特許 7061234 組換え宿主細胞内での炭素源調節タンパク質産生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-19

(45)【発行日】2022-04-27

(54)【発明の名称】組換え宿主細胞内での炭素源調節タンパク質産生

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20220420BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220420BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220420BHJP

   C12N 1/16 20060101ALI20220420BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20220420BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220420BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/16 G

C12N1/14 A

C12P21/02 C

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2021539943

(86)(22)【出願日】2020-01-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-19

(86)【国際出願番号】 EP2020050517

(87)【国際公開番号】W WO2020144313

(87)【国際公開日】2020-07-16

【審査請求日】2021-07-08

(31)【優先権主張番号】19151376.1

(32)【優先日】2019-01-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】391003864

【氏名又は名称】ロンザ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＬＯＮＺＡ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100187540

【弁理士】

【氏名又は名称】國枝 由紀子

(72)【発明者】

【氏名】ガッサー，ブリギッテ

(72)【発明者】

【氏名】レブネッガー，コリンナ

(72)【発明者】

【氏名】フローレス・ビレガス，ミレル・シトラリ

(72)【発明者】

【氏名】マタノビッチ，ディートハルト

【審査官】馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５１１１４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１１１４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３００１６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／３１

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／１６

Ｃ１２Ｎ １／１４

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質または配列番号１に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するそのホモログをコードする内在性遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、
前記宿主細胞が、１つ以上の遺伝子修飾によって、前記１つ以上の遺伝子修飾を行う前の前記宿主細胞と比較して前記ＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように操作され、ここで前記１つ以上の遺伝子修飾が（ｉ）前記内在性遺伝子もしくはその一部または（ｉｉ）前記内在性遺伝子の発現制御配列、好ましくは、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列もしくは翻訳開始及び停止配列、エンハンサー、ならびにアクチベーター配列からなる群より選択される発現制御配列の破壊、置換、欠失、もしくはノックアウトを含み、
前記宿主細胞が、発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）の制御下で、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む異種性発現カセットを含み、前記ＥＣＰが、非メタノール炭素源によって抑制可能であり、かつ
（ｉ）配列番号１０～１６のいずれか１つを含む、または
（ｉｉ）配列番号４１～４５のいずれか１つを含む、または
（ｉｉｉ）配列番号１０～１６もしくは配列番号４１～４５のいずれか１つの３’末端を含む少なくとも３００ｎｔの領域に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する、
前記組換え宿主細胞。

【請求項2】

前記内在性遺伝子が前記ＦＬＯ８タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項3】

前記ＦＬＯ８タンパク質または前記ホモログをコードする前記内在性遺伝子が、前記１つ以上の遺伝子修飾によってノックアウトされる、請求項１または２に記載の宿主細胞。

【請求項4】

前記ＥＣＰが、成長制限量の非メタノール炭素源の存在下で、好ましくはメタノールの非存在下で誘導可能であり、前記成長制限量よりも高い過剰量の非メタノール炭素源の存在下で抑制可能である、請求項１～３のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項5】

前記ＥＣＰが、配列番号１０または配列番号１１を含むまたはそれからなる、請求項４に記載の宿主細胞。

【請求項6】

前記発現カセットが、前記ＧＯＩによってコードされる目的タンパク質（ＰＯＩ）の分泌を可能にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、前記シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ＧＯＩの５’末端に隣接して融合している、請求項１～５のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項7】

前記ＧＯＩが、抗原結合タンパク質、治療タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、成長因子、ホルモン、サイトカイン、プロセス酵素、及び代謝酵素からなる群より選択されるペプチドまたはタンパク質である目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする、請求項１～６のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、
ａ）Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍからなる群より選択される属の酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、もしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、または
ｂ）糸状菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉもしくはｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの細胞
である、宿主細胞。

【請求項9】

非メタノール炭素源によって抑制可能なプロモーターの制御下で、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的遺伝子（ＧＯＩ）を発現する宿主細胞によって産生される前記ＰＯＩの収率を増加させる方法であって、
配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質または配列番号１に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するそのホモログをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、前記ＰＯＩの収率を増加させ
ここで前記ＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子の発現を低下させることが（ｉ）前記ＦＬＯ８タンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子もしくはその一部または（ｉｉ）前記ＦＬＯ８タンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子の発現制御配列、好ましくは、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列もしくは翻訳開始及び停止配列、エンハンサー、ならびにアクチベーター配列からなる群より選択される発現制御配列の破壊、置換、欠失、もしくはノックアウトを含む、
前記方法。

【請求項10】

目的遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、前記ＧＯＩを産生する条件下で請求項１～８のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することにより、前記ＰＯＩを産生する方法。

【請求項11】

請求項９または１０に記載の方法であって、以下のステップ：
ａ）成長条件下で前記宿主細胞を培養することと、
ｂ）最大１ｇ／Ｌの第２の非メタノール炭素源の存在下、成長制限条件下で前記宿主細胞を培養し、前記ＧＯＩを発現させて前記ＰＯＩを産生させることとを含み、
好ましくは、前記ａ）培養ステップがバッチフェーズで行われ、前記ｂ）培養ステップが流加バッチまたは連続培養フェーズで実施される、方法。

【請求項12】

前記第１または第２の炭素源が、糖類、ポリオール、アルコール、または前述のいずれか１つ以上の混合物から選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

宿主細胞内で目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、以下のステップ：
ａ）配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質または配列番号１に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するそのホモログをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように宿主細胞を遺伝子操作し、
前記宿主細胞に、目的遺伝子（ＧＯＩ）に作用可能に結合している発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）の制御下で、前記ＰＯＩを発現する前記ＧＯＩを含む異種性発現カセットを導入することであって、前記ＥＣＰが、非メタノール炭素源によって抑制可能であり、かつ
（ｉ）配列番号１０～１６のいずれか１つを含む、または
（ｉｉ）配列番号４１～４５のいずれか１つを含む、または
（ｉｉｉ）配列番号１０～１６もしくは配列番号４１～４５のいずれか１つの３’末端を含む少なくとも３００ｎｔの領域に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する、導入することと、
ｂ）前記ＰＯＩを産生する条件下で前記宿主細胞を培養することと、
ｃ）任意選択で、前記細胞培養物から前記ＰＯＩを単離することと、
ｄ）任意選択で、前記ＰＯＩを精製することと
を含み、
ここで前記宿主細胞の遺伝子操作が（ｉ）前記内在性遺伝子もしくはその一部または（ｉｉ）前記内在性遺伝子の発現制御配列、好ましくは、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列もしくは翻訳開始及び停止配列、エンハンサー、ならびにアクチベーター配列からなる群より選択される発現制御配列の破壊、置換、欠失、もしくはノックアウトを含む、
前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＯＩをコードする目的遺伝子（ＧＯＩ）を発現するための異種性発現カセットを含む組換え宿主細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の産生に関し、この宿主細胞は、ＦＬＯ８タンパク質の発現を低下させるように操作される。

【背景技術】

【0002】

組換え宿主細胞培養で産生されるタンパク質は、診断薬剤及び治療薬剤としてますます重要になっている。この目的において、細胞は、異常に高レベルの組換えまたは異種性の目的タンパク質を産生するように操作及び／または選択される。細胞培養条件の最適化は、組換えまたは異種性タンパク質の商業的生産を成功させるために重要である。

【0003】

目的タンパク質（ＰＯＩ）生産は、細胞培養で原核及び真核細胞の両方により成功している。真核宿主細胞、特定的には哺乳類宿主細胞、酵母もしくは糸状菌、または細菌は、生物薬剤学的タンパク質及びバルク化学物質の産生宿主として一般的に使用されている。最も顕著な例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのような酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉもしくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのような糸状菌、またはＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞である。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどのメチロトローフ酵母は、異種性タンパク質を効率的に分泌するとよく言われている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは新規のＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属に再分類され、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ、及びＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓの３つの種に分かれている。バイオテクノロジー用途に一般的に使用される株は、２つの提唱される種、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＫ．ｐｈａｆｆｉｉに属する。株ＧＳ１１５、Ｘ－３３、ＣＢＳ２６１２、及びＣＢＳ７４３５はＫ．ｐｈａｆｆｉｉであり、一方ＳＭＤシリーズのプロテアーゼ欠損株（例えば、ＳＭＤ１１６８）はタイプ種Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓに分類され、これは全ての利用可能なＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの基準株である。（Ｋｕｒｔｚｍａｎ ２００９，Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（１１）：１４３５－８）。Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２００９，８：２９ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７５－２８５９－８－２９）は、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓのタイプ株ＤＳＭＺ ７０３８２のゲノムシークエンシングについて記述し、そのセクレトーム及び糖輸送体を解析した。

【0004】

ＷＯ２０１５／１５８８０８Ａ２は、ヘルパータンパク質を過剰発現するように操作された組換え宿主細胞を開示している。

【0005】

ＷＯ２０１５／１５８８００Ａ１は、宿主細胞のＰＯＩを発現及び／または分泌する能力の改善について開示しており、宿主細胞にとって内在性であり過剰発現するとタンパク質産生の収率を低下させることが判明しているある特定のタンパク質（ＫＯタンパク質と呼ばれる）を過小発現させるように操作することにより、能力を改善する。そのため、このようなＫＯタンパク質は、収率を改善するためのノックアウト標的として選択されている。さらに、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞系でＫＯタンパク質を過小発現させると、モデルタンパク質の収率が１．２～２．４倍増加することが分かった。誘導可能（ｐＡＯＸ１）プロモーターまたは構成的（ｐＧＡＰ）プロモーターが使用されている。ＫＯタンパク質は、Ｐ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＬＯ８タンパク質のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓホモログ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＣＨ１タンパク質のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓホモログとして同定されており、ＫＯ３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＣＪ１タンパク質のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓホモログとして同定されている。

【0006】

Ｒｅｂｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１６，８２（１５）：４５７０－４５８３）は、フィルター目詰まりを防止するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｌｏ８欠失変異体のグルコース制限ケモスタット培養について記述している。

【0007】

組換え宿主細胞内でのタンパク質産生に使用されるプロモーターは、調節されている（例えば、培地にメタノールを添加すると誘導される／メタノール制御性）か、または恒常的に活性である（構成的）。メタノール制御性プロモーターは、リアクター内の廃熱、または酸素供給といった技術的限界をもたらす。

【0008】

ＷＯ２０１３７０５０５５１Ａ１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの一連の炭素源調節可能プロモーター（ｐＧ１－ｐＧ８と称される）と、細胞培養物中の炭素源を制限することによるタンパク質産生の誘導とについて開示している。

【0009】

ＷＯ２０１７０２１５４１Ａ１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの炭素源調節可能プロモーター（ｐＧ１と称される）のバリアントを開示している。このバリアントは、メタノール以外の炭素源によって調節され、すなわちメタノール制御性ではなく、例えば、成長フェーズ中に炭素源の存在下で抑制され、産生フェーズで炭素源を制限することによって誘導される。

【0010】

Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ２０１３；１２（５）：１－１０）は、メタノールなしで調節可能かつ誘導されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓプロモーターについて記載している。

【0011】

Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２０１８；１１５：２４７９－２４８８）は、野生型プロモーターと比較して誘導特性が大幅に増強したグルコース調節Ｐ_ＧＴＨ１プロモーター及び操作バリアントについて記載している。

【0012】

ＥＰ２６６９３７５Ａ１は、ＭＰＰ１ホモログの高レベル発現によってタンパク質発現が改善した酵母について開示している。

【0013】

Ｈｙｅ Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４，４４９：２０２－２０７）は、標的遺伝子セットの転写活性化におけるＦｌｏ８アクチベーターの２つのドメインの役割及び、Ｍｓｓ１１アクチベーターと相互作用することによるＦｌｏ８の作用様式について記載している。

【0014】

ＥＰ２９５２５８４Ａ１は、ある特定のポリヌクレオチドを過剰発現することによるタンパク質産生の改善について開示している。

【0015】

ＥＰ２２５８８５５Ａ１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのある特定のリーダー及び分泌シグナル配列について開示している。

【0016】

ＷＯ２０１００９９１９５Ａ１は、遺伝的修飾されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株、ならびに異種性タンパク質及びシャペロンタンパク質の同時発現について開示している。

【発明の概要】

【0017】

目的は、組換え宿主細胞内でのタンパク質産生を改善すること、及びタンパク質産生の収率を増加させることである。本発明の別の目的は、宿主細胞内で組換えタンパク質または異種性タンパク質を産生する方法であって、産生プロセス中に宿主細胞の形態が変化するリスクが低下する、方法を提供することである。

【0018】

当該目的は、特許請求される主題によって解決される。

【0019】

本発明によれば、配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする内在性遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、当該宿主細胞が、１つ以上の遺伝子修飾によって、当該１つ以上の遺伝子修飾を行う前の当該宿主細胞と比較して当該ポリヌクレオチドの発現を低下させる（または消失させる）ように操作され、当該宿主細胞が、発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）の制御下で目的遺伝子（ＧＯＩ）を発現するためのＧＯＩを含む異種性発現カセットを含む、組換え宿主細胞が提供される。

【0020】

具体的には、ＥＣＰは、非メタノール炭素源によって調節可能である。

【0021】

具体的には、ＥＣＰは、非メタノール炭素源によって抑制可能である。

【0022】

具体的には、ＥＣＰは、抑制炭素源、例えば、メタノールではない抑制炭素源（例えば、グルコースまたはグリセロール）によって抑制可能であり、抑制炭素源の量を減らすことによって誘導可能（抑制解除可能）である。

【0023】

具体的には、ＥＣＰはメタノールによって誘導可能ではない。

【0024】

具体的には、非メタノール炭素源は、宿主細胞培養で好適に使用される、メタノール以外の任意の炭素源である。具体的には、非メタノール炭素源はメタノールではない。

【0025】

具体的には、非メタノール炭素源はメタノール以外の炭素源である。特定的には、ＥＣＰはメタノール制御性ではない。細胞培養物または細胞培養基はメタノールを含む場合も含まない場合もあるが、本明細書で使用されるＥＣＰはいかなる量のメタノールにも調節されず、特定的には、メタノールによって誘導可能ではないためメタノール制御性ではない。具体的には、ＥＣＰは、メタノールを含まない細胞培養物または培養基中で十分に誘導することができる。

【0026】

本明細書で説明される目的において、「ＦＬＯ８タンパク質」という用語は、配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むタンパク質、または配列番号１に対しある特定の相同性を有するアミノ酸配列の両方を指すものとする。さらに、相同配列はＦＬＯ８ホモログとも称される。

【0027】

具体的には、ＦＬＯ８ホモログは、配列番号１に対し少なくとも２５％、３０％、もしくは３５％のいずれか１つの配列同一性、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％のいずれか１つの配列同一性を有する、または配列番号１と１００％同一である。具体的には、配列同一性は、例えば全長配列を比較したときに、本明細書でさらに開示されるように決定される。

【0028】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質またはそれぞれのホモログは、配列番号５０に対し少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％のいずれか１つの配列同一性を含むか、または配列番号５０と１００％同一である、ＬｉｓＨドメインを含む。

【0029】

具体的な態様によれば、ＦＬＯ８タンパク質のＬｉｓＨドメインは、真核生物のＦＬＯ８タンパク質またはそれぞれのＦＬＯ８オルソログの天然に存在するＬｉｓＨドメインのいずれかに対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つの配列同一性を含むか、またはこのような天然に存在するＬｉｓＨドメイン、具体的には、酵母または真菌（特定的には糸状菌）のＬｉｓＨドメイン、例えば、以下のいずれか１つを含むまたはそれからなるＬｉｓＨドメインと１００％同一である。
ａ）Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉのＦＬＯ８タンパク質のＬｉｓＨドメインである配列番号５０（配列番号５０）
ｂ）配列番号５１（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＦＬＯ８タンパク質のＬｉｓＨドメイン）（ＢＬＡＳＴｐ：配列番号５０に対し９６％の同一性（２３／２４ａａ））
ｃ）配列番号５２（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のＦＬＯ８オルソログのＬｉｓＨドメイン）（ＢＬＡＳＴｐ：配列番号５０に対し５４％の同一性（１３／２４ａａ））
ｄ）配列番号５３（別のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のＦＬＯ８オルソログのＬｉｓＨドメイン）（ＢＬＡＳＴｐ：配列番号５０に対し５４％の同一性（１３／２４ａａ））
ｅ）配列番号５４（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株のＦＬＯ８オルソログのＬｉｓＨドメイン）（ＢＬＡＳＴｐ：配列番号５０に対し７１％の同一性（１２／１７ａａ））
ｆ）配列番号５５（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ株のＦＬＯ８オルソログのＬｉｓＨドメイン）（ＢＬＡＳＴｐ：配列番号５０に対し６２％の同一性（８／１３ａａ））、または
ｇ）配列番号５６（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株のＦＬＯ８オルソログのＬｉｓＨドメイン）（ＢＬＡＳＴｐ：配列番号５０に対し７３％の同一性（８／１１ａａ））

【0030】

典型的には、ＦＬＯ８タンパク質のＬｉｓＨドメインの長さは２５～２７アミノ酸であり、データベースＰｆａｍ、ＩＤ番号ＰＦ０８５１３に記載のヒトタンパク質ＬＩＳ１及びそれぞれの配列に対し、ある特定の配列同一性を有する。分子生物学において、ＬｉｓＨドメインは、広範囲の機能を有する多数の真核生物タンパク質に認められるタンパク質ドメインである。ＬＩＳ１のＮ末端領域におけるＬｉｓＨドメインの構造は、それを二量体化モチーフとして示した（Ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＬＩＳ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＬｉｓＨ ｍｏｔｉｆ．Ｍａｔｅｊａ Ａ，Ｃｉｅｒｐｉｃｋｉ Ｔ，Ｐａｄｕｃｈ Ｍ，Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ ＺＳ，Ｏｔｌｅｗｓｋｉ Ｊ．２００６．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３５７（２）：６２１－３１）

【0031】

ＦＬＯ８ホモログは、特定的には、本明細書でさらに説明されるように、ＰＯＩを産生する組換え宿主細胞として使用される宿主細胞にとって内在性であることが理解される。特定的には、ＦＬＯ８タンパク質は、宿主細胞種の種にとって内在性であるオルソログである。

【0032】

具体的には、宿主細胞がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、特定的にはＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｐｈａｆｆｉｉである場合、ＦＬＯ８タンパク質は、それぞれ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ起源、特定的にはＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ起源である。代替的に、ＦＬＯ８タンパク質は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ起源、特定的にはＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ起源のこのようなＦＬＯ８タンパク質の相同（またはオルソログ）配列を含み、この相同（オルソログ）配列は、別の起源または種の場合、野生型宿主細胞にとって内在性である。例えば、宿主細胞がＫ．ｐｈａｆｆｉｉである場合、内在性ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。別の例によれば、宿主細胞がＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓである場合、内在性ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号３（配列番号１に対し９１％同一である）として同定されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。さらに、宿主細胞が異なる種（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ及び／またはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ以外）のものである場合、宿主細胞にとって内在性であるＦＬＯ８タンパク質配列は配列番号１のホモログであり、本明細書で説明される目的において、宿主細胞内でのこのようなホモログの発現（配列番号１のオルソログ配列）が低下する。

【0033】

具体的には、相同配列のいずれかまたは各々は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、特定的にはＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｐｈａｆｆｉｉにおけるように、それぞれの野生型宿主細胞におけるＦＬＯ８タンパク質の転写因子としての、特定的には、細胞接着、凝集、侵襲的成長、またはデンプン異化の調節に関与するＤＮＡ結合転写アクチベーターとしての同じ定性的機能によって特徴付けられるが、その定量的活性は、野生型Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｐｈａｆｆｉｉのＦＬＯ８タンパク質と比較すると異なる可能性がある。

【0034】

具体的には、それぞれの相同配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（特定的には、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ）以外の種のもの、例えば、別の酵母または糸状菌細胞、好ましくはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａもしくはＰｉｃｈｉａ属の酵母、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属もしくは任意のメチロトローフ酵母のものである。さらに、宿主細胞は、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、植物細胞、細菌細胞、線虫細胞、無脊椎動物細胞（例えば、昆虫細胞もしくは軟体動物細胞）、または幹細胞とすることができ、本明細書に記載のそれぞれのＦＬＯ８タンパク質及びそのホモログは、それぞれの宿主細胞にとって内在性であるが、本明細書に記載されるようにその発現が低下または消失する。

【0035】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質ホモログは、内在性もしくはＰｉｃｈｉａ種由来、または内在性もしくは他の任意の酵母、真菌、もしくは細菌由来であり、配列番号１もしくは配列番号２に対し２５％の配列同一性、特定の場合において少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のいずれか１つの配列同一性を有し、または配列番号１または配列番号２と１００％同一である。具体的には、Ｐｉｃｈｉａ（ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株のｆｌｏ８ノックアウト株の培養物に外来性ＦＬＯ８タンパク質（または外来性ＦＬＯ８タンパク質をコードする遺伝子）を添加して機能する場合（このノックアウト株が外来性ＦＬＯ８タンパク質の起源とは異なることにより、欠失した内在性ＦＬＯ８タンパク質の機能的置き換えが立証される）、この外来性ＦＬＯ８タンパク質はＦＬＯ８タンパク質ホモログと判定される。

【0036】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ起源のものであり、特定的には、宿主細胞にとって内在性の遺伝子によってコードされ、このとき、宿主細胞はＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。

【0037】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号１を含むまたはそれからなるＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ起源のものである。具体的には、このようなＦＬＯ８タンパク質は、宿主細胞にとって内在性の遺伝子によってコードされ、このとき、宿主細胞はＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉである。具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号２として同定されるヌクレオチド配列によってコードされる。

【0038】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号１に対し少なくとも９０％または９１％の配列同一性を含むＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ起源のものである。具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号３を含むまたはそれからなるＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ起源のものである。具体的には、このようなＦＬＯ８タンパク質は、宿主細胞にとって内在性の遺伝子によってコードされ、このとき、宿主細胞はＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。

【0039】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号１に対し少なくとも３５％の配列同一性を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ起源のものである。具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号５または配列番号６を含むまたはそれからなるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ起源のものである。具体的には、このようなＦＬＯ８タンパク質は、宿主細胞にとって内在性の遺伝子によってコードされ、このとき、宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。

【0040】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号１に対し少なくとも４０％または４４％の配列同一性を含むＹａｒｒｏｗｉａ起源のものである。具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号７を含むまたはそれからなるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ起源のものである。具体的には、このようなＦＬＯ８タンパク質は、宿主細胞にとって内在性の遺伝子によってコードされ、このとき、宿主細胞はＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。

【0041】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号１に対し少なくとも３０％または３４％の配列同一性を含むＯｇａｔａｅａ起源のものである。具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号８を含むまたはそれからなるＯｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ起源のものである。具体的には、このようなＦＬＯ８タンパク質は、宿主細胞にとって内在性の遺伝子によってコードされ、このとき、宿主細胞はＯｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである。

【0042】

具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号１に対し少なくとも２５％または２６％の配列同一性を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ起源のものである。具体的には、ＦＬＯ８タンパク質は、配列番号９を含むまたはそれからなるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ起源のものである。具体的には、このようなＦＬＯ８タンパク質は、宿主細胞にとって内在性の遺伝子によってコードされ、このとき、宿主細胞はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒである。

【0043】

具体的には、宿主細胞は、ＦＬＯ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写及び／もしくは翻訳を低下させる、ならびに／または他の方法でポリヌクレオチドの発現を低下させＦＬＯ８タンパク質の産生を低下させる、ゲノム変異を含む１つ以上の遺伝子修飾により、遺伝子修飾される。

【0044】

具体的には、当該１つ以上の遺伝子修飾は、（ｉ）１つ以上の内在性ポリヌクレオチドもしくはその一部または（ｉｉ）発現制御配列の、破壊、置換、欠失、またはノックアウトを含む。

【0045】

具体的な態様によれば、当該１つ以上の遺伝子修飾は、本明細書に記載ｎｏ宿主細胞の１つ以上の内在性ポリヌクレオチドのもの、例えば、コードポリヌクレオチドのものであり、これには例えば、ＦＬＯ８タンパク質、特定的には、宿主細胞の種、タイプ、または株に天然に存在する野生型（修飾されていないまたはネイティブの）タンパク質をコードするポリヌクレオチド（または遺伝子）が含まれる。

【0046】

具体的な態様によれば、当該１つ以上の遺伝子修飾は、発現制御配列のもの（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写または翻訳開始及び停止配列を含む）、またはエンハンサーまたはアクチベーター配列のものである。

【0047】

宿主細胞を操作する様々な方法を用いて内在性ポリヌクレオチド（例えば、ＦＬＯ８タンパク質をコードする遺伝子）の発現を低下させることができ、このような低下には、ＦＬＯ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを破壊すること、このようなポリヌクレオチドに作用可能に結合しているプロモーターを破壊すること、このようなプロモーターを、プロモーター活性がより低い別のプロモーターで置き換えること、このようなポリヌクレオチドの発現を調整する調節配列を修飾または調整（例えば、活性化、上方調節、不活性化、阻害、または下方調節）すること、例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの宿主細胞の修飾方法で使用されるＲＮＡ誘導リボヌクレアーゼにより、関連する配列を標的とするそれぞれの転写調節因子を使用することが含まれ、例えば、調節配列は、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始または停止配列、翻訳開始または停止配列、エンハンサーまたはアクチベーター配列、リプレッサーまたはインヒビター配列、シグナルまたはリーダー配列、特定的には、タンパク質の発現及び／または分泌を制御する配列からなる群より選択される。

【0048】

具体的には、当該１つ以上の遺伝子修飾は、例えば遺伝子のノックアウトにより、このような遺伝子修飾を伴わないそれぞれの宿主と比較して、遺伝子もしくは遺伝子の一部の発現を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％低下させる、またはその発現を完全に消失させる、遺伝子またはゲノム配列の欠失または不活性化を含む、１つ以上のゲノム変異を含む。

