特許 7061875 アミロイドベータタンパク質に対するモノクローナル抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-21

(45)【発行日】2022-05-06

(54)【発明の名称】アミロイドベータタンパク質に対するモノクローナル抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/06 20060101AFI20220425BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220425BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220425BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20220425BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220425BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220425BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20220425BHJP

【ＦＩ】

C12N15/06 100

A61K39/395 N

A61P25/28

C07K16/18

C12N5/10 ZNA

G01N33/53 D

C12P21/08

【請求項の数】 9

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2018000073

(22)【出願日】2018-01-04

(62)【分割の表示】P 2017089395の分割

【原出願日】2006-11-30

(65)【公開番号】P2018093876

(43)【公開日】2018-06-21

【審査請求日】2018-02-05

【審判番号】

【審判請求日】2020-04-03

(31)【優先権主張番号】60/740,866

(32)【優先日】2005-11-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】60/778,950

(32)【優先日】2006-03-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-7238

(73)【特許権者】

【識別番号】512212195

【氏名又は名称】アッヴィ・インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】513144626

【氏名又は名称】アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ボリス・ラブコフスキー

(72)【発明者】

【氏名】シユテフアン・バルクホルン

(72)【発明者】

【氏名】ハインツ・ヒレン

(72)【発明者】

【氏名】ウルリヒ・エーベルト

(72)【発明者】

【氏名】アンドレーアス・アール・シユトリービンガー

(72)【発明者】

【氏名】パトリツク・ケラー

【合議体】

【審判長】長井 啓子

【審判官】松野 広一

【審判官】高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，（２００５．０８），９５，［３］，ｐ．８３４－８４７

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N15/00-15/90

C07K16/00-16/46

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡＰｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

可変重鎖及び可変軽鎖を含む、アミロイドベータタンパク質と結合するモノクローナル抗体であって、
該可変重鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３であり、並びに、該可変軽鎖の３つのＣＤＲは、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３であり、
ヒト化抗体である、モノクローナル抗体。

【請求項2】

可変重鎖が配列番号３で示されるアミノ酸配列を含み、且つ可変軽鎖が配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項3】

フレームワーク領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものに相当する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項4】

抗体が、アミロイドベータタンパク質単量体に対してよりもアミロイドベータタンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

【請求項5】

Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ指定番号ＰＴＡ－７２３８を有するハイブリドーマ。

【請求項6】

請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体を含む、アルツハイマー病の治療又は予防のための医薬。

【請求項7】

前記抗体が、筋肉内投与、静脈内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して投与される、請求項６に記載の医薬。

【請求項8】

請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。

【請求項9】

請求項８に記載の組成物を含む、アルツハイマー病の予防又は治療のための医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば、アルツハイマー病又はその他の神経変性疾患の、予防、治療及び診
断において使用され得るモノクローナル抗体（例えば、８Ｆ５及び８Ｃ５）に関する。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の認知能力喪失及び脳のいくつかの領域での、ア
ミロイド沈着、神経原線維のもつれ及びニューロン欠損を含む特徴的な神経病理学的特性
を特徴とする神経変性疾患である（Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９
７、３５３（２００２）；Ｍａｔｔｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ ４３１、７００４（２００４
）参照）。アミロイド沈着の主要な構成因子はアミロイドベータペプチド（Ａβ）であり
、４２アミノ酸長型（Ａβ１－４２）が最も顕著である。

【0003】

特に、アミロイドβ（１－４２）タンパク質は、タンパク質分解性プロセシングによる
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来の４２アミノ酸を有するポリペプチドである
。これにはまた、ヒト変異型に加え、ヒト以外の生物（特にその他の哺乳動物、とりわけ
ラット）に存在するアミロイドβ（１－４２）タンパク質のアイソフォームも含まれる。
このタンパク質は、水性の環境で重合する傾向があり、非常に様々な分子形態で存在し得
る。

【0004】

例えばアルツハイマー病などの認知症の発症又は進行と不溶性タンパク質の沈着との単
純な相互関係は疑わしいことが分かっている（Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３
０．５７２－５８０（１９９１）；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ
１６、２８５－２９８（１９９５））。一方、シナプス欠損及び知的知覚は、Ａβ（１
－４２）の可溶型とより相関すると思われる（Ｌｕｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５
５、８５３－８６２（１９９９）；ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６、８６
０－８６６（１９９９））。

【0005】

過去にポリクローナル及びモノクローナル抗体がＡβ（１－４２）に対して作製されて
きたが、動物及び／又はヒトにおいて重篤な副作用も起こさずに所望の治療効果をもたら
すことが証明されているものはない。例えば、５ヵ月間、週に１回、Ｎ－末端特異的抗－
Ａβ（１－４２）抗体の投与を受けた老齢ＡＰＰ２３マウスでの前臨床研究からの受動免
疫付与の結果から、治療的に関連のある副作用が示されている。特に、これらのマウスは
、食塩水処置マウスと比較して、微小出血の数及び重症度が上昇していた（Ｐｆｅｉｆｅ
ｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２ ２９８：１３７９）。同様の出血の増加は、最近、老
齢（＞２４ヵ月）Ｔｇ２５７６及びＰＤＡＰＰマウスに対しても報告された（Ｗｉｌｃｏ
ｃｋら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３、２３：３７４５－５１；Ｒａｃｋｅ
ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００５、２５：６２９－６３６）。両系統におい
て、抗－Ａβ（１－４２）の注射の結果、微小出血が顕著に増加した。このように、ヒト
の身体においてネガティブで潜在的な致死的影響を誘発することなく疾患の進行を予防又
は遅らせる生物製剤の開発に対して非常に大きい治療ニーズがある。一般集団の寿命が長
くなっており、この長寿化とともに、アルツハイマー病と診断される年間患者数が上昇し
ているという観点で、このようなニーズは特に明白である。さらに、このような抗体によ
り、アルツハイマー病の症状があった患者においてアルツハイマー病の適切な診断が可能
となろう（この診断は、現在、剖検でのみ確認することができる。）。さらに、このよう
な抗体により、本タンパク質の生物学的特性及びこの衰弱性疾患に関与するその他の生物
学的因子を解明することが可能となろう。本明細書中で言及する全ての特許及び刊行物は
、参照によりその全体を本明細書中に組み込む。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７、３５３（２００２）

【文献】Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ４３１、７００４（２００４）

【文献】Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３０．５７２－５８０（１９９１）

【文献】Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １６、２８５－２９８（１９９５）

【文献】Ｌｕｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５、８５３－８６２（１９９９）

【文献】ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６、８６０－８６６（１９９９）

【文献】Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２ ２９８：１３７９

【文献】Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３、２３：３７４５－５１

【文献】Ｒａｃｋｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００５、２５：６２９－６３６

【発明の概要】

【0007】

本発明は、アミロイドベータタンパク質単量体に対してよりもアミロイドベータ（Ａβ
）タンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する単離抗体を含む。従って、選択的
結合が観察される。本抗体は、例えば、８Ｆ５又は８Ｃ５などのモノクローナル抗体であ
り得る。単量体と対比した球状凝集体の結合特異性の比は少なくとも１．４である。特に
、この比は、好ましくは、少なくとも約１．４から少なくとも約１６．９である。（１．
０－１７．５（両端を含む。）の比もまた、本発明の範囲内であるとみなされる（同時に
その小数％範囲内）。例えば、１．１、１．２、１．３、．．．、２．０、２．１、２．
２．．．、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５ならびにそれらの間及び
％の全ての整数は、本発明の範囲内に入るとみなされる。）。アミロイドベータタンパク
質単量体は、例えば、Ａβ（１－４２）単量体又はＡβ（１－４０）単量体であり得る。

