特許 7060555 ビフィドバクテリウムラクティスＧＫＫ２の活性物質、それを含む組成物及びそれによって長寿命化を促進する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-18

(45)【発行日】2022-04-26

(54)【発明の名称】ビフィドバクテリウムラクティスＧＫＫ２の活性物質、それを含む組成物及びそれによって長寿命化を促進する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/745 20150101AFI20220419BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220419BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220419BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 9/02 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220419BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20220419BHJP

   A23K 10/16 20160101ALI20220419BHJP

   A23L 2/52 20060101ALI20220419BHJP

   A23C 23/00 20060101ALI20220419BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20220419BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20220419BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220419BHJP

【ＦＩ】

A61K35/745

A61P25/00

A61P21/00

A61P43/00 107

A61K9/14

A61K9/20

A61K9/02

A61K9/50

A61K9/08

A61K9/12

A23K10/16

A23L2/00 F

A23C23/00

A23L33/135

C12N1/20 E

C12N15/12

【請求項の数】 8

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2019149363

(22)【出願日】2019-08-16

(65)【公開番号】P2020075902

(43)【公開日】2020-05-21

【審査請求日】2019-11-08

(31)【優先権主張番号】107128656

(32)【優先日】2018-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

【微生物の受託番号】CGMCC  CGMCC 15205

【微生物の受託番号】CGMCC  CGMCC 14565

【微生物の受託番号】CGMCC  CGMCC 14566

(73)【特許権者】

【識別番号】519298765

【氏名又は名称】葡萄王生技股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】陳 勁初

(72)【発明者】

【氏名】陳 炎▲錬▼

(72)【発明者】

【氏名】林 詩偉

(72)【発明者】

【氏名】陳 ▲彦▼博

(72)【発明者】

【氏名】王 ▲啓▼憲

(72)【発明者】

【氏名】侯 毓欣

(72)【発明者】

【氏名】石 仰慈

(72)【発明者】

【氏名】林 ▲静▼▲ウェン▼

(72)【発明者】

【氏名】陳 雅君

(72)【発明者】

【氏名】江 佳琳

【審査官】長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】特開平０３－００４７６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】生物工学，2013年，Vol.91, No.11，pp.632-636

【文献】月刊メディカル・サイエンス・ダイジェスト，2015年，Vol.41, No.4，pp.176-180

【文献】Bifidobacteria Microflora，1986年，Vol.6, No.1，pp.21-31

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／００ －３５／７６８

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

Ｃ１２Ｎ １／２０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２０１８年１月１２日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０８２６及びＣＧＭＣＣ １５２０５で生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）、食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、台湾新竹３００６２、及び中国普通微生物菌種保蔵管理センター（Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＭＣＣ）、中国科学院、北京１００１０１、中華人民共和国に寄託されるビフィドバクテリウムラクティスを含み、ビフィドバクテリウムラクティス（ＣＧＭＣＣ １５２０５又はＢＣＲＣ ９１０８２６）が組成物の活性成分として、Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現を増強する、組成物。

【請求項2】

２０１８年１月１２日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０８２６及びＣＧＭＣＣ １５２０５で生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ）、食品工業発展研究所、台湾新竹３００６２、及び中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）、中国科学院、北京１００１０１、中華人民共和国に寄託される、活性物質を有する有効投薬量のビフィドバクテリウムラクティスを含み、組成物の活性成分としての活性物質がＣｉｓｄ２遺伝子の発現を増強する、組成物。

【請求項3】

前記組成物は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、フィラー、吸収剤、甘味剤からなる群から選ばれた添加剤又はその組み合わせを含む請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記組成物は、薬物、飼料、飲料、栄養補給剤、乳製品、老年食品、乳幼児食品、副食品又は健康食品である請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物の形態は、粉末、錠剤、丸剤、座剤、マイクロカプセル剤、アンプル、液剤又はスプレー剤である請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項6】

対象におけるＣｉｓｄ２遺伝子の発現を増強するための、ビフィドバクテリウムラクティスを活性成分として含む組成物であって、前記ビフィドバクテリウムラクティスが、２０１８年１月１２日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０８２６及びＣＧＭＣＣ １５２０５で生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）、食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、台湾新竹３００６２、及び中国普通微生物菌種保蔵管理センター（Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＭＣＣ）、中国科学院、北京１００１０１、中華人民共和国に寄託されたものである、組成物。

【請求項7】

前記組成物は、前記対象のミトコンドリアの損傷を低減及び／又は遅延させる請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物は、神経変性疾患、筋肉減少症、又はそれらの組み合わせを含む前記対象の老化に関連する症状を低減及び／又は遅延させる請求項６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、長寿命化を促進する活性物質を有する乳酸菌、それを含む組成物及びその使用方法に関する。より具体的に、本発明は、活性物質を有するビフィドバクテリウムラクティスＧＫＫ２、それを含む組成物、及びそれによって長寿命化を促進し、対象に投与する場合にＣｉｓｄ２遺伝子の発現を増強し、ミトコンドリアの損傷を低減し及び／又は老化に関連する症状（例えば、神経変性疾患及び筋肉減少症）を遅延させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

長寿遺伝子

【0003】

科学者らは、長寿の秘密を見付けることを望んでいる。科学者は、ある種がよりその環境に適応するようになると、より長く生存する可能性がより高いと仮定する。そのため、ある科学者は、例えば、暑い天気、食物又は水の剥奪のような、環境ストレスに注目して、ストレスに関わる１組の遺伝子を発見した。実際、個体の年齢に関わらず、これらの遺伝子は、何れも個体の生体分子に対する自然な保護を維持し及びその活性を修復する作用を果たすことができる。なお、これらの遺伝子は、生体の生存能力を増進して、危機を乗り越えさせることができる。これらの遺伝子は、長寿遺伝子と見なされ、また有効でありさえであれば、健康を著しく改善し個体の寿命を延ばすことができる。

【0004】

他の科学者は、１００歳以上の高齢者に取り組んで、それらの遺伝子を評価した。科学者は、平均寿命予期を有する個体に比べると、１００歳以上の高齢者がある特定の遺伝子のより高い発現を有することを発見して、これらの遺伝子がより長い寿命に関連すると推測した。

