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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-21
(45)【発行日】2022-05-02
(54)【発明の名称】抗ヒトＩＬ－２６抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/24 20060101AFI20220422BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220422BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220422BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220422BHJP
C12N 15/06 20060101ALN20220422BHJP
C12N 5/16 20060101ALN20220422BHJP
【ＦＩ】
C07K16/24
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P37/02
C12P21/08
C12N15/06 100
C12N5/16
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2017231439
(22)【出願日】2017-12-01
(65)【公開番号】P2019099492
(43)【公開日】2019-06-24
【審査請求日】2020-11-17
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-02577
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-02578
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-02579
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-02580
(73)【特許権者】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(73)【特許権者】
【識別番号】510301242
【氏名又は名称】ワイズ・エー・シー株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】森本 幾夫
(72)【発明者】
【氏名】波多野 良
(72)【発明者】
【氏名】大沼 圭
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 匠
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／００９３９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０９１５１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０６９３１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】臨床血液，2015年，Vol.56, No.9，p.1408 (p.292)
【文献】PLOS Biology，2012年，Vol.10, No.9, e1001395，pp.1-15
【文献】The Journal of Biological Chemistry，2004年，Vol.279, No.32，pp.33343-33351
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７７、受託番号ＮＩＴＥＰ－０２５７８、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７９又は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５８０として寄託されたハイブリドーマが産生する、ヒトＩＬ－２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項2】
請求項１記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含有する医薬。
【請求項3】
ＩＬ－２６関連性疾患治療薬である請求項２記載の医薬。
【請求項4】
ＩＬ－２６が関与する難治性免疫異常症治療薬又はＩＬ－２６が関与する難治性がん治療薬である請求項２又は３記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、中和活性を有する抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体及びこれを含有する医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン（ＩＬ）－２６はＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉに感染したＴ細胞から初めて同定されたサイトカインで、ヒトＩＬ－２６は１７１アミノ酸から成り、ＩＬ－１０、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４を含むＩＬ－１０ ｆａｍｉｌｙに分類される。ＩＬ－２６遺伝子はヒト第１２染色体１２ｑ１５領域の、インターフェロン（ＩＦＮ）－γとＩＬ－２２の遺伝子の間に位置し、様々な脊椎動物種でも保存されているが、マウスやラット等の齧歯類では欠損している。ＩＬ－２６はＴｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、ＮＫ細胞のほか、関節リウマチ患者の滑膜細胞やエンドトキシン刺激を受けた肺胞マクロファージなどから産生され、ＩＬ－２０ＲＡとＩＬ－１０ＲＢで構成される特異的な細胞表面受容体に結合することで、ＳＴＡＴ３のリン酸化を介して細胞を活性化させる。ＩＬ－１０ＲＢが様々な細胞種に広範に発現しているのに対し、ＩＬ－２６受容体からの細胞内シグナル伝達の鍵となるＩＬ－２０ＲＡの発現は、ケラチノサイトと腸管上皮細胞で報告されているが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞などの血液細胞には認められない。ＩＬ－２６はケラチノサイトと腸管上皮細胞に作用して、ＩＬ－１０、ＩＬ－８、ＴＮＦ－αの産生や細胞接着分子ＩＣＡＭ－１の発現を亢進する。また、本発明者らは、ＩＬ－２６受容体がヒト及びマウスの線維芽細胞にも発現しており、ＩＬ－２６がＩＬ－２０ＲＡを介して線維芽細胞を活性化させ、コラーゲン産生を増加させることを見出した（非特許文献１）。血液細胞にはＩＬ－２０ＲＡの発現は認められないとの過去の報告に反して、近年、ＩＬ－２６の単球、好中球及びＮＫ細胞への作用も報告された。ＩＬ－２６はヒト単球のＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＣＣＬ２０の産生を誘導し、Ｔｈ１７細胞の発生を促進する（非特許文献２）。また、ＩＬ－２６はＩＬ－８や細菌性ホルミルペプチド（ｆＭＬＰ）によって誘導されるヒト好中球の細胞遊走を増強させる（非特許文献３）。さらに、ヒトＣＤ１６陰性ＣＤ５６強陽性のＮＫ細胞膜上のＴＲＡＩＬ発現を亢進し、ＮＫ細胞のＩＬ－１β、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α産生を促進する（非特許文献４）。
【0003】
ＩＬ－２６は、ＩＬ－１７を産生するＣＤ４ヘルパーＴ細胞であるＴｈ１７細胞が特に産生するサイトカインである。Ｔｈ１７細胞は、関節リウマチや炎症性腸疾患、多発性硬化症や乾癬など様々な難治性自己免疫疾患の病態への関与が動物実験で示され、ＩＬ－１７ＡやＴｈ１７分化を促進するＩＬ－２３を標的とした治療薬は、様々な免疫疾患に対して臨床試験が行われている（非特許文献５）。ＩＬ－２６はマウスやラット等の齧歯類で欠損しているため、ヒト検体を用いての報告が主であり、炎症病態における役割に関してまだ解明されていない点が多い。炎症性腸疾患であるクローン病患者では、大腸でのＩＬ－２６のｍＲＮＡ発現が増加しており、クローン病の症状が強く表れているときに大腸でのＩＬ－２６陽性Ｔ細胞数が増加していることが報告されている（非特許文献６）。ＩＬ－２６はＩＬ－２０ＲＡ／ＩＬ－１０ＲＢを発現する腸管上皮細胞に作用して、ＩＬ－８とＴＮＦ－αの発現を増強させる。関節リウマチ患者では、健常者よりも血清中のＩＬ－２６濃度が高値を示し、滑液中にはさらに高濃度で存在する。関節リウマチ患者の滑膜細胞はＩＬ－２６を産生し、ＩＬ－２６はＣＤ１４陽性単球のＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α産生を非常に強く増強することで、Ｔｈ１７細胞分化やＩＬ－１７Ａ産生をより促進する（非特許文献２）。本発明者らは、重度の免疫不全マウスであるＮＯＧマウスを亜致死量の放射線で前処理し、ヒト臍帯血単核球を移植する慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルを確立し、肺の線維化に決定的なエフェクターサイトカインとしてＩＬ－２６を見出した（非特許文献１）。さらに、ＩＬ－２６がヒト及びマウスの線維芽細胞に作用してコラーゲン産生を顕著に亢進すること、急性リンパ芽球性白血病患者で同種末梢血幹細胞移植後にＧＶＨＤを発症した肺においても、多数のＩＬ－２６陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が浸潤しており、気管支周囲や血管周囲に顕著なコラーゲン堆積が認められることを明らかにした。このことから、ＩＬ－２６は、炎症性腸疾患や関節リウマチ、慢性肺ＧＶＨＤの病態に深く関与していることが示唆される。また、乾癬患者の皮膚病変部位でＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２といったＴｈ１７サイトカインとともにＩＬ－２６のｍＲＮＡ発現も上昇していること（非特許文献７）、多発性硬化症の患者の血清中ＩＬ－２６濃度が健常者よりも高値を示すことも報告されており（非特許文献８）、炎症病態における役割の詳細は不明ながら、それらの疾患の病態にもＩＬ－２６が関係していることが示唆されている。
また、ＩＬ－２６は免疫疾患だけでなく、がんの病態への関与も示唆されている。胃がん組織では、隣接した正常組織よりもＩＬ－２６のｍＲＮＡ発現が高く、胃がん浸潤細胞のうちＴｈ１７細胞とＮＫ細胞がＩＬ－２６の主な産生源であること、胃がん患者では血清中ＩＬ－２６濃度が健常者よりも高いことが報告されている（非特許文献９）。ＩＬ－２６は胃がん細胞株の増殖を促進するとともに、ＳＴＡＴ３シグナル依存的に抗アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘｌ、ｃ－ｍｙｃの発現を上昇させることで、シスプラチンによるアポトーシス誘導を阻害し、がん細胞の生存促進に作用する。
また、ＩＬ－２６は免疫疾患だけでなく、がんの病態への関与も示唆されている。胃がん組織では、隣接した正常組織よりもＩＬ－２６のｍＲＮＡ発現が高く、胃がん浸潤細胞のうちＴｈ１７細胞とＮＫ細胞がＩＬ－２６の主な産生源であること、胃がん患者では血清中ＩＬ－２６濃度が健常者よりも高いことが報告されている（非特許文献９）。ＩＬ－２６は胃がん細胞株の増殖を促進するとともに、ＳＴＡＴ３シグナル依存的に抗アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘｌ、ｃ－ｍｙｃの発現を上昇させることで、シスプラチンによるアポトーシス誘導を阻害し、がん細胞の生存促進に作用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ohnuma, K., R. Hatano, T. M. Aune, H. Otsuka, S. Iwata, N. H. Dang, T. Yamada, and C. Morimoto. 2015. Regulation of pulmonary graft-versus-host disease by IL-26+CD26+CD4 T lymphocytes. Journal of immunology 194: 3697-3712.
【文献】Corvaisier, M., Y. Delneste, H. Jeanvoine, L. Preisser, S. Blanchard, E. Garo, E. Hoppe, B. Barre, M. Audran, B. Bouvard, J. P. Saint-Andre, and P. Jeannin. 2012. IL-26 is overexpressed in rheumatoid arthritis and induces proinflammatory cytokine production and Th17 cell generation. PLoS biology 10: e1001395.
【文献】Che, K. F., S. Tengvall, B. Levanen, E. Silverpil, M. E. Smith, M. Awad, M. Vikstrom, L. Palmberg, I. Qvarfordt, M. Skold, and A. Linden. 2014. Interleukin-26 in antibacterial host defense of human lungs. Effects on neutrophil mobilization. Am J Respir Crit Care Med 190: 1022-1031.
【文献】Miot, C., E. Beaumont, D. Duluc, H. Le Guillou-Guillemette, L. Preisser, E. Garo, S. Blanchard, I. Hubert Fouchard, C. Creminon, P. Lamourette, I. Fremaux, P. Cales, F. Lunel-Fabiani, J. Boursier, O. Braum, H. Fickenscher, P. Roingeard, Y. Delneste, and P. Jeannin. 2015. IL-26 is overexpressed in chronically HCV-infected patients and enhances TRAIL-mediated cytotoxicity and interferon production by human NK cells. Gut 64: 1466-1475.
【文献】Fragoulis, G. E., S. Siebert, and I. B. McInnes. 2016. Therapeutic Targeting of IL-17 and IL-23 Cytokines in Immune-Mediated Diseases. Annual review of medicine 67: 337-353.
【文献】Dambacher, J., F. Beigel, K. Zitzmann, E. N. De Toni, B. Goke, H. M. Diepolder, C. J. Auernhammer, and S. Brand. 2009. The role of the novel Th17 cytokine IL-26 in intestinal inflammation. Gut 58: 1207-1217.
【文献】Wilson, N. J., K. Boniface, J. R. Chan, B. S. McKenzie, W. M. Blumenschein, J. D. Mattson, B. Basham, K. Smith, T. Chen, F. Morel, J. C. Lecron, R. A. Kastelein, D. J. Cua, T. K. McClanahan, E. P. Bowman, and R. de Waal Malefyt. 2007. Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells. Nature immunology 8: 950-957.
【文献】Esendagli, G., A. T. Kurne, G. Sayat, A. K. Kilic, D. Guc, and R. Karabudak. 2013. Evaluation of Th17-related cytokines and receptors in multiple sclerosis patients under interferon beta-1 therapy. Journal of neuroimmunology 255: 81-84.
