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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-20
(45)【発行日】2022-04-28
(54)【発明の名称】６７ｋＤａラミニンレセプター活性化剤及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/353 20060101AFI20220421BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20220421BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20220421BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220421BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220421BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20220421BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220421BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220421BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220421BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220421BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220421BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220421BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220421BHJP
【ＦＩ】
A61K31/353
A23L33/105
A61K31/7048
A61K45/00 ZNA
A61P3/04
A61P7/02
A61P9/10 101
A61P21/00
A61P29/00
A61P35/00
A61P37/04
A61P37/08
A61P43/00 111
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2017151708
(22)【出願日】2017-08-04
(65)【公開番号】P2018027935
(43)【公開日】2018-02-22
【審査請求日】2020-07-29
(31)【優先権主張番号】P 2016158139
(32)【優先日】2016-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504145342
【氏名又は名称】国立大学法人九州大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(72)【発明者】
【氏名】立花 宏文
【審査官】菊池 美香
(56)【参考文献】
【文献】特開２００５－０７５７９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１１９４１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－３３６１１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－０３９８８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０８－００３０５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－０７７２３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第１１／１６２３２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１５／１９９１６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中村淳一 他，特定保健用食品「黒烏龍茶 OTPP」の継続摂取による内蔵脂肪低減効果とその安全性，薬理と治療，2007年06月，Vol.35, No.6，p.661-671，第６６２頁右欄、［２．試験飲料］、第６７１頁左欄第１０－１９行
【文献】松井陽吉，茶系飲料について ウーロン茶の魅力，日本食生活学会誌，2000年，Vol,11 No.1，第2-15頁，第１０頁右欄［表１７］、第１１頁左欄（２）
【文献】吉本孝憲，ウーロンホモビスフラバンＢは６７ＬＲを介して多発性骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導する，JSoFF LETTER [online]，No.71, 6月号，2017年06月15日，インターネット, 第１１頁，<URL:http://nodaiweb.university.jp/jsoff/jsoffletter71.pdf>, 第１１頁全文
【文献】第２１回日本フードファクター学会学術集会、２０１６年１１月、第７４頁、アブストラクト番号ＹＩＡ－３
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／３５３
Ａ２３Ｌ ３３／１０５
Ａ６１Ｋ ３１／７０４８
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｐ ３／０４
Ａ６１Ｐ ７／０２
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ ２１／００
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３７／０４
Ａ６１Ｐ ３７／０８
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウーロンホモビスフラバンＢを有効成分として含有する、６７ｋＤａラミニンレセプター（６７ＬＲ）活性化剤。
【請求項2】
６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用であり、前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、動脈硬化、炎症、筋委縮、血栓症又は免疫不全である、請求項１に記載の６７ＬＲ活性化剤。
【請求項3】
請求項１に記載の６７ＬＲ活性化剤と、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲを活性化するための組成物であって、
前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）阻害剤であり、
前記フラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ヘスペレチン、エリオジクチオール配糖体、ナリンゲニン配糖体又はヘスペレチン配糖体である、組成物。
【請求項4】
６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用であり、前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満又は炎症である、請求項３に記載の６７ＬＲを活性化するための組成物。
【請求項5】
前記６７ＬＲ関連疾患が癌である、請求項４に記載の６７ＬＲを活性化するための組成物。
【請求項6】
請求項１に記載の６７ＬＲ活性化剤を含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物であって、前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、動脈硬化、炎症、筋委縮、血栓症又は免疫不全である、食品組成物。
【請求項7】
請求項１に記載の６７ＬＲ活性化剤と、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物であって、
前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）阻害剤であり、
前記フラバノン若しくはその配糖体が、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ヘスペレチン、エリオジクチオール配糖体、ナリンゲニン配糖体又はヘスペレチン配糖体であり、
前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満又は炎症である、食品組成物。
【請求項8】
前記６７ＬＲ関連疾患が癌である、請求項７に記載の食品組成物。
【請求項9】
請求項６に記載の食品組成物を非ヒト動物に摂取させる工程を備える、癌、アレルギー、動脈硬化、炎症、筋委縮、血栓症又は免疫不全の予防又は改善方法。
【請求項10】
請求項７に記載の食品組成物を非ヒト動物に摂取させる工程を備える、癌、アレルギー、肥満又は炎症の予防又は改善方法。
【請求項11】
請求項８に記載の食品組成物を非ヒト動物に摂取させる工程を備える、癌の予防又は改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、６７ｋＤａラミニンレセプター（以下、「６７ＬＲ」という場合がある。）アゴニスト及びその使用に関する。より具体的には、６７ＬＲアゴニスト、６７ＬＲアゴニスト組成物、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物及び６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法に関する。
【背景技術】
【0002】
緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－Ｏ－ｇａｌｌａｔｅ、以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）は、抗癌作用を有することが報告されており（例えば、非特許文献１を参照。）、血液癌の一種である慢性リンパ性白血病患者において第二相臨床試験が行われている（例えば、非特許文献２を参照。）。
【0003】
発明者らは、これまでにＥＧＣＧが細胞膜上の６７ＬＲに結合することで抗癌作用を発揮することを明らかにした（例えば、非特許文献３を参照。）。６７ＬＲの発現は癌細胞において異常に亢進している。ＥＧＣＧが６７ＬＲに結合すると、Ａｋｔが活性化され、内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化され、一酸化窒素（ＮＯ）及び環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の産生が誘導され、タンパク質キナーゼＣδ（ＰＫＣδ）が活性化され、産生スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）が活性化され、その結果、細胞死が誘導される。すなわち、ＥＧＣＧは、６７ＬＲを介してｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路を活性化し、細胞致死活性を示す。
【0004】
６７ＬＲを介したＥＧＣＧの作用には、抗癌作用だけでなく、抗アレルギー作用、抗肥満作用、抗動脈硬化作用、抗炎症作用、筋萎縮阻害作用、コレステロール低下作用、抗血栓性作用、免疫増強作用、神経細胞保護作用等が知られている（例えば、特許文献１、２を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２０１１／１６２３２０号
【文献】国際公開第２０１５／１９９１６９号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Khan N, et al., Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate., Cancer res., 66 (5), 2500-2505, 2006.
【文献】Shanafelt TD, et al., Phase I trial of daily oral Polyphenon E in patients with asymptomatic Rai stage 0 to II chronic lymphocytic leukemia., J. Clin. Oncol., 27 (23), 3808-3814, 2009.
