特許 7061611 バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株、及びそれによって生産されるポリペプチドを含む抗酸化及び抗炎症活性を提供するかあるいは脂質異常症を予防又は治療する組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-20

(45)【発行日】2022-04-28

(54)【発明の名称】バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株、及びそれによって生産されるポリペプチドを含む抗酸化及び抗炎症活性を提供するかあるいは脂質異常症を予防又は治療する組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220421BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20220421BHJP

   A61K 38/44 20060101ALI20220421BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220421BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20220421BHJP

   A23L 33/195 20160101ALI20220421BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20220421BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

C12N9/02

A61K38/44

A61P35/00

A61P3/06

A23L33/195

C12N15/53

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2019538343

(86)(22)【出願日】2018-03-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-05-21

(86)【国際出願番号】 KR2018002677

(87)【国際公開番号】W WO2018164468

(87)【国際公開日】2018-09-13

【審査請求日】2019-10-16

(31)【優先権主張番号】10-2017-0030300

(32)【優先日】2017-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0030301

(32)【優先日】2017-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0116305

(32)【優先日】2017-09-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 13222BP

(73)【特許権者】

【識別番号】519166224

【氏名又は名称】ジェノフォーカス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＦＯＣＵＳ， ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】６５， Ｔｅｃｈｎｏ １－ｒｏ， Ｙｕｓｅｏｎｇ－ｇｕ Ｄａｅｊｅｏｎ ３４０１４， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ヨム，ト ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，チョン ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】パン，チェ ク

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウイ チュン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，テク ホ

(72)【発明者】

【氏名】カン，ジ ウン

(72)【発明者】

【氏名】パク，ソ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒョン ト

【審査官】小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】特開平０８－００３０１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】I2C7T2，UniProtKB[online]，2012年，https://www.uniprot.org/uniprot/I2C7T2，[retrieved on 11.13.2020]

【文献】S6FMU1，UniProtKB[online]，2013年，https://www.uniprot.org/uniprot/S6FMU1，[retrieved on 11.13.2020]

【文献】A7Z6R8，UniProtKB[online]，2007年，https://www.uniprot.org/uniprot/A7Z6R8，[retrieved on 11.13.2020]

【文献】Vaille, A. et al.，Normolipidaemic activity of liposomal-encapsulated superoxide dismutase in rats，Free Radic. Res. Commun.，1990年，Vol. 11(4-5)，pp. 241-50

【文献】Inaoka, T. et al.，Molecular cloning and nucleotide sequence of the superoxide dismutase gene and characterization of its product from Bacillus subtilis，J. Bacteriol.，1998年，Vol. 180(14)，pp. 3697-3703

【文献】Carillon, J. et al.，Superoxide dismutase administration, a potential therapy against oxidative stress related diseases:several routes of supplementation and proposal of an original mechanism of action，Pharm. Res.，2013年，Vol. 30(11)，pp. 2718-2728

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産された、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む、大腸癌治療用薬剤学的組成物。

【請求項2】

韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産された、配列番号２のアミノ酸配列からなるスーパーオキシドジスムターゼを含む、脂質異常症予防又は治療のための経口投与用薬剤学的組成物。

【請求項3】

韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産された、配列番号２のアミノ酸配列からなるスーパーオキシドジスムターゼを含む、脂質異常症予防又は改善用に役立つ食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株、及びそれによって生産されるスーパーオキシドジスムターゼ活性を有するポリペプチドを含む抗酸化、抗炎症及び脂質異常症予防又は治療用薬剤学的組成物及び食品組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

活性酸素は人体内で正常な代謝過程中に生物学的反応によって形成される。しかし、活性酸素の蓄積又は過度な量の活性酸素の生成は大部分の生物に有害であり、このような状態は酸化的ストレスと知られている。酸化的ストレスは細胞と組職にさまざまな疾病を誘発するものと知られている。今まで知られたところによれば、消化器疾患、糖尿病、癌、心血関系疾患、退行性疾患などが酸化的ストレスによって誘発されると知られている。これを防止するために、生体内で自由ラジカルの生成を抑制するための生理作用として、酸化性自由ラジカルに電子を供与して酸化を抑制するか又は過酸化ラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）を正常状態の酸素に転換させる作用機序が知られている。

【0003】

このような酸化的ストレスが老化を含めて各種の疾患を引き起こす重要な原因であることが明かされるにつれて生体内活性酸素を除去する抗酸化剤を開発しようとする研究が活発に進んでいる。活性酸素種を調節することができるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、グルタチオンなどの抗酸化性酵素及びビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（トコフェロール）などの天産物由来の低分子抗酸化物質に対して多くの研究が進んでいる。合成抗酸化剤としては、ＢＨＡ（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｏｓｏｌｅ）、ＢＨＴ（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙ ｔｏｌｕｅｎｅ）及びＮＤＧＡ（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ ａｃｉｄ）なども多く開発されて医薬品及び食品分野に用いられている。

【0004】

しかし、自然界に由来した天然抗酸化性物質は抗酸化効果が大きくないから、これらの抗酸化性物質を使って実効を得るためには多量を使わなければならなく、これによって価格が上昇するから、経済性が低いという問題点があった。一方、化学的に合成された抗酸化性物質は天然抗酸化性物質よりも優れた抗酸化効果を現すが、人体に多様な副作用を誘発するという新しい問題点があるため使用が制限されている。

【0005】

一方、過多な脂質が血管壁に積もれば、血管の大きさを減らし、炎症反応による動脈硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を引き起こす。これにより冠状動脈心臓疾患又は脳血管疾患、末梢血管の閉鎖などが発生することがある。また、過多な血液内脂質は肝組織に蓄積され、これによって脂肪肝が誘発されることがある。

【0006】

現在まで血中脂質濃度を減少させる方法としては、コレステロール又は脂肪が多く含有されている飲食物の摂取を減らす食餌療法、運動療法及び薬物療法などが使われている。しかし、食餌療法又は運動療法は厳格な管理及び実施が困り、その治療効果にも限界がある。

【0007】

一方、現在まで開発された脂質濃度を減少させる薬物としては、胆汁酸結合樹脂、コレステロール生合成に重要な酵素であるＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素抑制剤（ＨＭＦ－ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）のようなコレステロールの量を低める薬物、フィブリン酸誘導体、ニコチン酸などの中性脂肪を低める薬剤が開発された。しかし、これらの薬剤は肝毒性、胃膓障害及び発癌性などの副作用が報告された。したがって、血中脂質濃度を効果的に低めて脂質異常症及びこれに関連した疾病の治療に使うことができながらも副作用が少ない薬剤の開発が至急な実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

このような背景下で、本発明者は自然界に由来して安全性を確保しながらも、優れた抗酸化効果を示す抗酸化性物質を開発するために、鋭意研究した結果、バチルスアミロリケファシエンス菌株に由来した抽出物が優れたスーパーオキシドジスムターゼ活性を現すことを確認し、本発明を完成した。

【0009】

本発明の他の目的は、前記スーパーオキシドジスムターゼを用いてＳＯＤを製造する方法を提供することである。

【0010】

本発明のさらに他の目的は、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む抗酸化及び抗炎症薬剤学的組成物を提供することである。

【0011】

また、本発明のさらに他の目的は、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む抗酸化及び抗炎症に役立つ健康機能性食品及び飼料添加剤を提供することである。

【0012】

本発明のさらに他の目的は、毒性副作用なしに安全でありながらも脂質代謝異常に係わる疾患又は障害を予防又は治療するための手段を提供することであり、具体的に脂質異常症の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

【0013】

本発明のさらに他の目的は、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるスーパーオキシドジスムターゼを含む脂質異常症予防又は改善に役立つ健康機能性食品を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上述した課題を解決するための本発明の一つの様相は、スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドを生産し、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）に関する。

【0015】

本発明の他の様相は、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）を培養して収得した培養液からスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドを分離することを含む、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。

【0016】

本発明のさらに他の様相は、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む、抗酸化又は抗炎症薬剤学的組成物に関する。

【0017】

本発明のさらに他の様相は、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む、抗酸化又は抗炎症に役立つ健康機能性食品に関する。