【文献】You, W., Q. Tang, C. Zhang, J. Wu, C. Gu, Z. Wu, and X. Li. 2013. IL-26 promotes the proliferation and survival of human gastric cancer cells by regulating the balance of STAT1 and STAT3 activation. PloS one 8: e63588.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
関節リウマチや炎症性腸疾患、乾癬、多発性硬化症、慢性ＧＶＨＤなどの難治性免疫異常症の治療薬として、ステロイド剤や免疫抑制剤、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａなどを分子標的とした生物学的製剤が用いられているが、作用する細胞の特異性の低さや免疫系の抑制効果の強さが原因となり、日和見感染に代表される副作用が問題となっている。そこで、免疫系による本来の生体防御反応を過剰に抑制しない、疾患の病態に即した有効かつ副作用のリスクを改善した治療法の開発が望まれている。また、現時点で有効な治療薬が開発されていない難治性がんに対しても、有効かつ安全な新しい分子標的治療薬の開発が望まれている。
従って、本発明の課題は、難治性免疫異常症及び難治性がんの治療薬を提供することにある。
従って、本発明の課題は、難治性免疫異常症及び難治性がんの治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
そこで本発明者は、難治性免疫異常症や難治性がんに関与しているＩＬ－２６に着目し、市販されている抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の作用について検討したところ、これらの抗体はＩＬ－２６には結合するものの、中和活性がないことが判明した。そこで、本発明者は数多くのＩＬ－２６に対する抗体を製造し、その中からヒトＩＬ－２６に対する中和活性を有する抗体を選択することに成功した。さらに、抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体の作用を検討したところ、ＩＬ－２６が関与する種々の疾患に対して優れた治療効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔９〕を提供するものである。
【0008】
〔１〕ヒトＩＬ－２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔２〕ヒトＩＬ－２６の活性を阻害するものである〔１〕記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔３〕受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７７、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７８、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７９、又は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５８０として寄託されたハイブリドーマが産生する、ヒトＩＬ－２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔４〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含有する医薬。
〔５〕ＩＬ－２６関連性疾患治療薬である〔４〕記載の医薬。
〔６〕ＩＬ－２６が関与する難治性免疫異常症治療薬又はＩＬ－２６が関与する難治性がん治療薬である〔４〕又は〔５〕記載の医薬。
〔７〕ＩＬ－２６が関連する疾患を治療するための、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔８〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、ＩＬ－２６が関連する疾患治療薬製造のための使用。
〔９〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の有効量を投与することを特徴とするＩＬ－２６が関連する疾患の治療方法。
〔２〕ヒトＩＬ－２６の活性を阻害するものである〔１〕記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔３〕受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７７、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７８、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７９、又は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５８０として寄託されたハイブリドーマが産生する、ヒトＩＬ－２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔４〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含有する医薬。
〔５〕ＩＬ－２６関連性疾患治療薬である〔４〕記載の医薬。
〔６〕ＩＬ－２６が関与する難治性免疫異常症治療薬又はＩＬ－２６が関与する難治性がん治療薬である〔４〕又は〔５〕記載の医薬。
〔７〕ＩＬ－２６が関連する疾患を治療するための、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
〔８〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、ＩＬ－２６が関連する疾患治療薬製造のための使用。
〔９〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の有効量を投与することを特徴とするＩＬ－２６が関連する疾患の治療方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いれば、ＩＬ－２６が関与する種々の難治性免疫異常症やがんを治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のＩＬ－２６に対する結合性を示す図である。組換えヒトＩＬ－２６をプレートにそれぞれ固相化し、ハイブリドーマ各クローンの培養上清を精製して得たＩｇＧ画分を添加して、結合させた。次いで、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇ抗体）を反応させ、基質を添加した後、プレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光値（吸収波長）を測定した。本発明者らが樹立したマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体及び市販のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体では、プレートに固相化したＩＬ－２６濃度依存的な吸光値の上昇が見られた。データは、各群３連で測定した結果の平均±標準偏差として示している。類似の結果を有する３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図1B】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のＩＬ－２６に対する結合性を示す図である。組換えヒトＩＬ－１０をプレートにそれぞれ固相化し、ハイブリドーマ各クローンの培養上清を精製して得たＩｇＧ画分を添加して、結合させた。次いで、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇ抗体）を反応させ、基質を添加した後、プレートリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光値（吸収波長）を測定した。本発明者らが樹立したマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体及び市販のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体では、プレートに固相化したＩＬ－１０に対してはいずれの濃度でも結合は認められないことが示された。データは、各群３連で測定した結果の平均±標準偏差として示している。類似の結果を有する３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図2A】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５に対するＩＬ－２６の中和活性を示す図である。ＣＯＬＯ ２０５細胞に対照マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩＬ－２６ ＩｇＧ抗体の存在下、不存在下で外因性ＩＬ－２６を添加し、２４時間培養後に細胞を回収してＩＣＡＭ－１の発現をフローサイトメトリーによって測定した。ＭＦＩは平均蛍光強度の略語であり、データとして取り込んだ細胞それぞれの蛍光強度の総和を全細胞数で割った値（＝平均値）を示す。蛍光強度が高いほど、一つの細胞の細胞膜上にＩＣＡＭ－１分子が多く発現しており、それらに対し蛍光標識された抗体が多く結合していることを意味する。ＣＯＬＯ ２０５細胞を対照マウスＩｇＧ、ハイブリドーマ各クローンの培養上清を精製して得たＩｇＧ画分、市販のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体または市販のヤギ抗ヒトＩＬ－２６ポリクローナル抗体の存在下で外因性ＩＬ－２６を添加した。ＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現は、外因性ＩＬ－２６によって増強し、本発明者らが樹立したマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の存在によって部分的に阻害された（＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。一方で、市販のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体２クローンでは全く阻害効果が見られなかった。データは、各群３連で培養し、それぞれ独立して測定した結果の平均±標準偏差として示している。青色点線は未刺激のＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１のＭＦＩを示す。類似の結果を有する５回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図2B】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５に対するＩＬ－２６の中和活性を示す図である。ＣＯＬＯ ２０５細胞を対照マウスＩｇＧ、クローン６９－１０単独または６９－１０との２クローン組み合わせの存在下で外因性ＩＬ－２６を添加した。外因性ＩＬ－２６によって増強するＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現は、モノクローナル抗体６９－１０単独で部分的に阻害され、６９－１０との２クローン組み合わせにより阻害効果が有意に増加した（＊対応するクローン６９－１０単独添加群に対してｐ＜０．０１）。データは、各群３連で培養し、それぞれ独立して測定した結果の平均±標準偏差として示している。青色点線は未刺激のＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１のＭＦＩを示す。類似の結果を有する３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図2C】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５に対するＩＬ－２６の中和活性を示す図である。ＣＯＬＯ ２０５細胞を対照マウスＩｇＧ、クローン６９－１０単独または６９－１０との２クローン組み合わせ、３クローン組み合わせ、４クローン組み合わせの存在下で外因性ＩＬ－２６を添加した。外因性ＩＬ－２６によって増強するＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現は、モノクローナル抗体６９－１０単独で部分的に阻害され、さらにクローンを組み合わせるほどより阻害効果が増加した。データは、各群３連で培養し、それぞれ独立して測定した結果の平均±標準偏差として示している。青色点線は未刺激のＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１のＭＦＩを示す。類似の結果を有する３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図2D】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５に対するＩＬ－２６の中和活性を示す図である。ＣＯＬＯ ２０５細胞を対照マウスＩｇＧ、クローン６９－１０単独または４クローン組み合わせの存在下で外因性ＩＬ－２６を添加した。外因性ＩＬ－２６によって増強するＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現は、モノクローナル抗体６９－１０単独で用量依存的に阻害され、４クローン組み合わせにより非常に強い阻害効果が観察された。データは、各群３連で培養し、それぞれ独立して測定した結果の平均±標準偏差として示している。青色点線は未刺激のＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１のＭＦＩを示す。類似の結果を有する３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図2E】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５に対するＩＬ－２６の中和活性を示す図である。図２Ｄの代表的な結果をヒストグラムで示した。黒色実線は無刺激のＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現を示し、灰色の領域は、ＩＣＡＭ－１抗体と同じ蛍光色素が標識されたマウスＩｇＧ1,κアイソタイプ対照抗体で染色した結果を示す。対照マウスＩｇＧ（パネル（ｉ）黒色太実線）、クローン６９－１０単独（パネル（ii）黒色太点線）、４クローン組み合わせ（パネル（iii）黒色太点線）存在下で外因性ＩＬ－２６を添加したＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現を示す。
【図3A】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣに対するＩＬ－２６の中和活性を示す図である。ＨＵＶＥＣに対照マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩＬ－２６ ＩｇＧ抗体の存在下、不存在下で外因性ＩＬ－２６またはＶＥＧＦを添加した。刺激を開始して４８時間の細胞増殖を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭによって成育可能面積中の細胞の割合を算出することで評価した。ＨＵＶＥＣの増殖は、外因性ＩＬ－２６によって濃度依存的に促進され（水色線、青色線）、モノクローナル抗体６９－１０単独で有意に阻害された（赤色線；＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、４クローン組み合わせでは外因性ＩＬ－２６によって促進されるＨＵＶＥＣの増殖はほぼ完全に阻害された（オレンジ色線）。データは、各群８連で培養し、それぞれ独立して測定した結果の平均±標準偏差として示している。類似の結果を有する３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図3B】ハイブリドーマ各クローンの培養上清から精製したＩｇＧ画分のヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣに対するＩＬ－２６の中和活性を示す図である。ＨＵＶＥＣに対照マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩＬ－２６ ＩｇＧ抗体の存在下、不存在下で外因性ＩＬ－２６またはＶＥＧＦを添加した。刺激して９時間後の管の長さをＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭによって算出することで管形成能を評価した。代表的な写真を上のパネルに示した。ＨＵＶＥＣの管形成能は、外因性ＩＬ－２６によって濃度依存的に促進され、モノクローナル抗体６９－１０単独で有意に阻害された（*対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、４クローン組み合わせでは阻害効果が増加した。データは、各群８連で培養し、それぞれ独立して測定した結果の平均±標準偏差として示している。青色点線は未刺激のＨＵＶＥＣの管形成を示す。類似の結果を有する３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図4A】イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。ヒトＩＬ－２６遺伝子を含むバクテリア人工染色体トランスジェニック（ｈＩＬ－２６Ｔｇ）マウスと、ＩＬ－２６を発現しない対照トランスジェニック（ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇ）マウスの背中に５％イミキモドクリーム２０ｍｇを５日間連続で塗布した。対照マウスＩｇＧ、モノクローナル抗体６９－１０単独、４クローン組み合わせを、初日クリーム塗布前と３回目クリーム塗布前と５回目クリーム塗布前に１日おきでマウス１匹あたり２００μｇずつ腹腔内投与を行った。各群のマウスの背中の皮膚の外観の代表的な写真を示す。
【図4B】イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。背中の皮膚の炎症の重症度をＰＡＳＩスコアによって評価した。背中の皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚それぞれに正常をスコア０、極めて重篤をスコア４としたスコアを付け、累計スコアとともに示した。ｈＩＬ－２６ＴｇマウスはΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較して、皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚のいずれも悪化が見られるが、モノクローナル抗体６９－１０単独投与及び４クローン組み合わせ投与により、症状の顕著な改善が認められた。データは２回の独立した実験の累積結果の平均±標準偏差として示した（各群ｎ＝１０）。