【0005】

Ｃｉｓｄ２遺伝子

【0006】

Ｃｉｓｄ２遺伝子は、進化の過程において高度に保持され、また無脊椎動物、脊椎動物及び哺乳動物に存在する。この観点から、Ｃｉｓｄ２遺伝子は、重要な生物機能を制御することができる。Ｃｉｓｄ２によってコードされるタンパク質がミトコンドリアの外膜に位置する。Ｃｉｓｄ２遺伝子の欠損は、ミトコンドリアを損傷し、ミトコンドリアの構造や機能に影響を与え、その後、老化に関連する症状に繋がっている。Ｃｉｓｄ２遺伝子に関連する研究によれば、対照群と比較した場合、Ｃｉｓｄ２遺伝子ノックアウトマウスは、よりも著しく薄く且つより小さい体型を有することが判明された。なお、Ｃｉｓｄ２遺伝子ノックアウトマウスの平均寿命は対照群の平均寿命に比べ半分と短くされたものである。実験の観察期間中、Ｃｉｓｄ２ノックアウトマウスは、第３週くらいで（ヒトの１０～１２歳に相当）、例えば、神経変性疾患及び筋肉減少症等の症状を示し始め、第４週くらいで（ヒトの１５歳に相当）体重が著しく減少した。第８週くらいで（ヒトの１８～２０歳に相当）、Ｃｉｓｄ２ノックアウトマウスは、著しい不透明な眼及び骨粗鬆症を示した。第１２週～第４８週くらいで（ヒトの３０～４５歳に相当）、Ｃｉｓｄ２ノックアウトマウスは、例えば、脊椎湾曲（ｌｏｒｄｏｋｙｐｈｏｓｉｓ）、失明、脱毛及び皮膚のたるみのような、早老症を示した。野生型マウスの正常な老化プロセスについての更なる研究によると、マウスの老化につれて、Ｃｉｓｄ２の発現レベルが低下し、仔マウスに比べると、発現レベルが１４ヶ月くらいで（ヒトの６０歳に相当）６０％まで低下し、また２８ヶ月くらいで（ヒトの９０歳に相当）３０％まで低下することが判明された。これらの知見に基づいて、Ｃｉｓｄ２は健康的な老化及び寿命を調節する必須遺伝子であることが証明される。

【0007】

ラクトバチルス属

【0008】

ラクトバチルス属は、一般的な環境に存在し、また発酵によって炭水化物を乳酸に転化して、発酵食品の製造に適用されることができる。１９９０年代、ラクトバチルス属は、ヒトの健康に多くの利点を提供することができ、消化を助け及び消化管の健康状態を改善する効果を有することが発見される。そのため、人々は、消化環境を改善し及び腸管運動を促進するために、より多くのラクトバチルス属を食べると推奨される。なお、ラクトバチルスが糖（例えば、乳糖、グルコース、スクロース及びフラクトース）を分解して、乳酸及び酢酸を発生して腸環境を酸性化することができるため、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）は、悪玉菌の生長を抑制して腸内の微生物叢のバランスを保つことができる。

【0009】

ラクトバチルス属において、異なる種類のラクトバチルス属及び同じ種の異なる菌株は、異なる特徴を有し且つ人体に対して異なる効果を持つ。例えば、ラクトバチルスプランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株がヒトの健康を改善することが既に発見され、ラクトバチルスプランタラムＰＨ０４が血液におけるコレステロールを低下させること、ラクトバチルスプランタラム２９９ＶがＩＬ-１０欠損マウスの大腸炎症状を緩和すること、ラクトバチルスプランタラム１０ｈｋ２が例えば、インターロイキン（ＩＬ）-１β、ＩＬ-６及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ-α）及びＩＬ-１０のような炎症促進性メディエータを増加させて、抗炎症効果を発揮すること、ラクトバチルスプランタラムＫ２１が血中コレステロール及びトリグリセリドレベルを低下させ及び抗炎症効果を有することは既知である。

【0010】

ビフィズス菌

【0011】

ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）は、腸、膣及びヒトや動物の口腔に普遍的に存在している。ビフィドバクテリウム属は、グラム陽性で、非運動性で、Ｙ型のものであり、またしばしば偏性嫌気性菌である。１８９９年、健康な乳児の胚からビフィズス菌が単離された。下記の研究によると、ビフィズス菌の特定の菌株はプロバイオティクスとして例えば、食品、医薬、飼料等の分野に適用されることができることが判明された。

【0012】

しかしながら、例えば、ラクトバチルス及びビフィズス菌等の乳酸菌の寿命に与える影響を検討する関連研究はなく、また乳酸菌がＣｉｓｄ２遺伝子の発現レベルに影響を与えることで（これは、生理学的変化を引き起こし及び個体の寿命を変える）個体の寿命を制御するかを証明する実験はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明の目的は、長寿命化を促進する組成物において、２０１８年１月１２日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０８２６及びＣＧＭＣＣ １５２０５で生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）、食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、台湾新竹３００６２、及び中国普通微生物菌種保蔵管理センター（Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣＧＭＣＣ）、中国科学院、北京１００１０１、中華人民共和国に寄託されるビフィドバクテリウムラクティスを含む組成物を提供することにある。

【0014】

本発明の別の目的は、長寿命化を促進する組成物において、２０１８年１月１２日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０８２６及びＣＧＭＣＣ １５２０５で生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ）、食品工業発展研究所、台湾新竹３００６２、及び中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）、中国科学院、北京１００１０１、中華人民共和国に寄託される、活性物質を有する有効投薬量のビフィドバクテリウムラクティスを含む組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0015】

好ましくは、
ビフィドバクテリウムラクティス（ＢＣＲＣ ９１０８２６及びＣＧＭＣＣ １５２０５）を寒天プレートに画線培養して、単離されたコロニーを発生させる工程（ａ）、及び、
工程（ａ）からの単離されたコロニーの１つを液体培地液体インキュベーション工程に接種して、液体培養物を得る工程（ｂ）によって、
活性物質を有するビフィドバクテリウムラクティス（Ｂ．ｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）を調製する。

【0016】

好ましくは、更に、
工程（ｂ）からの液体培養物を遠心させて、沈殿物を得る工程（ｃ）、及び、
工程（ｃ）からの沈殿物に対して凍結乾燥を行って、活性物質を有するビフィドバクテリウムラクティス（ＢＣＲＣ ９１０８２６、及びＣＧＭＣＣ １５２０５）を得る工程（ｄ）によって、
活性物質を有するビフィドバクテリウムラクティスを調製する。

【0017】

好ましくは、温度を３５～５０℃、通気を０～１ｖｖｍのＮ_２又はＣＯ_２、回転速度を１０～１００ｒｐｍ、インキュベーション時間を１６～２４時間に設定する。

【0018】

好ましくは、工程（ｄ）における凍結乾燥温度を－１９６～－４０℃に設定する。

【0019】

好ましくは、組成物は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、フィラー、吸収剤、甘味剤からなる群から選ばれた添加剤及び／又はその組み合わせを含んでよい。