【0018】

本発明のさらに他の様相は、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産された、配列番号２のアミノ酸配列からなるスーパーオキシドジスムターゼを含む、脂質異常症予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。

【0019】

本発明のさらに他の様相は、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産された、配列番号２のアミノ酸配列からなるスーパーオキシドジスムターゼを含む、脂質異常症予防又は治療用に役立つ健康機能性食品に関する。

【発明の効果】

【0020】

本発明のバチルスアミロリケファシエンス菌株はスーパーオキシドジスムターゼ生産性に非常に優れ、食品、健康機能性食品、健康補助食品、医薬品及び化粧品の材料生産に有利に使われることができる。

【0021】

本発明の菌株は人間に安全な微生物であり、ＳＯＤは細胞の外部に分泌される酵素なので、本発明による菌株を用いてＳＯＤ製造する場合、高価の精製過程（例えば、カラム精製）を経ず、人間に安全性が確保されたＳＯＤを大量で生産することができる。また、本発明による菌株の培養によるＳＯＤの生産は、植物由来のＳＯＤ生産に比べて培養時間が短く、生産に必要な空間が植物の栽培に必要な空間に比べて数等少なくて経済的に生産可能である。

【0022】

本発明のバチルスアミロリケファシエンス由来のスーパーオキシドジスムターゼ活性を有するポリペプチドは、現在商業化している他の植物由来のスーパーオキシドジスムターゼとは違い、細胞の外部に分泌されて酵素活性の安全性に優れながらも、従来の天然抗酸化性物質よりも抗酸化効果に優れ、合成抗酸化性物質と同等な水準の抗酸化効果を現すので、抗酸化性物質を含む食品、健康機能性食品、医薬品、化粧品などの各種の製品の開発に広く活用されることができる。

【0023】

本発明の組成物は炎症反応時に分泌する炎症誘発因子と活性酸素種の生成及び炎症媒介物質と炎症誘発遺伝子の発現を抑制することにより、抗酸化活性を有しながらもより効果的な抗炎症効果を現す。

【0024】

本発明の抗酸化及び抗炎症性組成物はスーパーオキシド陰イオンラジカルの消去能に優れ、脂質過酸化物生成抑制効果に非常に優れるので、これを用いれば化粧料組成物に適用するとき、皮膚の老化抑制及び皮膚美白機能に効果的である。

【0025】

本発明の薬剤学的組成物は、脂質異常症及びこれに関連した疾患の治療において有用に使うことができるので、血管内の高濃度の脂質によって発生する冠状動脈心臓疾患、脳血管疾患、又は末梢血管の閉鎖などの予防又は治療に使われることができる。

【0026】

本発明の薬剤学的組成物はバチルスアミロリケファシエンス菌株に由来したスーパーオキシドジスムターゼを含んで安全性を確保しながらも、脂質異常症によって発生し得る病変現象を予防するか抑制することができる著しくても有利な効果があり、各種の医薬品、健康機能性食品、又は飼料添加剤などの開発に広く活用されることができる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】本発明の一実施例によってバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株からスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を精製した結果を示した図で、フェニルセファロースの溶出挙動を示したグラフである。

【図2】バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株からＳＯＤ遺伝子を不活性化させる方法を示す図である。

【図3】バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株からＳＯＤ遺伝子を不活性化するために使用されたプラスミドの模式図である。

【図4】本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤとメロンＳＯＤのアミノ酸配列相同性比較結果を示した図である。

【図5】バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の培養様相を示したグラフである。

【図6A】大膓癌細胞増殖に対するバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産された本発明のＳＯＤ活性を有するポリペプチドの効果を示したグラフである。

【図6B】大膓癌細胞増殖に対するバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産された本発明のＳＯＤ活性を有するポリペプチドの効果を示したグラフである。

【図7】マウスの体重変化に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【図8】マウスの血液内のスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、ＳＯＤ）活性に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【図9】マウスのカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）活性に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【図10】マウスの血液内のグルタチオンペルオキシダーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＧＰｘ）活性に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【図11】マウスの血液内の炎症性サイトカインＩＬ－１βの濃度に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【図12】マウスの血液内の炎症性サイトカインＴＮＦ－αの濃度に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【図13】マウスの血液内の炎症性サイトカインＩＬ－６の濃度に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【図14】マウスの血液内の酸化窒素（ＮＯ）の濃度に対する本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤの効果を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0028】

以下で図面を参照して本発明についてより詳細に説明する。

【0029】

本明細書で、“抗酸化”と言う用語は狭い範囲では体内で生成される自由ラジカル、前記自由ラジカルから生成される過酸化水素又は過酸化物、前記過酸化水素から生成されるヒドロキシラジカルの生成又は反応を抑制、減少又は制御する作用を意味し、広い範囲では自然界で発生する酸化反応の生成を抑制、減少又は制御する作用を意味する。

【0030】

本明細書で、“核酸分子”と言う用語はＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけではなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)）。

【0031】

本明細書で、“抗炎症”と言う用語は以下で定義する炎症性疾患の改善活性と定義され、“改善”と言う用語は炎症性疾患が有する病理的症状の改善、及びそのような病理的症状の発病抑制及び遅延を含む意味である。また、本明細書で、“炎症性疾患”と言う用語は外部の物理／化学的刺激又は外部感染源の感染に対する局所的又は全身的生体防御反応に特定される病的状態と定義されることができる。前記炎症性疾患は、急性、慢性、潰瘍性、アレルギー性又は怪死性を有することができる。具体的に、前記炎症性疾患には、喘息、気管支炎、鼻炎、胃炎、膓炎、腎臓炎、肝炎、膵膓炎、結膜炎、虹彩炎、強膜炎、ブドウ膜炎、皮膚炎、関節炎などが含まれることができる。

【0032】

本明細書で、“坑癌”と言う用語は大膓癌の改善活性と定義され、“改善”と言う用語は大膓癌が有する病理的症状の改善、及びそのような病理的症状の発病抑制及び遅延を含む意味である。

【0033】

本明細書で、“脂質異常症”と言う用語は血液内に遊離コレステロール、コレステロールエステル、燐脂質、中性脂肪などの脂肪質が異常に増加した状態を意味する。脂質異常症はコレステロール、中性脂肪、燐脂質及び遊離脂肪酸などの血清脂質の一つ以上の血清内濃度が空腹時の血清脂質の正常範囲である中性脂肪５０～１５０ｍｇ／ｄｌ、燐脂質１５０～２５０ｍｇ／ｄｌ、コレステロール１３０～２２０ｍｇ／ｄｌ及び遊離脂肪酸５～１０ｍｇ／ｄｌより高い状態である。

【0034】

本明細書で、“健康機能性食品”と言う用語は特定の保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同じ用語であり、栄養供給の他にも生体調節機能が効率的に現れるように加工された医療効果の高い食品を意味し、場合によって健康食品、機能性食品、健康補助食品などの用語と互換されることができる。本発明の目的上、前記健康機能性食品は抗酸化、抗炎症及び抗脂質異常症活性を現し、これを取った個体の健康を維持、改善又は回復に役立つ有用な効果を提供することができる。

【0035】

本発明の一様相はスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドを生産するバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）に関する。本発明のこのような菌株はＢｉｎｅｘ Co., Ltdから購入したビスパン（Ｂｉｓｐａｎ）粉末から分離した、ＳＯＤ生成能力に優れた菌株である。前記バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）を韓国生命工学研究院に２０１７年３月６日付で寄託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託した。

【0036】

本発明のバチルスアミロリケファシエンス菌株は配列番号１からなる遺伝子配列によってコード化したスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドを生産する。このようなＳＯＤ活性を有するポリペプチドは配列リスト配列番号２のアミノ酸配列を有する。

【0037】

本発明の前記菌株は配列リスト配列番号３～１１と同じ１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子配列を有する。

【0038】

本発明によるバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の特性は次のようである。

【0039】

【表1】

【0040】

本発明によるバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の糖利用性は次のようである。

【0041】

【表2】

【0042】

本発明のさらに他の様相によれば、本発明はスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドを生産し、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）を培養して収得した培養液からスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドを分離する段階を含むスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドの製造方法を提供する。