【図4C】イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。イミキモドクリームの塗布を開始して３日後及び５日後の背中の皮膚のＨ＆Ｅ染色の代表的な結果を示す。元の大きさの×１００である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図4D】イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。イミキモドクリームの塗布を開始して３日後の背中の皮膚の抗マウスＬｙ６ｇ（好中球マーカー）での免疫蛍光染色の代表的な結果を示す。全ての切片はＤＡＰＩにより核を青色に染色している。元の大きさの×１００である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図4E】イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。イミキモドクリームの塗布を開始して５日後の背中の皮膚の抗マウスＣＤ３１（内皮細胞マーカー）での免疫蛍光染色の代表的な結果を示す。全ての切片はＤＡＰＩにより核を青色に染色している。元の大きさの×１００である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図4F】イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。イミキモドクリームの塗布を開始して５日後の背中の皮下の血管形成の代表的な写真を示す。
【図5A】異種慢性ＧＶＨＤモデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。ＮＯＧマウスを亜致死線量（２００ｃＧｙ）で放射線照射し、翌日、ヒト臍帯血から単離した単核球（ＣＢＭＣ）を移植した。対照マウスＩｇＧ、またはモノクローナル抗体６９－１０単独を、軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植＋２８日目からマウス１匹あたり２００μｇずつ週２回、腹腔内投与を行った。 全体的生存率の結果を示す。データは３回の独立した実験からの累計結果である（対照マウスＩｇＧ群ｎ＝１０，ＩＬ－２６抗体投与群ｎ＝６）。
【図5B】異種慢性ＧＶＨＤモデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。体重変動（平均±標準誤差）の結果を示す。データは３回の独立した実験からの累計結果である（対照マウスＩｇＧ群ｎ＝１０，ＩＬ－２６抗体投与群ｎ＝６）。
【図5C】異種慢性ＧＶＨＤモデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。ＣＢＭＣ移植後、ＮＯＧマウスの末梢血を表示されている時点で採取し、フローサイトメトリーを用いてヒトＣＤ４５+細胞の割合を解析した。データは、全末梢血白血球（ＰＢＬ）中のヒトＣＤ４５+細胞の平均±標準誤差として示している（対照マウスＩｇＧ群では０－４週目はｎ＝１０，６週目はｎ＝７，８週目はｎ＝４、ならびにＩＬ－２６抗体投与群では０－８週目までｎ＝６）。
【図5D】異種慢性ＧＶＨＤモデルにおける新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を示す図である。ヒトＣＢＭＣから造血幹細胞画分ＣＤ３４+細胞のみを精製して移植したＧＶＨＤ非発症対照群、ＣＢＭＣ移植後に対照マウスＩｇＧを投与した群、ＩＬ－２６抗体６９－１０を投与した群の移植後８週目における背中の皮膚の外観、皮膚、肺および肝臓のＨ＆Ｅ染色の代表的な結果を示す。Ｈ＆Ｅ染色の結果は、元の大きさの×１００である。スケールバーは１００μｍを示す。
【図6A】新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体投与後もドナーＴ細胞による移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果が保持されていることを示す図である。ＮＯＧマウスを亜致死線量（２００ｃＧｙ）で放射線照射し、翌日、ヒト臍帯血から単離した単核球（ＣＢＭＣ）を移植した。移植＋２８日目に尾静脈からＡ２０－ｌｕｃ細胞を播種し、その翌日（＋２９日目）から対照マウスＩｇＧ、またはモノクローナル抗体６９－１０単独をマウス１匹あたり２００μｇずつ週２回、腹腔内投与した。ドナーＴ細胞による抗腫瘍効果が働かない比較対照として、ＣＢＭＣ移植をしないＮＯＧマウスにＡ２０－ｌｕｃ細胞を播種した。Ａ２０－ｌｕｃを播種して３日後、７日後、１０日後、１４日後、１７日後にマウスにルシフェリンを注射し、ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍにて発光の強さを定量化し、腫瘍細胞の測定を行った。各群の腫瘍の発光強度を平均±標準偏差で示した（各群ｎ＝５）。
【図6B】新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体投与後もドナーＴ細胞による移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果が保持されていることを示す図である。Ａ２０－ｌｕｃを播種して１０日後、１７日後に測定を行った各群の代表的なマウスを示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の抗体は、ヒトＩＬ－２６に対する中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。
【0012】
本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。好ましくは、ＩｇＧであり、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ２である。
【0013】
抗原結合性断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。
【0014】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩＬ－２６に特異的に結合し、ヒトＩＬ－２６の活性を阻害することを特徴とする。
【0015】
「特異的に結合する」とは、抗体の抗原やエピトープに対して特異的な結合することを意味する。例えば、特異的にＩＬ－２６のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片は、他のエピトープ又は非エピトープ部分に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、及び/又は、より長時間持続して、このＩＬ－２６エピトープに結合可能である。しかしながら、第１の標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片は、第２の標的に特異的に結合することを排除しない。
【0016】
「中和モノクローナル抗体」とは、抗原と結合することで、抗原とその受容体との結合を阻害することが可能なモノクローナル抗体を意味する。すなわち、ヒトＩＬ－２６と結合してヒトＩＬ－２６の活性を阻害するモノクローナル抗体である。
【0017】
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）の抗体、又は、それらの抗原結合性断片が挙げられる。キメラ抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変領域だけを取ってきて、ヒト抗体の定常領域に導入した抗体であって、可変領域は非ヒト由来、定常領域はヒト由来の抗体とすればよい。ヒト化抗体は、抗原と直接結合する部分である超可変領域（相補性決定領域ともいう）だけを非ヒト（例えば、マウス）型にした抗体である。ヒト抗体は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン遺伝子をノックアウトした非ヒト動物（例えば、マウス）と、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した非ヒト動物どうしを交配させて、ヒト免疫グロブリンだけを産生する非ヒト動物を作製し、かかるヒト免疫グロブリンを産生する非ヒト動物から調製した抗体である。
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、場合により、単量体、二量体又は多量体の形態であってよい。
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、場合により、単量体、二量体又は多量体の形態であってよい。
【0018】
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、種々の方法で製造することができる。モノクローナル抗体の製造方法は当該技術分野で当業者に周知である（例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照）。
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、当業者に周知の、例えば、「Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495」に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して製造することができる。ハイブリドーマ法においては、例えば、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を、抗原であるヒトＩＬ－２６又はその断片等で免疫することにより、当該宿主動物に、当該抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）を作らせる。抗体力価を高めるために、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、脂質系アジュバント、グルカン多糖系アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、又は、合成コポリマー系アジュバント等を添加してもよい。抗体産生細胞は脾臓に多く存在するため、一般的には、脾臓から脾細胞を取り出した後に、脾細胞を腫瘍細胞（例えば、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）酵素を欠損した９－アザグアニン耐性株であるミエローマ細胞）と細胞融合させることで不死化させて、ハイブリドーマを作製する。細胞融合は、センダイウイルス、ポリエチレングリコール又は電気刺激等により行ってよい。ハイブリドーマを作製後、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で培養することにより、脾細胞と腫瘍細胞のハイブリドーマを選択できる。選択したハイブリドーマを１個／ウェルで播種し直すことで、抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。培養上清は、さらに、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、又は、プロテインＡ／Ｇクロマト法等を用いて精製することで、例えば、ＩｇＧ画分（ＩｇＧ抗体）へと精製してもよい。
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、当業者に周知の、例えば、「Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495」に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して製造することができる。ハイブリドーマ法においては、例えば、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を、抗原であるヒトＩＬ－２６又はその断片等で免疫することにより、当該宿主動物に、当該抗原に特異的に結合する抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）を作らせる。抗体力価を高めるために、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、脂質系アジュバント、グルカン多糖系アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、又は、合成コポリマー系アジュバント等を添加してもよい。抗体産生細胞は脾臓に多く存在するため、一般的には、脾臓から脾細胞を取り出した後に、脾細胞を腫瘍細胞（例えば、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）酵素を欠損した９－アザグアニン耐性株であるミエローマ細胞）と細胞融合させることで不死化させて、ハイブリドーマを作製する。細胞融合は、センダイウイルス、ポリエチレングリコール又は電気刺激等により行ってよい。ハイブリドーマを作製後、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で培養することにより、脾細胞と腫瘍細胞のハイブリドーマを選択できる。選択したハイブリドーマを１個／ウェルで播種し直すことで、抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。培養上清は、さらに、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、又は、プロテインＡ／Ｇクロマト法等を用いて精製することで、例えば、ＩｇＧ画分（ＩｇＧ抗体）へと精製してもよい。
【0019】
本発明においては、抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体のうち、中和活性を有するモノクローナル抗体であるから、前記のハイブリドーマ中からＩＬ－２６中和活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する必要がある。その選択法としては、例えば、ヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５の細胞膜上のＩＣＡＭ－１の発現は、ＩＬ－２６刺激により増強されるので、このＣＯＬＯ ２０５の細胞膜上のＩＣＡＭ－１発現増強阻害作用を検討することにより評価できる。また、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣの細胞増殖および管形成能は、ＩＬ－２６刺激により促進されるので、このＨＵＶＥＣの細胞増殖および管形成能促進阻害作用を検討することにより評価できる。
【0020】
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの具体例としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７７として寄託されたハイブリドーマ（６９－１０）、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５７８として寄託されたハイブリドーマ（２０－３）、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５７９として寄託されたハイブリドーマ（３１－４）、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ０２５８０として寄託されたハイブリドーマ（２－２）が挙げられる。ここでハイブリドーマの寄託機関は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターである。
【0021】
また、本発明のモノクローナル抗体には、これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって認識（結合）されるエピトープに結合する抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であってよい。これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と、当該抗体によって認識されるエピトープに結合する抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とは、実質的に又は完全に同一のエピトープを認識し結合するのが好ましい。実質的に同一のエピトープとは、抗体又はその抗原結合性断片の結合性には影響を与えないアミノ酸の修飾、置換、付加、欠失等を有するエピトープを指してもよい。あるいは、これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の相補性決定領域を有する抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片も、本発明の範囲内に含まれる。これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と、当該抗体の相補性決定領域を有する抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とは、実質的に又は完全に同一の相補性決定領域を有するのが好ましい。実質的に同一の相補性決定領域とは、抗体又はその抗原結合性断片の結合性には影響を与えないアミノ酸の修飾、置換、付加、欠失等を受けている相補性決定領域を指してもよい。
【0022】
あるいは、本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような、遺伝子組換え技術により作製されてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号及び第６，２６５，１５０号）。本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用といった、従来的な方法を使用することで、単離し、配列決定することができる。当該ＤＮＡを単離後に発現ベクターに組み込んで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は、当該発現ベクターが導入されない限り免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞に遺伝子導入することにより、本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を産生させてもよい。
【0023】
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、所望により、修飾してもよい。抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシート又はヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性の状態；又は、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等）によって達成してよい。
本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｄ－アミノ酸（Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン、α－メチル－ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。
例えば、天然に存在するアミノ酸残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失又は置換を適宜行ってもよい。