【0008】

さらに、本発明はまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ指定番号ＰＴＡ－７２３８を有するハイブリドーマにより産生されるモノクロー
ナル抗体（本明細書中で「８Ｆ５」と呼ぶ。）ならびにこのモノクローナル抗体（即ち８
Ｆ５）を産生するハイブリドーマを包含する。また、本発明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ指定番号ＰＴＡ－７４０７を有するハイブ
リドーマにより産生されるモノクローナル抗体（本明細書中で「８Ｃ５」と呼ぶ。）なら
びにこのモノクローナル抗体（即ち８Ｃ５）を産生するハイブリドーマも含む。

【0009】

さらに、本発明は、配列番号１によりコードされる可変重鎖を含むモノクローナル抗体
を含む。この抗体は、マウス、ヒト又はヒト化であり得る。さらに、本発明は、配列番号
２によりコードされる可変軽鎖を含むモノクローナル抗体を含む。この抗体もまた、マウ
ス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は、配列番号１によりコードされる可変軽重鎖
をさらに含み得、ヒト又はヒト化であり得る。

【0010】

さらに、本発明は、配列番号３を含むモノクローナル抗体を含む。この抗体は、マウス
、ヒト又はヒト化であり得る。

【0011】

さらに、本発明は配列番号４を含むモノクローナル抗体を包含する。この抗体は、マウ
ス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は配列番号３をさらに含み得、マウス、ヒト又
はヒト化であり得る。

【0012】

さらに、本発明は、配列番号１１によりコードされる可変重鎖を含むモノクローナル抗
体を含む。この抗体は、マウス、ヒト又はヒト化であり得る。

【0013】

さらに、本発明は、配列番号１２によりコードされる可変軽鎖を含むモノクローナル抗
体を含む。この抗体もまた、マウス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は、配列番号
１１によりコードされる可変重鎖をさらに含み得、ヒト又はヒト化であり得る。

【0014】

さらに、本発明は配列番号１９を含むモノクローナル抗体を含む。この抗体は、マウス
、ヒト又はヒト化であり得る。

【0015】

さらに、本発明は、配列番号２０を含むモノクローナル抗体を包含する。この抗体は、
マウス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は配列番号１９をさらに含み得、マウス、
ヒト又はヒト化であり得る。

【0016】

本発明はまた、アミロイドベータタンパク質原線維に対してよりもアミロイドベータタ
ンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する単離抗体も含む。この抗体は、例えば
モノクローナルであり得、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ指定番号ＰＴＡ－７２４３を有するハイブリドーマ又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＰＴＡ－７４０７を有するハイブリドーマ
により産生されるモノクローナル抗体であり得る。これらのモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマもまた本発明の範囲内に入る。

【0017】

さらに、本発明は、可変重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが、配列番
号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択される抗体を含む。

【0018】

さらに、本発明はまた、可変軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つが配列番号８、配列番号９
及び配列番号１０からなる群から選択される抗体も含む。この抗体は、配列番号５、配列
番号６及び配列番号７からなる群から選択される可変重鎖の少なくとも１つのＣＤＲをさ
らに含み得る。

【0019】

本発明はまた、可変重鎖のＣＤＲの少なくとも１つが配列番号１３、配列番号１４及び
配列番号１５からなる群から選択される抗体も含む。

【0020】

さらに、本発明はまた、可変軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つが配列番号１６、配列番号
１７及び配列番号１８からなる群から選択される抗体も包含する。この抗体は配列番号１
３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択される可変重鎖の少なくとも１つ
のＣＤＲをさらに含み得る。

【0021】

さらに、本発明は、アルツハイマー病の治療又は予防を必要とする患者においてアルツ
ハイマー病を治療又は予防する方法を包含する。この方法は、治療又は予防を達成するの
に十分な量で患者に上述の単離抗体の何れか１以上を投与することを含む。

【0022】

例えば筋肉内投与、静脈内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して本
単離抗体を投与し得る。

【0023】

本発明はまた、アルツハイマー病の疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断す
る方法も含む。この方法は、１）患者から生体試料を単離する段階；２）抗原／抗体複合
体の形成に十分な時間及び条件下で、上述の抗体の少なくとも１つと該生体試料を接触さ
せる段階；３）該試料中の抗原／抗体複合体の存在（該複合体の存在は患者におけるアル
ツハイマー病の診断を示す。）を検出する段階を含む。この抗原は、例えば、球状凝集体
又は、完全な球状凝集体と同じ機能特性（例えば結合活性）を有する、その一部もしくは
断片であり得る。

【0024】

さらに、本発明は、アルツハイマー病の疑いがある患者においてアルツハイマー病を診
断する別の方法を含む。この方法は、１）患者から生体試料を単離する段階；２）抗体／
抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、抗原と該生体試料を接触させる段階；３）
共役物を結合抗体に結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体／抗原複合体
に共役物を添加する段階（この共役物は、上述の抗体の１つを含み、検出可能なシグナル
を生成することができるシグナル生成化合物に結合されている。）；４）シグナル生成化
合物により生成されたシグナルを検出することにより、該生体試料に存在し得る抗体の存
在を検出する（このシグナルは、該患者においてアルツハイマー病の診断を示す。）段階
を含む。この抗原は、球状凝集体又は、完全な球状凝集体と同じ機能特性（例えば結合活
性）を有するその一部もしくは断片であり得る。

【0025】

本発明は、アルツハイマー病の疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断するさ
らなる方法を含む。この方法は、１）患者から生体試料を単離する段階；２）抗－抗体／
抗体複合体（該複合体は該生体試料中に存在する抗体を含有する。）を形成させるのに十
分な時間及び条件下で、抗－抗体と生体試料を接触させる段階（該抗－抗体は、上述の抗
体の１つに特異的である。）；２）共役物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を結合抗体に結合させ
るのに十分な時間及び条件下で、得られた抗－抗体／抗体複合体に共役物を添加する段階
（該共役物は抗原を含み、これは、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル
生成化合物に結合されている。）；３）シグナル生成化合物により生成されたシグナルを
検出する（このシグナルは、該患者においてアルツハイマー病の診断を示す。）段階を含
む。

【0026】

さらに、本発明は、上述の抗体の何れか１以上を含有する組成物を含む（例えば、８Ｆ
５及び８Ｃ５）。

【0027】

本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者においてアルツハイマー
病を予防又は治療する別の方法を含む。この方法は、予防又は治療を達成するのに十分な
量で患者に直上の組成物を投与する段階を含む。

【0028】

さらに、本発明は、上述の抗体の少なくとも１つと、医薬的に許容可能なアジュバント
と、を含むワクチンを包含する。

【0029】

さらに、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者においてアルツ
ハイマー病を予防又は治療するさらなる方法を含む。この方法は、予防又は治療を達成す
るのに十分な量で患者に上述のワクチンを投与する段階を含む。さらに、本発明は、アル
ツハイマー病が発現することが予測される患者の能動免疫化に適切な化合物を同定する方
法を包含する。この方法は、１）１以上の化合物が上述の抗体の１以上に結合するのに十
分な時間及び条件下で、関心のある１以上の化合物を上述の抗体の１以上に曝露する段階
；２）該抗体に結合する化合物を同定する（同定された化合物は、アルツハイマー病を発
現すると予測される患者での能動免疫化において使用される。）段階を含む。