【0049】

具体的には、当該１つ以上の遺伝子修飾は、１つ以上の内在性ポリヌクレオチドの発現を構成的に障害するまたは別の方法で低下させる、ゲノム変異を含む。

【0050】

具体的には、当該１つ以上の遺伝子修飾は、１つ以上の内在性ポリヌクレオチドの発現を条件的に障害するまたは別の方法で低下させる、１つ以上の誘導可能または抑制可能調節配列を導入するゲノム変異を含む。このような条件的に活性の修飾は、特定的には、細胞培養条件に応じて活性でありかつ／または発現する調節エレメント及び遺伝子を標的化している。

【0051】

具体的には、当該１つ以上の内在性ポリヌクレオチドの発現が低下することにより、ＰＯＩを産生する際にＦＬＯ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現が低下する。具体的には、遺伝子修飾されると、ＰＯＩが産生される宿主細胞培養の条件下でＦＬＯ８タンパク質の発現が低下する。

【0052】

具体的には、当該ＦＬＯ８タンパク質の量（例えば、レベルまたは濃度）を、例えば、遺伝子のノックアウトにより、修飾を伴わない宿主細胞と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のうちの１つ、または１００％（例えば、検出可能でない量まで）低下させて、ＦＬＯ８タンパク質の産生を完全に消失させるように、宿主細胞を遺伝子修飾する。具体的な実施形態によれば、宿主細胞は、（１つ以上の）ゲノム配列、特定的には、ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログをコードするゲノム配列の１つ以上の欠失を含むように遺伝子修飾される。このような宿主細胞は、典型的には欠失株またはノックアウト株として提供される。

【0053】

具体的な実施形態によれば、ひとたび本明細書に記載の宿主細胞が細胞培養物中で培養されると、宿主細胞または宿主細胞培養物中の合計ＦＬＯ８タンパク質量は、このような遺伝子修飾の前にもしくは遺伝子修飾なしで宿主細胞によって発現もしくは産生される参照量と比較して、またはそれぞれの宿主細胞培養物中で産生される参照量と比較して、または当該修飾の前もしくは修飾なしの宿主細胞と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のいずれか１つ、または１００％にも（例えば、検出可能でない量まで）低下する。

【0054】

本明細書に記載の宿主細胞を、当該ＦＬＯ８タンパク質の産生を低下させる遺伝子修飾の作用に関して比較する場合、典型的には、このような遺伝子修飾の前または遺伝子修飾なしの比較可能な宿主細胞と比較する。比較は、典型的には、組換えまたは異種性ＰＯＩを産生するように操作された、このような遺伝子修飾を伴わない同じ宿主細胞の種またはタイプを用いて、特定的には、当該ＰＯＩを産生する条件下で培養するときに、行われる。ただし、組換えまたは異種性ＰＯＩを産生するようにさらなる操作がされていない同じ宿主細胞の種またはタイプを用いても、比較を行うことができる。

【0055】

具体的な態様によれば、当該ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログの減少は、細胞中の当該ＦＬＯ８タンパク質の量（例えば、レベルまたは濃度）の減少によって定量される。具体的には、当該ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログの量は、好適な方法によって、例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光イメージング、フローサイトメトリー、または質量分析（特定的には、質量分析は、液体クロマトグラフ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）または液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である）（例えば、Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．（ＭＡｂｓ．２０１２；４（１）：２４－４４）に記載の通り）によって定量される。

【0056】

具体的な態様によれば、組換え宿主細胞は、１つのみまたは複数の異種性発現カセット、例えば、発現カセットの複数コピー（例えば、少なくとも２、３、４、または５コピー（遺伝子コピー数、ＧＣＮ））を含む。例えば、組換え宿主細胞は、最大２、３、４、または５コピーを含む。コピーの各々は、同じまたは異なる配列を含むまたはそれらからなることができ、さらに、ＧＯＩに作用可能に結合したＥＣＰを含む。

【0057】

具体的な態様によれば、異種性発現カセットは、ＧＯＩに作用可能に結合したＥＣＰを含むポリヌクレオチドの人工的融合物と、任意選択でさらなる配列（例えば、シグナル、リーダー、またはターミネーター配列）とを含むまたはこれらからなる。具体的には、宿主細胞にとって異種性のまたは人工的な発現カセットが使用され、特定的には、この発現カセットはプロモーター（ＥＣＰ）及びＧＯＩを含み、このときプロモーター及びＧＯＩは互いに異種性であり、この組合せでは自然界に存在せず、例えば、プロモーター及びＧＯＩのいずれか一方（または一方のみ）が、人工的であるまたは他方及び／もしくは本明細書に記載の宿主細胞にとって異種性である、プロモーターが内在性プロモーターであり、ＧＯＩが異種性ＧＯＩである、あるいはプロモーターが人工的または異種性プロモーターであり、ＧＯＩが内在性ＧＯＩである。このとき、プロモーター及びＧＯＩの両方は、人工的、異種性、または異なる起源由来（例えば、本明細書に記載の宿主細胞と比較して異なる種またはタイプ（株）細胞由来）である。具体的には、ＥＣＰは、本明細書に記載の宿主細胞として使用される細胞内で、当該ＧＯＩと天然には会合しておらず、かつ／または作用可能に結合していない。

【0058】

具体的な態様によれば、ＥＣＰは、成長制限量の非メタノール炭素源の存在下で、好ましくはメタノールの非存在下で誘導可能であり、成長制限量よりも高い過剰量の非メタノール炭素源の存在下で抑制可能である。具体的には、異種性発現カセットによるＧＯＩ発現は、誘導性ＥＣＰによって誘導可能である。

【0059】

好ましくは、ＥＣＰは、調節可能な炭素源であり、例えば、細胞培養基または上清中の１、１．５、２、２．５、または３ｇ／Ｌのいずれか１つよりも多い量（本明細書ではプロモーター抑制量と称される）の炭素源の存在下で抑制され、検出可能な炭素源の非存在下で、または細胞培養基もしくは上清中の最大０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、もしくは１．０ｇ／Ｌのいずれか１つの量（本明細書ではプロモーター誘導量と称される）の炭素源の存在下で、誘導または抑制解除される。細胞培養基または上清中のこのような量は、特定的には、宿主細胞の摂食及び宿主細胞による消費の際に検出可能であり得る量として理解されている。典型的には、成長制限条件下でＰＯＩを産生する際、細胞培養物の供給は、ＰＯＩ産生中に細胞によって直ちに消費される量の補充炭素源を添加することによって行われ、したがって、細胞培養基または上清中に残存量が全くまたはごくわずか（例えば、最大１．０ｇ／Ｌ）しか残らない。

【0060】

具体的には、ＥＣＰを調節する炭素源はメタノール以外の任意の炭素源であり、本明細書ではこれを非メタノール炭素源と称する。

【0061】

具体的には、非メタノール炭素源は炭水化物ではない。

【0062】

具体的には、非メタノール炭素源は、糖類、ポリオール、アルコール、または前述のいずれか１つ以上の混合物から選択される。

【0063】

具体的には、糖類は、単糖類、例えば、ヘキソース（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはマンノース）、あるいは二糖類（例えば、サッカロース）、あるいはアルコールまたはポリオール、例えば、エタノール、または任意のジオール、またはトリオール（例えば、グリセロール）、あるいは上記のいずれかの混合物のいずれか１つ以上であり得る。具体的には、任意のこのような非メタノール炭素源は、ＥＣＰの制御下で当該ＰＯＩを産生する量で細胞培養物中に使用することができる。

【0064】

具体的な態様によれば、ＥＣＰは、少なくとも１つの第１のコア調節領域及び少なくとも１つの第２のコア調節領域を含む。具体的には、ＥＣＰは、少なくとも２つの当該第１及び／または第２コア調節領域を含む。具体的には、ＥＣＰは、限定された数の当該第１及び第２のコア調節領域を含み、当該第１のコア調節領域の数は１つのみ、２つ、または３つであり、当該第２のコア調節領域の数は１つのみ、２つ、または３つである。具体的には、ＥＣＰは、同数の当該第１及び第２のコア調節領域を含み、例えば、当該第１のコア調節領域の数が１かつ当該第２のコア調節領域の数が１、当該第１のコア調節領域の数が２かつ当該第２のコア調節領域の数が２、または当該第１のコア調節領域の数が３かつ第２のコア調節領域の数が３である。

【0065】

具体的には、第１のコア調節領域は、配列番号１７に対し少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％または少なくとも９０％のいずれか１つの配列同一性）を有し、及び／または第２のコア調節領域は、配列番号１８に対し少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％または少なくとも９０％のいずれか１つの配列同一性）を有する。

【0066】

具体的には、第１コア調節領域及び第２のコア調節領域の各々は、８～１６ｎｔの長さを有する。

【0067】

具体的には、第１のコア調節領域は８～１０ｎｔ、特定的には９ｎｔの長さを有する。具体的には、第１のコア調節領域は、配列番号１７、または配列番号１７として同定されるヌクレオチド配列の修飾を含むまたはそれからなり、このとき修飾は、最大１つまたは２つの点変異であり、特定的には、１つの点変異は、１つのヌクレオチドの置換、挿入、または欠失のいずれか１つである。

【0068】

具体的には、第２のコア調節領域は１４～１６ｎｔ、特定的には１５ｎｔの長さを有する。具体的には、第２のコア調節領域は、配列番号１８、または配列番号１８として同定されるヌクレオチド配列の修飾を含むまたはそれからなり、このとき修飾は、最大１つ、２つ、または３つの点変異であり、特定的には、１つの点変異は、１つのヌクレオチドの置換、挿入、または欠失のいずれか１つである。

【0069】

具体的には、ＥＣＰは、少なくとも１つの第１のコア調節領域及び少なくとも１つの第２のコア調節領域を、任意の順序で、好ましくは互いに近接して（例えば、最も近い第１及び第２のコア調節領域間が最大２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ｎｔのいずれか１つ）含む。

【0070】

具体的には、ＥＣＰは、１つの第１のコア調節領域及び１つの第２のコア調節領域を含み、これらは、スペーサーを介して結合し、特定的には、少なくとも５、６、７、８、９、１０ｎｔのいずれか１つの長さ、かつ／または最大２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、もしくは１０のいずれか１つの長さを有するヌクレオチド配列（本明細書中では「スペーサーコア領域」と称される）によって分離している。特定的には、スペーサーコア領域は、配列番号３６に対し少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％少なくとも９０％のいずれか１つの配列同一性）を有し、かつ／または配列番号３６、または配列番号３６として同定されるヌクレオチド配列の修飾を含むまたはそれからなり、このとき修飾は、最大１つ、２つ、３つ、または４つの点変異であり、特定的には、１つの点変異は、１つのヌクレオチドの置換、挿入、または欠失のいずれか１つである。具体的には、スペーサーコア領域は、ヌクレオチドの大部分（少なくとも５０％または少なくとも６０％）がＧ、Ｃ、またはＴから選択されるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。

【0071】

具体的には、ＥＣＰは、５’末端→３’末端で以下の３つの連続するエレメント、（ｉ）第１のコア調節領域、（ｉｉ）スペーサーコア領域、及び（ｉｉｉ）第２のコア調節領域からなるヌクレオチド配列からなる少なくとも１つの領域を含み、これは本明細書では「主要調節領域」と称される。

【0072】

具体的には、ＥＣＰは、少なくとも１つもしくは２つ、または１つのみもしくは２つの主要調節領域を含み、これらは各々、配列番号３５に対し少なくとも８５％、９０％、または９５％のいずれか１つの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。このような主要調節領域は、好ましくは、第１のコア調節領域、スペーサーコア領域、及び第２のコア調節領域からなる。

【0073】

具体的には、ＥＣＰは、配列番号３５に対し少なくとも８５％、９０％、または９５％のいずれか１つの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0074】

具体的には、ＥＣＰは、本明細書に記載のように、１つのみ、２つ、または３つの主要調節領域を含み、特定的には、主要調節領域の数は２つまたは３つであり、当該２つまたは３つの調節領域は互いに同一であっても異なっていてもよい。具体的には、ＥＣＰは、２つのみの主要調節領域を含み、これらは、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｔのいずれか１つの長さ、かつ／または最大５００、４５０、４００、３５０、または３００ｎｔのいずれか１つの長さ、特定的には１００から３００ｎｔの間の範囲の長さを有するヌクレオチド配列（本明細書中では「スペーサー主要領域」と称される）によって分離している。具体的には、スペーサー主要領域は、配列番号３７に対し少なくとも６０％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つの配列同一性）を有する少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｔのいずれか１つの長さのヌクレオチド配列を含み、かつ／または配列番号３７、または配列番号３７として同定されるヌクレオチド配列の修飾を含むまたはそれからなり、このとき修飾は、最大３０、２５、２０、１５、または１０のいずれか１つの点変異であり、特定的には、１つの点変異は、１つのヌクレオチドの置換、挿入、または欠失のいずれか１つである。

【0075】

具体的な態様によれば、ＥＣＰは、大部分がチミン（Ｔ）である、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか１つがＴであるヌクレオチド配列からなる少なくとも１つのＴモチーフを含み、当該Ｔモチーフは、例えば、配列番号１９～３４のいずれか１つを含むまたはそれからなり、当該Ｔモチーフの５’または３’末端のいずれかにある１つ以上のさらなる（または隣接する）チミンによる伸長を伴わない。

【0076】

具体的には、ＥＣＰは、１つのみもしくは２つの当該Ｔモチーフ、または少なくとも２つの当該Ｔモチーフ、最大４つもしくは３つのＴモチーフを含み、このとき、当該Ｔモチーフは互いに同一であるか、または異なる。

【0077】

具体的には、ＥＣＰは、主要調節領域の上流または下流の少なくとも１つのＴモチーフ、例えば、主要調節領域の上流の１つ（または１つのみもしくは２つ）のＴモチーフと、下流の１つ（または１つのみもしくは２つ）のＴモチーフとを含む。さらに、具体的な実施形態によれば、ＥＣＰは、当該Ｔモチーフの少なくとも１つ、特定的には、スペーサー主要領域内の１つのみまたは２つのＴモチーフを含む。

【0078】

具体的には、ＥＣＰは、少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８５０、９００、９５０、または１０００ｂｐのいずれか１つの長さで、例えば、最大２０００ｂｐ、または１５００ｂｐの長さを有する。

【0079】

具体的には、ＥＣＰは、例えば、長さが最大５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６または５ｎｔ以下（３’末端を含む）の３’末端ヌクレオチド配列を含み、これは翻訳開始部位の少なくとも一部、例えば、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のいずれか１つに対し少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、または少なくとも９０％同一のいずれか１つである配列を含む。翻訳開始部位は、真核生物におけるＫｏｚａｋコンセンサス配列であり、遺伝子発現を支持するための好適なプロモーター配列であり得る。

【0080】

具体的な態様によれば、ＥＣＰは、例えば、転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含む領域内、及び／または配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、もしくは配列番号１６のいずれか１つ、または配列番号４１～４５のいずれか１つの配列の３’末端を含む３’末端配列内（特定的には、全長が１０００ｎｔ未満の場合、前述のヌクレオチド配列のいずれかの全長以下とする）で、少なくとも３００（連続）ｎｔ、特定的には少なくとも３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８５０、９００、９５０、または１０００ｎｔのいずれか１つに対し、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％の配列同一性、特定的には少なくとも８５％、９０％、または９５％のいずれか１つの配列同一性を含むか、または１００％同一である。

【0081】

具体的な態様によれば、ＥＣＰは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、もしくは配列番号１６のいずれか１つまたは配列番号４１～４５のいずれか１つの全長配列に対し、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、もしくは８０％のいずれか１つの配列同一性、特定的には、少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％のいずれか１つの配列同一性を含むか、または１００％同一である。

【0082】

具体的な実施形態は、配列番号１０または配列番号１１を含むまたはそれからなるＥＣＰ、あるいは配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、もしくは配列番号１６、または配列番号４１～４５のいずれか１つの完全長配列に対し、それぞれ少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つの配列同一性を有するか、または１００％同一である、ヌクレオチド配列を含むまたはそれからなるＥＣＰを指す。

【0083】

具体的には、ＥＣＰプロモーターは、配列番号１０または配列番号１１の少なくとも一部または断片を含むまたはそれからなり、長さは少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｂｐのいずれか１つの長さであり、特定的には、ＴＦＢＳ及び／または３’末端を含む。

【0084】

具体的には、ＥＣＰの第１及び第２のコア調節領域、またはＥＣＰの主要調節領域のいずれかが１つ以上のＴＦＢＳを含む。具体的には、ＥＣＰの第１及び第２のコア調節領域の各々、または第１及び第２のコア調節領域の両方、または主要調節領域の各々は、機能的であると考えられそれぞれの転写因子によって認識されるＴＦＢＳまたは少なくともその一部を含む。

【0085】

具体的には、ＴＦＢＳは、Ｒｇｔ１（例えば、配列番号４７を含むまたはそれからなる）、Ｃａｔ８－１（例えば、配列番号４８を含むまたはそれからなる）、及びＣａｔ８－２（例えば、配列番号４９を含むまたはそれからなる）からなる群より選択される転写因子のいずれか１つ以上によって認識される。
ＴＦＢＳはある特定のコンセンサス配列によって特徴付けられ、これは同じ因子に対して変化し得る。特異的な転写因子は以下のように同定される。

【0086】

Ｒｇｔ１は、グルコース応答性転写アクチベーター及びリプレッサーであり、いくつかのグルコース輸送体（ＨＸＴ）遺伝子の発現を調節する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＲｇｔ１はアミノ酸配列の配列番号４７を含む。

【0087】

Ｃａｔ８－１及びＣａｔ８－２は、炭素源応答エレメントに結合する亜鉛クラスター転写アクチベーターであり、非発酵性成長条件下での様々な遺伝子の抑制解除に必要である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＣａｔ８－１及びＣａｔ８－２は、それぞれ配列番号４８及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む。

【0088】

具体的な態様によれば、ＥＣＰは、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８個のＴＦＢＳを含み、ＴＦＢＳの各々は、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８－１、またはＣａｔ８－２のいずれかによって個別に認識される。

【0089】

具体的には、ＥＣＰは、参照プロモーターと比較して増加したプロモーター強度によって特徴付けられ、
・プロモーター強度は、参照プロモーターのプロモーター強度と同じであるか、またはそれよりも高く、特定的には、誘導状態にある場合、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．３倍、３．５倍、３．８倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、または少なくとも６倍の増加のいずれか１つである。

【0090】

特定的には、宿主細胞のネイティブｐＧＡＰプロモーター、具体的には、組換えＰＯＩ産生に使用される宿主細胞にとって内在性でかつ宿主細胞内に天然に存在するｐＧＡＰプロモーター、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内でのＧＡＰＤＨの発現を制御するために使用されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのネイティブｐＧＡＰプロモーター（例えば、配列番号４６を含むまたはそれからなる）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞内でのＥＣＰプロモーター強度の改善を定量するための参照として機能し得る。このような参照プロモーターは、同じ宿主細胞及び発現系を用いた並行対照実験で、または同じ宿主細胞培養物内の内部対照として使用することができる。参照プロモーターと比較してプロモーター機能を認定するこのような対照実験は、好ましくは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞培養物で、特定的にはモデルタンパク質（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）を発現する組換えＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓで、実施される。参照プロモーター強度と比較したプロモーター強度は、以下の標準アッセイによって定量することができる：ｅＧＦＰを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、試験対象のプロモーターの制御下で、２４ディープウェルプレート中２５℃で、２８０ｒｐｍで振とうしながらウェル当たり２ｍＬの培養物を用いてスクリーニングする。グルコースフィードビーズ（６ｍｍ、Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）を使用して、グルコース制限成長条件を作成する。誘導状態（ＹＰ＋１フィードビーズ、２０～２８時間）における細胞のｅＧＦＰ発現を解析する。

【0091】

具体的な態様によれば、本明細書に記載のＥＣＰの相対的なプロモーターまたは転写の強度または比率は、ＰＯＩを産生するための宿主として使用される同じ種または株の細胞のネイティブｐＧＡＰプロモーターと比較される。

【0092】

具体的には、参照プロモーターは、宿主細胞のネイティブｐＧＡＰプロモーターである。例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内にある修飾されていない内在性プロモーター配列であるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのネイティブｐＧＡＰプロモーター（例えば、配列番号４６として同定される配列を含むまたはそれからなる）を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＧＳ１１５）内でのＧＡＰＤＨの発現を制御するために使用するように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内での参照プロモーターとして使用することができる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを、本明細書に記載されるようなＰＯＩを産生するための組換え宿主細胞として使用する場合、本明細書に記載のＥＣＰの転写強度または転写率は、このようなＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのネイティブｐＧＡＰプロモーターと好都合に比較される。

【0093】

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＧＳ１１５）の例示的なネイティブｐＧＡＰプロモーター配列（配列番号４６）

【表1】

^＊ＰＡＳ：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５のＯＲＦ名；ＰＩＰＡ：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓタイプ株ＤＳＭＺ ７０３８２のＯＲＦ名

【0094】

別の例によれば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の修飾されていない内在性プロモーター配列であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのネイティブｐＧＡＰプロモーターを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でのＧＡＰＤＨの発現を制御するために使用されるように、参照プロモーターとして使用することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、本明細書に記載されるようなＰＯＩを産生するための組換え宿主細胞として使用する場合、本明細書に記載のＥＣＰの転写強度または転写率は、このようなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのネイティブｐＧＡＰプロモーターと好都合に比較される。

【0095】

具体的には、プロモーター強度は、参照プロモーターと比較したＰＯＩの発現レベル、例えば、モデルタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ（例えば、増強ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５７６０７を含む））の発現レベル、及び／または転写強度によって定量される。好ましくは、転写解析は定量的または半定量的であり、好ましくはｑＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡシークエンシング、及びトランスクリプトーム解析を用いる。

【0096】

具体的には、ＥＣＰはさらに、抑制状態での低レベルと比較して完全誘導状態で転写強度が高いことによって特徴付けられるプロモーター誘導比により、特徴付けられる。

【0097】

具体的には、プロモーター誘導比とは転写の誘導を指し、具体的には、さらなる翻訳及び当該ＰＯＩの任意選択の発現を含む。転写は、典型的には、プロモーター強度の尺度として定量され、具体的には、当該プロモーターを完全に誘導する際に得られる転写物の量を指す。当該転写物の存在量は、例えば、グルコース制限ケモスタット培養条件下で得られ発現する、参照プロモーターの転写率と比較した完全誘導状態での転写強度によって定量することができる。

【0098】

誘導比はＥＣＰの炭素源調節を定量する重要なパラメーターであり、抑制状態のプロモーター活性または強度に対する誘導状態のプロモーター活性または強度を設定する。例えば、抑制状態におけるレポータータンパク質（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）の発現レベル及び／または転写レベルは、過剰グリセロールによる抑制によって定量され、モデルタンパク質の発現レベル及び／または転写レベルは、グルコース供給を制限することによって誘導された誘導状態で定量される。

【0099】

ＥＣＰプロモーターは、培養条件が例えば、０．４ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．０４ｇ／Ｌ未満、とりわけ０．０２ｇ／Ｌ未満のグルコース濃度でほぼ最大の誘導がもたらされる場合、抑制解除状態かつ完全誘導状態とみなされる。好ましくは、完全誘導状態のプロモーターは、ネイティブｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％、または少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％というさらに高い転写レベル／強度を示す。転写レベル／強度は、例えば、液体培養でクローンを培養する際のレポーター遺伝子（例えば、ｅＧＦＰ）の転写物の量によって定量することができる。代替的に、転写率は、マイクロアレイ上のネイティブ制御遺伝子の転写強度によって定量することができ、このときマイクロアレイデータは、抑制状態と抑制解除状態との間の発現レベルの差、及び完全誘導状態での対照より高いシグナル強度を示す。

【0100】

具体的には、誘導比は、抑制状態に対する誘導状態における（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰなどのモデルタンパク質の）発現レベルの比によって定量することができる。参照プロモーターと比較した誘導比は、以下の標準アッセイによって定量することができる：ｅＧＦＰを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、試験対象のプロモーターの制御下で、２４ディープウェルプレート中２５℃で、２８０ｒｐｍで振とうしながらウェル当たり２ｍＬの培養物を用いてスクリーニングする。グルコースフィードビーズ（６ｍｍ、Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）を使用して、グルコース制限成長条件を作成する。抑制状態（ＹＰ＋１％グリセロール、対数期）及び誘導状態（ＹＰ＋１フィードビーズ、２０～２８時間）の間の細胞のｅＧＦＰ発現を解析する。

【0101】

具体的には、ＥＣＰプロモーターは、抑制解除（誘導）状態で、抑制状態よりも少なくとも１．５、２．０、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０倍高いのいずれか１つであるプロモーター活性または強度（例えば、転写活性または転写強度）を有する。そのため、それぞれの誘導率は、少なくとも１．５、２．０、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０のいずれか１つであり得る。

【0102】

驚くべきことに、ＦＬＯ８ノックアウト株における（例えばグルコース制限誘導条件下で、完全に誘導されたときの）本明細書に記載のＥＣＰの転写活性（または転写強度）は、ＦＬＯ８遺伝子座を含みかつＦＬＯ８タンパク質を産生する野生型株と比較してはるかに高く、例えば、少なくとも１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高いのいずれか１つであることが判明した。本明細書に記載の宿主細胞内での転写強度は顕著に増加し、ｆｌｏ８欠失変異体においてはＥＣＰの制御下でＧＯＩの発現レベルを高められることが分かった。これに対し、ｐＧＡＰまたはｐＡＯＸからの転写は、（比較例で定量されている通り）ｆｌｏ８欠失変異体では増加しない。