また、抗体の適切な立体構造を維持するのには関与しない任意のシステイン残基を置換することにより（通常はセリンと置換する）、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋形成を防いでもよい。逆に、抗原結合性断片がＦｖ断片等の抗体断片である場合、システイン結合を抗原結合性断片に付加することにより、抗原結合性断片の安定性を向上させることができる。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾は、１つ以上のアミノ酸の変化又は修飾であってもよく、可変領域等の領域の完全な再設計であってもよい。可変領域における変化は、結合親和性及び/又は特異性を変化させ得る。一実施態様において、１～５個以下の保存的なアミノ酸置換をＣＤＲ上で行ってよい。他の実施態様において、１～３個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲ３上で行ってよい。さらなる別の実施態様において、ＣＤＲはＣＤＲＨ３及び/又はＣＤＲＬ３であってよい。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化又はリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ－結合型又はＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、及び、アスパラギン－Ｘ－システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体又はその抗原結合性断片に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ－結合型グリコシル化は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又は、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリン又はスレオニン）への結合であってよく、場合により、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。
本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｄ－アミノ酸（Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン、α－メチル－ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。
例えば、天然に存在するアミノ酸残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失又は置換を適宜行ってもよい。
また、抗体の適切な立体構造を維持するのには関与しない任意のシステイン残基を置換することにより（通常はセリンと置換する）、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋形成を防いでもよい。逆に、抗原結合性断片がＦｖ断片等の抗体断片である場合、システイン結合を抗原結合性断片に付加することにより、抗原結合性断片の安定性を向上させることができる。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾は、１つ以上のアミノ酸の変化又は修飾であってもよく、可変領域等の領域の完全な再設計であってもよい。可変領域における変化は、結合親和性及び/又は特異性を変化させ得る。一実施態様において、１～５個以下の保存的なアミノ酸置換をＣＤＲ上で行ってよい。他の実施態様において、１～３個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲ３上で行ってよい。さらなる別の実施態様において、ＣＤＲはＣＤＲＨ３及び/又はＣＤＲＬ３であってよい。
抗体又はその抗原結合性断片を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化又はリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ－結合型又はＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、及び、アスパラギン－Ｘ－システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体又はその抗原結合性断片に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ－結合型グリコシル化は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又は、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリン又はスレオニン）への結合であってよく、場合により、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。
【0024】
本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、後記実施例に示すように、ヒトＩＬ－２６の活性を阻害し、ＩＬ－２６活性が増強することによって生じる種々の疾患の治療薬として有用である。ここで、ＩＬ－２６が関連する疾患としては、難治性免疫異常症及びがんが挙げられる。具体的な対象疾患としては、急性又は慢性移植片対宿主病、移植後拒絶反応、自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎、がん、特発性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、閉塞性細気管支炎、ウイルス性肝炎、肝硬変、腎硬化症、慢性糸球体腎炎及び特発性ネフローゼ症候群から選ばれる疾患が挙げられる。ここで自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、血管炎症候群、混合性結合組織病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、Ｉ型糖尿病、天疱瘡、類天疱瘡、習慣性流産、原因病及び自己免疫性視神経炎から選ばれる疾患が挙げられる。また、がんとしては、例えば、頭頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、子宮頚癌、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。
【0025】
本発明の医薬は、抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有するが、これらの有効成分及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物として提供するのが好ましい。
【0026】
そのような医薬組成物としては、注射剤、経口剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が挙げられるが、注射剤がより好ましい。
【0027】
注射剤を調製する場合は、本発明の抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内又は静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、それぞれ、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。
【0028】
本発明の医薬、疾患、患者の症状などにより相違するか、注射剤の場合、有効成分として通常成人１回当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇを１日１回又は２～４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【0029】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【0030】
１．研究方法
（１）細胞
ヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５はＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）より購入し、マウスリンパ腫細胞Ａ２０に、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞（Ａ２０－ｌｕｃ）は、Ｄｒ．Ｘｉａｏ Ｃｈｅｎ （Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）の好意により提供された（Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（１９）：３９７０－８０．）。ＣＯＬＯ２０５とＡ２０－ｌｕｃは、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と１０％ＦＢＳ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣはＬＯＮＺＡ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）より購入し、ＥＧＭ培地（ＬＯＮＺＡ）で培養した。細胞培養は全て５％ ＣＯ２、３７℃の環境で行った。ヒト臍帯血単核球は、ヒト臍帯血からフィコール密度勾配法で単離した単核球をＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入した。
（１）細胞
ヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５はＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）より購入し、マウスリンパ腫細胞Ａ２０に、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞（Ａ２０－ｌｕｃ）は、Ｄｒ．Ｘｉａｏ Ｃｈｅｎ （Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）の好意により提供された（Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（１９）：３９７０－８０．）。ＣＯＬＯ２０５とＡ２０－ｌｕｃは、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と１０％ＦＢＳ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣはＬＯＮＺＡ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）より購入し、ＥＧＭ培地（ＬＯＮＺＡ）で培養した。細胞培養は全て５％ ＣＯ２、３７℃の環境で行った。ヒト臍帯血単核球は、ヒト臍帯血からフィコール密度勾配法で単離した単核球をＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより購入した。
【0031】
（２）研究に用いた抗ヒトＩＬ－２６抗体および組換えヒトＩＬ－２６
新たに樹立したＩＬ－２６モノクローナル抗体の比較対照として、市販されているＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＬＬ０７，カタログ番号ｓｃ－８０５２３）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ５１０４１４，カタログ番号ＭＡＢ１３７５１）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのヤギ抗ヒトＩＬ－２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１３７５）を用いた。用いたＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＩＬ－２６ポリクローナル抗体は、これまでに複数の論文でＩＬ－２６の活性を阻害することが報告されている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（３２）：３３３４３－５１．；Ｇｕｔ．２０１５；６４（９）：１４６６－７５．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（８）：３６９７－７１２．）。アイソタイプ対照抗体としてＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のマウスＩｇＧ1,κモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＧ１－４５，カタログ番号４０１４０４）を用いた。マウスに免疫する組換えヒトＩＬ－２６はＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＩＬ－２６モノマー（カタログ番号１３７５－ＩＬ－０２５／ＣＦ）を、細胞を刺激するための組換えヒトＩＬ－２６はＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＩＬ－２６ダイマー（カタログ番号１８７０－ＩＬ－０１０／ＣＦ）を用いた。
新たに樹立したＩＬ－２６モノクローナル抗体の比較対照として、市販されているＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＬＬ０７，カタログ番号ｓｃ－８０５２３）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ５１０４１４，カタログ番号ＭＡＢ１３７５１）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのヤギ抗ヒトＩＬ－２６ポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＦ１３７５）を用いた。用いたＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＩＬ－２６ポリクローナル抗体は、これまでに複数の論文でＩＬ－２６の活性を阻害することが報告されている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（３２）：３３３４３－５１．；Ｇｕｔ．２０１５；６４（９）：１４６６－７５．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（８）：３６９７－７１２．）。アイソタイプ対照抗体としてＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のマウスＩｇＧ1,κモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＧ１－４５，カタログ番号４０１４０４）を用いた。マウスに免疫する組換えヒトＩＬ－２６はＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＩＬ－２６モノマー（カタログ番号１３７５－ＩＬ－０２５／ＣＦ）を、細胞を刺激するための組換えヒトＩＬ－２６はＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＩＬ－２６ダイマー（カタログ番号１８７０－ＩＬ－０１０／ＣＦ）を用いた。
【0032】
（３）マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウス、♀は日本クレア（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６を遺伝子背景とした、ヒトＩＬ２６及びＩＦＮＧ遺伝子を含む１９０ｋｂのバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）遺伝子導入（ｈＩＬ２６－ＩＦＮＧ Ｔｇ）マウスならびにＩＦＮＧ転写開始部位の７７ｋｂ上流に位置する保存された非コード配列（ＣＮＳ）を欠損しているＢＡＣ Ｔｇ（ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇ）マウスは、Ｔｈｏｍａｓ Ａｕｎｅの研究室で開発された（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１８５（３）：１４９２－５０１．；Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．２０１２；１３（６）：４８１－８．）。ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ＲγＫＯ Ｊｉｃ（Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／Ｊｉｃ）マウス（以下、ＮＯＧマウス）、♀は、実験動物中央研究所（Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｊａｐａｎ）から購入した。すべてのマウスは特定病原体除去施設においてマイクロアイソレーターケージ内で飼育した。マウスは８－１４週齢を使用した。動物実験は施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）で承認されたプロトコルに従って行った。
ＢＡＬＢ／ｃマウス、♀は日本クレア（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６を遺伝子背景とした、ヒトＩＬ２６及びＩＦＮＧ遺伝子を含む１９０ｋｂのバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）遺伝子導入（ｈＩＬ２６－ＩＦＮＧ Ｔｇ）マウスならびにＩＦＮＧ転写開始部位の７７ｋｂ上流に位置する保存された非コード配列（ＣＮＳ）を欠損しているＢＡＣ Ｔｇ（ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇ）マウスは、Ｔｈｏｍａｓ Ａｕｎｅの研究室で開発された（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１８５（３）：１４９２－５０１．；Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．２０１２；１３（６）：４８１－８．）。ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ＲγＫＯ Ｊｉｃ（Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／Ｊｉｃ）マウス（以下、ＮＯＧマウス）、♀は、実験動物中央研究所（Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｊａｐａｎ）から購入した。すべてのマウスは特定病原体除去施設においてマイクロアイソレーターケージ内で飼育した。マウスは８－１４週齢を使用した。動物実験は施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）で承認されたプロトコルに従って行った。
【0033】
（４） マウスへの免疫とハイブリドーマの作製
