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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-19
(45)【発行日】2022-04-27
(54)【発明の名称】耐熱性の逆転写酵素変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20220420BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20220420BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220420BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220420BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220420BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220420BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220420BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20220420BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220420BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALN20220420BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20220420BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N9/12
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P19/34 A
C12P21/02 C
C12Q1/6844 Z
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2018556717
(86)(22)【出願日】2017-12-13
(86)【国際出願番号】 JP2017044693
(87)【国際公開番号】W WO2018110595
(87)【国際公開日】2018-06-21
【審査請求日】2020-11-24
(31)【優先権主張番号】P 2016242171
(32)【優先日】2016-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】302019245
【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】石川 一彦
(72)【発明者】
【氏名】上森 隆司
(72)【発明者】
【氏名】高津 成彰
【審査官】小金井 悟
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１１２７６７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１２／０２０７５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０４１６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５１１２１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５１６０７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】久好哲郎 他，RNase H触媒部位から離れた部位へのアミノ酸変異によるMMLV逆転写酵素の耐熱化とRNase H活性の消失，日本農芸化学会大会講演要旨集，2015年，Vol.2015th，#4C22p03, 特に【方法】，ISSN: 2186-7976
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の野生型逆転写酵素の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での５５位に相当する位置にアミノ酸変異を含む逆転写酵素変異体であって、該アミノ酸変異がスレオニンから、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、前記野生型逆転写酵素と比較して耐熱性が向上した逆転写活性を有することを特徴とする、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素変異体。
【請求項2】
さらに下記（１）～（８）からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の逆転写酵素変異体：（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
【請求項3】
リボヌクレアーゼＨ活性を欠損している、請求項１又は２に記載の逆転写酵素変異体。
【請求項4】
請求項１～３いずれか１項に記載の逆転写酵素変異体をコードする核酸。
【請求項5】
請求項４記載の核酸および発現調節配列を含む発現ベクター。
【請求項6】
請求項５記載の発現ベクターで形質転換された、逆転写酵素変異体を発現する細胞。
【請求項7】
ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする配列番号１１で示される核酸において、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素の配列番号１で示されるアミノ酸配列における、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での５５位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換する工程を包含する、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素変異体をコードする核酸の製造方法。
【請求項8】
ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする核酸が、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素又は該酵素の変異体タンパク質をコードする核酸である、請求項７記載の方法。
【請求項9】
ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする核酸が、下記（１）～（８）からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む逆転写酵素変異体をコードする核酸である、請求項８に記載の方法：（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
【請求項10】
ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での５５位に相当する位置にあるスレオニンを、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸に置換することを特徴とする、ＭＭＬＶ由来の耐熱性逆転写酵素変異体の製造方法。
【請求項11】
請求項１～３いずれか１項に記載の逆転写酵素変異体を使用して、鋳型となるＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成する工程を包含する、ｃＤＮＡの合成方法。
【請求項12】
さらにｃＤＮＡを増幅する工程を包含する、請求項１１記載の方法。
【請求項13】
ｃＤＮＡの増幅が等温増幅反応またはＰＣＲで実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項14】
請求項１～３いずれか１項に記載の逆転写酵素変異体を含む組成物。
【請求項15】
請求項１～３いずれか１項に記載の逆転写酵素変異体を含むキット。
【請求項16】
ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする配列番号１１で示される核酸において、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素の配列番号１で示されるアミノ酸配列における、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での５５位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換することを特徴とする、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素の耐熱性向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、耐熱性の逆転写酵素変異体に関する。さらに、既存の逆転写酵素の耐熱性を向上させるための方法、および当該耐熱性の逆転写酵素変異体の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）は、一般的にＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性、いわゆるＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性と、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を分解する活性、いわゆるリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有している。
【0003】
逆転写酵素は、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していることから、生体内で発現しているタンパク質のアミノ酸配列を直接反映しているｍＲＮＡの塩基配列解析、ｃＤＮＡライブラリーの構築、さらにはＲＴ－ＰＣＲなどに使用することができる。これらの用途には、モロニーマウス白血病ウイルス又はトリ骨髄芽球症ウイルスの産生する逆転写酵素がよく用いられている。
【0004】
このように逆転写酵素の用途は多岐にわたるが、ＲＮＡを鋳型とすることから種々の問題点がある。例えば、ｍＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合、当該ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成が前記二次構造によって妨げられることがある。この問題を解決するためには逆転写反応の温度を上げることで効果があるが、前記モロニーマウス白血病ウイルスが産生する逆転写酵素およびトリ骨髄芽球症ウイルスが産生する逆転写酵素は耐熱性が低く、ＲＮＡの二次構造形成が抑制されるような温度条件では失活してしまう。そのため、耐熱性を向上させた逆転写酵素変異体が提案されてきた（例えば、特許文献１～６を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】日本特許第４１９３０７９号
【文献】国際公開パンフレットＷＯ２００４／０２４７４９
【文献】国際公開パンフレットＷＯ２００７／０２２０４５
【文献】国際公開パンフレットＷＯ２００９／１２５００６
【文献】国際公開パンフレットＷＯ２０１２／１０８６７２
【文献】国際公開パンフレットＷＯ２０１５／１１２７６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、さらなる耐熱性逆転写酵素の開発が依然として望まれている。本発明の目的は、耐熱性の逆転写酵素変異体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、耐熱性の逆転写酵素変異体を開発すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）（以下、ＭＭＬＶと略することもある）が産生する逆転写酵素のアミノ酸配列において、これまで変異が導入されたことのない、ループ構造の安定化に関連すると思われる第５５番目のスレオニンを非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択された他のアミノ酸に置換することによって、耐熱性を有する逆転写酵素が得られることを見出した。さらに当該アミノ酸変異を既知の耐熱性逆転写酵素のアミノ酸変異と組み合わせることにより、該既知の逆転写酵素の耐熱性をさらに向上させることができることを見出した。さらに当該アミノ酸変異を新規な他のアミノ酸変異と組み合わせることにより、耐熱性がさらに向上した逆転写酵素が得られることも見出した。かくして、本発明を完成させた。
【0008】
すなわち、本発明は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列のループ構造の立体構造を安定化させるために、アミノ酸配列の５３位から５６位にかけての部位のアミノ酸を置換することを特徴とする。本発明の第一の態様は、特に限定はされないが、５５位に相当する位置にアミノ酸変異を含む逆転写酵素変異体であって、該アミノ酸変異がスレオニンから他のアミノ酸への置換であり、該他のアミノ酸が非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されることを特徴とする、逆転写酵素変異体に関する。本発明の第一の態様の逆転写酵素変異体において、前記アミノ酸変異は、スレオニンから、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸への置換であってもよい。また、本発明の第一の態様の逆転写酵素変異体において、前記アミノ酸変異は、スレオニンから、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸への置換であってもよい。
【0009】
本発明の第一の態様の逆転写酵素変異体の一例として、前記アミノ酸変異がスレオニンからグリシン又はアスパラギン酸への置換であることを特徴とする逆転写酵素変異体が挙げられる。また、本発明の第一の態様の逆転写酵素変異体は、下記（１）～（８）からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい：
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
【0010】
なお、上記の第５５位のアミノ酸置換および上記（１）の第５４位のアミノ酸置換と、上記（２）～（８）からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換とを組み合わせて含む逆転写酵素変異体も本発明の範疇である。また、本発明の第一の態様の逆転写酵素変異体は、さらにリボヌクレアーゼＨ活性を欠損していてもよい。
【0011】
なお、上記（３）の第２９１位のアミノ酸置換、ならびに上記（８）の第２０９位および第２１２位のアミノ酸置換は、本発明により初めて耐熱性との関連が確認されたものである。例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型のアミノ酸配列において第２９１位のグルタミンからリシンへのアミノ酸置換、あるいは第２０９位のアスパラギン酸からプロリン並びに第２１２位のイソロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を有する逆転写酵素変異体は、野生型に比べて耐熱性が向上する。従って、本発明の上記の第５５位のアミノ酸置換と組み合わせる対象となる。
【0012】
本発明の第二の態様は、前記第一の態様の逆転写酵素変異体をコードする核酸に関する。
【0013】
本発明の第三の態様は、前記第二の態様の核酸および発現調節配列を含む発現ベクターに関する。
【0014】
本発明の第四の態様は、前記第三の態様の発現ベクターで形質転換された、逆転写酵素変異体を発現する細胞に関する。
【0015】
本発明の第五の態様は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素をコードする核酸において、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸をコードするコドンに置換する工程を包含する、逆転写酵素変異体をコードする核酸の製造方法に関する。本発明の第五の態様において、前記スレオニンをコードするコドンは、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換してもよい。
【0016】
本発明の第五の態様において、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素をコードする核酸は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素又は該酵素の変異体をコードする核酸であってもよい。
【0017】