【0043】

本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の培養は当該分野に知られた適合した培地と培養条件によって行うことができる。このような培養過程は当業者であれば選択される菌株によって容易に調整して使うことができる。前記培養方法の例として、回分式、連続式及び流加式培養が含まれるが、これに限定されるものではない。このような多様な培養方法は、例えば文献（Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp. 138-176）に記載されている。

【0044】

本発明の菌株の培養に使われる培地は特定の菌株の要求条件を適切に満たさなければならない。多様な微生物培養培地は、例えば文献（"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981）に記載されている。これら培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。炭素源は、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、澱粉及び纎維素のような炭水化物；豆油、ひまわり油、ひまし油及びココナツオイルのような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコールと酢酸のような有機酸を含む。これらの炭素源は単独で又は組合せで使われることができる。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出液、酵母エキス、麦芽抽出液、トウモロコシ浸出液及び大豆粉のような有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含む。これらの窒素源は単独で又は組合せで使われることができる。前記培地には、リン酸源として、追加的にリン酸二水素カリウム、リン酸水素カリウム及び相応するナトリウム包含塩を含むことができる。また、培地は、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属を含むことができる。また、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが添加されることができる。これらの培地又は前駆体は培養物に回分式又は連続式で添加されることができる。

【0045】

また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を適切な方式で添加することによって培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使うことによって培養中に気泡生成を抑制することができる。また、培養液の好気性条件を維持するために、培養液内に酸素又は酸素を含むガス（例えば、空気）を培養液に注入することができる。培養物の温度は一般的に２０～４５℃、好ましくは２５～４０℃である。培養の期間はＳＯＤ活性を有するポリペプチドの生産が所望の水準に到逹するまで続くことができ、好ましい培養時間は４８～７２時間である。

【0046】

ＳＯＤ活性を有するポリペプチドは下記の分離方法によって分離されることが好ましいが、これに限定されない。バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株を培養した培養液を遠心分離して上澄み液分画を回収し、上澄み液分画を固相抽出（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）で前処理した後、上澄み液分画をクロマトグラフィーで分離及び精製する。ここで、クロマトグラフィーは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使うことが好ましいが、必ずしもこれに限定されない。

【0047】

本発明の方法では、宿主細胞から生産されたスーパーオキシドジスムターゼ活性を有するポリペプチドを精製した精製溶液とセラックを含有する緩衝液を混合して凍結乾燥する段階をさらに含むことができる。ＳＯＤを経口投与した場合、胃腸管内で活性が急速に低下することがあるから、生体利用率及び効率性の減少につながる問題がある。このような問題はＳＯＤの効果が最も高い特定の細胞位置までＳＯＤを伝達することが困ってもっと深刻になる。したがって、本発明の方法ではスーパーオキシドジスムターゼを溶液状態でコーティングすることができる。具体的に、精製溶液とセラックを含む緩衝液を混合した後、凍結乾燥させる。このような凍結乾燥された菌株サンプルは粉末化して使うまで約-４℃で保管することができる。

【0048】

本発明で使うのに適したコーティングの例としては、セラック（ｓｈｅｌｌａｃ）を挙げることができ、この他にもエチルセルロース（ｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヒドロキシメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタルレート（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ゼイン（ｚｅｉｎ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ及びこれらの組合せを含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。

【0049】

本発明では、前記コーティング剤は、ＳＯＤ精製粉末の総重量を基準に０．６～４重量％含むことが好ましい。また、前記コーティング溶液には、塩化カルシウム、クエン酸、グリセリン酢酸脂肪酸エステル、ポリソルベート、Ｄ－ソルビトール又はトリアセチンのような可塑剤などが加わることができる。

【0050】

本発明のさらに他の様相は、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む抗酸化又は抗炎症薬剤学的組成物に関する。

【0051】

本発明による抗酸化又は抗炎症薬剤学的組成物は細胞損傷の主要原因になるラジカルと過酸化脂質を抑制し、細胞内の抗酸化酵素の活性を増加させて活性酸素種を除去することによって酸化的ストレスによる細胞損傷を防止するので、抗酸化薬物として使うことができる。また、本発明による抗酸化又は抗炎症薬剤学的組成物は、大膓癌細胞に対して坑癌活性を有するので、抗癌剤薬物として使うことができる。

【0052】

本発明のさらに他の様相は、韓国生命工学研究院生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰとして国際寄託されたバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるスーパーオキシドジスムターゼを含む脂質異常症予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。

【0053】

血中の低密度リポタンパク（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＤＬ）は受容体によって細胞内で分解されるが、コレステロール多量摂取によって受容体が不足であるか欠乏すれば、血中に多くなり、結局蓄積して酸化したＬＤＬが生成される。酸化したＬＤＬは高い細胞毒性がある脂質過酸化物を持っているため、細胞組職に拡散して毒性を示し、内皮細胞に炎症を引き起こして動脈硬化を誘発する。本発明の薬剤学的組成物は活性酸素種を十分に解毒して、身体の抗酸化機能を活性化し、低密度リポタンパクの過酸化率を低めることにより、脂質異常症の発病を予防するか遅延させ、血中の総コレステロール及びＬＤＬコレステロール、中性脂肪を減少させることにより、脂質異常症を改善又は緩和させることができる。

【0054】

本発明の薬剤学的組成物は、脂質異常症、脂肪肝疾患、又は動脈硬化症の予防又は治療に使うために単独で使うか、又は他の薬剤と併用して投与されることができる。

【0055】

本発明では、前記バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の培養上澄み液から抗酸化、抗炎症又は抗脂質異常症活性を有するＳＯＤを抽出することができる。まず、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３をｐＨ６．０～８．０の複合培地で、２５～４２℃で、１～４日間培養して培養液を得る。バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株を培養する複合培地としては、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地、ＩＳＰ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）培地、ＮＡ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ）培地、ＢＨＩ（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｇａｒ）培地、ＳＤＡ（ｓａｂｏｕｒｏｕｄ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ）、ＰＤＡ（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ）培地、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）培地などが使われることができ、好ましくは、ＬＢ培地、ＩＳＰ培地、ＢＨＩ培地、ＳＤＡ培地、ＮＢ培地を使うことができる。

【0056】

前記培養液を遠心分離して培養上澄み液を得た後、培養上澄み液を濾過及び濃縮すれば、抗酸化、抗炎症又は抗脂質異常症活性物質を最適に抽出した培養上澄み液抽出物を収得することができる。

【0057】

本発明の組成物は、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株から生産されたＳＯＤ以外に通常的な薬剤学的に許容可能な担体又は賦形剤をさらに含むことができ、この他にも、バインダー、コーティング剤、分解剤、滑剤、コーティング剤などの薬剤学的に通常的に使われる多様な添加剤とともに剤形化して調剤されることができる。

【0058】

本発明の薬剤学的組成物の場合、前記薬剤学的組成物は前記有効成分以外に薬剤学的に許容される担体を含むことができる。このような薬剤学的に許容される担体は薬品製剤時に通常的に用いられるもので、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどを含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0059】

本発明で使用可能な賦形剤は、スクロース、ラクトース、マンニトール、グルコースなどの砂糖及びトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、米澱粉、部分的に前ゼラチン化した澱粉などの澱粉を含む。バインダーは、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、グアーガム、アカシア、寒天などの多糖類、トラガカント、ゼラチン、グルテンなどの自然発生高分子物質、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体及びポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びビニルアセテート樹脂などの高分子を含む。

【0060】

分解剤としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体及びナトリウムカルボキシメチル澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、米澱粉及び部分的に前ゼラチン化した澱粉などの澱粉を使うことができる。

【0061】

本発明で使用可能な滑剤の例としては、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状シリカ、含水二酸化ケイ素、多様な種類のワックス及び水素化油などを含む。

【0062】

コーティング剤としては、セラック、ジメチルアミノエチルメタクリレート－メタクリル酸共重合体、ポリビニルアセタルジエチルアミノアセテート、エチルアクリレート－メタクリル酸共重合体、エチルアクリレート－メチルメタクリレート－クロロトリメチルアンモニウムエチルメタクリレート共重合体、エチルなどの水不溶性重合体、メタクリル酸－エチル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスシネートなどの腸溶性重合体及びメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールなどの水溶性重合体を含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。