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの組換えヒトＩＬ－２６タンパク（ヒトＩＬ－２６の２２番目から１７１番目のアミノ酸残基を大腸菌に発現させたもの）４０μｇ／５０μＬと、合成コポリマー系アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）５０μＬとを混合して、１匹あたり１００μＬ／ｄｏｓｅでＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。２週間ごとに合計５回皮下注射を行い、最後に尾静脈に上記の半量である５０μＬを静脈注射した。３日後にマウスを解剖して得た粗精製脾細胞と、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞とを、１：１で混合し、ポリエチレングリコールで細胞融合してハイブリドーマを作製した。細胞を洗浄した後、５％ ＢｒｉＣｌｏｎｅ（ＮＩＣＢ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ，カタログ番号ＢＲＢＲ００１）とＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加したＧＩＴ培地（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で当該細胞を懸濁してから、９６ウェル平底プレートに播種した。生育したハイブリドーマの培養上清を回収し、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）によって、抗ヒトＩＬ－２６抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行い、陽性であったハイブリドーマを選出した後、中和活性の検討を行った。中和活性を有する抗体を産生するハイブリドーマを９６ウェル平底プレートに１個／ウェルで播種し直し、複数の単クローンを選出した。目的の抗体を含む細胞培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｇＧ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてＩｇＧ画分を精製した。
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの組換えヒトＩＬ－２６タンパク（ヒトＩＬ－２６の２２番目から１７１番目のアミノ酸残基を大腸菌に発現させたもの）４０μｇ／５０μＬと、合成コポリマー系アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）５０μＬとを混合して、１匹あたり１００μＬ／ｄｏｓｅでＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。２週間ごとに合計５回皮下注射を行い、最後に尾静脈に上記の半量である５０μＬを静脈注射した。３日後にマウスを解剖して得た粗精製脾細胞と、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞とを、１：１で混合し、ポリエチレングリコールで細胞融合してハイブリドーマを作製した。細胞を洗浄した後、５％ ＢｒｉＣｌｏｎｅ（ＮＩＣＢ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ，カタログ番号ＢＲＢＲ００１）とＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加したＧＩＴ培地（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で当該細胞を懸濁してから、９６ウェル平底プレートに播種した。生育したハイブリドーマの培養上清を回収し、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）によって、抗ヒトＩＬ－２６抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行い、陽性であったハイブリドーマを選出した後、中和活性の検討を行った。中和活性を有する抗体を産生するハイブリドーマを９６ウェル平底プレートに１個／ウェルで播種し直し、複数の単クローンを選出した。目的の抗体を含む細胞培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｇＧ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてＩｇＧ画分を精製した。
【0034】
（５） ＥＬＩＳＡ
抗ヒトＩＬ－２６抗体産生ハイブリドーマの最初のスクリーニングでは、組換えヒトＩＬ－２６モノマーを炭酸塩／重炭酸塩バッファー（ＣＢＢ）に希釈し、５０ｎｇ／ｗｅｌｌでイムノプレート（ＮＵＮＣ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に添加して４℃で一晩静置した。陰性コントロールとしてＣＢＢのみをプレートに添加し、ヒトＩＬ－２６をコートしない群を用意した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄後、２％ＢｌｏｃｋＡｃｅ（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加して室温で１時間静置することでプレートをブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、一次抗体としてＰＢＳで２倍に希釈したハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号５５４００２）をＰＢＳ－Ｔで５００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を添加して発色させた後、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。培養上清から精製したＩｇＧ画分のＩＬ－２６への結合性の検討では、組換えヒトＩＬ－２６モノマーまたは組換えヒトＩＬ－１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をＣＢＢに希釈し、２－１００ｎｇ／ｗｅｌｌでイムノプレートに添加して４℃で一晩静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、２％ＢｌｏｃｋＡｃｅを添加して室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、一次抗体として精製した新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体をＲＰＭＩ－１６４０培地で１０μｇ／ｍＬに調整した溶液を添加し、室温で１時間静置した。以降の手順は上記と同様の方法で行い、４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。データはＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で解析した。
抗ヒトＩＬ－２６抗体産生ハイブリドーマの最初のスクリーニングでは、組換えヒトＩＬ－２６モノマーを炭酸塩／重炭酸塩バッファー（ＣＢＢ）に希釈し、５０ｎｇ／ｗｅｌｌでイムノプレート（ＮＵＮＣ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に添加して４℃で一晩静置した。陰性コントロールとしてＣＢＢのみをプレートに添加し、ヒトＩＬ－２６をコートしない群を用意した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄後、２％ＢｌｏｃｋＡｃｅ（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加して室温で１時間静置することでプレートをブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、一次抗体としてＰＢＳで２倍に希釈したハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号５５４００２）をＰＢＳ－Ｔで５００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を添加して発色させた後、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。培養上清から精製したＩｇＧ画分のＩＬ－２６への結合性の検討では、組換えヒトＩＬ－２６モノマーまたは組換えヒトＩＬ－１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をＣＢＢに希釈し、２－１００ｎｇ／ｗｅｌｌでイムノプレートに添加して４℃で一晩静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、２％ＢｌｏｃｋＡｃｅを添加して室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、一次抗体として精製した新規マウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体をＲＰＭＩ－１６４０培地で１０μｇ／ｍＬに調整した溶液を添加し、室温で１時間静置した。以降の手順は上記と同様の方法で行い、４５０ｎｍの吸収波長と５７０ｎｍのレファレンス波長とを測定した。データはＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で解析した。
【0035】
（６） ＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ－１発現解析
ＣＯＬＯ ２０５を９６ウェル平底プレートに５×１０4個／ウェルとなるよう播種し、対照マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の存在下、不存在下で組換えヒトＩＬ－２６ダイマー（２０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間培養後に細胞を回収し、１％ＦＢＳと０．１％アジ化ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳ（ＦＣＭバッファー）で洗浄した。その後、Ｂａｙ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）のＰＥ標識マウス抗ヒトＩＣＡＭ－１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ １５．２，カタログ番号５０－０５４９－Ｔ１００）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＰＥ標識マウスＩｇＧ1,κアイソタイプ対照モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＯＰＣ－２１，カタログ番号４００１１４）をＦＣＭバッファーで５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／サンプルで添加し、４℃で２５分静置した。その後、細胞を氷冷ＦＣＭバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で解析した。
ＣＯＬＯ ２０５を９６ウェル平底プレートに５×１０4個／ウェルとなるよう播種し、対照マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の存在下、不存在下で組換えヒトＩＬ－２６ダイマー（２０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間培養後に細胞を回収し、１％ＦＢＳと０．１％アジ化ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳ（ＦＣＭバッファー）で洗浄した。その後、Ｂａｙ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）のＰＥ標識マウス抗ヒトＩＣＡＭ－１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ １５．２，カタログ番号５０－０５４９－Ｔ１００）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＰＥ標識マウスＩｇＧ1,κアイソタイプ対照モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＯＰＣ－２１，カタログ番号４００１１４）をＦＣＭバッファーで５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／サンプルで添加し、４℃で２５分静置した。その後、細胞を氷冷ＦＣＭバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で解析した。
【0036】
（７） ＨＵＶＥＣの細胞増殖試験
ＨＵＶＥＣを、増殖因子を半減した２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地中に９６ウェル平底プレートに５×１０3個／ウェルとなるよう播種し、３７℃で１２時間培養した。その後、培地を吸引し、増殖因子を含まない２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地で、組換えヒトＩＬ－２６ダイマーを最終濃度３ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ、組換えヒトＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整して、細胞に添加した。ＩＬ－２６の中和試験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで添加した。刺激を開始して４８時間の細胞増殖を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）によって成育可能面積中の細胞の割合を算出することで評価した。
ＨＵＶＥＣを、増殖因子を半減した２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地中に９６ウェル平底プレートに５×１０3個／ウェルとなるよう播種し、３７℃で１２時間培養した。その後、培地を吸引し、増殖因子を含まない２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地で、組換えヒトＩＬ－２６ダイマーを最終濃度３ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ、組換えヒトＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整して、細胞に添加した。ＩＬ－２６の中和試験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで添加した。刺激を開始して４８時間の細胞増殖を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）によって成育可能面積中の細胞の割合を算出することで評価した。
【0037】
（８） ＨＵＶＥＣの管形成試験
培養ディッシュ中でＨＵＶＥＣの培地を、増殖因子を半減した２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地に置換して３７℃で一晩培養した。その後、９６ウェル平底プレートにＣｕｌｔｒｅｘ ＰａｔｈＣｌｅａｒ増殖因子減量基底膜抽出物（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３４３３－００５－０１）を５０μＬ／ウェルで添加し、増殖因子を含まない２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地中にＨＵＶＥＣを１．５×１０4個／ウェルとなるよう播種した。同じ培地で組換えヒトＩＬ－２６ダイマーを最終濃度３ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ、組換えヒトＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整し、細胞に添加した。ＩＬ－２６の中和試験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで添加した。刺激を開始して９時間の管形成を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭを用いて評価した。管形成の長さをＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で解析した。
培養ディッシュ中でＨＵＶＥＣの培地を、増殖因子を半減した２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地に置換して３７℃で一晩培養した。その後、９６ウェル平底プレートにＣｕｌｔｒｅｘ ＰａｔｈＣｌｅａｒ増殖因子減量基底膜抽出物（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３４３３－００５－０１）を５０μＬ／ウェルで添加し、増殖因子を含まない２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ培地中にＨＵＶＥＣを１．５×１０4個／ウェルとなるよう播種した。同じ培地で組換えヒトＩＬ－２６ダイマーを最終濃度３ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ、組換えヒトＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるよう調整し、細胞に添加した。ＩＬ－２６の中和試験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで添加した。刺激を開始して９時間の管形成を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭを用いて評価した。管形成の長さをＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で解析した。
【0038】
（９） イミキモド誘導性乾癬モデル
ｈＩＬ２６－ＩＦＮＧ Ｔｇマウス及びΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスの背中の毛を剃り、５％イミキモド含有クリーム（ベセルナクリーム；Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）２０ｍｇを背中の皮膚に５日連続で（０日目から４日目まで）塗布した。抗体による治療実験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで０日目、２日目、４日目に１日おきに投与した。抗体溶液は無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）腹腔内注射した。背中の皮膚の炎症の重症度を、臨床のＰｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）に基づき毎日スコア化した。皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚それぞれに対し、「正常」をスコア０、「やや悪化」をスコア１、「中程度に悪化」をスコア２、「顕著に悪化」をスコア３、「極めて顕著に悪化」をスコア４とした０－４までのスコアを付け、累計スコア（０－１２）とともに示した（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１１７２４．）。