本発明の第五の態様において、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素をコードする核酸は、下記（１）～（８）からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む逆転写酵素変異体をコードする核酸であってもよい：
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
【0018】
本発明の第六の態様は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする、耐熱性の逆転写酵素変異体の製造方法に関する。本発明の第六の態様の方法において、前記スレオニンは、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に置換してもよい。
【0019】
本発明の第七の態様は、前記第一の態様の逆転写酵素変異体を使用して、鋳型となるＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成する工程を包含する、ｃＤＮＡの合成方法に関する。また、当該方法において、さらにｃＤＮＡを増幅する工程を包含してもよい。さらに前記ｃＤＮＡの増幅が等温増幅反応またはＰＣＲで実施されるものであってもよい。
【0020】
本発明の第八の態様は、前記第一の態様の逆転写酵素変異体を含む組成物に関する。
【0021】
本発明の第九の態様は、前記第一の態様の逆転写酵素変異体を含むキットに関する。
【0022】
本発明の第十の態様は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする、逆転写酵素の耐熱性を向上させる方法である。本発明の第十の態様において、前記スレオニンは、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に置換してもよい。また、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素をコードする核酸において、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換することを特徴とする、逆転写酵素の耐熱性向上方法も提供される。
【発明の効果】
【0023】
本発明により、耐熱性逆転写酵素変異体並びにその製造方法が提供される。本発明によれば、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを他のアミノ酸に置換することにより、耐熱性逆転写酵素変異体が提供される。また、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを他のアミノ酸に置換することにより、既知の耐熱性逆転写酵素の耐熱性がさらに向上される。このような既知の耐熱性逆転写酵素の耐熱性をさらに向上させる効果を有するアミノ酸変異は、これまで知られておらず、本発明により初めて見出された。また、本発明の耐熱性逆転写酵素変異体は、逆転写酵素の特性、例えば、ＲＮＡ結合活性、ｃＤＮＡ伸長活性、およびｃＤＮＡ伸長速度に何ら影響を受けることなく、向上した耐熱性を有する。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明において、「耐熱性」とは、熱処理の後にも酵素活性を保持することのできる性質のことを言う。例えば、４０℃、５分の処理で活性が５０％失われる酵素であれば、５０℃以上、６０℃以上、あるいは７０℃以上の条件で５分処理した後でも５０％以上の活性を保持することができた場合に「耐熱性」が向上したと言える。このような耐熱性が向上した酵素は、より高い温度での反応に供することができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素の場合、野生型酵素の至適温度は３７～４２℃であるので、例えば４３℃以上、好ましくは４５℃以上、さらに好ましくは５０℃以上で酵素活性を保持する逆転写酵素変異体は、「耐熱性である」または「向上した耐熱性を有する」と言える。
【0025】
本発明において、「残存活性」とは、加熱処理後の酵素活性のことをいう。また、「残存活性率」とは、加熱処理しない（非加熱処理）タンパク質の酵素活性を１００％とした場合の、加熱処理後の酵素活性の割合（％）のことをいう。
【0026】
本発明において使用しているアミノ酸番号（またはアミノ酸位置）は、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号で表示している。従って、１番目のメチオニンを数える場合は、本明細書に記載されるアミノ酸番号に１を足した番号となる。
【0027】
以下、詳細に説明する。
【0028】
１．本発明の耐熱性逆転写酵素変異体
本発明の第一の態様は、耐熱性逆転写酵素変異体、即ち耐熱性を獲得した（又は耐熱性が向上した）逆転写酵素の変異体に関するものである。該逆転写酵素変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素又はその変異体において、野生型逆転写酵素のループ構造部分であるアミノ酸配列の５３位から５６位にかけての立体構造をより安定な構造にするアミノ酸に変異させることを特徴とする。例えば、野生型アミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンが、該逆転写酵素における本ループ構造の立体構造を安定化させるためのアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする。前記「非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸」とは、さらに言い換えれば、非極性で疎水性のアミノ酸であり、イソロイシン、ロイシン、バリン、グリシン、プロリン、およびアラニンが例示される。前記「極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸」とは、カルボン酸基を有するアミノ酸であり、アスパラギン酸およびグルタミン酸が例示される。本発明の逆転写酵素変異体は、特に、前記アミノ酸変異が、スレオニンからグリシンまたはアスパラギン酸へのアミノ酸置換であることが好適である。
本発明の第一の態様は、耐熱性逆転写酵素変異体、即ち耐熱性を獲得した（又は耐熱性が向上した）逆転写酵素の変異体に関するものである。該逆転写酵素変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素又はその変異体において、野生型逆転写酵素のループ構造部分であるアミノ酸配列の５３位から５６位にかけての立体構造をより安定な構造にするアミノ酸に変異させることを特徴とする。例えば、野生型アミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンが、該逆転写酵素における本ループ構造の立体構造を安定化させるためのアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする。前記「非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸」とは、さらに言い換えれば、非極性で疎水性のアミノ酸であり、イソロイシン、ロイシン、バリン、グリシン、プロリン、およびアラニンが例示される。前記「極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸」とは、カルボン酸基を有するアミノ酸であり、アスパラギン酸およびグルタミン酸が例示される。本発明の逆転写酵素変異体は、特に、前記アミノ酸変異が、スレオニンからグリシンまたはアスパラギン酸へのアミノ酸置換であることが好適である。
【0029】
さらに立体構造を安定化させるアミノ酸への置換という観点から、例えば、本発明の逆転写酵素変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がスレオニンから他のアミノ酸への置換であり、該他のアミノ酸が非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されることを特徴とする。好ましくは、本発明の逆転写酵素変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がスレオニンから他のアミノ酸への置換であり、該他のアミノ酸が非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されことを特徴とする。前記「極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸」としては、アルギニンおよびリシンが例示される。前記「極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸」としては、セリンが例示される。
【0030】
また、本発明の逆転写酵素変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がスレオニンから他のアミノ酸への置換であり、該他のアミノ酸が非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸である逆転写酵素変異体であってもよく、例えば、前記アミノ酸変異は、スレオニンからグリシン、アルギニン、リシンまたはセリンへのアミノ酸置換であってもよい。
【0031】
また、例えば、本発明の逆転写酵素変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にアミノ酸変異を含み、該アミノ酸変異がスレオニンから他のアミノ酸への置換であり、該他のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、バリン、グリシン、プロリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である逆転写酵素変異体であってもよい。さらなる例として、上記他のアミノ酸は、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸であってもよい。
【0032】
本明細書において、「モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置」とは、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のループ構造の立体構造に関与する位置であり、具体的にはアミノ酸配列の５５位、またはモロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素変異体のアミノ酸配列における、該野生型アミノ酸配列の５５位に相当する位置を意味する。逆転写酵素変異体のアミノ酸配列における「モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置」は、例えば、公知のアルゴリズム等を用いて、該野生型配列と該変異体のアミノ酸配列との比較およびアラインメントより容易に特定することができる。同様に、本願明細書においてアミノ酸位置に言及する場合、野生型アミノ酸配列におけるアミノ酸位置を記載しているが、該アミノ酸位置は、その対応する変異体における、該野生型アミノ酸配列の当該位置に相当する位置を包含する。特に限定はされないが、野生型配列の５５位に相当する位置として、変異体のアミノ酸配列の５３位から５６位にかけての部位が例示される。
【0033】
また、本発明の逆転写酵素変異体は、上記した「モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置」におけるスレオニンのアミノ酸置換（以下、「５５位のアミノ酸置換」ともいう）に加えて、５５位以外のアミノ酸位置の変異（以下、「他のアミノ酸位置の変異」ともいう）を含んでいてもよい。他のアミノ酸位置の変異は、アミノ酸置換変異、アミノ酸挿入変異、またはアミノ酸欠失変異のいずれであってもよく、また、本発明の逆転写酵素変異体は、２以上の他のアミノ酸位置の変異を含んでいてもよい。他のアミノ酸位置の変異は、特に限定されず、いずれのアミノ酸変異であってもよい。
【0034】
他のアミノ酸位置の変異の例としては、限定するものではないが、耐熱性を付与するための変異、耐熱性を向上させるための変異、および逆転写酵素の特性を改善させるためのアミノ酸変異が挙げられる。例えば、本発明の逆転写酵素変異体が、上記５５位のアミノ酸置換と、他のアミノ酸位置の変異として耐熱性の付与または向上に関与する変異とを組みあわせて含む場合、その耐熱性がさらに向上する。
【0035】
特に限定はされないが、他のアミノ酸位置の変異の好ましい例として、以下の（１）～（８）に示されるアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせが挙げられる。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
【0036】
ここで、上記他のアミノ酸位置の変異のうち上記(３)の第２９１位ならびに上記（８）の第２０９位および第２１２位のアミノ酸変異については、本発明により初めて耐熱性との関連が確認されたものである。例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型のアミノ酸配列において第２９１位のグルタミンからリシンへのアミノ酸置換、あるいは第２０９位のアスパラギン酸からプロリン並びに第２１２位イソロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を有する逆転写酵素変異体は、野生型に比べて耐熱性が向上する。従って、本発明の上記５５位のアミノ酸置換と組み合わせることにより、耐熱性がさらに向上した逆転写酵素を得ることができる。
【0037】
例えば、本発明の逆転写酵素変異体は、上記５５位のアミノ酸置換に加えて、上記（１）～（８）から選択される１以上のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、上記５５位のアミノ酸置換と、上記（１）の第５４位のアミノ酸置換を含み、さらに上記（２）～（８）から選択される１以上のアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせとを含む逆転写酵素変異体も本発明の範疇である。例えば、第５４位のアラニンをプロリン、第５５位のスレオニンをグリシンにアミノ酸置換し、さらに上記（２）～（８）のアミノ酸置換を組み合わせたものが例示される。
【0038】
本発明の逆転写酵素変異体は、さらにＲＮａｓｅＨ活性を欠失する変異を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅＨ活性欠失変異としては、特に限定はされないが、５８３位および／または５２４位のアスパラギン酸を別のアミノ酸に置換させたもの、またはＲＮａｓｅ Ｈ活性ドメインを欠失させたものが例示される。かくして、本発明は、耐熱性を有し、かつＲＮａｓｅＨ活性を欠失した逆転写酵素変異体を提供する。このような変異体は、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応に好適に使用される。
【0039】
本発明の逆転写酵素変異体として、特に限定はされないが、配列番号１記載の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号２）を含む変異体、またはアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列（配列番号３）を含むタンパク質が例示される。さらに、本発明の逆転写酵素変異体の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる変異体、および配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる変異体が挙げられる。また、本発明の逆転写酵素変異体として、特に限定はされないが、配列番号４～１０、３９～４４、５２、５５～６２記載のいずれかのアミノ酸配列を含む変異体が例示される。さらに、本発明の逆転写酵素変異体の例として、配列番号４～１０、３９～４４、５２、５５～６２記載のいずれかのアミノ酸配列からなる変異体が挙げられる。前記アミノ酸配列においては、さらに耐熱性を向上させるための別の変異や逆転写酵素の特性を改善させるための変異等を含んでいてもよい。
【0040】
さらに、本発明の逆転写酵素変異体の例として、配列番号１と少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、耐熱性を有する変異体であって、該アミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンが、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸、例えば、グリシンまたはアスパラギン酸に置換された逆転写酵素変異体が挙げられる。また、本発明の逆転写酵素変異体のさらなる例として、配列番号１と少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、耐熱性を有する変異体であって、該アミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンが、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸、例えば、グリシンまたはアスパラギン酸に置換された、逆転写酵素変異体が挙げられる。
