてはMillipore）。一次抗体を無関係なＩｇＧ（Santa Cruz）で置換することにより、特異性を判定した。免疫組織化学検査について、ＤＡＢ（Vector Laboratories）により発色させ、切片をヘマトキシリンで対比染色してＤＰＸ（Fluka）に封入した。２０倍、４０倍又は６３倍のＨＣＸ ＰＬ Ｆｌｕｏｔａｒ対物レンズを備えるＬｅｉｃａ ＤＭ２５００顕微鏡、及びＬｅｉｃａ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎスイートＶ３．５．０取得ソフトウェアのもとで画像を取得した。免疫蛍光について、二次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６複合化ヤギ抗ウサギ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７複合化ヤギ抗ウサギ（BD Phramigen）であった。ＤＡＰＩを含むＣｉｔｉｆｌｕｏｒ ＡＦ４封入剤（Aname）に切片を封入した。２０倍又は４０倍の油浸レンズを備えるＬｅｉｃａ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して、１０２４×１０２４ピクセル、８ビットで画像を取得した。
【0097】
コラーゲン含有量についてマッソン・トリクローム及びＥＶＧの染色の画像をＩｍａｇｅＪ（http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html）により、またエラスチン破断の定量のためＭｅｔａＭｏｒｐｈ（カリフォルニア州サニーベールのMolecular Devices）により分析した。各動物について、３つの切片でエラスチン破断を数え、破断数の平均を計算した。プレゼンテーションのため、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ及びＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ（Adobe）で画像を処理した。
【0098】
免疫ブロット分析
マウスの大動脈試料を単離し、液体窒素で凍結した後、ホモジナイズした（ＭａｇＮＡ ｌｙｚｅｒ、Roche）。タンパク質抽出物を、プロテアーゼ、ホスファターゼ及びキナーゼの阻害剤で完結させた氷冷ＲＩＰＡバッファー（ＮａＣｌ ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８ ５０ｍＭ、１％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）中で溶解することにより得た。ＶＳＭＣについては、細胞を感染させた後、ＡｎｇＩＩで刺激し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡバッファー中で溶解した。
マウスの大動脈試料を単離し、液体窒素で凍結した後、ホモジナイズした（ＭａｇＮＡ ｌｙｚｅｒ、Roche）。タンパク質抽出物を、プロテアーゼ、ホスファターゼ及びキナーゼの阻害剤で完結させた氷冷ＲＩＰＡバッファー（ＮａＣｌ ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８ ５０ｍＭ、１％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）中で溶解することにより得た。ＶＳＭＣについては、細胞を感染させた後、ＡｎｇＩＩで刺激し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡバッファー中で溶解した。
【0099】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上、還元条件下でタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質検出を以下の一次抗体で行った：抗Ａｄａｍｔｓ１（１／１０００；Santa Cruz）、抗ＧＦＰ（１／１０００；Invitrogen）、抗ｐＳＭＡＤ２（１／５００；Cell Signaling）、抗アルファチューブリン（１／４００００；Sigma-Aldrich）、抗ＧＡＰＤＨ（１／１００００；Abcam）。結合した抗体を、増強化学発光（ＥＣＬ：enhanced chemiluminescence）検出試薬（Millipore）で検出した。
【0100】
ＲＴ及び定量的ＰＣＲ
５ｍｌの食塩水灌流の灌流後、大動脈を取り出し（extracted）、外膜層を廃棄した。乳鉢及び自動ビーズホモジナイザー（ＭａｇＮＡ Ｌｙｚｅｒ、Roche）を使用して凍結組織をホモジナイズした。全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ（Life Technologies）で単離した。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Life Technologies）２００Ｕ、ランダムプライマー１００ｎｇ及びＲＮアーゼ阻害剤（Life Technologies）４０Ｕを含む反応ミックス２０μｌ中で、３７℃にて５０分間に亘り全ＲＮＡ（２μｇ）を逆転写させた。以下のＰＣＲプライマーによりリアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った：Ａｄａｍｔｓ１（ＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴ、ＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣ）、Ｔｇｆβ１（ＣＧＣＣＡＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＣ、ＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴ）、Ｃｔｇｆ（ＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＧＣＡＣＡＣＴＧ、ＣＣＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＴＣＣＡＡＡ）、Ｃｏｌ１ａ１（ＧＣＴＣＣＴＣＴＴＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴ、ＣＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧ）、Ｐａｉ－１（ＧＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＴＧＧＧ、ＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧ）、Ｎｏｓ３（ＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＣ、ＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＣＴＧＴＴＧ）、Ｎｏｓ２（ＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴ、ＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＴＣＧ）。製造業者のガイドラインに従い、ＳＹＢＲマスターミックス（Applied Biosystems）を用いてｑＰＣＲ反応を３反復で行った。プローブ特異性を調べるため、本発明者らは増幅後の融解曲線分析を行った。各反応について、１つのＴｍピークのみがもたらされた。正規化のためＧＡＰＤＨを使用して、２－ΔＣＴ相対定量法により試料中の標的ｍＲＮＡの量を推定した。倍比率（Fold ratios）を対照動物と比較して計算した。
５ｍｌの食塩水灌流の灌流後、大動脈を取り出し（extracted）、外膜層を廃棄した。乳鉢及び自動ビーズホモジナイザー（ＭａｇＮＡ Ｌｙｚｅｒ、Roche）を使用して凍結組織をホモジナイズした。全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ（Life Technologies）で単離した。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Life Technologies）２００Ｕ、ランダムプライマー１００ｎｇ及びＲＮアーゼ阻害剤（Life Technologies）４０Ｕを含む反応ミックス２０μｌ中で、３７℃にて５０分間に亘り全ＲＮＡ（２μｇ）を逆転写させた。以下のＰＣＲプライマーによりリアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った：Ａｄａｍｔｓ１（ＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴ、ＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣ）、Ｔｇｆβ１（ＣＧＣＣＡＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＣ、ＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴ）、Ｃｔｇｆ（ＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＧＣＡＣＡＣＴＧ、ＣＣＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＴＣＣＡＡＡ）、Ｃｏｌ１ａ１（ＧＣＴＣＣＴＣＴＴＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴ、ＣＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧ）、Ｐａｉ－１（ＧＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＴＧＧＧ、ＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧ）、Ｎｏｓ３（ＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＣ、ＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＴＣＴＧＴＴＧ）、Ｎｏｓ２（ＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴ、ＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＴＣＧ）。製造業者のガイドラインに従い、ＳＹＢＲマスターミックス（Applied Biosystems）を用いてｑＰＣＲ反応を３反復で行った。プローブ特異性を調べるため、本発明者らは増幅後の融解曲線分析を行った。各反応について、１つのＴｍピークのみがもたらされた。正規化のためＧＡＰＤＨを使用して、２－ΔＣＴ相対定量法により試料中の標的ｍＲＮＡの量を推定した。倍比率（Fold ratios）を対照動物と比較して計算した。
【0101】
一酸化窒素染色
製造業者の使用説明書に従い、ＤＡＦ－ＦＭジアセテート試薬（Molecular Probes）によりマウスに由来する固定されていない新鮮な大動脈切片においてＮＯ染色を行った。ＤＡＦ－ＦＭジアセテート試薬１０μｍｏｌ／Ｌと共に室温で１時間の間試料をインキュベートし、１０％グリセロール／ＰＢＳに封入した。画像をＬｅｉｃａ ＳＰ５顕微鏡で取得した。
製造業者の使用説明書に従い、ＤＡＦ－ＦＭジアセテート試薬（Molecular Probes）によりマウスに由来する固定されていない新鮮な大動脈切片においてＮＯ染色を行った。ＤＡＦ－ＦＭジアセテート試薬１０μｍｏｌ／Ｌと共に室温で１時間の間試料をインキュベートし、１０％グリセロール／ＰＢＳに封入した。画像をＬｅｉｃａ ＳＰ５顕微鏡で取得した。
【0102】
ザイモグラフィーアッセイ