【0030】

また、本発明は、ａ）上述の単離抗体の少なくとも１つと、ｂ）シグナル生成化合物に
結合された抗体を含む共役物（この共役物の抗体はａ）の単離抗体とは異なる。）と、を
含む、キットを含む。このキットは、このキットの成分の利用方法に関する説明付きの添
付文書も含み得る。

【0031】

本発明はまた、ａ）上述の抗体の１つに対する抗－抗体と、ｂ）シグナル生成化合物に
結合された抗原を含む共役物と、を含むキットも包含する。この抗原は、球状凝集体又は
、球状凝集体と同じ機能特性（例えば結合活性）を有するその一部もしくは断片であり得
る。また、このキットは、このキットの成分の利用方法に関する説明付きの添付文書も含
み得る。

【0032】

図面の簡単な説明
図１は、Ａβ（１－４２）単量体、Ａβ（１－４０）及びｓＡＰＰと対比した、球状凝
集体への、８Ｆ５の選択性を示す。ＥＣ５０値間の比として、８Ｆ５に対する選択性係数
を計算することができる（ＨＦＩＰ中でＡβ（１－４２）単量体に対して：５５５．８／
９０．７４＝６．１；ＮＨ_４ＯＨ中でＡβ（１－４２）単量体に対して：１００７／９０
．７４＝１１．１；Ａβ（１－４０）単量体に対して：６６７．８／９０．７４＝７．４
；ｓＡＰＰに対して：＞１００）。

【0033】

図２は、上清中の、原線維結合重及び軽鎖抗体（レーン４、６、８）及び対応する非結
合遊離断片（レーン３、５、７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【0034】

図３は、軽度認知障害（ＭＣＩ、左）又はアルツハイマー病（ＡＤ、右）の患者由来の
ＣＳＦ試料中のＡβ４２及びＡβ４０含量を示す。標準抗体６Ｅ１０と比較した場合、又
は同じＥＬＩＳＡを用いた直接試料分析と比較した場合、両群とも、８Ｆ５はＡβ（１－
４２）の割合がより高く、Ａβ（１－４０）の量が少ないか又は同等であることが観察さ
れ得る。

【0035】

図４は、ＡＰＰトランスジェニックマウスの３群（即ち、６Ｇ１、８Ｆ５、ＰＢＳ）及
び非トランスジェニックの同腹仔（野生型）の１群における、既知の物体と対比した未知
の物体と過ごす時間としての、新規物体認識指数を示す。３週間にわたる、１週間に１回
の腹腔内注射により、動物（数は下記カラムで与える。）に対して、モノクローナル抗体
６Ｇ１もしくは８Ｆ５で免疫付与を行うか又はビヒクル（即ち、リン酸緩衝食塩水；ＰＢ
Ｓ、及び野生型）での処置を行った。注射の最終日に、新規物体認識テストを行った。Ｐ
ＢＳ群と野生型群との間の相違から、この範例において、ＡＰＰトランスジェニックマウ
スの認知障害が示された。ＰＢＳを注射したマウスはチャンスレベルであったが（即ち、
５０と有意差はなかった。）、一方、他の全てのマウスは物体認識を示した（ｔ検定；星
印）。抗体処置ＡＰＰトランスジェニックマウスのパフォーマンスを対照群と比較したと
ころ、ＰＢＳ処置マウスと対比して有意差が見られたが、野生型マウスと対比した場合有
意差は見られず（事後ｔ検定を用いたＡＮＯＶＡ；丸印）、このことから、これらのＡＰ
Ｐトランスジェニックマウスにおいて、抗体処置により認知障害が軽減したことが示唆さ
れる。

【0036】

図５（Ａ）は本明細書中で「８Ｆ５」と呼ぶモノクローナル抗体をコードする可変重鎖
のＤＮＡ配列（配列番号１）を示し、図５（Ｂ）は、モノクローナル抗体８Ｆ５をコード
する可変軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。（各配列において相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）に下線を付す。図６も参照のこと。）。

【0037】

図６（Ａ）はモノクローナル抗体８Ｆ５の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示
し、図６（Ｂ）はモノクローナル抗体８Ｆ５の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を
示す。可変重鎖の１つのＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号５）により表され
る。可変重鎖の別のＣＤＲは、アミノ酸配列ＡＳＩＮＳＮＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配
列番号６）により表され、可変重鎖の別のＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＧＤＹ（配列番号７
）により表される。可変軽鎖のあるＣＤＲは、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＹＳＮＧＤＴ
ＹＬＨ（配列番号８）により表される。可変軽鎖の別のＣＤＲは、アミノ酸配列ＫＶＳＮ
ＲＦＳ（配列番号９）により表され、可変軽鎖の別のＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＱＳＴＨ
ＶＰＷＴ（配列番号１０）により表される。上述のＣＤＲの全てに図６（Ａ）及び６（Ｂ
）で下線を付す。

【0038】

図７は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新
皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示す。特に、図７（Ａ）は、ＡＰＰ
トランスジェニックマウス系統Ｔｇ２５７６及びＡＤ患者（ＲＺ５５）での、脳組織の斑
としての、及び脳血管での大脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）としての、コンゴレッド染
色による、アミロイド沈着の検証を示す。図７（Ｂ）は、ＡＤ患者（ＲＺ１６）における
Ａβ（アミロイド斑）の実質性沈着の染色が６Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０によってのみ
起こり、一方、８Ｆ５及び８Ｃ５では染色が非常に弱いことを示す。図７（Ｃ）は、ＴＧ
２５７６マウスにおけるＡβ（アミロイド斑）の実質性沈着の強い染色が６Ｇ１及び市販
の抗体６Ｅ１０によってのみ起こり、一方、８Ｆ５及び８Ｃ５では染色が非常に弱いこと
を示す。図７（Ｄ）－（Ｇ）は、画像解析を用いた組織学的画像におけるＡβ斑染色の分
析の定量を示す。斑のグレースケール値からバックグラウンド組織のグレースケール値を
差し引くことにより、光学密度値（０％＝染色なし）を計算した。（図（Ｄ）＝Ｔｇ２５
７６マウスにおける０．７μｇ／ｍＬ抗体の結合；図（Ｅ）＝ＡＰＰ／Ｌマウスにおける
０．０７－０．７μｇ／ｍＬ抗体の結合；図（Ｆ）＝ＡＤ患者（ＲＺ５５）における０．
７μｇ／ｍＬ抗体の結合；及び図（Ｇ）＝ＡＤ患者（ＲＺ１６）における０．０７－０．
７μｇ／ｍＬ抗体の結合）。市販の抗体６Ｅ１０（星印）及び４Ｇ８（丸）及び抗体６Ｇ
１、８Ｃ５及び８Ｆ５の染色間の差異を統計的に評価した（対照と対比して、星印１個／
丸印：ｐ＜０．０５、星印２個／丸印：ｐ＜０．０１及び星印３個／丸印：ｐ＜０．００
１；ｐ＜０．００１でのＡＮＯＶＡ後の、事後ボンフェローニｔ検定）（図（Ｄ）及び図
（Ｅ））。図（Ｅ）及び（Ｇ）において、抗体８Ｃ５及び８Ｆ５は常に、市販の抗体６Ｅ
１０及び４Ｇ８よりも有意に弱い染色を示した（ＡＮＯＶＡでのｐ＜０．００１後、事後
ｔ検定において、ｐ＜０．０５）。図（Ｈ）は、Ａβの血管沈着（矢印）の強い染色が６
Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０でのみ起こり、一方、８Ｆ５又は８Ｃ５での染色は非常に弱
かったことを示す。Ｔｇ２５７６マウスにおいて、量的に同様の状況が見られた（ここで
は示さない。）。