【0041】
野生型逆転写酵素では３７～４２℃において活性を示すのに対し、本発明の逆転写酵素変異体は、４０℃以上、例えば、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、または６０℃以上の温度条件下でも活性を示す。例えば、限定するのもではないが、本発明の逆転写酵素変異体は、５０～５５℃の高温域でも野生型と比較して高い活性を示し、該高温域にて保温された後の残存活性も野生型と比較して高くなる。
【0042】
また、本発明の逆転写酵素変異体は、耐熱性を有し、かつ、逆転写酵素の特性、例えばＲＮＡ結合活性、ｃＤＮＡ伸長活性等を保持する。すなわち、上記「５５位のアミノ酸置換」は、逆転写酵素に耐熱性を付与するが、逆転写酵素の特性、例えばＲＮＡ結合活性、ｃＤＮＡ伸長活性、ｃＤＮＡ伸長速度に対して影響を与えない。
【0043】
さらに、本発明の逆転写酵素変異体は、上記５５位のアミノ酸置換と他の耐熱化変異とを組み合わせて含む場合、さらに向上した耐熱性を有する。
【0044】
さらに、本発明の逆転写酵素変異体は、発現させたポリペプチドの精製を容易にするためのアフィニティタグを含んでいてもよい。本発明の逆転写酵素変異体は、逆転写酵素活性ならびに固有の耐熱性を維持する限り、アフィニティタグ等のペプチドもしくはポリペプチドを、例えばＮ末端またはＣ末端に有していてもよい。このようなタグは当該変異体の生成に有用である。タグの例としては、Ｈｉｓ残基が４個～８個連続するヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ｃ－ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグなどの公知のものが挙げられる。所望により、これらタグは１～１５個のアミノ酸を含むリンカーを介して本発明の変異体と連結することができる。
【0045】
２．本発明の耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸
本発明においては、耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸を提供することができる。具体的には上記した本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸を提供する。
本発明においては、耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸を提供することができる。具体的には上記した本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸を提供する。
【0046】
本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸として、特に限定はされないが、配列番号２～１０、３９～４４、５２、または５５～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸が例示される。さらに、本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸の例として、配列番号２～１０、３９～４４、５２または５５～６２記載のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸が挙げられる。さらに好適には、本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸として、配列番号１２～２０、４５～５０、５４または６３～７０のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸が例示される。さらに、本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸の例として、配列番号１２～２０、４５～５０、５４または６３～７０のいずれかに記載の塩基配列からなる核酸が挙げられる。前記核酸は、さらに耐熱性を付与または向上させるための別の核酸変異や逆転写酵素の特性を改善させるため核酸変異を含んでいてもよい。
【0047】
本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸は、使用する宿主（ｈｏｓｔ）において発現可能かつ逆転写酵素活性を有するタンパク質をコードするコドンで構成されたものであれば特に限定は無く、使用する宿主において発現可能にするためまたは発現量を増加させるためにコドンの最適化を行ってもよい。該コドン最適化は、本分野において通常使用されている方法によって行うことが好ましい。
【0048】
３．本発明の耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸を含む発現ベクター
本発明の発現ベクターは、本発明の変異体逆転写酵素変異体をコードする核酸、および該核酸と作動可能に連結された発現調節配列を含むことが好ましい。
本発明の発現ベクターは、本発明の変異体逆転写酵素変異体をコードする核酸、および該核酸と作動可能に連結された発現調節配列を含むことが好ましい。
【0049】
本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸を挿入する発現ベクターとしては、本分野において通常使用されている発現ベクターであれば、特に限定は無い。宿主細胞において自立複製が可能なベクターや宿主染色体に組み込まれ得るベクターを使用することができる。宿主に適合するベクターを使用すればよい。
【0050】
本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸を挿入する発現ベクターとして、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、使用する宿主に適したプラスミド、例えば大腸菌由来のプラスミド、バチルス属細菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドが当業者に周知であり、また、市販されているものも多い。本発明には、これら公知のプラスミドやその改変体を使用することができる。ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。さらに、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞を宿主とする異種タンパク質発現系も数多く構築されており、また、すでに市販もされている。本発明の逆転写酵素変異体の製造には、これら発現系を使用してもよい。
【0051】
本発明の発現ベクターに搭載するプロモーターは宿主に応じて選択することができ、例えば大腸菌ではｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターやそれらの改変体を使用することができるが、前記のものに限定されるものではない。さらに、ファージ由来のプロモーターとＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み合わせた発現系（例えばｐＥＴ発現系等）を利用してもよい。
【0052】
発現させたポリペプチドの精製を容易にするために、本発明の発現ベクターは、アフィニティタグをコードする核酸をさらに含んでいてもよい。アフィニティタグをコードする核酸は、本発明の逆転写酵素変異体と当該アフィニティタグの融合タンパク質が発現されるようにベクターに挿入される。本発明を何ら限定するものではないが、アフィニティタグとしては、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＢＰ）タグ、８残基のアミノ酸（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ）からなるＳｔｒｅｐ（ＩＩ）タグなどをコードする核酸が例示される。当該タグを付加する位置は、本発明のモロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）変異体をコードする核酸の５’末端および／または３’末端側のいずれでもよく、発現およびタグ機能の障害とならない位置に適宜付加すればよい。なお、該タグは、発現させたポリペプチドの精製段階において切断できるタグが好ましい。本発明を何ら限定するものではないが、かかる切断できるタグとしては、例えば、Ｆａｃｒｏｒ Ｘａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、エンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの融合ポリペプチド切断用プロテアーゼの認識配列をコードする核酸を含むタグが例示される。
【0053】
本発明の発現ベクターは、さらに１または複数の発現調節配列を含んでいてもよい。当該発現調節配列は特に限定されるものではないが、プロモーターならびにプロモーターの制御に関わる遺伝子、リボソーム結合配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列（転写ターミネーター）、エンハンサー等が挙げられる。さらに複製起点（ｏｒｉｇｉｎ）や形質転換体の選別に用いられるマーカー（薬剤耐性遺伝子、蛍光マーカー、発光マーカー）をコードする遺伝子、翻訳効率を高めるための塩基配列、等を挙げることができる。
【0054】
４．本発明の発現ベクターで形質転換された細胞
本発明の逆転写酵素変異体を発現するベクターで形質転換する細胞（宿主）としては、本分野において通常使用されている宿主であれば、特に限定は無い。例えば細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、糸状菌、昆虫細胞、真核細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む哺乳動物細胞等）が使用できる。
本発明の逆転写酵素変異体を発現するベクターで形質転換する細胞（宿主）としては、本分野において通常使用されている宿主であれば、特に限定は無い。例えば細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、糸状菌、昆虫細胞、真核細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む哺乳動物細胞等）が使用できる。
【0055】
原核細胞を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：大腸菌）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。異種タンパク質の製造に使用可能な大腸菌は当業者に周知であり、また、市販されているものも多い（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｔ１Ｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１等）。また、バチルス属細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ１１４、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ２０７－２１等、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌であるもＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ等が異種タンパク質の製造用宿主として知られている。これらの宿主細胞を適切な発現ベクターと組み合わせ、本発明の融合ポリペプチドの製造に使用することができる。特に限定はされないが、大腸菌株のＢＬ２１系統である、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｔ１ＲやＢＬ２１ＤＥ３が好適に使用できる。
【0056】
発現ベクターの宿主への導入方法としては、宿主に核酸を導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。ファージベクターやウイルスベクターは、これらベクターに応じた方法で宿主細胞への感染を実施し、本発明の融合ポリペプチドを発現する形質転換体を得ることができる。
【0057】
上記形質転換体を培養し、培養物から本発明の逆転写酵素変異体を取得することができる。培養条件は、使用する発現ベクター、宿主等に適した条件であれば特に限定はない。本発明を何ら限定するものではないが、例えば、ｐＥＴベクターにて大腸菌を形質転換した場合、形質転換体をＬＢ培地へ接種して３７℃にて振盪培養する。培養液のＯＤが０．２～０．８になった時点でＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導するために例えば１５～３０℃で２～５時間、好ましくは２５℃で４～５時間振盪培養する。その後、培養液を遠心分離し、得られた菌体を洗浄後、超音波破砕処理またはリゾチームによる溶菌処理によって本発明の変異体を含む破砕物を得ることができる。破砕物は夾雑物が多いため、本分野において使用されている精製方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、アフィニティクロマトカラム、透析等を適宜組み合わせるによって本発明の変異体の精製を行うことが望ましい。アフィニティタグが付加された変異体は、当該アフィニティタグの性質に応じたアフィニティ担体を使用して簡便に精製することが可能である。また、使用する宿主または発現ベクターの種類によっては、ＩＰＴＧに加え、Ｌ－アラビノースなど他に必要な誘導物質を適切なタイミングで添加してもよい。
【0058】
５．本発明の耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸の製造方法
本発明の核酸の製造方法は、例えば、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする核酸において、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換する工程を含む。立体構造を安定化させるアミノ酸については、上記１．で説明したとおりである。特に限定はされないが、上記スレオニンに対応するコドンの置換は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に対応するコドンへの置換が好適であり、グリシンまたはアスパラギン酸に対応するコドンへの置換がさらに好適である。
本発明の核酸の製造方法は、例えば、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする核酸において、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換する工程を含む。立体構造を安定化させるアミノ酸については、上記１．で説明したとおりである。特に限定はされないが、上記スレオニンに対応するコドンの置換は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に対応するコドンへの置換が好適であり、グリシンまたはアスパラギン酸に対応するコドンへの置換がさらに好適である。
【0059】
上記１．で説明したとおり、本発明の逆転写酵素変異体は、例えば、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置におけるスレオニンを立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸へ置換する変異を含むことを特徴としている。本発明において、上記５５位のアミノ酸置換を導入する逆転写酵素のアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列、または変異型アミノ酸配列、例えば耐熱性変異体のアミノ酸配列、のいずれであってもよい。したがって、本発明の核酸の製造方法において、上記のコドン置換を導入するＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする核酸は、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素をコードする核酸、または該酵素の変異体をコードする核酸のいずれであってもよい。
【0060】
例えば、ＭＭＬＶ由来の耐熱性逆転写酵素変異体に上記５５位のアミノ酸置換を導入する場合、該耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸上の、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素アミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンに対応するコドンを、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸のコドンに変換することにより、上記コドン変換前の耐熱性逆転写酵素の耐熱性よりも向上した耐熱性を有する逆転写酵素変異体をコードする核酸を製造することができる。