【0063】

前記薬剤学的組成物は薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量形態に製造されるか又は多回用剤形に製造されることができる。ここで、剤形は、溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エリキシル剤、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、硬膏剤、ローション剤、軟膏制などの形態であり得る。

【0064】

本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤを含む薬剤学的組成物の投与量は治療又は予防の目的、治療又は予防しようとする患者の種類、患者の症状、体重、年齢、性別などを考慮して適切に決定することができる。一例として、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して、有効成分としてバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤを治療有効量又は栄養的に有効な濃度で含むが、好ましくは２～１００Ｕ／ｍｇの含量で含むことができる。

【0065】

前記薬剤学的組成物は症状程度によって投与方法が決定されるが、通常的には局所投与方式が好ましい。また、前記薬剤学的組成物のうち有効成分の投与量は、投与経路、疾病の程度、患者の年齢、性別、体重などによって変わることができ、一日に１回乃至数回投与することができる。

【0066】

本発明の薬剤学的組成物は多様な経路を介して投与されることができる。投与の全ての方式は予想可能であるが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、髄腔内又は脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与されることができる。

【0067】

本発明の他の様相は、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む抗酸化又は抗炎症に役立つ食品に関する。

【0068】

本発明の健康機能性食品は食品学分野で公知となった多様な方法で製造されることができ、その自体又は食品学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などと混合して経口で摂取することができるどんな食品形態にも製造されることができる。好ましくは、散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ剤、浸出剤、液剤、エキス剤、ガム、お茶、ゼリー、又は飲料などに製造されることができる。

【0069】

本発明のさらに他の様相は、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産される配列番号２のアミノ酸配列からなるＳＯＤを含む抗酸化又は抗炎症に役立つ化粧品組成物に関する。好ましい一実施例によれば、本発明の化粧品組成物は機能性化粧品の製造に使われることができる。

【0070】

本発明の機能性化粧品は当該分野で通常的に製造されるどんな剤形にも製造されることができるが、好ましくは、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジングオイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤形化されることができ、より詳細に、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、ローション、ゲル、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、軟膏、スティック、パッチ、スプレー又はパウダーの製品に製造されることができるが、これに制限されない。

【0071】

本発明のさらに他の様相は、本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）菌株によって生産されるＳＯＤを含み、抗酸化及び抗炎症活性強化に役立つ飼料添加剤を提供する。本発明の飼料添加剤を製造するために、前記菌株の培養液の上澄み液を直接製剤化するか小麦粉、澱粉、デキストリンなどの希釈剤及び穀類、もみがら及び脱脂米ぬかのようなぬか、オイル及び脂肪分が豊かな種子ケーキのような飼料用原料とともに製剤化されることができる。

【0072】

本発明によれば、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）によって生産されるＳＯＤ成分が炎症によって発生する酸化的ストレスを減らす役目をすることにより、大腸炎症の発病時に同伴される体重減少、脱水、血便などの症状を緩和させることができる。

【0073】

以下、本発明の理解を助けるために、実施例に基づいて詳細に説明する。ただ、下記の実施例は本発明の内容を例示するものであるだけ、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。

【0074】

実施例１．菌株の分離及び同定
Ｂｉｎｅｘ Co., Ltdからビスパンを購入し、これから後述する過程によって本発明のＳＯＤを生産するバチルスアミロリケファシエンス菌株を純粋分離した。ビスパン粉末０．１ｇを１０ｍｌ生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に希釈し、ＬＢ寒天プレートに塗抹してコロニーを確保した。これから単一コロニーを取り、またＬＢ寒天プレートに塗抹した。このような過程を３回繰り返して単一菌株を分離した。分離された細菌はグラム陽性、模様はバチルスであり、内生胞子（ｅｎｄｏｓｐｏｒｅ）を生成することができた。

【0075】

純粋分離された菌株を同定するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed.", 2001, Cold Spring Harbor Press）の方法で純粋分離された菌株からゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）を精製した。精製されたゲノムはＩｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑ ＰＥ１００を用いて全体ゲノムの塩基配列を決定した。

【0076】

分離された菌株のゲノムを分析した結果、９コピーの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列リスト配列番号３～１１）が発見された。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち、ＢＰＪＧＰ＿ｒ００１３０（配列番号７）とＢＰＪＧＰ＿ｒ００１６０（配列番号８）は同じ塩基配列を示したが、他の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は互いに異なる塩基配列を示した。すなわち、分離された菌株は塩基配列が互いに異なる８種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を持っていた。

【0077】

９コピーの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を用いての属水準（Ｇｅｎｕｓ ｌｅｖｅｌ）の同定を進めた。使用した１６Ｓ ｒＲＮＡデータベースとソフトウェアはＴｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ＰｒｏｊｅｃｔのＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ（Wang, Q. et al., Appl Environ Microbiol., 73:5261-5267 (2007)), Ｌｉｖｉｎｇ Ｔｒｅｅ Ｐｒｏｊｅｃｔの Ａｌｉｇｎｅｒ(Pruesse, E. et al., Bioinformatics, 28:1823-1829 (2012)）、ＥｚＴａｘｏｎ ｄａｔａｂａｓｅのＩｄｅｎｔｉｔｙ（Kim, O.S. et al., Int J SystEvol Microbiol., 62:716721 (2012)）を使った。分離された菌株は全ての同定ソフトウェアで信頼区間（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）９５％以上であってバチルス属と同定された。

【0078】

分離された菌株をＥｚＴａｘｏｎデータベースのＩｄｅｎｔｉｔｙ（Kim, O.S. et al., Int J SystEvol Microbiol., 62:716721 (2012)）を使って種水準（Ｓｐｅｃｉｅｓ ｌｅｖｅｌ）の同定を進めた。現在種水準（Ｓｐｅｃｉｅｓ ｌｅｖｅｌ）を同定するための１６Ｓ ｒＲＮＡの相同性閾値（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の国際的標準は存在しないが、最も広く認められている臨界値のうち最も高い基準である９９％（Yarza, P. et al., Nature Rev. Microbiol., 12:635645 (2014)）を探索基準として用いた。また、純粋分離された菌株は８種の相異なる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を持っているから、各１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を対象として検索し、検索された基準菌株のうち、共通して発見される基準菌株を選択した。探索結果、互いに異なる種に属する８０種の基準菌株が探索された。この結果は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の相同性のみを用いてバチルス属に属する種を区別することができないという先行の研究結果と一致する（Janda J.M. & Abbott S.L., J Clin Microbiol., 45:2761-2764 (2007); Maughan H. & Van der AuweraG., Infect Genet Evol., 11:789-797 (2011)）。

【0079】

したがって、ゲノムに基づいた分類を進めた。前記過程で選別された菌株を対象として、一番目分離された菌株の全体ゲノムの相同性をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＤＮＡ－ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（DDH; AuchA.F. et al., Stand Genomic Sci., 28:117-234 (2010)）で分析して７０％以上の相同性を示す基準菌株を選択した。この結果、２種の基準菌株が発見され（表３）、発見された基準菌株と分離された菌株のゲノム水準でのＡＮＩ（ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とＡＡＩ（ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を分析して検証した（Rodriguez-R L.M. & Konstantinidis K.T., https://doi.org/10.7287/peerj.preprints.1900v1 (2016)）。

【0080】

下記の表３に分離された菌株とＤＤＨ分析において最も相同性が高い３種の基準菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ＤＤＨ、ＡＮＩ、ＡＡＩの結果を示した。

【0081】

【表3】

【0082】

以上のように１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、全体ゲノム比較により、純粋分離された菌株はバチルスアミロリケファシエンスに属する微生物と同定し、分離された菌株をバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３と名付け、２０１７年３月６日付で国際寄託機関である韓国生命工学院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託して受託番号ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰを受けた。

【0083】

アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のヌクレオチドデータベースを対象として検索した結果、本発明の菌株と同じ１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号３～１１）と１００％相同性を有する生物体は存在しなかった。

【0084】

実施例２－バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３からスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の分離／精製
２．１バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３の培養
バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の培養のために、ＬＢ寒天培地（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天；トリプトファン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）で形成された単一コロニーをＬＢ培地３０ｍｌに接種し、３７℃で１２時間培養した。この種培養をまた１ｍＭ硫酸マンガン（ＭｎＳＯ_４）の含まれたＬＢ培地３Ｌに接種し、３７℃で２０時間培養した。