【0020】

好ましくは、前記組成物は、薬物、飼料、飲料、栄養補給剤、乳製品、老年食品、乳幼児食品、副食品又は健康食品であってよい。

【0021】

好ましくは、組成物の形態は、粉末、錠剤、丸剤、座剤、マイクロカプセル剤、アンプル、液剤又はスプレー剤であってよい。

【0022】

本発明の別の目的は、対象に活性物質を有するビフィドバクテリウムラクティス（ＣＧＭＣＣ １５２０５）を含む組成物を投与することで、長寿命化を促進する方法を提供することである。

【0023】

好ましくは、前記組成物は、対象のＣｉｓｄ２遺伝子の発現を増強する。

【0024】

好ましくは、前記組成物は、対象のミトコンドリアの損傷を低減及び／又は遅延させる。

【0025】

好ましくは、前記組成物は、神経変性疾患、筋肉減少症、又はそれらの組み合わせを含む対象の老化に関連する症状を低減及び／又は遅延させる。

【0026】

理解すべきなのは、前記の一般的な説明及び下記の詳しい説明はすべて例示的な説明であり、また保護しようとする本発明を更に解釈するためのものであることである。

【0027】

本発明を、下記の添付図面を参照して、実施形態の以下の詳しい説明を読むことで、十分に理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】酸耐性試験の細胞数を示す。

【図2】胆汁耐性試験の細胞数を示す。

【図3】熱耐性試験の細胞数を示す。

【図4】異なる用量の活性物質を有する乳酸菌株号Ａ～Ｊを含む組成物で処理されたＨＥＫ２９３細胞におけるＣｉｓｄ２プロモーターにより制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子の相対的な活性を示す。

【図5】異なる用量の活性物質を有する乳酸菌株号Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｉを含む組成物で処理されたＨＥＫ２９３細胞における内因性Ｃｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルの電気泳動写真である。

【図6】図５の結果に基づいたＣｉｓｄ２ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルの統計結果である。

【図7】動物実験のフローチヤ一トを示す。

【図8】前肢握力試験におけるオスマウスの握力を示す。

【図9】単一試験受動回避試験におけるメスマウスの潜伏時間を示す。

【図10】単一試験受動回避試験におけるオスマウスの潜伏時間を示す。

【図11】能動シャトル回避試験におけるメスマウスの成功に能動的に回避した回数の平均値を示す。

【図12】能動シャトル回避試験におけるオスマウスの成功に能動的に回避した回数の平均値を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

現在、本発明の本実施形態を詳細に参照し、前記実施形態の例示を添付図面に示す。可能な場合、添付図面に同一の参照番号が使用され、また同一又は同様の部品を参照して説明する。

【0030】

菌株の由来

【0031】

実験で用いた乳酸菌は、ラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム属を含む。好ましい実施形態において、乳酸菌株は、台湾新竹食品路３３１号に位置する食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ）から購入する。好ましい実施形態において、下記実験で用いた乳酸菌株Ａ～Ｊの番号（ＮＯ．）、種及び受託番号を表１に示す。台湾特許出願第１０６１３７７７３号及び第１０６１３６１３４号に、寄託の更なる情報、分離及び精製の過程、及び遺伝子解析及び菌株同定の結果が示される。

【0032】

【表1】

【0033】

ＢＣＲＣ：台湾新竹食品路３３１号に位置する食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存と研究センター。
ＣＧＭＣＣ：中国普通微生物菌種保蔵管理センター、中国科学院、北京１００１０１、中華人民共和国。
ＡＴＣＣ：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州、ＶＡ ２０１１０、米国。
ＣＩＣＣ：中国工業微生物菌種保蔵管理センター、中国食品発酵工業研究院（ＣＮＩＦ）、北京１０００００、中華人民共和国。
ＮＣＩＭＢ：国立産業食品及び海洋菌保存管理センター、スコットランド農村学院（ＳＲＵＣ）、アバディーン、ＡＢ２１ ９ＹＡ、イギリス。
ＤＣＭ：ＤＳＭ １５９５４、ドイツ微生物細菌保存管理センター（Ｌｅｉｂｎｉｚ-Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ-Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、ブラウンシュワイク３８１２４、ドイツ。

【0034】

表現型解析

【0035】

表現型解析は、酸耐性試験、胆汁耐性試験及び熱耐性試験によって乳酸菌株番号Ｉと他の菌株との間の表現型の差異を比較する研究である。

【0036】

酸耐性試験

【0037】

ＢＣＲＣから購入するＧＫＫ２、ＢＣＲＣ１７３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ ０４（Ｂｉ ０４、受託番号ＡＴＣＣ ＳＤ ５２１９でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託される）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ ＢＢ-１２（ＢＢ-１２、受託番号ＤＳＭ １５９５４でドイツ微生物細菌保存管理センターに寄託される）、及びビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ ０７（Ｂｉ ０７、受託番号ＡＴＣＣ ＳＤ ５２２０でＡＴＣＣに寄託される）という、合計で５種類の菌株を回収した。そして、ＨＣｌでｐＨ値約６．５の原始Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）液体培地を約ｐＨ３．２、ｐＨ２．４及びｐＨ２．０の３つの異なるｐＨ値に調節した。菌株を上記ＭＲＳ液体培地に接種した後で、連続希釈、播種、インキュベーションを行い、最後でコロニー計数を行った。

【0038】

図１に酸耐性試験の結果を示した。横軸は異なる培地のｐＨ値を示し、縦軸は細胞数を１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬとして示した。バー１０１、１０３、１０５、１０７、１０９は、それぞれ乳酸菌株ＧＫＫ２、ＢＣＲＣ １７３９４、ＤＳＭ １５９５４（ＢＢ-１２）、ＡＴＣＣ ＳＤ ５２２０（Ｂｉ ０７）及びＡＴＣＣ ＳＤ ５２１９（Ｂｉ ０４）を表した。記号「*」及び「＃」は、同じｐＨ値でのＧＫＫ２と他の乳酸菌株との間の著しい差異（ｐ<０．０５）を表した。