【0061】
例えば、上記のコドン置換を導入するＭＭＬＶ由来の耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸としては、下記（１）～（８）からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む逆転写酵素変異体をコードする核酸が挙げられる。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
【0062】
前記コドン変換は、公知の方法によって行えばよく、特に限定するものではないが、例えば、変異導入プライマーを用いた部位特異的変異導入など公知の手法による変異導入、または変異後の配列（もしくは配列の一部）を有する核酸の人工合成によって行うことができる。さらに、使用する宿主において発現可能にするためまたは発現量を増加させるためにコドンの最適化を行ってもよい。該コドン最適化は、本分野において通常使用されている方法によって行うことができる。
【0063】
さらに、本発明の核酸の製造方法では、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素をコードする核酸において、上記５５位のアミノ酸置換を導入するためのコドン置換に加えて、１以上の他のコドン置換を行ってもよい。他のコドン置換としては、例えば、耐熱性を付与するための変異を導入するためのコドン置換、耐熱性を向上させるためのアミノ酸置換を導入するためのコドン置換、逆転写酵素の特性を改善させるための変異を導入するためのコドン置換、ＲＮａｓｅＨ活性欠失変異を導入するためのコドン置換等が挙げられる。耐熱性を付与または向上するためのアミノ酸置換を導入するためのコドン置換としては、例えば、限定するものではないが、上記（１）～（８）に示されるアミノ酸置換を導入するためのコドン置換が挙げられる。さらに、宿主内でタンパク質生産を安定・向上させるためのコドン置換を組み合わせてもよい。
【0064】
本発明の核酸の製造方法には、前記２．で説明した核酸が適用できる。
【0065】
６．本発明の逆転写酵素変異体の製造方法および逆転写酵素の耐熱性の向上方法
本発明の逆転写酵素変異体の製造方法は、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする。また、本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法は、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする。立体構造を安定化させるアミノ酸については、上記１．で説明したとおりである。好ましくは、上記５５位のアミノ酸置換は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸への置換であり、さらに好ましくは、グリシンまたはアスパラギン酸への置換である。
本発明の逆転写酵素変異体の製造方法は、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする。また、本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法は、ＭＭＬＶ由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の５５位に相当する位置にあるスレオニンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする。立体構造を安定化させるアミノ酸については、上記１．で説明したとおりである。好ましくは、上記５５位のアミノ酸置換は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸への置換であり、さらに好ましくは、グリシンまたはアスパラギン酸への置換である。
【0066】
本発明の逆転写酵素変異体の製造方法および本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法は、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列に上記５５位のアミノ酸置換を導入することを含む。該ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列、または変異型配列のいずれであってもよい。該変異型配列として、ＭＭＬＶ由来の耐熱性逆転写酵素変異体のアミノ酸配列を用いる場合、本発明の方法にしたがって上記５５位のアミノ酸置換を導入することにより、該アミノ酸置換を導入する前の逆転写酵素の耐熱性よりも向上した耐熱性を有する逆転写酵素変異体を製造することができる。
【0067】
したがって、本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法によれば、ＭＭＬＶ由来の耐熱性逆転写酵素変異体のアミノ酸配列に上記５５位のアミノ酸置換を導入することにより、該アミノ酸置換を導入する前の逆転写酵素の耐熱性を向上させることができる。この技術により、既存の耐熱性逆転写酵素の耐熱性をさらに向上させることができる。当該技術は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の製造方法として有用である。
【0068】
上記５５位のアミノ酸置換を導入するＭＭＬＶ由来の耐熱性逆転写酵素変異体としては、例えば、限定するものではないが、下記（１）～（８）からなる群から選択さる１以上のアミノ酸置換を含む逆転写酵素変異体が挙げられる。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
（１）Ａ５４Ｐ、
（２）Ｔ２８７Ｋ、
（３）Ｑ２９１Ｋ、
（４）Ｔ３０６Ｋ、
（５）Ｄ５２４Ａ、
（６）Ｄ５２４Ｎ、
（７）Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６ＫおよびＦ３０９Ｎ、ならびに
（８）Ｄ２０９Ｐ、およびＩ２１２Ａ。
【0069】
さらに、本発明の逆転写酵素変異体の製造方法、ならびに本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法においては、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列において、上記５５位のアミノ酸置換に加えて、１以上の他のアミノ酸位置の変異を導入してもよい。他のアミノ酸位置の変異としては、例えば、耐熱性を付与するための変異、耐熱性を向上させるための変異、逆転写酵素の特性を改善させるための変異、およびＲＮａｓｅＨ活性欠失変異等が挙げられる。耐熱性を付与または向上するための変異としては、例えば、限定するものではないが、上記（１）～（８）に示されるアミノ酸置換が挙げられる。
【0070】
上記アミノ酸置換またはその他の変異の導入は、対応する核酸配列にＰＣＲ法を用いて変異導入する方法、人工遺伝子で全核酸を合成する方法などの既知の方法により行えばよい。例えば、上記５．で記載したように、本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸を製造し、適当な発現ベクターを用いて宿主細胞中で該逆転写酵素変異体を発現させ、該細胞培養物から該逆転写酵素変異体を取得してもよい。
【0071】
本発明の逆転写酵素変異体の製造方法および本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法によれば、例えば４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、または６０℃以上の温度条件下でも使用できる逆転写酵素を得ることができる。また、本発明の逆転写酵素変異体の製造方法および本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法は、逆転写酵素の特性、例えば、ＲＮＡ結合活性、ｃＤＮＡ伸長活性、ｃＤＮＡ伸長速度に対して影響を与えることなく、耐熱性を向上させることができる。
【0072】
７．本発明の逆転写酵素変異体を用いたｃＤＮＡの合成方法
本発明の逆転写酵素変異体は、ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成する工程を包含する、ｃＤＮＡの合成に使用することができる。本発明の逆転写酵素変異体は、耐熱性を有するので、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素より高温で逆転写反応を行うことができる。さらに、本発明の逆転写酵素変異体は、従来の耐熱性逆転写酵素よりも向上した耐熱性を有するので、従来の耐熱性逆転写酵素と比較してさらに高温条件下で逆転写反応を行うことができる。従って、これまで既存の耐熱性逆転写酵素を用いて４０℃、４５℃、５０℃、または５５℃でｃＤＮＡを合成していたのに対し、本発明の逆転写酵素変異体を用いれば、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、または７０℃以上という、これまでに想定されていなかった高温条件下にて逆転写反応を行うことが可能である。これにより、今までの温度条件ではなし得なかったｍＲＮＡの高次構造破壊を達成することができ、その結果としてｍＲＮＡ全長のｃＤＮＡ合成が容易となる。
本発明の逆転写酵素変異体は、ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成する工程を包含する、ｃＤＮＡの合成に使用することができる。本発明の逆転写酵素変異体は、耐熱性を有するので、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素より高温で逆転写反応を行うことができる。さらに、本発明の逆転写酵素変異体は、従来の耐熱性逆転写酵素よりも向上した耐熱性を有するので、従来の耐熱性逆転写酵素と比較してさらに高温条件下で逆転写反応を行うことができる。従って、これまで既存の耐熱性逆転写酵素を用いて４０℃、４５℃、５０℃、または５５℃でｃＤＮＡを合成していたのに対し、本発明の逆転写酵素変異体を用いれば、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、または７０℃以上という、これまでに想定されていなかった高温条件下にて逆転写反応を行うことが可能である。これにより、今までの温度条件ではなし得なかったｍＲＮＡの高次構造破壊を達成することができ、その結果としてｍＲＮＡ全長のｃＤＮＡ合成が容易となる。
【0073】
前記ｃＤＮＡの合成方法を実施する際には、通常、二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、ｐＨ維持のための緩衝成分（緩衝液）、還元剤などを含む反応液が調製される。前記二価金属塩を構成する二価金属イオンとしては、特に限定するものではないが、マンガンイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオンが例示される。逆転写酵素に適する二価金属イオンとその濃度は、当該分野で知られている。二価金属イオンは塩化物、硫酸塩、または酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物中の二価金属イオンの濃度としては、例えば０．５～２０ｍＭが好ましく例示される。前記ｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、もしくはそれらの誘導体の少なくとも１種が使用される。好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの４種類の混合物が使用される。
【0074】
ｐＨ維持のための緩衝成分としては、当該分野で知られている弱酸とその共役塩基や弱塩基とその共役酸を混合したものが使用できる。特に限定するものではないが、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、へぺス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、酢酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液が例示される。例えば、逆転写酵素に適する緩衝成分とその濃度は、当該分野で知られている。還元剤としては、特に限定するものではないが、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌが例示される。逆転写酵素に適する還元剤とその濃度は、当該分野で知られている。
【0075】
プライマーを使用してｃＤＮＡ合成を実施する場合、例えばｒａｎｄｏｍ ６ ｍｅｒｓ、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒ、および遺伝子特異的プライマーがプライマーとして使用できる。当該プライマーの鎖長は、ハイブリダイゼーションの特異性の観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。なお、非特異的なｃＤＮＡ合成を目的としたランダムプライマーとしては鎖長６～８ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの混合物を使用してもよい。前記オリゴヌクレオチドは、例えば公知の方法により化学的に合成することができる。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。
【0076】
上記方法にて得られたｃＤＮＡを鋳型とし、さらにｃＤＮＡを増幅してもよい。ＤＮＡ増幅反応としてはＰＣＲ法や種々の等温増幅法が例示される。核酸増幅法は上記ｃＤＮＡの合成方法にて得られたｃＤＮＡを鋳型とした相補鎖合成反応により実施されることから、例えば、上記反応液にさらにＤＮＡポリメラーゼを添加して実施することが可能である。当該ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【0077】
このように本発明の逆転写酵素変異体は、優れた耐熱性を有していることから、複雑な二次構造を形成するＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によるｃＤＮＡ合成やＲＴ－ＰＣＲなどに有用である。
【0078】
８．本発明の組成物またはキット
本発明の組成物は、逆転写反応用組成物である。本発明の組成物は、本発明の逆転写酵素変異体に加え、逆転写反応に必要な成分、例えば、二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、緩衝成分、還元剤、滅菌水等を含有する。本発明の組成物は、プライマーをさらに含んでいてもよい。本発明のキットは、逆転写反応用キットである。本発明のキットとしては、本発明の逆転写酵素変異体、二価金属塩、ｄＮＴＰ、緩衝成分、還元剤などを含有し、使用時にこれらを混合して逆転写反応液を調製するためのキット、前記の本発明の組成物を含有し、使用時に鋳型ＤＮＡと水（滅菌水等）を添加するのみで使用可能なキット、さらに前記の本発明の組成物が乾燥状態で含有されたキット、等が例示される。特定のＲＮＡの検出を目的とした、標的ＲＮＡに特異的なプライマーや陽性コントロール用のＲＮＡを含有するキットも本発明に包含される。なお、上記二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、緩衝成分、および還元剤は、上記７．で説明したとおりである。
本発明の組成物は、逆転写反応用組成物である。本発明の組成物は、本発明の逆転写酵素変異体に加え、逆転写反応に必要な成分、例えば、二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、緩衝成分、還元剤、滅菌水等を含有する。本発明の組成物は、プライマーをさらに含んでいてもよい。本発明のキットは、逆転写反応用キットである。本発明のキットとしては、本発明の逆転写酵素変異体、二価金属塩、ｄＮＴＰ、緩衝成分、還元剤などを含有し、使用時にこれらを混合して逆転写反応液を調製するためのキット、前記の本発明の組成物を含有し、使用時に鋳型ＤＮＡと水（滅菌水等）を添加するのみで使用可能なキット、さらに前記の本発明の組成物が乾燥状態で含有されたキット、等が例示される。特定のＲＮＡの検出を目的とした、標的ＲＮＡに特異的なプライマーや陽性コントロール用のＲＮＡを含有するキットも本発明に包含される。なお、上記二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、緩衝成分、および還元剤は、上記７．で説明したとおりである。
【0079】
