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▶ フェリング ベスローテン フェンノートシャップの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-20
(45)【発行日】2022-04-28
(54)【発明の名称】精製および／またはウイルス不活性化の方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/14 20060101AFI20220421BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220421BHJP
A61K 38/24 20060101ALI20220421BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20220421BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220421BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20220421BHJP
【ＦＩ】
C07K1/14
C12P21/02 H
A61K38/24
A61P15/00
C12N15/12
C12N5/10
【請求項の数】
12
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020182008
(22)【出願日】2020-10-30
(62)【分割の表示】P 2017567128の分割
【原出願日】2016-06-24
(65)【公開番号】P2021036876
(43)【公開日】2021-03-11
【審査請求日】2020-11-27
(31)【優先権主張番号】15174029.7
(32)【優先日】2015-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】500297535
【氏名又は名称】フェリング ベスローテン フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(72)【発明者】
【氏名】アハラノヴ，ジェニー
(72)【発明者】
【氏名】エレズ，エリノア
(72)【発明者】
【氏名】ハロッシュ，イーライ
【審査官】竹内 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】特開２０００－０９５７９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０８－１７６０１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第００／０５６７６８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】欧州特許出願公開第０２７１９７０４（ＥＰ，Ａ１）
【文献】特開平０２－２７３１７５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゴナドトロピンの精製方法であって、カプリル酸とエタノールの組み合わせによりゴナドトロピンを処理する工程と、濾過する更なる工程を含む方法。
【請求項2】
ゴナドトロピンのウイルス不活性化方法であって、カプリル酸とエタノールの組み合わせによりゴナドトロピンを処理する工程と、濾過する更なる工程を含む方法。
【請求項3】
カプリル酸およびエタノールの組み合わせにより、ゴナドトロピンの溶液を処理することを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ゴナドトロピンがＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ゴナドトロピンが組換えゴナドトロピンである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ゴナドトロピンが、好適な培地中で細胞を培養すること、ならびに前記細胞および／または前記培地から組換えゴナドトロピンを採取することを含む方法により、細胞内で産生された組換えゴナドトロピンである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
カプリル酸とエタノールの組み合わせにより前記ゴナドトロピンを処理することが、ｐＨ２～ｐＨ６．５、例えばｐＨ３～ｐＨ６．５、例えばｐＨ４～ｐＨ６、例えばｐＨ４．５～ｐＨ５．５において行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
カプリル酸が濃度１０ｍＭ～３０ｍＭのカプリル酸であり、かつ／またはエタノールが２０％～５０％のＥｔＯＨである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
（ａ）撹拌しながら、２３±２℃の温度で、１分～６時間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸により前記ゴナドトロピンを処理すること；（ｂ）撹拌せずに、４℃～８℃の温度で、１分～３２時間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸により前記ゴナドトロピンを処理すること；（ｃ）撹拌しながら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸により前記ゴナドトロピンを処理し、続いて温度を４℃～８℃まで低下させ、その後、撹拌せずに、１４時間～１８時間インキュベーションを行うこと；または（ｄ）５．５±０．１のｐＨおよび２３±２℃の温度で、１時間±１０分の継続時間にわたり、エタノールおよびカプリル酸により前記ゴナドトロピンを処理することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ガラス繊維フィルターを使用して前記ゴナドトロピンを濾過する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ゴナドトロピンを所望の濃度に濃縮する更なる工程および／または後続の製剤化工程を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質（もしくはタンパク質製品）の精製方法および／またはタンパク
質（もしくはタンパク質製品）のウイルス不活化方法に関する。本発明は、糖タンパク質
（もしくは糖タンパク質製品）の精製方法および／または糖タンパク質（もしくは糖タン
パク質製品）のウイルス不活化方法に関する。タンパク質／糖タンパク質は、例えば、宿
主細胞内で産生された、ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨなどの組換え糖タンパク質であっても
よい。タンパク質／糖タンパク質は尿由来であってもよい。
質（もしくはタンパク質製品）のウイルス不活化方法に関する。本発明は、糖タンパク質
（もしくは糖タンパク質製品）の精製方法および／または糖タンパク質（もしくは糖タン
パク質製品）のウイルス不活化方法に関する。タンパク質／糖タンパク質は、例えば、宿
主細胞内で産生された、ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨなどの組換え糖タンパク質であっても
よい。タンパク質／糖タンパク質は尿由来であってもよい。
【背景技術】
【0002】
多くの糖タンパク質が治療処置に使用されている。例えば、ゴナドトロピンは、不妊症
の処置に使用される種類の糖タンパク質である。ゴナドトロピンは、男性および女性の性
腺機能を制御する一群のヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンである。ゴナドトロピンには
、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および絨毛性ゴナドトロピ
ン（ＣＧ）が含まれる。
の処置に使用される種類の糖タンパク質である。ゴナドトロピンは、男性および女性の性
腺機能を制御する一群のヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンである。ゴナドトロピンには
、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および絨毛性ゴナドトロピ
ン（ＣＧ）が含まれる。
【0003】
妊娠中および閉経後の女性の尿から抽出されたＦＳＨおよびｈＣＧは、長年にわたって
不妊症処置に使用されてきた。尿から抽出されるＦＳＨおよびｈＣＧの生産は、大量の尿
の収集および処理を含む。
不妊症処置に使用されてきた。尿から抽出されるＦＳＨおよびｈＣＧの生産は、大量の尿
の収集および処理を含む。
【0004】
尿由来製品の代替として、ＦＳＨおよびｈＣＧの組換え型が利用可能である。現在承認
されている製品（Ｇｏｎａｌ－Ｆ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ製Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅ；Ｍ
ＳＤ製Ｐｕｒｅｇｏｎ）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で産生（発現
）される。
されている製品（Ｇｏｎａｌ－Ｆ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ製Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅ；Ｍ
ＳＤ製Ｐｕｒｅｇｏｎ）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で産生（発現
）される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本出願人らは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系において発現される、組換えＦＳＨお
よび組換えｈＣＧを開発した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系由来ＦＳＨ製品、および
その産生方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００９７８（ＷＯ２００９／１
２７８２６Ａとして公開）、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６５５０７（ＷＯ２０１３／０２
０９９６として公開）に記載されている。本製品（ＦＥ９９９０４９）は欧州での第ＩＩ
Ｉ相臨床試験を完了した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系由来組換えｈＣＧ製品、およ
びその産生方法は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８５４（ＷＯ２０１１／０４２６８８
として公開）に記載されている。
よび組換えｈＣＧを開発した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系由来ＦＳＨ製品、および
その産生方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００９７８（ＷＯ２００９／１
２７８２６Ａとして公開）、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６５５０７（ＷＯ２０１３／０２
０９９６として公開）に記載されている。本製品（ＦＥ９９９０４９）は欧州での第ＩＩ
Ｉ相臨床試験を完了した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系由来組換えｈＣＧ製品、およ
びその産生方法は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８５４（ＷＯ２０１１／０４２６８８