【0039】

図１に示すように、初期のｐＨ値（約ｐＨ６．５）で培養される場合、菌株ＧＫＫ２（バー１０１）の細胞数及び他の４つの菌株（バー１０３、１０５、１０７及び１０９）の細胞数は５×１０^９ｃｆｕ／ｍＬに達した。ＭＲＳ液体培地のｐＨ値がｐＨ３．２まで低下すると、全ての菌株の細胞数はわずかに減少し、またＧＫＫ２と他の４つの菌株との間に統計学的に有意な細胞数の差異はなかった。ＭＲＳ液体培地のｐＨ値がｐＨ２．４又は２．０まで低下すると、ＢＣＲＣ １７３９４（バー１０３）、ＢＢ-１２（バー１０５）及びＢｉ０７（バー１０７）の細胞数は１０^６から１０^７ｃｆｕ／ｍＬまで低下した。これらの数がＧＫＫ２の数より明らかに低く、ＧＫＫ２は、その細胞数が１０^８ｃｆｕ／ｍＬ（ｐ<０．０５）より大きくなるように維持していた。そのため、酸性の環境において、菌株ＧＫＫ２の生細胞数が他の菌株の生細胞数より著しく高かった。この実験の結果によると、他の菌株に比べ、ＧＫＫ２は、より良好な耐酸性を有するで、胃を通過する場合、より良好な胃酸耐性を有することが判明された。

【0040】

胆汁耐性試験

【0041】

ＢＣＲＣから購入するＧＫＫ２、ＢＣＲＣ１７３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ ０４（受託番号ＡＴＣＣ ＳＤ ５２１９でＡＴＣＣに寄託される）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ ＢＢ-１２（受託番号ＤＳＭ １５９５４でドイツ微生物細菌保存管理センターに寄託される）、及びビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ ０７（受託番号ＡＴＣＣ ＳＤ ５２２０でＡＴＣＣに寄託される）という、合計で５種類の菌株を回収した。菌株を０．３％の胆汁酸塩を含む上記ＭＲＳ液体培地に接種して、３７℃で半時間培養した後で、連続希釈、播種、インキュベーションを行い、最後でコロニー計数を行った。

【0042】

図２に胆汁耐量試験の結果を示した。横軸は培地における胆汁酸塩の濃度を示し、また縦軸は乳酸菌株の細胞数を示した。バー２０１、２０３、２０５、２０７及び２０９は、それぞれ乳酸菌株ＧＫＫ２、ＢＣＲＣ １７３９４、ＤＳＭ １５９５４（ＢＢ-１２）、ＡＴＣＣ ＳＤ ５２２０（Ｂｉ ０７）及びＡＴＣＣ ＳＤ ５２１９（Ｂｉ ０４）を表した。記号「*」はＧＫＫ２と他の乳酸菌株との間の著しい差異（ｐ<０．０５）を示した。

【0043】

図２に示すように、菌株ＧＫＫ２（バー２０１）及び他の４つの菌株（バー２０３、２０５、２０７及び２０９）の細胞数は、これらの菌株が原始ＭＲＳ液体培地で培養される場合に５×１０^９ｃｆｕ／ｍＬに達することができた。０．３％の胆汁酸塩を有するＭＲＳ液体培地で培養される菌株については、ＢＣＲＣ １７３９４（バー２０３）、Ｂｉ０７（バー２０７）及びＢｉ０４（バー２０９）の細胞数がＧＫＫ２の細胞数（ｐ<０．０５）より著しく低いが、ＢＢ-１２（バー２０５）とＧＫＫ２との間に統計学的に有意な細胞数の差異はなかった。そのため、胆汁酸塩の環境において、菌株ＧＫＫ２の生細胞数が他の菌株の生細胞数より著しく高く、ＧＫＫ２は、他の菌株よりも良好な耐胆汁性を有するで、生体内の消化管を通過する場合、よりも胆汁酸塩に強いことが判明された。

【0044】

熱耐性試験

【0045】

ＢＣＲＣから購入するＧＫＫ２、ＢＣＲＣ１７３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ ０４（受託番号ＡＴＣＣ ＳＤ ５２１９でＡＴＣＣに寄託される）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ ＢＢ-１２（受託番号ＤＳＭ １５９５４でドイツ微生物細菌保存管理センターに寄託される）、及びビフィドバクテリウム・アニマリス亜種Ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ ０７（受託番号ＡＴＣＣ ＳＤ ５２２０でＡＴＣＣに寄託される）という、合計で５種類の菌株を回収した。菌株を７０℃まで加熱されたＭＲＳ液体培地に接種してそれぞれ５、１０及び１５分間維持した後で、連続希釈、播種、インキュベーションを行い、最後でコロニー計数を行って観察した。

【0046】

図３に熱耐性試験の結果を示した。横軸は７０℃で加熱する時間幅を表し、また縦軸は乳酸菌株の細胞数を表した。バー３０１、３０３、３０５、３０７及び３０９は、それぞれ乳酸菌株ＧＫＫ２、ＢＣＲＣ １７３９４、ＤＳＭ １５９５４（ＢＢ-１２）、ＡＴＣＣ ＳＤ ５２２０（Ｂｉ ０７）及びＡＴＣＣ ＳＤ ５２１９（Ｂｉ ０４）を表した。記号「*」はＧＫＫ２と他の乳酸菌株との間の著しい差異（ｐ<０．０５）を示した。

【0047】

図３に示すように、加熱されない（０分間）場合、菌株ＧＫＫ２の細胞数及び他の４つの菌株の細胞数は５×１０^９ｃｆｕ／ｍＬに達することができた。７０°Ｃで５分間加熱されると、ＢＣＲＣ １７３９４（バー３０３）、Ｂｉ０７（バー３０７）及びＢｉ０４（バー３０９）の細胞数がＧＫＫ２（バー３０１）の細胞数（ｐ<０．０５）より著しく低くなるが、ＢＢ-１２（バー３０５）とＧＫＫ２ との間に統計学的に有意な細胞数の差異はなかった。７０°Ｃで１５分間加熱されると、４つの他の菌株の細胞数はＧＫＫ２の細胞数（ｐ<０．０５）より著しく低かった。そのため、高温の環境において、ＧＫＫ２の生細胞数が他の菌株の生細胞数より著しく高いで、ＧＫＫ２の耐熱性がよりよいことが判明された。乳酸菌が常に熱不安定性でありまた活性を保持するために低温で保存されるべきであるが、この試験により、ＧＫＫ２は耐熱性の特徴を有しまた室温で長時間保存されることができることが判明され、これは過程の推進中でＧＫＫ２を加えることに有利であった。

【0048】

菌株のインキュベーション

【0049】

各種の上記乳酸菌株番号Ａ～Ｊの単離したコロニーを固体培地に画線培養した後でピックアップした。好ましい実施形態において、固体培地はＭＲＳ寒天であった。単離されたコロニーをフラスコに含まれる液体培地に接種して、液体インキュベーション工程を行って、液体培養物を得た。好ましい実施形態において、液体培養の条件として、温度３５～５０℃、通気範囲０～１ｖｖｍのＮ_２又はＣＯ_２、また回転速度の範囲１０～１００ｒｐｍに設定した。好ましい実施形態において、液体インキュベーション工程の時間幅は、１６～２４時間であるが、より好ましくは１８時間であった。好ましい実施形態において、液体培地は、ＭＲＳ液体培地であった。好ましい実施形態において、液体培地を表２に示すレシピで調製した。