ＤＴＴが存在しない状態であること以外は、免疫ブロットアッセイについて記載される通りに、全大動脈から大動脈抽出物を調製した。１％ゼラチンを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、非還元条件下にて抽出物（１５μｇ）を分画した。室温で３０分間に亘り２．５％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００中でゲルを３回洗浄し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５ ５０ｍＭ、ＣａＣｌ２ １０ｍＭ及びＮａＣｌ ２００ｍＭ中で３７℃にて一晩インキュベートし、クマシーブルーで染色した。ゼラチン分解活性又はＭＭＰ活性の領域を透明なバンドとして可視化した。画像をＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Bio-Rad）で分析した。
ＤＴＴが存在しない状態であること以外は、免疫ブロットアッセイについて記載される通りに、全大動脈から大動脈抽出物を調製した。１％ゼラチンを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、非還元条件下にて抽出物（１５μｇ）を分画した。室温で３０分間に亘り２．５％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００中でゲルを３回洗浄し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５ ５０ｍＭ、ＣａＣｌ２ １０ｍＭ及びＮａＣｌ ２００ｍＭ中で３７℃にて一晩インキュベートし、クマシーブルーで染色した。ゼラチン分解活性又はＭＭＰ活性の領域を透明なバンドとして可視化した。画像をＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Bio-Rad）で分析した。
【0103】
Ａｄａｍｔｓ１ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡキット（BioNova）を用い、マウス血清５０μｌ中で血清Ａｄａｍｔｓ１を測定した。
ＥＬＩＳＡキット（BioNova）を用い、マウス血清５０μｌ中で血清Ａｄａｍｔｓ１を測定した。
【0104】
ヒト試料
研究は、カンタブリア州の倫理及び臨床研究委員会によって承認された。上行大動脈は、ドナーの家族からの書面によるインフォームド・コンセントの後、多重臓器移植ドナーから無記名で得られた。移植用の心臓を準備する際の余分な上行大動脈の組織を研究用に採取した。匿名性を維持しながら患者から臨床データを回収した。組織を直ちに固定して室温で４８時間維持し、パラフィンに包埋した。
研究は、カンタブリア州の倫理及び臨床研究委員会によって承認された。上行大動脈は、ドナーの家族からの書面によるインフォームド・コンセントの後、多重臓器移植ドナーから無記名で得られた。移植用の心臓を準備する際の余分な上行大動脈の組織を研究用に採取した。匿名性を維持しながら患者から臨床データを回収した。組織を直ちに固定して室温で４８時間維持し、パラフィンに包埋した。
【0105】
統計学的分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０１を分析に使用した。大動脈径のデータを、７５パーセンタイル及び２５パーセンタイルを含む箱ひげ図として提示した。バーは最大及び最小のデータを表す。一元配置又は二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉのポストホック検定又はＮｅｗｍａｎのポストホック検定（３群以上による実験）により、差を分析した。生存曲線について、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定で差を分析した。統計的有意差を＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１で割り当てた。
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０１を分析に使用した。大動脈径のデータを、７５パーセンタイル及び２５パーセンタイルを含む箱ひげ図として提示した。バーは最大及び最小のデータを表す。一元配置又は二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉのポストホック検定又はＮｅｗｍａｎのポストホック検定（３群以上による実験）により、差を分析した。生存曲線について、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定で差を分析した。統計的有意差を＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１で割り当てた。
【0106】
実施例２．構成的なＡｄａｍｔｓ１欠損は、症候型ＴＡＡを誘導する
Ａｎｇ－ＩＩで誘発された大動脈拡張及び動脈瘤に対するＡｄａｍｔｓ１の寄与を調べるため、本発明者らは、欧州マウス突然変異体アーカイブ（ＥＭ：０２２９１）からＡｄａｍｔｓ１欠陥マウスを使用した。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスは野生型の（ｗｔ）同腹仔より低いレベルの大動脈のＡｄａｍｔｓ１を発現した（図１Ａ及び図７Ａ）。Ａｄａｍｔｓ１－／－マウスは離乳時の生存率が非常に低かった（図７Ｂ）ため、使用しなかった。対照的に、Ａｄａｍｔｓ１＋／－生存率は、野生型同腹仔の生存率に類似し、これらのマウスはこの段階では健康そうに見えた。２８日間に亘るＡｎｇ－ＩＩによる８週齢の野生型マウスの治療は、大動脈輪（ＡＲ）、上行大動脈（ＡｓＡｏ）及び腹部大動脈（ＡｂＡｏ）の超音波検査によって確認される、全身性の大動脈拡張を促進した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。予想外に、１つのＡｄａｍｔｓ１アレルの不活性化は、治療していないマウスにおける大動脈の拡張を誘導し、この効果はＡｎｇ－ＩＩによって悪化した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。さらに、Ａｎｇ－ＩＩは野生型マウスにおいてＡＡ又は致死性の大動脈解離をわずかに誘導したが、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスではそれらの形成を容易に引き起こした（図１Ｄ及び図１Ｅ）。動脈瘤又は致死性の解離は、Ａｎｇ－ＩＩの不在下でこの年齢のＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスで検出されなかった。Ａｎｇ－ＩＩが高血圧症を誘導することから、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１不活性化が同様の効果を有したかどうか調べた。本発明者らは、Ａｎｇ－ＩＩとは異なり、Ａｄａｍｔｓ１遺伝子量（gene dose）の減少は、収縮期及び拡張期の血圧（ＢＰ）を減少させることを見出し（図１Ｆ）、このことは、Ａｎｇ－ＩＩ及びＡｄａｍｔｓ１ハプロ不全が、別々の機構によって大動脈の拡張を誘導し得ることを示唆している。