【文献】Tachibana H, et al., A receptor for green tea polyphenol EGCG., Nat. Struct. Mol. Biol., 11 (4), 380-381, 2004.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
このような状況のもと、ＥＧＣＧの作用増強が強く望まれている。本発明は、ＥＧＣＧよりも強力な６７ＬＲアゴニストを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ＬＲアゴニスト。
［２］前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（１）又は（２）で表される化合物である、［１］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１～３のアルキル基又は－ＯＲ２（ここで、Ｒ２はグルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース又はマルトースから水素原子を１個除いた基を表す。）を表し、Ｒ３はそれぞれ独立に存在しないか又はハロゲン原子若しくは炭素数１～３のアルキル基を表し、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子又は下記式（１Ａ）で表される基を表す。］
［式（１Ａ）中、Ｒ１及びＲ３の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［式（２）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［３］前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（３）～（６）のいずれかで表される化合物である、［１］又は［２］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
［式（３）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［式（４）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［式（５）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［式（６）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［４］６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニスト。
［５］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［４］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニストと、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲアゴニスト組成物。
［７］６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、［６］に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
［８］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［７］に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
［９］［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニストを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
［１０］ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を更に含有する、［９］に記載の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
［１１］［９］又は［１０］に記載の食品組成物をヒト又は動物に摂取させる工程を備える、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法（ヒトに対する医療行為を除く。）。
［１２］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［１１］に記載の予防又は改善方法。
［１］ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ＬＲアゴニスト。
［２］前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（１）又は（２）で表される化合物である、［１］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
【化1】
【化2】
【化3】
［３］前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（３）～（６）のいずれかで表される化合物である、［１］又は［２］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
［４］６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニスト。
［５］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［４］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニストと、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲアゴニスト組成物。
［７］６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、［６］に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
［８］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［７］に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
［９］［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニストを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
［１０］ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を更に含有する、［９］に記載の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
［１１］［９］又は［１０］に記載の食品組成物をヒト又は動物に摂取させる工程を備える、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法（ヒトに対する医療行為を除く。）。
［１２］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［１１］に記載の予防又は改善方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、ＥＧＣＧよりも強力な６７ＬＲアゴニストを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】（ａ）～（ｎ）は、実験例１における各癌細胞株の生存率を示すグラフである。
【図2】実験例１において、各癌細胞株に対するウーロンホモビスフラバンＢ（ＯＨＢＦＢ）のＩＣ５０とＥＧＣＧのＩＣ５０をプロットしたグラフである。
【図3】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２における蛍光顕微鏡写真である。
【図4】実験例３における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図5】実験例４における細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。
【図6】実験例５における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図7】（ａ）は、実験例６において、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７及びｅＮＯＳをウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化し、ｅＮＯＳの存在量に対するリン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７の存在量を算出した結果を示すグラフである。
【図8】実験例７における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図9】実験例８におけるＡｋｔ活性の測定結果を示すグラフである。
【図10】実験例９における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図11】実験例１０における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図12】実験例１１におけるアイソボログラム解析の結果を示すグラフである。
【図13】実験例１２におけるアイソボログラム解析の結果を示すグラフである。
【図14】実験例１３における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図15】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１４において、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）における、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞数を計測した結果を示すグラフである。
【図16】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１４において、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図17】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１４において、リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図18】実験例１４において、ＯＨＢＦＢ非投与群（対照）及び投与群の腫瘍組織におけるＡＳＭ活性の測定結果を示すグラフである。
【図19】ＯＨＢＦＢにより活性化される、ｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路の模式図を示す。
【図20】実験例１６における細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。
【図21】（ａ）～（ｃ）は、実験例１７におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図22】実験例１８におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図23】実験例１９におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図24】実験例２０におけるＴＮＦ－α量の算出結果を示すグラフである。
【図25】実験例２１におけるβ－ヘキソサミニダーゼの遊離率の算出結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
［６７ＬＲアゴニスト］
１実施形態において、本発明は、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ＬＲアゴニストを提供する。
１実施形態において、本発明は、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ＬＲアゴニストを提供する。
【0012】
実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ＥＧＣＧよりも強力に６７ＬＲの下流のシグナル伝達経路を活性化する。ここで、ＥＧＣＧよりも強力であるとは、例えば、ＥＧＣＧと比較して５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が低いことを意味する。ＩＣ５０は、例えば、癌細胞の培地に段階希釈した６７ＬＲアゴニストを添加し、９６時間培養後の細胞生存率を測定すること等により測定することができる。
【0013】
ウーロン茶重合ポリフェノールとは、半発酵というウーロン茶の独特の製造方法において、酵素反応や熱重合反応により形成される、カテキン類が複雑に結合した化合物の総称であり、例えばカテキン類の２量体、カテキン類の３量体等が挙げられる。カテキン類の２量体としては、例えば、後述するウーロンホモビスフラバンＡ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ、ウーロンホモビスフラバンＢ、ウーロンホモビスフラバンＣ等のウーロンホモビスフラバン類等が挙げられる。
【0014】
本実施形態の６７ＬＲアゴニストの分子量は、例えば８００以上であってもよく、例えば９００以上であってもよく、例えば１０００以上であってもよい。６７ＬＲアゴニストの分子量の上限は特に制限されないが、概ね３０００程度であってもよい。
【0015】
一般的に、分子量が５００以上の化合物は、経口投与した場合に生体内への吸収が悪いと考えられている。このため、ウーロン茶重合ポリフェノールは、経口投与しても生体内に吸収されにくいと考えられている。
【0016】
これに対し、発明者らは、実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、分子量が比較的大きいにもかかわらず、経口投与により生体内の癌組織に到達し、６７ＬＲの下流のシグナル伝達経路を活性化することができることを明らかにした。