【0103】

具体的な態様によれば、異種性発現カセットは、自律複製ベクターまたはプラスミドに含まれるか、または宿主細胞の染色体内に組み込まれる。

【0104】

発現カセットは、宿主細胞に導入し、（例えば、組込みの特定の部位の、またはランダムに組み込まれた）染色体内エレメントとして宿主細胞ゲノム（またはその染色体のいずれか）に組み込むことができ、それから高産生宿主細胞系が選択される。代替的に、発現カセットは、プラスミドまたは人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ））などの染色体外遺伝子要素内に組み込んでもよい。具体的な例によれば、発現カセットは、ベクター、特定的には発現ベクターによって宿主細胞に導入され、当該ベクターは、好適な形質転換技術によって宿主細胞に導入される。この目的において、ＧＯＩを発現ベクターにライゲーションすることができる。

【0105】

好ましい酵母発現ベクター（好ましくは酵母内での発現に使用されるベクター）は、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣＺａｌｆａ、ｐＧＡＰＺａｌｆａ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＧＡＰＨｉｓ、ｐＰＵＺＺＬＥ、またはＧｏｌｄｅｎＰｉＣＳに由来するプラスミドからなる群より選択される。

【0106】

ベクターまたはプラスミドを導入するために宿主細胞を形質移入または形質転換する技法は、当技術分野で周知されている。このような技法には、エレクトロポレーション、スフェロプラスト形成、脂質小胞媒介取り込み、熱ショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介形質移入（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿）、ウイルス感染（特定的には、修飾ウイルス（例えば、修飾アデノウイルス）、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションを用いた感染）が含まれ得る。

【0107】

本明細書に記載の形質転換体は、発現カセット、ベクター、またはプラスミドＤＮＡを宿主に導入し、関連するタンパク質または選択マーカーを発現する形質転換体を選択することにより、得ることができる。宿主細胞は、宿主細胞の形質転換に従来的に使用されている方法（例えば、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びこれらの改変方法）によって処理して異種または外来ＤＮＡを導入することができる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、好ましくはエレクトロポレーションによって形質転換される。微生物による組換えＤＮＡ断片の取込みのための好ましい形質転換方法には、化学的形質転換、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト法による形質転換が含まれる。

【0108】

具体的には、発現カセットは、ＰＯＩをコードするＧＯＩに作用可能に結合したＥＣＰを含み、任意選択でさらに、必要に応じて分泌タンパク質としてＰＯＩを発現及び産生するためのシグナル及びリーダー配列を含む。

【0109】

具体的な態様によれば、発現カセットは、ＰＯＩの分泌を可能にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＧＯＩの５’末端に対し、隣接してまたは直接融合される。

【0110】

具体的には、シグナルペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－接合因子プレプロペプチド由来のシグナル配列、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）、及び細胞外プロテインＸ（ＥＰＸ１）（Ｈｅｉｓｓ，Ｓ．，Ｖ．Ｐｕｘｂａｕｍ，Ｃ．Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．Ａｌｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ ＆ Ｂ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；１６１（７）：１３５６－６８）からなる群より選択される。

【0111】

具体的には、ＷＯ２０１４０６７９２６Ａ１に記載のシグナル及び／またはリーダー配列のいずれか、特定的には、配列番号５９または配列番号６０を使用することができる。

【0112】

具体的には、ＷＯ２０１２１５２８２３Ａ１に記載のシグナル配列、特定的には、配列番号６１として同定されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのネイティブアルファ接合因子のシグナル配列またはその変異体を使用することができる。

【0113】

具体的な態様によれば、本明細書に記載の宿主細胞は、例えば、タンパク質産生を改善するために、１つ以上のさらなる遺伝子修飾を経ることができる。

【0114】

具体的には、宿主細胞をさらに操作して、プロテアーゼ欠損株、特定的には、カルボキシペプチダーゼＹ活性欠損株の生成に使用されるタンパク質分解活性に影響を及ぼす１つ以上の遺伝子を修飾する。特定的な例は、ＷＯ１９９２０１７５９５Ａ１に記載されている。プロテアーゼＡまたはプロテイナーゼＢなどの液胞プロテアーゼに機能的欠損を有するプロテアーゼ欠損Ｐｉｃｈｉａ株のさらなる例は、ＵＳ６１５３４２４Ａに記載されている。さらなる例は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが提供する、ａｄｅ２欠失を有する、及び／またはプロテアーゼ遺伝子ＰＥＰ４及びＰＲＢ１の一方もしくは両方の欠失を有する、Ｐｉｃｈｉａ株である。

【0115】

具体的には、宿主細胞は、ＷＯ２０１００９９１９５Ａ１で開示されているように、ＰＥＰ４、ＰＲＢ１、ＹＰＳ１、ＹＰＳ２、ＹＭＰ１、ＹＭＰ２、ＹＭＰ１、ＤＡＰ２、ＧＲＨ１、ＰＲＤ１、ＹＳＰ３、及びＰＲＢ３からなる群より選択される、機能的遺伝子産物、特定的にはプロテアーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を修飾するように操作される。

【0116】

ヘルパー因子をコードする遺伝子の過剰発現または過小発現は、具体的には、例えばＷＯ２０１５１５８８００Ａ１に記載のように、ＧＯＩの発現を増強するために適用される。

【0117】

以下の遺伝子の過剰発現は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内でのＰＯＩ分泌を増加させることが示された：ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３－０６０７、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３－０９３３、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ２－０２２０、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３－０６３９、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４－０１０８、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１－１２３２、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１－１２２５、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１－０６６７、及びＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４－０４４８。

【0118】

以下の遺伝子の過小発現は，Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＰＯＩ分泌を増加させることが示された：ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ１－０１７６、ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ３－１０６２、及びＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４－０２５２。

【0119】

特定的には、宿主細胞は、任意の１つ以上のヘルパー因子を過剰発現させ、配列番号６２～７１のいずれか１つによって同定されるそれぞれのタンパク質の産生を増加させるように操作して、ＰＯＩ収率をさらに増加させることができる。ＰＯＩは、真核生物、原核生物、または合成ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または宿主細胞の代謝産物のいずれか１つとすることができる。

【0120】

具体的には、ＰＯＩは宿主細胞種にとって異種性である。

【0121】

具体的には、ＰＯＩは、分泌ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、すなわち、宿主細胞から細胞培養上清中に分泌される。

【0122】

具体的には、ＰＯＩは真核細胞タンパク質であり、好ましくは、哺乳類由来もしくは関連タンパク質（例えば、ヒトタンパク質もしくはヒトタンパク質配列を含むタンパク質）、または細菌タンパク質もしくは細菌由来タンパク質である。

【0123】

好ましくは、ＰＯＩは哺乳類で機能する治療用タンパク質である。

【0124】

具体的な場合において、ＰＯＩは、多量体タンパク質、具体的には二量体または四量体である。

【0125】

具体的な態様によれば、ＰＯＩは、抗原結合タンパク質、治療タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、成長因子、ホルモン、サイトカイン、プロセス酵素、及び代謝酵素からなる群より選択されるペプチドまたはタンパク質である。

【0126】

具体的には、抗原結合タンパク質は、以下からなる群より選択される：
ａ）抗体または抗体断片、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、Ｆｖ四量体、ミニボディ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＩＧｎａＲＳ、もしくはＶ－ＮＡＲのような単一ドメイン抗体のいずれか
ｂ）抗体ミメティック、例えば、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、もしくはＮａｎｏＣＬＡＭＰ、または
ｃ）１つ以上の免疫グロブリン折畳みドメイン、抗体ドメイン、もしくは抗体ミメティックを含む融合タンパク質。

【0127】

具体的なＰＯＩは、抗原結合分子、例えば、抗体またはその断片、特定的には、抗原結合ドメインを含む抗体断片である。具体的なＰＯＩに含まれるものとして、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）もしくは免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）もしくはその断片、例えば、断片－抗原結合（Ｆａｂ）、Ｆｄ、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、もしくはその操作バリアント、例えば、Ｆｖ二量体（ダイアボディ）、Ｆｖ三量体（トリアボディ）、Ｆｖ四量体、もしくはミニボディ、及びＶＨ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ、もしくはＶ－ＮＡＲのような単一ドメイン抗体、または免疫グロブリン折畳みドメインを含む任意のタンパク質がある。さらなる抗原結合分子は、抗体ミメティック、または（代替的な）足場タンパク質（例えば、操作されたクニッツドメイン、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、またはＤＡＲＰｉｎ）から選択され得る。

【0128】

具体的な態様によれば、ＰＯＩは、例えば、ＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（またはボツリヌス神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ－１６、コリオゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリックス、インターロイキン－２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ－ｎ３（注射用）、インターフェロンアルファ－ｎｌ、ＤＬ－８２３４、インターフェロン、Ｓｕｎｔｏｒｙ（ガンマ－１ａ）、インターフェロンガンマ、サイモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、Ｒｅｂｉｆ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射用（骨疾患）、カルシトニン（経鼻用、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ｂｏｖｉｎｅ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子（局所用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ、エプタコグアルファ（活性化）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え）、Ａｌｐｈｎｍａｔｅ、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ、モルグラモスチム、トリプトレリン酢酸塩、ヒストレリン（皮下インプラント、Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放デポー（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＫＰ－１０２プログラム、ソマトロピン、メカセルミン（成長障害）、エンルファルビチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ－３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入用）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（頬側、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ ｍＴｃ－アプシタイド注射、Ｍｙｅｌｏｐｉｄ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、グラチラマー酢酸塩、Ｇｅｐｏｎ、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、Ｂｉｌｉｖｅ、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ、インターフェロン－アルファ２、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ、インターフェロンアルファコン－１、インターフェロンアルファ、Ａｖｏｎｅｘ組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、Ｚｅｍａｉｒａ、ＣＴＣ－１１１、Ｓｈａｎｖａｃ－Ｂ、ＨＰＶワクチン（４価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ、ＰＥＧ－イントロン、Ｔｒｉｃｏｍｉｎ、組換えハウスダウトダニアレルギー減感作注射、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１－８４（皮下用、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ、Ｖｉｔｒａｓｅ、組換えインスリン、インターフェロン－アルファ（経口用ロゼンジ）、ＧＥＭ－２１Ｓ、バプレオチド、イズルスルファーゼ、オマパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１ エステラーゼ阻害剤（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（ニードルフリー注射、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ ２０００）、ＶＧＶ－１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入用、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、Ａｕｒｏｇｒａｂ、ペキシガナンアセテート（ｐｅｘｉｇａｎａｎａｃｅｔａｔｅ）、ＡＤＩ－ＰＥＧ－２０、ＬＤＩ－２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ－１３７９、ＩＳＡｔｘ－２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション 、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ－１２３、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ－９５０７、テデュグルチド、Ｄｉａｍｙｄ、ＤＷＰ－４１２、成長ホルモン（徐放注射）、組換えＧ－ＣＳＦ、インスリン（吸入用、ＡＩＲ）、インスリン（吸入用、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（吸入用、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ－３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス注射（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ－ｎ３（経口用）、ベラタセプト、経皮用インスリンパッチ、ＡＭＧ－５３１、ＭＢＰ－８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン（ｏｐｅｂａｃａｎ）、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ－１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ、ルスプルチド、ＭＰ５２（ベータ－リン酸三カルシウム担体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプロイセル－Ｔ、ＣＴＰ－３７、Ｉｎｓｅｇｉａ、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、Ｐｕｒｉｃａｓｅ、テルリプレシン（静注用、肝腎症候群）、ＥＵＲ－１００８Ｍ、組換えＦＧＦ－Ｉ（注射用、血管疾患）、ＢＤＭ－Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ－２１６、Ｐ－１１３、ＭＢＩ－５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入用、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ－０７、ＯＰＩ－４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ－５１０、ボウマン・バーク型阻害剤濃縮物、ＸＭＰ－６２９、９９ ｍＴｃ－Ｈｙｎｉｃ－アネキシン Ｖ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ－９９０８、テベレリクス（持続放出）、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ－５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ－３２１、Ｐｅｐｓｃａｎ、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ－０１５、ＩＬ－２１、ＡＴＮ－１６１、シレンギチド、Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ－２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ－３１４５、ＣＡＰ－２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１－ＤＭＩ、卵巣癌免疫療法ワクチン、ＳＢ－２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ－ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ－Ｐ、ＢＬＰ－２５、ＣｅｒＶａｘ－１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入用）、ｒＡＡＴ（皮膚科用）、ＣＧＲＰ（吸入用、喘息）、ペグスネルセプト、サイモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ－２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ－１、ＡＣ－１００、サケカルシトニン（経口用、ｅｌｉｇｅｎ）、カルシトニン（経口用、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ－ＴＭ－６０１、ＫＫ－２２０、Ｔ－１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ（局所用）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ－１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ－００２、島細胞新生療法、ｒＧＬＰ－１、ＢＩＭ－５１０７７、ＬＹ－５４８８０６、ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（即時放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ－００１０、ＧＡ－ＧＣＢ、アボレリン、ＡＣＭ－９６０４、リナクロチドアセテート（ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄ ｅａｃｅｔａｔｅ）、ＣＥＴｉ－１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ（注射用）、速効性インスリン（注射用、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻内インスリン、インスリン（吸入用）、インスリン（経口用、ｅｌｉｇｅｎ）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ、ＲＧ－１０６８、ＭＭ－０９３、ＮＢＩ－６０２４、ＡＴ－００１、ＰＩ－０８２４、Ｏｒｇ－３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所用）、ｒＥＶ－１３１（点眼用）、ｒＥＶ－１３１（呼吸器疾患）、経口用組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ－７８Ｍ、オプレルベキン（経口用）、ＣＹＴ－９９００７ ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＴＹ－００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ－ｎ３（局所用）、ＩＲＸ－３、ＲＤＰ－５８、Ｔａｕｆｅｒｏｎ、胆汁酸塩刺激リパーゼ、Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ、アルカリ（ａｌａｌｉｎｅ）ホスファターゼ、ＥＰ－２１０４Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ－ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ－１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ－２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ－１、Ｘｅｎ－２１７４、ＣＪＣ－１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ－６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ－００２、ＢＧＣ－７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ－１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽ワクチン、Ｖａｃｃ－５ｑ、Ｖａｃｃ－４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口用）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ－１３３４０、ＰＴＨ（１－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ－Ｃ、ＰＴＨアナログ（局所用、乾癬）、ＭＢＲＩ－９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ－Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ－２１０、組換えペストＦＩＶワクチン、ＡＧ－７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ－ｐ１／Ｄｅｒ－ｐ２／Ｄｅｒ－ｐ７アレルゲン標的化ワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異型ｒａｓワクチン、ＨＰＶ－１６ Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンシン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）ワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１－ペプチドワクチン（癌）、ＩＤＤ－５、ＣＤＸ－１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ－９８０８、ＶＴ－１１１、イクロカプチド（ｉｃｒｏｃａｐｔｉｄｅ）、テルベルミン（皮膚科用、糖尿病足潰瘍）、ルピントリビル、レチキュロース（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ－０１１、ＡＬＴＵ－１４０、ＣＧＸ－１１６０、アンジオテンシン治療薬ワクチン、Ｄ－４Ｆ、ＥＴＣ－６４２、ＡＰＰ－０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ－０７（経口用、結核）、ＤＲＦ－７２９５、ＡＢＴ－８２８、ＥｒｂＢ２－特異性イムノトキシン（抗癌）、ＤＴ３ＳＳＩＬ－３、ＴＳＴ－１００８８、ＰＲＯ－１７６２、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、コレシストキニン－Ｂ／ガストリン－受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ－ｈＥＧＦ、ＡＥ－３７、トラスツズマブ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）－ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ－１２（組換え）、ＰＭ－０２７３４、ＩＭＰ－３２１、ｒｈＩＧＦ－ＢＰ３、ＢＬＸ－８８３、ＣＵＶ－１６４７（局所用）、Ｌ－１９ベース放射線免疫療法薬（癌）、Ｒｅ－１８８－Ｐ－２０４５、ＡＭＧ－３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（癌）、ＶＸ－００１、ＡＶＥ－９６３３、ＡＣ－９３０１、ＮＹ－ＥＳＯ－１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、
黒色腫ワクチン（パルス抗原治療薬）、前立腺癌ワクチン、ＣＢＰ－５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ－０６、ＡＰ－２１４、ＷＡＰ－８２９４Ａ（注射用）、ＡＣＰ－ＨＩＰ、ＳＵＮ－１１０３１、ペプチドＹＹ［３－３６］（肥満、鼻内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３－Ｆｃ、ＢＮ－００３、ＢＡ－０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１－３４（経鼻用、骨粗鬆症）、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＴ－１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ－００３、ＰＴＨ（７－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（点眼用、ドライアイ）、ＣＡＢ－２、ＣＴＣＥ－０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ－Ｆｃ、ＣＮＴＯ－５２８、ＡＭＧ－１１４、ＪＲ－０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ－９５１、７１６１５５、ＳＵＮ－Ｅ７００１、ＴＨ－０３１８、ＢＡＹ－７３－７９７７、テベレリクス（即時放出）、ＥＰ－５１２１６、ｈＧＨ（即時放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ－Ｉ、シフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ－８８９、Ｏｒｇ－４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ－９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン、Ｌ１９－ＩＬ－２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ－１５０、ＡＬＴＵ－１３９、ＥＮ－１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少障害）、ＡＬ－１０８、ＡＬ－２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ－３１７、ＣＧＸ－１００７、ＩＮＮＯ－１０５、経口用テリパラチド（ｅｌｉｇｅｎ）、ＧＥＭ－ＯＳ１、ＡＣ－１６２３５２、ＰＲＸ－３０２、ＬＦｎ－ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ－１０４３、Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ小児ワクチン、マラリアワクチン、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ－５９）、中耳炎療法、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１－３４）（経皮用、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ－１０１、ＰＧＮ－００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ）、ＢＩＭ－２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、癌ワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ－８０２４、ＧＩ－５００５、ＡＣＣ－００１、ＴＴＳ－ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（頬側用即時放出）、オネルセプト、もしくはＴＰ－９２０１、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ ＴＨＥＲＡ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグフィルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、または他の任意の好適なＰＯＩ（バイオシミラー及びバイオベターを含む）である。

【0129】

具体的な態様によれば、宿主細胞は、任意の動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、植物細胞、線虫細胞、無脊椎動物細胞（例えば、昆虫細胞もしくは軟体動物細胞）、上記のいずれかに由来する幹細胞、または真菌細胞もしくは酵母細胞であり得る。具体的には、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍからなる群より選択される属の細胞であり、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、もしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの細胞、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉもしくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのような糸状菌の細胞である。好ましくは、宿主細胞はメチロトローフ酵母、好ましくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。本明細書では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、全てのＫｏｍａｇａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、及びＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓに対し同義的に使用される。
具体的な態様によれば、宿主細胞は、以下のものである。

【0130】

ａ）Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍからなる群より選択される属の酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、及びＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属（例えば、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属（例えば、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、もしくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅの酵母細胞、または
ｂ）糸状菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉもしくはｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの細胞。

【0131】

Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種が好ましい。具体的には、宿主細胞は、ＣＢＳ ７０４、ＣＢＳ ２６１２、ＣＢＳ ７４３５、ＣＢＳ ９１７３－９１８９、ＤＳＭ Ｚ７０８７７、Ｘ－３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、及びＳＭＤ１１６８からなる群より選択されるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株である。

【0132】

供給源：ＣＢＳ ７０４（＝ＮＲＲＬ Ｙ－１６０３＝ＤＳＭＺ ７０３８２）、ＣＢＳ ２６１２（＝ＮＲＲＬ Ｙ－７５５６）、ＣＢＳ ７４３５（＝ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０）、ＣＢＳ ９１７３－９１８９（ＣＢＳ株：ＣＢＳ－ＫＮＡＷ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及びＤＳＭＺ ７０８７７（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の株、例えばＸ－３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、及びＳＭＤ１１６８。

【0133】

好ましいＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の例としては、Ｗ３０３、ＣＥＮ．ＰＫ、及びＢＹシリーズ（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦコレクション）が挙げられる。上記の株は全て、形質転換体を産生し異種遺伝子を発現するのに首尾よく使用されている。

【0134】

具体的な態様によれば、真核宿主細胞は、真菌細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（例えば、Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（例えば、Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（例えば、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ（例えば、Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ（例えば、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ（例えば、Ｍ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、Ｎｅｃｔｒｉａ（例えば、Ｎ．ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｎ．ｃｒａｓｓａ），Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｒｏｔｒｉｃｈｕｍ（Ｓ．好熱菌など）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ（例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ（例えば、Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、またはＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（例えば、Ｖ．ｄａｈｌｉａ））であり得る。

【0135】

具体的な態様によれば、哺乳類細胞は、ヒト、げっ歯類、またはウシの細胞、細胞系、または細胞株である。本明細書に記載される宿主細胞に適した具体的な哺乳類細胞の例は、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性、またはハイブリドーマ細胞系である。好ましくは、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞系である。１つの実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。１つの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。また、真核細胞には、鳥類の細胞、細胞系、または細胞株（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、またはＥＢｖｌ３）も含まれる。

【0136】

別の具体的な態様によれば、真核細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１－ＴＮ－５Ｂ１－４）、またはＢＴ１－Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えば、Ａｍｐｈｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ（シアノバクテリア）、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、またはＯｃｈｒｏｍｏｎａｓ属）、あるいは植物細胞（例えば、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、もしくはセタリア）由来の細胞、または双子葉植物（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、もしくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の細胞）である。

【0137】

具体的な態様によれば、宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）である。具体的には、宿主細胞は、グラム陽性細胞（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である。使用することができるＢａｃｉｌｌｕｓは、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｎａｔｔｏ、またはＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである。実施形態において、細胞はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ３ＮＡ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８）である。Ｂａｃｉｌｌｕｓは、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５６，４８４ Ｗｅｓｔ １２^ｔｈ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ＯＨ ４３２１０－１２１４から入手可能である。

【0138】

１つの実施形態において、原核細胞は、グラム陰性細胞、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えば、ＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、及びＯｒｉｇａｍｉ、ならびにＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株（例えば、ＢＬ－２１またはＢＬ２１（ＤＥ３））由来の細胞であり、これらは全て市販されている。

【0139】

具体的な実施形態によれば、原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなる群より選択される。

【0140】

好適な宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｉｔｉｏｎｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの培養コレクションから市販されている。

【0141】

具体的な態様によれば、本発明は、非メタノール炭素源によって調節可能または抑制可能なプロモーター（特定的には、本明細書に記載のＥＣＰ）の制御下で、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的遺伝子（ＧＯＩ）を発現する宿主細胞によって産生される当該ＰＯＩの収率を増加させる方法であって、当該宿主細胞にとって内在性である、配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子（特定的には、当該ＦＬＯ８タンパク質をコードする遺伝子）の発現を低下させることにより、当該ＰＯＩの収率を増加させる方法を提供する。

【0142】

具体的には、収率は、当該ＧＯＩを発現する比較可能な宿主細胞と比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１０．５倍、１１倍、１１．５倍、または１２倍のいずれか１つだけ増加し、
ａ）比較可能な宿主細胞は、内在性ＦＬＯ８タンパク質をコードする当該遺伝子の発現を低下させるように操作されていないか、または内在性ＦＬＯ８タンパク質をコードする当該遺伝子の発現が修飾されておらず、また任意選択的で
ｂ）当該ＧＯＩの発現を制御するプロモーターが、構成的プロモーター、特定的にはＧＡＰプロモーター、またはメタノール誘導性プロモーター、特定的にはＡＯＸ１プロモーターである。

【0143】

具体的には、本明細書に記載されるＰＯＩ産生の収率を増加させる方法は、本明細書でさらに記載されるように、組換え宿主細胞を用いる。

【0144】

さらなる具体的な態様によれば、本発明は、目的遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、目的遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するための条件下で、本明細書にさらに記載されるような組換え宿主細胞を培養することによって行う、方法を提供する。

【0145】

さらなる具体的な実施形態によれば、本発明は、ＰＯＩの産生のための本明細書に記載の宿主細胞の使用を提供する。

【0146】

具体的には、宿主細胞は、細胞培養物中で培養された細胞系、特定的には、産生宿主細胞系である。

【0147】

具体的な実施形態によれば、細胞系は、バッチ、流加バッチ、または連続培養条件の下で培養される。この培養は、マイクロタイタープレート、振とうフラスコ、またはバイオリアクターで実施することができ、任意選択で、第１ステップとしてバッチ段階で開始し、その後、第２ステップとして流加バッチフェーズまたは連続培養フェーズが続く。

【0148】

具体的には、当該方法は以下のステップ：
ａ）成長条件下で宿主細胞を培養することと、さらに
ｂ）最大１ｇ／Ｌの第２の非メタノール炭素源の存在下、成長制限条件下で宿主細胞を培養し、その結果当該ＧＯＩが発現して当該ＰＯＩが産生されること
とを含む。

【0149】

具体的には、第２のステップｂ）は、第１のステップａ）に続く。

【0150】

具体的には、第１の炭素源は、本明細書で基礎炭素源と呼ばれる非メタノール炭素源である。

【0151】

具体的には、宿主細胞は、第１の炭素源を含む細胞培養基中で、例えば、細胞培養で宿主細胞の成長を可能にするのに十分な量で、任意選択で炭素源の量が消費されるまで、成長条件下で第１のステップで培養され、さらなる培養は成長制限条件下にあり得る。

【0152】

具体的には、第２の炭素源は、本明細書で補充炭素源と呼ばれる非メタノール炭素源である。

【0153】

具体的には、当該第１及び／または第２のメタノール炭素源は、本明細書でさらに記載されるように、糖類、ポリオール、アルコール、または前述のいずれか１つ以上の混合物から選択される。

【0154】

具体的な実施形態によれば、基礎炭素源は補充炭素源とは異なり、例えば、量的及び／または質的に異なる。この量的な差異により、典型的には、プロモーター活性を抑制または抑制解除するための異なる条件がもたらされる。

【0155】

さらなる具体的な実施形態によれば、基礎炭素源及び補充炭素源は、同じタイプの分子または炭水化物を、好ましくは異なる濃度で含む。さらなる具体的な実施形態によれば、炭素源は、２つ以上の異なる炭素源の混合物である。