Ａｎｇ－ＩＩで誘発された大動脈拡張及び動脈瘤に対するＡｄａｍｔｓ１の寄与を調べるため、本発明者らは、欧州マウス突然変異体アーカイブ（ＥＭ：０２２９１）からＡｄａｍｔｓ１欠陥マウスを使用した。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスは野生型の（ｗｔ）同腹仔より低いレベルの大動脈のＡｄａｍｔｓ１を発現した（図１Ａ及び図７Ａ）。Ａｄａｍｔｓ１－／－マウスは離乳時の生存率が非常に低かった（図７Ｂ）ため、使用しなかった。対照的に、Ａｄａｍｔｓ１＋／－生存率は、野生型同腹仔の生存率に類似し、これらのマウスはこの段階では健康そうに見えた。２８日間に亘るＡｎｇ－ＩＩによる８週齢の野生型マウスの治療は、大動脈輪（ＡＲ）、上行大動脈（ＡｓＡｏ）及び腹部大動脈（ＡｂＡｏ）の超音波検査によって確認される、全身性の大動脈拡張を促進した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。予想外に、１つのＡｄａｍｔｓ１アレルの不活性化は、治療していないマウスにおける大動脈の拡張を誘導し、この効果はＡｎｇ－ＩＩによって悪化した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。さらに、Ａｎｇ－ＩＩは野生型マウスにおいてＡＡ又は致死性の大動脈解離をわずかに誘導したが、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスではそれらの形成を容易に引き起こした（図１Ｄ及び図１Ｅ）。動脈瘤又は致死性の解離は、Ａｎｇ－ＩＩの不在下でこの年齢のＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスで検出されなかった。Ａｎｇ－ＩＩが高血圧症を誘導することから、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１不活性化が同様の効果を有したかどうか調べた。本発明者らは、Ａｎｇ－ＩＩとは異なり、Ａｄａｍｔｓ１遺伝子量（gene dose）の減少は、収縮期及び拡張期の血圧（ＢＰ）を減少させることを見出し（図１Ｆ）、このことは、Ａｎｇ－ＩＩ及びＡｄａｍｔｓ１ハプロ不全が、別々の機構によって大動脈の拡張を誘導し得ることを示唆している。
【0107】
他のＡｄａｍｔｓ１標的化マウスにおける腎発生異常と一致して、本発明者らのＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスの腎臓には拡大した腎杯腔（caliceal space）があり、水腎症を示した（図７Ｃ）。しかしながら、野生型マウス及びヘテロ接合マウスにおいて血漿尿素及びクレアチニンは類似し（図７Ｄ及び図７Ｅ）、腎機能が損なわれなかったことを示唆する。
【0108】
腎異常の存在は、Ａｄａｍｔｓ１欠損によって誘導された大動脈の病状が症候性である可能性を示唆した。ＭＦＳを含む、ヒト及びマウスにおける症候性の大動脈の状態は、肺及び骨格に対する変化を含む。３ヶ月齢のＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスの検査は、肺気腫の特徴である末梢気腔径（distal airspace caliber）の著しい増加を明らかにした（図１Ｇ）。著しい脊柱後弯が３ヶ月齢～４ヶ月齢のＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスの４４．４％で検出された（図１Ｈ）。これは、肋骨の過成長に起因する胸郭の前後径及び横径の増加と関連した（図１Ｉ）。また、他の長骨（上腕骨、脛骨及び大腿骨）は性別を一致させたＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスにおいてより長かったのに対し、頭蓋サイズ及び形態は遺伝子型の間で差を示さなかった（図１Ｊ及び図１Ｋ）。
【0109】
実施例３．大動脈のＡｄａｍｔｓ１ノックダウンはＴＡＡを促進する
大動脈の拡張に対するＡｄａｍｔｓ１枯渇の直接の効果を調べるため、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１特異的ｓｉＲＮＡをコードするレンチウイルスで大動脈壁を形質導入することより、成体マウスにおいて大動脈での発現をノックダウンした。培養ＶＳＭＣにおけるＡｄａｍｔｓ１ ｓｉＲＮＡのスクリーニングは、ｓｉＲＮＡ－２７の高いサイレンシング能力を同定した（図８Ａ及び図８Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレンチウイルスによって駆動される共発現は、形質導入効率の評価を促進した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのレンチウイルスの頸静脈内接種は、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの大動脈のＧＦＰ免疫染色によって７週間後に特定される、全て大動脈壁層の効率的で安定した形質導入をもたらした（図２Ａ及び図２Ｂ）。Ａｄａｍｔｓ１の発現は、過去４週間に亘ってＡｎｇ－ＩＩで治療したマウスであっても（図２Ｃ及び図８Ｃ）、ｓｉＲＮＡ－２７（ｓｉＡｄａｍｔｓ１）をコードするレンチウイルスで接種したマウスの大動脈試料においてほぼ検出不可能であった（図２Ｂ及び図２Ｃ）。実際、形質導入マウスの大動脈試料中のＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡのレベルは、Ａｄａｍｔｓ１＋／－の大動脈でのｍＲＮＡレベルを下回った（図８Ｄ）。Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングはＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの全ての層で確認された（図２Ｂ）。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスによるデータと一致して、成体の大動脈における大動脈Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングは、収縮期及び拡張期の血圧を減少させ（図２Ｄ）、ＡＲ、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの強い拡張を誘導し、これらの拡張はＡｎｇ－ＩＩで治療することによって更に増加された（図２Ｅ）。