として公開）に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本出願人らは、例えば、哺乳類細胞系内で産生される組換えＦＳＨおよび組換えｈＣＧ
（例えば、ＷＯ２００９／１２７８２６ＡおよびＷＯ２０１３／０２０９９６に記載の組
換えＦＳＨ、およびＷＯ２０１１／０４２６８８に記載の組換えｈＣＧ）の精製に用いる
ことができる技術を開発した。
（例えば、ＷＯ２００９／１２７８２６ＡおよびＷＯ２０１３／０２０９９６に記載の組
換えＦＳＨ、およびＷＯ２０１１／０４２６８８に記載の組換えｈＣＧ）の精製に用いる
ことができる技術を開発した。
【0007】
本発明の第１の態様によれば、タンパク質［例えば、糖タンパク質、例えば、組換え糖
タンパク質、（例えば、組換え）ゴナドトロピン、（例えば、組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧま
たはＬＨ］の精製方法であって、カプリル酸およびエタノールと組み合わせて、タンパク
質［例えば、糖タンパク質、例えば、組換え糖タンパク質、（例えば、組換え）ゴナドト
ロピン、（例えば、組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ］を処理する工程を含む方法が提
供される。
タンパク質、（例えば、組換え）ゴナドトロピン、（例えば、組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧま
たはＬＨ］の精製方法であって、カプリル酸およびエタノールと組み合わせて、タンパク
質［例えば、糖タンパク質、例えば、組換え糖タンパク質、（例えば、組換え）ゴナドト
ロピン、（例えば、組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ］を処理する工程を含む方法が提
供される。
【0008】
本方法は、カプリル酸およびエタノールと組み合わせて、タンパク質［例えば、水、緩
衝液またはその他の培地（例えば緩衝液；１００ｍＭ酢酸アンモニウム、３０～５０ｍＭ
のＮａＣｌ、ｐＨ９～９．５）］の溶液を処理することを含んでもよい。本方法は、ｐＨ
６．５～１２、例えばｐＨ７．５～１０、例えばｐＨ９～９．５において緩衝液（例えば
、酢酸アンモニウム緩衝液）中でタンパク質の溶液を処理することを含んでもよい。
衝液またはその他の培地（例えば緩衝液；１００ｍＭ酢酸アンモニウム、３０～５０ｍＭ
のＮａＣｌ、ｐＨ９～９．５）］の溶液を処理することを含んでもよい。本方法は、ｐＨ
６．５～１２、例えばｐＨ７．５～１０、例えばｐＨ９～９．５において緩衝液（例えば
、酢酸アンモニウム緩衝液）中でタンパク質の溶液を処理することを含んでもよい。
【0009】
カプリル酸およびエタノールと組み合わせて糖タンパク質を処理する工程は、例えばｐ
Ｈ２～ｐＨ６．５、例えばｐＨ３～ｐＨ６．５、例えばｐＨ４～ｐＨ６（例えばｐＨ５．
５±０．１）、好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ５．５の酸性ｐＨにおいて行われてもよい。
酸性状態（例えば、ｐＨ４～ｐＨ６）の使用は、カプリル酸の作用によるものである。カ
プリル酸はウイルス膜を壊すことによりエンベロープウイルスを不活性化することができ
る。このことはウイルスの疎水性膜を貫通できる非帯電形態のカプリル酸により可能とな
る。カプリル酸は、そのｐＫａ（ｐＨ４．９）に近いｐＨでは帯電しない。１単位上昇の
ΔｐＨ（ｐＨ約５．９）では、カプリル酸分子の１００％が負に帯電し、従ってウイルス
不活性化の効率が低下する。
Ｈ２～ｐＨ６．５、例えばｐＨ３～ｐＨ６．５、例えばｐＨ４～ｐＨ６（例えばｐＨ５．
５±０．１）、好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ５．５の酸性ｐＨにおいて行われてもよい。
酸性状態（例えば、ｐＨ４～ｐＨ６）の使用は、カプリル酸の作用によるものである。カ
プリル酸はウイルス膜を壊すことによりエンベロープウイルスを不活性化することができ
る。このことはウイルスの疎水性膜を貫通できる非帯電形態のカプリル酸により可能とな
る。カプリル酸は、そのｐＫａ（ｐＨ４．９）に近いｐＨでは帯電しない。１単位上昇の
ΔｐＨ（ｐＨ約５．９）では、カプリル酸分子の１００％が負に帯電し、従ってウイルス
不活性化の効率が低下する。
【0010】
タンパク質は、組換えタンパク質であっても尿由来タンパク質であってもよい。タンパ
ク質は、糖タンパク質であってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、ゴナドトロピン、
例えば、ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであってもよい。糖タンパク質は、組換え糖タンパク
質、例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであってもよ
い。タンパク質／糖タンパク質は、好適な培地中で細胞（細胞系）を培養して前記細胞（
細胞系）および／または前記培地から組換え糖タンパク質を採取する（例えば、細胞培養
上清から組換えタンパク質を採取する）方法により、細胞（細胞系）内で産生された、組
換え糖タンパク質（例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬ
Ｈ）であることが好ましい。細胞（細胞系）は、哺乳類細胞（細胞系）、例えば、ＣＨＯ
細胞（系）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）、ＨＥＫ２９３細胞（系）、ＨＴ１０
８０細胞（系）、ＣＯＳ細胞（系）、ＮＯＳ細胞（系）、ＳＰ２０細胞（系）等であって
もよい。細胞（細胞系）はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）であることが好ましい。
ク質は、糖タンパク質であってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、ゴナドトロピン、
例えば、ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであってもよい。糖タンパク質は、組換え糖タンパク
質、例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであってもよ
い。タンパク質／糖タンパク質は、好適な培地中で細胞（細胞系）を培養して前記細胞（
細胞系）および／または前記培地から組換え糖タンパク質を採取する（例えば、細胞培養
上清から組換えタンパク質を採取する）方法により、細胞（細胞系）内で産生された、組
換え糖タンパク質（例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬ
Ｈ）であることが好ましい。細胞（細胞系）は、哺乳類細胞（細胞系）、例えば、ＣＨＯ
細胞（系）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）、ＨＥＫ２９３細胞（系）、ＨＴ１０
８０細胞（系）、ＣＯＳ細胞（系）、ＮＯＳ細胞（系）、ＳＰ２０細胞（系）等であって
もよい。細胞（細胞系）はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）であることが好ましい。
【0011】
糖タンパク質（ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等）は、尿由来であっても組換
えであっても、一般に、培地中で溶液／懸濁液の形態をとる。糖タンパク質は、当該技術
分野において周知であるように、単一のアイソフォームとして、または複数のアイソフォ
ームの混合物として、存在し得る。用語「タンパク質」、「糖タンパク質」、「ゴナドト
ロピン」、「ＦＳＨ」、「ｈＣＧ」、「ＬＨ」等は、タンパク質、糖タンパク質、ゴナド
トロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等を含んだ溶液または懸濁液を包含する。本明細書にお
いて、用語「タンパク質」、「糖タンパク質」、「ゴナドトロピン」、「ＦＳＨ」、「ｈ
ＣＧ」、「ＬＨ」等は、タンパク質、糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、
ＬＨ等を含んだ溶液または懸濁液を包含し、ここで、タンパク質、糖タンパク質、ゴナド
トロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等は、単一のアイソフォームまたは複数のアイソフォー
ムの混合物として存在する。従って、用語「ＦＳＨ」は、ＦＳＨを含んだ溶液または懸濁
液（例えば、ＦＳＨが、単一のアイソフォームまたはアイソフォームの混合物として存在
する）を包含する。
えであっても、一般に、培地中で溶液／懸濁液の形態をとる。糖タンパク質は、当該技術
分野において周知であるように、単一のアイソフォームとして、または複数のアイソフォ
ームの混合物として、存在し得る。用語「タンパク質」、「糖タンパク質」、「ゴナドト
ロピン」、「ＦＳＨ」、「ｈＣＧ」、「ＬＨ」等は、タンパク質、糖タンパク質、ゴナド
トロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等を含んだ溶液または懸濁液を包含する。本明細書にお
いて、用語「タンパク質」、「糖タンパク質」、「ゴナドトロピン」、「ＦＳＨ」、「ｈ
ＣＧ」、「ＬＨ」等は、タンパク質、糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、
ＬＨ等を含んだ溶液または懸濁液を包含し、ここで、タンパク質、糖タンパク質、ゴナド
トロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等は、単一のアイソフォームまたは複数のアイソフォー
ムの混合物として存在する。従って、用語「ＦＳＨ」は、ＦＳＨを含んだ溶液または懸濁
液（例えば、ＦＳＨが、単一のアイソフォームまたはアイソフォームの混合物として存在
する）を包含する。
【0012】
本明細書において、「カプリル酸およびエタノールと組み合わせてタンパク質（糖タン
パク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等）を処理する」という語句は、カプリ
ル酸およびエタノールの両方をタンパク質（糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈ
ＣＧ、ＬＨ等）に適用し、タンパク質（糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ
、ＬＨ等）がカプリル酸およびエタノールの両方に同時に曝露されるようにすることを意
味する。従って、この語句は、混合物として、または２種類の別個の試薬として、カプリ
ル酸およびエタノールをタンパク質（糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、
ＬＨ等）の溶液へ添加し、前記溶液がカプリル酸、エタノールおよびタンパク質（糖タン
パク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等）の混合物になるようにする技術を包
含し、また、カプリル酸およびエタノールの両方がタンパク質（糖タンパク質、ゴナドト
ロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等）に同時に作用する他の技術をも包含する。
パク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等）を処理する」という語句は、カプリ
ル酸およびエタノールの両方をタンパク質（糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈ
ＣＧ、ＬＨ等）に適用し、タンパク質（糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ
、ＬＨ等）がカプリル酸およびエタノールの両方に同時に曝露されるようにすることを意