【0017】
本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の溶媒和物であってもよく、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の薬学的に許容される塩であってもよく、薬学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。
【0018】
薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。より具体的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩；アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩；グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
【0019】
また、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の溶媒和物、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【0020】
より具体的な本実施形態の６７ＬＲアゴニストとしては、例えば、下記式（１）又は（２）で表される化合物が挙げられる。
【0021】
【化8】
【0022】
【化9】
【0023】
【化10】
【0024】
上記式（１）で表される化合物は、ウーロンホモビスフラバン類と呼ばれる化合物又はその誘導体を含む。いいかえると、上記式（１）で表される化合物は、カテキン類の２量体を骨格とする化合物であるということができる。また、上記式（２）で表される化合物は、カテキン類の３量体を骨格とする化合物であるということができる。
【0025】
本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、６７ＬＲのアゴニスト活性を有している限り、ウーロン茶重合ポリフェノールの誘導体であってもよい。ウーロン茶重合ポリフェノールの誘導体としては、例えばウーロン茶重合ポリフェノールを基本骨格として、一部の官能基を変更する等した化合物が挙げられる。
【0026】
ウーロン茶重合ポリフェノールを誘導体化することにより、例えば、水溶性、脂溶性等の物理的な性質や、６７ＬＲアゴニスト活性、血中滞留性、生体毒性等の生物学的な活性等を所望の範囲に調節することができる。
【0027】
ウーロン茶重合ポリフェノールの誘導体としては、上記式（１）、上記式（１Ａ）又は上記式（２）において、Ｒ１がそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１～３のアルキル基又は－ＯＲ２（ここで、Ｒ２はグルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース又はマルトースから水素原子を１個除いた基を表す。）であり、Ｒ３がそれぞれ独立に存在しないか又はハロゲン原子若しくは炭素数１～３のアルキル基である化合物等が挙げられる。
【0028】
ここで、Ｒ１又はＲ３で表される炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基は置換されていてもよい。炭素数１～３のアルキル基の置換基としては、例えばハロゲン原子が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。また、Ｒ３で表されるハロゲン原子としては、フッ素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
【0029】
更に具体的な本実施形態の６７ＬＲアゴニストとしては、例えば、下記式（３）～（６）のいずれかで表される化合物が挙げられる。
【0030】
【化11】
【0031】
式（３）で表され、式（３）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在せず、Ｒ４が上記式（１Ａ）で表され、式（１Ａ）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在しない化合物は、ウーロンホモビスフラバンＡとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロンホモビスフラバンＡ又はその誘導体であってもよい。
【0032】
また、上記のウーロンホモビスフラバンＡにおいて、Ｒ４で表される基の一方が水素原子である化合物は、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ又はその誘導体であってもよい。
【0033】
【化12】
【0034】
式（４）で表され、式（４）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在せず、Ｒ４が上記式（１Ａ）で表され、式（１Ａ）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在しない化合物は、ウーロンホモビスフラバンＢとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロンホモビスフラバンＢ又はその誘導体であってもよい。
【0035】
【化13】
【0036】
式（５）で表され、式（５）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在せず、Ｒ４が上記式（１Ａ）で表され、式（１Ａ）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在しない化合物は、ウーロンホモビスフラバンＣとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロンホモビスフラバンＣ又はその誘導体であってもよい。
【0037】
【化14】
【0038】
式（６）で表される化合物は、例えば、次のような製造方法により製造することができる。すなわち、エピガロカテキン－３－Ｏ－ガレート等のフラバン－３－オール類を、メタノール、エタノール等の溶媒中で、塩酸、硫酸等の酸の存在下、ホルムアルデヒドと反応させること等により製造することができる。反応溶液中のホルムアルデヒドの濃度は、３～３７ｗ／ｖ％が好ましい。生じた生成物は、必要に応じてエステル化、加水分解等の誘導化を行ってもよい。
【0039】
本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用に好適に用いることができる。本明細書において、６７ＬＲ関連疾患としては、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症、免疫不全等が挙げられる。
【0040】
実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストを生体に投与することにより、例えば癌細胞致死活性、すなわち抗癌活性を発揮することができる。癌としては、６７ＬＲの発現が亢進している癌であれば特に制限されず、例えば、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、子宮頸癌、結腸癌等が挙げられる。
【0041】
また、実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストの作用機序はＥＧＣＧの作用機序と同様である。したがって、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ＥＧＣＧにおいて見出されているものと同様の用途に用いることができる。
【0042】
［６７ＬＲアゴニスト組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した６７ＬＲアゴニストと、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲアゴニスト組成物を提供する。６７ＬＲアゴニストとしては、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
１実施形態において、本発明は、上述した６７ＬＲアゴニストと、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲアゴニスト組成物を提供する。６７ＬＲアゴニストとしては、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【0043】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、上述した６７ＬＲアゴニストと、ＰＤＥ阻害剤とを含有するものであってもよい。
【0044】
実施例において後述するように、上述した６７ＬＲアゴニストと、ＰＤＥ阻害剤とを併用することにより、６７ＬＲアゴニストの活性を相乗的に増強することができる。
【0045】
ＰＤＥ阻害剤は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質であり、非選択的なＰＤＥ阻害剤と選択的なＰＤＥ阻害剤とが知られている。本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物が含有するＰＤＥ阻害剤は、非選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよく、選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよい。
【0046】
非選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ペントキシフィリン等が挙げられる。
【0047】
選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、８－メトキシ－３－イソブチル－１－メチルキサンチン等のＰＤＥ１阻害剤；エリスロ－９－（２－ヒドロキシ－３－ノニル）アデニン塩酸塩等のＰＤＥ２阻害剤；シロスタミド、ミルリノン、トレキシン等のＰＤＥ３阻害剤；エタゾラート塩酸塩、デンブフィリン等のＰＤＥ４阻害剤；バルデナフィル、シルデナフィル、ザプリナスト、タダラフィル、ジピリダモール、４－｛［３’，４’－（メチレンジオキシ）ベンジル］アミノ｝－６－メトキシキナゾリン、１－（３－クロロアニリノ）－４－フェニルフタラジン（ＭＹ－５４４５）、硫化水素等のＰＤＥ５阻害剤が挙げられる。中でも、ＰＤＥ３阻害剤又はＰＤＥ５阻害剤が好ましい。
【0048】
ところで、生体にポリスルフィド類を投与すると、代謝されて硫化水素が生成される。このため、ポリスルフィド類はＰＤＥ５阻害剤であるということができる。ポリスルフィド類としては、例えばジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド等が挙げられる。
【0049】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、ＰＤＥ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、６７ＬＲアゴニストも、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【0050】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、ＰＤＥ阻害剤１００質量部あたりの６７ＬＲアゴニストの配合割合は、例えば１～１０００質量部であってもよく、例えば１～５００質量部であってもよく、例えば１０～１００質量部であってもよく、例えば１０～８０質量部であってもよい。
【0051】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、上述した６７ＬＲアゴニストと、フラバノン若しくはその配糖体とを含有するものであってもよい。
【0052】
実施例において後述するように、上述した６７ＬＲアゴニストと、フラバノン若しくはその配糖体とを併用することにより、６７ＬＲアゴニストの活性を相乗的に増強することができる。
【0053】
フラバノン若しくはその配糖体としては、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ヘスペレチン、エリオジクチオール配糖体、ナリンゲニン配糖体、ヘスペレチン配糖体等が挙げられる。
【0054】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、フラバノン若しくはその配糖体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、６７ＬＲアゴニストについても、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【0055】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、フラバノン若しくはその配糖体１００質量部あたりの６７ＬＲアゴニストの配合割合は、例えば１～１００質量部であってもよく、例えば１０～１００質量部であってもよく、例えば２０～１００質量部であってもよい。
【0056】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、上述した６７ＬＲアゴニストと、ＰＤＥ阻害剤と、フラバノン若しくはその配糖体とを含有するものであってもよい。
【0057】
本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用であってもよい。６７ＬＲ関連疾患としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
【0058】
［医薬組成物］
上述した６７ＬＲアゴニスト又は６７ＬＲアゴニスト組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として製剤化されていてもよい。
上述した６７ＬＲアゴニスト又は６７ＬＲアゴニスト組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として製剤化されていてもよい。
【0059】
上記の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
【0060】
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