【0039】

図８は、Ａβ（１－４２）単量体、Ａβ（１－４０）及びｓＡＰＰと対比した、球状凝
集体に対する８Ｃ５の選択性を示す。ＥＣ５０値間の比として、８Ｃ５に対する選択性係
数を計算することができる（ＨＦＩＰ中でＡβ（１－４２）単量体に対して：２３４６／
５６８．２＝４．１；ＮＨ_４ＯＨ中でＡβ（１－４２）単量体に対して：＞１００；Ａβ
（１－４０）単量体に対して：＞１００；ｓＡＰＰに対して：＞１００）。

【0040】

図９（Ａ）は、８Ｃ５の重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示し、
図９（Ｂ）は、８Ｃ５の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。図
１０（Ａ）及び１０（Ｂ）で述べる対応するＣＤＲをコードするヌクレオチド配列に下線
を付す。

【0041】

図１０（Ｂ）は、モノクローナル抗体８Ｃ５の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９
）を示し、図１０（Ｂ）は、モノクローナル抗体８Ｆ５の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列
番号２０）を示す。可変重鎖の１つのＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号１３
）で表される。可変重鎖の別のＣＤＲはアミノ酸配列ＳＩＫＮＮＧＧＳＴＹＹＰＤＳＬＫ
Ｇ（配列番号１４）で表され、可変重鎖の別のＣＤＲはアミノ酸配列ＳＧＤＹ（配列番号
１５）で表される。可変軽鎖の１つのＣＤＲはアミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＤＴ
ＦＬＨ（配列番号１６）で表される。可変軽鎖の別のＣＤＲはアミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦ
Ｓ（配列番号１７）で表され、可変軽鎖の別のＣＤＲはアミノ酸配列ＳＱＳＩＨＶＰＷＴ
（配列番号１８）で表される。上述のＣＤＲの全てに図１０（Ａ）及び１０（Ｂ）で下線
を付す。

【0042】

発明の詳細な説明
本発明は、本明細書中で「８Ｆ５」と呼ぶモノクローナル抗体ならびにその他の関連抗
体（例えば８Ｃ５）に関する。例えば、アルツハイマー病及びその他の神経変性疾患の、
診断、予防及び治療において、これらの抗体を使用し得る。

【0043】

モノクローナル抗体８Ｆ５ならびにモノクローナル抗体８Ｃ５は、多くの興味深い特性
を有し、このため、これらは非常に興味深い治療薬候補であり、同時に非常に有用な診断
薬候補である。例えば、モノクローナル抗体８Ｆ５及び８Ｃ５は、単量体又は原線維と比
較して、Ａβ（１－４２）球状凝集体に対して選択的な結合を有する。

【0044】

「Ａβ（Ｘ－Ｙ）」という用語は、本明細書中で、ヒトアミロイドβタンパク質のアミ
ノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙ（Ｘ及びＹの両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に
、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ
ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ ＩＡ又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置Ｘからアミ
ノ酸位置Ｙのアミノ酸配列を指し、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅ
ｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ
（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群
から選択される少なくとも１つの突然変異があるもの（ここで、数字は、Ａβペプチドの
開始位置に対応し、位置Ｘ及び位置Ｙの両方を含む。）又は３個以下のさらなるアミノ酸
置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列を指す。「
さらなる」アミノ酸置換とは、本明細書中で、自然には見られない規範的な配列からの何
らかの逸脱として定義する。

【0045】

より具体的には、本明細書中で「Ａβ（１－４２）」という用語は、ヒトアミロイドβ
タンパク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４２（１及び４２の両方を含む。）のア
ミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ
ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ ＩＡ（アミノ酸位置１から４２に対応す
る。）又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４２のアミノ
酸配列を指す。このような変異体は、例えば、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆ
ｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２
２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからな
る群から選択される少なくとも１つの突然変異を有するもの（ここで、数字は、Ａβペプ
チドの開始位置に対応し、位置１及び位置４２の両方を含む。）又は３個以下のさらなる
アミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列で
あり得る。同様に、「Ａβ（１－４０）」という用語は、ここで、ヒトアミロイドβタン
パク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４０（１及び４０の両方を含む。）のアミノ
酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥ
ＤＶＧＳＮＫＧＡ ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位
置１からアミノ酸位置４０のアミノ酸配列を指す。このような変異体は、例えば、Ａ２Ｔ
、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、
Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）及びＤ２３Ｎ（「Ｉｏｗ
ａ」）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有するもの（ここで、数字
は、Ａβペプチドの開始位置に対応し、位置１及び位置４０の両方を含む。）又は３個以
下のさらなるアミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を
有する配列を含む。「Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体」（「Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状オリゴマー」
としても知られる。）という用語は、本明細書中で、上記で定義されるように、均一性及
び個別の物理的特性を有する、Ａβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドの可溶性の球状の非共有結合を指
す。Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体は、陰イオン性界面活性剤とインキュベートすることによ
り得られるＡβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドの安定な非原線維性のオリゴマー集合体である。単量
体及び原線維とは異なり、これらの球状凝集体は、サブユニットの定められた集合体数を
特徴とする（例えば、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１に記載のように、初期
集合形態、ｎ＝３－６、「オリゴマーＡ」及び後期集合形態、ｎ＝１２－１４、「オリゴ
マーＢ」。）。球状凝集体は、３次元球状型構造を有する（「モルテングロビュール」、
Ｂａｒｇｈｏｒｎら、２００５、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５、８３４－８４７参照）
。これらはさらに、次の特性の１以上をさらに特徴とする：
－短縮型Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体を生じる広域プロテアーゼ（サーモリシン又はエン
ドプロテイナーゼＧｌｕＣなど）でのＮ－末端アミノ酸Ｘ－２３の切断可能性；
－広域プロテアーゼ及び抗体とのＣ末端アミノ酸２４－Ｙの非近接性；及び
－これらのＡβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体の短縮型が、球状凝集体の３次元コア構造（その
球状凝集体配座におけるコアエピトープＡβ（２０－Ｙ）の近接性がより優れている。）
を維持する。

【0046】

本発明によると、及び、特に本発明の抗体の結合親和性を評価する目的のために、「Ａ
β（Ｘ－Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、国際出願公開ＷＯ０４／０６７
５６１（参照により、その全体を本明細書中に組み込む。）に記載のようなプロセスによ
り得ることができる産物を指す。このプロセスは、天然、組み換え又は合成Ａβ（Ｘ－Ｙ
）ペプチドもしくはその誘導体をアンフォールディングすること；アンフォールディング
したＡβ（Ｘ－Ｙ）ペプチド又はその誘導体を界面活性剤に少なくとも部分的に曝露し、
その界面活性剤作用を低下させ、インキュベートを続けることを含む。

【0047】

ペプチドのアンフォールディングのために、例えばヘキサフルオロイソプロパノール（
ＨＦＩＰ）などの水素結合破壊剤をタンパク質に対して作用させ得る。作用温度が約２０
から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数分、例えば１０から６０分の作用時間
で十分である。蒸発乾固した残渣を、好ましくは濃縮形態で、例えばジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）などの水性緩衝剤と混ざり合う適切な有機溶媒中で続いて溶解することに
より、結果として、その後に使用できる、少なくとも部分的にアンフォールディングされ
たペプチド又はその誘導体の懸濁液が得られる。必要ならば、保存用懸濁液を低温、例え
ば約－２０℃でしばらくの間保存し得る。