味する。従って、この語句は、混合物として、または２種類の別個の試薬として、カプリ
ル酸およびエタノールをタンパク質（糖タンパク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、
ＬＨ等）の溶液へ添加し、前記溶液がカプリル酸、エタノールおよびタンパク質（糖タン
パク質、ゴナドトロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等）の混合物になるようにする技術を包
含し、また、カプリル酸およびエタノールの両方がタンパク質（糖タンパク質、ゴナドト
ロピン、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＬＨ等）に同時に作用する他の技術をも包含する。
【0013】
出願人らは、驚くべきことに、組換えタンパク質／糖タンパク質（例えば、組換えＦＳ
Ｈ、組換えｈＣＧ）を含有する溶液を、酸性ｐＨにおいて、エタノールおよびカプリル酸
、例えばカプリル酸２０ｍＭ／エタノール３０％の組み合わせにより処理すると、いつく
かのウイルスの変性（ウイルスの不活性化）ならびに／または他のウイルスおよび宿主細
胞タンパク質（不純物）の沈殿が生じ得ることを見出した。その後、（例えばガラスフィ
ルターなどのデプスフィルターを使用して、沈殿したウイルスおよび／または宿主細胞タ
ンパク質を除去するために）前記溶液を遠心分離または濾過し、後続の処理および使用の
ために上清が精製糖タンパク質（例えば、組換えＦＳＨ、組換えｈＣＧ）を含むようにし
てもよい。本出願人らは、組換え糖タンパク質（例えば、組換えＦＳＨ、組換えｈＣＧ）
を含有する溶液をエタノールおよびカプリル酸で処理することにより、（ｉ）エンベロー
プウイルスを不活性化すること、および／または（ｉｉ）沈殿によりノンエンベロープウ
イルスを排除すること（沈殿したウイルスはその後、遠心分離または例えばガラス繊維フ
ィルターによる濾過の後続工程により除去できる。）、および／または（ｉｉｉ）沈殿に
より宿主関連タンパク質を除去すること（沈殿した宿主関連タンパク質はその後、遠心分
離または例えばガラス繊維フィルターによる濾過の後続工程により除去できる。）が可能
となることを見出した。この比較的単純な処理および濾過プロセスにより、顕著な率によ
る不純物の除去（宿主関連不純物の６４％～７９％がこのプロセスにおいて除去される。
）が可能となり、産生糖タンパク質の損失は最小限となる（即ち、高収率である）。
Ｈ、組換えｈＣＧ）を含有する溶液を、酸性ｐＨにおいて、エタノールおよびカプリル酸
、例えばカプリル酸２０ｍＭ／エタノール３０％の組み合わせにより処理すると、いつく
かのウイルスの変性（ウイルスの不活性化）ならびに／または他のウイルスおよび宿主細
胞タンパク質（不純物）の沈殿が生じ得ることを見出した。その後、（例えばガラスフィ
ルターなどのデプスフィルターを使用して、沈殿したウイルスおよび／または宿主細胞タ
ンパク質を除去するために）前記溶液を遠心分離または濾過し、後続の処理および使用の
ために上清が精製糖タンパク質（例えば、組換えＦＳＨ、組換えｈＣＧ）を含むようにし
てもよい。本出願人らは、組換え糖タンパク質（例えば、組換えＦＳＨ、組換えｈＣＧ）
を含有する溶液をエタノールおよびカプリル酸で処理することにより、（ｉ）エンベロー
プウイルスを不活性化すること、および／または（ｉｉ）沈殿によりノンエンベロープウ
イルスを排除すること（沈殿したウイルスはその後、遠心分離または例えばガラス繊維フ
ィルターによる濾過の後続工程により除去できる。）、および／または（ｉｉｉ）沈殿に
より宿主関連タンパク質を除去すること（沈殿した宿主関連タンパク質はその後、遠心分
離または例えばガラス繊維フィルターによる濾過の後続工程により除去できる。）が可能
となることを見出した。この比較的単純な処理および濾過プロセスにより、顕著な率によ
る不純物の除去（宿主関連不純物の６４％～７９％がこのプロセスにおいて除去される。
）が可能となり、産生糖タンパク質の損失は最小限となる（即ち、高収率である）。
【0014】
（例えば組換えＦＳＨおよび／または組換えｈＣＧの精製／ウイルス不活性化における
）カプリル酸およびエタノールの使用には、他の利点もある。第一に、カプリル酸とエタ
ノールの組み合わせでは、単一工程が、ウイルス不活性化および沈殿、ならびに宿主細胞
タンパク質沈殿という、二重の作用を持ち得るため、精製プロセスを短縮することができ
る。第二に、前述の通り、カプリル酸はウイルス不活性化に関してｐＨ約４．９において
最も高い活性を示すが、この低ｐＨは理論的に（分子の解離等により）組換えＦＳＨ製品
を損傷させ得る。ヘンダーソン－ハッセルベルヒの式によれば、ｐＨ５．５においてＣＡ
の約２０％が帯電せず、組換えＦＳＨ損傷のリスクが低減されて、ウイルス不活性化の良
好なバランスが得られる。ＥｔＯＨ（例えば３０％のＥｔＯＨ）を添加すると、前記の条
件においてカプリル酸活性の損失が補われ、タンパク質への有害性が少なくなる。最後に
、カプリル酸／ＥｔＯＨの組み合わせでは、より低濃度のＥｔＯＨ（例えば３０％）の使
用が可能となる。より低濃度のＥｔＯＨの使用は、安全問題のため製造プロセスにおいて
極めて重要である。
）カプリル酸およびエタノールの使用には、他の利点もある。第一に、カプリル酸とエタ
ノールの組み合わせでは、単一工程が、ウイルス不活性化および沈殿、ならびに宿主細胞
タンパク質沈殿という、二重の作用を持ち得るため、精製プロセスを短縮することができ
る。第二に、前述の通り、カプリル酸はウイルス不活性化に関してｐＨ約４．９において
最も高い活性を示すが、この低ｐＨは理論的に（分子の解離等により）組換えＦＳＨ製品
を損傷させ得る。ヘンダーソン－ハッセルベルヒの式によれば、ｐＨ５．５においてＣＡ
の約２０％が帯電せず、組換えＦＳＨ損傷のリスクが低減されて、ウイルス不活性化の良
好なバランスが得られる。ＥｔＯＨ（例えば３０％のＥｔＯＨ）を添加すると、前記の条
件においてカプリル酸活性の損失が補われ、タンパク質への有害性が少なくなる。最後に
、カプリル酸／ＥｔＯＨの組み合わせでは、より低濃度のＥｔＯＨ（例えば３０％）の使
用が可能となる。より低濃度のＥｔＯＨの使用は、安全問題のため製造プロセスにおいて
極めて重要である。
【0015】
カプリル酸は、濃度１０ｍＭ～３０ｍＭ、例えば１８ｍＭ～２５ｍＭ、例えば１９ｍＭ
～２３ｍＭ、例えば２０ｍＭのカプリル酸であってもよい。ＥｔＯＨは、２０％～５０％
、例えば２５％～５０％、例えば３０％～５０％、例えば３０％のＥｔＯＨであってもよ
い。本方法は、３０％～５０％のエタノールおよび１８ｍＭ～２５ｍＭのカプリル酸、例
えば２０ｍＭのカプリル酸および３０％のエタノールで糖タンパク質を処理する工程を含
んでもよい。
～２３ｍＭ、例えば２０ｍＭのカプリル酸であってもよい。ＥｔＯＨは、２０％～５０％
、例えば２５％～５０％、例えば３０％～５０％、例えば３０％のＥｔＯＨであってもよ
い。本方法は、３０％～５０％のエタノールおよび１８ｍＭ～２５ｍＭのカプリル酸、例
えば２０ｍＭのカプリル酸および３０％のエタノールで糖タンパク質を処理する工程を含
んでもよい。
【0016】
本方法は、（例えば、ウイルス不活性化を目的として、沈殿が観察される状態で）、撹
拌しながら、２３±２℃の温度で、１分～６時間のインキュベーションの間、エタノール
およびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理することを含んでもよく、例
えば、（例えば、ウイルス不活性化を目的として、沈殿が観察される状態で）、撹拌しな
がら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキュベーションの間、エタノール
およびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理することを含んでもよい。本
方法は、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で、１分～３２時間のインキュベーションの間、
エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理すること（この工
程は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびノンエンベロープウイルスの沈殿を継続するか
可能にすることができる。）を含んでもよく、例えば、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で
、１４時間～１６時間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタ
ンパク質（糖タンパク質）を処理すること（この工程はＨＣＰおよびノンエンベロープウ
イルスの沈殿を継続するか可能にすることができる。）を含んでもよい。好ましい実施例
において、本方法は、撹拌しながら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキ
ュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処
理し、続いて温度を４℃～８℃まで低下させ、その後、撹拌せずに、１６±２時間、例え
ば１４時間～１６時間のインキュベーションを行うことを含む。
拌しながら、２３±２℃の温度で、１分～６時間のインキュベーションの間、エタノール
およびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理することを含んでもよく、例
えば、（例えば、ウイルス不活性化を目的として、沈殿が観察される状態で）、撹拌しな
がら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキュベーションの間、エタノール
およびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理することを含んでもよい。本
方法は、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で、１分～３２時間のインキュベーションの間、
エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理すること（この工
程は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびノンエンベロープウイルスの沈殿を継続するか
可能にすることができる。）を含んでもよく、例えば、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で
、１４時間～１６時間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタ
ンパク質（糖タンパク質）を処理すること（この工程はＨＣＰおよびノンエンベロープウ
イルスの沈殿を継続するか可能にすることができる。）を含んでもよい。好ましい実施例
において、本方法は、撹拌しながら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキ
ュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処
理し、続いて温度を４℃～８℃まで低下させ、その後、撹拌せずに、１６±２時間、例え
ば１４時間～１６時間のインキュベーションを行うことを含む。
【0017】
本方法は、１時間±１０分の継続時間にわたり、５．５±０．１のｐＨおよび２３±２
℃の温度で、エタノールおよびカプリル酸でタンパク質（糖タンパク質）を処理すること
を含んでもよい。
℃の温度で、エタノールおよびカプリル酸でタンパク質（糖タンパク質）を処理すること
を含んでもよい。
【0018】
本方法は、カプリル酸およびエタノールによる処理に続き、タンパク質（糖タンパク質
）（溶液）の遠心分離または濾過（例えばデプスフィルター、例えばガラス繊維フィルタ
ーを通した濾過）を行う更なる工程を含んでもよい。
）（溶液）の遠心分離または濾過（例えばデプスフィルター、例えばガラス繊維フィルタ
ーを通した濾過）を行う更なる工程を含んでもよい。
【0019】
本方法は、タンパク質（糖タンパク質）（溶液）を（タンパク質／糖タンパク質の）所