【0085】

２．２スーパーオキシドジスムターゼの分離及び精製
細胞培養液を４℃で、３，５７８ｘｇで２０分間遠心分離して上澄み液を取った後、限外濾過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、以下、ＵＦ、ＭＷＣＯ １０，０００）を用いて１０倍濃縮した。濃縮された上澄み液３００ｍｌを４℃で撹拌しながら６０％飽和度まで硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）を添加し、３０分間撹拌した。その後、３，５７８ｇで３０分間遠心分離して上澄み液を取り、２Ｍ硫酸アンモニウムが含まれた５０ｍＭリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ^ＴＭ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ １６／１０カラムにロードした。その後、２Ｍ～０Ｍの硫酸アンモニウムが含まれた５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いて溶出した（図１のＡ）。

【0086】

ＳＯＤ含有分画（＃３５～＃４０）を集めた後、ＵＦ（ＭＷＣＯ １０，０００）を用いて濃縮し、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）で透析して塩を除去した。タンパク質の濃度はブラッドフォード（Bradford M, Anal Biochem, 72, 248-254, 1976）の方法で測定した。精製挙動は図１に示した。

【0087】

スーパーオキシドジスムターゼの活性はスーパーオキシドジスムターゼ分析キット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）を用いて確認した。スーパーオキシドジスムターゼ活性の１単位はスーパーオキシドラジカルを５０％抑制する酵素の量と定義される。精製されたＳＯＤの活性は２２３１．１２±２６９Ｕ／ｍｇ、ＳＤＳ上の分子量は約２２，０００ｄａｌｔｏｎであった。

【0088】

実施例３－バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３からスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の遺伝子の確認
Ｅｄｍａｎ分解方法を用いて、精製されたＳＯＤのＮ末端を分析した結果、Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕのアミノ酸配列を確認した。ゲノム上に前記アミノ酸配列をコード化することができる遺伝子を探索した結果、配列番号１の遺伝子を見つけた。

【0089】

配列番号１の遺伝子がＳＯＤをコード化する遺伝子であるかを検証するために、配列番号１の遺伝子を図２のように不活性化した。エリスロマイシン抵抗性遺伝子はＥｍＦ（ｇａａｇｃａａａｃｔｔａａｇａｇｔｇｔｇ）とＥｍＲ（ｔｃｃｔｔｇｇａａｇｃｔｇｔｃａｇｔａｇ）のオリゴプライマーを用いてｐＤＧ１６６４ ｐｌａｓｍｉｄ（Guerout-Fleury, A.M. et al., Gene 180:57-61 (1996)）から１１４４ｂｐの大きさのＰＣＲ増幅産物を得た。配列番号１の遺伝子の両隣接領域の相同性部位はバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３ゲノムを鋳型として使い、プライマー１（ａａａｃａｇｃｔｇｇｇａｔｇａａｃａｃａａｇｔｇａｇａｇ）とプライマー２（ｃａｃａｃｔｃｔｔａａｇｔｔｔｇｃｔｔｃｃａａｔｔｃｔｇｇａａｇｔｔｔｇｔａａｇ）の組合せで７７８ｂｐ大きさと、プライマー３（ｃｔａｃｔｇａｃａｇｃｔｔｃｃａａｇｇａｔａｃｃｔｇａａｃｔａｃｃａａａａｃｃｇ）とプライマー４（ａａａｃａｇｃｔｇａａｇｃｔｃａｔｇａｃｃａｃａｇｃａａｇ）の組合せで７９６ｂｐ大きさのＰＣＲ産物を増幅してエリスロマイシン抵抗性遺伝子とＰＣＲで連結して単一断片のＤＮＡに作った。連結されたＤＮＡはｐＵｏｒｉ－ｔｓ－ｃｍプラスミド（図３）のＰｖｕＩＩ制限酵素部位に挿入した。完成されたプラスミドｐＵｏｒｉ－ｓｏｄｅｍ（図３）はＺｈａｎｇなどの方法（Zhang G.Q. et al., Anal Biochem. 409:130-137 (2011)）でＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３に形質導入した。３０℃でクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）とエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）が添加されたＬＢ培地で生成された形質転換体を選別し、エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）が添加されたＬＢ液状培地に接種し、３７℃で１６時間培養した。培養液をエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）の含有されたＬＢ寒天培地に塗抹し、３７℃でコロニーを形成させ、これからクロラムフェニコールに対する感受性を有するコロニーを選別してＳＯＤ遺伝子が不活性化した菌株を確保した。

【0090】

親株と配列番号１の遺伝子が不活性化した菌株のＳＯＤ活性を比較した結果、同じ細胞ＯＤ_６００で不活性化した菌株（３．１ＳＯＤ Ｕ／ｍｌ）は親株（４１．４ＳＯＤ Ｕ／ｍｌ）に比べてＳＯＤ活性が１０倍以上減少したことから、配列番号１の遺伝子はバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３が生産する主要ＳＯＤ活性を有するポリペプチドをコード化することを確認した。

【0091】

実施例４－メロンＳＯＤと本発明のバチルスアミロリケファシエンスＳＯＤの相同性比較
メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏｎ）のミトコンドリア（ＸＰ＿００８４５７２９８、ＸＰ＿００８４５７２９７）クロロプラスト（ＸＰ＿００８４５３８３８、ＸＰ＿００８４５０７００、ＸＰ＿００８４５０６９９、ＸＰ＿００８４６５４２２、ＮＰ＿００１３１５３８２）、サイトゾル（ＸＰ＿００８４４１９８９、ＸＰ＿００８４５５５７８、ＸＰ＿００８４５５５７４、ＡＬＯ６２０４３、ＡＬＯ６２０４２）内に存在するＳＯＤとバチルスアミロリケファシエンスＧＲ４２３菌株によって生産されたＳＯＤのアミノ酸配列と相同性を調査した結果、いずれも４０％以下の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示した。下記の表４に相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）と類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を示した。

【0092】

【表4】

【0093】

図４は本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤとメロンミトコンドリアＳＯＤの相同性を比較して示す結果である。

【0094】

実施例５－バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３由来のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の生産
５．１バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３の培養
前記菌株の培養のために、ＬＢ寒天培地で形成された単一コロニーをＬＢ培地５０ｍｌに接種し、３７℃で１２時間培養した。この種培養をまた５００ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で６時間培養した。この２次種培養をまた１ｍＭ硫酸マンガンの含まれた５０ＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で２０時間培養した。バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３の培養挙動は図５に示した。

【0095】

５．２バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３培養液後の工程
細胞培養液に０．７％リン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）を添加し、この混合液に１．４％塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）を添加した後、また０．７％リン酸水素二カリウムを添加し、３０分間混合して凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）を誘導した。その後、４℃、３，５７８ｇで間遠心分離して上澄み液を取った後、ＵＦ（ＭＷＣＯ １０，０００）を用いて１０倍濃縮した。

【0096】

５．３スーパーオキシドジスムターゼのコーティング
バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３由来スーパーオキシドジスムターゼのコーティングは天然コーティング製剤であるセラック（ｓｈｅｌｌａｃ）を用いた。セラックは５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）緩衝溶液に溶解し、スーパーオキシドジスムターゼ精製溶液と混合して凍結乾燥させた。凍結乾燥されたサンプルは粉末形態で４℃で保管した。

【0097】

セラック濃度変化によるコーティング効率は表５に示した。

【0098】

【表5】

＊（１－（コーティングＳＯＤを緩衝溶液に懸濁した直後に測定したＳＯＤ力価／懸濁後２４時間後に測定したＳＯＤ力価））＊１００

【0099】

実施例６－スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の活性測定
精製したバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株由来のスーパーオキシドジスムターゼ（ＧＦ４２３ ＳＯＤ）の活性をスーパーオキシドジスムターゼ活性測定キット（ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ｃａｙｍａｎ ７０６００２）を用いて測定した。