【0048】

あるいは、ペプチド又はその誘導体を僅かに酸性の、好ましくは水性の、溶液、例えば
約１０ｍＭ ＨＣｌ水溶液中で溶解させ得る。およそ数分間インキュベートした後、不溶
性成分を遠心により除去する。１０，０００ｇで数分が好都合である。これらの方法の段
階を好ましくは室温、即ち２０から３０℃の範囲の温度で行う。遠心後に得られる上清は
、Ａβ（Ｘ－Ｙ）ペプチド又はその誘導体を含有し、低温、例えば約－２０℃でしばらく
の間保存し得る。

【0049】

オリゴマー（国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１、オリゴマーＡと呼ばれる。）の中
間型を与えるための、界面活性剤への続く曝露は、ペプチド又はその誘導体のオリゴマー
化に関連する。このために、十分な中間体オリゴマーが生じるまで、場合によっては少な
くとも部分的にアンフォールディングされたペプチド又はその誘導体に対して界面活性剤
を作用させる。イオン性界面活性剤、特に陰イオン性界面活性剤を用いるのが好ましい。

【0050】

特定の実施形態によると、式（Ｉ）：
Ｒ－Ｘ
の界面活性剤が使用される（式中、基「Ｒ」は、６から２０、好ましくは１０から１４
個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルキル又は６から２０、好ましくは１０から
１４個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルケニルであり、基「Ｘ」は酸性基又は
その塩であり、Ｘは好ましくは－ＣＯＣ^－Ｍ^＋、－ＳＯ_３ ^－Ｍ^＋の中から選択され、最も
好ましくは－ＯＳＯ_３ ^－Ｍ^＋であり、Ｍ^＋は、水素陽イオン又は無機もしくは有機陽イオ
ンであり、好ましくは、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン及びアンモニ
ウム陽イオンから選択される。）。最も有利であるのは、特にＲが非分枝アルキルである
（そのａｌｋ－ｌ－ｙｌ基を言及しなければならない。）、式（Ｉ）の界面活性剤である
。特に好ましいのは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ラウリン酸及びオレイ
ン酸も有利に使用できる。界面活性剤ラウロイルサルコシンのナトリウム塩（サルコシル
ＮＬ－３０又はＧａｒｄｏｌ^（Ｒ）としても知られている。）もまた特に有利である。

【0051】

界面活性剤作用時間は、特に、アンフォールディングされているならば、オリゴマー化
に供されるペプチド又はその誘導体がどの程度までアンフォールディングされているかに
依存する。アンフォールディング段階に従い、ペプチド又はその誘導体が水素結合破壊剤
で（即ち、特にヘキサフルオロイソプロパノールで）既に処理されているならば、作用温
度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲の作用時間、有
利には約１から２０、特に約２から１０時間で十分である。アンフォールディングの程度
が小さいか又は基本的にアンフォールディングされていないペプチド又はその誘導体が出
発点である場合、同様に、作用時間が長い方が好都合である。例えばＨＦＩＰ処理に代わ
る手段として上記手順に従いペプチドもしくはその誘導体が前処理されているか、又は該
ペプチドもしくはその誘導体がオリゴマー化に直接供されるならば、作用温度が約２０か
ら５０℃、特に約３５から４０℃である場合、約５から３０時間、特に約１０から２０時
間の作用時間で十分である。インキュベート後、不溶性成分を遠心により有利に除去する
。１０，０００ｇで数分が好都合である。

【0052】

選択すべき界面活性剤濃度は使用する界面活性剤に依存する。ＳＤＳを使用する場合、
０．０１から１重量％、好ましくは、０．０５から０．５重量％の範囲、例えば、約０．
２重量％の濃度が好都合である。ラウリン酸又はオレイン酸を使用する場合、例えば、０
．０５から２重量％、好ましくは０．１から０．５重量％の範囲、例えば約０．５重量％
の、幾分高い濃度が好都合である。界面活性剤作用は、生理的範囲前後の塩濃度で起こる
はずである。従って、特に５０から５００ｍＭ、好ましくは１００から２００ｍＭの範囲
、より具体的には約１４０ｍＭのＮａＣｌ濃度が好都合である。

【0053】

続く界面活性剤作用の低下及びインキュベートの継続は、本発明のＡβ（Ｘ－Ｙ）球状
凝集体（国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１において、オリゴマーＢと呼ばれる。）を
与えるためのオリゴマー化にさらに関連する。前段階から得られる組成物は通常界面活性
剤及び生理的範囲の塩濃度を含有するので、界面活性剤作用を低下させ、好ましくは塩濃
度も低下させることが好都合である。例えば、水又は低塩濃度の緩衝液（例えばＴｒｉｓ
－ＨＣｌ、ｐＨ７．３）で好都合に希釈することにより界面活性剤及び塩の濃度を低下さ
せることによって、これを行い得る。約２から１０の範囲、有利には、約３から８の範囲
、特に約４の、希釈係数が適切であることが分かっている。この界面活性剤作用を中和す
ることができる物質を添加することによっても、界面活性剤作用の低下を達成し得る。こ
れらの例には、一連の精製及び抽出手段において細胞を安定化させることができる物質の
ような界面活性剤を錯化することができる物質（例えば、特定のＥＯ／ＰＯブロックコポ
リマー、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^（Ｒ）Ｆ６８の商標名のブロックコポリマー）が含まれ
る。特定の臨界ミセル濃度前後又はそれ以上の濃度の、アルコキシル化及び、特に、エト
キシル化アルキルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）Ｘシリーズのエトキシル化ｔ－オクチ
ルフェノール、特にＴｒｉｔｏｎ^（Ｒ）Ｘ１００、３－（３－コラミドプロピルジメチル
アンモニオ）－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ^（Ｒ））など）又はアルコキシル
化及び、特に、エトキシル化ソルビタン脂肪エステル（Ｔｒｉｔｏｎ^（Ｒ）シリーズのも
の、特にＴｗｅｅｎ^（Ｒ）２０など）も同様に使用し得る。

【0054】

続いて、十分なＡβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体が産生されるまでこの溶液をインキュベート
する。作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲、
好ましくは約１０から３０時間、特に約１５から２５時間の範囲の作用時間で十分である
。次にこの溶液を濃縮し得、得られるであろう残渣を遠心により除去し得る。繰り返すが
、１０，０００ｇで数分間が好都合であることが分かっている。遠心後に得られた上清は
、本明細書中に記載のようなＡβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体を含有する。

【0055】

例えば超遠心、透析、沈殿又は遠心により、Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体を最終的に回収
することができる。変性条件下でのＡβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体の電気泳動による（例えば
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる）分離によって２重のバンドが得られれば（例えば、Ａβ（１－
４２）に対して３８／４８ｋＤａの見かけの分子量を有する。）さらに好ましく、分離前
にオリゴマーのグルタールアルデヒド処理においてこれらの２本のバンドが１本にまとま
れば特に好ましい。球状凝集体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果、１本のピークに
なる場合も好ましい（例えば、Ａβ（１－４２）に対するおよそ６０ｋＤａの分子量に対
応する。）。Ａβ（１－４２）ペプチドから開始する場合、本プロセスは、特にＡβ（１
－４２）球状凝集体を得るために適切である。好ましくは、この球状凝集体は、神経細胞
に対して親和性を示し、また、神経調節作用も示す。「神経調節作用」は、神経可塑性に
関してニューロンの機能不全を導く、ニューロンの長期にわたる阻害作用として定義され
る。