さらに本発明のキットは、二本鎖核酸合成に必要な成分、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等、ならびに増幅された二本鎖核酸の検出に必要な成分、例えば、インターカレーターや蛍光標識プローブ等を含有していてもよい。インターカレーターとしてはＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉやその他の核酸結合性色素が、蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｃｙｃｌｅａｖｅ（登録商標）プローブあるいはモレキュラービーコンプローブ等が、それぞれ挙げられる。該キットは、二本鎖核酸合成用のプライマーセットをさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【0080】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0081】
実験方法１
（１）逆転写酵素変異体の調製Ａ
Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の野生型逆転写酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ． ＡＦ０３３８１１．１に開示されている。本明細書では、その塩基配列をもとに特定の部位に変異を導入した人工遺伝子を常法により調製した。得られた人工遺伝子は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオＵＳＡ社製）を用いて、プラスミドｐＥＴ６ｘＨＮ－Ｃ（タカラバイオＵＳＡ社製）に導入した。得られたプラスミドは、Ｃ末端側にヒスチジンタグが付加された逆転写酵素変異体をコードする塩基配列を有している。
（１）逆転写酵素変異体の調製Ａ
Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の野生型逆転写酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ． ＡＦ０３３８１１．１に開示されている。本明細書では、その塩基配列をもとに特定の部位に変異を導入した人工遺伝子を常法により調製した。得られた人工遺伝子は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオＵＳＡ社製）を用いて、プラスミドｐＥＴ６ｘＨＮ－Ｃ（タカラバイオＵＳＡ社製）に導入した。得られたプラスミドは、Ｃ末端側にヒスチジンタグが付加された逆転写酵素変異体をコードする塩基配列を有している。
【0082】
次に、当該プラスミドで大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３株（タカラバイオ社製）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含む１．５％アガロースＬＢプレート上で３７℃で終夜培養を行った。このプレートから３つのシングルコロニーを選択して１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（以下ＬＢ－ＡＰ培地と称する）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養を行った。さらに前記培養液３００μｌをＬＢ－ＡＰ培地６ｍｌに接種し、３７℃で終夜振とう培養した。ＯＤ６００値が０．６になった時に、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えてさらに２５℃で４時間誘導培養を行った。その後ＯＤ６００値が４になった時に菌体を採取した。
【0083】
上記で得られた菌体を４００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール及び０．１５％トライトンＸ－１００を含む溶液（以下、Ｂｕｆｆｅｒ Ｓと称する）に懸濁し、４℃で超音波破砕装置（Ｓｏｎｉｃ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を使用した３０秒間の超音波処理を３回繰り返す操作を実施した。この操作により懸濁液は透明となった。超音波破砕後の懸濁液を４℃で１１０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。こうして得た粗抽出液をＮｉ樹脂精製に供した。
【0084】
Ｎｉ樹脂精製は、以下のようにして行った。即ち、５０μｌのＮｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を１．５ｍｌのチューブに入れ、２５０μｌの滅菌蒸留水で２回洗浄したのちＢｕｆｆｅｒ Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール及び５ｍＭ イミダゾール）２５０μｌで２回平衡化した。平衡化したＮｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅを粗抽出液４００μｌに懸濁し、３０分間静置させた。その後、４℃で１２０００回転１０分間遠心した。上清を除去した後のＮｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅを１００μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａで３回洗浄した。その後、１００μｌのＢｕｆｆｅｒ Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール及び３００ｍＭ イミダゾール）でＮｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅから吸着物を溶出させた。得られた溶出液を逆転写酵素変異体溶液として、以下の試験に使用した。
【0085】
（２）逆転写酵素変異体の耐熱性評価試験Ａ
上記（１）で得られた逆転写酵素変異体について、以下の方法で耐熱性を試験した。即ち、当該逆転写酵素変異体溶液について、最終濃度が０．２５％のウシ血清アルブミン（宝生物工程社製）を含む希釈Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．３、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＮＰ－４０及び１０％グリセロール）で２倍希釈した。当該希釈液を未加熱処理、あるいは４４℃又は５０℃で１５分間の加熱処理に供した。その後、未加熱処理、あるいは熱処理後の希釈液を前記希釈Ｂｕｆｆｅｒでさらに５倍希釈したのち、逆転写酵素活性を測定した。
上記（１）で得られた逆転写酵素変異体について、以下の方法で耐熱性を試験した。即ち、当該逆転写酵素変異体溶液について、最終濃度が０．２５％のウシ血清アルブミン（宝生物工程社製）を含む希釈Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．３、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＮＰ－４０及び１０％グリセロール）で２倍希釈した。当該希釈液を未加熱処理、あるいは４４℃又は５０℃で１５分間の加熱処理に供した。その後、未加熱処理、あるいは熱処理後の希釈液を前記希釈Ｂｕｆｆｅｒでさらに５倍希釈したのち、逆転写酵素活性を測定した。
【0086】
測定は以下のようにして行った。即ち、０．０１μｇ／μｌ濃度のポリ（リボアデニンヌクレオチド）、０．１ｎｇ／μｌ濃度のオリゴ（ｄＴ）１２－１８、８５ｍＭ 塩化カリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．３、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＮＰ－４０を含む反応液３５μｌに上記未加熱処理、あるいは熱処理後の希釈液５μｌを添加し、３７℃で５分間加温した。次に、反応液に２．５ｍＭ ｄＴＴＰを１０μｌ添加し、３７℃ １０分間反応させた。反応停止は、１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液５μｌを添加して行った。反応停止後の溶液から５μｌを９６穴プレートに分取した。このプレートのそれぞれのウェルに１×ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（サーモサイエンティフィック社製）を１５０μｌずつ分注し、プレートミキサー（タイテック社製）を用いて混合させた。その後、プレートをプレート遠心機（アレグラ社製）を用いて１０００ｒｐｍで１分間の条件で遠心した。遠心後、プレートをＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ｐｒｏ（テカン社製）にセットし、励起波長４８５ｎｍ、検出波長５２０ｎｍの条件で各ウェルの蛍光量を測定することで逆転写酵素活性測定を行った。
【0087】
実験方法２
（１）逆転写酵素変異体の調製Ｂ
菌体処理方法を超音波処理からリゾチームによる溶菌処理へ変更した点を除き、実験方法１（１）と同じ調製方法で、逆転写酵素変異体を調製した。
（１）逆転写酵素変異体の調製Ｂ
菌体処理方法を超音波処理からリゾチームによる溶菌処理へ変更した点を除き、実験方法１（１）と同じ調製方法で、逆転写酵素変異体を調製した。
【0088】
（２）逆転写酵素変異体の耐熱性評価試験Ｂ
上記（１）で得られた逆転写酵素変異体について、耐熱性を試験した。なお、加熱処理温度を５５℃、６０℃、６５℃、および７０℃へ変更した点を除き、実験方法１（２）と同じ試験方法である。
上記（１）で得られた逆転写酵素変異体について、耐熱性を試験した。なお、加熱処理温度を５５℃、６０℃、６５℃、および７０℃へ変更した点を除き、実験方法１（２）と同じ試験方法である。
【0089】
実施例１：逆転写酵素変異体の調製１
（１）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１～Ｏ３およびＰ１２、Ｐ１３の調製（Ｔ５５Ｇ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５５Ｓ、Ｔ５５Ｄ、Ｔ５５Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位にスレオニンからグリシンへの置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１と命名した。また、５５位のスレオニンをアラニンに置き換えた逆転写酵素変異体、５５位のスレオニンをセリンに置き換えた逆転写酵素変異体をそれぞれＯ２及びＯ３と命名した。さらに、５５位のスレオニンをアスパラギン酸に置き換えた逆転写酵素変異体、５５位のスレオニンをリシンに置き換えた逆転写酵素変異体をそれぞれＰ１２及びＰ１３と命名した。これらのタンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号２１～２６に示す。
（１）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１～Ｏ３およびＰ１２、Ｐ１３の調製（Ｔ５５Ｇ、Ｔ５５Ａ、Ｔ５５Ｓ、Ｔ５５Ｄ、Ｔ５５Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位にスレオニンからグリシンへの置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１と命名した。また、５５位のスレオニンをアラニンに置き換えた逆転写酵素変異体、５５位のスレオニンをセリンに置き換えた逆転写酵素変異体をそれぞれＯ２及びＯ３と命名した。さらに、５５位のスレオニンをアスパラギン酸に置き換えた逆転写酵素変異体、５５位のスレオニンをリシンに置き換えた逆転写酵素変異体をそれぞれＰ１２及びＰ１３と命名した。これらのタンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号２１～２６に示す。
【0090】
（２）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシンに置き換え、同時に５４位のアラニンをプロリンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位と５５位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４及び１４に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシンに置き換え、同時に５４位のアラニンをプロリンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位と５５位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４及び１４に示す。
【0091】
（３）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｄ１の調製（Ｔ２８７Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＤ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号２７および３３に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＤ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号２７および３３に示す。
【0092】
（４）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１＋Ｄ１の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ｔ２８７Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｄ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５および１５に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｄ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５および１５に示す。
【0093】
（５）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３＋Ｄ１の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ＋Ｔ２８７Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン、５４位のアラニンをプロリン及び２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、５４位及び２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｄ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３９および４５に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン、５４位のアラニンをプロリン及び２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、５４位及び２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｄ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３９および４５に示す。
【0094】
（６）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体ＬＴの調製（Ｈ２０４Ｒ＋Ｍ２８９Ｌ＋Ｔ３０６Ｋ＋Ｆ３０９Ｎ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２０４位、２８９位、３０６位及び３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３２および３８に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２０４位、２８９位、３０６位及び３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３２および３８に示す。
【0095】
（７）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１＋ＬＴの調製（Ｔ５５Ｇ＋Ｈ２０４Ｒ＋Ｍ２８９Ｌ＋Ｔ３０６Ｋ＋Ｆ３０９Ｎ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０４位、２８９位、３０６位及び３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋ＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号１０および２０に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０４位、２８９位、３０６位及び３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋ＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号１０および２０に示す。