大動脈の拡張に対するＡｄａｍｔｓ１枯渇の直接の効果を調べるため、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１特異的ｓｉＲＮＡをコードするレンチウイルスで大動脈壁を形質導入することより、成体マウスにおいて大動脈での発現をノックダウンした。培養ＶＳＭＣにおけるＡｄａｍｔｓ１ ｓｉＲＮＡのスクリーニングは、ｓｉＲＮＡ－２７の高いサイレンシング能力を同定した（図８Ａ及び図８Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレンチウイルスによって駆動される共発現は、形質導入効率の評価を促進した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのレンチウイルスの頸静脈内接種は、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの大動脈のＧＦＰ免疫染色によって７週間後に特定される、全て大動脈壁層の効率的で安定した形質導入をもたらした（図２Ａ及び図２Ｂ）。Ａｄａｍｔｓ１の発現は、過去４週間に亘ってＡｎｇ－ＩＩで治療したマウスであっても（図２Ｃ及び図８Ｃ）、ｓｉＲＮＡ－２７（ｓｉＡｄａｍｔｓ１）をコードするレンチウイルスで接種したマウスの大動脈試料においてほぼ検出不可能であった（図２Ｂ及び図２Ｃ）。実際、形質導入マウスの大動脈試料中のＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡのレベルは、Ａｄａｍｔｓ１＋／－の大動脈でのｍＲＮＡレベルを下回った（図８Ｄ）。Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングはＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの全ての層で確認された（図２Ｂ）。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスによるデータと一致して、成体の大動脈における大動脈Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングは、収縮期及び拡張期の血圧を減少させ（図２Ｄ）、ＡＲ、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの強い拡張を誘導し、これらの拡張はＡｎｇ－ＩＩで治療することによって更に増加された（図２Ｅ）。
【0110】
実施例４．Ａｄａｍｔｓ１欠損マウスの大動脈壁における中膜変性及びＴＧＦβ経路の活性化
ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの組織学的分析は、レンチウイルスの形質導入又は遺伝子不活性化による、Ａｄａｍｔｓ１レベルの減少が中膜変性の特徴的な特性、すなわち、大動脈壁の肥厚、弾性線維断裂及び無秩序化（disarray）、過度のコラーゲン沈着、並びにプロテオグリカン蓄積（図２Ｆ～図２Ｈ及び図９Ａ～図９Ｅ）を引き起こしたことを明らかにした。これらの特性は、Ａｎｇ－ＩＩによって悪化した（図２Ｆ～図２Ｈ及び図９Ａ～図９Ｅ）。
ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの組織学的分析は、レンチウイルスの形質導入又は遺伝子不活性化による、Ａｄａｍｔｓ１レベルの減少が中膜変性の特徴的な特性、すなわち、大動脈壁の肥厚、弾性線維断裂及び無秩序化（disarray）、過度のコラーゲン沈着、並びにプロテオグリカン蓄積（図２Ｆ～図２Ｈ及び図９Ａ～図９Ｅ）を引き起こしたことを明らかにした。これらの特性は、Ａｎｇ－ＩＩによって悪化した（図２Ｆ～図２Ｈ及び図９Ａ～図９Ｅ）。
【0111】
マルファン症候群及びロイス・ディーツ症候群における大動脈中膜変性は、ＴＧＦβ経路の活性化に結びつく。Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスに由来する大動脈切片の免疫組織化学検査は、高リン酸化及び核の位置（nuclear location）によって特定される、ＴＧＦβ１及びＳｍａｄ２／３の発現増加（図２Ｉ）、並びにＳｍａｄ２活性化の増加を明らかにした（図２Ｉ）。同様の結果がＡｄａｍｔｓ１ノックダウンマウスで見られた（図１０Ａ）。一貫して、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウス及びｓｉＡｄａｍｔｓ１接種マウスの大動脈では、ＴＧＦβ転写標的Ｃｔｇｆ、Ｃｏｌ１ａ１及びＰａｉ－１のｍＲＮＡレベルが上昇した（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。
【0112】
実施例５．Ａｄａｍｔｓ１欠損によって誘導された大動脈拡張は速く、ＴＧＦβ非依存性である