【0056】

本発明の別の態様によると、「Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中
で、基本的にＡβ（Ｘ－Ｙ）サブユニットからなる球状凝集体を指し、これは、平均で１
２サブユニットのうち少なくとも１１がＡβ（Ｘ－Ｙ）タイプであれば好ましく、より好
ましくはこの球状凝集体の１０％未満が何らかの非Ａβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドであり、最も
好ましくは、この調製物の非Ａβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値以下である。より
具体的には、「Ａβ（１－４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義
されるような、Ａβ（１－４２）ユニットを含有する球状凝集体を指し；「Ａβ（１２－
４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（１２
－４２）ユニットを含有する球状凝集体を指し；「Ａβ（２０－４２）球状凝集体」とい
う用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（２０－４２）ユニットを含有
する球状凝集体を指す。

【0057】

「架橋Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、球状凝集体の構成単
位の、架橋により、好ましくは化学的架橋により、より好ましくはアルデヒド架橋により
、最も好ましくはグルタールアルデヒド架橋により、上述のようなＡβ（Ｘ－Ｙ）球状凝
集体から得られる分子を指す。本発明の別の態様において、架橋球状凝集体は基本的に、
その単位が、非共有結合相互作用のみによって一緒になっているのではなく、少なくとも
一部が共有結合により連結されている球状凝集体である。

【0058】

「Ａβ（Ｘ－Ｙ）球状凝集体誘導体」という用語は、本明細書中で、特に、検出を容易
にする基に共有結合されることにより標識されている球状凝集体（好ましくは、フルオロ
フォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、オワンクラゲ
（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ蛍光タ
ンパク質もしくは何らかの組み合わせ又はその蛍光活性誘導体；発色団；化学発光団、例
えば、ルシフェラーゼ、好ましくはＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）ルシフ
ェラーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ（発光細菌）ルシフェラーゼもしくは何らか
の組み合わせ又はその化学発光活性誘導体；酵素活性基、例えば、ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ又はその酵素活性誘導体；高電子密度基、例えば
、金含有基などの重金属含有基；ハプテン、例えば、フェノール誘導化ハプテン；強い抗
原性のある構造、例えば、Ｋｏｌａｓｋａｒ及びＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムな
どにより抗原性があると予想されるペプチド配列；別の分子に対するアプタマー；キレー
ト基、例えば、ヘキサヒスチジニル；さらに特異的なタンパク質－タンパク質相互作用に
介在する天然もしくは天然由来タンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎペアのメンバー
；磁気群、例えば、強磁性体群；又は^１Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓもしくは^１２５Ｉ又
はそれらの何らかの組み合わせを含む基などの放射活性基）；又は共有結合により、もし
くは高親和性相互作用による非共有結合によりフラッグ化されている、好ましくは、不活
性化、金属イオン封鎖、分解及び／又は沈降を促進する基に共有結合されている、好まし
くは、インビボでの分解を促進する基（より好ましくは、ユビキチン）でフラッグ化され
ている球状凝集体（このフラッグ化オリゴマーがインビボでアセンブルされている場合、
特に好ましい。）；又は何らかの上記の組み合わせにより修飾されている球状凝集体を指
す。このような標識及びフラッグ化基及びこれらをタンパク質に結合するための方法は当
技術分野で公知である。球状化の前、最中又は後に、標識及び／又はフラッグ化を行い得
る。本発明の別の態様において、球状凝集体誘導体は、標識及び／又はフラッグ化反応に
より球状凝集体から得ることができる分子である。従って、「Ａβ（Ｘ－Ｙ）単量体誘導
体」という用語は、本明細書中で、特に、球状凝集体に対して述べたように標識又はフラ
ッグ化されたＡβ単量体を指す。

【0059】

「より高い親和性」という用語は、本明細書中で、一方の未結合抗体及び未結合球状凝
集体と、他方の抗体－球状凝集体複合体との間の平衡が、抗体－球状凝集体複合体にさら
に偏っている、相互作用の程度を指す。同様に、「より小さい親和性」という用語は、本
明細書中で、一方の未結合抗体及び未結合球状凝集体と、他方の抗体－球状凝集体複合体
との間の平衡が、未結合抗体及び未結合球状凝集体にさらに偏っている相互作用の程度を
指す。

【0060】

「Ａβ（Ｘ－Ｙ）単量体」という用語は、本明細書中で、Ａβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドの単
離形態、好ましくは、その他のＡβペプチドとの基本的に非共有相互作用に関与していな
いＡβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドの形態を指す。実際に、Ａβ（Ｘ－Ｙ）単量体は通常、水溶液
の形態で与えられる。好ましくは、水性単量体溶液は、例えば本発明の抗体の結合親和性
を調べるために使用する場合、０．０５％から０．２％、より好ましくは、約０．１％
ＮａＯＨを含有する。別の好ましい状況において、水性単量体溶液は、０．０５％から０
．２％、より好ましくは、約０．１％ ＮａＯＨを含有する。使用する場合、適切な形式
で溶液を希釈することが好都合であり得る。さらに、通常、溶液調製後、２時間以内、特
に１時間以内、とりわけ３０分以内に溶液を使用することが好都合である。

【0061】

「原線維」という用語は、本明細書中で、電子顕微鏡下で原線維性構造を示す非共有結
合した個々のＡβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドの集合体を含む分子構造を指し、これはコンゴレッ
ドに結合し、偏光下で複屈性を示し、そのＸ－線回折パターンはクロス－β構造である。
原線維はまた、２４単位を超える、好ましくは、１００単位を超える凝集体の形成を導く
、変性剤非存在下での、例えば０．１Ｍ ＨＣｌ中での、適切なＡβペプチドの自己誘導
重合体凝集を含むプロセスにより得られる分子構造とも定義され得る。このプロセスは当
技術分野で周知である。好都合に、Ａβ（Ｘ－Ｙ）原線維は、水溶液の形態で使用される
。本発明の特に好ましい実施形態において、０．１％ＮＨ_４ＯＨ中でＡβペプチドを溶解
し、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：４に希釈し、
次いでｐＨ７．４に再調整し、３７℃にて２０時間インキュベートし、次いで１００００
ｇで１０分間遠心し、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で
再懸濁することにより、水性原線維溶液を調製する。

【0062】

「Ａβ（Ｘ－Ｙ）原線維」という用語は、本明細書中で、Ａβ（Ｘ－Ｙ）サブユニット
を含む原線維を指し、この場合、平均でサブユニットの少なくとも９０％がＡβ（Ｘ－Ｙ
）型のものであれば好ましく、サブユニットの少なくとも９８％がＡβ（Ｘ－Ｙ）型のも
のであればより好ましく、非Ａβ（Ｘ－Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値以下であれば最も
好ましい。