【0156】

任意のタイプの有機炭素源、特定的には宿主細胞培養、特定的には真核宿主細胞培養のために典型的に用いられるものを使用することができる。具体的な実施形態によれば、炭素源は、ヘキソース（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、もしくはマンノース）、二糖類（例えば、サッカロース）、アルコール（例えば、グリセロールもしくはエタノール）、またはこれらの混合物である。

【0157】

具体的に好ましい実施形態によれば、基礎炭素源は、グルコース、グリセロール、エタノール、またはこれらの混合物からなる群より選択される。好ましい実施形態によれば、基礎炭素源はグリセロールである。

【0158】

さらなる具体的な実施形態によれば、補充炭素源は、ヘキソース（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、及びマンノース）、二糖類（例えば、サッカロース）、アルコール（例えば、グリセロールもしくはエタノール）、またはこれらの混合物である。好ましい実施形態によれば、補充炭素源はグルコースである。

【0159】

具体的には、
ａ）基礎炭素源は、グルコース、グリセロール、エタノール、及びこれらの混合物からなる群より選択され、
ｂ）補充炭素源は、ヘキソース（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、もしくはマンノース）、二糖類（例えば、サッカロース）、アルコール（例えば、グリセロールもしくはエタノール）、または前述のうちのいずれかの混合物である。

【0160】

両方の培養するステップが、具体的に、当該炭素源の存在下で当該細胞系を培養することを含む。例えば、成長条件下での宿主細胞の当該培養（ステップａ）は基礎炭素源を用いて行われ、成長制限条件下での宿主細胞の当該培養（ステップｂ）は補充炭素源を用いて行われ、例えば、細胞培養基が最大１ｇ／Ｌを含むか、または培養中（ステップｂ）の細胞培養基または上清中に検出可能な量の補充炭素源が含まれないように制限された量で行われる。

【0161】

抑制解除（または誘導）条件は、好適には、具体的な手段によって達成され得る。第２のステップｂ）は、任意選択で、細胞培養基または上清中に補充炭素源を提供しないまたは制限量で提供するフィード培地を用いる。具体的には、フィード培地は化学規定のものであり、またメタノールを含まない。

【0162】

具体的には、第２のステップｂ）は、比成長率を０．０００１ｈ^－１～０．２ｈ^－１、好ましくは０．００５ｈ^－１～０．１５ｈ^－１の範囲内に維持するための成長制限量の補充炭素源を提供するフィード培地を用いる。

【0163】

フィード培地は、液体形態または別の代替形態（例えば、固体（例えば、錠剤もしくは他の徐放手段として）、または気体）で培養基に添加することができる。さらに、好ましい実施形態によれば、細胞培養基に添加される補充炭素源の制限量はゼロであってもよい。好ましくは、制限された炭素基質の条件下で、培養基中の補充炭素源の検出可能な濃度は、０～１ｇ／Ｌ、好ましくは０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｇ／Ｌ未満のいずれか１つ、好ましくは９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０ｍｇ／Ｌ未満のいずれか１つ、さらに９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１ｍｇ／Ｌ未満、または具体的には１～５０ｍｇ／Ｌ、もしくは１～１０ｍｇ／Ｌ未満、具体的には１ｍｇ／Ｌもしくはそれ以下であり、例えば、好適な標準アッセイで測定される検出限界未満、例えば、成長細胞培養物によって消費される際の培地中の残留濃度として定量される検出限界未満である。

【0164】

好ましい方法において、制限量の補充供給源は、産生フェーズの終わりの発酵ブロス、または（好ましくは発酵産物を収集する際の）発酵プロセスの産出物での定量において、検出限界未満の細胞培養物中残存量をもたらす。

【0165】

具体的には、当該ステップａ）の培養はバッチフェーズで実施され、当該ステップｂ）の培養は流加バッチまたは連続培養フェーズで実施される。

【0166】

具体的には、宿主細胞は、（成長条件下にある）ステップａ）の高成長率（例えば、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大成長率まで）フェーズ中には、基礎炭素源を含む炭素源豊富培地中で成長し、ステップｂ）の低成長率（例えば、最大成長率の９０％未満、好ましくは８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、または０．２％未満）フェーズ中には、炭素源を制限しながら、特定的には、産生フェーズで細胞培養物を維持する際に完全に消費される炭素源量のみを含む規定された最小培地を供給することにより、ＰＯＩを産生する。

【0167】

具体的には、ＰＯＩは、当該成長制限条件下で、例えば、細胞の最大成長率未満の成長率で、典型的には、細胞の最大成長率の９０％未満、好ましくは８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、または０．２％未満で細胞系を培養することにより、発現する。典型的には、最大成長率は、各タイプの宿主細胞に対し個別に定量される。

【0168】

具体的には、バッチフェーズは、最初に細胞培養に添加される基礎炭素源が細胞系によって消費されるまで実施される。溶存酸素（ＤＯ）スパイク法を使用してバッチフェーズ中の基礎炭素源消費量を定量することができる。

【0169】

具体的な実施形態によれば、バッチフェーズは酸素分圧（ｐＯ２）シグナルの連続的な減少によって特徴付けられ、バッチフェーズの終わりはｐＯ２の増加によって特徴付けられる。典型的には、バッチフェーズ中に基礎炭素源を消費しながら、かつバッチフェーズに典型的であるようにさらなる炭素源を追加することなく、酸素分圧（ｐＯ２）シグナルは、例えば６５％未満、例えば３０％まで連続的に減少する。基礎炭素源を消費すると、ｐＯ２は、例えば３０％超、例えば６５％超、またはそれ以上に増加し得、これは、炭素源制限条件下でさらなる炭素源を追加するためにフィード培地を用いて流加バッチ系に切り替えるための適切な時点を示す。

【0170】

具体的には、ｐＯ２は、バッチフェーズ中に６５％未満またはそれ以下の飽和度に減少し、続いてバッチの最後に６５％超またはそれ以上の飽和度に増加する。具体的には、バッチフェーズは、酸素分圧（ｐＯ２）シグナルの増加が６５％飽和度を超えるまで、具体的には７０％、７５％、８０％、または８５％のいずれかを超えるまで実施される。

【0171】

具体的には、バッチフェーズはおよそ１０～３６時間にわたって実施される。

【0172】

培養時間に対する「およそ」という用語は、＋／－５％または＋／－１０％を意味するものとする。

【0173】

例えば、およそ１０～３６時間の具体的なバッチ性能時間は、１８～３９．６時間、具体的には１９から３７．８時間とすることができる。

【0174】

具体的な実施形態によれば、バッチフェーズは、４０～５０ｇ／Ｌのグリセロール、具体的には４５ｇ／Ｌのグリセロールを基礎炭素源としてバッチ培地中で使用して行われ、培養は、２５℃でおよそ２７～３０時間、または３０℃でおよそ２３～３６時間、または２３～３６時間の培養時間中に２５℃から３０℃の間の任意の温度で実施される。バッチ媒体中のグリセロール濃度を低下させればバッチフェーズの長さが減少し、バッチ媒体中のグリセロールを増加させればバッチフェーズがさらに長くなるであろう。グリセロールの代替として、グルコースを、例えばほぼ同量で使用してもよい。

【0175】

典型的な細胞培養系及びＰＯＩ発現系では、バッチフェーズの後に流加バッチフェーズが続き、具体的には、流加バッチフェーズでの培養は、およそ１５～８０時間、およそ１５～７０時間、およそ１５～６０時間、およそ１５～５０時間、およそ１５～４５時間、およそ１５～４０時間、およそ１５～３５時間、およそ１５～３０時間、およそ１５～３５時間、およそ１５～２５時間、またはおよそ１５～２０時間のいずれか１つ、好ましくはおよそ２０～４０時間にわたって行われる。具体的には、流加バッチでの培養は、およそ８０時間、およそ７０時間、およそ６０時間、およそ５５時間、およそ５０時間、およそ４５時間、およそ４０時間、およそ３５時間、およそ３３時間、およそ３０時間、およそ２５時間、およそ２０時間、またはおよそ１５時間のいずれか１つにわたって行われる。

【0176】

ＰＯＩ産生の成功、及びそれによる高収率をもたらす１２０時間未満または１００時間未満または最大８０時間のいずれかの流加バッチ培養は、本明細書では、「高速発酵」と称される。具体的には、体積比産物形成率（ｒＰ）は、単位体積（Ｌ）及び単位時間（ｈ）当たりに形成される産物（ｍｇ）

【0177】

（ｍｇ（Ｌｈ）^－１）の量である。体積比産物形成率は、空間時間収率（ＳＴＹ）または体積生産性とも呼ばれる。

【0178】

具体的には、本明細書に記載の方法の流加バッチ培養は、およそ３０ｍｇ（Ｌｈ）^－１（３０ｍｇ（Ｌｈ）^－１＋／－５％または＋／－１０％を意味する）の時空収率が得られるように実施される。具体的には、およそ３０ｍｇ（Ｌｈ）^－１の時空収率は、およそ３０時間以内の供給バッチで達成され、具体的には、少なくとも２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３ｍｇ（Ｌｈ）－１のいずれか１つが、３３時間、３２時間、３１時間、３０時間、２９時間、２８時間、２７時間、２６時間、または２５時間未満のいずれか１つの供給バッチ時間で達成され得る。

【0179】

具体的には、バッチフェーズは第１のステップａ）として実施され、流加バッチフェーズは第２のステップｂ）として実施される。

【0180】

具体的には、第２のステップｂ）は、流加バッチフェーズにおいて、比成長率を０．０００１ｈ^－１～０．２ｈ^－１、好ましくは０．２、０．１５、０．１ｈ^－１、または０．１５ｈ^－１未満のいずれかの範囲内に維持するための成長制限量の補充炭素源を提供するフィード培地を用いる。

【0181】

具体的には、バッチ及び流加バッチ工程の両方を含む培養方法は、特定的には、酵母宿主細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属もしくはＰｉｃｈｉａ属もしくはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属のいずれかの酵母、またはＰｉｃｈｉａ以外の属由来の酵母、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、好ましくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用いることができる。

【0182】

さらなる具体的な態様によれば、本発明は、宿主細胞内で目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、以下のステップ：
ａ）配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように宿主細胞を遺伝子操作することと、
ｂ）当該宿主細胞に、発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）の制御下で、当該ＰＯＩをコードまたは発現する目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む異種性発現カセットを導入することであって、当該ＥＣＰが、当該ＧＯＩに作用可能に結合しており、かつ非メタノール炭素源によって調節可能または抑制可能である、導入することと、
ｃ）当該ＰＯＩを産生する条件下で当該宿主細胞を培養することと、
ｄ）任意選択で、当該細胞培養物から当該ＰＯＩを単離することと、
ｅ）任意選択で、当該ＰＯＩを精製することと
を含む、方法を提供する。

【0183】

具体的には、本明細書に記載の方法のステップａ）は、ステップｂ）の前、後、または同時に行われる。

【0184】

特定の態様によれば、宿主細胞は、ＰＯＩ産生のために操作する前に、最初に、当該ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログの発現を低下させるように遺伝子操作する。具体的な例によれば、野生型宿主細胞は、本明細書に記載の方法のステップａ）に従って遺伝子修飾される。具体的には、宿主細胞は、当該ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログを減少させるために、当該１つ以上の遺伝子修飾を野生型宿主細胞株に導入する際に提供される。

【0185】

さらなる態様によれば、宿主細胞は、当該ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログを減少させるためにさらに遺伝子修飾する前に、最初に、異種性または組換えＰＯＩを産生するように操作する。具体的な例によれば、野生型宿主細胞は、最初に、ＰＯＩ産生のための発現カセットを含むように操作することができる。次いで、このような操作宿主細胞をさらに修飾して、本明細書に記載のように、当該ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログを減少させることができる。

【0186】

さらなる態様によれば、宿主細胞は、例えば１つの方法ステップでは、１つ以上の反応混合物中でそれぞれの発現カセット、試薬、及びツールを用いて、ＰＯＩ産生のための操作と、当該ＦＬＯ８タンパク質またはそのそれぞれのホモログを減少させるための遺伝的修飾との両方を経る。

【0187】

具体的には、この方法は、本明細書でさらに記載されるように、組換え宿主細胞を産生するための方法ステップを用いる。

【0188】

具体的には、異種性発現カセットは、本明細書でさらに記載されるようなＥＣＰを含む。

【0189】

具体的には、ＰＯＩの産生は、宿主細胞を適切な培地で培養し、細胞を分離したら、発現したＰＯＩを細胞培養物から（特定的には、細胞培養物上清または培地から）単離し、発現した産物に適切な方法によってＰＯＩを精製する（特定的には、ＰＯＩを細胞から分離したら、好適な手段によって精製する）ことにより、行われ得る。これにより、精製したＰＯＩ調製物を産生することができる。

【図面の簡単な説明】

【0190】

【図1-1】図１は、本明細書で言及される配列である。

【図1-2】同上。

【図1-3】同上。

【図1-4】同上。

【図1-5】同上。

【図1-6】同上。

【図1-7】同上。

【図1-8】同上。

【図1-9】同上。

【図1-10】同上。

【図1-11】同上。

【図1-12】同上。

【図1-13】同上。

【図1-14】同上。

【図1-15】同上。

【発明を実施するための形態】

【0191】

本明細書全体において使用される具体的な用語は、以下の意味を有する。

【0192】

本明細書で使用する場合、「炭素源」（「炭素基質」とも称される）という用語は、発酵性炭素基質、典型的には、微生物のエネルギー源として適した供給源炭水化物（例えば、宿主生物または産生細胞系によって代謝可能なもの）、特定的には、単糖、オリゴ糖、多糖、グリセロールを含むアルコールからなる群より選択される供給源を意味するものとし、精製形態をとるか、最小培地に含まれるか、または原料（例えば、複合栄養物質）中に供給される。炭素源は、本明細書で記載されるように、単一の炭素源として、または異なる炭素源の混合物として使用され得る。

【0193】

非メタノール炭素源は、本明細書では、ある量のメタノール以外の任意の炭素源、特定的にはメタノールを含まない炭素源として理解される。

【0194】

本明細書に記載のように使用される「基礎炭素源」は、典型的には、細胞成長に適した炭素源であり、例えば、宿主細胞、特定的には真核細胞のための栄養素である。基礎炭素源は、培地（例えば、基礎培地または複合培地）中に供給され得るが、精製された炭素源を含む化学規定培地中にも供給され得る。基礎炭素源は、典型的には、細胞成長をもたらす量で、特定的には培養プロセスでの成長フェーズ中に供給して、例えば、少なくとも５ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、または少なくとも１５ｇ／Ｌ細胞乾燥重量の細胞密度を得、例えば、標準的な継代培養ステップの間に９０％超、好ましくは９５％超の生存率を示す。

【0195】

基礎炭素源は、典型的には、過剰量または余剰量で使用され、これは、例えば、高い比成長率を伴った細胞系の培養中に（例えば、バッチまたは流加バッチ培養プロセスでの細胞系の成長フェーズ中に）、バイオマスを増加させるためのエネルギーをもたらす過剰として理解される。この余剰量は、特定的には、測定可能であり、かつ制限量の補充炭素源を供給する間よりも典型的には少なくとも１０倍高い、好ましくは少なくとも５０倍または少なくとも１００倍高い発酵ブロス中の残留濃度を達成するために、（成長制限条件下で使用される）制限量の補充炭素源を上回る。

【0196】

本明細書で記載されるような「補充炭素源」は、典型的には、産生細胞系による発酵産物の産生を、特定的には培養プロセスの産生フェーズで促進する補充基質である。産生フェーズは、具体的には、例えばバッチ、流加バッチ、及び連続培養プロセスにおいて、成長フェーズに続く。補充炭素源は、具体的には、流加バッチプロセスの供給物に含まれてもよい。補充炭素源は、典型的には、炭素基質制限条件下、すなわち、制限量の炭素源を使用する細胞培養で用いられる。

【0197】

炭素源の「制限量」または「制限された炭素源」とは、本明細書では、特定的には最大成長率未満の制御された成長率を伴った培養プロセスにおいて、産生細胞系による発酵産物の産生を促進する炭素基質のタイプ及び量を具体的に指すものと理解される。産生フェーズは、具体的には、例えばバッチ、流加バッチ、及び連続培養プロセスにおいて、成長フェーズに続く。細胞培養プロセスは、バッチ培養、連続培養、及び流加バッチ培養を用いることができる。バッチ培養は、培地に少量のシード培養液を添加し、培養中に追加培地を添加することも培養溶液を排出させることもせずに細胞を成長させる培養プロセスである。連続培養は、培養中に培地を連続的に添加し排出させる培養方法である。連続培養には灌流培養も含まれる。流加バッチ培養は、バッチ培養及び連続培養の中間であり、セミバッチ培養とも称され、培養中に培地を連続的または継続的に添加する培養方法であるが、連続培養のように培養液を連続的に排出させることはない。

【0198】

具体的に好ましいのは、培養物への成長制限栄養素基質の供給に基づいた流加バッチプロセスである。単一流加バッチまたは反復流加バッチ発酵を含む流加バッチ戦略は、典型的には、バイオリアクター内で高い細胞密度に到達するために、バイオ産業プロセスで使用されている。炭素基質の制御された添加は、培養物の成長率に直接影響を及ぼし、オーバーフロー代謝または望ましくない代謝副産物の形成を回避するのに役立つ。炭素源制限条件下では、炭素源は、具体的には、流加バッチプロセスの供給物に含まれてもよい。これにより、炭素基質が制限量で供給される。

【0199】

また、本明細書で記載されるようなケモスタットまたは連続培養においても、成長率を厳密に制御することができる。

【0200】

炭素源の制限量は、本明細書では、特定的には、産生細胞系を成長制限条件下で、例えば産生フェーズまたは産生モードで維持するために必要な炭素源の量として理解される。このような制限量は流加バッチプロセスで用いられ得、このとき、炭素源はフィード培地中に含まれ、例えばＰＯＩを産生するため、低いフィード率で培養物に補充して持続的にエネルギーを送達し、低い比成長率でバイオマスを維持する。フィード培地は、典型的には、細胞培養の産生フェーズ中に発酵ブロスに添加する。

【0201】

炭素源の制限量は、例えば、細胞培養ブロス中の炭素源の残存量によって定量することができ、これは所定の閾値未満か、または標準（炭水化物）アッセイでの測定における検出限界未満ですらある。残存量は、典型的には、発酵産物を収集する際に発酵ブロス中で定量される。

【0202】

炭素源の制限量は、例えば、全培養プロセス（例えば、流加バッチフェーズ）にわたって追加された培養時間当たりの量による定量における、発酵槽への炭素源の平均供給率を規定することによっても定量することができ、時間当たりの計算された平均量を定量する。この平均供給率は、細胞培養による補充炭素源の完全な使用を確実にするために低く維持され、例えば、０．６ｇＬ^－１ｈ^－１（Ｌ初期発酵体積及びｈ時間当たりの炭素源ｇ）から２５ｇＬ^－１ｈ^－１の間、好ましくは１．６ｇＬ^－１ｈ^－１から２０ｇＬ^－１ｈ^－１の間である。

【0203】

また、炭素源の制限量は、比成長率を測定することによっても定量することができ、比成長率は、産生フェーズ中に、例えば最大比成長率よりも低く維持され、例えば所定の範囲内で、例えば０．００１ｈ^－１～０．２０ｈ^－１、または０．００５ｈ^－１～０．２０ｈ^－１、好ましくは０．０１ｈ^－１～０．１５ｈ^－１の範囲で維持される。

【0204】

具体的には、フィード培地は化学規定であり、かつメタノールを含まない。

【0205】

細胞培養基（例えば、最小培地または流加バッチプロセスにおけるフィード培地）に対する「化学規定」という用語は、産生細胞系のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養に適し、全ての化学的な構成成分及び（ポリ）ペプチドが既知の培養基を意味するものとする。典型的には、化学規定培地は、動物由来構成成分を全く含まず、純粋で安定した細胞培養環境に相当する。

【0206】

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、単一細胞、単一細胞クローン、または宿主細胞の細胞系を指す。

【0207】

本明細書で使用する場合、「細胞系」という用語は、長期間にわたり増殖する能力を獲得した特定の細胞タイプの確立されたクローンを指す。細胞系は、典型的には、内在性または組換え遺伝子、または代謝経路の産物を発現させて、このようなポリペプチドによって媒介されるポリペプチドまたは細胞代謝産物を産生するために使用される。「産生宿主細胞系」または「産生細胞系」は、一般的には、産生プロセスの産物（例えば、ＰＯＩ）を得るためにバイオリアクターでの細胞培養にすぐに使用できる細胞系であることが理解されている。

【0208】

本明細書で記載されるようなＰＯＩを産生する宿主細胞は「産生宿主細胞」、それぞれの細胞系は「産生細胞系」とも称される。

【0209】

本明細書で記載される具体的な実施形態は、ＦＬＯ８タンパク質をコードする内在性遺伝子を過小発現するように操作されている、かつ／またはこのような遺伝子の発現が低下している産生細胞系を指し、当該実施形態は、炭素源調節可能プロモーター（例えば、本明細書に記載のＥＣＰ）、特定的には、細胞培養物にメタノールを添加する必要なしに誘導され得るプロモーターの制御下でＰＯＩ産生の収率が高いことを特徴とする。このような宿主細胞は、顕著に形態を変化させることなく安定的にＰＯＩを発現していることが分かった。

【0210】

「宿主細胞」という用語は、特定的には、ＰＯＩまたは宿主細胞代謝産物を産生するための組換え目的で好適に使用される任意の真核または原核の細胞または生物に適用するものとする。「宿主細胞」という用語にヒトが含まれないことは十分に理解されている。具体的には、本明細書に記載の宿主細胞は、人工的な生物及びネイティブ（野生型）宿主細胞の派生物である。本明細書に記載の宿主細胞、方法、及び使用（例えば、具体的には、１つ以上の遺伝子修飾、異種性発現カセットまたは構築物、形質移入または形質転換された宿主細胞及び組換えタンパク質を指す）が、天然に存在しない「人工」または合成のものであり、そのため「自然法則」の結果とみなされないことは十分に理解されている。

【0211】

宿主細胞に対し本明細書で使用する場合、「細胞培養」または「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」または「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」という用語は、人工的な（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの）環境で、細胞の増殖、分化、または持続的な生存に有利な条件下で、活性状態または休止状態で、特定的には、業界で知られている方法に従った制御されたバイオリアクター内で、細胞を維持することを指す。

【0212】

適切な培養基を用いて細胞培養物を培養する際に、細胞培養物中での細胞の培養を支持するのに適した条件下で、細胞を培養容器中の培地または基質と接触させる。本明細書で記載されるように、宿主細胞、例えば、真核細胞、具体的には酵母または糸状菌の成長のために使用され得る培養基が提供される。標準的な細胞培養技法は、当技術分野で周知されている。

【0213】

本明細書に記載の細胞培養物は、特定的には、例えば、細胞培養基中のＰＯＩを得るために、分泌ＰＯＩを産生させる技法を用いる。分泌ＰＯＩは細胞バイオマス（本明細書では「細胞培養上清」と称される）から分離可能であり、精製してより高い純度でＰＯＩを得ることができる。本明細書では、細胞培養物中で宿主細胞によってタンパク質（例えば、ＰＯＩ）が産生及び分泌される際、このようなタンパク質が、細胞培養物上清中に分泌され、そして、宿主細胞バイオマスから細胞培養上清を分離し、任意選択でさらにタンパク質を精製して精製タンパク質調製物を産生することにより得られ得ることが理解される。

【0214】

細胞培養基は、制御された人工的なｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で細胞を維持し成長させるために必要な栄養素を提供する。細胞培養基の特徴及び組成は、特定的な細胞要件に応じて変化する。重要なパラメーターとしては、浸透圧、ｐＨ、及び栄養配合物が挙げられる。栄養素の供給は、当技術分野で知られている方法に従って、連続的または非連続的様式で行うことができる。

【0215】

バッチプロセスが、細胞の培養に必要な全ての栄養素が最初の培養基に含まれる細胞培養様式であり、発酵中にさらなる栄養素を追加的に補充することはないのに対し、流加バッチプロセスでは、バッチフェーズの後に流加によって１つ以上の栄養素が培養物に補充される流加フェーズが生じる。ほとんどのプロセスにおいて、供給様式は決定的かつ重要であるが、本明細書に記載の宿主細胞及び方法は、細胞培養のある特定の様式に関して制限を受けない。

【0216】

組換えＰＯＩは、本明細書に記載の宿主細胞及びそれぞれの細胞系を用いて、適切な培地中で培養し、発現した産物または代謝産物を培養物から単離し、任意選択で、それを好適な方法によって精製することにより、産生することができる。

【0217】

本明細書で記載されるようなＰＯＩ産生のためのいくつかの異なるアプローチが好ましい。ＰＯＩの発現、処理、及び任意選択による分泌は、関連タンパク質をコードする組換えＤＮＡを有する発現ベクターを用いて宿主細胞に対し形質移入または形質転換し、形質移入または形質転換された細胞の培養物を調製し、培養物を成長させ、転写及びＰＯＩ産生を誘導し、ＰＯＩを回収することにより、行うことができる。

【0218】

ある特定の実施形態において、細胞培養プロセスは流加バッチプロセスである。具体的には、所望の組換えＰＯＩを産生させるには、所望の組換えＰＯＩをコードする核酸コンストラクトで形質転換した宿主細胞を成長フェーズにおいて培養して産生フェーズに移行させる。

【0219】

別の実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞は、連続的様式で、例えば、ケモスタットを用いて培養される。連続的発酵プロセスは、バイオリアクター内に新鮮な培養基を規定された一定の連続的比率で供給することを特徴とし、それにより、培養ブロスは、同じ規定された一定かつ連続的な除去率で同時にバイオリアクターから除去される。培養基、供給率、及び除去率を同じ一定レベルに保つことにより、バイオリアクター内の細胞培養パラメーター及び条件が一定に保たれる。