【0100】

まず、サンプル緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０）を用いて標準サンプル（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ）とスーパーオキシドジスムターゼサンプル（ＳＯＤ ｓａｍｐｌｅｓ）を希釈して準備し、９６ウェルにラジカル検出器（ｒａｄｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）２００μｌを分株した後、標準サンプルとスーパーオキシドジスムターゼサンプルを１０μｌずつ分株した。その後、キサンチンオキシダーゼ（ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）を２０μｌずつ分株し、常温で３０分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。標準サンプルの吸光度値から線形比率（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ｒａｔｅ、ＬＲ）値を求めて標準曲線を描き、標準曲線から得た式を用いてスーパーオキシドジスムターゼの活性を下記の数学式１によって算出した。
［数１］
スーパーオキシドジスムターゼ活性（ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｕ／ｍｌ）＝［｛（ＬＲ－ｙ切片）／勾配｝＊２３］＊希釈倍数
例）標準サンプルＡの線形比率値（Ｓｔｄ Ａ ＬＲ）＝標準サンプルＡのＯ．Ｄ．／標準サンプルＡのＯ．Ｄ．
標準サンプルＢの線形比率値（Ｓｔｄ Ｂ ＬＲ）＝標準サンプルＡのＯ．Ｄ．／標準サンプルＢのＯ．Ｄ．

【0101】

本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＧＦ４２３ ＳＯＤ）と他製品のＳＯＤ活性を比較した。比較のために、本発明の菌株によって生産されたＧＦ４２３ ＳＯＤ、ウチワサボテンＳＯＤ（Ｘｉ’ａｎ Ｈａｏ－Ｘｕａｎ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、植物ハブＳＯＤ（Ｘｉ’ａｎ Ｈａｏ－Ｘｕａｎ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、及びメロンＳＯＤ（ＢｉｏＮｏｖ）のＳＯＤ活性を比較して下記の表６に示した。

【0102】

【表6】

【0103】

実施例７：バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株が生産するＳＯＤの抗酸化効果
動物モデルでバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の抗酸化効果と抗炎症効果を確認するために実験を進めた。

【0104】

動物実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のＡｎｉｍａｌ ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを守って進めた。実験動物は７週齢の雄ＳＤ実験用マウスを購入し、一週間の適応期間を持った後、下記のように４グループに分けて２４℃、５５±１０％湿度、１２時間明／暗周期の環境で育てた。

【0105】

動物実験は各グループ当たり７匹ずつ、対照群（グループＩ）、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤ投与群（グループＩＩ）、ストレスを受けるようにして炎症反応を誘発するためにガンマ線を照射したガンマ線照射群（グループＩＩＩ）、及びガンマ線照射後、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤを投与した群（グループＩＶ）の４グループに分けて進めた。実験は総２９日間遂行し、グループＩにはＰＢＳ １００μｌを毎日経口投与し、グループＩＩにはバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤを１０ｕｎｉｔ／１００μｌずつ毎日経口投与した。グループＩＩＩはストレスを誘発するために０日目、６日目、１３日目、２０日目、２７日目にガンマ線を２グレー（Ｇｙ）照射し、ＰＢＳ １００μｌを毎日経口投与した。グループＩＶはグループＩＩＩと同様にガンマ線を照射し、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤを１０ｕｎｉｔ／１００μｌずつ毎日経口投与した。

【0106】

投与後、毎日体重変化を測定し、０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目に血液サンプルを採取し、採取した血液サンプルは常温で３０分インキュベーションした後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して血清を得た。

【0107】

１）マウスの体重変化測定
動物実験を進めるうちマウスの体重変化を毎日測定して記録して図７に示した。図７を参照すれば、他のグループに比べて対照群（グループＩ）の体重増加幅が最も大きく現れ、他のグループはＳＯＤ又はガンマ線の影響によって体重の増加幅が対照群に比べて少なく現れた。

【0108】

２）血液内の抗酸化酵素変化測定
－ＳＯＤ活性変化測定
動物実験後に得た血清を用いて血液内のＳＯＤ活性を測定して図８に示した。図８を参照すれば、対照群と比較したとき、グループＩＩ（ＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤ投与グループ）で血液内のＳＯＤ活性が増加したことを確認し、グループＩＩＩ（ガンマ線照射グループ）はＳＯＤ活性が減少したことを確認した。ガンマ線を照射し、本発明の菌株を投与したグループＩＶ（ＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤ投与グループ）では血液内のＳＯＤ活性がガンマ線のみ照射したグループ（グループＩＩＩ）より高く現れて対照群（グループＩ）と類似した様相を示した。

【0109】

－カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）変化測定
動物実験後に得た血清を用いて血液内のＣＡＴ活性を測定するために、カタラーゼ活性測定キット（ｃａｔａｌａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ｃａｙｍａｎ ７０７００２）を用いた。

【0110】

カタラーゼサンプルバッファー（２５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ）を用いてカタラーゼ対照群と血清サンプルを希釈して準備した後、カタラーゼ分析バッファー（１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）を９６ウェルプレートに１００μｌ分株し、メタノール３０μｌを分株した。その後、カタラーゼ対照群と標準サンプル（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ）、血清サンプルをそれぞれ２０μｌずつ分株した。ついで、過酸化水素を２０μｌずつ分株し、常温で２０分間インキュベーションした。その後、水酸化カリウム３０μｌ分株し、カタラーゼパーパルド（ｃａｔａｌａｓｅ ｐｕｒｐａｌｄ）３０μｌを加えた後、常温で１０分間インキュベーションした。

【0111】

最後に、過ヨウ素酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）１０μｌを入れた後、５分間インキュベーションし、５４０ｎｍで吸光度を測定した。標準サンプルと血清サンプルの吸光度値から標準サンプルＡ（濃度０）の吸光値を差し引いて得た値を用いて標準曲線を描き、標準曲線から得た式を用いて血清サンプルのホルムアルデヒド濃度を求め、その濃度値を用いて下記の式２によってカタラーゼの活性を計算し、図９にグラフで示した。

【0112】

［数２］
ホルムアルデヒド（ｕＭ）＝［（サンプルＯ．Ｄ．－ｙ切片）／勾配］＊（０．１７ｍｌ／０．０２ｍｌ）
カタラーゼ活性（ＣＡＴ ａｃｔｉｖｉｔｙ、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ）＝（サンプルのホルムアルデヒド濃度／２０分）＊希釈倍数

【0113】

図９の結果を参照すれば、対照群のカタラーゼ活性には何の変化もなく、対照群に比べてグループＩＩ（ＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤ投与グループ）が２８日目でカタラーゼの活性が増加したことを確認した。また、グループＩＩＩ（ガンマ線照射グループ）はカタラーゼ活性が減少したことを確認し、グループＩＶ（ガンマ線照射＋ＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤ）はカタラーゼの比率がガンマ線照射によって減少してからＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤ投与によって対照群グループ程度に回復したことを確認することができた。

【0114】

－グルタチオンペルオキシダーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＧＰｘ）変化測定
動物実験後に得た血清を用いて血液内のＧＰｘ活性を測定するためにグルタチオンペルオキシダーゼ活性測定キット（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ｃａｙｍａｎ ７０３１０２）を用いて測定し、結果を図１０に示した。

【0115】

まず、サンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を用いてグルタチオンペルオキシダーゼ（対照群）と血清サンプルを希釈して準備し、９６ウェルプレートのバックグラウンドウェルには分析バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭ ＥＤＴＡ）１２０μｌとｃｏ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ（ＮＡＤＰＨ、グルタチオン、グルタチオン還元酵素）５０μｌを入れ、陽性対照群ウェルと血清サンプルウェルには分析バッファー１００μｌとｃｏ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ５０μｌを入れた後、対照群と血清サンプルをそれぞれ２０μｌずつ分株した。その後、クメンヒドロペルオキシド（ｃｕｍｅｎｅ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）を２０μｌずつ分株し、数秒間よく交ぜた後、３４０ｎｍで１分に一回ずつ５回以上吸光度を測定した。時間別に吸光度からΔＡ３４０／ｍｉｎを求め、この値を用いて数３によってグルタチオンペルオキシダーゼの活性を計算して図１０にグラフで示した。