望の濃度に濃縮する更なる工程および／またはその他の（例えば後続の）精製／製剤化工
程を含んでもよい。
望の濃度に濃縮する更なる工程および／またはその他の（例えば後続の）精製／製剤化工
程を含んでもよい。
【0020】
本発明の更なる態様によれば、タンパク質［例えば糖タンパク質、例えば組換え糖タン
パク質、（例えば組換え）ゴナドトロピン、（例えば組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ
）］のウイルス不活性化方法であって、カプリル酸およびエタノールと組み合わせて、タ
ンパク質［例えば糖タンパク質、例えば組換え糖タンパク質、（例えば組換え）ゴナドト
ロピン、（例えば組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ）］を処理する工程を含む方法が提
供される。
パク質、（例えば組換え）ゴナドトロピン、（例えば組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ
）］のウイルス不活性化方法であって、カプリル酸およびエタノールと組み合わせて、タ
ンパク質［例えば糖タンパク質、例えば組換え糖タンパク質、（例えば組換え）ゴナドト
ロピン、（例えば組換え）ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ）］を処理する工程を含む方法が提
供される。
【0021】
本方法は、カプリル酸およびエタノールと組み合わせて、糖タンパク質の溶液［例えば
、水、緩衝液またはその他の培地（例えば緩衝液；１００ｍＭ酢酸アンモニウム、３０～
５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９～ｐＨ９．５）中］を処理することを含んでもよい。本方法
は、ｐＨ６．５～１２、例えばｐＨ７．５～１０、例えばｐＨ９～９．５において緩衝液
（例えば、酢酸アンモニウム緩衝液）中のタンパク質（例えば糖タンパク質）の溶液を処
理することを含んでもよい。
、水、緩衝液またはその他の培地（例えば緩衝液；１００ｍＭ酢酸アンモニウム、３０～
５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９～ｐＨ９．５）中］を処理することを含んでもよい。本方法
は、ｐＨ６．５～１２、例えばｐＨ７．５～１０、例えばｐＨ９～９．５において緩衝液
（例えば、酢酸アンモニウム緩衝液）中のタンパク質（例えば糖タンパク質）の溶液を処
理することを含んでもよい。
【0022】
カプリル酸およびエタノールと組み合わせて糖タンパク質を処理する工程は、例えばｐ
Ｈ２～ｐＨ６．５、例えばｐＨ３～ｐＨ６．５、例えばｐＨ４～ｐＨ６（例えばｐＨ５．
５±０．１）、好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ５．５の酸性ｐＨにおいて行われてもよい。
酸性状態（例えば、ｐＨ４～ｐＨ６）の使用は、カプリル酸の作用によるものである。カ
プリル酸はウイルス膜を壊すことによりエンベロープウイルスを不活性化することができ
る。このことはウイルスの疎水性膜を貫通できる非帯電形態のカプリル酸により可能とな
る。カプリル酸は、そのｐＫａ（ｐＨ４．９）に近いｐＨでは帯電しない。１単位上昇の
ΔｐＨ（ｐＨ約５．９）では、カプリル酸分子の１００％が負に帯電し、従ってウイルス
不活性化の効率が低下する。
Ｈ２～ｐＨ６．５、例えばｐＨ３～ｐＨ６．５、例えばｐＨ４～ｐＨ６（例えばｐＨ５．
５±０．１）、好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ５．５の酸性ｐＨにおいて行われてもよい。
酸性状態（例えば、ｐＨ４～ｐＨ６）の使用は、カプリル酸の作用によるものである。カ
プリル酸はウイルス膜を壊すことによりエンベロープウイルスを不活性化することができ
る。このことはウイルスの疎水性膜を貫通できる非帯電形態のカプリル酸により可能とな
る。カプリル酸は、そのｐＫａ（ｐＨ４．９）に近いｐＨでは帯電しない。１単位上昇の
ΔｐＨ（ｐＨ約５．９）では、カプリル酸分子の１００％が負に帯電し、従ってウイルス
不活性化の効率が低下する。
【0023】
カプリル酸は、濃度１０ｍＭ～３０ｍＭ、例えば１８ｍＭ～２５ｍＭ、例えば１９ｍＭ
～２３ｍＭ、例えば２０ｍＭのカプリル酸であってもよい。ＥｔＯＨは、２０％～５０％
、例えば２５％～５０％、例えば３０％～５０％、例えば３０％のＥｔＯＨであってもよ
い。本方法は、３０％～５０％のエタノールおよび１８ｍＭ～２５ｍＭのカプリル酸、例
えば２０ｍＭのカプリル酸および３０％のエタノールで糖タンパク質を処理する工程を含
んでもよい。
～２３ｍＭ、例えば２０ｍＭのカプリル酸であってもよい。ＥｔＯＨは、２０％～５０％
、例えば２５％～５０％、例えば３０％～５０％、例えば３０％のＥｔＯＨであってもよ
い。本方法は、３０％～５０％のエタノールおよび１８ｍＭ～２５ｍＭのカプリル酸、例
えば２０ｍＭのカプリル酸および３０％のエタノールで糖タンパク質を処理する工程を含
んでもよい。
【0024】
本方法は、撹拌しながら、２３±２℃の温度で、１分～６時間のインキュベーションの
間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理することを含
んでもよく、例えば、撹拌しながら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキ
ュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処
理することを含んでもよい。本方法は、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で、１分～３２時
間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパ
ク質）を処理することを含んでもよく、例えば、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で、１４
時間～１６時間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク
質（糖タンパク質）を処理することを含んでもよい。好ましい実施例において、本方法は
、撹拌しながら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキュベーションの間、
エタノールおよびカプリル酸により糖タンパク質を処理し、続いて温度を４℃～８℃まで
低下させ、その後、撹拌せずに、１４時間～１６時間インキュベーションを行うことを含
む。
間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理することを含
んでもよく、例えば、撹拌しながら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキ
ュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処
理することを含んでもよい。本方法は、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で、１分～３２時
間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパ
ク質）を処理することを含んでもよく、例えば、撹拌せずに、４℃～８℃の温度で、１４
時間～１６時間のインキュベーションの間、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク
質（糖タンパク質）を処理することを含んでもよい。好ましい実施例において、本方法は
、撹拌しながら、２３±２℃の温度で、０．５時間～１時間のインキュベーションの間、
エタノールおよびカプリル酸により糖タンパク質を処理し、続いて温度を４℃～８℃まで
低下させ、その後、撹拌せずに、１４時間～１６時間インキュベーションを行うことを含
む。
【0025】
本方法は、１時間±１０分の継続時間にわたり、５．５±０．１のｐＨおよび２３±２
℃の温度で、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理する
ことを含んでもよい。
℃の温度で、エタノールおよびカプリル酸によりタンパク質（糖タンパク質）を処理する
ことを含んでもよい。
【0026】
本方法は、カプリル酸およびエタノールによる処理に続き、タンパク質（糖タンパク質
）（溶液）の遠心分離または濾過（例えばガラス繊維フィルターを通した濾過）を行う更
なる工程を含んでもよい。
）（溶液）の遠心分離または濾過（例えばガラス繊維フィルターを通した濾過）を行う更
なる工程を含んでもよい。
【0027】
本方法は、タンパク質（糖タンパク質）（溶液）を（タンパク質／糖タンパク質の）所
望の濃度に濃縮する更なる工程および／またはその他の（例えば後続の）精製／製剤化工
程を含んでもよい。
望の濃度に濃縮する更なる工程および／またはその他の（例えば後続の）精製／製剤化工
程を含んでもよい。
【0028】
タンパク質は、組換えタンパク質であっても尿由来タンパク質であってもよい。タンパ
ク質は、糖タンパク質であってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、ゴナドトロピン、
例えば、ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、組換
え糖タンパク質、例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ
であってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、好適な培地に細胞（細胞系）を培養して
前記細胞（細胞系）および／または前記培地から組換え糖タンパク質を採取する（例えば
、細胞培養上清から組換えタンパク質を採取する）ことを含む方法により、細胞（細胞系
）内で産生された、組換え糖タンパク質（例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦ
ＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ）であることが好ましい。細胞（細胞系）は、哺乳類細胞（細胞
系）、例えば、ＣＨＯ細胞（系）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）、ＨＥＫ２９３
細胞（系）、ＨＴ１０８０細胞（系）、ＣＯＳ細胞（系）、ＮＯＳ細胞（系）、ＳＰ２０
細胞（系）等であってもよい。細胞（細胞系）はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）で
あることが好ましい。
ク質は、糖タンパク質であってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、ゴナドトロピン、
例えば、ＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、組換
え糖タンパク質、例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ
であってもよい。タンパク質／糖タンパク質は、好適な培地に細胞（細胞系）を培養して
前記細胞（細胞系）および／または前記培地から組換え糖タンパク質を採取する（例えば
、細胞培養上清から組換えタンパク質を採取する）ことを含む方法により、細胞（細胞系
）内で産生された、組換え糖タンパク質（例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦ
ＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨ）であることが好ましい。細胞（細胞系）は、哺乳類細胞（細胞
系）、例えば、ＣＨＯ細胞（系）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）、ＨＥＫ２９３
細胞（系）、ＨＴ１０８０細胞（系）、ＣＯＳ細胞（系）、ＮＯＳ細胞（系）、ＳＰ２０