Ａｄａｍｔｓ１欠損依存性大動脈障害の病因を評価するため、本発明者らは、ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１のレンチウイルスの頸静脈内接種後にＡｓＡｏ径及びＡｂＡｏ径、並びに血圧をモニターした（図３Ａ）。Ａｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの減少は、接種の１日後～２日後には検出され（図３Ｂ及び図３Ｃ）、収縮期及び拡張期の血圧における最初の降下、並びにエラスチン分解の誘導（図３Ｄ及び図３Ｅ及び図１１Ａ及び図１１Ｂ）と一致した。しかしながら、ＡｓＡｏ径及びＡｂＡｏ径は、接種から２日後～３日後まで有意に増加することはなかった（図３Ｆ及び図３Ｇ）。これらの事象は、接種から１週間後～２週間後に始まった（図１１Ｃ）大動脈壁におけるコラーゲン沈着（図３Ｈ）及びＴＧＦβ経路の転写活性化に先行した。エラスチン分解の初期の誘導は、大動脈壁の主なエラスチン分解性（elastolytic）タンパク質であるＭｍｐ２及びＭｍｐ９の活性を評価するよう本発明者らに促した。Ｍｍｐ２ではなくＭｍｐ９の活性は、Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングの後に急速に有意に誘導された（図３Ｉ）。
Ａｄａｍｔｓ１欠損依存性大動脈障害の病因を評価するため、本発明者らは、ｓｉＣｔｌ又はｓｉＡｄａｍｔｓ１のレンチウイルスの頸静脈内接種後にＡｓＡｏ径及びＡｂＡｏ径、並びに血圧をモニターした（図３Ａ）。Ａｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの減少は、接種の１日後～２日後には検出され（図３Ｂ及び図３Ｃ）、収縮期及び拡張期の血圧における最初の降下、並びにエラスチン分解の誘導（図３Ｄ及び図３Ｅ及び図１１Ａ及び図１１Ｂ）と一致した。しかしながら、ＡｓＡｏ径及びＡｂＡｏ径は、接種から２日後～３日後まで有意に増加することはなかった（図３Ｆ及び図３Ｇ）。これらの事象は、接種から１週間後～２週間後に始まった（図１１Ｃ）大動脈壁におけるコラーゲン沈着（図３Ｈ）及びＴＧＦβ経路の転写活性化に先行した。エラスチン分解の初期の誘導は、大動脈壁の主なエラスチン分解性（elastolytic）タンパク質であるＭｍｐ２及びＭｍｐ９の活性を評価するよう本発明者らに促した。Ｍｍｐ２ではなくＭｍｐ９の活性は、Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングの後に急速に有意に誘導された（図３Ｉ）。
【0113】
ＴＧＦβ活性化の標準的な及び非標準的な経路は、ＭＦＳマウスモデルにおいて極めて重要な役割を果たし、ＴＧＦβ中和抗体及びＡＴ１Ｒアンタゴニストであるロサルタンはいずれもこのモデルにおいて動脈瘤の形成を予防することができる。Ａｄａｍｔｓ１サイレンシング後のＴＧＦβ活性化のタイミングは、大動脈障害発症における二次的な役割を示唆したが、本発明者らは、ＴＧＦβ経路の寄与を評価するためロサルタン及びＴＧＦβ中和抗体を使用した（図３Ｊ）。際立ったことに、いずれの治療もｓｉＡｄａｍｔｓ１によって誘導された大動脈の拡張を抑制しなかった（図３Ｋ及び図１１Ｄ）。さらに、これらの治療は、低血圧を予防せず（図１１Ｅ）、弾性線維断裂又は線維症を減少しなかった（図３Ｌ及び図３Ｍ）。治療の有効性を表す代替分子としてのＴＧＦβ転写標的のｍＲＮＡレベルの検出は、ＴＧＦβ抗体がＴｇｆｂ１、Ｐａｉ－Ｉ、Ｃｔｇｆ及びＣｏｌ１ａ１の誘導を効率的に阻害したことを示した（図１１Ｆ）。これらの結果は、中和抗体が効率的にはたらき、疾患発症の間、線維症はＴＧＦβ活性化に非依存性であることを示す。ロサルタンは、予想通り、対照マウスにおいて血圧を減少させた（図１１Ｅ）。これらの結果は、ＴＧＦβ経路活性化は、Ａｄａｍｔｓ１関連の大動脈障害において大動脈拡張及びエラスチン分解に対して二次的であるという結論を指示する。
【0114】
実施例６．Ｎｏｓ２由来の一酸化窒素は、Ａｄａｍｔｓ１欠損によって誘導される大動脈障害を媒介する
Ａｄａｍｔｓ１関連大動脈障害の機構を更に調べるため、本発明者らはＡｄａｍｔｓ１サイレンシングの際に検出された最も初期の効果である低血圧の可能性のあるメディエーターに注目した。候補因子は、平滑筋を弛緩させ、血圧を低下させる内因性の血管弛緩物質（vasorelaxant）である、一酸化窒素（ＮＯ）である。ＮＯは、内皮型（ｅＮＯＳ、ＮＯＳ３）又は神経型（ｎＮＯＳ、ＮＯＳ１）を起源とする構成的に発現されるＮＯ合成酵素（ＮＯＳ：NO synthase）、又は誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ、ＮＯＳ２）によって産生され得る。大動脈拡張の誘導に対するＮＯの寄与を試験するため、本発明者らは、全てのＮＯＳ酵素の阻害剤であるＮ －ニトロ－Ｌ－アルギニン－メチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ）でＣ５７ＢＬ／６マウスを治療した（図４Ａ）。Ｌ－ＮＡＭＥの昇圧効果にもかかわらず（図１２Ａ）、Ｌ－ＮＡＭＥは、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏのｓｉＡｄａｍｔｓ１誘導性の拡張を阻止し（図４Ｂ）、エラスチン分解を遮断し（図４Ｃ及び図１２Ｂ）、線維症を減少させ（図４Ｄ）、Ｍｍｐ９活性化を阻止した（図４Ｅ）。
Ａｄａｍｔｓ１関連大動脈障害の機構を更に調べるため、本発明者らはＡｄａｍｔｓ１サイレンシングの際に検出された最も初期の効果である低血圧の可能性のあるメディエーターに注目した。候補因子は、平滑筋を弛緩させ、血圧を低下させる内因性の血管弛緩物質（vasorelaxant）である、一酸化窒素（ＮＯ）である。ＮＯは、内皮型（ｅＮＯＳ、ＮＯＳ３）又は神経型（ｎＮＯＳ、ＮＯＳ１）を起源とする構成的に発現されるＮＯ合成酵素（ＮＯＳ：NO synthase）、又は誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ、ＮＯＳ２）によって産生され得る。大動脈拡張の誘導に対するＮＯの寄与を試験するため、本発明者らは、全てのＮＯＳ酵素の阻害剤であるＮ －ニトロ－Ｌ－アルギニン－メチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ）でＣ５７ＢＬ／６マウスを治療した（図４Ａ）。Ｌ－ＮＡＭＥの昇圧効果にもかかわらず（図１２Ａ）、Ｌ－ＮＡＭＥは、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏのｓｉＡｄａｍｔｓ１誘導性の拡張を阻止し（図４Ｂ）、エラスチン分解を遮断し（図４Ｃ及び図１２Ｂ）、線維症を減少させ（図４Ｄ）、Ｍｍｐ９活性化を阻止した（図４Ｅ）。
【0115】