【0061】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【0062】
医薬組成物は、上述した６７ＬＲアゴニスト又は６７ＬＲアゴニスト組成物と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【0063】
医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（６７ＬＲアゴニスト）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１～５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。
【0064】
また、医薬組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。
【0065】
［食品組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した６７ＬＲアゴニストを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物を提供する。本実施形態の食品組成物は、ＰＤＥ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を更に含有していてもよい。
１実施形態において、本発明は、上述した６７ＬＲアゴニストを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物を提供する。本実施形態の食品組成物は、ＰＤＥ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を更に含有していてもよい。
【0066】
実施例において後述するように、本実施形態の食品組成物を生体に摂取させることにより、６７ＬＲ関連疾患を予防又は改善することができる。６７ＬＲ関連疾患としては、上述したものが挙げられる。
【0067】
本実施形態の食品組成物において、６７ＬＲアゴニストとしては、上述したもののうち、食品への添加が認められたものを適宜使用することができる。
【0068】
より具体的な６７ＬＲアゴニストとしては、例えば、ウーロン茶から抽出されたウーロン茶重合ポリフェノール、ウーロンホモビスフラバンＡ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ、ウーロンホモビスフラバンＢ、ウーロンホモビスフラバンＣ等が挙げられる。
【0069】
６７ＬＲアゴニストは、化学的に合成されたもの又は天然物から精製されたものを添加してもよく、６７ＬＲアゴニストを含む食品を食品組成物の原料に用いることにより含有させてもよい。６７ＬＲアゴニストを含有する食品としては、例えば、ウーロン茶、ウーロン茶抽出物、紅茶、紅茶抽出物等が挙げられる。
【0070】
本実施形態の食品組成物において、ＰＤＥ阻害剤は、食品への添加が認められた成分であることが好ましく、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、ポリスルフィド類等が挙げられる。ポリスルフィド類としては、例えばジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド等が挙げられる。これらのＰＤＥ阻害剤は、化学的に合成されたもの又は天然物から精製されたものを添加してもよく、これらのＰＤＥ阻害剤を含む食品を食品組成物の原料に用いることにより含有させてもよい。カフェインを含有する食品としては、例えば、コーヒー、緑茶、ウーロン茶、紅茶、ココア等が挙げられる。テオフィリンを含有する食品としては、例えば、茶葉等が挙げられる。テオブロミンを含有する食品としては、例えば、カカオ等が挙げられる。ポリスルフィド類を含有する食品としては、ニンニク、ネギ、ニラ、タマネギ、ラッキョウ等のネギ属野菜等が挙げられる。
【0071】
本実施形態の食品組成物において、フラバノン若しくはその配糖体としては、食品への添加が認められた成分であることが好ましく、例えば、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ヘスペレチン、エリオジクチオール配糖体、ナリンゲニン配糖体、ヘスペレチン配糖体等が挙げられる。
【0072】
これらのフラバノン若しくはその配糖体は、化学的に合成されたもの又は天然物から精製されたものを添加してもよく、これらのフラバノン若しくはその配糖体を含む食品を食品組成物の原料に用いることにより含有させてもよい。これらのフラバノン若しくはその配糖体を含有する食品としては、例えば、柑橘類が挙げられる。柑橘類としては、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、ユズ、ダイダイ、カボス、スダチ、ユコウ、ゆうこう、シークヮーサー、レモン、ライム、ナツミカン、ハッサク、イヨカン、ブンタン、マンダリンオレンジ、ウンシュウミカン、ポンカン、タチバナ、紀州ミカン、バレンシアオレンジ、ネーブルオレンジ、ブラッドオレンジ、ジャッファ・オレンジ、ベルガモット、キノット等のミカン属柑橘類、カラタチ属柑橘類、キンカン属柑橘類等が挙げられる。
【0073】
本実施形態の食品組成物において、６７ＬＲアゴニスト、ＰＤＥ阻害剤、フラバノン若しくはその配糖体は、それぞれ１種を単独で添加してもよく、２種以上を混合して添加してもよい。
【0074】
本実施形態の食品組成物は、１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の６７ＬＲアゴニストを摂取するように用いられてもよい。また、食品組成物は、１日１回又は２～４回程度に分けて摂取するように用いられてもよい。
【0075】
本実施形態の食品組成物は、例えば、サプリメントの形態であってもよいし、飲料の形態であってもよいし、固形状、半固形状又はゲル状食品の形態であってもよいし、任意の調理済み食品の形態等であってもよい。サプリメントの形状としては、例えば、実施例において使用したカプセル等の形状が挙げられる。
【0076】
本実施形態の食品組成物は、機能性表示食品であってもよい。「機能性表示食品」とは、科学的根拠を基に商品パッケージに機能性を表示するものとして、消費者庁に届け出られた食品を意味する。当該表示として、例えば、「血中コレステロールを低下させる」、「自然免疫力を向上させ、感染因子からの保護に寄与する」等が挙げられるが、これらに限定されない。また、機能性表示のない食品組成物であっても、機能性をチラシ、広告等に記載又は音声等で表示して製造、販売することも考えらえる。
【0077】
本実施形態の食品組成物は、特別用途食品であってもよい。特別用途食品とは、国の許可を受けて、乳児、幼児、妊産婦、病者等の発育、健康の保持・回復等に適するという特別の用途について表示する食品を意味する。本実施形態の食品組成物は、特別用途食品のうちの病者用食品であってもよい。あるいは、本実施形態の食品組成物は、特別用途食品のうちの特定保健用食品であってもよい。特定保健用食品とは、健康の維持増進に役立つことが科学的根拠に基づいて認められ、その効果の表示が許可されている食品を意味する。表示されている効果や安全性については国が審査を行い、食品ごとに消費者庁長官により許可される。
【0078】
［６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法］
１実施形態において、本発明は、上述した食品組成物をヒト又は動物に摂取させる工程を備える、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法（ヒトに対する医療行為を除く。）を提供する。ここで、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。本実施形態の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法において、医療行為とは、医師（医師の指示を受けた者を含む。）がヒトに対して治療を実施する行為を意味する。
１実施形態において、本発明は、上述した食品組成物をヒト又は動物に摂取させる工程を備える、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法（ヒトに対する医療行為を除く。）を提供する。ここで、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。本実施形態の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法において、医療行為とは、医師（医師の指示を受けた者を含む。）がヒトに対して治療を実施する行為を意味する。
【0079】
本実施形態の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法において、ヒト又は動物に摂取させる食品組成物の量としては、１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の６７ＬＲアゴニストを摂取する量が挙げられる。食品組成物は、１日１回又は２～４回程度に分けて摂取させてもよい。
【0080】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、６７ＬＲ関連疾患の治療方法を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述した６７ＬＲアゴニストが挙げられる。また、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。
１実施形態において、本発明は、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、６７ＬＲ関連疾患の治療方法を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述した６７ＬＲアゴニストが挙げられる。また、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。
【0081】
１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ関連疾患の治療のためのウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述した６７ＬＲアゴニストが挙げられる。また、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。
【0082】
１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療薬を製造するためのウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の使用を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述した６７ＬＲアゴニストが挙げられる。また、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。
【実施例】
【0083】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【0084】
［実験例１］
（ウーロンホモビスフラバンＢの抗癌作用）
ウーロンホモビスフラバンＢ（Ｏｏｌｏｎｇ ｈｏｍｏ ｂｉｓ ｆｌａｖａｎ Ｂ、以下、「ＯＨＢＦＢ」という場合がある。）の抗癌作用を検討した。具体的には、各種の癌細胞株の培地にＯＨＢＦＢを添加し、生細胞数を測定した。比較のために、エピガロカテキンガレート（以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）の抗癌作用についても同様に検討した。
（ウーロンホモビスフラバンＢの抗癌作用）
ウーロンホモビスフラバンＢ（Ｏｏｌｏｎｇ ｈｏｍｏ ｂｉｓ ｆｌａｖａｎ Ｂ、以下、「ＯＨＢＦＢ」という場合がある。）の抗癌作用を検討した。具体的には、各種の癌細胞株の培地にＯＨＢＦＢを添加し、生細胞数を測定した。比較のために、エピガロカテキンガレート（以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）の抗癌作用についても同様に検討した。
【0085】
癌細胞株としては、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＡＲＨ７７、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６、ヒト慢性リンパ性白血病細胞株であるＭｅｃ－１、ヒト急性骨髄性白血病細胞株であるＨＬ６０、ヒト急性骨髄性白血病細胞株であるＫａｓｕｍｉ－１、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株であるＫＵ８１２を用いた。
【0086】
各癌細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地を用いて、３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で継代し、対数増殖期で培養維持したものを使用した。
【0087】
ＥＧＣＧ（シグマアルドリッチ社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。ＯＨＢＦＢ（長良バイオサイエンス社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
【0088】
各癌細胞株を、１％ＦＣＳ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるようにそれぞれ懸濁して９６ウェルプレートに播種し、終濃度０、５、１０又は２５μＭのＯＨＢＦＢ又はＥＧＣＧをそれぞれ添加して９６時間培養した。その後、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて生細胞数を測定した。
【0089】
図１（ａ）～（ｎ）は、各癌細胞株の生存率を示すグラフである。図１（ａ）～（ｇ）は培地にＯＨＢＦＢを添加した結果を示し、図１（ｈ）～（ｎ）は培地にＥＧＣＧを添加した結果を示す。図１（ａ）及び（ｈ）はＵ２６６細胞の結果を示し、図１（ｂ）及び（ｉ）はＡＲＨ７７細胞の結果を示し、図１（ｃ）及び（ｊ）はＲＰＭＩ８２２６細胞の結果を示し、図１（ｄ）及び（ｋ）はＭｅｃ－１細胞の結果を示し、図１（ｅ）及び（ｌ）はＨＬ６０細胞の結果を示し、図１（ｆ）及び（ｍ）はＫａｓｕｍｉ－１細胞の結果を示し、図１（ｇ）及び（ｎ）はＫＵ８１２細胞の結果を示す。