ｈＩＬ２６－ＩＦＮＧ Ｔｇマウス及びΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスの背中の毛を剃り、５％イミキモド含有クリーム（ベセルナクリーム；Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）２０ｍｇを背中の皮膚に５日連続で（０日目から４日目まで）塗布した。抗体による治療実験では、対照マウスＩｇＧ、新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を単独、または組み合わせで０日目、２日目、４日目に１日おきに投与した。抗体溶液は無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）腹腔内注射した。背中の皮膚の炎症の重症度を、臨床のＰｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）に基づき毎日スコア化した。皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚それぞれに対し、「正常」をスコア０、「やや悪化」をスコア１、「中程度に悪化」をスコア２、「顕著に悪化」をスコア３、「極めて顕著に悪化」をスコア４とした０－４までのスコアを付け、累計スコア（０－１２）とともに示した（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１１７２４．）。
【0039】
（１０） 皮膚切片のＨ＆Ｅ染色及び免疫蛍光染色
イミキモド含有クリームを塗布したｈＩＬ２６－ＩＦＮＧ Ｔｇマウス及びΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスを解剖した後、背中の皮膚を切除して１０％ホルマリン溶液（Ｗａｋｏ）の中で室温で固定し、パラフィンに包埋した後、５μｍ厚の切片を作製し、スライドガラスに載せてヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色を行った。光学顕微鏡の画像はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影した。免疫蛍光染色では、背中の皮膚を４％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中で４℃で一晩静置した。固定した組織を２０％スクロース（Ｗａｋｏ）に置換して４℃で一晩静置し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋して、－８０℃で保存した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて５μｍ厚の凍結切片を作製した。１％パラホルムアルデヒドに室温で１０分間浸し、風乾させた後、１０％正常ロバ血清を添加して室温で１時間静置することでブロッキングした。ＰＢＳで洗浄後、一次抗体としてＤａｋｏ ＲＥＡＬ抗体希釈液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でウサギ抗マウス、ヒト、ブタＣＤ３１ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，カタログ番号ａｂ２８３６４）を３０倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、またはラット抗マウスＬｙ６ｇモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，ｃｌｏｎｅ ＲＢ６－８Ｃ５，カタログ番号ａｂ２５３７７）を１００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてＤａｋｏ ＲＥＡＬ抗体希釈液でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ロバ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ａ－２１２０６）を２００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ロバ抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，カタログ番号ａｂ１５０１５３）を３００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、スライドカラスにＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用封入剤ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、カバーガラスをのせてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡で画像を撮影した。
イミキモド含有クリームを塗布したｈＩＬ２６－ＩＦＮＧ Ｔｇマウス及びΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスを解剖した後、背中の皮膚を切除して１０％ホルマリン溶液（Ｗａｋｏ）の中で室温で固定し、パラフィンに包埋した後、５μｍ厚の切片を作製し、スライドガラスに載せてヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色を行った。光学顕微鏡の画像はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影した。免疫蛍光染色では、背中の皮膚を４％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中で４℃で一晩静置した。固定した組織を２０％スクロース（Ｗａｋｏ）に置換して４℃で一晩静置し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋して、－８０℃で保存した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて５μｍ厚の凍結切片を作製した。１％パラホルムアルデヒドに室温で１０分間浸し、風乾させた後、１０％正常ロバ血清を添加して室温で１時間静置することでブロッキングした。ＰＢＳで洗浄後、一次抗体としてＤａｋｏ ＲＥＡＬ抗体希釈液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でウサギ抗マウス、ヒト、ブタＣＤ３１ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，カタログ番号ａｂ２８３６４）を３０倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、またはラット抗マウスＬｙ６ｇモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，ｃｌｏｎｅ ＲＢ６－８Ｃ５，カタログ番号ａｂ２５３７７）を１００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてＤａｋｏ ＲＥＡＬ抗体希釈液でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ロバ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ａ－２１２０６）を２００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ロバ抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，カタログ番号ａｂ１５０１５３）を３００倍希釈した溶液（濃度は製品に記載なし）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、スライドカラスにＤＡＰＩを含む蛍光褪色防止用封入剤ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、カバーガラスをのせてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡で画像を撮影した。
【0040】
（１１） 異種慢性ＧＶＨＤモデル
－１日目に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施した。０日目に、ＮＯＧマウスの尾静脈からヒト臍帯血単核球５×１０6個を移植した。ＧＶＨＤを発症しない比較対照として、ヒト臍帯血単核球からＨｕｍａｎ ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，カタログ番号１３０－０４６－７０３）を用いてＣＤ３４+ 細胞（造血幹細胞画分）を精製し、ＮＯＧマウスの尾静脈から１×１０5個を移植した。マウスの生存評価は毎日行い、体重は週に２回測定した。抗体による治療実験では、対照マウスＩｇＧ、または新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体（クローン６９－１０）を、軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植＋２８日目から投与した。抗体溶液は無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）ずつ週に２回、腹腔内注射した。レシピエント（ＮＯＧマウス）体内でのドナー白血球の生着を計測するため、マウスの尻尾から５０－１００μＬ採血し、遠心して血漿を分離した後、血球懸濁液５０μＬにＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ８ａ，カタログ番号５５５６３４）を４０倍希釈（濃度は製品に記載なし）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識マウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ４，カタログ番号３００５３０）を５０倍希釈（濃度は製品に記載なし）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，ｃｌｏｎｅ ＨＩ３０，カタログ番号３０４０１２）を４０倍希釈（濃度は製品に記載なし）で直接添加し、ヒトリンパ球セブセットマーカーの染色を行い、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して赤血球を溶解した後、フローサイトメトリーにて解析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏで解析した。
－１日目に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施した。０日目に、ＮＯＧマウスの尾静脈からヒト臍帯血単核球５×１０6個を移植した。ＧＶＨＤを発症しない比較対照として、ヒト臍帯血単核球からＨｕｍａｎ ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，カタログ番号１３０－０４６－７０３）を用いてＣＤ３４+ 細胞（造血幹細胞画分）を精製し、ＮＯＧマウスの尾静脈から１×１０5個を移植した。マウスの生存評価は毎日行い、体重は週に２回測定した。抗体による治療実験では、対照マウスＩｇＧ、または新たに樹立した抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体（クローン６９－１０）を、軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植＋２８日目から投与した。抗体溶液は無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）ずつ週に２回、腹腔内注射した。レシピエント（ＮＯＧマウス）体内でのドナー白血球の生着を計測するため、マウスの尻尾から５０－１００μＬ採血し、遠心して血漿を分離した後、血球懸濁液５０μＬにＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ８ａ，カタログ番号５５５６３４）を４０倍希釈（濃度は製品に記載なし）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識マウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ４，カタログ番号３００５３０）を５０倍希釈（濃度は製品に記載なし）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，ｃｌｏｎｅ ＨＩ３０，カタログ番号３０４０１２）を４０倍希釈（濃度は製品に記載なし）で直接添加し、ヒトリンパ球セブセットマーカーの染色を行い、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して赤血球を溶解した後、フローサイトメトリーにて解析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定を行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏで解析した。
【0041】
（１２） 組織学的評価
マウスを解剖した後、背中の皮膚、肺、肝臓、腸管を切除して１０％ホルマリン溶液（Ｗａｋｏ）の中で室温で固定し、パラフィンに包埋した後、５μｍ厚の切片を作製し、スライドガラスに載せてヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色を行った。光学顕微鏡の画像は、ＯｌｙｍｐｕｓデジタルカメラＤＰ２５接続Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影し、ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを用いた。
マウスを解剖した後、背中の皮膚、肺、肝臓、腸管を切除して１０％ホルマリン溶液（Ｗａｋｏ）の中で室温で固定し、パラフィンに包埋した後、５μｍ厚の切片を作製し、スライドガラスに載せてヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色を行った。光学顕微鏡の画像は、ＯｌｙｍｐｕｓデジタルカメラＤＰ２５接続Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影し、ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを用いた。
【0042】
（１３） ＧＶＴ効果及び生物発光イメージング
－１日目に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施した。０日目に、ＮＯＧマウスの尾静脈からヒト臍帯血単核球５×１０6個を移植した。移植後＋２８日目に尾静脈からＮＯＧマウスと同じ遺伝的背景（Ｈ－２d）のマウスリンパ腫細胞Ａ２０－ｌｕｃ細胞１×１０5個を播種した。その翌日＋２９日目から、無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した対照マウスＩｇＧ、またはＩＬ－２６モノクローナル抗体（クローン６９－１０）を、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）ずつ週に２回、腹腔内注射した。生体内生物発光イメージングを用いて腫瘍細胞の測定を週２回行った。イソフルランガス麻酔下で、無菌ＰＢＳで１５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したＤ－ルシフェリンカリウム（Ｗａｋｏ，カタログ番号１２６－０５１１６）を、１匹あたり２００μＬずつ腹腔内注射した。基質となるルシフェリンを注射して５分後、１０分後の生体内生物発光をＣａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて撮影した。Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を用いて画像データの発光強度を定量化し、Ｔｏｔａｌ Ｆｌｕｘ（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃｏｎｄ）として示した。
－１日目に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施した。０日目に、ＮＯＧマウスの尾静脈からヒト臍帯血単核球５×１０6個を移植した。移植後＋２８日目に尾静脈からＮＯＧマウスと同じ遺伝的背景（Ｈ－２d）のマウスリンパ腫細胞Ａ２０－ｌｕｃ細胞１×１０5個を播種した。その翌日＋２９日目から、無菌ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した対照マウスＩｇＧ、またはＩＬ－２６モノクローナル抗体（クローン６９－１０）を、１匹あたり２００μＬ（２００μｇ）ずつ週に２回、腹腔内注射した。生体内生物発光イメージングを用いて腫瘍細胞の測定を週２回行った。イソフルランガス麻酔下で、無菌ＰＢＳで１５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したＤ－ルシフェリンカリウム（Ｗａｋｏ，カタログ番号１２６－０５１１６）を、１匹あたり２００μＬずつ腹腔内注射した。基質となるルシフェリンを注射して５分後、１０分後の生体内生物発光をＣａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて撮影した。Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を用いて画像データの発光強度を定量化し、Ｔｏｔａｌ Ｆｌｕｘ（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃｏｎｄ）として示した。
【0043】
（１４） 統計
データは、２群比較では両側スチューデントｔ検定によって、多重比較ではＡＮＯＶＡ検定とそれに続くＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒポストホック検定によって解析した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。生存率はＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を用いてログランク検定によって解析した。エクセル統計（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して計算を実施し、グラフを作成した。
データは、２群比較では両側スチューデントｔ検定によって、多重比較ではＡＮＯＶＡ検定とそれに続くＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒポストホック検定によって解析した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。生存率はＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を用いてログランク検定によって解析した。エクセル統計（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して計算を実施し、グラフを作成した。