【0050】

【表2】

【0051】

凍結乾燥粉末の調製

【0052】

液体インキュベーション工程の後で、液体培養物（細菌を含む液体培地）を収集して遠心させて沈殿物を得た。好ましい実施形態において、液体培養物を１０００～１５０００ｒｐｍの回転速度で遠心させた。得られた沈殿物と保護剤（６％～３０％の脱脂粉乳を含む）とを混合させて凍結乾燥した後で、冷凍保存した。好ましい実施形態において、凍結乾燥温度を－１９６℃～－４０℃に設定した。好ましい実施形態において、凍結乾燥の時間幅は１６～７２時間であった。好ましい実施形態において、冷凍保存の温度は－３０℃～０℃であった。凍結乾燥粉末を下記細胞実験の原料として使用し、つまり、凍結乾燥粉末は、本発明における活性物質を有する乳酸菌の様々な形態の１つであった。本発明における活性物質を有する乳酸菌の別の形態としては、上記単離されたコロニーに対して液体インキュベーション工程を行って得られた液体培養物を含んだ。

【0053】

Ｃｉｓｄ２遺伝子に対するルシフェラーゼレポーターアッセイ

【0054】

ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ）２９３細胞（台湾台北の国立陽明大学から入手した）に対してルシフェラーゼレポーターアッセイを行うことで、Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現に影響を与える活性物質を有する乳酸菌を決定し、前記乳酸菌のルシフェラーゼレポーター遺伝子はＣｉｓｄ２遺伝子を標的とするために、Ｃｉｓｄ２プロモーターにより制御された。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＨＥＫ２９３細胞を２×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度で６ウェルプレートに培養して、３７℃の温度下で５％のＣＯ_２インキュベーターで１日間インキュベーションした。そして、上記調製された乳酸菌株番号Ａ～Ｊの凍結乾燥粉末を０．１％のＤＭＳＯの担体で回収して表３に示す異なる濃度の凍結乾燥粉末を含有する溶液を調製して、ＨＥＫ２９３細胞の培地に加えて実験群とした。対照群に対しては、０．１％のＤＭＳＯの担体のみでＨＥＫ２９３細胞を処理した。ＨＥＫ２９３細胞を、活性物質を有する乳酸菌又は担体０．１％のＤＭＳＯと共に３７℃の温度下で５％のＣＯ_２インキュベーターで２４時間インキュベーションした。最後で、ＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼ活性を測定し定量分析した。ルシフェラーゼレポーターアッセイを３回繰り返した。実験結果を図４に示した。

【0055】

【表3】

【0056】

内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現レベル

【0057】

内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現レベルを検出することで、Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現に影響を与える活性物質を有する乳酸菌を確認した。まず、ＨＥＫ２９３細胞を２×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度で６ウェルプレートに接種して、３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターで１日間培養した。そして、６つの乳酸菌株番号Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ及びＩの凍結乾燥粉末を０．１％のＤＭＳＯの担体で再水和して、表４に示す異なる濃度を有する溶液を製作し、ＨＥＫ２９３細胞の培地に加えて実験群とした。対照群に対しては、０．１％のＤＭＳＯの担体のみでＨＥＫ２９３細胞の培地を処理した。ＨＥＫ２９３細胞を、活性物質を有する乳酸菌又は担体と共に３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターで２４時間インキュベーションした。氷上で６ウェルプレートからＨＥＫ２９３細胞を擦り取って、市販のＲＮＡ精製キット（ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ精製キット、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カタログ番号Ｋ０７３１、米国マサチューセッツ州）によってｍＲＮＡを抽出した。適切な濃度まで希釈した後、ＲＮＡ逆転写キット（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ基準ｃＤＮＡ合成キット、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号Ｋ１６３２、米国マサチューセッツ州）によってｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。最後で、ＰＣＲによって内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現レベルを分析した。実験結果の電気泳動写真を図５に示し、また図５の分析結果は図６に示した通りであった。

【0058】

【表4】

【0059】

Ｃｉｓｄ２の関連実験の統計方法

【0060】

全てのデータを平均値±標準偏差（ＳＤ）として示した。倍数変化は、対照群と実験群との間の遺伝子活性の変化であった。実験群と対照群との間に統計学的に有意な差異がある場合、*ｐ<０．０５は統計学的に有意な差異であり、また**ｐ<０．０１は統計学的に高度に有意である差異であった。

【0061】

Ｃｉｓｄ２実験の結果

【0062】

図４にＣｉｓｄ２を標的とするルシフェラーゼレポーターアッセイの実験結果を示した。横軸は処理を表し、また縦軸は実験群の対照群に対するルシフェラーゼ活性の倍数を表した。活性物質を有する１０種類の乳酸菌株番号Ａ～Ｊで処理されたＨＥＫ２９３細胞において、乳酸菌株番号Ａ、Ｃ、Ｈ又はＩで処理された細胞は、対照群よりも高いルシフェラーゼ活性を示し、Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現を増強することができることが判明された。具体的に、１２．５μｇ／ｍＬの濃度又は２５μｇ／ｍＬのより高い濃度の菌株番号Ａで処理されたＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼ活性が対照群のルシフェラーゼ活性よりも高い。結果によると、活性物質を有する乳酸菌株番号ＡはＣｉｓｄ２遺伝子を活性化してその発現を刺激することができることが判明された。結果によると、実験群における０．２５μｇ／ｍＬ又は０．５μｇ／ｍＬの菌株番号Ｃで処理されたＨＥＫ２９３細胞は、菌株番号Ａで処理されたもののように、ルシフェラーゼ活性が対照群のルシフェラーゼ活性よりも高いことが判明された。また、結果によると、活性物質を有する乳酸菌株番号ＣはＣｉｓｄ２遺伝子を活性化してその発現を刺激することができることが判明された。実験群における１．５μｇ／ｍＬの菌株番号Ｈで処理されたＨＥＫ２９３細胞については、処理されたＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼ活性は対照群のルシフェラーゼ活性の約１．１４倍であった。また、結果によると、活性物質を有する乳酸菌株番号ＨはＣｉｓｄ２遺伝子を著しく活性化して（ｐ<０．０５）、またＣｉｓｄ２遺伝子の発現を刺激する潜力を持つことが証明された。対照群におけるＨＥＫ２９３細胞と比べると、活性物質を有する２．５μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬの乳酸菌株番号Ｉで処理されたＨＥＫ２９３細胞もより高いルシフェラーゼ活性を示するので、活性物質を有する乳酸菌株番号ＩもＣｉｓｄ２遺伝子の発現を活性化する潜力を持つことが判明された。