【0090】
その結果、ＯＨＢＦＢは、Ｕ２６６（ＩＣ５０＝４．０μＭ）、ＡＲＨ７７（ＩＣ５０＝０．２μＭ）、ＲＰＭＩ８２２６（ＩＣ５０＝４．４μＭ）、Ｍｅｃ－１（ＩＣ５０＝１．４μＭ）、ＨＬ６０（ＩＣ５０＝２．５μＭ）、Ｋａｓｕｍｉ－１（ＩＣ５０＝３．０μＭ）、ＫＵ８１２（ＩＣ５０＝０．２μＭ）の各癌細胞株に対して抗癌作用を示すことが明らかとなった。
【0091】
また、ＥＧＣＧも、Ｕ２６６（ＩＣ５０＝１１．８μＭ）、ＡＲＨ７７（ＩＣ５０＝４．０μＭ）、ＲＰＭＩ８２２６（ＩＣ５０＝１１．１μＭ）、Ｍｅｃ－１（ＩＣ５０＝８．３μＭ）、ＨＬ６０（ＩＣ５０＝９．５μＭ）、Ｋａｓｕｍｉ－１（ＩＣ５０＝９．６μＭ）、ＫＵ８１２（ＩＣ５０＝６．２μＭ）の各癌細胞株に対して抗癌作用を示すことが確認された。
【0092】
また、ＯＨＢＦＢとＥＧＣＧのＩＣ５０の比較から、ＯＨＢＦＢはＥＧＣＧよりも少なくとも３倍程度強い抗癌作用を有することが明らかとなった。
【0093】
また、図２は、各癌細胞株に対するＯＨＢＦＢのＩＣ５０とＥＧＣＧのＩＣ５０をプロットしたグラフである。その結果、各癌細胞株のＯＨＢＦＢに対する感受性とＥＧＣＧに対する感受性との間に正の相関があることが明らかとなった。
【0094】
なお、実験結果の統計処理にはＴｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔを用い、Ｐ値は０．０５未満を有意とした。以下の実験例においても同様である。
【0095】
［実験例２］
（ＯＨＢＦＢは脂質ラフトの局在変化を誘導する）
癌細胞の脂質ラフトに対するＯＨＢＦＢの影響を評価した。具体的には、まず、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に１×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ添加した。
（ＯＨＢＦＢは脂質ラフトの局在変化を誘導する）
癌細胞の脂質ラフトに対するＯＨＢＦＢの影響を評価した。具体的には、まず、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に１×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ添加した。
【0096】
続いて、アレクサフルオロ（登録商標）５５５標識コレラトキシンＢサブユニット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）（１ｍｇ／ｍＬ）を１ウェルあたり３μＬ添加し、氷上で１５分間染色した。染色後、遠心して上清を除去し、終濃度５μＭのＯＨＢＦＢを含有するＲＰＭＩ １６４０培地を添加して３時間インキュベートした。続いて、油浸レンズ（６０倍）を用いて蛍光顕微鏡で観察した。
【0097】
対照には、ＯＨＢＦＢの代わりに同容量のリン酸バッファー（ＰＢＳ）を添加した以外は上記と同様の操作を行った試料を用いた。ＰＢＳは、超純水１Ｌに対し、ＮａＣｌ ８．０ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇを溶解し、オートクレーブ滅菌して調製した。
【0098】
図３（ａ）及び（ｂ）は、蛍光顕微鏡写真である。図３（ａ）は対照試料の結果を示す写真であり、図３（ｂ）はＯＨＢＦＢを添加した結果を示す写真である。その結果、ＯＨＢＦＢはＥＧＣＧと同様に脂質ラフト会合作用を示すことが明らかとなった。
【0099】
［実験例３］
（酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における酸性スフィンゴミエリナーゼの関与を評価した。
（酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における酸性スフィンゴミエリナーゼの関与を評価した。
【0100】
具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに播種し、酸性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤であるデシプラミン（シグマアルドリッチ社製）を終濃度５μＭとなるように添加して３時間インキュベートした。その後、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加し、更に９６時間培養した。続いて、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
【0101】
デシプラミン（シグマアルドリッチ社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
【0102】
図４は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢの癌細胞致死活性はデシプラミンの添加により阻害されることが明らかとなった。この結果から、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、酸性スフィンゴミエリナーゼ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
【0103】
［実験例４］
（ＯＨＢＦＢのｃＧＭＰ産生誘導能１）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対するｃＧＭＰ産生誘導作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、終濃度５μＭのＯＨＢＦＢ及び１％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に５．０×１０５個／ウェルの細胞密度で懸濁し、９６ウェルプレートに播種して３時間インキュベートした。その後、市販のキット（商品名「ｃＧＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ」、ケイマンケミカル社製）を用いて細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
（ＯＨＢＦＢのｃＧＭＰ産生誘導能１）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対するｃＧＭＰ産生誘導作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、終濃度５μＭのＯＨＢＦＢ及び１％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に５．０×１０５個／ウェルの細胞密度で懸濁し、９６ウェルプレートに播種して３時間インキュベートした。その後、市販のキット（商品名「ｃＧＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ」、ケイマンケミカル社製）を用いて細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
【0104】
図５は、細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、癌細胞におけるｃＧＭＰ産生誘導作用を有することが明らかとなった。
【0105】
［実験例５］
（ｃＧＭＰ合成酵素である可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに播種した。
（ｃＧＭＰ合成酵素である可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに播種した。
【0106】
続いて、ｓＧＣ阻害剤であるＮＳ２０２８（シグマアルドリッチ社製）を終濃度５μＭとなるように添加して３時間インキュベートした。続いて、細胞の培地を、ＯＨＢＦＢを終濃度５μＭ含有する培地に交換し、更に９６時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
【0107】
ＮＳ２０２８（シグマアルドリッチ社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
【0108】
図６は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢの癌細胞致死活性はｓＧＣ阻害剤の添加によって消失することが明らかとなった。つまり、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、ｓＧＣ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
【0109】
［実験例６］
（ＯＨＢＦＢによる内皮型一酸化合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性化）
癌細胞のｅＮＯＳに対するＯＨＢＦＢの影響を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に１×１０６個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して１時間培養した。対照として、ＯＨＢＦＢを添加しなかった細胞を用いた。
（ＯＨＢＦＢによる内皮型一酸化合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性化）
癌細胞のｅＮＯＳに対するＯＨＢＦＢの影響を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に１×１０６個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して１時間培養した。対照として、ＯＨＢＦＢを添加しなかった細胞を用いた。
【0110】
続いて、ｅＮＯＳ活性化の指標であるｅＮＯＳＳｅｒ１１７７のリン酸化レベルを、抗リン酸化ｅＮＯＳｓｅｒ１１７７抗体を用いたウエスタンブロット法により測定した。
【0111】
図７（ａ）は、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７及びｅＮＯＳをウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。図７（ｂ）は、図７（ａ）の結果を数値化し、ｅＮＯＳの存在量に対するリン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７の存在量を算出した結果を示すグラフである。対照における値を１００とした割合（％）で結果を示す。
【0112】
その結果、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、癌細胞のｅＮＯＳｓｅｒ１１７７リン酸化を誘導する、すなわち、ｅＮＯＳを活性化することが明らかとなった。
【0113】
［実験例７］
（ｅＮＯＳ阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用におけるｅＮＯＳの関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに播種した。
（ｅＮＯＳ阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用におけるｅＮＯＳの関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに播種した。
【0114】
続いて、ｅＮＯＳ阻害剤であるＬ－ＮＡＭＥ（和光純薬工業社製）を終濃度１０ｍＭとなるように添加して３時間インキュベートした。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して更に９６時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
【0115】
Ｌ－ＮＡＭＥ（和光純薬工業社製）は、１Ｍとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
【0116】
図８は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢの癌細胞致死活性は、ｅＮＯＳ阻害剤の添加により阻害された。つまり、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、ｅＮＯＳ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
【0117】
［実験例８］
（ＯＨＢＦＢのＡｋｔ活性化能の検討）
ＯＨＢＦＢの癌細胞におけるＡｋｔ活性化能を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に１×１０７個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して１時間インキュベートした。対照として、ＯＨＢＦＢを添加しなかった細胞を用いた。続いて、細胞溶解バッファーを添加して細胞を溶解し回収した。
（ＯＨＢＦＢのＡｋｔ活性化能の検討）
ＯＨＢＦＢの癌細胞におけるＡｋｔ活性化能を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に１×１０７個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して１時間インキュベートした。対照として、ＯＨＢＦＢを添加しなかった細胞を用いた。続いて、細胞溶解バッファーを添加して細胞を溶解し回収した。
【0118】
続いて、市販のキット（商品名「Ｋ－ＬＩＳＡ（商標）Ａｋｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔ」、型式「ＣＢＡ０１９」、メルクミリポア社製）を用いて回収したサンプルのＡｋｔ活性を測定した。
【0119】
図９は、Ａｋｔ活性の測定結果を示すグラフである。対照における値を１００とした割合（％）で結果を示す。その結果、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、癌細胞のＡｋｔ活性化作用を示すことが明らかとなった。
【0120】
［実験例９］