【0044】
２．結果
（１） 新規モノクローナル抗体のＩＬ－２６に対する結合性
上述のとおり、組換えヒトＩＬ－２６を免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの粗精製脾細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞とをポリエチレングリコールで細胞融合させ、生育したハイブリドーマからマウス抗ヒトＩＬ－２６抗体を含む培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによる一次スクリーニングを行った。その結果、抗ヒトＩＬ－２６抗体を安定して産生する９０クローンを得た（データ未掲載）。次に、ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いて上記９０クローンのＩＬ－２６の中和活性評価を行い、部分的にＩＬ－２６の活性を阻害できる７クローンを得た（データ未掲載）。その中でも、組み合わせることでＩＬ－２６の活性を相加的に阻害できる４クローン（クローン２－２，２０－３，３１－４，６９－１０）を見出した。
そこで、それら４クローンの培養上清からＩｇＧ画分を精製し、ヒトＩＬ－２６に対する結合性をＥＬＩＳＡで検討した。図１Ａに示すように、本発明者らが樹立したマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体では、プレートに固相化したＩＬ－２６濃度依存的な吸光値の上昇が見られた。なかでも、クローン２０－３とクローン６９－１０は、ＥＬＩＳＡにおいてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体よりもＩＬ－２６に対する結合性が非常に高いことが示された。ＩＬ－２６はＩＬ－１０ ｆａｍｉｌｙに属するサイトカインであり、ヒトＩＬ－２６はヒトＩＬ－１０と２４．７％のアミノ酸相同性を示す（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（８）：３８８１－７．）。そこで、ヒトＩＬ－２６に特異的に結合することの確認として、ヒトＩＬ－１０に対する結合性をＥＬＩＳＡで検討した結果、すべての抗体でいずれの濃度でもＩＬ－１０に対する結合は認められないことが示された（図１Ｂ）。これらの結果から、樹立した４クローンはヒトＩＬ－２６に特異的なモノクローナル抗体であることが示された。
（１） 新規モノクローナル抗体のＩＬ－２６に対する結合性
上述のとおり、組換えヒトＩＬ－２６を免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの粗精製脾細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞とをポリエチレングリコールで細胞融合させ、生育したハイブリドーマからマウス抗ヒトＩＬ－２６抗体を含む培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによる一次スクリーニングを行った。その結果、抗ヒトＩＬ－２６抗体を安定して産生する９０クローンを得た（データ未掲載）。次に、ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いて上記９０クローンのＩＬ－２６の中和活性評価を行い、部分的にＩＬ－２６の活性を阻害できる７クローンを得た（データ未掲載）。その中でも、組み合わせることでＩＬ－２６の活性を相加的に阻害できる４クローン（クローン２－２，２０－３，３１－４，６９－１０）を見出した。
そこで、それら４クローンの培養上清からＩｇＧ画分を精製し、ヒトＩＬ－２６に対する結合性をＥＬＩＳＡで検討した。図１Ａに示すように、本発明者らが樹立したマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体では、プレートに固相化したＩＬ－２６濃度依存的な吸光値の上昇が見られた。なかでも、クローン２０－３とクローン６９－１０は、ＥＬＩＳＡにおいてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体よりもＩＬ－２６に対する結合性が非常に高いことが示された。ＩＬ－２６はＩＬ－１０ ｆａｍｉｌｙに属するサイトカインであり、ヒトＩＬ－２６はヒトＩＬ－１０と２４．７％のアミノ酸相同性を示す（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４（８）：３８８１－７．）。そこで、ヒトＩＬ－２６に特異的に結合することの確認として、ヒトＩＬ－１０に対する結合性をＥＬＩＳＡで検討した結果、すべての抗体でいずれの濃度でもＩＬ－１０に対する結合は認められないことが示された（図１Ｂ）。これらの結果から、樹立した４クローンはヒトＩＬ－２６に特異的なモノクローナル抗体であることが示された。
【0045】
（２） 新規モノクローナル抗体のＣＯＬＯ ２０５細胞に対するＩＬ－２６の中和活性
次に、樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の中和活性評価を行った。これまでに、ＩＬ－２６がヒト単球とＮＫ細胞の活性化やヒト好中球の細胞遊走、ケラチノサイトのＩＬ－８産生を顕著に促進することが報告されているが、本発明者らが検討したところ、血液提供者によってＩＬ－２６に対する応答が大きく異なる試験や、ＩＬ－２６で刺激をしても報告されているほど著明な変化が認められない試験が多かった（データ未掲載）。そのなかで、ＩＬ－２６によるヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ－１発現亢進に関しては、実験回ごとの結果の誤差が非常に小さく再現性が極めて高いうえ、簡便かつ２４時間の短期間で抗体の中和活性を評価でき、初代培養の血球細胞と比較して細胞株は細胞調製も容易であることから、多数のモノクローナル抗体の中和活性評価に適したスクリーニング系であることを見出した。
図２Ａに示すように、ＣＯＬＯ ２０５の細胞膜上のＩＣＡＭ－１の発現は、ＩＬ－２６刺激によって増強し、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体クローン２－２，２０－３，３１－４，６９－１０はいずれも部分的にＩＣＡＭ－１の発現増強を阻害した（＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。一方で、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体は、対照マウスＩｇＧ抗体と同様にＩＬ－２６刺激によるＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ－１発現増強を全く阻害しなかった（図２Ａ）。これまでに複数の論文で研究用の中和抗体として使用されているＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＩＬ－２６ポリクローナル抗体は、ＩＬ－２６の活性を完全に阻害した。
ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いた試験では、樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体はいずれも１クローンではＩＬ－２６の活性を完全には阻害できなかったため、樹立した４クローンの中で最も中和活性が強いクローン６９－１０と、その他の３クローンとを組み合わせることでＩＬ－２６の中和効果が増加するかを検討した。その結果、図２Ｂに示すように、ＩＬ－２６刺激によって増強するＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現は、クローン６９－１０単独で部分的に阻害され、さらに６９－１０とクローン２－２，２０－３， ３１－４の２クローンを組み合わせることで、いずれの組み合わせでも阻害効果が有意に増加した（＊対応するクローン６９－１０単独添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、クローン６９－１０単独と比較して、２クローン組み合わせ、３クローン組み合わせ、４クローン組み合わせの効果を検討した結果、クローンを組み合わせるほどより阻害効果が増加することが示された（図２Ｃ）。抗体濃度を高用量の４０μｇ／ｍＬまで上げた場合でも、クローン６９－１０単独ではＩＬ－２６刺激によるＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ－１発現増強を完全には阻害できなかったが、樹立した４クローンの組み合わせによりほぼ完全に阻害できることが示された（図２Ｄ，２Ｅ）。
次に、樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の中和活性評価を行った。これまでに、ＩＬ－２６がヒト単球とＮＫ細胞の活性化やヒト好中球の細胞遊走、ケラチノサイトのＩＬ－８産生を顕著に促進することが報告されているが、本発明者らが検討したところ、血液提供者によってＩＬ－２６に対する応答が大きく異なる試験や、ＩＬ－２６で刺激をしても報告されているほど著明な変化が認められない試験が多かった（データ未掲載）。そのなかで、ＩＬ－２６によるヒト大腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ－１発現亢進に関しては、実験回ごとの結果の誤差が非常に小さく再現性が極めて高いうえ、簡便かつ２４時間の短期間で抗体の中和活性を評価でき、初代培養の血球細胞と比較して細胞株は細胞調製も容易であることから、多数のモノクローナル抗体の中和活性評価に適したスクリーニング系であることを見出した。
図２Ａに示すように、ＣＯＬＯ ２０５の細胞膜上のＩＣＡＭ－１の発現は、ＩＬ－２６刺激によって増強し、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体クローン２－２，２０－３，３１－４，６９－１０はいずれも部分的にＩＣＡＭ－１の発現増強を阻害した（＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。一方で、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社のマウス抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体は、対照マウスＩｇＧ抗体と同様にＩＬ－２６刺激によるＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ－１発現増強を全く阻害しなかった（図２Ａ）。これまでに複数の論文で研究用の中和抗体として使用されているＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヤギ抗ヒトＩＬ－２６ポリクローナル抗体は、ＩＬ－２６の活性を完全に阻害した。
ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いた試験では、樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体はいずれも１クローンではＩＬ－２６の活性を完全には阻害できなかったため、樹立した４クローンの中で最も中和活性が強いクローン６９－１０と、その他の３クローンとを組み合わせることでＩＬ－２６の中和効果が増加するかを検討した。その結果、図２Ｂに示すように、ＩＬ－２６刺激によって増強するＣＯＬＯ ２０５細胞のＩＣＡＭ－１の発現は、クローン６９－１０単独で部分的に阻害され、さらに６９－１０とクローン２－２，２０－３， ３１－４の２クローンを組み合わせることで、いずれの組み合わせでも阻害効果が有意に増加した（＊対応するクローン６９－１０単独添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、クローン６９－１０単独と比較して、２クローン組み合わせ、３クローン組み合わせ、４クローン組み合わせの効果を検討した結果、クローンを組み合わせるほどより阻害効果が増加することが示された（図２Ｃ）。抗体濃度を高用量の４０μｇ／ｍＬまで上げた場合でも、クローン６９－１０単独ではＩＬ－２６刺激によるＣＯＬＯ ２０５のＩＣＡＭ－１発現増強を完全には阻害できなかったが、樹立した４クローンの組み合わせによりほぼ完全に阻害できることが示された（図２Ｄ，２Ｅ）。
【0046】
（３） 新規モノクローナル抗体のＨＵＶＥＣに対するＩＬ－２６の中和活性
本発明者らは、ＩＬ－２６の新たな機能として、血管内皮細胞の増殖及び管形成を顕著に亢進することを見出した。そこで、ＣＯＬＯ ２０５細胞での評価系に加え、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣを用いての新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の中和活性評価を行った。図３Ａに示すように、ＩＬ－２６刺激によってＨＵＶＥＣの増殖は用量依存的に促進され、代表的な血管新生促進因子の一つであるＶＥＧＦと同程度であった（図３Ａ中、水色線・青色線・緑色線）。ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いた評価系において、１クローン単独でのＩＬ－２６の中和活性が最も強かったクローン６９－１０を添加することで、ＩＬ－２６刺激によって促進されるＨＵＶＥＣの増殖が顕著に抑制されることが示された（図３Ａ中、赤色線；＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、樹立した４クローンの組み合わせにより、ＩＬ－２６の活性は完全に阻害されることが示された（図３Ａ中、オレンジ色線）。
さらにＩＬ－２６は、ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦの存在下で基底膜抽出物中に播種した場合と同程度の明らかな管形成を誘導することを見出した（図３Ｂ－ｉ，３Ｂ－ｉｉ）。このＨＵＶＥＣの管形成においても、クローン６９－１０単独で顕著に抑制され、さらに４クローンの組み合わせではＩＬ－２６の阻害効果がより増加することが示された（図３Ｂ－ｉｉｉ，３Ｂ－ｉｖ；＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。
このことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＬＯ ２０５細胞とＨＵＶＥＣを用いたモノクローナル抗体のＩＬ－２６中和活性評価試験において、クローン６９－１０単独でもＩＬ－２６の中和効果は認められ、さらに４クローンを組み合わせることでほぼ完全にＩＬ－２６の活性を阻害できることが示された。
本発明者らは、ＩＬ－２６の新たな機能として、血管内皮細胞の増殖及び管形成を顕著に亢進することを見出した。そこで、ＣＯＬＯ ２０５細胞での評価系に加え、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣを用いての新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の中和活性評価を行った。図３Ａに示すように、ＩＬ－２６刺激によってＨＵＶＥＣの増殖は用量依存的に促進され、代表的な血管新生促進因子の一つであるＶＥＧＦと同程度であった（図３Ａ中、水色線・青色線・緑色線）。ＣＯＬＯ ２０５細胞を用いた評価系において、１クローン単独でのＩＬ－２６の中和活性が最も強かったクローン６９－１０を添加することで、ＩＬ－２６刺激によって促進されるＨＵＶＥＣの増殖が顕著に抑制されることが示された（図３Ａ中、赤色線；＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。さらに、樹立した４クローンの組み合わせにより、ＩＬ－２６の活性は完全に阻害されることが示された（図３Ａ中、オレンジ色線）。
さらにＩＬ－２６は、ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦの存在下で基底膜抽出物中に播種した場合と同程度の明らかな管形成を誘導することを見出した（図３Ｂ－ｉ，３Ｂ－ｉｉ）。このＨＵＶＥＣの管形成においても、クローン６９－１０単独で顕著に抑制され、さらに４クローンの組み合わせではＩＬ－２６の阻害効果がより増加することが示された（図３Ｂ－ｉｉｉ，３Ｂ－ｉｖ；＊対応する対照マウスＩｇＧ添加群に対してｐ＜０．０１）。
このことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＬＯ ２０５細胞とＨＵＶＥＣを用いたモノクローナル抗体のＩＬ－２６中和活性評価試験において、クローン６９－１０単独でもＩＬ－２６の中和効果は認められ、さらに４クローンを組み合わせることでほぼ完全にＩＬ－２６の活性を阻害できることが示された。
【0047】
（４） イミキモド誘導性乾癬モデルにおける新規モノクローナル抗体の治療効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性評価試験により、中和活性を示す新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を得ることができたため、これらの抗体を用いて難治性免疫異常症及びがんに対する動物実験での治療効果を検討した。ＩＬ－２６はその機能や標的細胞、産生細胞などまだ解明されていない点が多い新規炎症性サイトカインだが、炎症性腸疾患や関節リウマチ、慢性ＧＶＨＤや乾癬、多発性硬化症などの病態への関与が示唆されている。
イミキモドはマウスではトール様受容体７の、ヒトではトール様受容体７と８の強力なアゴニストとして作用し、尖圭コンジローマや日光角化症、表在型基底細胞がんの治療薬として臨床で使われている。イミキモド服用の副作用として、乾癬様の皮膚炎症が報告されており、ヒト乾癬を研究するためのイミキモド誘導性乾癬様マウスモデルが確立された（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２（９）：５８３６－４５．）。イミキモドを塗布したマウスの皮膚は、表皮肥厚、不全角化、乳頭腫症、炎症性細胞浸潤、皮膚の血管増生など多くの乾癬患者の皮膚の特徴を示す。そのため、このイミキモド含有クリームをマウスの皮膚に塗布するモデルは、初期の乾癬病態を研究するための、迅速かつ簡便で費用も効率的なモデルとして、現在、世界中で広く用いられている（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８（１）：４６２－９．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２（９）：４３６１－９．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（１１）：５０９４－１０２．；Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１１７２４．）。ＩＬ－２６はマウスやラット等の齧歯類では欠損しているため、ヒトＩＬ－２６遺伝子を含むバクテリア人工染色体遺伝子導入（ｈＩＬ－２６Ｔｇ）マウスと、ＩＬ－２６を発現しない対照遺伝子導入（ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇ）マウスを用いて、イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるＩＬ－２６の役割と、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を検討した。