【0063】

内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現レベルの実験結果を図５及び図６に示した。実験群において、菌株番号Ａ及びＣで処理されたＨＥＫ２９３細胞のＣｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルは、対照群のより著しく大きいわけではない。具体的に、実験群における菌株番号Ｃで処理されたＨＥＫ２９３細胞のＣｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルは、更に、対照群のＣｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルよりも低かった。なお、実験群における１．５μｇ／ｍＬの菌株番号Ｈ、５μｇ／ｍＬの菌株番号Ｈ又は２．５μｇ／ｍＬの菌株番号Ｉで処理されたＨＥＫ２９３細胞のＣｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルは対照群のＣｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルよりも著しく高いで、乳酸菌株番号Ｈ及びＩはＣｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルを増強することができることが判明された。具体的に、対照群と比較した場合、１．５μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬの菌株番号ＨでＨＥＫ２９３細胞を処理した後で、Ｃｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルはそれぞれ約１．１５倍（ｐ<０．０５）及び１．３７倍（ｐ<０．０１）まで刺激された。活性物質を有する乳酸菌の濃度の増加につれて、内因性Ｃｉｓｄ２遺伝子の発現レベルが増加するので、濃度・効果関係が判明された。対照群と比較した場合、２．５μｇ／ｍＬの乳酸菌株Ｉは、Ｃｉｓｄ２ ｍＲＮＡの発現レベルを約１．２１倍（ｐ<０．０５）まで刺激することができた。

【0064】

上記実験結果によると、活性物質を有する特定の乳酸菌株（好ましい実施形態では、ラクトバチルスパラカゼイ、ラクトバチルスプランタラム又はビフィドバクテリウムラクティス）のみが長寿遺伝子Ｃｉｓｄ２の発現レベルを向上させたことが証明された。これらの結果に基づいて、医薬分野への乳酸菌の新しい適用が発見された。そのため、活性物質を有する乳酸菌を実際的に適用するために、活性物質を有する乳酸菌を含む組成物を調製して、有効投薬量で対象に投与して所望の効果を達成した。

【0065】

乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）の老化の遅延及び長寿命化の効果を評価するために、下記実験を行った。

【0066】

老化スコア用の動物実験

【0067】

下記実験の過程を図７に示した。実験において、加齢を促進した動物モデルを老化促進マウス（ＳＡＭ）によって製作した。ＳＡＭマウスは、日本の東京の東京大学Ｔ． Ｔａｋｅｄａチームにより開発され、選抜育種プログラムによって発生するＡＫＲ／Ｊマウスの亜株を表すものであった。実験用のＳＡＭマウス系は、ＳＡＭＰ８であり、脳ニューロンの喪失、皮質萎縮、リポフスチン、網状構造における海綿状静脈の奇形、及びアミロイド沈着を特徴とする。ＳＡＭＰ８マウスの他の特徴として、他の器官の加速老化及び寿命の短縮化を含む。そのため、ＳＡＭＰ８マウスは、老化の遅延及び繁殖の関連研究に用いられる理想的な動物モデルであった。ＳＡＭＰ８マウスを自動制御のクリーンルームに位置する温度２５±２℃また湿度６５±５％の動物設備における３０（Ｗ）×２０（Ｄ）×１０（Ｈ）ｃｍ^３の透明プラスチックケージに維持した。０７:００～１９:００を暗闇期間、また１９:００～０７:００を照明期間と設定した自動タイマーによって、明暗サイクルを制御した。

【0068】

台湾衛生福利部（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ ｏｆ Ｔａｉｗａｎ）の発表した「老化防止用の健康食品の健康上の利点の評価方法」を参照して、下記実験において、マウス実験動物として、３ヶ月のオス及びメスのＳＡＭＰ８を選んだ。２０匹のオスマウス及び２０匹のメスマウスを対照群（ｎ=１０）及び乳酸菌株番号Ｉを投与した実験群（ｎ=１０）にグループ分けた。対照群のマウスにｄｄＨ_２Ｏを投与する場合、所望の用量を有する試験試料として、ｄｄＨ_２Ｏで再水和される乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）の凍結乾燥粉末を実験群のマウスに投与した。表５に各群の詳細情報及び試験試料の所望の用量を示した。

【0069】

【表5】

【0070】

実験過程は１３週間続いた。実験期間中、毎日マウスに１回投与し、また毎日マウスの食物や水分摂取量を記録した。１２週目に老化スコアリングアッセイ及び単一試験受動回避試験を実行した。１３週目に前肢握力試験及び能動シャトル回避試験を実行した。試験が終了した後、マウスを二酸化炭素で麻酔して首を切って殺した（マウスを犠牲前に８時間絶食させた）。血及び器官を取って更に分析した。

【0071】

老化スコア

【0072】

Ｔａｋｅｄａ等が１９８１年に作成した老化スコアを調節してＳＡＭマウスの老化程度の決定に用いた。皮膚光沢度、粗度、脱毛、皮膚潰瘍、眼球周辺の病変及び脊椎湾曲という、６つの項目を選んで老化程度の決定を行った。評価において、各項目の老化スコアとして、低から高への老化程度は０、１、２、３及び４であった。評価した後で、各項目の老化スコアを加算して、高い老化スコアを有するマウスは高い老化程度を有する。

【0073】

前肢握力試験

【0074】

老化する途中で、ヒトの生理機能が次第に劣化する。なお、このヒトは多種の慢性疾病を患って、身体活動量が減少して、廃用性筋萎縮を誘発させる可能性がある。一般的に、ヒトは、３０歳後に筋肉量が毎年１％～２％低減し、６０歳後に筋肉量の低減速率が著しく高くなり、ひいては、毎年約１５％に達する可能性がある。筋肉量の損失は、例えば、身体障害、転倒、機能低下、長期間病臥、更に死亡のような、後の増悪健康イベントのリスク因子である。