（抗６７ＬＲモノクローナル抗体によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における６７ＬＲの関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。
（抗６７ＬＲモノクローナル抗体によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における６７ＬＲの関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。
【0121】
続いて、抗６７ＬＲモノクローナル抗体（型式「ＭＬｕｃ５」、アブカム社製）又はコントロール抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加し、３時間インキュベートした。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるよう添加し、更に９６時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
【0122】
図１０は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、抗６７ＬＲモノクローナル抗体で前処理した細胞では、ＯＨＢＦＢの添加による生細胞数低下作用が著しく低下することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、６７ＬＲ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
【0123】
［実験例１０］
（６７ＬＲの発現抑制によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの抗癌作用における６７ＬＲの関与を評価した。具体的には、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６を、５％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地で１×１０４個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。続いて、６７ＬＲ ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社製）又はコントロールｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社製）を導入し、７２時間培養した。ｓｉＲＮＡの導入には、市販のキット（商品名「ＲＮＡｉＭＡＸ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用した。
（６７ＬＲの発現抑制によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
ＯＨＢＦＢの抗癌作用における６７ＬＲの関与を評価した。具体的には、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６を、５％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地で１×１０４個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。続いて、６７ＬＲ ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社製）又はコントロールｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社製）を導入し、７２時間培養した。ｓｉＲＮＡの導入には、市販のキット（商品名「ＲＮＡｉＭＡＸ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用した。
【0124】
その後、各細胞を１×１０４個／ｍＬの細胞密度で９６ウェルプレートに播種しなおし、２４時間インキュベートした。培地には５％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いた。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるよう添加して、更に７２時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
【0125】
図１１は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、６７ＬＲの発現を低下させた癌細胞では、ＯＨＢＦＢの添加による癌細胞増殖抑制活性が著しく低下することが明らかとなった。この結果は、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、６７ＬＲ依存的に抗癌作用を示すことを更に支持するものである。
【0126】
［実験例１１］
（ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）５阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
ＰＤＥ５阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。
（ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）５阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
ＰＤＥ５阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。
【0127】
続いて、ＰＤＥ５阻害剤であるバルデナフィル（ケイマンケミカル社製）を終濃度５μＭとなるように添加し、３時間インキュベートした。続いて、終濃度０、０．５、１．０及び２．５μＭのＯＨＢＦＢを添加し、更に９６時間培養した。その後、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて細胞生存率を測定した。
【0128】
その結果、ＯＨＢＦＢ及びバルデナフィルの併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０は１．０７μＭと算出された。
【0129】
また、上記と同様の検討を、終濃度０、５、１０、２５、５０及び１００μＭのバルデナフィル単独の存在下においても行った。その結果、バルデナフィルのＩＣ５０は９２．６８μＭと算出された。
【0130】
続いて、アイソボログラム解析により、ＯＨＢＦＢ及びバルデナフィルの併用による抗癌活性が拮抗的であるか、相加的であるか、相乗的であるかについて検討した。図１２は、アイソボログラム解析の結果を示すグラフである。
【0131】
具体的には、図１２に示すように、ＯＨＢＦＢのＩＣ５０（４．０μＭ）をｘ軸に、バルデナフィルのＩＣ５０（９２．６８μＭ）をｙ軸にそれぞれプロットし、それらの値を結んだ直線を引いた。また、バルデナフィル（終濃度５μＭ）との併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０（１．０７μＭ）をプロットした。
【0132】
その結果、ＯＨＢＦＢ及びバルデナフィルの併用時のプロットが、上記の直線よりも原点側にあったことから、ＰＤＥ５阻害剤はＯＨＢＦＢの抗癌活性を相乗的に増強することが明らかとなった。
【0133】
［実験例１２］
（エリオジクチオールによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
エリオジクチオールによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。
（エリオジクチオールによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
エリオジクチオールによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。
【0134】
続いて、エリオジクチオール（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）の非存在下又は終濃度５μＭの存在下において、終濃度０、１．０、２．５及び５．０μＭのＯＨＢＦＢを添加し、９６時間培養した。その後、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて細胞生存率を測定した。
【0135】
その結果、ＯＨＢＦＢ及びエリオジクチオールの併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０は１．１６μＭと算出された。
【0136】
また、上記と同様の検討を、終濃度０、５、１０、２５及び５０μＭのエリオジクチオール単独の存在下においても行った。その結果、エリオジクチオールのＩＣ５０は８９．４μＭと算出された。
【0137】
続いて、アイソボログラム解析により、ＯＨＢＦＢ及びエリオジクチオールの併用による抗癌活性が拮抗的であるか、相加的であるか、相乗的であるかについて検討した。図１３は、アイソボログラム解析の結果を示すグラフである。
【0138】
具体的には、図１３に示すように、ＯＨＢＦＢのＩＣ５０（４．０μＭ）をｘ軸に、エリオジクチオールのＩＣ５０（８９．４μＭ）をｙ軸にそれぞれプロットし、それらの値を結んだ直線を引いた。また、エリオジクチオール（終濃度５μＭ）との併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０（１．１６μＭ）をプロットした。
【0139】
その結果、ＯＨＢＦＢ及びエリオジクチオールの併用時のプロットが、上記の直線よりも原点側にあったことから、エリオジクチオールはＯＨＢＦＢの抗癌活性を相乗的に増強することが明らかとなった。
【0140】
［実験例１３］
（フラバノンによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
フラバノンによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。続いて、終濃度５μＭのフラバノン及び終濃度０μＭ又は２.５μＭのＯＨＢＦＢをそれぞれ添加し、９６時間培養した。対照としては、フラバノンの代わりに同容量のＰＢＳを添加した試料を使用した。
（フラバノンによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
フラバノンによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。続いて、終濃度５μＭのフラバノン及び終濃度０μＭ又は２.５μＭのＯＨＢＦＢをそれぞれ添加し、９６時間培養した。対照としては、フラバノンの代わりに同容量のＰＢＳを添加した試料を使用した。
【0141】
フラバノンとしては、エリオジクチオール（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）、ナリンゲニン（東京化成工業社製）及びヘスペレチン（和光純薬工業社製）を使用した。
【0142】
続いて、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて細胞生存率を測定した。
【0143】
図１４は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチンは、いずれもＯＨＢＦＢの抗癌活性を増強することが明らかとなった。
【0144】
［実験例１４］
（経口投与したＯＨＢＦＢの腫瘍組織に対する６７ＬＲ依存的癌細胞致死活性誘導能）
マウスにＯＨＢＦＢを経口投与し、６７ＬＲ依存的な癌細胞致死活性誘導能を評価した。
（経口投与したＯＨＢＦＢの腫瘍組織に対する６７ＬＲ依存的癌細胞致死活性誘導能）
マウスにＯＨＢＦＢを経口投与し、６７ＬＲ依存的な癌細胞致死活性誘導能を評価した。
【0145】
具体的には、まず、５週齢のメスのｂａｌｂ／ｃマウスを２週間予備飼育した。続いて、マウス多発性骨髄腫細胞株であるＭＰＣ－１１を５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁したもの２００μＬを、上記のマウスの右背部に皮下注射移植した。続いて、移植５日後に、ＯＨＢＦＢを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した。続いて、５時間後にマウスを屠殺して腫瘍を摘出し、組織切片を作製した。対照には、ＯＨＢＦＢを投与しなかった点以外は上記と同様にして作製した腫瘍組織切片を使用した。
【0146】
続いて、腫瘍組織切片を免疫染色し、Ｃｌｅａｖｅｄ（ＣＶ）－ｃａｓｐａｓｅ－３（ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３）、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７、及びリン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２の存在を検出した。
【0147】
《ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３の検出》
図１５（ａ）及び（ｂ）は、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１５（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１５（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。また、図１５（ｃ）は、図１５（ａ）及び図１５（ｂ）における、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞数を計測した結果を示すグラフである。
図１５（ａ）及び（ｂ）は、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１５（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１５（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。また、図１５（ｃ）は、図１５（ａ）及び図１５（ｂ）における、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞数を計測した結果を示すグラフである。