【0063】

８Ｆ５に戻って、図１ならびに８Ｃ５（図８）により明らかなように、Ａβ（１－４２
）球状凝集体特異的抗体モノクローナル抗体８Ｆ５及び８Ｃ５は、非特異的抗体６Ｇ１及
び６Ｅ１０とは異なり、主にＡβ（１－４２）球状凝集体型を認識し、凝集したＡβ（１
－４２）を含むＡβ（１－４０）又はＡβ（１－４２）単量体の標準的調製物を認識しな
い。特に、８Ｆ５は、ネイティブＰＡＧＥ－ウェスタンブロットによりＡβ（１－４２）
球状凝集体のみを検出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥウェスタンブロット分析では検出しないので
、このことから、コアＡβ（１－４２）球状凝集体構造における、より複雑な界面活性剤
－解離可能なサブユニット間エピトープへの結合が示唆される。サブユニット間エピトー
プは、少なくとも２個のサブユニットに位置する、複雑な非線形性スルースペース（ｔｈ
ｒｏｕｇｈ ｓｐａｃｅ）エピトープとして定義される。より具体的に、様々なＡβ（１
－４２）及びＡβ（１－４０）標準的調製物に対するドットブロット分析から、特異的８
Ｆ５及び８Ｃ５の場合、非球状Ａβ型（標準的Ａβ（１－４０）／（１－４２）単量体調
製物）、凝集Ａβ（１－４２）と対比してＡβ（１－４２）球状凝集体の認識に顕著な差
があるが、アイソフォーム非特異的抗体６Ｇ１及び６Ｅ１０の場合は顕著な差がないこと
が示される。８Ｆ５及び８Ｃ５は球状凝集体特異性があるが６Ｇ１及び６Ｅ１０は球状凝
集体特異性がないことは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、Ａβ（１－４２）球状凝集
体、Ａβ（１－４２）単量体、Ａβ（１－４０）単量体及び可溶性アミロイド前駆体タン
パク質α結合を定量することにより確認された。さらに、これらの抗体は、ネイティブウ
ェスタンブロッティング後には球状凝集体に接近するが、ＳＤＳウェスタンブロッティン
グ後には接近しないので、各抗体が、Ａβ（１－４２）のアミノ酸２０から３０の領域で
、サブユニットの間の構造的非線形性エピトープを認識すると思われる。例えば８Ｆ５又
は８Ｃ５などの球状凝集体選択的抗体によってＡβの球状凝集体型を特異的に標的とする
ことにより、１）不溶性アミロイド沈着を標的とすることが避けられ（これに結合するこ
とは、不溶性Ａβで免疫付与する際中に観察される炎症性の副作用の原因となり得る。）
；２）予知的な生理的機能を有することが報告されているＡβ単量体及びＡＰＰを使用せ
ず（Ｐｌａｎら、Ｊ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２３：５５３１－５５３５（２
００３）；３）不溶性沈着への大量の結合により隠されないか又は接近不可能でないため
、抗体のバイオアベイラビリティーが向上するので、球状凝集体に対するこのような特異
性は重要である。

【0064】

本発明はまた、モノクローナル抗体８Ｆ５及び８ＣＤの可変軽鎖及び重鎖をコードする
単離ヌクレオチド配列（又はその断片）ならびに、これらのコードヌクレオチド配列と少
なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％
、７７％、７８％又は７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１
％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％又は８９％）、より好ま
しくは少なくとも約９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％又は９９％）同一であるものを含むか、これらに相当するか、これらと
、同一であるか、ハイブリダイズ可能であるか又は相補的である、配列を有するヌクレオ
チド配列（又はその断片）も含む。（７０％と１００％との間及びこれらを含む全ての整
数（及びその一部）は、％同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。）。この
ような配列は、あらゆる源由来であり得る（例えば、天然源から単離されるか、半合成経
路介して産生されるか、又は合成デノボをの何れか。）。特に、実施例に記載のもの以外
の源からこのような配列を単離し得るか又はこのような配列は実施例に記載のもの以外の
源由来であり得る（例えば、細菌、真菌、藻類、マウス又はヒト）。

【0065】

上述のヌクレオチド配列に加えて、本発明はまた、モノクローナル抗体８Ｆ５及びモノ
クローナル抗体８Ｃ５の可変軽及び重鎖のアミノ酸配列（又はこれらのアミノ酸配列の断
片）も含む。さらに、本発明はまた、本発明のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約
７０％、好ましくは少なくとも約８０％及びより好ましくは少なくとも約９０％同一であ
るものを含むか、これらに相当するか、これらと、同一であるか又は相補的である、アミ
ノ酸配列（又はその断片）も含む（繰り返すが、７０％と１００％との間及びこれらを含
む全ての整数（及びその一部）も（上記のヌクレオチド配列同一性に関連して引用される
場合）、％同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。）。

【0066】

本発明の目的に対して、ヌクレオチド配列の「断片」は、特定のヌクレオチド配列の領
域に相当する、およそ、少なくとも６、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少な
くとも約１０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの連続
する配列として定義される。

【0067】

「同一性」という用語は、特定の比較枠又はセグメントにわたる、ヌクレオチドごとの
２つの配列の関連性を指す。従って、同一性は、２つのＤＮＡセグメント（又は２つのア
ミノ酸配列）の同じ鎖（センス又はアンチセンスの何れか）間の、同一性、対応性又は同
等性の程度として定義される。「配列同一性の％」は、特定の領域にわたり２つの最適に
アラインされた配列を比較し、一致している位置の数を得るために両配列において同一の
塩基又はアミノ酸がある位置の数を調べ、このような位置の数を比較しているセグメント
中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることにより計算される。Ｓｍｉｔｈ＆
Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムにより
、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０
）のアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法により、及び、関連するアル
ゴリズムを実行するコンピュータプログラムにより（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍａｃａ
ｗ Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅ
ｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５
１－１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳ
Ｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５
：３３８９－３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及
びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋ
ａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、
Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、配列の最適アラインメントを行い得る。（米国特許第５，９１
２，１２０号参照）。

【0068】

本発明の目的に対して、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の程度とし
て定義される。これは、二重らせんを形成するために、適切な条件下で、一方のＤＮＡセ
グメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズする能
力を測定することにより決定される。「相補的である」とは、規範的な塩基対形成規則に
基づきある一定の配列に対して対を形成する配列として定義される。例えば、あるヌクレ
オチド鎖中の配列Ａ－Ｇ－Ｔは、他方の鎖のＴ－Ｃ－Ａに対して「相補的」である。

【0069】

二重らせんにおいて、アデニンが一方の鎖に現れ、チミンが他方の鎖に現れる。同様に
、グアニンが一方の鎖で見られる場合は常に、他方でシトシンが見られる。２つのＤＮＡ
セグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間
でのハイブリッド二本鎖形成能が大きくなる。

【0070】

２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、一連の同一ならびに保存的アミノ酸残基が両配
列において存在することとして定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の程度が高い
ほど、２つの配列の、対応性、同一性又は同等性が高くなる。（２つのアミノ酸配列の間
の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、一連の正確に等しい又は不変のアミノ酸残基が両
配列において存在することとして意義される。）。「相補性」、「同一性」及び「類似性
」の定義は、当業者にとって周知である。

【0071】

「によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、このポ
リペプチド配列又はその一部は、その核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の、
少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸及びさらにより好ましくは
少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。

【0072】

さらに、核酸分子は、核酸分子の１本鎖形態が温度及びイオン強度の適切な条件下でそ
の他の核酸分子とアニールすることができる場合、別の核酸分子にハイブリダイズ可能で
ある（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）を参照）。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「スト
リンジェンシー」を定める。