【0220】

本明細書に記載の安定した細胞培養物は、遺伝的特性を維持し、具体的には、ＰＯＩ産生レベルを約２０世代の培養後も、好ましくは少なくとも３０世代、より好ましくは少なくとも４０世代、最も好ましくは少なくとも５０世代の培養後であっても、例えば少なくともμｇレベルに維持する細胞培養物を指すことが具体的に理解される。具体的には、工業規模生産向けに使用される際に大きな利点と考えられる、安定した組換え宿主細胞系がもたらされる。

【0221】

本明細書に記載の細胞培養は、栄養素の供給に基づく培養モード、特に、流加バッチまたはバッチプロセス、または連続的または半連続的プロセス（例えば、ケモスタット）と組み合わせた、例えば容量及び技術的システムの両方に関して、工業的製造スケールでの方法に特に有利である。

【0222】

本明細書に記載の宿主細胞は、典型的には、ＰＯＩ産生のためのＧＯＩの発現能力について試験され、以下の試験のいずれかによってＰＯＩ収率が試験される：ＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣ、または他の好適な試験、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング技法、または質量分析。

【0223】

遺伝子修飾が、それぞれの細胞培養物中でのＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子の過小発現または減少に及ぼす効果や、例えばＰＯＩ産生に及ぼす効果を定量するために、宿主細胞系は、マイクロタイタープレート、振とうフラスコ、またはバイオリアクター内で流加バッチまたはケモスタット発酵を用いて培養し、それぞれの細胞内にこのような遺伝子修飾を伴わない株と比較することができる。

【0224】

本明細書に記載の産生方法は、具体的には、パイロットスケールまたは工業スケールでの発酵を可能にする。好ましくは、工業プロセススケールは、少なくとも１０Ｌ、具体的には少なくとも５０Ｌ、好ましくは少なくとも１ｍ^３、好ましくは少なくとも１０ｍ^３、最も好ましくは少なくとも１００ｍ^３の体積を用いる。

【0225】

工業的規模での製造条件が好ましく、これは例えば、数日の典型的な処理時間を用いる１００Ｌ～１０ｍ^３またはそれ以上のリアクター容積での流加バッチ培養法、または約０．０２～０．１５ｈ^－１の希釈率を伴う約５０～１０００Ｌまたはそれ以上の発酵槽容積での連続的プロセスを指す。

【0226】

本明細書に記載の目的のために使用されるデバイス、設備、及び方法は、原核及び／または真核細胞系を含む任意の所望の細胞系の培養で及び培養と共に使用するのに特に適している。さらに、実施形態において、デバイス、設備、及び方法は、浮遊細胞または足場依存性（接着性）細胞を含む任意の細胞タイプを培養するのに適しており、医薬製品及びバイオ医薬製品（例えば、ポリペプチド産物（ＰＯＩ）、核酸産物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または細胞及び／もしくはウイルス（例えば、細胞及び／もしくはウイルス療法で使用されるもの））を生産するために構成される生産運用に適している。

【0227】

ある特定の実施形態において、細胞は、組換え治療製品または診断用製品などの製品を発現または産生する。本明細書でさらに詳細に記載されるように、細胞によって産生される製品の例としては、限定されるものではないが、本明細書で例示されるようなＰＯＩが挙げられ、これには抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体ミメティック（抗原に特異的に結合するが構造的に抗体に関連しないポリペプチド分子、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチン、もしくはＩｇＮＡＲ）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラ型サイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、またはウイルス治療薬（例えば、抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法及びウイルス免疫療法向けのウイルスベクター）、細胞治療薬（例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、及び成人幹細胞）、ワクチンもしくは脂質カプセル化粒子（例えば、エクソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）もしくはＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）、抗生剤、またはアミノ酸が含まれる。実施形態において、デバイス、設備、及び方法は、バイオシミラーを生産するために使用され得る。

【0228】

前述のように、ある特定の実施形態において、デバイス、設備、及び方法は、真核細胞、例えば哺乳類細胞もしくは下等真核細胞（例えば、酵母細胞もしくは糸状菌細胞）、または原核細胞（例えばグラム陽性細胞もしくはグラム陰性細胞）、及び／または真核細胞もしくは原核細胞の産物（例えば、タンパク質、ペプチド、もしくは抗生物質、アミノ酸、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を含むＰＯＩ）の産生を可能にし、これらは大規模な方式で当該細胞によって合成される。本明細書に別段の記載がない限り、デバイス、設備、及び方法は、限定されるものではないが、ベンチスケール、パイロットスケール、及びフル生産スケール能力を含む任意の所望のボリュームまたは生産能力を含むことができる。

【0229】

さらに、本明細書に別段の記載がない限り、デバイス、設備、及び方法は、限定されるものではないが、撹拌タンク、エアリフト、繊維、マイクロファイバー、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、及び／または噴流床バイオリアクターを含む任意の好適なリアクターを含むことができる。本明細書で使用する場合、「リアクター」には、発酵槽もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含まれ得、「リアクター」という用語は「発酵槽」と互換的に使用される。例えば、いくつかの態様において、例示的なバイオリアクターユニットは、以下の１つ以上、または全てを実施することができる：栄養素及び／もしくは炭素源の供給、適切なガス（例えば、酸素）の注入、発酵または細胞培養基の流入口及び流出口、気相及び液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））、ならびに／または洗浄／滅菌。発酵ユニットなどの例示的なリアクターユニットは、ユニット内に複数のリアクターを収容することができ、例えば、ユニットは、各ユニット内に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００以上のバイオリアクターを有し得、かつ／または設備は、施設内に１つまたは複数のリアクターを有する複数のユニットを収容することができる。様々な実施形態において、バイオリアクターは、バッチ、半流加バッチ、流加バッチ、灌流、及び／または連続発酵プロセスに適し得る。任意の好適なリアクター直径を使用することができる。実施形態において、バイオリアクターは、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの容積を有することができる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５０００リットル、２００００リットル、及び／または５００００リットルの容積が挙げられる。加えて、好適なリアクターは、複数回使用、単回使用、使い捨て、または非使い捨てであり得、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌまたは他の任意の好適なステンレス鋼）及びインコネル、プラスチック、及び／またはガラスなどの金属合金を含む任意の好適な材料で形成され得る。

【0230】

実施形態において、及び本明細書中で別段の記載がない限り、本明細書に記載のデバイス、設備、及び方法は、他に言及されない任意の好適なユニット運用及び／または装置、例えば、このような産物を分離、精製、及び単離するための運用及び／または装置も含み得る。任意の好適な設備及び環境、例えば、伝統的な現場組立て設備、モジュール式、移動式、及び一時的設備、または他の任意の好適な構造、設備、及び／またはレイアウトを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、モジュール式クリーンルームを使用することができる。加えて、別段の明記がない限り、本明細書に記載のデバイス、システム、及び方法は、１つの位置または設備に収容及び／または実施することができ、あるいは代替的に、別個のまたは複数の位置及び／または設備に収容及び／または実施することができる。

【0231】

好適な技法は、バッチフェーズで開始し、次いで高い比成長率の短い指数関数的流加バッチフェーズが続き、さらに、低い比成長率の流加バッチフェーズが続く、バイオリアクター内での培養を包含し得る。別の好適な培養技法は、バッチフェーズと、それに続く流加バッチフェーズであって、任意の好適な比成長率または比成長率の組合せ（例えば、ＰＯＩ産生時間にわたって高い成長率から低い成長率へ、またはＰＯＩ産生時間にわたって低い成長率から高い成長率へと進む）で行う流加バッチフェーズとを包含し得る。別の好適な培養技法は、バッチ相と、それに続く低希釈率で行う連続培養相とを包含し得る。

【0232】

好ましい実施形態は、バイオマスを提供するためのバッチ培養と、それに続く高収率のＰＯＩ産生のための流加バッチ培養とを含む。

【0233】

本明細書に記載の宿主細胞は、少なくとも１ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、または８０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量のいずれか１つの細胞密度を得るための成長条件下でバイオリアクター内で培養することが好ましい。このようなバイオマス産生の収量をパイロット規模または工業規模で提供することは有利である。

【0234】

バイオマスの蓄積を可能にする成長培地、具体的には基礎成長培地は、典型的には、炭素源、窒素源、硫黄源、及びリン酸源を含む。典型的には、このような培地はさらに、微量元素及びビタミンを含み、さらに、アミノ酸、ペプトン、または酵母抽出物を含むことができる。

【0235】

好ましい窒素源としては、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、またはＮＨ_３、または（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４が挙げられる。
好ましい硫黄源としては、ＭｇＳＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、またはＫ_２ＳＯ_４が挙げられる。
好ましいリン酸源としては、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、またはＨ_３ＰＯ_４、またはＮａＨ_２ＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、またはＫ_２ＨＰＯ_４が挙げられる。
さらなる典型的な培地構成成分としては、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２、及び以下のような微量元素が挙げられる：Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｉ、Ｂ。
好ましくは、培地にはビタミンＢ_７が補充される。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのための典型的な成長培地は、グリセロール、ソルビトール、またはグルコース、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２、ビオチン、及び微量元素を含む。

【0236】

産生フェーズでは、産生媒体は、具体的には、限られた量の補充炭素源のみを用いて使用される。

【0237】

好ましくは、宿主細胞株は、好適な炭素源を有する無機質培地中で培養され、それによって単離プロセスが顕著に簡略化される。好ましい無機質培地の例は、利用可能な炭素源（例えば、グルコース、グリセロール、またはソルビトール）、多量元素（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸、リン酸）及び微量元素（銅、ヨウ化物、マンガン、モリブデン酸、コバルト、亜鉛、及び鉄の塩、ならびにホウ酸）を含む塩、ならびに任意選択で（例えば、栄養要求性を補完するための）ビタミンまたはアミノ酸を含む培地である。

【0238】

具体的には、細胞は、所望のＰＯＩの発現をもたらすのに適した条件下で培養され、ＰＯＩは、発現系及び発現したタンパク質の性質に応じて、例えば、タンパク質がシグナルペプチドと融合しているか、及びタンパク質が可溶性であるか膜結合であるかに応じて、細胞または培養基から精製することができる。当業者によって理解されるであろうように、培養条件は、宿主細胞のタイプ及び用いられる特定的な発現ベクターを含む因子に応じて変化する。

【0239】

典型的な産生培地は、補充炭素源と、さらにＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＫＣl、ＣａＣl_２、ビオチン、及び微量元素とを含む。

【0240】

例えば、発酵に添加される補充炭素源のフィードは、最大５０ｗｔ％の利用可能な糖を含む炭素源を含むことができる。

【0241】

発酵は、好ましくは３～８の範囲のｐＨで行われる。

【0242】

典型的な発酵時間は、２０℃～３５℃、好ましくは２２～３０℃の範囲の温度で約２４～１２０時間である。

【0243】

ＰＯＩは、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌの収率をもたらす条件を用いて発現させることが好ましい。

【0244】

本明細書で使用する場合、「発現」または「発現カセット」という用語は、作用可能な結合で所望のコード配列及び制御配列を含む核酸分子を指し、このような配列を用いた形質転換または形質移入された宿主は、コードされたタンパク質または宿主細胞代謝産物を産生可能である。形質転換をもたらすには、発現系をベクターに含めることができるが、関連するＤＮＡを宿主細胞染色体に組み込むこともできる。発現とは、ポリペプチドまたは代謝産物を含む分泌されたまたは分泌されていない発現産物を指す。

【0245】

発現カセットは、発現コンストラクトとして、例えば、「ベクター」または「プラスミド」の形態で好都合に提供され、これは典型的には、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写や、好適な宿主生物内でのそのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列である。発現ベクターまたはプラスミドは、通常は、宿主細胞内での自律複製のための供給源またはゲノム組込みのための座位、選択マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子または抗生物質（例えば、ｚｅｏｃｉｎ、カナマイシン、Ｇ４１８またはハイグロマイシン、ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与する遺伝子）、複数の制限酵素切断部位、好適なプロモーター配列、及び転写ターミネーターを含み、これらの構成成分は共に作用可能に結合している。本明細書で使用する場合、「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、自律的に複製するヌクレオチド配列及びゲノム組込みヌクレオチド配列（例えば、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ））を包む。

【0246】

発現ベクターとしては、限定されるものではないが、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、及び特異的に設計されたプラスミドを挙げることができる。本明細書に記載の好ましい発現ベクターは、真核宿主細胞内で組換え遺伝子を発現させるのに適した発現ベクターであり、これは宿主生物に応じて選択される。適切な発現ベクターは、典型的には、真核宿主細胞内でＰＯＩをコードするＤＮＡを発現させるのに適した調節配列を含む。調節配列の例としては、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ならびに転写及び翻訳の開始及び終結を制御する配列が挙げられる。調節配列は、典型的には、発現対象のＤＮＡ配列に作用可能に結合している。

【0247】

宿主細胞内での組換えヌクレオチド配列の発現を可能にするために、本明細書に記載の発現カセットまたはベクターは、ＰＯＩの発現及び分泌を促進するためにＥＣＰ、典型的にはコード配列の５’末端に隣接するプロモーターヌクレオチド配列を含む（例えば、目的遺伝子（ＧＯＩ）の上流で隣接し、またはシグナルもしくはリーダー配列が使用される場合は、それぞれ当該シグナル及びリーダー配列の上流で隣接する）。プロモーター配列は、典型的には、下流のヌクレオチド配列の転写を調節及び開始するものであり、これ（特定的にはＧＯＩを含む）に対し、作用可能に結合している。

【0248】

本明細書に記載の具体的な発現コンストラクトは、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作用可能に結合したプロモーターを含み、当該ＰＯＩは当該プロモーターの転写制御下にある。具体的には、プロモーターは、ＰＯＩのコード配列とネイティブには会合していない。

【0249】

本明細書に記載の具体的な発現コンストラクトは、宿主細胞からのＰＯＩの分泌を引き起こすリーダー配列に結合したＰＯＩをコードするポリヌクレオチドを含む。発現ベクター内でこのような分泌リーダー配列の存在が必要とされるのは、典型的には、組換え発現及び分泌が意図されているＰＯＩが天然には分泌されないため、天然の分泌リーダー配列が欠如したタンパク質であるとき、またはそのヌクレオチド配列が、その天然の分泌リーダー配列なしにクローニングされたときである。概して、宿主細胞からのＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効な任意の分泌リーダー配列が使用され得る。分泌リーダー配列は、酵母源、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＦａなどの酵母α－因子、または酵母ホスファターゼ、哺乳類もしくは植物起源、またはその他のものから生じ得る。

【0250】

具体的な実施形態において、マルチクローニング部位を有するベクターであるマルチクローニングベクターが使用され得る。具体的には、所望の異種性遺伝子をマルチクローニング部位に組み込むかまたは取り込んで発現ベクターを調製することができる。マルチクローニングベクターの場合、プロモーターは典型的にはマルチクローニング部位の上流に配置される。

【0251】

本明細書に記載の組換え宿主細胞は、具体的には、宿主細胞の内在性ＦＬＯ８タンパク質または宿主細胞内のそれぞれのホモログもしくはオルソログの量を減少させるように操作され、これは特定的には、それぞれのコード遺伝子配列の発現を低下させて遺伝子を過小発現させることによって行う。

【0252】

本明細書で使用する場合、「遺伝子発現」または「ポリヌクレオチドの発現」という用語は、ｍＲＮＡへのＤＮＡ転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡ成熟、ｍＲＮＡ輸送、翻訳、タンパク質折畳み及び／またはタンパク質運搬からなる群より選択される少なくとも１つのステップを包含するように意図されている。

【0253】

「発現を低下させる」という用語は、典型的には「過小発現させること」を指し、概して、参照標準物質によって示される発現レベルよりも低い任意の量を指す。参照標準物質とは、ある特定のポリヌクレオチドの発現を低下させるように操作する前の宿主細胞であるか、または当該ポリヌクレオチドの発現を低下させるように操作されていない同じタイプまたは種の宿主細胞内で別の方法で発現させたものである。本明細書に記載の発現低下とは、規定されたＦＬＯ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子、特定的には、操作前に宿主細胞にとって内在性である遺伝子を指す。特定的には、それぞれの遺伝子産物は、本明細書に記載のように規定されたＦＬＯ８タンパク質である。遺伝子修飾によって宿主細胞を操作して当該遺伝子の発現を低下させると、当該遺伝子産物またはポリペプチドの発現は、宿主細胞を遺伝子修飾する前のまたは遺伝子修飾されていない同等の宿主内での同じ遺伝子産物またはポリペプチドの発現よりも低いレベルとなる。「～未満」には、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が含まれる。遺伝子産物またはポリペプチドの発現が全くないことも、「発現低下」または「過小発現」という用語によって包含される。

【0254】

本明細書に記載の具体的な実施形態によれば、宿主細胞は、ＦＬＯ８タンパク質（本明細書で定義されるように、例えば、それぞれのホモログまたはオルソログを含む）をコードする内在性宿主細胞遺伝子、または当該ＦＬＯ８タンパク質を発現または産生する宿主細胞の能力を付与する他の（コードまたは非コード）ヌクレオチド配列を、（遺伝子またはその一部の不活性化または欠失のために）ノックダウンまたはノックアウトするように操作される。

【0255】

具体的には、ヌクレオチド配列が破壊された欠失株が提供される。

【0256】

本明細書で使用する場合、「破壊する」という用語は、（例えば、ノックダウンまたはノックアウトによる）宿主細胞内の１つ以上の内在性タンパク質の発現の顕著な低下から完全な除去までを指す。これは、例えば、質量分析により、宿主細胞の細胞培養物または培養基中におけるこの１つ以上の内在性タンパク質の存在として測定することができ、このとき、内在性タンパク質の総含量は閾値未満または検出不可能であり得る。

【0257】

「破壊」という用語は、具体的には、遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、ドミナントネガティブコンストラクトの送達、条件付き遺伝子ノックアウト、及び／または特定の遺伝子に対する遺伝子修飾からなる群より選択される少なくとも１つのステップによる遺伝子操作の結果を指す。

【0258】

本明細書で使用される遺伝子発現の文脈における「ノックダウン」、「低下」、または「枯渇」という用語は、対照細胞における発現と比較して所与の遺伝子の発現低下をもたらす実験的アプローチを指す。遺伝子のノックダウンは、様々な実験的手段により、例えば、遺伝子のｍＲＮＡの一部とハイブリダイズして分解をもたらす核酸分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ）を細胞に導入すること、または転写の低下、ｍＲＮＡ安定性の低下、もしくはｍＲＮＡ翻訳の減少をもたらす方法で遺伝子の配列を改変することにより、達成することができる。

【0259】

所与の遺伝子の発現を完全に阻害することは、「ノックアウト」と称される。遺伝子のノックアウトとは、当該遺伝子から機能的転写産物が合成されず、この遺伝子によって正常に提供される機能が失われることを意味する。遺伝子ノックアウトは、ＤＮＡ配列を改変することによって達成され、遺伝子もしくはその調節配列、またはこのような遺伝子もしくは調節配列の一部の破壊または欠失をもたらす。ノックアウト技術には、重要な部分もしくは遺伝子配列全体を置換、中断、もしくは削除するための相同組換え技法の使用、または標的遺伝子のＤＮＡに二重鎖切断を導入するためのＤＮＡ修飾酵素（例えば、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼ）の使用が含まれる（例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（７）：３９７－４０５によって説明されている）。

【0260】

具体的な実施形態は、宿主細胞を形質転換または形質移入する１つ以上のノックアウトプラスミドまたはカセットを用いる。相同組換えにより、宿主細胞内の標的遺伝子を破壊することができる。この手順は、典型的には、標的遺伝子の全てのアレルが安定的に除去されるまで繰り返される。

【0261】

本明細書に記載の具体的な遺伝子をノックアウトするための１つの具体的な方法は、例えば、Ｗｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６，２３５：１３９－４９）で説明されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法である。別の方法としては、例えば、Ｈｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．２０１３（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９７（３）：１２４１－９）によって説明されているようなスプリットマーカーアプローチが挙げられる。

【0262】

別の実施形態は、宿主細胞を形質移入するために低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用し、当該宿主細胞によって内在的に発現した標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的化することによる、標的ｍＲＮＡ分解を指す。

【0263】

遺伝子の発現は、遺伝子発現を直接的に妨害する方法によって阻害または低下させることができ、このような方法には、限定されるものではないが、（例えば、特異的プロモーター関連リプレッサーの使用による、所与のプロモーターの部位特異的変異誘発による、プロモーター交換による）ＤＮＡ転写の阻害もしくは低下、または（例えば、ＲＮＡｉもしくは非コードＲＮＡ誘導転写後遺伝子サイレンシングによる）翻訳の阻害もしくは低下が含まれる。活性が低下した機能不全または不活性の遺伝子産物の発現は、例えば、コード遺伝子内の部位特異的またはランダムな変異誘発、挿入、または欠失によって達成され得る。

【0264】

遺伝子産物の活性の阻害または低下は、例えば、タンパク質発現の前またはそれと同時に、それぞれの酵素に対する阻害剤を投与するか、またはそれとインキュベートすることにより、達成することができる。このような阻害剤の例としては、限定されるものではないが、当該酵素に対する阻害性ペプチド、抗体、アプタマー、融合タンパク質、もしくは抗体ミメティック、またはこれらのリガンドもしくは受容体、あるいは同様の結合活性を有する阻害性ペプチドもしくは核酸、または小分子が挙げられる。

【0265】

遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウン、及び遺伝子ノックアウトとは、遺伝子の発現を低下させる技法を指し、遺伝子修飾を介して、またはｍＲＮＡ転写物もしくは遺伝子のいずれかに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドで処置することによって行われる。ＤＮＡの遺伝子修飾が行われれば、その結果はノックダウンまたはノックアウト生物である。遺伝子発現の変化が、オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡに結合するか、または一時的に遺伝子に結合することによって引き起こされる場合、染色体ＤＮＡの修飾なしに遺伝子発現の一時的な変化がもたらされ、これは一過性ノックダウンと称される。

【0266】

上記の用語にも包含される一過性のノックダウンにおいて、このオリゴヌクレオチドの活性遺伝子またはその転写物への結合は、転写のブロック（遺伝子結合の場合）、（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡによる）ｍＲＮＡ転写物の分解、またはｍＲＮＡ翻訳のブロックを介して、発現の減少を引き起こす。

【0267】

遺伝子サイレンシング、ノックダウン、またはノックアウトを行うための他のアプローチは、それぞれの文献から当業者に知られており、本発明の文脈でこれらを適用することは通例的なものとみなされる。遺伝子ノックアウトとは、遺伝子の発現が完全にブロックされる（すなわち、それぞれの遺伝子が作用しない、または除去すらされる）技法を指す。この目標を達成するための方法論的アプローチは多様であり、当業者には知られている。例としては、所与の遺伝子に対しドミナントネガティブである変異体の産生がある。このような変異体は、部位特異的変異誘発（例えば、欠失、部分欠失、挿入、または核酸置換）により、好適なトランスポゾンの使用により、またはそれぞれの文献から当業者に知られている他のアプローチによって産生することができ、従って、本発明の文脈でこれらを適用することは通例的なものとみなされる。１つの例は、標的化ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用によるノックアウトである。それぞれのキットは、「ＣｏｍｐｏＺＲノックアウトＺＦＮ」としてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって提供される。別のアプローチは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を包含する。

【0268】

ドミナントネガティブコンストラクトの送達は、例えば、トランスフェクションによって、機能不全な遺伝子発現産物をコードする配列を導入することを伴う。当該コード配列は、機能不全性酵素の遺伝子発現が遺伝子発現産物の自然な発現を無効にし、ひいては当該遺伝子発現産物のそれぞれの活性の有効な生理学的欠損をもたらすような方法で、強力なプロモーターに機能的に連結される。

【0269】

条件付き遺伝子ノックアウトは、組織特異的または時間特異的な方式で遺伝子発現をブロックすることを可能にする。これは、例えば、目的遺伝子の周囲にｌｏｘＰ部位と呼ばれる短い配列を導入することによって行われる。この場合も、他のアプローチがそれぞれの文献から当業者に知られており、本発明の文脈でこれらを適用することは通例的なものとみなされる。

【0270】

他のアプローチの１つは、機能不全の遺伝子産物または活性が低下した遺伝子産物をもたらし得る遺伝子修飾である。このアプローチは、フレームシフト変異の導入、ナンセンス変異の導入（すなわち、未成熟終止コドンの導入）、またはアミノ酸置換をもたらす変異の導入を伴い、これは、遺伝子産物全体を機能不全にするか、または活性低下を引き起こす。このような遺伝子修飾は、例えば、変異誘発（例えば、欠失、部分欠失、挿入もしくは核酸置換）、非特異的（ランダム）変異誘発または部位特異的変異誘発のいずれかによってもたらされ得る。遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、ドミナントネガティブコンストラクトの送達、条件付き遺伝子ノックアウト、及び／または遺伝子修飾の実際的な適用について記載するプロトコルは、当業者にとって一般的に入手可能なものであり、かつ当業者のルーチン内にある。したがって、本明細書で提供される技術的教示は、遺伝子産物の遺伝子発現の阻害または低下、または機能不全もしくは不活性の遺伝子産物の発現、または活性低下につながる全ての考えられる方法に関して完全に可能なものである。

【0271】

本明細書に記載される遺伝子修飾は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）によって説明されているような当技術分野で知られているツール、方法、技術を用いることができる。