【0096】
（８）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３＋ＬＴの調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ＋Ｈ２０４Ｒ＋Ｍ２８９Ｌ＋Ｔ３０６Ｋ＋Ｆ３０９Ｎ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位、２０４位、２８９位、３０６位及び３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋ＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４４および５０に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位、２０４位、２８９位、３０６位及び３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋ＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４４および５０に示す。
【0097】
（９）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｋ１の調製（Ｑ２９１Ｋ）
ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２９１位に変異を有する逆転写酵素変異体をＫ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列表の配列番号２８および３４に示す。
ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２９１位に変異を有する逆転写酵素変異体をＫ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列表の配列番号２８および３４に示す。
【0098】
（１０）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１＋Ｋ１の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ｑ２９１Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び２９１位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６および１６に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び２９１位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６および１６に示す。
【0099】
（１１）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３＋Ｋ１の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ＋Ｑ２９１Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び２９１位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４０および４６に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び２９１位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４０および４６に示す。
【0100】
（１２）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｋ２の調製（Ｄ５２４Ｎ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＫ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３１および３７に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＫ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３１および３７に示す。
【0101】
（１３）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１＋Ｋ２の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ｄ５２４Ｎ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号９および１９に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号９および１９に示す。
【0102】
（１４）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３＋Ｋ２の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ＋Ｄ５２４Ｎ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４３および４９に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４３および４９に示す。
【0103】
（１５）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｋ３の調製（Ｄ５２４Ａ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＫ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３０および３６に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＫ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号３０および３６に示す。
【0104】
（１６）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１＋Ｋ３の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ｄ５２４Ａ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号８および１８に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号８および１８に示す。
【0105】
（１７）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３＋Ｋ３の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ＋Ｄ５２４Ａ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４２および４８に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４２および４８に示す。
【0106】
（１８）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｋ４の調製（Ｔ３０６Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＫ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号２９および３５に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＫ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号２９および３５に示す。
【0107】
（１９）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１＋Ｋ４の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ｔ３０６Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号７および１７に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン及び３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位及び３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｋ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号７および１７に示す。
【0108】
（２０）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３＋Ｋ４の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ＋Ｔ３０６Ｋ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４１および４７に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン及び３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位及び３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｋ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号４１および４７に示す。
【0109】
（２１）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ５の調製（Ｄ２０９Ｐ＋Ｉ２１２Ａ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２０９位のアスパラギン酸をプロリン及び２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２０９位及び２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５１および５３に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、２０９位のアスパラギン酸をプロリン及び２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該２０９位及び２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５１および５３に示す。
【0110】
（２２）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｃ３＋Ｃ５の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ａ５４Ｐ＋Ｄ２０９Ｐ＋Ｉ２１２Ａ）
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン、２０９位のアスパラギン酸をプロリン及び２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位、２０９位及び２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｃ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５２および５４に示す。
実験方法１（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５４位のアラニンをプロリン、５５位のスレオニンをグリシン、２０９位のアスパラギン酸をプロリン及び２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５４位、５５位、２０９位及び２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＣ３＋Ｃ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５２および５４に示す。
【0111】
実施例２：逆転写酵素変異体の耐熱性評価試験１
実施例１（１）で調製した逆転写酵素変異体及び野生型逆転写酵素について、実験方法１（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表１に示す。
実施例１（１）で調製した逆転写酵素変異体及び野生型逆転写酵素について、実験方法１（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表１に示す。
【0112】
【表1】
【0113】
表１に示したように、特に変異体Ｏ１、Ｐ１２またはＣ３の変異体は、野生型のアミノ酸配列を有する逆転写酵素と比較して、４４℃および５０℃１５分の加熱処理のいずれでも残存活性が１．３～４．７倍と向上していることが確認できた。変異体Ｏ３及びＰ１３は、４４℃１５分の加熱処理で、野生型逆転写酵素よりも１．１～１．３倍高い残存活性を有した。
【0114】
実施例３：逆転写酵素変異体の耐熱性評価試験２
本発明のアミノ酸置換と耐熱性に関与していると報告されている既知の変異、あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。即ち、実施例１（３）と（５）、（６）と（８）、（９）と（１１）、（１２）と（１４）、（１５）と（１７）、（１８）と（２０）、（２１）と（２２）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法１（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表２に示す。
本発明のアミノ酸置換と耐熱性に関与していると報告されている既知の変異、あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。即ち、実施例１（３）と（５）、（６）と（８）、（９）と（１１）、（１２）と（１４）、（１５）と（１７）、（１８）と（２０）、（２１）と（２２）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法１（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表２に示す。
【0115】
【表2】
【0116】
表２に示したように、耐熱性に関与していると報告されている変異Ｄ１、ＬＴ、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４と、本発明のＣ３アミノ酸置換を組み合わせることにより、いずれの変異の組み合わせでも４４℃あるいは５０℃１５分の加熱処理における残存活性が１．３～１１．７倍と向上していることが確認できた。また、本願で初めて耐熱性に関与していることが確認できた変異Ｋ１と本発明のＣ３アミノ酸置換を組み合わせについて検討したところ、前記変異の組み合わせでも４４℃あるいは５０℃１５分の加熱処理における残存活性が１．４～１２．８倍と向上していることが確認できた。さらに変異Ｃ５とＣ３アミノ酸置換を組み合わせた場合も同様の結果が得られた。このことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
【0117】
実施例４：逆転写酵素変異体の耐熱性評価試験３
本発明のアミノ酸置換と耐熱性に関与していると報告されている既知の変異、あるいは本研究で初めて耐熱性との関与が確認できた変異との組み合わせについてさらに検討した。即ち、実施例１（９）と（１０）、（１５）と（１６）並びに（１８）と（１９）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法１（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。
本発明のアミノ酸置換と耐熱性に関与していると報告されている既知の変異、あるいは本研究で初めて耐熱性との関与が確認できた変異との組み合わせについてさらに検討した。即ち、実施例１（９）と（１０）、（１５）と（１６）並びに（１８）と（１９）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法１（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。
【0118】