【0116】

［数１０］
ΔＡ３４０／ｍｉｎ＝｜Ａ３４０（ｔｉｍｅ ２）Ｏ．Ｄ．－Ａ３４０（ｔｉｍｅ １）Ｏ．Ｄ．｜／｛Ｔｉｍｅ ２（ｍｉｎ）－Ｔｉｍｅ １（ｍｉｎ）｝
ＧＰｘ活性（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ）＝（ΔＡ３４０／ｍｉｎ／０．００３７３ｕＭ＾－１）＊（０．１９ｍｌ／０．０２ｍｌ）＊希釈倍数

【0117】

図１０を参照すれば、対照群グループのグルタチオンペルオキシダーゼの活性変化は大きく現れなく、対照群（グループＩ）に比べてグループＩＩ（ＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤ投与グループ）はグルタチオンペルオキシダーゼの活性が増加したことを確認した。また、グループＩＩＩ（ガンマ線照射グループ）でのＧＰｘ活性は減少し、グループＩＶ（ガンマ線照射＋ＧＦ４２３菌株）のＧＰｘ活性はガンマ線照射によって減少してから本発明のＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤの投与によって再び元の水準まで回復したことを確認した。

【0118】

実施例８：バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株の抗炎症効果検証
１）血液内のＩＬ－１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｂｅｔａ）変化測定
動物実験後に得た血清を用いて血液内のＩＬ－１βの濃度変化を測定するためにＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ測定キット（マウスＩＬ－１β ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ ＳＭＬＢ００Ｃ）を用いた。
まず、蒸溜水を用いてマウスＩＬ－１β対照群を溶かし、ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ５－１６を用いてＩＬ－１β標準サンプルと血清サンプルを希釈して準備した。マウスＩＬ－１β単クロン抗体がコートされたプレートにａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ１Ｎ ５０μｌを入れた後、準備した対照群、標準サンプル及び血清サンプルをそれぞれ５０μｌずつ分株し、常温で２時間インキュベーションした。その後、洗浄バッファー（１ｘ ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ－２０）を用いて５回洗浄した後、マウスＩＬ－１βコンジュゲート（ワサビダイコンペルオキシダーゼが結合したマウスＩＬ－１β多クロン抗体）を各ウェルに１００μｌずつ分株し、常温で２時間インキュベーションした。その後、５回洗浄し、発色試薬Ａ（過酸化水素）とＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｌｙｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を同量で交ぜて（使用１５分前に予め混ぜ合わせた）各ウェルに１００μｌずつ分株し、光を避けて３０分間常温でインキュベーションした後、停止液１００μｌを入れて反応を止め、４５０ｎｍと５４０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＬ－１βの数値を得るために、まず５４０ｎｍの吸光値から４５０ｎｍの吸光値を差し引いた値を用いて計算した。その後、標準サンプル、対照群、血清サンプルの値から標準サンプルの０点吸光値を差し引いた後、その値を用いて標準サンプルの標準曲線を描き、それによって得た式を用いて下記の数４によってＩＬ－１β値を計算して図１１にグラフで示した。

【0119】

［数４］
１）ΔＯ．Ｄ．＝５４０ｎｍＯ．Ｄ．－４５０ｎｍＯ．Ｄ．
２）ΔΔＯ．Ｄ．＝ΔＯ．Ｄ．－Ｓｔｄ ０ ΔＯ．Ｄ．
３）ＩＬ－１β（ｐｇ／ｍｌ）＝｛（ΔΔＯ.Ｄ.－ｙ切片）／勾配｝＊希釈倍数

【0120】

図１１を参照すれば、対照群（グループＩ）と本発明の菌株を投与したグループＩＩでＩＬ－１βの数値変化は大きく現れなく、グループＩＩＩ（ガンマ線照射グループ）ではＩＬ－１βの数値が大きく増加したことを確認した。一方、グループＩＶ（ガンマ線照射＋ＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤ）ではＩＬ－１βの数値の増加が現れたが、ガンマ線のみ照射したグループに比べて小さく増加したことを確認することができた。

【0121】

２）ＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）変化測定
動物実験後に得た血清を用いて血液内のＴＮＦ－αの濃度変化を測定するためにＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡ測定キット（マウスＴＮＦ－α免疫分析キット、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ ＳＭＴＡ００Ｂ）を用いた。

【0122】

まず、蒸溜水を用いてマウスＴＮＦ－α対照群を溶かし、ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ６－１２を用いてＴＮＦ－α標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）サンプルと血清サンプルを希釈して準備した。マウスＴＮＦ－α単クロン抗体がコートされたプレートにａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ１－６３ ５０μｌを入れた後、準備した対照群、標準サンプル及び血清サンプルをそれぞれ５０μｌずつ分株し、常温で２時間インキュベーションした。その後、洗浄バッファー（１ｘ ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ－２０）を用いて５回洗浄した後、マウスＴＮＦ－αコンジュゲート（ワサビダイコンペルオキシダーゼが結合したマウスＴＮＦ－α多クロン抗体）を各ウェルに１００μｌずつ分株し、常温で２時間インキュベーションした。その後、５回洗浄し、発色試薬Ａ（過酸化水素）とＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｌｙｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を同一量で交ぜて（使用１５分前に予め混ぜ合わせた）各ウェルに１００μｌずつ分株し、光を避けて３０分間常温でインキュベーションした後、停止液１００μｌを入れて反応を止め、４５０ｎｍと５４０ｎｍで吸光度を測定して図１２にグラフで示した。

【0123】

図１２を参照すれば、対照群と本発明の菌株を投与したグループＩＩのＴＮＦ－α数値は大きな変化を示さなく、グループＩＩＩ（ガンマ線照射グループ）はＴＮＦ－αの数値が増加したことを確認した。一方、グループＩＶ（ガンマ線照射＋ＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤ）のＴＮＦ－α数値はガンマ線照射によって増加してからＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤの投与によって減少したことを確認することができた。

【0124】

３）ＩＬ－６変化測定
動物実験後に得た血清を用いて血液内のＩＬ－６の濃度変化を測定するためにＩＬ－６ ＥＬＩＳＡ測定キット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ ＳＭ６０００Ｂ）を用いた。

【0125】

まず、蒸溜水を用いてマウスＩＬ－６対照群を溶かし、ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ５Ｔを用いてＩＬ－６標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）サンプルと血清サンプルを希釈して準備した。マウスＩＬ－６単クロン抗体がコートされたプレートにａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ１－１４ ５０μｌを入れた後、準備した対照群、標準サンプル及び血清サンプルをそれぞれ５０μｌずつ分株し、常温で２時間インキュベーションした。その後、洗浄バッファー（１ｘ ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ－２０）を用いて５回洗浄した後、マウスＩＬ－６コンジュゲート（ワサビダイコンペルオキシダーゼが結合したマウスＩＬ－６多クロン抗体）を各ウェルに１００μｌずつ分株し、常温で２時間インキュベーションした。その後、５回洗浄し、発色試薬Ａ（過酸化水素）とＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｌｙｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を同一量で交ぜて（使用１５分前に予め混ぜ合わせた）各ウェルに１００μｌずつ分株し、光を避けて３０分間常温でインキュベーションした後、停止液１００μｌを入れて反応を止め、４５０ｎｍと５４０ｎｍで吸光度を測定して図１３に示した。

【0126】

図１３を参照すれば、対照群（グループＩ）と本発明の菌株を投与したグループのＩＬ－６濃度の変化は大きくなく、グループＩＩＩ（ガンマ線照射グループ）ではＩＬ－６の濃度が増加したことを確認した。一方、グループＩＶ（ガンマ線照射＋ＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤ）のＩＬ－６濃度変化はＧＦ４２３ ＳＯＤのみ食べさせたグループの変化に似ている様相を示した。

【0127】

４）酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ、ＮＯ）変化測定
動物実験後に得た血清を用いて血液内の酸化窒素の変化を測定するために、酸化窒素測定キット（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ ＳＴＡ－８０２）を用いた。

【0128】

蒸溜水を用いて硝酸ナトリウム標準サンプル（１４ｍＭ）を希釈して準備し、血清サンプルはＰＢＳを用いて希釈する。希釈した標準サンプルと血清サンプルを９６ウェルプレートに５０μｌずつ分株し、酵素混合物（ｎｉｔｒｉｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、窒素還元酵素混合物）と酵素補助因子（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、水酸化ナトリウム）を交ぜて酵素反応混合物を作って各ウェルに５０μｌずつ分株した。その後、光を遮断し、一時間常温でインキュベーションし、ついで、グリース試薬Ａとグリース試薬Ｂを順次５０μｌずつ分株した後、発色するように常温で１０分間インキュベーションし、５４０ｎｍで吸光度を測定した。標準サンプルの吸光度を用いて標準曲線を描き、それによって得た式を用いて下記の５によって酸化窒素の濃度を計算して図１４にグラフで示した。