【0272】

本明細書で使用する場合、「内在性」という用語は、野生型（ネイティブ）宿主細胞内に存在する分子及び配列、特定的には内在性遺伝子またはタンパク質を含むように意図され、これらは、それぞれの内在性遺伝子の発現を低下させ、かつ／または内在性タンパク質の産生を低下させるための修飾を行う前に存在する。特定的には、自然界で見出されるような特定の宿主細胞内に生じる（かつそこから得ることができる）内在性核酸分子（例えば、遺伝子）またはタンパク質は、「宿主細胞内在性」または「宿主細胞にとって内在性」であると理解される。さらに、核酸またはタンパク質を「内在的に発現する」細胞は、自然界で見出される同じ特定のタイプの宿主と同様に、その核酸またはタンパク質を発現する。さらに、核酸、タンパク質、または他の化合物を「内在的に産生している」または「内在的に産生する」宿主細胞は、自然界で見出される同じ特定のタイプの宿主細胞と同様に、その核酸、タンパク質、または化合物を産生する。

【0273】

したがって、（例えば、遺伝子をコードするタンパク質が不活化または欠失した宿主細胞のノックアウト変異体において）内在性タンパク質がもはや宿主細胞によって産生されない場合であっても、当該タンパク質は、本明細書においてはなお「内在性」と称される。

【0274】

「異種性」という用語は、ヌクレオチド配列、コンストラクト（例えば、発現カセット、アミノ酸配列、またはタンパク質）に関して本明細書で使用する場合、所与の宿主細胞にとって異質である、すなわち、「外来性」である（例えば、当該宿主細胞に自然界では見出されない）化合物、または所与の宿主細胞に自然界で見出される化合物（例えば、「内在性」であるが異種性コンストラクトの文脈でそうである、またはこのような異種性コンストラクトに組み込まれている（例えば、内在性核酸と融合した異種性核酸を用いるか、または内在性核酸と共に異種性核酸を用いてコンストラクトを異種性にする）を指す。内在的に見出される異種性ヌクレオチド配列はまた、細胞中で非天然量で、例えば、予想よりも多いまたは天然に見出されるよりも多い量で、産生され得る。異種性ヌクレオチド配列、または異種性ヌクレオチド配列を含む核酸は、内在性ヌクレオチド配列とは配列が異なる可能性があるが、内在的に見出されるものと同じタンパク質をコードする。具体的には、異種性ヌクレオチド配列は、自然界では宿主細胞にとって同じ関係で見出されない配列である。任意の組換えまたは人工ヌクレオチド配列は、異種性であると理解される。異種性ポリヌクレオチドの例は、本明細書で記載されるように、例えばハイブリッドプロモーターを得るために、プロモーターとネイティブには会合していないか、またはコード配列に作用可能に結合していないヌクレオチド配列である。結果として、ハイブリッドまたはキメラ型ポリヌクレオチドが得られ得る。異種性化合物のさらなる例は、内在性の天然に存在するＰＯＩコード配列が通常は作用可能に結合していない、転写調節要素（例えば、プロモーター）に作用可能に結合したポリヌクレオチドをコードするＰＯＩである。

【0275】

本明細書で使用する場合、「作用可能に結合した」という用語は、ヌクレオチド配列が単一の核酸分子（例えば、ベクターまたは発現カセット）上で、１つ以上のヌクレオチド配列の機能が当該核酸分子上に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列によって影響を受けるような方法で、会合していることを指す。作用可能な結合により、核酸配列は、同じ核酸分子上の別の核酸配列と機能的関係に置かれる。例えば、プロモーターは、組換え遺伝子のコード配列の発現をもたらすことが可能な場合、そのコード配列と作用可能に結合している。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、分泌形態（例えば、成熟タンパク質または成熟タンパク質のプレフォーム）でタンパク質を発現可能な場合、ＰＯＩをコードする核酸配列に作用可能に結合している。具体的には、相互に作用可能に結合したこのような核酸は、直接結合していてもよく、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とＰＯＩをコードする核酸配列との間にさらなるエレメントまたは核酸配列が存在することなく結合していてもよい。

【0276】

「プロモーター」配列は、典型的には、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、コード配列に作用可能に結合していると理解される。プロモーター配列がコード配列とネイティブに会合していない場合、その転写はネイティブ（野生型）細胞内でプロモーターによる制御を受けないか、または当該コード配列は異なる連続配列と再結合する。

【0277】

非メタノール炭素源によって調節可能、特定的には抑制可能であり、本明細書に記載の目的で使用されるプロモーターは、本明細書では「ＥＣＰ」と称される。そのため、「ＥＣＰ」に関する本開示は、「非メタノール炭素源によって調節可能（または抑制可能）なプロモーター」も指し、逆もまた同様である。

【0278】

本明細書に記載のＥＣＰは、特定的には、ＰＯＩコードＤＮＡの発現を開始、調節、または別の方法で媒介もしくは制御する。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同一の遺伝子または異なる遺伝子に由来し得、また同一または異なる生物に由来し得る。

【0279】

本明細書に記載のＥＣＰは、具体的には、調節可能プロモーター、特定的には、抑制及び誘導状態で異なるプロモーター強度を有する炭素源調節可能プロモーター、特定的には、非メタノール炭素源調節可能プロモーター、例えば、非メタノール炭素源によって抑制され、特定的にはメタノールによって誘導可能でないＥＣＰとして理解される。具体的には、メタノールの非存在下で転写活性を有するＥＣＰを使用することにより、ＥＣＰの転写制御下でＰＯＩを産生するための宿主細胞培養物にメタノールを添加する必要がない。

【0280】

ＥＣＰの強度とは、具体的にはその転写強度を指し、そのプロモーターにおいて高頻度または低頻度で生じる転写開始の効率によって表される。転写強度が高いほど、そのプロモーターでの転写は頻繁に生じる。プロモーター強度はプロモーターの典型的な特徴である。なぜなら、プロモーター強度は、所与のｍＲＮＡ配列が転写される頻度を決定し、いくつかの遺伝子に他の遺伝子よりも高い転写の優先度を有効に与え、転写産物の濃度を高めるからである。例えば、大量に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子は、典型的には比較的強力なプロモーターを有する。ＲＮＡポリメラーゼは一度に１つの転写タスクしか実施できないため、効率的に行うには作業に優先順位を付けなければならない。プロモーター強度の差は、この優先順位付けを可能にするように選択される。

【0281】

本明細書で使用されるＥＣＰは、典型的にはほぼ最大活性状態として理解される完全誘導状態では比較的強力である。相対的強度は、一般的には、比較可能なプロモーター（本明細書では参照プロモーターと称される）に対し定量され、このプロモーターは、宿主細胞として使用される細胞のそれぞれのｐＧＡＰプロモーターのような標準プロモーターであり得る。

【0282】

転写の頻度は、転写率として一般に理解されており、これは例えば、好適なアッセイ（例えば、ＲＴ－ＰＣＲまたはノーザンブロッティング）における転写物の量によって定量される。例えば、本発明によるプロモーターの転写強度は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである宿主細胞において定量され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのネイティブｐＧＡＰプロモーターと比較される。

【0283】

目的遺伝子を発現するプロモーターの強度は、一般的には、発現強度または高い発現レベル／率を支持する能力として理解される。例えば、本発明のプロモーターの発現及び／または転写強度は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである宿主細胞において定量され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのネイティブｐＧＡＰプロモーターと比較される。

【0284】

参照プロモーターと比較した比較転写強度は、標準的な方法によって（例えば、転写産物の量を、例えばマイクロアレイを用いて測定することにより）、または細胞培養において（例えば、組換え細胞内のそれぞれの遺伝子発現産物の量を測定することにより）、定量することができる。特定的には、転写率は、マイクロアレイ上の転写強度、ノーザンブロットまたは定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）またはＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）によって定量することができ、このとき、データは、高い成長率を有する条件と低い成長率を有する条件との間の発現レベルの差、または異なる培地組成を用いる条件、及び参照プロモーターと比較した高いシグナル強度を示す。

【0285】

発現率は、例えば、ｅＧＦＰなどのレポーター遺伝子の発現量によって定量することができる。

【0286】

本明細書に記載のＥＣＰは、比較的高い転写強度を発揮し、例えば、宿主細胞内のネイティブｐＧＡＰプロモーター（「相同ｐＧＡＰプロモーター」とも呼ばれる）に対し少なくとも１５％の転写率または転写強度によって反映される。好ましくは、転写率または転写強度は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％またはそれ以上のいずれか１つ、例えば、ネイティブｐＧＡＰプロモーターと比較して少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、または２００％の少なくともいずれか１つであり、例えば、ＰＯＩを産生するための組換え目的の宿主細胞として選択された（例えば、真核）宿主細胞で定量される。

【0287】

ネイティブｐＧＡＰプロモーターは、典型的には、ほとんどの生物に存在する構成的プロモーターであるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするギャップ遺伝子の発現を開始する。ＧＡＰＤＨ（ＥＣ １．２．１．１２）は解糖及び糖新生のキーとなる酵素であり、異化及び同化炭水化物の代謝で重要な役割を果たす。

【0288】

ネイティブｐＧＡＰプロモーターは、修飾されていない（非組換え）または組換え真核細胞を含めた同じ種または株のネイティブ真核細胞と同様に、組換え真核細胞において特異的に活性である。このようなネイティブｐＧＡＰプロモーターは、一般的には、内在性プロモーターであると理解されるため、宿主細胞に相同であり、比較目的の標準プロモーターまたは参照プロモーターとして機能し得る。本明細書に記載されるようなプロモーターの相対的な発現または転写の強度または比率は、通常は、ＰＯＩを産生するための宿主として使用される同じ種または株の細胞のネイティブｐＧＡＰプロモーターと比較される。

【0289】

誘導可能または抑制可能調節エレメント（例えば、本明細書に記載のプロモーター）に対する「調節可能」という用語は、例えばバッチ培養の成長フェーズにおいて、過剰量の物質（例えば、細胞培養基中の栄養素）の存在下で宿主細胞内で抑制され、かつ例えば産生フェーズ（栄養素の量を減らす際、または補充基質を供給する際など）において、流加バッチ戦略に従って、強力な活性を誘導するために抑制解除されるエレメントを指すものとする。調節エレメントも同様に調節可能であるように、エレメントが細胞培養添加物の追加なしには不活性であり、このような添加剤の存在下では活性であるように設計され得る。したがって、このような調節エレメントの制御下でのＰＯＩの発現は、このような添加物を加えることによって誘導され得る。

【0290】

本明細書に記載のＥＣＰは、比較的強力な調節可能プロモーターであり、典型的には、細胞成長条件下（成長フェーズ）で沈黙化または抑制され、産生条件下（産生フェーズ）で活性化または抑制解除されるため、炭素源を制限することによって産生細胞系におけるＰＯＩ産生を誘導するのに適している。

【0291】

具体的には、本明細書に記載のプロモーターは、グルコース及びグルコース制限の存在下でのその強度を比較する試験で定量されるような示差的プロモーター強度で調節可能な炭素源であり、これは、当該プロモーターが比較的高いグルコース濃度で、好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌの濃度でなお抑制されることを示す。具体的には、本明細書に記載のプロモーターは、プロモーターを完全に誘導するグルコース閾値濃度を考慮して、制限されたグルコース濃度で完全に誘導され、この閾値は、典型的には、２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは１０ｇ／Ｌ未満、１ｇ／Ｌ以下、さらには０．１ｇ／Ｌ未満、または５０ｍｇ／Ｌ未満であり、好ましくは４０ｍｇ／Ｌ未満のグルコース濃度で、ネイティブの相同なｐＧＡＰプロモーターの、例えば少なくとも５０％の完全転写強度を伴う。

【0292】

本開示の文脈内で本明細書で使用する場合、「抑制」または「抑制された」という用語は、例えば、本明細書に記載の炭素源調節可能プロモーターを特徴付けるために使用する場合、抑制可能であると理解されるプロモーターの転写制御下にある（目的タンパク質をコードする）目的遺伝子の転写の妨害を指し、この妨害の結果、細胞による目的タンパク質の発現が減少する。

【0293】

本明細書に記載のＥＣＰの抑制は、抑制作用物質が細胞培養基中に存在する場合に特異的に生じる。抑制作用物質は、ある特定の炭素源、または（例えば、特定の閾値量を上回る）炭素源の抑制量であり得る。目的遺伝子または目的タンパク質の発現は、抑制作用物質が培地から除去されるか、またはこれ以上抑制されない閾値量未満まで減少したときに、「抑制解除」とされる。抑制解除時に、ＥＣＰは完全誘導状態であると理解され、目的タンパク質の発現は、典型的には、プロモーター抑制条件下での細胞による発現の基礎レベルの少なくとも１．５倍である。

【0294】

具体的には、本明細書に記載のＥＣＰの制御下での目的遺伝子の転写は、ＥＣＰの抑制解除または完全誘導時の当該遺伝子の転写と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つだけ抑制されるか、または完全に抑制（１００％抑制）され得る。

【0295】

抑制条件及び抑制解除条件下でのプロモーター強度を比較する示差的プロモーター強度は、プロモーターの調節可能特性及びそれぞれの誘導比を定量する。ある特定の実施形態によれば、誘導比は、所定の炭素源閾値未満の誘導条件に切り替えた際のＰＯＩ産生の開始によって定量される示差的プロモーター強度として理解され、抑制状態における強度と比較される。転写強度は一般的には、完全誘導状態での強度、すなわち、抑制解除条件下で最大の活性を示す強度として理解される。示差的プロモーター強度は、例えば、抑制条件と比較した脱抑制条件下での組換え宿主細胞系のＰＯＩ産生の効率または収率に従って、または転写物の量によって定量される。本明細書に記載の調節可能プロモーターは、抑制された状態と比較して、抑制解除（完全誘導）状態では少なくとも１．５倍または少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０、または１００倍である、好ましい示差的プロモーター強度（誘導比）を有し、誘導倍数としても理解される。

【0296】

本明細書で使用する場合、「変異誘発」という用語は、非コード領域またはコード領域内に少なくとも１つの変化を有するヌクレオチド配列の変異体を得るために、例えば１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／または置換により、ヌクレオチド配列の変異体を提供する方法を指すものとする。変異誘発は、ランダム、半ランダム、または部位特異的変異によるものであり得る。本明細書に記載されの具体的なＥＣＰ及びそれぞれのヌクレオチド配列は、同様に本明細書に記載の目的で使用され得る調節可能プロモーターであるバリアントを産生するために使用され得る。このようなバリアントは、親配列として本明細書に提供されるＥＣＰヌクレオチド配列を用いた好適な変異誘発法によって産生することができる。このような変異誘発法は、それぞれの親プロモーター配列情報を鋳型として用いて核酸を操作する方法またはヌクレオチド配列をｄｅ ｎｏｖｏ合成する方法を包含する。具体的な変異誘発法は、合理的なプロモーター操作を適用する。

【0297】

本明細書に記載の例示的なＥＣＰは、例えば、発現レベルの改変及び調節特性を有するプロモーターバリアントを生成するように修飾することができる。例えば、プロモーターライブラリーは、選択されたプロモーター配列の変異誘発によって調製することができ、このプロモーター配列は、例えば真核細胞内での遺伝子発現を微調整するための親分子として使用され得、これは、異なる発酵戦略下での発現のためのバリアントを解析し、好適なバリアントを選択することによって行われる。バリアントの合成ライブラリーは、例えば、選択されたＰＯＩを産生するための要件に適合するプロモーターを選択するために、使用することができる。このようなバリアントは、（例えば、真核）宿主細胞内で発現効率が増加し、炭素源の豊富及び制限条件下で示差的発現を示し得る。典型的には、大規模なランダム化遺伝子ライブラリーが高い遺伝子多様性で作製され、遺伝子多様性は、具体的に所望される遺伝子型または表現型に従って選択され得る。

【0298】

ある特定のＥＣＰバリアントは、本明細書に示されるＥＣＰヌクレオチド配列のサイズバリアントであり得、かつ／または本明細書に記載のプロモーターのエレメントまたは領域（例えば、コア調節領域、主要調節領域、もしくはＴモチーフ）のうちの２つ以上を含み得、かつ／またはＥＣＰヌクレオチド配列の１つ以上の（同じまたは異なる）断片を含み得る。

【0299】

特異的変異誘発法は、配列内の１つ以上のヌクレオチドの点変異、特定的にはタンデム点変異を提供し、例えば、プロモーターのヌクレオチド配列内の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはさらにより連続したヌクレオチドを変化させる。点変異は、典型的には、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、及び／または置換のうちの少なくとも１つである。プロモーター配列は、遠位の末端で、特定的には、全長プロモーター配列の最大５０％の量に達する５’領域内で変異させることができ、この５’領域は、プロモーター活性を実質的に喪失することなく高度に変動し得る。プロモーター配列は、主要調節領域内で特異的に変異させることができるが、それでもなお、例示的な主要調節領域、特定的には例示的なコア調節領域に対する配列同一性は高いことが好ましいと考えられ、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれか１つであることが好ましいと考えられる。コアまたは主要調節領域のいずれか以外では配列の可変性はより高く、ＥＣＰは、例えば、８０％未満または８５％未満の配列同一性で、依然機能的であり得る。

【0300】

コアまたは主要調節領域内のいかなる変異も、典型的には保存的であり、すなわち、例えば、ある特定の転写因子による認識を維持（またはさらに改善）するように保存的である。

【0301】

具体的には、本明細書に記載のＥＣＰは、例えば本明細書に記載のコアまたは主要調節領域を含むハイブリッドヌクレオチド配列と、さらに、１つ以上の領域または代替的な（ネイティブまたは人工の）プロモーター配列、例えば、異なるプロモーター（例えば、任意の構成的または調節可能（または別の方法による誘導可能）プロモーター）の３’領域の翻訳開始部位（具体的には、３’末端を含めて少なくとも１０または１５の３’末端ヌクレオチド配列を含む３’末端（例えば、最大２０、２５、または３０ｎｔ）とを含むことができ、それによってＥＣＰプロモーターの翻訳開始部位を置換する。

【0302】

本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを指す。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」または単に「ポリヌクレオチド」とは、５’末端→３’末端に読み止まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の１本鎖または２本鎖ポリマーを指す。これには、発現カセット、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、及び非機能的ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。

【0303】

本明細書で使用する場合、「目的タンパク質（ＰＯＩ）」という用語は、宿主細胞内で組換え技術によって産生されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。より具体的には、タンパク質は、宿主細胞内に天然に存在しないポリペプチド（すなわち、異種性タンパク質）であってもよく、または宿主細胞にとってネイティブであってもよく、すなわち、宿主細胞にとって相同性のタンパク質であってもよいが、ただし、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターを用いた形質転換によって、またはＰＯＩをコードする核酸配列の１つ以上のコピーの宿主細胞のゲノムへの組換え技術による組み込みによって、またはＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター配列）の組換え修飾によって、産生される。いくつかの場合において、本明細書で使用する場合、ＰＯＩという用語は、組換え発現したタンパク質によって媒介される宿主細胞による任意の代謝産物も指す。

【0304】

本明細書で使用する場合、「足場」という用語は、抗原結合分子の生成のための開始点として機能する、コンパクトで安定的に折り畳まれたタンパク質の多面的な群（サイズ、構造、及び起源が異なる）を説明するものである。抗体（免疫グロブリン）の構造－機能関係に触発され、このような代替タンパク質足場は、これは所与の（生体）分子標的を厳密かつ特異的に認識するために再形成され得る相互作用部位を支持するロバストで保存的な構造的枠組みを提供する。

【0305】

親ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較してのバリアント、ホモログ、またはオルソログの「配列同一性」という用語は、２つ以上の配列の同一性の程度を示す。２つ以上のアミノ酸配列は、対応する位置で、ある程度まで、最大で１００％、同じまたは保存的なアミノ酸残基を有し得る。２つ以上のヌクレオチド配列は、対応する位置で、ある程度まで、最大で１００％、同じまたは保存的な塩基対を有し得る。

【0306】

配列類似性検索は、過剰な（例えば、少なくとも５０％の）配列同一性を有するホモログを同定するための有効かつ信頼できる戦略である。頻繁に使用される配列類似性検索ツールは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＨＭＭＥＲである。

【0307】

配列類似性検索は、過剰な類似性、及び共通の祖先を反映する統計的に有意な類似性を検出することにより、このような相同性のタンパク質または遺伝子を同定することができる。ホモログはオルソログを包含することができ、オルソログは、本明細書では、異なる生物における同じタンパク質（例えば、異なる生物または種におけるこのようなタンパク質のバリアント）として理解される。

【0308】

異なる生物または種における同じタンパク質のオルソログ配列は、典型的には、タンパク質配列に対し、特定的には同じ属から生じるオルソログのタンパク質配列に対し相同性である。典型的には、オルソログは、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性、最大１００％の配列同一性のいずれか１つを有する。具体的には、オルソログは、ＦＬＯ８タンパク質またはＦＬＯ８タンパク質をコードする遺伝子を、宿主細胞内のオルソロガス配列によって置き換えることで決定することができ、これは内在性ＦＬＯ８タンパク質をノックアウトするように修飾される。例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でノックアウトされた遺伝子によってコードされる内在性ＦＬＯ８タンパク質を置き換える推定ＦＬＯ８タンパク質が、それぞれＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞内で機能的である場合、このような推定ＦＬＯ８タンパク質は、本明細書に記載の目的におけるＦＬＯ８タンパク質ホモログとみなすことができる。

【0309】

配列番号１として同定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＦＬＯ８タンパク質は、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ起源のものである。他の真核または原核宿主細胞内に存在する相同配列があることは十分に理解されている。例えば、酵母細胞は、特定的にはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの酵母内に、それぞれの相同配列を含み、これは新規の属Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａに再分類され、３つの種Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ、及びＫ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓに分けられている。具体的な相同配列は、例えば、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（例えば、配列番号３（例えば、配列番号４を含むまたはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされる））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えば、配列番号５または６）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（例えば、配列番号７）、Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（例えば、配列番号８）、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（例えば、配列番号９）に見出される。

【0310】

本明細書に記載のある特定の配列同一性を有するＦＬＯ８タンパク質の任意の相同配列、特定的には、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＦＬＯ８タンパク質のオルソログである任意のＦＬＯ８タンパク質は、本明細書に記載のＦＬＯ８タンパク質の定義に含まれる。

【0311】

本明細書に記載のアミノ酸配列、ホモログ、及びオルソログに対する「配列同一性」とは、配列をアラインメントしギャップを導入して、必要な場合は最大パーセント配列同一性を達成した後に、特定のポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない。当業者は、比較する配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0312】

本明細書に記載の目的において、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、以下の例示的パラメーターと共にＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョンＢＬＡＳＴＰ２．８．１を用いて定量される：Ｐｒｏｇｒａｍ：ｂｌａｓｔｐ、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：６、Ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ：１０、Ｈｉｔｌｉｓｔ ｓｉｚｅ：１００、Ｇａｐｃｏｓｔｓ：１１．１、Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｆｉｌｔｅｒ ｓｔｒｉｎｇ：Ｆ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ。

【0313】

（例えば、プロモーターまたは遺伝子の）ヌクレオチド配列に対する「同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインメントしギャップを導入して、必要な場合は最大パーセント配列同一性を達成した後に、ＤＮＡ配列内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージとして定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない。ヌクレオチド配列同一性パーセントの定量を目的としたアラインメントは、当業者の技量範囲内の様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、達成することができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0314】

ＰＯＩに対し本明細書で使用する場合、「単離された」または「単離」という用語は、天然に会合する環境、特定的には細胞培養上清から十分に分離され、「精製された」または「実質的に純粋な」形態で存在する化合物を指すものとする。しかし、「単離された」とは、必ずしも、他の化合物または材料との人工的または合成的混合物、または基礎的活性を妨害せず、例えば不完全な精製ゆえに存在し得る不純物の存在を除外することを意味するものではない。単離化合物は、その調製物を生成するためにさらに製剤化することができ、実際的な目的のために引き続き単離することができる。例えば、ＰＯＩは、診断または治療で使用される場合、医薬的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。

【0315】

本明細書で使用する場合、「精製された」という用語は、化合物（例えば、ＰＯＩ）の少なくとも５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を含む調製物を指す。純度は、化合物に適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。本明細書に記載されるような単離され精製されたＰＯＩは、細胞培養上清を精製して不純物を減少させることによって得ることができる。

【0316】

組換えポリペプチドまたはタンパク質産物を得るための単離及び精製方法として、溶解度の差を利用する方法（例えば、塩析、溶媒沈殿）、分子量の差を利用する方法（例えば、限外濾過、ゲル電気泳動）、電荷の差を利用する方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）、特異的親和性を利用する方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）、疎水性の差を利用する方法（例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー）、等電点の差を利用する方法（例えば、等電点電気泳動法）などの方法が使用され得る。

【0317】

以下の標準的な方法が好ましい：精密濾過またはタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）または遠心分離による細胞（デブリ）の分離及び洗浄、沈殿または熱処理によるＰＯＩの精製、酵素消化によるＰＯＩの活性化、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除（ＳＥＣ）、またはＨＰＬＣクロマトグラフィー）によるＰＯＩの精製、限外濾過ステップによる濃縮及び洗浄のＰＯＩ沈殿。

【0318】

高度に精製された産物は、本質的に混入タンパク質を含まず、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９８％、最大１００％の純度を有する。精製された産物は、細胞培養上清または細胞デブリからの精製によって得ることができる。

【0319】

単離及び精製されたＰＯＩは、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、活性アッセイ、またはＥＬＩＳＡなどの従来的な方法によって同定することができる。

【0320】

本明細書で使用する場合、「組換え」という用語は、遺伝子工学によって調製されているか、または遺伝子工学の結果であることを意味するものとする。組換え宿主は、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を欠失及び／または不活性化するように操作され得、（特定的には、宿主にとって異質なヌクレオチド配列を用いる）組換え核酸配列を含む発現ベクターまたはクローニングベクターを特異的に含み得る。組換えタンパク質は、それぞれの組換え核酸を宿主内で発現させることによって産生される。本明細書で使用する場合、ＰＯＩに対する「組換え」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるＰＯＩ（例えば、ＰＯＩを発現するように形質転換された宿主細胞から単離されるＰＯＩ）を含む。本発明に従って、当業者の技量範囲内の従来的な分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技法を用いることができる。このような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，（１９８２）を参照。