細胞（系）等であってもよい。細胞（細胞系）はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）で
あることが好ましい。
【0029】
本発明の更なる態様によれば、上記の方法により精製またはウイスル不活性化されたタ
ンパク質が提供される。タンパク質は、組換えタンパク質であっても尿由来タンパク質で
あってもよい。タンパク質は、糖タンパク質であってもよい。糖タンパク質は、組換え糖
タンパク質、例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであ
ってもよい。糖タンパク質は、好適な培地中で細胞（細胞系）を培養して前記細胞（細胞
系）および／または前記培地から組換え糖タンパク質を採取する（例えば、細胞培養上清
から組換えタンパク質を採取する）ことを含む方法により、細胞（細胞系）内で産生され
た、組換え糖タンパク質（例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧま
たはＬＨ）であることが好ましい。細胞（細胞系）は、哺乳類細胞（細胞系）、例えば、
ＣＨＯ細胞（系）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）、ＨＥＫ２９３細胞（系）、Ｈ
Ｔ１０８０細胞（系）、ＣＯＳ細胞（系）、ＮＯＳ細胞（系）、ＳＰ２０細胞（系）等で
あってもよい。細胞（細胞系）はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）であることが好ま
しい。
ンパク質が提供される。タンパク質は、組換えタンパク質であっても尿由来タンパク質で
あってもよい。タンパク質は、糖タンパク質であってもよい。糖タンパク質は、組換え糖
タンパク質、例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧまたはＬＨであ
ってもよい。糖タンパク質は、好適な培地中で細胞（細胞系）を培養して前記細胞（細胞
系）および／または前記培地から組換え糖タンパク質を採取する（例えば、細胞培養上清
から組換えタンパク質を採取する）ことを含む方法により、細胞（細胞系）内で産生され
た、組換え糖タンパク質（例えば組換えゴナドトロピン、例えば組換えＦＳＨ、ｈＣＧま
たはＬＨ）であることが好ましい。細胞（細胞系）は、哺乳類細胞（細胞系）、例えば、
ＣＨＯ細胞（系）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）、ＨＥＫ２９３細胞（系）、Ｈ
Ｔ１０８０細胞（系）、ＣＯＳ細胞（系）、ＮＯＳ細胞（系）、ＳＰ２０細胞（系）等で
あってもよい。細胞（細胞系）はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（系）であることが好ま
しい。
【0030】
本発明の更なる態様によれば、上記の方法により精製および／またはウイスル不活性化
がなされたタンパク質（例えば糖タンパク質、例えば組換え糖タンパク質、例えば組換え
ＦＳＨ、組換えｈＣＧ）を含む［例えば、不妊症処置（での使用）のための］医薬組成物
が提供される。
がなされたタンパク質（例えば糖タンパク質、例えば組換え糖タンパク質、例えば組換え
ＦＳＨ、組換えｈＣＧ）を含む［例えば、不妊症処置（での使用）のための］医薬組成物
が提供される。
【0031】
本発明の更なる態様によれば、上記の方法により精製および／またはウイスル不活性化
がなされたタンパク質（例えば糖タンパク質、例えば組換え糖タンパク質、例えば組換え
ＦＳＨ、組換えｈＣＧ）を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含
む、（例えば不妊症の）処置方法が提供される。
がなされたタンパク質（例えば糖タンパク質、例えば組換え糖タンパク質、例えば組換え
ＦＳＨ、組換えｈＣＧ）を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含
む、（例えば不妊症の）処置方法が提供される。
【0032】
不妊症の処置は、生殖補助医療（ＡＲＴ）、排卵誘発または子宮内授精（ＩＵＩ）を含
んでもよい。本医薬組成物は、例えば、公知のＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ製剤が使用される医
療適用に使用してもよい。
んでもよい。本医薬組成物は、例えば、公知のＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ製剤が使用される医
療適用に使用してもよい。
【0033】
本製品または組成物は、任意の薬物投与経路、例えば経口投与、直腸投与、非経口投与
、経皮投与（例えば、パッチ技術）、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、大槽内投与、
膣内投与、腹腔内投与、局部投与（散薬、軟膏もしくは点滴薬）のために、またはバッカ
ルもしくは鼻内スプレーとして、周知の組成物へと製剤化され得る。典型的な組成物は、
特に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｆ
ｉｆｔｅｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ
、１９７５）、１４０５～１４１２ページおよび１４６１～８７ページ、ならびにｎａｔ
ｉｏｎａｌ ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＸＩＶ ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９７５）
に記載されている、水溶液、塩および保存剤を含む非毒性賦形剤ならびに緩衝剤等の薬学
的に許容される担体を含む。
、経皮投与（例えば、パッチ技術）、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、大槽内投与、
膣内投与、腹腔内投与、局部投与（散薬、軟膏もしくは点滴薬）のために、またはバッカ
ルもしくは鼻内スプレーとして、周知の組成物へと製剤化され得る。典型的な組成物は、
特に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｆ
ｉｆｔｅｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ
、１９７５）、１４０５～１４１２ページおよび１４６１～８７ページ、ならびにｎａｔ
ｉｏｎａｌ ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＸＩＶ ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９７５）
に記載されている、水溶液、塩および保存剤を含む非毒性賦形剤ならびに緩衝剤等の薬学
的に許容される担体を含む。
【0034】
好適な水性および非水性の医薬用担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水
、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール等）、カルボキシメチルセルロースおよびその好適な混合物、植物油（例えば
オリーブ油）、ならびに注射用有機エステル（例えばエチルオレエート）が挙げられる。
本発明の組成物は、限定されないが保存剤、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤および分散剤な
どの添加剤をも含有し得る。微生物の増殖を予防するために抗菌剤および抗真菌剤が含ま
れていてもよく、抗菌剤および抗真菌剤としては、例えばｍ－クレゾール、ベンジルアル
コール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等が挙げられる。保存剤
が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールが好ま
しい。ただし、保存剤はこれらの例に限定されるわけではない。更に、糖、塩化ナトリウ
ム等の等張化剤を含むことが望ましい場合がある。本製品または組成物は、Ｎａ+－もし
くはＫ+－塩またはそれらの組み合わせからなる群から選択された薬学的に許容されるア
ルカリ金属カチオンを含む塩を更に含んでもよい。塩は、Ｎａ+－塩、例えばＮａＣｌま
たはＮａ2ＳＯ4であることが好ましい。
、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコール等）、カルボキシメチルセルロースおよびその好適な混合物、植物油（例えば
オリーブ油）、ならびに注射用有機エステル（例えばエチルオレエート）が挙げられる。
本発明の組成物は、限定されないが保存剤、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤および分散剤な
どの添加剤をも含有し得る。微生物の増殖を予防するために抗菌剤および抗真菌剤が含ま
れていてもよく、抗菌剤および抗真菌剤としては、例えばｍ－クレゾール、ベンジルアル
コール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等が挙げられる。保存剤
が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールが好ま
しい。ただし、保存剤はこれらの例に限定されるわけではない。更に、糖、塩化ナトリウ
ム等の等張化剤を含むことが望ましい場合がある。本製品または組成物は、Ｎａ+－もし
くはＫ+－塩またはそれらの組み合わせからなる群から選択された薬学的に許容されるア
ルカリ金属カチオンを含む塩を更に含んでもよい。塩は、Ｎａ+－塩、例えばＮａＣｌま
たはＮａ2ＳＯ4であることが好ましい。
【0035】
本製品または組成物は、糖タンパク質、ならびにポリソルベート２０、Ｌ－メチオニン
、フェノール、硫酸二ナトリウムおよびリン酸ナトリウム緩衝液、スクロースならびにク
エン酸緩衝液のうち１種以上を含むことが好ましい。
、フェノール、硫酸二ナトリウムおよびリン酸ナトリウム緩衝液、スクロースならびにク
エン酸緩衝液のうち１種以上を含むことが好ましい。
【0036】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターで濾過することにより、または使用直前に滅
菌水または他の滅菌注射液に溶解または分散させることができる滅菌固形組成物の形態の
滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。注射製剤は、任意の好適な容器、
例えばバイアル、充填済シリンジ、注射カートリッジ等で供給することができる。
菌水または他の滅菌注射液に溶解または分散させることができる滅菌固形組成物の形態の
滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。注射製剤は、任意の好適な容器、
例えばバイアル、充填済シリンジ、注射カートリッジ等で供給することができる。
【0037】
本組成物は、単回使用または多回使用（多回用量）のために製剤化してもよい。本製品
または組成物が多回使用のために製剤化される場合、保存剤が含まれることが好ましい。
保存剤が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ－クレゾール
が好ましい。ただし、保存剤はこれらの例に限定されるわけではない。単回使用または多
回使用のために製剤化された製品または組成物は、Ｎａ+－もしくはＫ+－塩またはそれら
の組み合わせからなる群から選択された薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む
塩を更に含んでもよい。塩は、Ｎａ+－塩、例えばＮａＣｌまたはＮａ2ＳＯ4であること
が好ましい。
または組成物が多回使用のために製剤化される場合、保存剤が含まれることが好ましい。
保存剤が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ－クレゾール
が好ましい。ただし、保存剤はこれらの例に限定されるわけではない。単回使用または多