【0148】
その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、アポトーシスの指標であるＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞数が増加したことが明らかとなった。
【0149】
《リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７》
図１６（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１６（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。
図１６（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１６（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。
【0150】
その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７が顕著に増加したことが明らかとなった。
【0151】
《リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２の検出》
図１７（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１７（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。
図１７（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１７（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。
【0152】
その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２が顕著に増加したことが明らかとなった。
【0153】
《ＡＳＭ活性の測定》
また、腫瘍組織の酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）活性を測定した。ＡＳＭ活性は次のようにして測定した。ＯＨＢＦＢを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した上記のマウスを、ＯＨＢＦＢの投与から６時間後に屠殺して腫瘍組織を摘出した。対照には、ＯＨＢＦＢ非投与群のマウスから摘出した腫瘍組織を使用した。
また、腫瘍組織の酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）活性を測定した。ＡＳＭ活性は次のようにして測定した。ＯＨＢＦＢを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した上記のマウスを、ＯＨＢＦＢの投与から６時間後に屠殺して腫瘍組織を摘出した。対照には、ＯＨＢＦＢ非投与群のマウスから摘出した腫瘍組織を使用した。
【0154】
続いて、摘出した各腫瘍組織を破砕して遠心し、上清をＰＢＳで２ｍｇタンパク質／ｍＬとなるように調整した後、チューブに２０μＬ分注した。続いて、このチューブに基質混合液（ＢＯＤＩＰＹ－Ｃ１２－スフィンゴミエリン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）２μＬ、１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １０μＬ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）２０μＬ、水７８μＬ）を８μＬ添加して混合し、３７℃で８時間インキュベートした。この反応の結果、ＡＳＭの活性により、ＢＯＤＩＰＹ－Ｃ１２－スフィンゴミエリンからＢＯＤＩＰＹ標識セラミドが生成される。
【0155】
続いて、停止液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を６０μＬ添加し、あらかじめ乾燥器で活性化させた薄層クロマトグラフィープレートに１０μＬずつスポットし、展開溶媒（水：メタノール：クロロホルム＝８：３５：６０）で展開した。
【0156】
続いて、薄層クロマトグラフィープレートに紫外光を照射し、蛍光イメージアナライザー（商品名「Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、ビルバー・ルーマット社製）を用いてＢＯＤＩＰＹ標識セラミドの蛍光シグナルを検出し、解析ソフト（商品名「ｋｙｐｌｏｔ」、カイエンス社）を用いて解析し、数値化した。
【0157】
図１８は、ＯＨＢＦＢ非投与群（対照）及び投与群の腫瘍組織におけるＡＳＭ活性の測定結果を示すグラフである。対照におけるＡＳＭ活性の測定値を１００とした割合（％）で結果を示す。
【0158】
その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、ＡＳＭ活性が顕著に増加したことが明らかとなった。
【0159】
以上の結果から、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、生体内においてｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路の活性化を特徴とする６７ＬＲ依存的な癌細胞致死活性を示すことが明らかとなった。図１９に、ＯＨＢＦＢにより活性化される、ｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路の模式図を示す。
【0160】
［実験例１５］
（経口投与したＯＨＢＦＢは腫瘍組織に送達される）
一般的に、分子量が５００以上の化合物は、経口投与した場合に生体内への吸収が悪いと考えられている。このため、ウーロン茶重合ポリフェノールは、経口投与しても生体内に吸収されにくいと考えられている。そこで、経口投与したＯＨＢＦＢが腫瘍組織に到達するか否かを検討した。
（経口投与したＯＨＢＦＢは腫瘍組織に送達される）
一般的に、分子量が５００以上の化合物は、経口投与した場合に生体内への吸収が悪いと考えられている。このため、ウーロン茶重合ポリフェノールは、経口投与しても生体内に吸収されにくいと考えられている。そこで、経口投与したＯＨＢＦＢが腫瘍組織に到達するか否かを検討した。
【0161】
《ＯＨＢＦＢの経口投与と腫瘍組織の摘出》
まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス（５週齢雌性）を２週間予備飼育した。続いて、マウス形質細胞腫細胞株であるＭＰＣ－１１を１×１０６個／マウスとなるように右背部に皮下注射移植した。
まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス（５週齢雌性）を２週間予備飼育した。続いて、マウス形質細胞腫細胞株であるＭＰＣ－１１を１×１０６個／マウスとなるように右背部に皮下注射移植した。
【0162】
続いて、腫瘍形成が確認されたマウスにＯＨＢＦＢ（１０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与（ｉ．ｇ．）し、投与から５時間後にイソフルラン麻酔下で心臓採血により屠殺を行って腫瘍組織を摘出した。
【0163】
続いて、摘出した腫瘍組織に２％アスコルビン酸含有ＰＢＳを４００ｍＬ、内部標準の１００ｍＭプロピルガレートを５ｍＬ加えて、ビーズショッカーにて組織破砕を行なった。続いて、破砕した組織を遠心分離し、上清をチューブに回収し、酢酸エチル抽出を行った。抽出サンプルは乾固させた後、内部標準である４－ヒドロキシベンゾフェノン（４ＨＢ）（１０ｍＭ）含有５０％アセトニトリル溶液１００ｍＬに再溶解させ、０．２２ｍｍのＰＶＤＦフィルターに通した後にＬＣ－ＭＳ分析に供した。
【0164】
《ＬＣ－ＭＳ分析》
サンプルを５μＬの注入量でＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（島津製作所）に供した。移動相には（Ａ）０．０５％ギ酸含有超純水及び（Ｂ）０．０５％ギ酸含有アセトニトリルを用いた。流速は０．１５ｍＬ／分とし、移動相Ｂの濃度が、０～２分：５％、２～３．５分：５～２０％、３．５～１０分：２０～４０％、１０～１３分：４０～１００％、１３～１５．５分：１００％、１５．５～１６分：１００～５％、１６～２０分：５％となるグラジエント条件下で測定を行なった。カラムにはＬ－ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、ＣＥＲＩ）を用いた（カラムオーブン：４０℃）。なお、イオン化はＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）法（ネガティブイオンモード）により行い、ＣＤＬ及びヒートブロック温度を２００℃に設定し、スキャンモード（ｍ／ｚ ３５０～１，４００）にてデータを取得した。
サンプルを５μＬの注入量でＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（島津製作所）に供した。移動相には（Ａ）０．０５％ギ酸含有超純水及び（Ｂ）０．０５％ギ酸含有アセトニトリルを用いた。流速は０．１５ｍＬ／分とし、移動相Ｂの濃度が、０～２分：５％、２～３．５分：５～２０％、３．５～１０分：２０～４０％、１０～１３分：４０～１００％、１３～１５．５分：１００％、１５．５～１６分：１００～５％、１６～２０分：５％となるグラジエント条件下で測定を行なった。カラムにはＬ－ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、ＣＥＲＩ）を用いた（カラムオーブン：４０℃）。なお、イオン化はＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）法（ネガティブイオンモード）により行い、ＣＤＬ及びヒートブロック温度を２００℃に設定し、スキャンモード（ｍ／ｚ ３５０～１，４００）にてデータを取得した。
【0165】
ＯＨＢＦＢ（Ｃ４５Ｈ３６Ｏ２２）の精密質量はｍ／ｚ ９２８．１６９であり、標準品のＬＣ－ＭＳ分析（ネガティブイオンモード）では、水素が脱離したイオンｍ／ｚ ９２７．１５８［Ｍ－Ｈ］－（理論値：９２７．１６９）としてＭＳピークが認められた。
【0166】
そこで、腫瘍サンプルのＭＳスペクトルを確認したところ、ＯＨＢＦＢ未投与群では、そのようなイオンピークは観察されなかったが、ＯＨＢＦＢ投与群ではｍ／ｚ ９２７．１５７のピークが認められた。また、本ピークのＭＳ／ＭＳ分析では、ｍ／ｚ ７５８．１３２、６０８．１１３、４７０．０７１が主要なプロダクトイオンとして検出された。
【0167】
これらの検出ピークは、ＯＨＢＦＢの標準品のＭＳ／ＭＳ分析によるプロダクトイオン（ｍ／ｚ ７５８．１３９、６０８．１０６、４７０．０８１）と一致したことから、ＯＨＢＦＢが経口投与後に腫瘍組織に存在することが明らかとなった。
【0168】
［実験例１６］
（ＯＨＢＦＢのｃＧＭＰ産生誘導能２）
ＯＨＢＦＢの細胞に対するｃＧＭＰ産生誘導作用を評価した。具体的には、まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣをＥＧＭ－２培地に懸濁し、５×１０６個／ｍＬとなるように調製した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度５μＭとなるように添加し、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで播種した。続いて、３７℃で１時間インキュベートした後、ＲＴ－ＦＲＥＴ法（ｃＧＭＰ ａｓｓａｙ、ｃｉｓｂｉｏ社）により、細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
（ＯＨＢＦＢのｃＧＭＰ産生誘導能２）
ＯＨＢＦＢの細胞に対するｃＧＭＰ産生誘導作用を評価した。具体的には、まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣをＥＧＭ－２培地に懸濁し、５×１０６個／ｍＬとなるように調製した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度５μＭとなるように添加し、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで播種した。続いて、３７℃で１時間インキュベートした後、ＲＴ－ＦＲＥＴ法（ｃＧＭＰ ａｓｓａｙ、ｃｉｓｂｉｏ社）により、細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
【0169】
【0170】
その結果、ＯＨＢＦＢが、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣに対して細胞内ｃＧＭＰの産生を促進することが明らかとなった。この結果は、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、ｃＧＭＰが関与する生理作用を有することを更に支持するものである。
【0171】
［実験例１７］
（ＯＨＢＦＢの免疫機能増強作用）
ＯＨＢＦＢの免疫機能増強作用を検討した。具体的には、まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢、雌性）の脾臓から単核球を採取し、２×１０６個／ｍＬとなるように１２ウェルプレートに播種した。
（ＯＨＢＦＢの免疫機能増強作用）
ＯＨＢＦＢの免疫機能増強作用を検討した。具体的には、まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢、雌性）の脾臓から単核球を採取し、２×１０６個／ｍＬとなるように１２ウェルプレートに播種した。
【0172】