【0321】

ある特定の組換え宿主細胞は、遺伝子工学を用いて、すなわちヒトの介入によって操作された宿主細胞として理解される「操作された」宿主細胞である。宿主細胞が、所与の遺伝子またはそれぞれのタンパク質の発現を低下させるかまたは過小発現するように操作される場合、宿主細胞は、操作前の同じ条件下の宿主細胞と比較して、または当該遺伝子またはタンパク質が過小発現するように操作されていない宿主細胞と比較して、このような遺伝子及びタンパク質をそれぞれ発現する能力をもはや持たないように操作される。

【0322】

具体的な例によれば、驚くべきことに、宿主細胞内での遺伝子発現をコードするＦＬＯ８の減少、特定的にはこのような遺伝子の欠失は、非メタノール制御誘導可能プロモーター（ＥＣＰ）によって制御される遺伝子の発現レベルに正の影響を及ぼし、よって、炭素源プロモーター調節を喪失することなくより高い発現レベルを可能にすることが見出された。そのため、ＦＬＯ８タンパク質をコードするそれぞれの内在性遺伝子（ＦＬＯ８遺伝子）の欠失のありまたはなしで細胞を生成し、ＥＣＰの制御下での遺伝子の強度及び調節を試験した。細胞内または分泌モデルタンパク質のいずれかであるいくつかの例示的なＰＯＩについては、それぞれのｆｌｏ８遺伝子の欠失を伴った細胞内で発現が増加したことが示されており、これは転写物レベルの増加に起因していた。この発現増加は，小規模スクリーニング培養及びバイオリアクター内での制御された産生プロセスの両方で示すことができた。したがって、メタノールを含まない培地（例えば、Ｐｉｃｈｉａなどの酵母の場合）において、過去に存在した発現系と比較してはるかに高い産物形成を可能にする新規の発現系が開発された。

【0323】

具体的な例によれば、（メタノール以外の炭素源によって調節される）非メタノール炭素源調節プロモーターｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６の発現強度に及ぼすＦＬＯ８破壊の効果を、構成的プロモーターｐＧＡＰまたはメタノール誘導プロモーターｐＡＯＸ１と比較した。全ての非メタノール炭素源調節プロモーターの転写が、ｄＦＬＯ８株において統計的に有意に高いことが見出された。これは驚くべきことであり、このようなプロモーターの制御下で発現が増加したことを示すものである。これに対し、メタノール誘導可能ｐＡＯＸ１は、ｄＦＬＯ８変異体において野生型と比較して有意な転写強度の増加を示さず、ｐＧＡＰの転写強度にも有意な影響を及ぼさなかった。したがって、ｐＧＡＰまたはｐＡＯＸ１プロモーター活性はＦＬＯ８の過小発現による影響を受けないことが結論付けられる。

【0324】

驚くべきことに、細胞培養物中での目的タンパク質を産生するための目的異種遺伝子の発現は、標準的なｐＧＡＰプロモーターと比較してメタノールによって誘導可能でない炭素源抑制可能プロモーターを使用した場合、ＦＬＯ８のノックアウトまたは破壊を行うと有効に増加することが見出された。例えば、ｄＦＬＯ８株においてプロモーターｐＧ１、ｐＧ１－３、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６、ｐＧ７、及びｐＧ８の各々についてのｅＧＦＰ蛍光の増加が見出され、これは、野生型宿主細胞（ＦＬＯ８破壊なし）における発現と比較して１．２～３．９倍の範囲の増加であった。

【0325】

以下の項目が、本明細書に記載される実施形態である。
１．配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする内在性遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、当該宿主細胞が、１つ以上の遺伝子修飾によって、当該１つ以上の遺伝子修飾を行う前の当該宿主細胞と比較して当該遺伝子の発現を低下させるように操作され、当該宿主細胞が、発現カセットプロモーター（ＥＣＰ）の制御下で、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む異種性発現カセットを含み、当該ＥＣＰが非メタノール炭素源によって調節可能である、組換え宿主細胞。
２．当該ホモログが配列番号１に対し少なくとも２５％の配列同一性を有する、項目１の宿主細胞。
３．当該１つ以上の遺伝子修飾が、（ｉ）１つ以上の内在性ポリヌクレオチドもしくはその一部または（ｉｉ）発現制御配列の、破壊、置換、欠失、またはノックアウトを含む、項目１～２のいずれか１つに記載の宿主細胞。
４．当該内在性ポリヌクレオチドが、当該ＦＬＯ８タンパク質または当該ホモログをコードする遺伝子である、項目３に記載の宿主細胞。
５．当該発現制御配列が、プロモーター、リボソーム結合部位、転写もしくは翻訳の開始及び停止配列、またはエンハンサーもしくはアクチベーター配列のいずれか１つを含む、項目４に記載の宿主細胞。
６．当該ＥＣＰが、成長制限量の非メタノール炭素源の存在下で、好ましくはメタノールの非存在下で誘導可能であり、当該成長制限量よりも高い過剰量の非メタノール炭素源の存在下で抑制可能である、項目１～４のいずれか１つに記載の宿主細胞。
７．当該非メタノール炭素源の成長制限量が最大１ｇ／Ｌ細胞培養基である、項目６に記載の宿主細胞。
８．当該ＥＣＰが、少なくとも１つの第１のコア調節領域及び少なくとも１つの第２のコア調節領域を含み、当該第１のコア調節領域が配列番号１７に対し少なくとも７５％の配列同一性を有し、当該第２のコア調節領域が配列番号１８に対し少なくとも７５％の配列同一性を有する、項目１～７のいずれか１つに記載の宿主細胞。
９．当該ＥＣＰが、配列番号３５に対し少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１つの調節領域を含む、項目１～８のいずれか１つに記載の宿主細胞。
１０．当該ＥＣＰが、少なくとも２つの当該第１及び／または第２コア調節領域を含む、項目８または９に記載の宿主細胞。
１１．当該ＥＣＰが、配列番号１９～３４のいずれか１つからなる少なくとも１つのＴモチーフを含み、任意選択で、当該Ｔモチーフの５’または３’末端のいずれかにおける１つ以上のチミンによる当該Ｔモチーフの伸長を伴わない、項目１～１０のいずれか１つに記載の宿主細胞。
１２．当該ＥＣＰが、少なくとも２つの当該Ｔモチーフを含む、項目１１に記載の宿主細胞。
１３．当該ＥＣＰが、配列番号１０～１６のいずれか１つまたは配列番号４１～４５のいずれか１つの配列の少なくとも３００ｎｔに対し少なくとも６０％の配列同一性を含む、項目１～７のいずれか１つに記載の宿主細胞。
１４．当該ＥＣＰが、全長配列配列番号１０～１６のいずれか１つまたは配列番号４１～４５のいずれか１つに対し少なくとも６０％の配列同一性を含む、項目１３に記載の宿主細胞。
１５．当該ＥＣＰが、配列番号１０または配列番号１１を含むまたはそれからなる、項目１３または１４に記載の宿主細胞。
１６．当該発現カセットが、自律複製ベクターもしくはプラスミドまたは当該宿主細胞の染色体内に含まれる、項目１～１５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
１７．当該発現カセットが、当該ＧＯＩによってコードされる目的タンパク質（ＰＯＩ）の分泌を可能にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、当該シグナルペプチドをコードする当該ヌクレオチド配列が、当該ＧＯＩの５’末端に隣接して融合している、項目１～１６のいずれか１つに記載の宿主細胞。
１８．当該ＧＯＩが、抗原結合タンパク質、治療タンパク質、酵素、ペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物－タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン抗原、成長因子、ホルモン、サイトカイン、プロセス酵素、及び代謝酵素からなる群より選択されるペプチドまたはタンパク質である目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする、項目１～１７のいずれか１つに記載の宿主細胞。
１９．当該抗原結合タンパク質が、以下からなる群より選択される、項目１～１８のいずれか１つに記載の宿主細胞：
ａ）抗体または抗体断片、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、Ｆｖ四量体、ミニボディ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＩＧｎａＲＳ、もしくはＶ－ＮＡＲのような単一ドメイン抗体のいずれか
ｂ）抗体ミメティック、例えば、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、もしくはＮａｎｏＣＬＡＭＰ、または
ｃ）１つ以上の免疫グロブリン折畳みドメイン、抗体ドメイン、もしくは抗体ミメティックを含む融合タンパク質。
２０．項目１～１９のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、
ａ）Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍからなる群より選択される属の酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、もしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、または
ｂ）糸状菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉもしくはｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの細胞
である、宿主細胞。
２１．非メタノール炭素源によって調節可能または抑制可能なプロモーターの制御下で、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする目的遺伝子（ＧＯＩ）を発現する宿主細胞によって産生される当該ＰＯＩの収率を増加させる方法であって、配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、当該ＰＯＩの収率を増加させる方法。
２２．目的遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、当該ＧＯＩを産生する条件下で項目１～２０のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養することにより、当該ＰＯＩを産生する方法。
２３．項目２１または２２に記載の方法であって、以下のステップ：
ａ）成長条件下で宿主細胞を培養することと、さらに
ｂ）最大１ｇ／Ｌの第２の非メタノール炭素源の存在下、成長制限条件下で宿主細胞を培養し、その結果当該ＧＯＩが発現して当該ＰＯＩが産生されることと
を含む、方法。
２４．当該第１または第２の炭素源が、糖類、ポリオール、アルコール、または前述のいずれか１つ以上の混合物から選択される、項目２３に記載の方法。
２５．当該ステップａ）の培養がバッチフェーズで実施され、当該ステップｂ）の培養が流加バッチまたは連続培養フェーズで実施される、項目２３または２４に記載の方法。
２６．宿主細胞内で目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、以下のステップ：
ａ）配列番号１として同定されるアミノ酸配列を含むＦＬＯ８タンパク質またはそのホモログをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように宿主細胞を遺伝子操作することと、
ｂ）当該ＰＯＩをコードする目的遺伝子（ＧＯＩ）に作用可能に結合した非メタノール性炭素源調節可能プロモーター（特定的には、本明細書に記載のＥＣＰ）を含む異種発現カセットを宿主細胞に導入することと、
ｃ）当該ＰＯＩを産生する条件下で当該宿主細胞を培養することと、
ｄ）任意選択で、当該細胞培養物から当該ＰＯＩを単離することと、
ｅ）任意選択で、当該ＰＯＩを精製することと
を含む、方法。

【0326】

上記の説明は、以下の実施例を参照すればより十分に理解されるであろう。ただし、このような実施例は、本発明の１つ以上の実施形態を実施する方法を単に代表するものであり、発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0327】

以下の実施例は、転写調節因子ＦＬＯ８の破壊がｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６、及びｐＧ８などの炭素調節プロモーターならびにこれらの操作バリアントの転写活性を高め、炭素制限培養条件下での組換えタンパク質の生産性の増加を可能にすることを示すものである。

【0328】

実施例１：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｄＦＬＯ８株の構築
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型株ＣＢＳ７４３５またはＣＢＳ２６１２（ＣＢＳ－ＫＮＡＷ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いた。

【0329】

ｄＦＬＯ８変異体株を生成するため、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに適合させ（Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）ＷＯ２０１５１５８８００Ａ１に記載のように、スプリットマーカーカセット法によって遺伝子ＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４－０２５２（ＦＬＯ８）を破壊した。簡潔に説明すると、ＯＲＦの翻訳開始の約２００ｂｐ上流及び下流に位置する２つの１．５ｋｂ領域を、それぞれプライマーＡ＿ｆｗ及びＡ＿ｂｗ、Ｄ＿ｆｗ及びＤ＿ｂｗを用いて増幅した（表１）。得られた断片Ａ及びＢを使用して、融合ＰＣＲにより、ＫａｎＭＸマーカーカセット（プライマーＢ＿ｆｗ、Ｂ＿ｂｗ、Ｃ＿ｆｗ、及びＣ＿ｂｗ）の２つの約１ｋｂの長さと重複部分（４３５ｂｐｓ）とを、抵抗性マーカーカセットのそれぞれのＢ及びＣ部分の５’及び３’末端に対し相同であるプライマーＡ＿ｂｗ及びＤ＿ｆｗ上のオーバーハングを用いてフランキングした。２つの融合断片ＡＢ及びＣＤを、（Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）に記載のように、同時にエレクトロコンピテントＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に形質転換した。組込みに成功するには３つの異なる組換え事象が必要であり、結果的にＰＰ７４３５＿Ｃｈｒ４－０２５２及びそのプロモーターの５’末端の０．４ｋｂ断片をＫａｎＭＸカセットによって置換した。

【0330】

陽性形質転換体の選択は、５００μｇｍＬ^－１のＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含む選択的ＹＰＤ寒天プレート（１リットル当たり：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース、２０ｇ寒天）上で行った。妥当な欠失変異体を、スプリットマーカーカセットの外側に位置するプライマー（Ｄｅｔ＿ｆｗ及びＤｅｔ＿ｂｗ、表１）を用いたＰＣＲと、ゲル電気泳動とによって確認した。

【表2】

【0331】

実施例２：ＦＬＯ８破壊がｐＧ１及びｐＧ１－３駆動型細胞内ｅＧＦＰ生産性に及ぼす影響
ａ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｄＦＬＯ８株の構築
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１＿ｅＧＦＰ ＃８（ＷＯ２０１３０５０５５１Ａ１に記載）及びＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｅＧＦＰ ＃１（ＷＯ２０１７０２１５４１Ａ１及びＰｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１８においてＣＢＳ２６１２＿ｐＧＴＨ１－Ｄ１２４０として記載）を宿主株として使用した。これらの株は、Ｚｅｏｃｉｎ耐性カセットの単一コピーを、グルコース調節プロモーターｐＧ１（配列番号１２）またはその操作バリアント（ｐＧ１－３、配列番号１０）、ＧＯＩ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＹＣ１転写ターミネーターからなるｅＧＦＰ発現カセットと一緒に組み込んだことが示されている。対応するｄＦＬＯ８変異体株を実施例１に記載のように構築した。

【0332】

ｂ）ｅＧＦＰ生産性のスクリーニング
発現スクリーニングのために、ｄＦＬＯ８株の単一コロニーならびにそのそれぞれの親株及び非産生野生型株を、２５μｇｍＬ^－１ Ｚｅｏｃｉｎ及び５００μｇｍＬ^－１ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（適切な場合）を含む２ｍＬの液体ＹＰ培地（１リットル当たり：２０ｇペプトン、１０ｇ酵母抽出物）に接種した。プレ培養物を２４－ＤＷＰ中２５℃及び２８０ｒｐｍで約２４時間成長させ、続いて５０ｇＬ^－１多糖及び１．５％グルコース放出酵素（グルコース放出率約０．８ｍｇｍＬ^－１ ｈ^－１を可能にする；ｍ２ｐ培地開発キット）を含む２ｍＬの合成スクリーニング培地ＡＳＭｖ６（培地組成を以下に示す）を５の開始ＯＤ_６００（誘導条件）に接種するために使用した。抑制条件として、２％グリセロールを含むＡＳＭｖ６を使用した。次いで、メイン培養物をさらに４８時間にわたり、２５℃及び２８０ｒｐｍでインキュベートした。ｅＧＦＰ発現を測定するために、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で０．１のＯＤ_６００まで希釈し、Ｓｔａｄｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．２０１０に記載のようにフローサイトメトリーによって解析した。各試料について、１５０００個の細胞を解析した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型細胞を用いてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの自己蛍光を測定し、シグナルから差し引いた。正規化されたｅＧＦＰ発現レベル（細胞サイズに関連する蛍光強度）をｐＧＡＰ制御発現のパーセンテージとして示す（表２）。

【0333】

１Ｌ当たりに含まれる合成スクリーニング培地ＡＳＭｖ６：２２．０ｇクエン酸一水和物、６．３０ｇ（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、０．４９ｇ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、２．６４ｇ ＫＣｌ、０．０５３５ｇ ＣａＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ、１．４７０ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液、０．４ｍｇビオチン；ｐＨはＫＯＨ（固体）で６．５に設定した。

【0334】

１リットル当たりに含まれるＰＴＭ０微量塩ストック溶液：
６．０ｇ ＣｕＳＯ_４＊５Ｈ_２Ｏ、０．０８ｇ ＮａＩ、３．３６ｇ ＭｎＳＯ_４＊Ｈ_２Ｏ、０．２ ｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４＊２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｇ Ｈ_３ＢＯ_３、０．８２ｇ ＣｏＣｌ_２＊６Ｈ_２Ｏ、２０．０ｇ ＺｎＣｌ_２、６５．０ｇ ＦｅＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、及び５．０ｍｌＨ_２ＳＯ_４（９５％～９８％）。

【0335】

表２：ｄＦＬＯ８がｐＧ１またはｐＧ１－３の制御下でｅＧＦＰの発現に及ぼす影響。２％グリセロール（抑制）または制限グルコース（誘導）中で４８時間培養した後のｐＧＡＰに対するｅＧＦＰ発現レベルと、野生型におけるｐＧ１またはｐＧ１－３と比較した誘導条件下でのｄＦＬＯ８株におけるｅＧＦＰ蛍光の増加とを示す。

【表3】

^＊実施例２に記載の方法によって産生。

【0336】

ＦＬＯ８の欠失は、ｐＧ１駆動発現に正の影響を及ぼし、誘導（グルコース制限）条件においてほぼ４倍高いｅＧＦＰレベルをもたらした（表２）。よって、ＦＬＯ８を破壊する効果を、それ自体がより高い内在性発現を有するプロモーターバリアントｐＧ１－３についても調べた。正の影響はプロモーターバリアントについても示され、この場合も、野生型バックグラウンドにおける同じプロモーターからの発現と比較して、ｄＦＬＯ８株において２．５～３倍高いｅＧＦＰレベルを可能にした（表２）。

【0337】

実施例３：ＦＬＯ８破壊が分泌組換えタンパク質のＰ_Ｇ１－３駆動型生産性に及ぼす効果
次に、ｄＦＬＯ８変異が分泌モデルタンパク質のｐＧ１－３駆動型発現に及ぼす影響を評価した。この目的において、ｖＨＨまたはｓｃＲの発現カセットを、ＣＢＳ２６１２及びＣＢＳ２６１２＿ｄＦＬＯ８に形質転換した。

【0338】

ａ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｄＦＬＯ８株の構築及び選択マーカー再利用

【0339】

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型株ＣＢＳ２６１２（ＣＢＳ－ＫＮＡＷ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を宿主株として用いた。

【0340】

ＣＢＳ２６１２＿ＫａｎＲ＿ｄＦＬＯ８ ＃２を、実施例１に記載のように構築した。Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ組換えに基づいてゲノムからＫａｎＭＸ選択マーカーカセットを切除するために、ＣＢＳ２６１２＿ＫａｎＲ＿ｄＦＬＯ８ ＃２を、Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３に記載のように、エレクトロポレーションによって、プラスミドｐＴＡＣ＿Ｃｒｅ＿ｈｐｈＭＸ４で一時的に形質転換した。ｐＴＡＣ＿Ｃｒｅ＿ｈｐｈＭＸ４は、プラスミドｐＹＸ０２２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の派生物であり、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点、Ｃｒｅ－リコンビナーゼ遺伝子の発現カセット、ハイグロマイシン耐性カセット、及びＡＲＳ／ＣＥＮエレメントからなる。この構築のために、ｐＴＡＣ＿Ｃｒｅ＿ｋａｎＭＸ（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．，２００８）をＥｃｏＲ９１Ｉで消化して、カナマイシン耐性カセットを除去した。プラスミドｐＧＡ２６＿ｈｐｈＭＸ４を同じ酵素で消化してハイグロマイシン耐性カセットを切除し、適切な断片をライゲーションによって融合した。

【0341】

陽性形質転換体の選択は、１００μｇｍＬ^－１ハイグロマイシンを含むＹＰＤ寒天上で行った。続いてハイグロマイシン耐性クローンを、ＹＰＤ寒天（ｐＫＴＡＣ－ＣＲＥ＿ｈｙｇＲの喪失を促進するためにハイグロマイシンを含まない）及び５００μｇｍＬ^－１のＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含むＹＰＤ寒天上に並行的に再ストリークした。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎに対する耐性を喪失した株は、さらに、ＰＣＲならびにプライマーＤｅｔ＿ｂｗ及びＤｅｔ＿ｆｗ（表１）を用いたゲル電気泳動によってチェックして、ゲノムからのＫａｎＭＸ耐性カセットの切除を確認した。対応する株から、ＣＢＳ２６１２＿Ｌ＿ｄＦＬＯ８ ＃２＿４をさらなる使用に選択した。

【0342】

ｂ）Ｐ_Ｇ１－３の転写制御下で抗体断片ｓｃＦｖ（ＳＣｒ）及びｖＨＨを分泌するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の構築
発現プラスミドｐＰＭ２ｄ＿ＰａＯＸ＿ＳＣｒ及びｐＰＭ２ｄ＿ＰａＯＸ＿ｖＨＨは、ｐＰＵＺＺＬＥプラスミド骨格の派生物である（Ｓｔａｄｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．２０１０）。これらは、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＵＣ１９）の複製起点、Ｚｅｏｃｉｎ耐性カセット、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－接合因子プレプロリーダー、目的遺伝子（ｖＨＨまたはｓｃＲ）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＹＣ１転写ターミネーター、ならびにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへの組込みのための座位（３’ＡＯＸ１領域）からなる。これらの構築のために、ｓｃＦｖ（ｓｃＲ）及びｖＨＨをコードする遺伝子をＤＮＡ２．０によってコドン最適化し、合成ＤＮＡとして得た（配列を以下に記載する）。Ｈｉｓ６－タグを検出のために遺伝子のＣ末端に融合させた。ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（ｓｃＲについて）またはＥｃｏＲＶ（ｖＨＨについて）で制限消化した後、各遺伝子を、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＶで消化したｐＰＭ２ｄ＿ＰａＯＸにライゲーションした。Ｐ_ＡＯＸ１のＰ_Ｇ１－３による置換は、これらのプラスミドならびに発現プラスミドｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ１－３＿ｅＧＦＰ（ＷＯ２０１７０２１５４１Ａ１に記載のｐＰＵＺＺＬＥ誘導体でもある）のＡｌｗＮＩ及びＳｂｆＩによる制限消化及び適切なプラスミド断片の融合によって行われた。ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ１－３＿ｅＧＦＰ由来の断片は、この座位への標的化組込みを可能にするＡＯＸターミネーターの配列も含んだ。

【0343】

得られた発現プラスミドｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ１－３＿ｓｃＲ及びｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨをＡｓｃＩで線状化し、Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３に記載のような標準的なプロトコルを用いたエレクトロポレーションにより、ＣＢＳ２６１２（略称ｗｔ）、ＣＢＳ２６１２＿ＫａｎＲ＿ｄＦＬＯ８＃ ２（略称ｄＦＬＯ８）、またはＣＢＳ２６１２＿Ｌ＿ｄＦＬＯ８ ＃２＿４（略称ｄＦＬＯ８Ｌ）に形質転換した。

【0344】

陽性形質転換体の選択は、５０μｇ／ｍＬ^－１のＺｅｏｃｉｎ及び５００μｇ／ｍＬ^－１のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（適切な場合）を含む選択的ＹＰＤ寒天上で行った。

【0345】

ｃ）抗体断片生産性のスクリーニング
発現スクリーニングのために、それぞれの形質転換体の単一コロニーを、２５μｇｍＬ^－１ Ｚｅｏｃｉｎ及び５００μｇｍＬ^－１のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（適切な場合）を含む２ｍＬ液体ＹＰ培地（１リットル当たり２０ｇペプトン、１０ｇ酵母エキス）に接種し、２８０ｒｐｍの２４－ＤＷＰ中、２５℃で約２４時間成長させた。これらの培養物を使用して、５０ｇＬ^－１多糖及び１．５％グルコース放出酵素（グルコース放出率約０．８ｍｇｈ^－１ｍＬ^－１を可能にする；ｍ２ｐ培地開発キット）を含む２ｍＬの合成スクリーニング培地ＡＳＭｖ６（組成については実施例２を参照）を８の開始ＯＤ_６００に接種するために使用した。培養条件はプレ培養条件と類似していた。４８時間後、１ｍＬの細胞浮遊液を予め秤量した１．５ｍＬ遠心分離チューブに移し、室温で５分間１６１００ｇで遠心分離した。上清を慎重に新しいバイアルに移し、さらに使用するまで－２０℃で保存した。ペレットを含む遠心分離チューブを再び秤量して、湿細胞重量（ＷＣＷ）を定量した。上清中の組換え分泌タンパク質の定量化は、以下に記載のように、マイクロ流体キャピラリー電気泳動によって行った。

【0346】

ｄ）マイクロ流体キャピラリー電気泳動（ＭＣｅ）による定量化
培養上清中の分泌タンパク質力価の定量分析には、「ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ／ＧＸＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した。消耗品「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｂ Ｃｈｉｐ」（７６０４９９、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）及び「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ」（ＣＬＳ９６０００８、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した。チップ及び試料調製は、製造業者の推奨に従って行った。この手順の簡単な説明を以下に示す。

【0347】

チップの準備：試薬が室温になった後、５２０及び２８０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓゲルマトリックスをスピンフィルターに移した。２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ色素溶液を、５２０μＬゲルマトリックスを含むスピンフィルターに添加した。色素を含むスピンフィルターを逆方向に短時間ボルテックスした後、両方のスピンフィルターを９３００ｇで１０分間遠心分離した。チップを洗浄するため、１２０μＬ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を全ての活性チップウェルに添加し、チップを機器洗浄プログラムに供した。さらにＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水でさらに２回すすぐステップの後、残りの流体を完全に吸引し、適量の濾過したゲルマトリックス溶液及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌｏｗｅｒ Ｍａｒｋｅｒ溶液を適切なチップウェルに加えた。