図４Ａに示すように、ｈＩＬ－２６ＴｇマウスではΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較して、イミキモドクリームの塗布を開始して２日目から皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚が見られ、３日目以降でいずれの症状も顕著に悪化することが示された。このｈＩＬ－２６Ｔｇマウスに、モノクローナル抗体６９－１０を単独で、または新規モノクローナル抗体４クローンを組み合わせで投与すると、対照マウスＩｇＧ投与群と比較して、乾癬様皮膚症状の進行が顕著に抑制された。ＰＡＳＩスコアによって背中の皮膚の炎症の重症度を評価した結果、ｈＩＬ－２６ＴｇマウスはΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較して、皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚のいずれも悪化が見られるが（図４Ｂ中、青色線・赤色線）、モノクローナル抗体抗体６９－１０を単独で投与した群、ならびに４クローンを組み合わせて投与した群では、ＩＬ－２６を発現しないΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと同程度まで、皮膚症状の顕著な改善が認められた（図４Ｂ中、ピンク色線・オレンジ色線）。そこで次に、イミキモドクリームを塗布したΔＣＮＳ－７７ ＴｇマウスとｈＩＬ－２６Ｔｇマウス、さらにモノクローナル抗体６９－１０を単独で投与した群、ならびに４クローンを組み合わせて投与した群の背中の皮膚を採取して、病理学的解析を行った。図４Ｃに示すように、ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較してｈＩＬ－２６Ｔｇマウスでは、顕著な炎症性細胞の浸潤と血管浸潤、表皮層の肥厚が観察され、モノクローナル抗体６９－１０の単独投与群、ならびに４クローン組み合わせ投与群は、ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスの皮膚と同等のレベルであった。炎症性細胞浸潤と血管増生をより詳細に検討するため、好中球マーカーのＬｙ６ｇと内皮細胞マーカーのＣＤ３１とで皮膚組織の免疫蛍光染色を行った。図４Ｄ，４Ｅに示すように、ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較してｈＩＬ－２６Ｔｇマウスでは、Ｌｙ６ｇ陽性の好中球ならびにＣＤ３１陽性の血管の著明な増加が観察され、新規抗ヒトＩＬ－２６中和抗体投与群ではΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと同等のレベルまで抑制されていた。背中の皮膚を採取して、皮下の血管形成を観察した場合においても、同様の結果が認められた（図４Ｆ）。
これらの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでのイミキモド誘導性乾癬モデルにおいて血管新生および好中球浸潤を抑制し、乾癬様皮膚症状の進行を顕著に抑制することが示された。イミキモド誘導性乾癬モデルでは、クローン６９－１０単独でも新規モノクローナル抗体４クローンの組み合わせと同程度の優れた治療効果を示した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性評価試験により、中和活性を示す新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体を得ることができたため、これらの抗体を用いて難治性免疫異常症及びがんに対する動物実験での治療効果を検討した。ＩＬ－２６はその機能や標的細胞、産生細胞などまだ解明されていない点が多い新規炎症性サイトカインだが、炎症性腸疾患や関節リウマチ、慢性ＧＶＨＤや乾癬、多発性硬化症などの病態への関与が示唆されている。
イミキモドはマウスではトール様受容体７の、ヒトではトール様受容体７と８の強力なアゴニストとして作用し、尖圭コンジローマや日光角化症、表在型基底細胞がんの治療薬として臨床で使われている。イミキモド服用の副作用として、乾癬様の皮膚炎症が報告されており、ヒト乾癬を研究するためのイミキモド誘導性乾癬様マウスモデルが確立された（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２（９）：５８３６－４５．）。イミキモドを塗布したマウスの皮膚は、表皮肥厚、不全角化、乳頭腫症、炎症性細胞浸潤、皮膚の血管増生など多くの乾癬患者の皮膚の特徴を示す。そのため、このイミキモド含有クリームをマウスの皮膚に塗布するモデルは、初期の乾癬病態を研究するための、迅速かつ簡便で費用も効率的なモデルとして、現在、世界中で広く用いられている（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８（１）：４６２－９．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９２（９）：４３６１－９．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（１１）：５０９４－１０２．；Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１１７２４．）。ＩＬ－２６はマウスやラット等の齧歯類では欠損しているため、ヒトＩＬ－２６遺伝子を含むバクテリア人工染色体遺伝子導入（ｈＩＬ－２６Ｔｇ）マウスと、ＩＬ－２６を発現しない対照遺伝子導入（ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇ）マウスを用いて、イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるＩＬ－２６の役割と、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体の治療効果を検討した。
図４Ａに示すように、ｈＩＬ－２６ＴｇマウスではΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較して、イミキモドクリームの塗布を開始して２日目から皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚が見られ、３日目以降でいずれの症状も顕著に悪化することが示された。このｈＩＬ－２６Ｔｇマウスに、モノクローナル抗体６９－１０を単独で、または新規モノクローナル抗体４クローンを組み合わせで投与すると、対照マウスＩｇＧ投与群と比較して、乾癬様皮膚症状の進行が顕著に抑制された。ＰＡＳＩスコアによって背中の皮膚の炎症の重症度を評価した結果、ｈＩＬ－２６ＴｇマウスはΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較して、皮膚の紅斑、鱗屑、肥厚のいずれも悪化が見られるが（図４Ｂ中、青色線・赤色線）、モノクローナル抗体抗体６９－１０を単独で投与した群、ならびに４クローンを組み合わせて投与した群では、ＩＬ－２６を発現しないΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと同程度まで、皮膚症状の顕著な改善が認められた（図４Ｂ中、ピンク色線・オレンジ色線）。そこで次に、イミキモドクリームを塗布したΔＣＮＳ－７７ ＴｇマウスとｈＩＬ－２６Ｔｇマウス、さらにモノクローナル抗体６９－１０を単独で投与した群、ならびに４クローンを組み合わせて投与した群の背中の皮膚を採取して、病理学的解析を行った。図４Ｃに示すように、ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較してｈＩＬ－２６Ｔｇマウスでは、顕著な炎症性細胞の浸潤と血管浸潤、表皮層の肥厚が観察され、モノクローナル抗体６９－１０の単独投与群、ならびに４クローン組み合わせ投与群は、ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスの皮膚と同等のレベルであった。炎症性細胞浸潤と血管増生をより詳細に検討するため、好中球マーカーのＬｙ６ｇと内皮細胞マーカーのＣＤ３１とで皮膚組織の免疫蛍光染色を行った。図４Ｄ，４Ｅに示すように、ΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと比較してｈＩＬ－２６Ｔｇマウスでは、Ｌｙ６ｇ陽性の好中球ならびにＣＤ３１陽性の血管の著明な増加が観察され、新規抗ヒトＩＬ－２６中和抗体投与群ではΔＣＮＳ－７７ Ｔｇマウスと同等のレベルまで抑制されていた。背中の皮膚を採取して、皮下の血管形成を観察した場合においても、同様の結果が認められた（図４Ｆ）。
これらの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでのイミキモド誘導性乾癬モデルにおいて血管新生および好中球浸潤を抑制し、乾癬様皮膚症状の進行を顕著に抑制することが示された。イミキモド誘導性乾癬モデルでは、クローン６９－１０単独でも新規モノクローナル抗体４クローンの組み合わせと同程度の優れた治療効果を示した。
【0048】
（５） 異種慢性ＧＶＨＤモデルにおける新規モノクローナル抗体の治療効果
本発明者らは、重度の免疫不全マウスであるＮＯＧマウスに亜致死量の放射線を照射した後、含まれるＴ細胞のほとんどが抗原感作されていないナイーブであるヒト臍帯血単核球を移植する異種慢性ＧＶＨＤモデルを確立し、ＩＬ－２６が線維芽細胞のコラーゲン産生を増強させ、肺の線維化に極めて重要であることを明らかにした（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（８）：３６９７－７１２．）。そこで同モデルを用いて、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体６９－１０を、被毛の乱れや体重減少など軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植２８日目から投与開始し、慢性ＧＶＨＤに対する治療効果を検討した。
図５Ａ、図５Ｂに示すように、対照マウスＩｇＧ投与群では移植４週目から体重減少が始まり、５週から９週にかけて全てのマウスが死亡した（青色線）。一方で、ＩＬ－２６中和抗体６９－１０投与群では、体重減少が明白に軽減し、生存日数の著明な延長が見られた（図５ＡＢ中、オレンジ色線）。レシピエント（マウス）体内のドナー（ヒト）リンパ球の生着を解析した結果、ＩＬ－２６抗体投与群でも対照マウスＩｇＧ投与群と同程度の生着が認められた（図５Ｃ中、青色線・オレンジ色線）。また、生着したヒトＣＤ４ Ｔ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の比率に関しても、対照マウスＩｇＧ投与群とＩＬ－２６抗体投与群で大きな違いは見られなかった（データ未掲載）。このことから、ＩＬ－２６抗体投与による著明な生存日数の延長や体重減少の軽減は、ドナーリンパ球の生着を阻害したことによるものではないことが示された。
次に、ＧＶＨＤ標的器官の組織病理学的評価を行った。図５Ｄに示すように、ヒト臍帯血造血幹細胞のみを移植したＧＶＨＤ非発症群と比較して、臍帯血単核球移植後に対照マウスＩｇＧを投与した群では、移植８週目には脱毛や皮膚萎縮、背骨の歪曲、運動量の低下などが外観で観察され、皮膚組織学では炎症性細胞浸潤、表皮層の肥厚、皮膚萎縮、脂肪減少および毛嚢脱落を示し、肺では上皮下線維組織の拡大と気管支周囲の炎症性細胞浸潤、細気管支の閉塞が認められ、肝臓では胆管を取り囲む組織において炎症性細胞による脈管周囲浸潤が観察された。急性ＧＶＨＤの主な標的器官の一つである腸管（小腸および結腸）は、本モデルでは顕著な病変所見は見られなかった（データ未掲載）。一方で、ＩＬ－２６モノクローナル抗体６９－１０を投与した群では、外観でも被毛の乱れが軽度に抑えられ、細気管支、脈管および胆管周囲の炎症性細胞浸潤も明白に減少しており、ＧＶＨＤ非発症群に近いレベルであることが示された（図５Ｄ）。
これらの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、慢性ＧＶＨＤ発症初期の新規治療アプローチとしても有用であることが示唆された。
本発明者らは、重度の免疫不全マウスであるＮＯＧマウスに亜致死量の放射線を照射した後、含まれるＴ細胞のほとんどが抗原感作されていないナイーブであるヒト臍帯血単核球を移植する異種慢性ＧＶＨＤモデルを確立し、ＩＬ－２６が線維芽細胞のコラーゲン産生を増強させ、肺の線維化に極めて重要であることを明らかにした（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（８）：３６９７－７１２．）。そこで同モデルを用いて、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６モノクローナル抗体６９－１０を、被毛の乱れや体重減少など軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植２８日目から投与開始し、慢性ＧＶＨＤに対する治療効果を検討した。
図５Ａ、図５Ｂに示すように、対照マウスＩｇＧ投与群では移植４週目から体重減少が始まり、５週から９週にかけて全てのマウスが死亡した（青色線）。一方で、ＩＬ－２６中和抗体６９－１０投与群では、体重減少が明白に軽減し、生存日数の著明な延長が見られた（図５ＡＢ中、オレンジ色線）。レシピエント（マウス）体内のドナー（ヒト）リンパ球の生着を解析した結果、ＩＬ－２６抗体投与群でも対照マウスＩｇＧ投与群と同程度の生着が認められた（図５Ｃ中、青色線・オレンジ色線）。また、生着したヒトＣＤ４ Ｔ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の比率に関しても、対照マウスＩｇＧ投与群とＩＬ－２６抗体投与群で大きな違いは見られなかった（データ未掲載）。このことから、ＩＬ－２６抗体投与による著明な生存日数の延長や体重減少の軽減は、ドナーリンパ球の生着を阻害したことによるものではないことが示された。
次に、ＧＶＨＤ標的器官の組織病理学的評価を行った。図５Ｄに示すように、ヒト臍帯血造血幹細胞のみを移植したＧＶＨＤ非発症群と比較して、臍帯血単核球移植後に対照マウスＩｇＧを投与した群では、移植８週目には脱毛や皮膚萎縮、背骨の歪曲、運動量の低下などが外観で観察され、皮膚組織学では炎症性細胞浸潤、表皮層の肥厚、皮膚萎縮、脂肪減少および毛嚢脱落を示し、肺では上皮下線維組織の拡大と気管支周囲の炎症性細胞浸潤、細気管支の閉塞が認められ、肝臓では胆管を取り囲む組織において炎症性細胞による脈管周囲浸潤が観察された。急性ＧＶＨＤの主な標的器官の一つである腸管（小腸および結腸）は、本モデルでは顕著な病変所見は見られなかった（データ未掲載）。一方で、ＩＬ－２６モノクローナル抗体６９－１０を投与した群では、外観でも被毛の乱れが軽度に抑えられ、細気管支、脈管および胆管周囲の炎症性細胞浸潤も明白に減少しており、ＧＶＨＤ非発症群に近いレベルであることが示された（図５Ｄ）。
これらの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、慢性ＧＶＨＤ発症初期の新規治療アプローチとしても有用であることが示唆された。
【0049】
（６） 新規モノクローナル抗体によるＧＶＨＤ治療処置はレシピエントのＧＶＴ能力を損なわない
ＧＶＨＤとＧＶＴ効果は高度に関連する免疫反応であるため（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；１５（１４）：４５１５－１７．）、ＩＬ－２６中和抗体によるＧＶＨＤ治療処置がレシピエントのＧＶＴ効果に与える潜在的影響を解析した。前述の慢性ＧＶＨＤモデルと同様に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施し、翌日にヒト臍帯血単核球を移植した。ドナー（ヒト）リンパ球がレシピエント体内に十分に生着し、軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植＋２８日目に、レシピエントマウスと同じ遺伝的背景（Ｈ－２d）のマウスリンパ腫細胞にルシフェラーゼをトランスフェクトしたＡ２０－ｌｕｃ細胞を尾静脈から播種し、その翌日＋２９日目から対照マウスＩｇＧ、またはＩＬ－２６抗体投与を行った。図６Ａ、図６Ｂに示すように、ヒト臍帯血単核球移植をせずにＡ２０－ｌｕｃ細胞だけを播種した、ドナーＴ細胞によるＧＶＴ効果が得られないマウスは、腫瘍が非常に強い勢いで増殖し、腫瘍播種後３週間以内に全て死亡した。一方で、ヒト臍帯血単核球を移植して対照マウスＩｇＧを投与したマウスは、Ａ２０－ｌｕｃ細胞だけを播種したマウスと比較して、腫瘍の増殖が顕著に抑制されていたが（図６Ａ中、青色線）、日数の経過にともない体重減少や被毛の乱れなどのＧＶＨＤ症状の進行が見られた（図６Ｂ）。これに対し、ＩＬ－２６モノクローナル抗体６９－１０を投与したマウスでは、対照マウスＩｇＧ投与群と同程度のレベルで腫瘍の増殖が抑えられていると同時に、ＧＶＨＤ症状もほとんど見られなかった（図６Ａ中、オレンジ色線・図６Ｂ）。
これまでの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、慢性ＧＶＨＤにおける肺の線維化やＧＶＨＤ標的器官への炎症性細胞浸潤を顕著に抑制し、ＧＶＨＤ症状の進行の制御に有用であると同時に、移植の恩恵であるドナーリンパ球によるＧＶＴ効果も保持されていることが示された。
ＧＶＨＤとＧＶＴ効果は高度に関連する免疫反応であるため（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；１５（１４）：４５１５－１７．）、ＩＬ－２６中和抗体によるＧＶＨＤ治療処置がレシピエントのＧＶＴ効果に与える潜在的影響を解析した。前述の慢性ＧＶＨＤモデルと同様に、ＮＯＧマウスに亜致死線量（２００ ｃＧｙ）の照射を実施し、翌日にヒト臍帯血単核球を移植した。ドナー（ヒト）リンパ球がレシピエント体内に十分に生着し、軽度なＧＶＨＤの臨床徴候／症状が見られ始めた移植＋２８日目に、レシピエントマウスと同じ遺伝的背景（Ｈ－２d）のマウスリンパ腫細胞にルシフェラーゼをトランスフェクトしたＡ２０－ｌｕｃ細胞を尾静脈から播種し、その翌日＋２９日目から対照マウスＩｇＧ、またはＩＬ－２６抗体投与を行った。図６Ａ、図６Ｂに示すように、ヒト臍帯血単核球移植をせずにＡ２０－ｌｕｃ細胞だけを播種した、ドナーＴ細胞によるＧＶＴ効果が得られないマウスは、腫瘍が非常に強い勢いで増殖し、腫瘍播種後３週間以内に全て死亡した。一方で、ヒト臍帯血単核球を移植して対照マウスＩｇＧを投与したマウスは、Ａ２０－ｌｕｃ細胞だけを播種したマウスと比較して、腫瘍の増殖が顕著に抑制されていたが（図６Ａ中、青色線）、日数の経過にともない体重減少や被毛の乱れなどのＧＶＨＤ症状の進行が見られた（図６Ｂ）。これに対し、ＩＬ－２６モノクローナル抗体６９－１０を投与したマウスでは、対照マウスＩｇＧ投与群と同程度のレベルで腫瘍の増殖が抑えられていると同時に、ＧＶＨＤ症状もほとんど見られなかった（図６Ａ中、オレンジ色線・図６Ｂ）。
これまでの結果から、本発明者らが樹立した新規抗ヒトＩＬ－２６中和モノクローナル抗体は、慢性ＧＶＨＤにおける肺の線維化やＧＶＨＤ標的器官への炎症性細胞浸潤を顕著に抑制し、ＧＶＨＤ症状の進行の制御に有用であると同時に、移植の恩恵であるドナーリンパ球によるＧＶＴ効果も保持されていることが示された。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