その結果、耐熱性に関与していると報告されている変異Ｋ３、Ｋ４と、本発明のＯ１アミノ酸置換を組み合わせることにより、Ｋ３とＯ１＋Ｋ３の比較で４．２倍、Ｋ４とＯ１＋Ｋ４の比較で４．８倍といずれの変異の組み合わせでも５０℃１５分の加熱処理における残存活性が向上していることが確認できた。また、本願で初めて耐熱性に関与していることが確認できた変異Ｋ１と本発明のＯ１アミノ酸置換を組み合わせについても、Ｋ１とＯ１＋Ｋ１の比較で５０℃１５分の加熱処理における残存活性が４倍向上していることが確認できた。以上のことから、本発明のＯ１アミノ酸置換も、実施例３のＣ３アミノ酸置換と同様に、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。さらに本発明のＯ１アミノ酸置換は、Ｄ１、ＬＴ、Ｋ２並びにＣ５変異との組み合わせでも耐熱性をさらに向上させることができる。
【0119】
実施例５：逆転写酵素変異体の調製２
（１）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋Ｄ１の調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｔ２８７Ｋ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｄ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５５および６３に示す。
（１）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋Ｄ１の調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｔ２８７Ｋ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および２８７位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および２８７位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｄ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５５および６３に示す。
【0120】
（２）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋ＬＴの調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｈ２０４Ｒ＋Ｍ２８９Ｌ＋Ｔ３０６Ｋ＋Ｆ３０９Ｎ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０４位、２８９位、３０６位、および３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋ＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５６および６４に示す。
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸、２０４位のヒスチジンをアルギニン、２８９位のメチオニンをロイシン、３０６位のスレオニンをリシン、さらに３０９位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０４位、２８９位、３０６位、および３０９位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋ＬＴと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５６および６４に示す。
【0121】
（３）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋Ｋ１の調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｑ２９１Ｋ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および２９１位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５７および６５に示す。
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および２９１位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および２９１位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ１と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５７および６５に示す。
【0122】
（４）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋Ｋ２の調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｄ５２４Ｎ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５８および６６に示す。
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および５２４位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ２と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５８および６６に示す。
【0123】
（５）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋Ｋ３の調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｄ５２４Ａ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５９および６７に示す。
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および５２４位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ３と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５９および６７に示す。
【0124】
（６）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋Ｋ４の調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｔ３０６Ｋ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６０および６８に示す。
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸および３０６位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位および３０６位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｋ４と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６０および６８に示す。
【0125】
（７）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｏ１＋Ｃ５の調製（Ｔ５５Ｇ＋Ｄ２０９Ｐ＋Ｉ２１２Ａ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン、２０９位のアスパラギン酸をプロリンおよび２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０９位および２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｃ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６１および６９に示す。
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをグリシン、２０９位のアスパラギン酸をプロリンおよび２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０９位および２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＯ１＋Ｃ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６１および６９に示す。
【0126】
（８）ＭＭＬＶ逆転写酵素変異体Ｐ１２＋Ｃ５の調製（Ｔ５５Ｄ＋Ｄ２０９Ｐ＋Ｉ２１２Ａ）
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸、２０９位のアスパラギン酸をプロリンおよび２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０９位および２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｃ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６２および７０に示す。
実験方法２（１）にしたがって、ＭＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、５５位のスレオニンをアスパラギン酸、２０９位のアスパラギン酸をプロリンおよび２１２位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法２（１）にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該５５位、２０９位および２１２位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をＰ１２＋Ｃ５と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号６２および７０に示す。
【0127】
実施例６：逆転写酵素変異体の耐熱性評価試験４
本発明のアミノ酸置換と、耐熱性に関与していると報告されている既知の変異あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。すなわち、実施例１（３）、実施例１（４）と実施例５（１）；実施例１（６）、実施例１（７）と実施例５（２）；実施例１（９）、実施例１（１０）と実施例５（３）；実施例１（１２）、実施例１（１３）と実施例５（４）；実施例１（１５）、実施例１（１６）と実施例５（５）；実施例１（１８）、実施例１（１９）と実施例５（６）；実施例１（２１）と実施例５（７）、実施例１（２２）と実施例５（８）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法２（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表３および表４に示す。
本発明のアミノ酸置換と、耐熱性に関与していると報告されている既知の変異あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。すなわち、実施例１（３）、実施例１（４）と実施例５（１）；実施例１（６）、実施例１（７）と実施例５（２）；実施例１（９）、実施例１（１０）と実施例５（３）；実施例１（１２）、実施例１（１３）と実施例５（４）；実施例１（１５）、実施例１（１６）と実施例５（５）；実施例１（１８）、実施例１（１９）と実施例５（６）；実施例１（２１）と実施例５（７）、実施例１（２２）と実施例５（８）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法２（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表３および表４に示す。
【0128】
【表3】
【0129】
表３に示したように、耐熱性に関与していると報告されている変異Ｄ１、ＬＴ、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４と、本発明のＯ１、Ｐ１２アミノ酸置換を組み合わせることにより、いずれの変異の組み合わせでも５５℃１５分の加熱処理における残存活性が１．３～７．１倍と大幅に向上していることが確認できた。
また、本願で初めて耐熱性に関与していることが確認できた変異Ｋ１と本発明のＯ１、Ｐ１２アミノ酸置換を組み合わせについて検討したところ、前記変異の組み合わせでも５５℃１５分の加熱処理における残存活性が３．０～８．４倍と大幅に向上していることが確認できた。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
また、本願で初めて耐熱性に関与していることが確認できた変異Ｋ１と本発明のＯ１、Ｐ１２アミノ酸置換を組み合わせについて検討したところ、前記変異の組み合わせでも５５℃１５分の加熱処理における残存活性が３．０～８．４倍と大幅に向上していることが確認できた。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
【0130】
【表4】
【0131】
表４に示したように、本願で初めて耐熱性に関与していることが確認できた変異Ｃ５と、本発明のＯ１、Ｐ１２アミノ酸置換を組み合わせることにより、いずれの変異の組み合わせでも５５℃１５分の加熱処理における残存活性が２．０～９．０倍と大幅に向上していることが確認できた。また、変異Ｃ５とＣ３アミノ酸置換を組み合わせた場合も同様の結果が得られた。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
【0132】
実施例７：逆転写酵素変異体の耐熱性評価試験５
本発明のアミノ酸置換と、耐熱性に関与していると報告されている既知の変異あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。すなわち、実施例１（７）と実施例５（２）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法２（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。
本発明のアミノ酸置換と、耐熱性に関与していると報告されている既知の変異あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。すなわち、実施例１（７）と実施例５（２）で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法２（２）にしたがって耐熱性評価試験を行った。
【0133】
その結果、耐熱性に関与していると報告されている変異ＬＴと、本発明のＯ１＋ＬＴの比較で、６０℃１５分加熱処理において６．７倍、６５℃１５分加熱処理において１．９倍、７０℃１５分加熱処理において１．９倍とさらに高温の加熱処理においても残存活性が向上していることが確認できた。また、ＬＴと、本発明のＰ１２＋ＬＴの比較で、６０℃１５分加熱処理において２．４倍、６５℃１５分加熱処理において１．９倍、７０℃１５分加熱処理において１．９倍とさらに高温の加熱処理においても残存活性が向上していることが確認できた。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0134】
本発明により耐熱性逆転写酵素変異体を提供することができ、当該逆転写酵素変異体を用いることにより、これまで逆転写酵素反応が困難であった強固な二次構造を有するＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成が可能になった。当該耐熱性逆転写酵素変異体は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0135】
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SEQ ID NO: 50: Reverse transcriptase mutant C3+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 51: Reverse transcriptase mutant C5(D209P+I212A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 52: Reverse transcriptase mutant C3+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 53: Reverse transcriptase mutant C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 54: Reverse transcriptase mutant C3+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 55: Reverse transcriptase mutant P12+D1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 56: Reverse transcriptase mutant P12+LT amino acid sequence