【0075】

老化した後で骨格筋減少になり、骨格筋減少が筋肉減少症になることがある。（１）低筋肉量、（２）低筋肉強度、及び（３）低身体活動能力という、３つの方面から筋肉減少症を検討する。欧洲高齢者筋肉減少症ワークグループ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ ｉｎ Ｏｌｄｅｒ Ｐｅｏｐｌｅ）は、２０１０年に老化関連の筋肉減少症の診断方法及び定義を開発した。慣れた歩行速度が１．０ｍ／ｓより低く又は両手の握力が低く及び筋肉量が閾値よりも低い６５歳以上の高齢者を筋肉減少症と診断する。国立台湾大学付属病院一般医科学及び家庭医学科（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の高齢者入院の統計データによると、高齢になると、男性の筋肉減少症の有病率が１８％から６４％まで上昇し、女性の筋肉減少症の有病率が９％から４１％まで上昇する。しかしながら、効果的な干渉や診断によって筋肉減少症及び身体衰弱の悪化を遅延させて、その後の如何なる不利の健康イベントを防止することができる。

【0076】

前肢握力試験において、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌ握力計（ＧＳＭ、カタログ番号４７２００、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、２１０３６ ＶＡ、イタリア）によってＳＡＭＰ８マウスの前肢握力を試験して、筋力評価を行った。試験中、各匹のマウスの尾部を端点に保持して、マウスがその前肢でグリップレバーを掴むようにした。そして、マウスがグリップレバーを放すまで、尾部を水平となるように後ろへ引いた。ＧＳＭによって結果を３回連続して記録した。

【0077】

単一試験受動回避試験

【0078】

単一試験受動回避試験によってマウスの学習や記憶に影響を与える可能性のある乳酸菌を決定し、この試験は典型的な条件付け原理及びマウスの背光性の習性に基づくものであった。実験で用いた専用ケースの中心にドアがあり、ケースが互いに接続する明室及び暗室に分けられた。ケースの底部に平行して配列され電流に接続される金属ロッドがあった。まず、マウスを明室に置いて、単一試験受動回避試験の開始時に中心でのドアを開けて、マウスを自由に探索させた。一旦、マウスが暗室に入ると、直ちにドアを閉じて、また学習訓練として、マウスに０．５ｍＡの単回ショックを０．５秒間印加した。訓練後の２４時間、４８時間及び７２時間に、ショックを与えずに同じく操作するように、マウスの学習や記憶を試験し、またマウスの明室に留まる潜伏時間を記録した。最大試験時間幅は１８０秒間であった。マウスの明室での潜伏時間によってマウスの学習や記憶を評価した。マウスの明室での潜伏時間が長いほど、マウスの学習や記憶がよいことを表す。

【0079】

能動シャトル回避試験

【0080】

マウスの学習や記憶に影響を与える乳酸菌を決定するために、典型的な条件付け原理及びマウスの背光性及び負の走音性の習性に基づいて、能動シャトル回避試験を行った。試験に使用される専用ケースの中心にドアがあり、ケースが互いに接続する明室及び暗室に分けられ、底部に電流装置に接続された、平行して配列される金属ロッドを有する。光線、騒音又は電気ショックのタイミングをコンピュータプログラムによって制御した。まず、マウスに光及び音声の条件付け刺激（ＣＳ）を与えた。ＣＳを避けられないマウスに、非条件付け刺激（ＵＣＳ）として、電気ショックを与えた。ＣＳを避けたマウスに、電気ショックを与えなかった。試験のたびに、能動シャトル回避試験を５回し、毎日試験を４回し、ＣＳ／ＵＣＳを４日間連続して実験動物を試験した。シャトル回避試験によって、マウスがシステムにおいて成功に能動的に回避した回数によって、マウスの活動の学習や記憶を評価した。マウスが成功に能動的に回避した回数が多いほど、マウスの学習や記憶がよいことを表す。

【0081】

動物実験の統計方法

【0082】

統計パッケージソフトウェア統計製品及びサービスソリューション(エスピーエスエス)（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；ＳＰＳＳ）によって研究によるデータを統計し分析して、実験結果値を平均値±試料平均値の標準偏差（ＳＥＭ）として示した。一元分散分析（一元ＡＮＯＶＡ）によってデータを試験して、各群の間の差異を試験して、ダンカンの多重範囲検定（ＭＲＴ）によって各群内の差異を試験した。*ｐ<０．０５は統計学的に有意な差異を示した。

【0083】

動物実験の結果

【0084】

各群の老化スコアを表６及び表７に示した。

【0085】

【表6】

【0086】

【表7】

【0087】

上記１２週目の老化スコアを参照すると、対照群と実験群との間に統計学的に有意な老化スコア差異があり、３ヶ月のオス及びメスのＳＡＭＰ８マウスの何れも乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）によって処理された。具体的に、メスマウスの間の差異はより著しかった（ｐ<０．０５）。高い老化スコア（表６及び表７に示す合計のスコア）が高い老化程度を表すため、動物実験から得られた老化スコアによって、マウスに乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）を投与するとマウスの老化程度を有利的に低下させることが示され、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）が老化の遅延に対して著しい効果を有することが。

【0088】

各群におけるオスマウスの前肢握力試験の結果を表８に示し、統計分析としては、図８に示すように、縦軸は握力を表し、横軸は群別を表し、またバー８０１及び８０３はそれぞれ対照群及び実験群を表した。

【0089】

【表8】

【0090】

上記前肢握力試験における１３週目で測定した握力を参照すると、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）の投与された実験群におけるマウスの握力（バー８０３）は（ｐ<０．０５）対照群におけるマウスの握力（バー８０１）より著しく高かった。高い握力がよい筋力を表すため、その結果によると、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）の投与されたマウスがよい筋力を有することが示され、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）は老化による筋肉減少症の緩和に対して著しい効果ことが判明された。

【0091】

単一試験受動回避試験については、各群におけるメス及びオスマウスの実験結果及び統計学分析をそれぞれ表９、図９及び表１０、図１０に示した。図９及び図１０において、横軸は訓練後の時間を表し、縦軸は潜伏時間を表し、またバー９０１／１００１及び９０３／１００３はそれぞれ対照群及び実験群を表した。

【0092】

【表9】

【0093】

【表10】

【0094】

１３週目のマウスの単一試験受動回避の結果を参照すると、３ヶ月のオス及びメスのＳＡＭＰ８マウスの何れも対照群（バー１００１、バー９０１）と実験群との間に統計学的に有意な潜伏時間の差異があることが示され、前記実験群においてマウスに乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）が投与された（バー１００３、バー９０３）。なお、学習訓練後の２４時間目、マウス潜伏時間の差異はより著しかった。潜伏時間が長いほどマウスの学習や記憶が長いことが示されるため、その結果によると、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）試料の投与されたマウスはより良好な学習や記憶を有し、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）が老化の遅延に対して著しい効果を有することが判明された。