回使用のために製剤化された製品または組成物は、Ｎａ+－もしくはＫ+－塩またはそれら
の組み合わせからなる群から選択された薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む
塩を更に含んでもよい。塩は、Ｎａ+－塩、例えばＮａＣｌまたはＮａ2ＳＯ4であること
が好ましい。
【0038】
本製品または組成物は、バイアルなどの容器、充填済みカートリッジ（例えば、単回投
与もしくは多回使用を目的としたもの）、または例えば多回用量の投与のための「ペン」
などの注射装置内に含まれてもよい。
与もしくは多回使用を目的としたもの）、または例えば多回用量の投与のための「ペン」
などの注射装置内に含まれてもよい。
【0039】
バイアルは、ブリスターパッケージまたは滅菌状態を維持するためのその他の手段によ
る包装がなされてもよい。いずれの製品も、ＦＳＨ（および存在する場合、例えばｈＣＧ
）製剤の使用に関する取扱説明書が任意に添付されることがある。医薬組成物の種々の成
分のｐＨおよび正確な濃度は、当分野における通常の業務に従って調整される。ＧＯＯＤ
ＭＡＮ ａｎｄ ＧＩＬＭＡＮ’ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳ
ＩＳ ＦＯＲ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＥＳ，７ｔｈ ｅｄを参照されたい。好ましい実
施形態では、本発明の組成物は、非経口投与用組成物として供給される。非経口製剤を調
製するための一般的方法は、当技術分野で公知であり、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ；ＴＨＥ Ｓ
ＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ、上記、７８０～８
２０ページに記載されている。非経口組成物は、液体製剤に含有された状態で、または投
与直前に滅菌注射液と混合される固形物として、供給され得る。特に好ましい実施形態で
は、非経口組成物は、投与の容易性および投薬量の均一性のために単位剤形で供給される
。
る包装がなされてもよい。いずれの製品も、ＦＳＨ（および存在する場合、例えばｈＣＧ
）製剤の使用に関する取扱説明書が任意に添付されることがある。医薬組成物の種々の成
分のｐＨおよび正確な濃度は、当分野における通常の業務に従って調整される。ＧＯＯＤ
ＭＡＮ ａｎｄ ＧＩＬＭＡＮ’ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳ
ＩＳ ＦＯＲ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＥＳ，７ｔｈ ｅｄを参照されたい。好ましい実
施形態では、本発明の組成物は、非経口投与用組成物として供給される。非経口製剤を調
製するための一般的方法は、当技術分野で公知であり、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ；ＴＨＥ Ｓ
ＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ、上記、７８０～８
２０ページに記載されている。非経口組成物は、液体製剤に含有された状態で、または投
与直前に滅菌注射液と混合される固形物として、供給され得る。特に好ましい実施形態で
は、非経口組成物は、投与の容易性および投薬量の均一性のために単位剤形で供給される
。
【0040】
添付図面を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】本発明の実施形態による組換えＦＳＨ精製（ウイルス不活化）プロセスの概要を示す図である。
【図2】１２％還元ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけた種々の処理済みＵＦ２－ＡＤ（透析後の限外濾過）ＦＳＨ試料に関する不純物除去の定性的評価後のゲルパターンを示し、ここで、レーン１はＬＭＷ（低分子量）マーカー、レーン２は試料緩衝液であり、レーン３はＵＦ２－ＡＤ、レーン４はＵＦ２－ＡＤ＋１０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．５、レーン５はＵＦ２－ＡＤ＋１０ｍＭのＣＡ、３０％のエタノール，ｐＨ５．５、レーン６は試料緩衝液、レーン７は低範囲ＭＷ、レーン８はＵＦ２－ＡＤ、レーン９はＵＦ２－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．５、レーン１０はＵＦ２－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ、３０％のエタノール，ｐＨ５．５である（実施例３を参照のこと）。
【図3】１２％還元ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけた種々の処理済みｈＣＧ試料に関する、不純物除去の定性的評価後のゲルパターンを示し、ここで、レーン１はＬＭＷ（低分子量）マーカー、レーン２はＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤを含有するｈＣＧ、レーン３はＮＲ（無関係）、レーン４は［Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋１５ｍＭのＣ．Ａ，ｐＨ５．０］の上清、レーン５は［Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋２０ｍＭのＣ．Ａ＋１０％のエタノール，ｐＨ５．０］の上清である（実施例４を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【0042】
［実施例１］
図１は組換えＦＳＨ精製全プロセスの概要を示している。図１からわかるように、組換
えＦＳＨは、バイオリアクターを使用して、ＷＯ２０１３／０２０９９６およびＷＯ２０
０９／１２７８２６Ａに開示された方法により操作されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞
系内で発現される。
図１は組換えＦＳＨ精製全プロセスの概要を示している。図１からわかるように、組換
えＦＳＨは、バイオリアクターを使用して、ＷＯ２０１３／０２０９９６およびＷＯ２０
０９／１２７８２６Ａに開示された方法により操作されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞
系内で発現される。
【0043】
バイオリアクターにおいて播種を行い、当業者に公知の方法により細胞増殖を促進し、
更に、バイオリアクターを潅流モードで運転し、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製Ｈｏｌｌｏｆｉｂｒ
ｅ（ＡＴＦ４）システムを使用して、連続的に組換えＦＳＨを産生し連続的に採取する。
６ＧＲＯ培地において、少なくとも１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総容積４±１リットル
で播種を行う。ＰｒｏＰｅｒ－１培地中で産生が行われ、バイオリアクター採取物はポリ
エチレン袋に収集される。従って、本実施例において、タンパク質（糖タンパク質）は、
好適な培地（ＰｒｏＰｅｒ－１培地）中で細胞系を培養して（細胞培養上清から組換えタ
ンパク質を採取することで）培地から組換え糖タンパク質を採取することを含む方法によ
り、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系内で産生された、組換え糖タンパク質（組換えＦＳ
Ｈ）である。
更に、バイオリアクターを潅流モードで運転し、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製Ｈｏｌｌｏｆｉｂｒ
ｅ（ＡＴＦ４）システムを使用して、連続的に組換えＦＳＨを産生し連続的に採取する。
６ＧＲＯ培地において、少なくとも１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総容積４±１リットル
で播種を行う。ＰｒｏＰｅｒ－１培地中で産生が行われ、バイオリアクター採取物はポリ
エチレン袋に収集される。従って、本実施例において、タンパク質（糖タンパク質）は、
好適な培地（ＰｒｏＰｅｒ－１培地）中で細胞系を培養して（細胞培養上清から組換えタ
ンパク質を採取することで）培地から組換え糖タンパク質を採取することを含む方法によ
り、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系内で産生された、組換え糖タンパク質（組換えＦＳ
Ｈ）である。
【0044】
バイオリアクター採取物をプールして１０ｋＤａ限外濾過／透析濾過工程（ＵＦ１）に
供し、前記工程において、採取物の濃度を低下させ、Ｃａｐｔｏ－Ｑクロマトグラフィー
用に採取物をコンディショニング（ｐＨおよび導電率の点で）し、培養培地の色素および
低分子量成分を除去する。０．８＋０．６５μｍのガラス繊維フィルターを通して濃縮水
を濾過して、プロセス溶液を清澄化し（図１を参照）、その後、バイオバーデンコントロ
ールとして０．２μｍ濾過に供する。次に、当該技術分野において周知の方法により、Ｃ
ａｐｔｏ－Ｑアニオン交換クロマトグラフィーを用いて、組換えＦＳＨを捕捉し、ＤＮＡ
、内毒素、宿主細胞タンパク質およびプロセス関連不純物を除去する。バイオバーデンコ
ントロールとして０．２μｍ濾過を更に行う。
供し、前記工程において、採取物の濃度を低下させ、Ｃａｐｔｏ－Ｑクロマトグラフィー
用に採取物をコンディショニング（ｐＨおよび導電率の点で）し、培養培地の色素および
低分子量成分を除去する。０．８＋０．６５μｍのガラス繊維フィルターを通して濃縮水
を濾過して、プロセス溶液を清澄化し（図１を参照）、その後、バイオバーデンコントロ
ールとして０．２μｍ濾過に供する。次に、当該技術分野において周知の方法により、Ｃ
ａｐｔｏ－Ｑアニオン交換クロマトグラフィーを用いて、組換えＦＳＨを捕捉し、ＤＮＡ
、内毒素、宿主細胞タンパク質およびプロセス関連不純物を除去する。バイオバーデンコ
ントロールとして０．２μｍ濾過を更に行う。
【0045】
精製／ウイルス不活性化の前に、濾過したＣａｐｔｏ－Ｑ溶出液を、当該技術分野にお
いて周知の方法により、脱塩および減容のために更なる１０ｋＤａ限外濾過／透析濾過（
ＵＦ２）に供する。
いて周知の方法により、脱塩および減容のために更なる１０ｋＤａ限外濾過／透析濾過（
ＵＦ２）に供する。
【0046】
ＣＡ／ＥｔＯＨ工程
ＵＦ２の濃縮水は、緩衝液（１００ｍＭの酢酸アンモニウム、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ９．３～ｐＨ９．７）中の組換えＦＳＨの溶液である。まず、撹拌しながら２３±２℃
でタンパク質溶液のｐＨをｐＨ９．３～ｐＨ９．７からｐＨ６．３±０．３に低下させ、
次に、２０ｍＭのカプリル酸／３０％のエタノールの組み合わせ（ＣＡ／ＥｔＯＨ）によ
り処理し、続いて、ｐＨを４．５～５．６に更に調整する（ｐＨは１ＭのＨＣｌにより調
整する）。この処理の後、タンパク質溶液を撹拌したまま２３±２℃で０．５時間～１時
間インキュベートする（この時間中に、ウイルス不活性化が生じ、白色の薄片様の沈殿が
観察される）。０．５時間～１時間の最後に、タンパク質溶液の温度は４℃～８℃に低下
し、撹拌せずに、更に１４時間～１８時間、例えば１４～１６時間、溶液をインキュベー
トする（これによりＨＣＰおよびノンエンベロープウイルスの沈殿が継続する）。ＣＡ／
ＥＴＯＨ処理工程は、（ｉ）エンベロープウイルスの不活性化；（ｉｉ）沈殿およびそれ
に続く沈殿除去のための清澄化工程によるノンエンベロープウイルスの排除；ならびに（
ｉｉｉ）沈殿による宿主関連タンパク質の除去という、３つの作用を有する。
ＵＦ２の濃縮水は、緩衝液（１００ｍＭの酢酸アンモニウム、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ９．３～ｐＨ９．７）中の組換えＦＳＨの溶液である。まず、撹拌しながら２３±２℃