SEQ ID NO: 57: Reverse transcriptase mutant P12+K1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 58: Reverse transcriptase mutant P12+K2 amino acid sequence
SEQ ID NO: 59: Reverse transcriptase mutant P12+K3 amino acid sequence
SEQ ID NO: 60: Reverse transcriptase mutant P12+K4 amino acid sequence
SEQ ID NO: 61: Reverse transcriptase mutant O1+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 62: Reverse transcriptase mutant P12+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 63: Reverse transcriptase mutant P12+D1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 64: Reverse transcriptase mutant P12+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 65: Reverse transcriptase mutant P12+K1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 66: Reverse transcriptase mutant P12+K2 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 67: Reverse transcriptase mutant P12+K3 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 68: Reverse transcriptase mutant P12+K4 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 69: Reverse transcriptase mutant O1+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 70: Reverse transcriptase mutant P12+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 2: Reverse transcriptase mutant O1(T55G) amino acid sequence
SEQ ID NO: 3: Reverse transcriptase mutant P12(T55D) amino acid sequence
SEQ ID NO: 4: Reverse transcriptase mutant C3(T55G+A54P) amino acid sequence
SEQ ID NO: 5: Reverse transcriptase mutant O1+D1(T55G+T287K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 6: Reverse transcriptase mutant O1+K1(T55G+Q291K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 7: Reverse transcriptase mutant O1+K4 (T55G+T306K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 8: Reverse transcriptase mutant O1+K3 (T55G+D524A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 9: Reverse transcriptase mutant O1+K2 (T55G+D524N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 10: Reverse transcriptase mutant O1+LT (T55G+H204R +M289L+T306K+F309N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 11: Molony Murine Leukemia Virus reverse transcriptase nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 12: Reverse transcriptase mutant O1(T55G) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 13: Reverse transcriptase mutant P12(T55D) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 14: Reverse transcriptase mutant C3(T55G+A54P) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 15: Reverse transcriptase mutant O1+D1(T55G+T287K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 16: Reverse transcriptase mutant O1+K1(T55G+Q291K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 17: Reverse transcriptase mutant O1+K4 (T55G+T306K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 18: Reverse transcriptase mutant O1+K3 (T55G+D524A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 19: Reverse transcriptase mutant O1+K2 (T55G+D524N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 20: Reverse transcriptase mutant O1+LT (T55G+H204R+M289L+T306K+F309N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 21: Reverse transcriptase mutant O2(T55A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 22: Reverse transcriptase mutant O3(T55S) amino acid sequence
SEQ ID NO: 23: Reverse transcriptase mutant P13(T55K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 24: Reverse transcriptase mutant O2(T55A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 25: Reverse transcriptase mutant O3(T55S) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 26: Reverse transcriptase mutant P13(T55K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 27: Reverse transcriptase mutant D1(T287K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 28: Reverse transcriptase mutant K1(Q291K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 29: Reverse transcriptase mutant K4(T306K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 30: Reverse transcriptase mutant K3(D524A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 31: Reverse transcriptase mutant K2(D524N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 32: Reverse transcriptase mutant LT(H204R+M289L+T306K+F309N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 33: Reverse transcriptase mutant D1(T287K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 34: Reverse transcriptase mutant K1(Q291K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 35: Reverse transcriptase mutant K4(T306K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 36: Reverse transcriptase mutant K3(D524A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 37: Reverse transcriptase mutant K2(D524N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 38: Reverse transcriptase mutant LT(H204R+M289L+T306K+F309N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 39: Reverse transcriptase mutant C3+D1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 40: Reverse transcriptase mutant C3+K1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 41: Reverse transcriptase mutant C3+K4 amino acid sequence
SEQ ID NO: 42: Reverse transcriptase mutant C3+K3 amino acid sequence
SEQ ID NO: 43: Reverse transcriptase mutant C3+K2 amino acid sequence
SEQ ID NO: 44: Reverse transcriptase mutant C3+LT amino acid sequence
SEQ ID NO: 45: Reverse transcriptase mutant C3+D1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 46: Reverse transcriptase mutant C3+K1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 47: Reverse transcriptase mutant C3+K4 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 48: Reverse transcriptase mutant C3+K3 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 49: Reverse transcriptase mutant C3+K2 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 50: Reverse transcriptase mutant C3+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 51: Reverse transcriptase mutant C5(D209P+I212A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 52: Reverse transcriptase mutant C3+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 53: Reverse transcriptase mutant C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 54: Reverse transcriptase mutant C3+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 55: Reverse transcriptase mutant P12+D1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 56: Reverse transcriptase mutant P12+LT amino acid sequence
SEQ ID NO: 57: Reverse transcriptase mutant P12+K1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 58: Reverse transcriptase mutant P12+K2 amino acid sequence
SEQ ID NO: 59: Reverse transcriptase mutant P12+K3 amino acid sequence
SEQ ID NO: 60: Reverse transcriptase mutant P12+K4 amino acid sequence
SEQ ID NO: 61: Reverse transcriptase mutant O1+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 62: Reverse transcriptase mutant P12+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 63: Reverse transcriptase mutant P12+D1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 64: Reverse transcriptase mutant P12+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 65: Reverse transcriptase mutant P12+K1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 66: Reverse transcriptase mutant P12+K2 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 67: Reverse transcriptase mutant P12+K3 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 68: Reverse transcriptase mutant P12+K4 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 69: Reverse transcriptase mutant O1+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 70: Reverse transcriptase mutant P12+C5 nucleic acid sequence
【配列表】