【0095】

能動シャトル回避試験については、各群のメスマウスの実験結果及び統計分析をそれぞれ表１１及び図１１に示した。各群のオスマウスの実験結果及び統計分析をそれぞれ表１１、表１２及び図１１、図１２に示した。図１１及び図１２において、横軸は訓練後の日数を表し、縦軸は成功に能動的に回避した回数の平均値を表し、またバー１１０１／１２０１及び１１０３／１２０３はそれぞれ対照群及び実験群を表した。

【0096】

【表11】

【0097】

【表12】

【0098】

１４週目のマウスが能動シャトル回避試験において成功に能動的に回避した回数を参照すると、試験後の初めての実験日の当日に、まだ学習する途中であるため、各々の間に統計学的に有意な成功に能動的に回避した回数の差異はなかった。しかしながら、試験後の２日目～４日目に、実験群のオス及びメスのマウスの成功に能動的に回避した回数（それぞれバー１２０３、１１０３である）は対照群の成功に能動的に回避した回数（それぞれバー１２０１、１１０１である）より著しく高かった。具体的に、試験後の３日目に、実験群のメスマウスの成功に能動的に回避した回数は対照群の２倍（ｐ<０．０５）であった。成功に能動的に回避した回数が多いほどマウスの学習や記憶がよいことを示すため、その結果によると、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）試料の投与されたマウスの学習や記憶はよりよいことが判明された。上記結果によると、乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）は老化関連の神経変性疾患による学習や記憶悪化の緩和に対して著しい効果を有することが証明された。

【0099】

上記実験の結果によると、乳酸菌、特にビフィドバクテリウムラクティス、又は好ましくは乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）は、長寿遺伝子Ｃｉｓｄ２の発現レベル、老化スコア、前肢握力試験、及び学習や記憶を著しく改善した。そのため、活性物質を有する乳酸菌株菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）を含む組成物は、長寿命化の促進に用いられることができる。

【0100】

ここで、「有効投薬量」とは、上記予防及び／又は治療効果を達成することに十分な使用量であった。インビトロ細胞培養実験については、上記有効投薬量を「μｇ／ｍＬ」と定義し、「ｍＬ」は各種の細胞培養物の細胞培地に基づいた総体積であった。動物モデル実験については、上記有効投薬量を「ｇ／６０ kｇ体重／日」と定義した。なお、下記の計算によって、インビトロ細胞培養実験の得られた有効投薬量を動物用の有効投薬量に転換することができた。

【0101】

一般的に（Ｒｅａｇａｎ-Ｓｈａｗ等、２００９）、１「μｇ／ｍＬ」（インビトロ細胞培養実験に基づいた有効投薬量）は１「ｍｇ／ｋｇ体重／日」（動物モデル実験による有効投薬量）と等価であった。なお、マウスの代謝率はヒトの代謝率の６倍であった。

【0102】

そのため、体外細胞実験による有効投薬量が５００μｇ／ｍＬであれば、マウス用の有効投薬量は、５００ｍｇ／ｋｇ体重／日（つまり０．５ｇ／ｋｇ体重／日）として計算すべきであつた。なお、上記代謝率の差異に基づいて、ヒトに用いられる合理的な有効投薬量は５ｇ／６０ｋｇ体重／日として計算すべきであった。

【0103】

上記の経験結果を参照すると、インビトロ細胞培養実験による有効投薬量が１．５μｇ／ｍＬであるため、マウス実験用の有効投薬量を１．５ｍｇ／ｋｇ体重／日と推算し、ヒト用の合理的な有効投薬量は０．０１５ｇ／６０ｋｇ体重／日であるべきであった。

【0104】

好ましい実施形態において、組成物に含まれる活性物質を有する乳酸菌の有効投薬量は１０ｍｇ／６０ｋｇ体重／日であった。

【0105】

前記組成物は、添加剤を更に含む。好ましい実施形態において、添加剤は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収剤、甘味剤、又はそれらの如何なる組み合わせであってよい。賦形剤は、クエン酸、炭酸カルシウム、リン酸三カルシウム、スクロース、又はそれらの如何なる組み合わせであってよい。防腐剤は、組成物の保存期間を延ばすことができ、例えば、ベンジルアルコール及びパラオキシ安息香酸エステル類を加えるように適用されてよい。希釈剤は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、又はそれらの如何なる組み合わせからなる群から選ばれてよい。フィラーは、乳糖、ガラクトース、高分子量ポリエチレングリコール、又はそれらの如何なる組み合わせからなる群から選ばれてよい。吸収剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アゾン、プロピレングリコール、グリセリン、又はそれらの如何なる組み合わせであってよい。甘味剤は、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース、ネオテーム、又はそれらの如何なる組み合わせであってよい。上記の添加剤以外、活性物質を有する乳酸菌を含む組成物の薬効に影響を与えずに、他の好適な添加剤を任意に選択してもよい。

【0106】

前記組成物は、医薬分野で異なる製品として開発されてよい。好ましい実施形態において、組成物は、薬物、飼料、飲料、栄養補給剤、乳製品、高齢者用食品、乳幼児食品又は健康食品であってよい。

【0107】

対象の要求に基づいて、組成物は、異なる形態に調節されてよい。好ましい実施形態において、組成物の形態は、粉末、錠剤、丸剤、座剤、マイクロカプセル剤、アンプル、液剤又はスプレー剤であってよい。

【0108】

組成物を動物又はヒトに投与することができる。乳酸菌の活性物質の機能に影響を与えずに、活性物質を有する乳酸菌を含む組成物を、如何なる薬物形態に調製して、また前記薬物形態に基づいて好ましい形態で動物又はヒトに投与してよい。

【0109】

組成物の調製．

【0110】

組成物１の下記方面を、活性物質を有する乳酸菌を含む組成物の食品用途に用いられる場合の例示として示す。

【0111】

組成物１：活性物質を有する乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）の凍結乾燥粉末（２０重量％又はｗｔ．％）を、防腐剤としてのベンジルアルコール（８重量％）、希釈剤としてのグリセリン（７重量％）及び純水（６５重量％）と完全に混合して４℃で保存した。上記ｗｔ．％は、各種の複合体の組成物の合計重量に対する重量比を示した。

【0112】

組成物２の下記方面を、活性物質を有する乳酸菌を含む組成物の医療用途に用いられる場合の例示として示す。

【0113】

組成物２：活性物質を有する乳酸菌株番号Ｉ（ＧＫＫ２）の凍結乾燥粉末（２０ｗｔ．％）を、防腐剤としてのベンジルアルコール（８重量％）、希釈剤としてのグリセリン（７重量％）、賦形剤スクロース（１０重量％）及び純水（５５重量％）と完全に混合して４℃で保存した。上記ｗｔ％は、各種の複合体の組成物の合計重量に対する重量比を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】