【0348】

試料及びラダーの調製：試料調製のために、６μＬの試料を９６マイクロタイタープレート中の２１μＬの試料バッファーと混合した。試料を１００℃で５分間変性させ、１２００ｇで２分間遠心分離した。続いて、１０５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を加えた。試料溶液をピペッティングによって短時間混合し、測定前に１２００ｇで２分間再度遠心分離した。ラダーを調製するため、ＰＣＲチューブ内で１２μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓラダーを１００℃で５分間変性させた。続いて、１２０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を添加し、ラダー溶液を短時間ボルテックスした後、ミニ遠心分離機中でチューブを１５秒間スピンさせた。

【0349】

定量化は、製造業者が提供するＬａｂＣｈｉｐソフトウェアを使用し、ＢＳＡ標準と比較することによって行った。

【0350】

表３は、平均ｓｃＲ力価が、ｄＦＬＯ８株の上清では野生型と比較して１．８倍高く、一方、バイオマス濃度は差がなく、ｄＦＬＯ８株の上清で１．８６倍高いｓｃＲ収率がもたらされることを示している。ｖＨＨ発現株の場合にも、ｄＦＬＯ８変異による平均力価及びｖＨＨ収率の増加（１．７倍）が同様に観察された（表４）。

【0351】

表３：ｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ１－３＿ｓｃＲで形質転換されたＣＢＳ２６１２及びＣＢ２６１２＿Ｌ＿ｄＦＬＯ８ ＃２＿４の２４－ＤＷＰスクリーニングの平均ＷＣＷ、産物力価、及び収率。コンストラクト当たり２０クローンをスクリーニングした。

【表4】

【0352】

表４：ｐＰＭ１ａＺ３０＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨで形質転換されたＣＢＳ２６１２及びＣＢ２６１２＿ＫａｎＲ＿ｄＦＬＯ８ ＃２の２４－ＤＷＰスクリーニングの平均ＷＣＷ、産物力価、及び収率。コンストラクト当たり２０クローンをスクリーニングした。

【表5】

【0353】

次に、実施例１に記載のようなスプリットマーカーカセットアプローチを用いることにより、上記のスクリーニングから選択された４つの異なるｖＨＨ発現クローン（ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ＃４、＃５、＃１３、及び＃１５）においてＦＬＯ８を破壊した。続いて、ｄＦＬＯ８変異体クローン及び対応するＦＬＯ８親クローンを、２４－ＤＷＰスクリーニングレジームを適用して、これらの生産性についてスクリーニングした。表５は、ｖＨＨ力価及び産物収率が、ｄＦＬＯ８クローンにおいて２～３倍高かったことを示している。産生レベルの増加がより高い転写発現に基づくことを確認するため、ｖＨＨ転写物レベルを異なる時点でｑＰＣＲにより定量化した。平均して２倍高いｖＨＨ発現レベルがｄＦＬＯ８クローンで観察され、これは、ｖＨＨ力価の改善が実際に、より高い転写活性ｏｆｐＧ１－３に基づくことを示す（実施例４を参照）。

【0354】

表５：４つの異なるｖＨＨ発現株及びこれらの対応するｄＦＬＯ８株の平均ＷＣＷ及び力価。各親株の４つの複製物及び６つの対応するｄＦＬＯ８株をスクリーニングした。（ＦＣ：倍数変化）

【表6】

【0355】

実施例４：ＦＬＯ８破壊がｐＧ１－３制御ｖＨＨ－転写に及ぼす影響
ＦＬＯ８の破壊がｐＧ１－３の制御下で遺伝子の転写活性を増加させるかを試験するため、ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４及び＃１３ならびに対応するｄＦＬＯ８変異体株ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４＿ｄＦＬＯ８＿１及び＃１３＿ｄＦＬＯ８＿２の６つの技術的複製物（表５；実施例３）を、実施例３に記載のような２４－ＤＷＰフォーマットで培養した。２、１９、及び２６時間後、２つの複製物から１ｍＬの培養物を収集し、１６１００ｇ及び４℃で１分間遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞ペレットを１ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し、さらなる処理まで－８０℃で保存した。

【0356】

ＲＮＡ単離を実施例６に記載のように行った。残留ＤＮＡを除去するため、ＲＮＡサンプルを、製造業者のマニュアルに従ってＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）－ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。続いて、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ゲル電気泳動及び分光光度分析によって、ＲＮＡの品質、純度、及び濃度を解析した。

【0357】

ｃＤＮＡの合成は、製造業者のマニュアルに従ってＢｉｏｚｙｍ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて行った。簡潔に説明すると、５００ｎｇの総ＲＮＡを、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、及び合成緩衝液を含むマスター混合物に添加した。プライミングにはオリゴｄ（Ｔ）_２３ ＶＮ（ＮＥＢ）を使用した。反応混合物のインキュベートを５５℃で６０分間行った。続いて、酵素の不活性化は、反応混合物を９９℃で５分間インキュベートすることによって達成した。

【0358】

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）用にｖＨＨ特異的プライマーを使用した（表６）。正規化は、ＡＣＴ１発現レベルと比較することによって行った（表６）。１μＬのｃＤＮＡを解析するため、水及びプライマーをＳｅｎｓｉＭｉｘ ＳＹＢＲ ２ｘマスターミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）と混合し、リアルタイムＰＣＲサイクラー（Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ、Ｑｉａｇｅｎ）で解析した。

【表7】

【0359】

全ての試料を技術的３連で測定した。比較定量（ＱＣ）法を用いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅソフトウェアでデータ解析を行った。

【0360】

表７は、ｄＦＬＯ８株において、解析した全ての培養時点にわたって平均ｖＨＨ－転写物レベルが増加したことを示している。

【表8】

【0361】

実施例５：ＦＬＯ８破壊がラボスケールバイオリアクター流加バッチ培養におけるｐＧ１－３－駆動型分泌抗体断片の生産性に及ぼす影響
流加バッチ培養を行う前に、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性マーカーカセットを、ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４＿ｄＦＬＯ８＿４株（略称ｄＦＬＯ８＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４＿４）のゲノムから、実施例３に記載したように、Ｃｒｅ媒介組換えによって切除した（表５、実施例３）。得られた株ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４＿ｄＦＬＯ８＿４ ＃Ｌ１（略称Ｌ＿ｄＦＬＯ８＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４＿４＿１）の３つの複製物の生産性を、実施例３に記載の２４－ＤＰＷスクリーニングフォーマットにおけるその親株の３つの複製物の産物レベルと比較した（表８）。ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４＿ｄＦＬＯ８＿４ ＃Ｌ１の平均生産性は親株と同程度であった（ｐ値０．０９６）。

【0362】

【表9】

【0363】

ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４株及び対応するｌｏｘｅｄ ｄＦＬＯ８変異体ＣＢＳ２６１２＿Ｌ＿ｄＦＬＯ８＿ｐＧ１－３＿ｖＨＨ ＃４＿４＿１株を用いて、１Ｌベンチトップバイオリアクター（ＳＲ０７００ＯＤＬＳ；Ｄａｓｇｉｐ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で流加バッチ培養を行った。プレ培養のために、１Ｌ振とうフラスコ中に５０μｇｍＬ Ｚｅｏｃｉｎを含む１００ｍＬのＹＰＧ培地に１．０ｍＬの凍結ストックを接種し、１８０ｒｐｍ及び２５℃で約２４時間インキュベートした。バッチ培養物を０．２５Ｌの作業体積で運用し、１．５の出発ＯＤ６００に接種した。グリセロールバッチ媒体の組成を以下に示す。全プロセス中、温度を３０℃に制御し、ＤＯは、撹拌機速度（４００から１２００ｒｐｍの間）及び空気流（９．５から３０ｓＬｈ^－１の間）の自動調整によって３０％に維持し、ｐＨは、１２．５％ ＮＨ_４ＯＨの自動添加によって５．０に調節した。バッチ終了を示すＤＯの突然のスパイクの後、Ｐ_Ｇ１－３に基づくｑ_Ｐに対し特異的に最適化された、速い初期成長率とそれに続く徐々に減少するμの延長相をもたらす線形増分グルコース供給（培地組成を以下に詳述する）をμ動態に適用した（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0364】

１リットル当たりに含まれるグリセロールバッチ媒体：
２ｇクエン酸一水和物（Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７＊Ｈ_２Ｏ）、４５ｇグリセロール、１２．６ｇ（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、０．５ｇ ＭｇＳＯ^４＊７Ｈ_２Ｏ、０．９ｇ ＫＣｌ、０．０２２ｇ ＣａＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ、６．６ｍＬビオチンストック溶液（０．２ｇＬ^－１）、及び４．６ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液（実施例２に記載）。ＨＣｌ（濃）を加えてｐＨを５に設定した。

【0365】

１リットル当たりに含まれるグルコースフィード培地：
４９５ｇグルコース一水和物、５．２ｇ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、８．４ｇ ＫＣｌ、０．２８ｇ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、１１．８ｍＬビオチンストック溶液（０．２ｇＬ^－１）、及び１０．１ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液（実施例２に記載）。

【0366】

ＹＤＭ及び分泌組換えタンパク質を、プロセス全体における様々な時点で解析した（表９）。ＹＤＭ解析のために、１ｍＬの培養ブロスを、２ｍＬの（１０５℃で少なくとも２４時間）予め乾燥し予め秤量した遠心分離チューブに移した。１６１００ｇで５分間遠心分離した後、上清を慎重に新しいバイアルに移し、さらに使用するまで－２０℃で保存した。細胞ペレットを脱イオン水で２回洗浄し、１０５℃で少なくとも２４時間乾燥した後、再び重量を測定した。

【0367】

実施例３に記載のように、上清をマイクロ流体キャピラリー電気泳動（ＧＸＩＩ、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）によって解析した。

【表10】

^＊グルコース供給開始

【0368】

表９から、プロセス全体を通じて、ｄＦＬＯ８株の生成物力価がｗｔ－バックグラウンド株よりも一貫して高かったことが分かる。プロセスの最後に、生産性の５．７倍の増加が観察された。また、流加バッチ培養では、ｄＦＬＯ８株においてｖＨＨ転写物レベルの増加が全時間的に観察された。

【0369】

実施例６：ＦＬＯ８破壊が非メタノール炭素調節プロモーターの発現強度及び調節挙動に及ぼす影響
次のステップでは、誘導条件においてＦＬＯ８の破壊が他の炭素調節プロモーター（ＷＯ２０１３０５０５５１Ａ１及びＰｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３に記載）の転写強度に及ぼす影響について調べた。グルコース制限条件下のトランスクリプトーム解析のために、ＣＢＳ７４３５野生型及びＣＢＳ７４３６＿ＫａｎＲ＿ｄＦＬＯ８ ＃２を使用した。プレ培養物及びメイン培養物を２４ディープウェルプレート（２４－ＤＷＰ）で培養した。最初のプレ培養では、５００μｇｍＬ^－１のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（適切な場合）を含む２ｍＬのＹＰＤ（１リットル当たり：１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコース）に、それぞれＣＢＳ７４３５及びＣＢＳ７４３５＿ＫａｎＲ＿ｄＦＬＯ８ ＃２の単一コロニーを接種し、２５℃及び２８０ｒｐｍで約２４時間成長させた。第２のプレ培養には、４の出発ＯＤ_６００に接種した２ｍＬのＭ２（Ｄ）培地（以下に記載する組成物）を使用した。ディスク当たり１．６３ｔ^０．７４ｍｇ（ｔ＝時間［ｈ］）の非線形速度でグルコースを放出するグルコース放出ポリマービーズ（１２ｍｍ供給ビーズ、Ｋｕｈｎｅｒ，ＣＨ）を添加し、培養物を約２４時間、２５℃及び２８０ｒｐｍでインキュベートした。メイン培養物には２ｍＬのＭ２培地（グルコースを含まないＭ２（Ｄ））を使用した。培養物を２８０ｒｐｍ及び２５℃で振とうした。グルコースのゆっくりとした放出は、グルコース制限成長を確実にした。試料をメイン培養から３時間後に採取し（推定比成長率：０．１ｈ^－１）、予め冷却した固定液（５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］フェノール／エタノール［絶対値］）と直ちに２：１の割合で混合し、密封した試験管に分注し、１６１００ｇで１分間遠心分離した。ペレットは、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

【0370】

１Ｌ当たりに含まれるＭ２（Ｄ）：２２．０ｇグルコース一水和物、２２．０ｇクエン酸一水和物、３．１５ｇ（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、０．４９ｇ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、０．８０ｇ ＫＣｌ、０．０２６８ｇ ＣａＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ、１．４７ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液、０．４ｍｇビオチン；ｐＨはＫＯＨ（固体）で５に設定した。

【0371】

ＲＮＡ単離のために、１ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５００μＬの酸で洗浄したガラスビーズを加え、細胞をＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（ｍｐｂｉｏ）中で５．５ｍ／ｓの速度で４０秒間破壊した。その後、２００μＬのクロロホルムを加えた。続いて、試料を激しく振とうし、次いで室温で５～１０分間静置した。相分離を促進するために１６１００ｇ及び４℃で１０分間遠心分離した後、ＲＮＡを含む無色の上層水相を新しい試験管に移し、５００μＬのイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿させた。１０分間のインキュベート後、試料を１６１００ｇ及び４℃で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、風乾し、ＲＮａｓｅフリー水中に再懸濁した。

【0372】

トランスクリプトーム解析のために、インハウス設計のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ特異的オリゴヌクレオチドアレイ（ＡＭＡＤ－ＩＤ０３４８２１、８×１５Ｋカスタムアレイ；Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）を使用した（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．；ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８；９：３９０．）。ｃＲＮＡの合成、ハイブリダイゼーション、及びスキャニングは、Ａｇｉｌｅｎｔプロトコルに従って、２色発現アレイについて行った。試料をＣｙ３及びＣｙ５で３連で標識し、様々な培養条件下で成長させた細胞から生じた参照プールに対してハイブリダイズした。全てのサンプルについて、色素スワップ実験を行った。

【0373】

マイクロアレイデータの正規化ステップ及び統計的解析には、局所重み付けＭＡ－スキャッタープロット平滑化（ＬＯＥＳＳ）を用いてカラーバイアスを除去し、続いて「Ａｑｕａｎｔｉｌｅ」法を用いてアレイ間正規化を行うことが含まれた。差次的に発現する遺伝子を同定しｐ値を計算するために、ｅＢａｙｅｓ補正による線形モデル適合を使用した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ＆ Ｙｅｋｕｔｉｅｌｉ，２００１による偽検出法（ＦＤＲ）を用いた多重検定のためにＰ値を調整した。調整済みｐ値＜０．０５の遺伝子は、統計的に有意な差次的発現を有すると考えられる。差次的発現遺伝子を同定するために、さらに、少なくとも０．５８＞ｌｏｇ２ＦＣ＜－０．５８の倍数変化カットオフを適用した。

【0374】

全てのステップは、Ｒソフトウェア（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＭＤ，ＭｃＣａｒｔｈｙ ＤＪ，Ｓｍｙｔｈ ＧＫ．ｅｄｇｅＲ：ａ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．２０１０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２６：１３９－４０．）及びｌｉｍｍａパッケージを用いて行った。炭素調節遺伝子（炭素源調節プロモーターの制御下にある遺伝子）の選択に対する倍数変化を表１０に示す。ネイティブＦＬＯ８遺伝子の発現は、野生型と比較して、ｄＦＬＯ８変異体において明らかにかつ有意に減少している。全ての炭素源調節遺伝子について、ｄＦＬＯ８変異体の転写物レベルの増加が見られ、誘導条件下での転写強度は３．７～１１．４倍に達した。これらの遺伝子は全て、ｄＦＬＯ８変異体株において統計的に有意に高い転写（調整済みｐ値＜０．０５）を有する。これは、ＦＬＯ８の破壊により、Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３及びＰｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１８で記載されているような全ての非メタノール炭素調節プロモーターの産生の可能性が増強されることを強く示すものである。これに対し、ＧＡＰプロモーターの発現強度は、ＦＬＯ８の破壊による影響を受けない。

【0375】

表１０：ｄＦＬＯ８変異体が、グルコース制限誘導条件において炭素調節プロモーター下で制御されるＦＬＯ８遺伝子の転写強度に及ぼす影響。野生型株と比較したｄＦＬＯ８変異株間の倍数変化（ＦＣ）を示している。調整済みｐ値＜０．０５での発現変化は統計学的に有意な差を示している。

【表11】

【0376】

実施例７：ＦＬＯ８破壊がメタノール調節プロモーターｐＡＯＸ１の転写強度に及ぼす影響
ＦＬＯ８破壊が転写強度に及ぼす影響を、メタノール誘導条件下のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ標準プロモーター（例えば、ｐＡＯＸ１及びｐＧＡＰ）についても定量した。そのため、ｐＡＯＸ１の制御下で組換えＦａｂ断片を発現する株ＣＢＳ７４３５及びそれぞれのｄＦＬＯ８変異株ｄＦＬＯ８＃２をメタノールベースの流加バッチ培養で培養した。

【0377】

流加バッチは、１．４ＬのＤＡＳＧＩＰリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において最大使用容量１．０Ｌで実施した。培養温度を２５℃に制御し、ｐＨは２５％水酸化アンモニウムを加えることにより５．０に制御し、溶存酸素濃度は、撹拌速度を４００から１２００ｒｐｍの間、空気流を２４から７２ｓＬ／ｈの間に制御することにより２０％飽和超に維持した。

【0378】

流加バッチ培養のための接種物を、２０ｇ／Ｌのグリセロール及び５０μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを含む１００ｍＬのＹＰ培地を収容する振とうフラスコ中で培養し、２８℃及び１８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。培養物を使用して、バイオリアクター内の０．４Ｌの出発体積に接種して１．０の出発光学密度（６００ｎｍ）にした。バッチは約２４時間後に終了し、最初の（１０ｍＬ）ソルトショットが得られた。

【0379】

次いで、グリセロール流加バッチ溶液を５ｍＬ／ｈの一定速度で５時間供給した。次いで、メタノールパルス（２ｇ）及びソルトショット（１０ｍＬ）を培養物に加えた。培養中の溶存酸素濃度の増加によってメタノールパルス消費が示された後、メタノール流加バッチ溶液による一定供給を１．０ｇ／ｈの供給速度で開始した。新たに形成されたバイオマス１０ｇごとにソルトショット１０ｍＬを加えた。これは約４３ｇのメタノールフィード培地に対応する。バイオマス濃度の増加に伴い、メタノール供給速度は、メタノール供給を短時間停止したときに培地中の溶存酸素の急激な増加によってメタノール蓄積を除外することができた場合に、適切に増加した。最終的なメタノール供給速度は２．５ｇ／ｈであった。

【0380】

試料は頻繁に採取した。細胞密度が１００ｇ／Ｌ細胞乾燥重量超に達した約１００時間後に、培養物を収集した。

【0381】

培地は以下の通りである：
バッチ媒体（１リットル当たり）に含まれたもの：２．０ｇクエン酸、１２．４ｇ（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、０．０２２ｇ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．９ｇ ＫＣｌ、０．５ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４０ｇグリセロール、４．６ｍＬ ＰＴＭ１微量塩ストック溶液。ｐＨは、２５％ＨＣｌを用いて５．０に設定する。

【0382】

グリセロール流加バッチ溶液（１リットル当たり）には、６２３ｇグリセロール、１２ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液、及び４０ｍｇビオチンが含まれた。ＰＴＭ０の組成は実施例２に示されている。

【0383】

純粋なメタノールのメタノール流加バッチ溶液（１リットル当たり）には、１２ｍＬ ＰＴＭ０微量塩ストック溶液及び４０ｍｇビオチンが含まれた。

【0384】

ソルトショット溶液（１リットル当たり）に含まれたもの：２０．８ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４１．６ ＫＣｌ、１．０４ｇ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ。

【0385】

コーティング抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体（ａｂ７４９７、Ａｂｃａｍ）を用い、検出抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）－アルカリホスファターゼ結合抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ８５４２）を用いて、ＥＬＩＳＡによるインタクトなＦａｂの定量化を行った。ヒトＦａｂ／Ｋａｐｐａ、ＩｇＧ断片（Ｂｅｔｈｙｌ Ｐ８０－１１５）を出発濃度１００ｎｇ／ｍＬで標準物質として使用し、上清試料を適宜希釈した。検出はｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ Ｓ０９４２）を用いて行った。コーティング、希釈、及び洗浄バッファーは、ＰＢＳ（２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、２．７ｍＭ ｇ ＫＣｌ、８ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に基づいており、適宜ＢＳＡ（１％（ｗ／ｖ））及び／またはＴｗｅｅｎ２０（０．１％（ｖ／ｖ））を用いて完了した。

【0386】

産物力価に関しては、ｐＡＯＸ１の制御下のｄＦＬＯ８変異体でのＦａｂ産生の増加は、メタノール流加バッチ培養の終了時（ＷＯ２０１５／１５８８００Ａ１に記載のように１１９時間後）に最大１．４５倍であり、一方バイオマス形成はわずかに減少した（１０～１４％）。

【0387】

マイクロアレイ試料を５３．５時間後（２５時間のメタノール供給）に採取し、実施例６に記載のように処理した。野生型株と比較したｄＦＬＯ８変異株間の遺伝子の選択についての倍数変化を表１１に示す。この場合も、ｄＦＬＯ８変異体におけるＦＬＯ８転写物レベルは、野生型と比較して有意に低い。表１０に示される非メタノール炭素調節遺伝子及びプロモーターとは対照的に、メタノール誘導性ｐＡＯＸ１は、完全誘導条件でのｄＦＬＯ８変異体における転写強度について、野生型と比較して有意な増加を示さない（調整済みｐ値が０．０５より大きいため）。また、メタノール成長細胞におけるｐＧＡＰにも有意な影響は認められない。したがって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるこれらの標準プロモーターの転写は、ＦＬＯ８の過小発現による影響を受けない。

【0388】

表１１：ｄＦＬＯ８変異体が、メタノール誘導流加バッチ条件においてＦＬＯ８遺伝子及びメタノール誘導可能ＡＯＸ１プロモーター下で制御される遺伝子の転写強度に及ぼす影響。野生型株と比較したｄＦＬＯ８変異株間の倍数変化（ＦＣ）を示している。調整済みｐ値＜０．０５での発現変化は統計学的に有意な差を示している。

【表12】

【0389】

実施例８：ＦＬＯ８破壊が非メタノール炭素調節プロモーターによって駆動される細胞内ｅＧＦＰ発現に及ぼす影響
ほとんどの非メタノール炭素調節プロモーター（ＷＯ２０１３０５０５５１Ａ１；Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３））によって駆動されるネイティブ遺伝子の発現が、ｄＦＬＯ８株での誘導条件下で顕著に上方調節された（実施例６参照）ため、ＷＯ２０１３０５０５５１Ａ１及びＰｒｉｅｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に記載のそれぞれのｅＧＦＰレポーター株においてもＦＬＯ８の破壊を試験した。各非メタノール誘導可能プロモーターについて、ｐＰＭ１ａＺ１０＿ｐＧ＃＿ｅＧＦＰ発現ベクター（ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ３＿ｅＧＦＰ ＃１；ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ４＿ｅＧＦＰ ＃６；ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ６＿ｅＧＦＰ ＃５３；Ｘ３３＿ｐＧ７＿ｅＧＦＰ ＃１；ＣＢＳ２６１２＿ｐＧ８＿ｅＧＦＰ ＃８）を有する１つの株を選択し、実施例１に記載のスプリットマーカーカセット法を用いることにより、ＦＬＯ８を破壊した。多糖及びグルコース放出酵素が異なる供給業者（ＥｎＰｕｍｐ２００、Ｅｎｐｒｅｓｓｏ）から得たことを除き、実施例２に記載のように誘導（グルコース制限）条件下でのスクリーニング培養を行った。新たなグルコース放出酵素の性質が異なるため、濃度を約０．６ｍｇｍＬ^－１ｈ^－１の一定グルコース放出速度に対応して０．４％に適合させた。各場合において、それぞれの親の２つの複製物及び少なくとも７つの対応するｄＦＬＯ８株をスクリーニングした。ｅＧＦＰ－生産性は、細胞サイズについて値を正規化しなかったことを除いて、実施例２に記載のように定量した。表１２は、ＦＬＯ８の破壊が各プロモーターにおけるｅＧＦＰ蛍光の増加をもたらし、ｐＧ３及びｐＧ８の場合にそれぞれ１．７倍及び１．２倍、ｐＧ４及びｐＧ７の場合に２．３倍、ｐＧ６の場合に２．２倍に達することを示している。このことは、ｐＧ１及びｐＧ１派生物以外の他の非メタノール炭素調節プロモーターを増強することに対するＦＬＯ８破壊の可能性をさらに強調するものである。

【0390】

これらの結果は、野生型宿主細胞におけるこのような発現と比較して、ｄＦＬＯ８宿主細胞ではｐＧ１またはｐＧ１派生物（ｐＧ１－３）の制御下でｅＧＦＰ発現が増加することを裏付けている。表２は、ＦＬＯ８の破壊が、ｐＧ１及びｐＧ１－３の場合にｅＧＦＰ蛍光の増加をもたらし、それぞれ３．８（または３．９）及び２．８（または２．９）倍であることを示している。

【0391】

表１２：ｄＦＬＯ８が非メタノール炭素源調節プロモーターの制御下でｅＧＦＰの発現に及ぼす影響。グルコース制限（誘導）条件で４８時間培養した後のｐＧＡＰ発現のパーセンテージとしてのｅＧＦＰ発現レベル及びそれぞれのｄＦＬＯ８＿ｐＧ＃＿ｅＧＦＰ株の倍数変化とを親野生型株と比較して示している。

【表13】

【0392】

参考文献：
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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図1-8】

【図1-9】

【図1-10】

【図1-11】

【図1-12】

【図1-13】

【図1-14】

【図1-15】

【配列表】

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