続いて、単核球を、ＯＨＢＦＢを含む１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ培地にて２４時間培養後、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（コスモバイオ社）によりＲＮＡを回収した。続いて、ｃＤＮＡを合成後、細菌の鞭毛タンパク質を認識する受容体であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）５、ウイルスの一本鎖ＲＮＡを認識する受容体であるＴＬＲ７、ＣＤ８陽性Ｔ細胞増殖に関与するＣＣＲ５のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法により測定した。ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＣＣＲ５の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチン遺伝子の発現量を用いて標準化した。
【0173】
ＴＬＲ５のＰＣＲには、配列番号１に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号２に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ＴＬＲ７のＰＣＲには、配列番号３に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号４に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ＣＣＲ５のＰＣＲには、配列番号５に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号６に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、β－アクチン遺伝子のＰＣＲには、配列番号７に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号８に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。
【0174】
図２１（ａ）～（ｃ）は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２１（ａ）は、ＴＬＲ５の発現量の測定結果を示すグラフである。また、図２１（ｂ）は、ＴＬＲ７の発現量の測定結果を示すグラフである。また、図２１（ｃ）は、ＣＣＲ５の発現量の測定結果を示すグラフである。図２１（ａ）～（ｃ）中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３～４）。また、「＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ ０μＭの結果に対してｐ＜０．０５で統計的有意差が存在することを表す。また、「＊＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ ０μＭの結果に対してｐ＜０．０１で統計的有意差が存在することを表す。
【0175】
その結果、ＯＨＢＦＢは脾臓単核球に対してＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＣＣＲ５の発現を促進することが明らかとなった。つまり、ＯＨＢＦＢは、これらの分子の発現を促進することにより、細菌感染やウイルス感染を予防する能力を高める作用を有することが明らかとなった。したがって、ＯＨＢＦＢは免疫機能増強作用を有するということができる。
【0176】
［実験例１８］
（ＯＨＢＦＢの動脈硬化予防作用・血栓症予防作用）
ＯＨＢＦＢの動脈硬化予防作用・血栓症予防作用を検討した。具体的には、まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）－ＥＧＭ－２培地に懸濁して１．５×１０５個／ｍＬとなるように調製し、１２ウェルプレートに播種した。続いて、２４時間の前培養後、培地を、終濃度０、１、５μＭのＯＨＢＦＢを含む１０％ＦＢＳ－ＥＧＭ－２培地に置換し、更に２４時間培養した。
（ＯＨＢＦＢの動脈硬化予防作用・血栓症予防作用）
ＯＨＢＦＢの動脈硬化予防作用・血栓症予防作用を検討した。具体的には、まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）－ＥＧＭ－２培地に懸濁して１．５×１０５個／ｍＬとなるように調製し、１２ウェルプレートに播種した。続いて、２４時間の前培養後、培地を、終濃度０、１、５μＭのＯＨＢＦＢを含む１０％ＦＢＳ－ＥＧＭ－２培地に置換し、更に２４時間培養した。
【0177】
その後、細胞の回収、ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡの合成を行い、リアルタイムＰＣＲ法にて動脈硬化予防作用や血栓予防作用を示すＴｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ）のｍＲＮＡの発現量を測定した。
【0178】
ＴＦＰＩの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチン遺伝子の発現量を用いて標準化した。ＴＦＰＩのＰＣＲには、配列番号９に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１０に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、β－アクチン遺伝子のＰＣＲには、配列番号１１に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１２に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。
【0179】
図２２は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２２中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「＊＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ ０μＭの結果に対してｐ＜０．０１で統計的有意差が存在することを表す。
【0180】
その結果、ＯＨＢＦＢは、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣに対してＴＦＰＩの発現を促進することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは、動脈硬化予防作用・血栓症予防作用を有することが明らかとなった。
【0181】
［実験例１９］
（ＯＨＢＦＢの筋委縮予防作用）
ＯＨＢＦＢの筋委縮予防作用を検討した。具体的には、まず、マウス筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）－ＤＭＥＭ培地に懸濁して２×１０４個／ｍＬとなるように調製し、２４時間前培養を行った。続いて０．５％ＦＣＳ－ＤＭＥＭの分化誘導培地に置換し、更に７２時間培養した。筋管細胞に分化後、ＯＨＢＦＢを含む分化誘導培地に置換し、更に４８時間培養した。
（ＯＨＢＦＢの筋委縮予防作用）
ＯＨＢＦＢの筋委縮予防作用を検討した。具体的には、まず、マウス筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）－ＤＭＥＭ培地に懸濁して２×１０４個／ｍＬとなるように調製し、２４時間前培養を行った。続いて０．５％ＦＣＳ－ＤＭＥＭの分化誘導培地に置換し、更に７２時間培養した。筋管細胞に分化後、ＯＨＢＦＢを含む分化誘導培地に置換し、更に４８時間培養した。
【0182】
その後、細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲによって筋萎縮関連遺伝子の一種であるＭｕｓｃｌｅ ＲＩＮＧ－Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＭｕＲＦ１）のｍＲＮＡの発現量を測定した。ＭｕＲＦ１の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を用いて標準化した。
【0183】
ＭｕＲＦ１のＰＣＲには、配列番号１３に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１４に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲには、配列番号１５に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１６に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。
【0184】
図２３は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２３中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「ｎ．ｓ．」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ ０μＭの結果に対して統計的有意差がないことを表し、「＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ ０μＭの結果に対してｐ＜０．０５で統計的有意差が存在することを表す。
【0185】
その結果、ＯＨＢＦＢは骨格筋細胞におけるＭｕＲＦ１の発現を抑制することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは筋萎縮抑制作用を有することが明らかとなった。
【0186】
［実験例２０］
（ＯＨＢＦＢの抗炎症作用）
ＯＨＢＦＢの抗炎症作用を検討した。具体的には、まず、マウスマクロファージ様細胞株であるＲＡＷ２６４．７を５％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に懸濁して１×１０４個／ｍＬとなるように調製し、２４ウェルプレートに播種して２４時間前培養を行った。
（ＯＨＢＦＢの抗炎症作用）
ＯＨＢＦＢの抗炎症作用を検討した。具体的には、まず、マウスマクロファージ様細胞株であるＲＡＷ２６４．７を５％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に懸濁して１×１０４個／ｍＬとなるように調製し、２４ウェルプレートに播種して２４時間前培養を行った。
【0187】
続いて、終濃度１μＭのＯＨＢＦＢを含む５％ＦＢＳ－ＤＭＥＭと培地交換を行い、更に１時間培養した。また、比較のために、ＯＨＢＦＢを添加しなかった群も用意した。続いて、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加し、更に２４時間培養した。また、比較のために、ＬＰＳを添加しなかった群も用意した。
【0188】
その後、培養上清を回収し、炎症性のサイトカインであるＴＮＦ－αの濃度をＥＬＩＳＡ法により定量した。また、培養上清中のタンパク質量を測定し、単位タンパク質量あたりのＴＮＦ－α量を算出した。
【0189】
【0190】
その結果、ＯＨＢＦＢはマクロファージにおいて、ＬＰＳ誘導性のＴＮＦ－α発現誘導を抑制することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは抗炎症用を有することが明らかとなった。
【0191】
［実験例２１］
（ＯＨＢＦＢの抗アレルギー作用）
ＯＨＢＦＢの抗アレルギー作用を検討した。具体的には、好塩基球性細胞からのβ－ヘキソサミニダーゼの遊離に与えるＯＨＢＦＢの影響を検討した。
（ＯＨＢＦＢの抗アレルギー作用）
ＯＨＢＦＢの抗アレルギー作用を検討した。具体的には、好塩基球性細胞からのβ－ヘキソサミニダーゼの遊離に与えるＯＨＢＦＢの影響を検討した。
【0192】
まず、２×１０５個のヒト好塩基球性細胞であるＫＵ８１２を、タイロード液１００ｍＬに懸濁した。続いて、この細胞懸濁液１００ｍＬと、終濃度１ｍＭのＣａＣｌ２、終濃度５０ｍＭのカルシウムイオノファＡ２３１８７、ＯＨＢＦＢを含むタイロード液１００ｍＬとを混合し、３７℃で２０分恒温した。その後、氷上で５分間静置し反応を停止させた。
【0193】
続いて、４℃、２００×ｇで５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清５０ｍＬに基質溶液（０．５ｍＭ ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｂ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）５０ｍＬを添加し、３７℃で６０分間反応させた。
【0194】
続いて、反応停止液（０．１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ１０）２００ｍＬを添加し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、上清中のβ－ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。
【0195】
また、細胞懸濁液に終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを添加して上記と同様の操作を行い、細胞内のβ－ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。続いて、下記式（Ｆ１）により、β－ヘキソサミニダーゼの遊離率を算出した。
【0196】
β－ヘキソサミニダーゼの遊離率（％）＝上清中のβ－ヘキソサミニダーゼ活性（波長４０５ｎｍにおける吸光度）／細胞内のβ－ヘキソサミニダーゼ活性（波長４０５ｎｍにおける吸光度）×１００ …（Ｆ１）
【0197】
図２５は、β－ヘキソサミニダーゼの遊離率の算出結果を示すグラフである。図２５中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「＊＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ ０μＭの結果に対してｐ＜０．０１で統計的有意差が存在することを表す。
【0198】
その結果、ＯＨＢＦＢは好塩基球性細胞に対して脱顆粒を阻害することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは抗アレルギー作用を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0199】
本発明によれば、ＥＧＣＧよりも強力な６７ＬＲアゴニストを提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】