でタンパク質溶液のｐＨをｐＨ９．３～ｐＨ９．７からｐＨ６．３±０．３に低下させ、
次に、２０ｍＭのカプリル酸／３０％のエタノールの組み合わせ（ＣＡ／ＥｔＯＨ）によ
り処理し、続いて、ｐＨを４．５～５．６に更に調整する（ｐＨは１ＭのＨＣｌにより調
整する）。この処理の後、タンパク質溶液を撹拌したまま２３±２℃で０．５時間～１時
間インキュベートする（この時間中に、ウイルス不活性化が生じ、白色の薄片様の沈殿が
観察される）。０．５時間～１時間の最後に、タンパク質溶液の温度は４℃～８℃に低下
し、撹拌せずに、更に１４時間～１８時間、例えば１４～１６時間、溶液をインキュベー
トする（これによりＨＣＰおよびノンエンベロープウイルスの沈殿が継続する）。ＣＡ／
ＥＴＯＨ処理工程は、（ｉ）エンベロープウイルスの不活性化；（ｉｉ）沈殿およびそれ
に続く沈殿除去のための清澄化工程によるノンエンベロープウイルスの排除；ならびに（
ｉｉｉ）沈殿による宿主関連タンパク質の除去という、３つの作用を有する。
【0047】
沈殿した不純物（ノンエンベロープウイルスおよび宿主関連タンパク質）は、０．８＋
０．６５μｍのガラス繊維フィルターを通した濾過の工程であって、組換えＦＳＨ溶液も
清澄化する濾過工程により除去される。
０．６５μｍのガラス繊維フィルターを通した濾過の工程であって、組換えＦＳＨ溶液も
清澄化する濾過工程により除去される。
【0048】
バイオバーデンコントロールとして０．２μｍ濾過を更に行う。
【0049】
次いで、当該技術分野において周知の方法により、溶液をＳｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ－Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－ＦＦ）に供し、カプリル酸、
エタノール、更に宿主細胞タンパク質を除去する。バイオバーデンコントロールとして０
．２μｍ濾過を更に行い、続いて、Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー（ＰＳ－ＦＦ）を用いた精製の追加工程を行い、遊離組換えＦＳＨサブ
ユニットおよび宿主細胞タンパク質を除去する。
ｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－ＦＦ）に供し、カプリル酸、
エタノール、更に宿主細胞タンパク質を除去する。バイオバーデンコントロールとして０
．２μｍ濾過を更に行い、続いて、Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー（ＰＳ－ＦＦ）を用いた精製の追加工程を行い、遊離組換えＦＳＨサブ
ユニットおよび宿主細胞タンパク質を除去する。
【0050】
ＰＳ溶出液を３回目の１０ｋＤａ限外濾過／透析濾過工程（ＵＦ３）に供して、塩を除
去し、次の工程のために溶液をコンディショニングする。バイオバーデンコントロールと
して０．２μｍ濾過を更に行った後、解離したＦＳＨサブユニットおよび塩基性ヘテロ二
量体を除去することを目的として、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー（Ｈｙ
Ａ）を行い、続いてバイオバーデンコントロールとして０．２μｍ濾過を更に行う。
去し、次の工程のために溶液をコンディショニングする。バイオバーデンコントロールと
して０．２μｍ濾過を更に行った後、解離したＦＳＨサブユニットおよび塩基性ヘテロ二
量体を除去することを目的として、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー（Ｈｙ
Ａ）を行い、続いてバイオバーデンコントロールとして０．２μｍ濾過を更に行う。
【0051】
結合／溶出モードで、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィー（ＱＳ
－ＦＦ）「ポリッシング工程」を行い、宿主タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシンおよび
潜在的ウイルスを除去する。次に、ＱＳ ＭＰのプールおよびナノ濾過の前に、更なるバ
イオバーデンコントロールとして０．２μｍ濾過を行い、潜在的ウイルスを除去する。上
清を４回目の１０ｋＤａ限外濾過／透析濾過工程（ＵＦ４）に供して、組換えＦＳＨを０
．５～１．１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、続いて、０．００５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまで
ポリソルベート２０を添加した。以上は当該技術分野において周知の透析および緩衝液調
整工程である。組換えＦＳＨを最終の０．２μｍ濾過工程に供し、等しく小分けして一次
包装を行い、出荷まで－２０℃で保管する。
－ＦＦ）「ポリッシング工程」を行い、宿主タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシンおよび
潜在的ウイルスを除去する。次に、ＱＳ ＭＰのプールおよびナノ濾過の前に、更なるバ
イオバーデンコントロールとして０．２μｍ濾過を行い、潜在的ウイルスを除去する。上
清を４回目の１０ｋＤａ限外濾過／透析濾過工程（ＵＦ４）に供して、組換えＦＳＨを０
．５～１．１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、続いて、０．００５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまで
ポリソルベート２０を添加した。以上は当該技術分野において周知の透析および緩衝液調
整工程である。組換えＦＳＨを最終の０．２μｍ濾過工程に供し、等しく小分けして一次
包装を行い、出荷まで－２０℃で保管する。
【0052】
本出願人らは、カプリル酸／エタノールによる処理は宿主関連不純物を著しく低減させ
得ることを見出した。種々の製造運転（データ掲載せず）によれば、上記のＣＡ／ＥｔＯ
Ｈ工程（および後続のガラス繊維濾過）により、宿主関連不純物の６４～７９％が除去さ
れる一方で、ＦＳＨの約９０～９５％という高収率での回収がなされた。このことは単純
なプロセスにより実現される宿主関連不純物の著しい低減であり、産生タンパク質（産生
糖タンパク質）の損失は最小限となる。
得ることを見出した。種々の製造運転（データ掲載せず）によれば、上記のＣＡ／ＥｔＯ
Ｈ工程（および後続のガラス繊維濾過）により、宿主関連不純物の６４～７９％が除去さ
れる一方で、ＦＳＨの約９０～９５％という高収率での回収がなされた。このことは単純
なプロセスにより実現される宿主関連不純物の著しい低減であり、産生タンパク質（産生
糖タンパク質）の損失は最小限となる。
【0053】
本工程の顕著なウイルス排除効率を表１に要約する。表１は、≧４．２５～≧５．４１
の範囲である、対数減少値〔log10 reduction factor〕の要約を示す。対数減少値（ＬＲ
Ｆ）≧４ Ｌｏｇ10（例えば最大８ Ｌｏｇ10以上）は一般に、高く、強力であり、効果
的であると考えられる。
の範囲である、対数減少値〔log10 reduction factor〕の要約を示す。対数減少値（ＬＲ
Ｆ）≧４ Ｌｏｇ10（例えば最大８ Ｌｏｇ10以上）は一般に、高く、強力であり、効果
的であると考えられる。
【0054】
【表1】
【0055】
上記の実施例はｒＦＳＨに関するものであるが、当業者であれば、上記のプロセス［例
えばＣＡ／ＥｔＯＨ工程（および後続のガラス繊維濾過）］は、他のタンパク質（例えば
糖タンパク質）、例えばｒｈＣＧ［例えば、ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８５４（ＷＯ
２０１１／０４２６８８として公開）の方法によりＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系内で
産生されるｒｈＣＧ］の精製／ウイルス不活性化に容易に適用可能であることを理解する
だろう。
えばＣＡ／ＥｔＯＨ工程（および後続のガラス繊維濾過）］は、他のタンパク質（例えば
糖タンパク質）、例えばｒｈＣＧ［例えば、ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８５４（ＷＯ
２０１１／０４２６８８として公開）の方法によりＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系内で
産生されるｒｈＣＧ］の精製／ウイルス不活性化に容易に適用可能であることを理解する
だろう。
【0056】
［実施例２］
本発明の方法の別の実施例において、ｈＣＧ精製／ウイルス不活性化プロセスが提供さ
れる。ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８５４（ＷＯ２０１１／０４２６８８として公開）
に記載の方法によりＰＥＲ．Ｃ６細胞系内で産生されたｒｈＣＧの精製／ウイルス不活性
化のために、上記の実施例１と同様の方法（Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅカチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－ＦＦ）工程を除く）を用いた。本出願人らは
、酸性ｐＨにおけるカプリル酸およびエタノールによる化学的不活性化、即ち、実施例１
に記載されたＣＡ／ＥｔＯＨ工程を用いた化学的不活性化では、（沈殿により）非ｈＣＧ
不純物の約６５％が除去された一方、ｈＣＧの約９０％という高収率での回収がなされた
ことを見出した。
本発明の方法の別の実施例において、ｈＣＧ精製／ウイルス不活性化プロセスが提供さ
れる。ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８５４（ＷＯ２０１１／０４２６８８として公開）
に記載の方法によりＰＥＲ．Ｃ６細胞系内で産生されたｒｈＣＧの精製／ウイルス不活性
化のために、上記の実施例１と同様の方法（Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅカチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－ＦＦ）工程を除く）を用いた。本出願人らは
、酸性ｐＨにおけるカプリル酸およびエタノールによる化学的不活性化、即ち、実施例１
に記載されたＣＡ／ＥｔＯＨ工程を用いた化学的不活性化では、（沈殿により）非ｈＣＧ
不純物の約６５％が除去された一方、ｈＣＧの約９０％という高収率での回収がなされた
ことを見出した。
【0057】
本実施例におけるＣＡ／ＥｔＯＨ工程の非常に高いウイルス排除効率を表２に要約する
。≧５．３１～≧５．４８の範囲において得られた高いＬＲＦによって決定された通り、
ＭｕＬＶのウイルス不活性化は効果的だった。ＣＡ／ＥｔＯＨ処理および沈殿除去につい
て、≧２．０３～≧２．７４のＬＲＦを得た。
。≧５．３１～≧５．４８の範囲において得られた高いＬＲＦによって決定された通り、
ＭｕＬＶのウイルス不活性化は効果的だった。ＣＡ／ＥｔＯＨ処理および沈殿除去につい
て、≧２．０３～≧２．７４のＬＲＦを得た。
【0058】
【表2】
【0059】
［実施例３］
ｒＦＳＨ含有溶液の不純物除去のための沈殿条件の評価
実験内容：
実施例１のｒＦＳＨ精製プロセス（ＣＡ／ＥｔＯＨ工程まで）を用いて得たＵＦ２－Ａ
Ｄ（透析後の限外濾過）中間生成物は、１００ｍＭの酢酸アンモニウム＋３０ｍＭのＮａ
Ｃｌ（ｐＨ９．５０±０．２０、１１．００±０．５０ｍＳ／ｃｍ）を含有していた。こ
の中間生成物を等しく小分けし、各分量を不純物除去をする異なる沈殿条件に供した（ｒ
ＦＳＨは溶液に溶解する）。試験した沈殿条件は以下の通りである。
１．処理なしＵＦ２－ＡＤ（対照）
２．ＵＦ２－ＡＤ＋１０ｍＭのカプリル酸（ＣＡ），ｐＨ５．５
３．ＵＦ２－ＡＤ＋１０ｍＭのＣＡ、３０％のエタノール，ｐＨ５．５
４．ＵＦ２－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．５
５．ＵＦ２－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ、３０％のエタノール，ｐＨ５．５