ＮＯＳ活性阻害の治療可能性を判定するため、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１＋／－マウスを治療するためＬ－ＮＡＭＥを使用した。Ｌ－ＮＡＭＥは、正常なレベルへとＡｓＡｏ径及びＡｂＡｏ径を急速に減少させ（図４Ｆ）、収縮期及び拡張期の低血圧を元の状態に戻し（図４Ｇ及び図１２Ｃ）、弾性線維の断裂を減少させ（図４Ｈ）、線維症を減少させた（図４Ｉ）。
【0116】
生理学的条件下では、血管型ＮＯＳ３は、血管のホメオスタシスを維持するため低レベルのＮＯを産生するのに対し、病態時では、ＮＯＳ２は転写的に活性化され得て、その構成上の対応物よりも１０００倍超のＮＯを産生する。したがって、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ１欠損マウスではＮｏｓ２レベルが増加して、大動脈の拡張及び中膜変性を媒介するのかもしれないと仮定した。Ｎｏｓ２発現は、ｓｉＡｄａｍｔｓ１接種の２日後には有意に誘導された（図５Ａ）が、Ｎｏｓ３は影響を受けなかった（図１３Ａ）。別の血圧調節物質であるエンドセリン－１は、Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングによって影響を受けなかった（図１３Ｂ）。ｓｉＡｄａｍｔｓ１マウス及びＡｄａｍｔｓ１＋／－マウスに由来する大動脈の横断切片の免疫染色は、Ｎｏｓ２レベルの増加を確認した（図５Ｂ）。
【0117】
Ｎｏｓ２由来ＮＯがＡｄａｍｔｓ１欠損によって誘導される大動脈障害を媒介するかどうか調べるため、本発明者らは、Ｎｏｓ２－／－マウス及び野生型マウスにｓｉＡｄａｍｔｓ１レンチウイルスを接種した（図５Ｃ）。Ｎｏｓ２欠損は、ｓｉＡｄａｍｔｓ１誘導性のＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの拡張（図５Ｄ）、弾性線維断裂（図５Ｅ）、及び線維症（図５Ｆ）を妨げた。Ｎｏｓ２－／－マウスは正常血圧であり、Ａｄａｍｔｓ１サイレンシングは該マウスの収縮期及び拡張期の血圧を減少させることができなかった（図５Ｇ及び図１３Ｄ）。Ａｄａｍｔｓ１欠損誘導性大動脈障害におけるＮｏｓ２由来ＮＯに対する極めて重要な役割と一致して、ｓｉＡｄａｍｔｓ１形質導入大動脈の固定されていない切片は、対照マウスに由来する切片よりも高いレベルのＮＯを含んだ（図５Ｈ）。同様に、ＮＯレベルは、Ａｄａｍｔｓ１＋／－大動脈の固定されていない切片では、野生型マウスに由来するものよりも高かった（図５Ｈ）。ＮＯは、ｓｉＡｄａｍｔｓ１を接種したＮｏｓ２－／－マウスの大動脈切片に蓄積しなかった（図５Ｈ）。
【0118】
実施例７．一酸化窒素及びＡｄａｍｔｓ１はマルファン症候群において重要な役割を果たす
本発明者らは、ＮＯが他の症候型のＴＡＡにおける中膜変性を媒介し得ると仮定した。ＭＦＳにおけるＮＯの役割を特定するため、本発明者らは、ＭＦＳ患者において頻繁に起こる突然変異と等価なシステイン置換（Ｃ１０３９Ｇ）を含むＦｂｎ１アレルに関してヘテロ接合のマウスにＬ－ＮＡＭＥを投与した（図６Ａ）。Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋の表現型は、胸部の大動脈拡張、動脈瘤及び解離を含むヒトＭＦＳ、並びに動脈の中膜変性の組織学的特徴に類似する。Ａｄａｍｔｓ１欠損マウスと同様に、１２週齢のＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスは、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの拡張を示した（図６Ｂ及び図１４Ａ）。Ｌ－ＮＡＭＥは、急速に正常なレベルまでＡｓＡｏ径及びＡｂＡｏ径を減少させ（図６Ｂ及び図１４Ａ）、収縮期及び拡張期の血圧を増大し（図６Ｃ及び図１４ｂ）、弾性線維断裂を減少させた（図６Ｃ及び図１４Ｃ）。Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスは有意なコラーゲン蓄積を示さず、コラーゲン含有量はＬ－ＮＡＭＥに影響されなかった（図１４Ｄ）。また、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスは、同腹仔対照に関して、有意に高いレベルのＮｏｓ２及びＮＯ産生を示したのに対し、Ｎｏｓ３は影響を受けなかった（図６Ｅ）。
本発明者らは、ＮＯが他の症候型のＴＡＡにおける中膜変性を媒介し得ると仮定した。ＭＦＳにおけるＮＯの役割を特定するため、本発明者らは、ＭＦＳ患者において頻繁に起こる突然変異と等価なシステイン置換（Ｃ１０３９Ｇ）を含むＦｂｎ１アレルに関してヘテロ接合のマウスにＬ－ＮＡＭＥを投与した（図６Ａ）。Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋の表現型は、胸部の大動脈拡張、動脈瘤及び解離を含むヒトＭＦＳ、並びに動脈の中膜変性の組織学的特徴に類似する。Ａｄａｍｔｓ１欠損マウスと同様に、１２週齢のＦｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスは、ＡｓＡｏ及びＡｂＡｏの拡張を示した（図６Ｂ及び図１４Ａ）。Ｌ－ＮＡＭＥは、急速に正常なレベルまでＡｓＡｏ径及びＡｂＡｏ径を減少させ（図６Ｂ及び図１４Ａ）、収縮期及び拡張期の血圧を増大し（図６Ｃ及び図１４ｂ）、弾性線維断裂を減少させた（図６Ｃ及び図１４Ｃ）。Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスは有意なコラーゲン蓄積を示さず、コラーゲン含有量はＬ－ＮＡＭＥに影響されなかった（図１４Ｄ）。また、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスは、同腹仔対照に関して、有意に高いレベルのＮｏｓ２及びＮＯ産生を示したのに対し、Ｎｏｓ３は影響を受けなかった（図６Ｅ）。
【0119】
これらの類似性は、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウスのＡｄａｍｔｓ１と大動脈の病態との間のつながりを示唆した。Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋大動脈切片の免疫染色は、大動脈タンパク質抽出物の免疫ブロット分析によって確認されるＡｄａｍｔｓ１のレベルの低下を明らかにした（図６Ｇ）。しかしながら、Ｆｂｎ１Ｃ１０３９Ｇ／＋マウス及び対照同腹仔においてＡｄａｍｔｓ１ ｍＲＮＡレベルは類似し（図１４Ｅ）、マルファン症候群におけるＡｄａｍｔｓ１発現の転写後下方制御を示唆した。