【0129】

［数５］
酸化窒素（ＮＯ）ｕＭ＝｛（サンプルＯ．Ｄ．－ｙ切片）／勾配｝＊希釈倍数

【0130】

図１４を参照すれば、対照群と本発明の菌株を投与したグループＩＩの酸化窒素濃度の変化は大きくなく、グループＩＩＩ（ガンマ線照射グループ）の濃度は増加したことを確認した。一方、グループＩＶ（ガンマ線照射＋ＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤ）の酸化窒素濃度はガンマ線照射によって増加してからＧＦ４２３菌株生産ＳＯＤの投与によって元の水準に減少したことを確認した。

【0131】

実施例９－バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３から精製されたＳＯＤの大膓癌細胞株増殖抑制効果
以下で説明する方法によって本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されたＳＯＤを大膓癌細胞に処理したとき、細胞増殖の阻害程度を確認した。

【0132】

大膓癌細胞ＨＴ－２９とＳＷ４８０を９６ウェルに１ｘ１０^４個で蒔いた後、２４時間３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で培養した。２４時間後、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３によって生産されたＳＯＤと商業化したスーパーオキシドジスムターゼ（ウチワサボテンＳＯＤ（Ｘｉ’ａｎ Ｈａｏ－Ｘｕａｎ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、植物ハブＳＯＤ（Ｘｉ’ａｎ Ｈａｏ－Ｘｕａｎ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、メロンＳＯＤ（ＢｉｏＮｏｖ））を濃度（０、１０、２５、５０、１００、２００、４００、８００Ｕ／ｍｌ）で処理し、４８時間３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）でインキュベーションした。その後、ＷＳＴ－８（ＷＳＴ－８細胞増殖キット、Ｃａｙｍａｎ １００１０１９９）混合物を１０μｌずつ分株した後、１時間３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベーションした後、４５０ｎｍで吸光度を測定して対照群の吸光度値と比較し、下記の数学式６によって細胞増殖阻害程度をパーセント（％）値に計算し、その結果を図６Ａ及び図６Ｂに示した。

【0133】

［数６］
細胞増殖（％）＝（各濃度別Ｏ．Ｄ．／対照群Ｏ．Ｄ．）＊１００」

【0134】

図６Ａを参照すれば、商業化したウチワサボテンＳＯＤ、植物ハブＳＯＤ、メロンＳＯＤより発明の菌株によって生産されたＳＯＤが大膓癌細胞に対する細胞増殖阻害効果がもっと優れたことを確認することができる。特に、低濃度１０Ｕ／ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌで効果の差が著しかった。すなわち、大膓癌細胞ＳＷ４８０の場合、ＳＯＤ １０Ｕ／ｍｌの濃度でウチワサボテンＳＯＤ、メロンＳＯＤは大膓癌細胞に対する増殖阻害効果がない反面、植物ハブＳＯＤとＧＦ４２３ ＳＯＤの場合は約１０％の阻害効果を示し、ＳＯＤ ２５Ｕ／ｍｌの場合、植物ハブＳＯＤは約１０％、本発明のＧＦ４２３ ＳＯＤの場合は約４０％の優れた阻害効果を示した。

【0135】

図６Ｂを参照すれば、大膓癌細胞ＨＴ２９の場合にも、ウチワサボテンＳＯＤ、植物ハブＳＯＤ、メロンＳＯＤ（ＢｉｏＮｏｖ）は１００Ｕ／ｍｌの濃度まで大膓癌細胞の増殖抑制効果が小さい反面（約１０％以下）、本発明のＧＦ４２３ ＳＯＤの場合、２５Ｕ／ｍｌ濃度から効果を示し始めて２５Ｕ／ｍｌでは約１５％、５０Ｕ／ｍｌでは３０％、１００Ｕ／ｍｌの濃度では５０％の非常に優れた大膓癌細胞増殖抑制効果を示した。

【0136】

以上の結果から確認できるように、本発明のバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株によって生産されるＳＯＤ活性を有するポリペプチドは大膓癌細胞に対しては癌細胞増殖阻害効果を示すことを確認したし、商業化したＳＯＤに比べて低濃度で格段の効果を示した。

【0137】

実施例１０：バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株由来のＳＯＤの脂質異常症に対する効果
本実施例ではバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株由来のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の脂質異常症患者及び正常人の脂質代謝に対する効能効果を確認するために実験を進めた。

【0138】

本発明の組成物の脂質異常症に対する予防又は治療効果を立証するために、それぞれ２２人の正常グループ（正常群）と脂質異常症患者（危険群）の４４人の対象者に、配列番号２のアミノ酸配列を有するスーパーオキシドジスムターゼを一定期間投与した後、血中総コレステロール（ＴＣ）、中性脂肪（ＴＧ）、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロール濃度を測定した。

【0139】

本実施例では配列番号２のアミノ酸配列を有するスーパーオキシドジスムターゼを下記の表７の組成で賦形剤とともに混合してカプセル当たり２５０Ｕになるように調剤した。このように製造された本発明の組成物を４週間２グループの対象体に毎日経口で１回１カプセルずつ投与した（２５０ＵＮＩＴ／ｄａｙ）。

【0140】

【表7】

【0141】

効能評価方法－脂質パラメーター
本発明のスーパーオキシドジスムターゼの服用４週前後、全血のＨＤＬ－コレステロール、ＬＤＬ－コレステロール、総コレステロール及び中性脂肪濃度を測定した。前記実験例の各対象者から得た血液の総コレステロールはアライン（Ａｌｌａｉｎ）などの酵素法（Clin. Chem. 20: 470-475, 1974）を応用した測定用試薬（アサン製薬キット）を使った。ＨＤＬ－コレステロールはアサン製薬試薬を使って測定した（Clin. Chem. 28: 1379-1388, 1982）。血液の中性脂肪（ＴＧ）の濃度はＭｃＧｏｗａｎなどの酵素法（Clin. Chem. 29: 538-542, 1983）を用いた発色法原理によって中性脂肪測定用試薬（アサン製薬キット）を使って測定し、その結果を下記の表８に示した。全ての値は平均値±標準偏差（ＳＤ）で示した。本発明の薬剤学的組成物に対して全ての対象体では何の副作用も観察されなかった。

【0142】

【表8】

【0143】

前記表８に示したように、偽薬群は総コレステロール、中性脂肪及び低密度コレステロールの濃度において少しの変化はあったが、有意な著しい変化を示さなかった。これに比べ、本発明のスーパーオキシドジスムターゼを主成分とする薬剤学的組成物を服用した脂質異常症患者群の場合には、服用前に比べて総コレステロール、中性脂肪及び低密度コレステロールの濃度が有意に低くなった。

【0144】

以上で本発明について詳細に説明したが、これはただ本発明の具体的な具現例を例示したもので、これによって本発明の範囲が制限されるものではない。本発明が本発明の精神及び範疇を逸脱しない範疇内で多様に変形及び／又は変更して実施されることができるのは本発明が属する技術分野の通常の技術者に明らかであろう。したがって、本発明の実質的な保護範囲は添付の請求範囲及びそれと均等範囲によって決定されなければならない。

【産業上の利用可能性】

【0145】

本発明のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチドは抗酸化、抗炎症及び坑癌活性に優れ、脂質異常症の予防又は治療活性に優れ、酵素活性の安全性及び生体内での安全性に優れるので、既存のＳＯＤを含む食品、健康補助食品、医薬品、化粧品などの材料として有利に使われることができる。

【受託番号】

【0146】

ＫＣＴＣ １３２２２ ＢＰ

【配列表フリーテキスト】

【0147】

配列番号１はバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）によって生産されるスーパーオキシドジスムターゼをコーディングする遺伝子の塩基配列である。
配列番号２はバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）によって生産されるスーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸配列である。
配列番号３～１１はバチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＦ４２３）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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