ｒＦＳＨ含有溶液の不純物除去のための沈殿条件の評価
実験内容：
実施例１のｒＦＳＨ精製プロセス（ＣＡ／ＥｔＯＨ工程まで）を用いて得たＵＦ２－Ａ
Ｄ（透析後の限外濾過）中間生成物は、１００ｍＭの酢酸アンモニウム＋３０ｍＭのＮａ
Ｃｌ（ｐＨ９．５０±０．２０、１１．００±０．５０ｍＳ／ｃｍ）を含有していた。こ
の中間生成物を等しく小分けし、各分量を不純物除去をする異なる沈殿条件に供した（ｒ
ＦＳＨは溶液に溶解する）。試験した沈殿条件は以下の通りである。
１．処理なしＵＦ２－ＡＤ（対照）
２．ＵＦ２－ＡＤ＋１０ｍＭのカプリル酸（ＣＡ），ｐＨ５．５
３．ＵＦ２－ＡＤ＋１０ｍＭのＣＡ、３０％のエタノール，ｐＨ５．５
４．ＵＦ２－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．５
５．ＵＦ２－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ、３０％のエタノール，ｐＨ５．５
【0060】
全ての試験試料を、撹拌しながら室温で３０分間インキュベートし、続いて、撹拌せず
に３０分間の追加のインキュベーションを行った。１６～２０時間、２～８℃で更なるイ
ンキュベーションを行った。生成した沈殿剤を遠心分離により除去し、上清を収集した。
に３０分間の追加のインキュベーションを行った。１６～２０時間、２～８℃で更なるイ
ンキュベーションを行った。生成した沈殿剤を遠心分離により除去し、上清を収集した。
【0061】
沈殿プロセスの性能パラメータ：
ｒＦＳＨ回収
ＦＳＨ ＥＬＩＳＡにより全ての試料のｒＦＳＨ濃度を決定し、各試料の処理後の収率
を計算したうえで、表３に示している。
ｒＦＳＨ回収
ＦＳＨ ＥＬＩＳＡにより全ての試料のｒＦＳＨ濃度を決定し、各試料の処理後の収率
を計算したうえで、表３に示している。
【0062】
表３から分かるように、それぞれ１０ｍＭのＣＡ、１０ｍＭのＣＡ＋３０％のエタノー
ル、２０ｍＭのＣＡおよび２０ｍＭのＣＡ＋３０％のエタノールによる沈殿の後、ＵＦ２
－ＡＤプロセス溶液中のｒＦＳＨの９６％、１０６％、１０６％および９８％を回収した
。このことは、ｒＦＳＨが沈殿せず、溶液中に溶解可能なままであることを示す。
ル、２０ｍＭのＣＡおよび２０ｍＭのＣＡ＋３０％のエタノールによる沈殿の後、ＵＦ２
－ＡＤプロセス溶液中のｒＦＳＨの９６％、１０６％、１０６％および９８％を回収した
。このことは、ｒＦＳＨが沈殿せず、溶液中に溶解可能なままであることを示す。
【0063】
不純物除去
未処理ＵＦ２－ＡＤおよび処理済みＵＦ２－ＡＤの上清のそれぞれにおいて２８０ｎｍ
での吸光度を測定し、表３に示すように、不純物除去率を計算した。それぞれ、１０ｍＭ
のＣＡ、１０ｍＭのＣＡ＋３０％のエタノール、２０ｍＭのＣＡおよび２０ｍＭのＣＡ＋
３０％のエタノールによる沈殿の後に、ＵＦ２－ＡＤ中のＡ280不純物全体の３３．９％
、６４．９％、６５．９％および６８．８％を除去した。
未処理ＵＦ２－ＡＤおよび処理済みＵＦ２－ＡＤの上清のそれぞれにおいて２８０ｎｍ
での吸光度を測定し、表３に示すように、不純物除去率を計算した。それぞれ、１０ｍＭ
のＣＡ、１０ｍＭのＣＡ＋３０％のエタノール、２０ｍＭのＣＡおよび２０ｍＭのＣＡ＋
３０％のエタノールによる沈殿の後に、ＵＦ２－ＡＤ中のＡ280不純物全体の３３．９％
、６４．９％、６５．９％および６８．８％を除去した。
【0064】
未処理ＵＦ２－ＡＤおよび各種処理済みＵＦ２－ＡＤの上清を、不純物除去の定性的評
価のために１２％還元ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけた。ゲルパタ
ーンを図２に示す。１０ｍＭのＣＡ＋３０％のエタノール（レーン５）および２０ｍＭの
ＣＡ＋３０％のエタノール，ｐＨ５．５（レーン１０）による沈殿の後に得られた上清は
、それぞれ、１０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．５（レーン４）および２０ｍＭのＣＡ（レーン９
）による沈殿の後に得られた上清と比較して、実質的に純粋である。このことは沈殿工程
におけるカプリル酸へのエタノールの添加の相乗効果を示している。
価のために１２％還元ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけた。ゲルパタ
ーンを図２に示す。１０ｍＭのＣＡ＋３０％のエタノール（レーン５）および２０ｍＭの
ＣＡ＋３０％のエタノール，ｐＨ５．５（レーン１０）による沈殿の後に得られた上清は
、それぞれ、１０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．５（レーン４）および２０ｍＭのＣＡ（レーン９
）による沈殿の後に得られた上清と比較して、実質的に純粋である。このことは沈殿工程
におけるカプリル酸へのエタノールの添加の相乗効果を示している。
【0065】
実験条件：
１．エタノールおよびカプリル酸によるＵＦ２－ＡＤの沈殿は、カプリル酸のみを用いて
得られた製品と比較して、より純粋な製品をもたらした。
２．エタノールとカプリル酸の組み合わせは、溶液中に溶解可能なままであるｒＦＳＨを
沈殿させず、本工程が高収率の精製およびウイルス不活性化工程であることを意味してい
る。
１．エタノールおよびカプリル酸によるＵＦ２－ＡＤの沈殿は、カプリル酸のみを用いて
得られた製品と比較して、より純粋な製品をもたらした。
２．エタノールとカプリル酸の組み合わせは、溶液中に溶解可能なままであるｒＦＳＨを
沈殿させず、本工程が高収率の精製およびウイルス不活性化工程であることを意味してい
る。
【0066】
【表3】
【0067】
［実施例４］
ｈＣＧ含有採取物中の不純物除去のための沈殿条件の評価
実験内容：
ｈＣＧ含有採取物を約４０倍に濃縮し、１０ｋＤａ限外濾過（ＵＦ）システムにより、
１００ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ９．０）、６ｍＳ／ｃｍの緩衝液で透
析した。ＵＦの最後に、回収したタンパク質溶液であるＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤ（透析後）
物質を等しく小分けし、各分量を不純物除去をする異なる沈殿条件に供した（ｈＣＧは溶
液中に溶解可能である）。試験した沈殿条件は以下の通りである（表４）。
１.対照としての処理なしＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤ；
２.Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋１５ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．０
３.Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．０
４.Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ＋１０％のエタノール，ｐＨ５．０
ｈＣＧ含有採取物中の不純物除去のための沈殿条件の評価
実験内容：
ｈＣＧ含有採取物を約４０倍に濃縮し、１０ｋＤａ限外濾過（ＵＦ）システムにより、
１００ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ９．０）、６ｍＳ／ｃｍの緩衝液で透
析した。ＵＦの最後に、回収したタンパク質溶液であるＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤ（透析後）
物質を等しく小分けし、各分量を不純物除去をする異なる沈殿条件に供した（ｈＣＧは溶
液中に溶解可能である）。試験した沈殿条件は以下の通りである（表４）。
１.対照としての処理なしＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤ；
２.Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋１５ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．０
３.Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．０
４.Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ＋２０ｍＭのＣＡ＋１０％のエタノール，ｐＨ５．０
【0068】
全ての処理済み試料を、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。生成した沈殿
剤を遠心分離により除去し、上清を収集した。
剤を遠心分離により除去し、上清を収集した。
【0069】
沈殿プロセスの性能パラメータ：
ｈＣＧ回収
表４に詳細を示すように、未処理採取物および処理済みＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤの上清の
それぞれにおけるｈＣＧ濃度を決定し、回収率を計算した。
ｈＣＧ回収
表４に詳細を示すように、未処理採取物および処理済みＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤの上清の
それぞれにおけるｈＣＧ濃度を決定し、回収率を計算した。
【0070】
不純物除去
表４に詳細を示すように、未処理採取物および処理済みＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤの上清の
それぞれにおける、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）を決定し、不純物除去率を計算した
。
表４に詳細を示すように、未処理採取物および処理済みＨａｒｖｅｓｔ－ＡＤの上清の
それぞれにおける、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）を決定し、不純物除去率を計算した
。
【0071】
【0072】
考察：
１.ｈＣＧ回収率－それぞれ１５ｍＭのＣＡ、２０ｍＭのＣＡおよび２０ｍＭのＣＡ＋１
０％のエタノールによる沈殿の後に、Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ中のｈＣＧの９１％、８６％
および８３％が回収された。
１.ｈＣＧ回収率－それぞれ１５ｍＭのＣＡ、２０ｍＭのＣＡおよび２０ｍＭのＣＡ＋１
０％のエタノールによる沈殿の後に、Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤ中のｈＣＧの９１％、８６％
および８３％が回収された。
【0073】
２.Ａ280ごとの不純物除去－それぞれ１５ｍＭのＣＡ、２０ｍＭのＣＡおよび２０ｍＭの
ＣＡ＋１０％のエタノールによる沈殿の後に、Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤにおける総計Ａ280
の５６．６％、５５．８％および６３．０％が除去された。
ＣＡ＋１０％のエタノールによる沈殿の後に、Ｈａｒｖｅｓｔ－ＡＤにおける総計Ａ280
の５６．６％、５５．８％および６３．０％が除去された。
【0074】
３．ゲルごとの不純物除去－２０ｍＭのＣＡ＋１０％のエタノール，ｐＨ５．０（レーン
５）による沈殿の後に得た上清は、１５ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．０（レーン４）による沈殿
の後に得られた上清と比較して、実質的に純粋である。
５）による沈殿の後に得た上清は、１５ｍＭのＣＡ，ｐＨ５．０（レーン４）による沈殿
の後に得られた上清と比較して、実質的に純粋である。
【0075】
結論：
１．エタノールおよびカプリル酸を添加したｈＣＧ含有採取物の沈殿は、カプリル酸のみ
を用いて得られた製品と比較して、より純粋な製品をもたらした。
１．エタノールおよびカプリル酸を添加したｈＣＧ含有採取物の沈殿は、カプリル酸のみ
を用いて得られた製品と比較して、より純粋な製品をもたらした。
【0076】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