【0120】
ヒトＭＦＳに対するＡＤＡＭＴＳ１及びＮＯＳ２の寄与の評価は、性別及び年齢にかかわらず、臓器移植ドナーに由来する大動脈と比較して、ＭＦＳ患者に由来する大動脈切片の中膜におけるＡＤＡＭＴＳ１発現の低下を明らかにした（図６Ｈ及び図１４Ｆ）。免疫組織化学染色された切片におけるＡＤＡＭＴＳ１陽性領域の定量は、ＭＦＳ試料における急激な発現減少を確認した（図６Ｉ）。エラスチン自発蛍光は、ＭＦＳの大動脈切片において僅かに検出され、無秩序なパターンを示した。ＮＯＳ２免疫蛍光は、８つのうち６つのＭＦＳ大動脈切片の中膜におけるより高い発現を明らかにし（図６Ｊ及び図１４Ｇ）、これらの切片におけるＮＯＳ２陽性領域の定量はＭＦＳ試料において有意な増加を示した（図６Ｋ）。まとめると、これらのデータは、ＡＤＡＭＴＳ１及びＮＯＳ２がヒトＭＦＳにおける大動脈の病態の重要なメディエーターであるかもしれないという意見を支持する（図６Ｌ）。
【0121】
実施例８．ヒトＮＯＳ２のドッキング及び阻害剤との相互作用
ヒトＮＯＳ２タンパク質のオキシゲナーゼドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｉｄ：Ｐ３５２２８、残基５１１～１１５３）及びレダクターゼドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｉｄ：Ｐ３５２２８、残基１～５３５）のＦａｓｔａ配列を、ホモロジーによるモデリングのため、Ｉ－Ｔａｓｓｅｒソフトウェアスイートｖ５．０（１）のローカル実装に送信（submitted）した。各々に対して、最小エネルギー及び正確なフォールディングを有する最良モデル（テンプレートに対して最も良好な構造アラインメント：それぞれＰＤＢ ＩＤ ４ｎｏｓ及び３ｈｒ４）を最終テンプレートとして選択した。パイモル（pymol）プログラム（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １．８、www.pymol.org）を使用して、両方のテンプレートの重複領域（残基５１１～５３５）に構造アラインメントを行い、Ｒｏｓｅｔｔａスイートｖ３．６リリース（www.rosettacommons.org）のループモデルツールを使用して、近接するループに対する最終全モノマーテンプレートを生成した。詳細化（refinement）のためＲｏｓｅｔｔａスイートｖ３．６（www.rosettacommons.org）のリラックスツール（relax tool）を使用し、スコアはより小さいが、依然高いエネルギーを有するモデルを最終テンプレートとして選択し、最終モノマーモデルを得た。
ヒトＮＯＳ２タンパク質のオキシゲナーゼドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｉｄ：Ｐ３５２２８、残基５１１～１１５３）及びレダクターゼドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｉｄ：Ｐ３５２２８、残基１～５３５）のＦａｓｔａ配列を、ホモロジーによるモデリングのため、Ｉ－Ｔａｓｓｅｒソフトウェアスイートｖ５．０（１）のローカル実装に送信（submitted）した。各々に対して、最小エネルギー及び正確なフォールディングを有する最良モデル（テンプレートに対して最も良好な構造アラインメント：それぞれＰＤＢ ＩＤ ４ｎｏｓ及び３ｈｒ４）を最終テンプレートとして選択した。パイモル（pymol）プログラム（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １．８、www.pymol.org）を使用して、両方のテンプレートの重複領域（残基５１１～５３５）に構造アラインメントを行い、Ｒｏｓｅｔｔａスイートｖ３．６リリース（www.rosettacommons.org）のループモデルツールを使用して、近接するループに対する最終全モノマーテンプレートを生成した。詳細化（refinement）のためＲｏｓｅｔｔａスイートｖ３．６（www.rosettacommons.org）のリラックスツール（relax tool）を使用し、スコアはより小さいが、依然高いエネルギーを有するモデルを最終テンプレートとして選択し、最終モノマーモデルを得た。
【0122】
先のモデルの２つの切断型（残基８３～１１５３）に、ＰＤＢ ＩＤ ４ｃｘ７構造に対して構造アラインメントを行い、Ｒｏｓｅｔｔａスイートｖ３．６（www.rosettacommons.org）のドッキングツールを使用して、ＮＯＳ２ダイマーをドッキングするためのテンプレートを作製した。最良モデル（最小エネルギー、４ｃｘ７に対する正確な構造アラインメントを有する）を、４ｃｘ７構造（図１８ａ及び図１８ｂ）から固定されたリガンドｈｅｍｏ、Ｈ４Ｂ及びＡｒｇを有する最終ホモダイマーモデルとして選択した。
【0123】
ＮＯＳ２ダイマーと阻害剤とのｉｎ－ｓｉｌｉｃｏドッキングのため、各リガンドＬ－ＮＡＭＥ、１４００Ｗ、アミノグアニジン、ＧＷ２７３６２９、Ｌ－ＮＩＬ及びクロトリマゾールに対するデフォルトの３Ｄ構造をＰｕｂＣｈｅｍ（pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）から得て、Ｆｒｏｇ２ウェブツールを使用して各々に対して１００のコンフォーマー（conformers）を生成した。各阻害剤に対するデフォルトのコンフォーマーの重心座標を両方の鎖のグアニジン部位の重心座標に配置し、Ｒｏｓｅｔｔａスイートｖ３．６リリース（www.rosettacommons.org）のリガンドドッキングツールを使用してＮＯＳ２の最終モデルの阻害剤とのドッキングに対する最初のテンプレートを作製した。先の通り、詳細化のためＲｏｓｅｔｔａスイートｖ３．６（www.rosettacommons.org）のリラックスツールを使用し、スコアはより小さいが、依然高いエネルギーを有するモデルを最終テンプレートとして選択し、最終モデルを得た。
【0124】
【表1】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】