【0073】

「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書で使用する場合、当業者にとって
容易に明らかになるであろうように、プローブ配列及び標的配列の性質に依存して、スト
リンジェンシーの適切な条件での核酸のハイブリダイゼーションを意味するために通常使
用される。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は当技術分野で周知であり、インキュ
ベート時間、温度及び／又は溶液のイオン強度を変化させることによる、所望のストリン
ジェンシーに依存した条件の調整は容易に行われる。例えば、上述のような、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９を参照のこと（これを参照により本明
細書中に組み込む。）。（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｂｅｌら編及びＴｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒ
ｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９８
３）も参照のこと。両者とも参照により本明細書中に組み込む。）。具体的に、条件の選
択は、ハイブリダイズさせる配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的Ｇ－Ｃ
含量及び許容されるミスマッチの量による。低ストリンジェンシー条件は、相補性の程度
がより低い鎖間の部分的ハイブリダイゼーションが望ましい場合に好ましい。完全又はほ
ぼ完全な相補性が望ましい場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高スト
リンジェンシー条件の場合、ハイブリダイゼーション溶液は、６ｘＳ．Ｓ．Ｃ．、０．０
１Ｍ ＥＤＴＡ、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液及び０．５％ＳＤＳを含有する。クローン化
ＤＮＡの断片の場合、約６８℃で約３から４時間、トータル真核ＤＮＡの場合、約１２か
ら約１６時間、ハイブリダイゼーションを行う。中程度のストリンジェンシーの場合、３
ｘ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド（ｐＨ７．５で
、この緩衝液の０．１Ｍ）の溶液及び５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液でのフィルタープレハイ
ブリダイズ及びハイブリダイズを利用し得る。３７℃で４時間プレハイブリダイズし、続
いて３，０００，０００ｃｐｍトータルに等しい標識プローブ量と３７℃で１６時間ハイ
ブリダイズし、次いで、２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄（室温で各1分間を
４回及び６０℃にて各３０分間を４回）し得る。乾燥後、フィルムに曝露する。より低い
ストリンジェンシーの場合、ハイブリダイゼーション温度を２本鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）よ
りも約１２℃低くする。Ｔ_ｍは、Ｇ－Ｃ含量及び２本鎖の長さならびに溶液のイオン強度
の関数として知られている。

【0074】

「ハイブリダイゼーション」には、２つの核酸が相補的配列を含有することが必要であ
る。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって、塩基間のミスマッ
チが起こり得る。上述のように、核酸をハイブリダイズさせるのに適切なストリンジェン
シーは、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。このような可変性は当技術分野で周知
である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似性又はホモロジーの程度が大
きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴ_ｍ値が大きくなる。１０
０ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、Ｔ_ｍを計算するための式がある（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、前出参照）。短い核酸のハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位
置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さによりその特異性が決まる（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、前出参照）。

【0075】

本明細書で使用する場合、「単離核酸断片又は配列」は、１本鎖又は２本鎖であり、場
合によっては合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含有する、ＲＮＡ又はＤＮＡのポ
リマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は
合成ＤＮＡの１以上のセグメントから構成され得る。（特定のポリヌクレオチドの「断片
」とは、およそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、
より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド及びさらにより好ましくは少なくとも約１
５ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの、特定のヌクレオ
チド配列の領域と同一又は相補的な連続配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。）。ヌ
クレオチド（通常、その５’－モノリン酸形態で見出される。）は、次のように１文字表
記で表される：アデニル酸又はデオキシアデニル酸に対して「Ａ」（それぞれＲＮＡ又は
ＤＮＡに対して）、シチジル酸又はデオキシシチジル酸に対して「Ｃ」、グアニル酸又は
デオキシグアニル酸に対して「Ｇ」、ウリジル酸に対して「Ｕ」、デオキシチミジル酸に
対して「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対して「
Ｙ」、Ｇ又はＴに対して「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ
」及び何れかのヌクレオチドに対して「Ｎ」。

【0076】

「機能的に同等の断片又はサブフラグメント」及び「機能的に同等の断片又はサブフラ
グメント」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、その断
片又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変化さ
せるか又はある種の表現型を生じさせる能力が保持されている、単離核酸断片の一部又は
部分配列を指す。例えば、形質転換された植物において所望の表現型を生じさせるための
キメラコンストラクトの設計において、断片又はサブフラグメントを使用することができ
る。活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物プロモーター配列に対して適切な方向
で、核酸断片又はそのサブフラグメントを連結することによるコサプレッション又はアン
チセンスにおける使用のために、キメラコンストラクトを設計することができる。

【0077】

「ホモロジー」、「相同の」、「実質的に同様の」及び「実質的に一致する」という用
語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらは、１以上のヌクレオチド塩基の変化
が、その核酸断片の、遺伝子発現介在能力又はある種の表現型生成能に影響を与えない核
酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の、非修飾断片に対して、得られる核酸断片の
機能特性を実質的に変化させない１以上のヌクレオチドの欠失又は挿入などの、本発明の
核酸断片の修飾も指す。従って、当業者にとって当然のことながら、本発明は、具体的な
代表的配列だけにとどまらないものを包含する。

【0078】

「遺伝子」とは、コード配列の前にある（５’非コード配列）及び後にある（３’非コ
ード配列）制御配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。

【0079】

「ネイティブ遺伝子」とは、それ自身の制御配列とともに天然に見出されるような遺伝
子を指す。一方、「キメラコンストラクト」とは、天然において通常は一緒に見出されな
い核酸断片の組み合わせを指す。従って、キメラコンストラクトは、異なる源由来の制御
配列及びコード配列又は、同じ源由来であるが、天然で通常見られるものとは異なる方式
で編成される制御配列及びコード配列を含み得る。（「単離された」という用語は、配列
がその天然の環境から離されることを意味する。）。

【0080】

「外来」遺伝子とは、宿主生物において通常は見られない遺伝子を指すが、これは、遺
伝子移入により宿主生物に導入される。外来遺伝子は、非ネイティブ生物又はキメラコン
ストラクトに挿入されたネイティブ遺伝子を含み得る。「トランス遺伝子」は、形質転換
手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。

【0081】

「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列
」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、又はその下流（３’非
コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、この配列は、転写、ＲＮＡプロセシン
グ又は安定性又は関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。制御配列には、以下に限定
されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列及びポリアデニル化認識配列が含まれ得る
。

【0082】

「プロモーター」又は「制御遺伝子配列」とは、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を
調節することができるＤＮＡ配列を指す。この配列は、隣接及びより遠位の上流エレメン
トからなり、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。従って、「エンハ
ンサー」は、プロモーター又は制御遺伝子配列活性を刺激することができ、プロモーター
の生来のエレメント又はプロモーターのレベル又は組織特異性を促進するために挿入され
た異種エレメントであり得るＤＮＡ配列である。プロモーター配列はまた、遺伝子の転写
部分内、及び／又は転写配列の下流にも位置し得る。プロモーターは、それらの全体にお
いて、ネイティブ遺伝子由来であるか、又は、天然で見られる様々なプロモーター由来の
様々なエレメントからなるか、又は合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者にとって当
然のことながら、異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は発生の異
なるステージにおいて、又は異なる環境条件に反応して、遺伝子の発現を支配し得る。殆
どの場合に、殆どの宿主細胞型において遺伝子発現を引き起こすプロモーターは、一般に
「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞で有用な様々なタイプの新しいプロモータ
ーが常に発見されている；Ｏｋａｍｕｒｏ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１－８２（１９８９）による編集物において、多くの
例を見出すことができる。殆どの場合において、制御配列の正確な境界は完全に定められ
ていないので、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し
得ることがさらに認められる。

【0083】

「イントロン」は、タンパク質配列の一部をコードしない遺伝子中の介在配列である。
従って、このような配列は、ＲＮＡに転写されるが、その後切り出され、翻訳されない。
この用語はまた、切り出されたＲＮＡ配列に対しても使用される。「エクソン」は、転写
され、その遺伝子由来の成熟メッセンジャーＲＮＡで見出される遺伝子配列の一部である
が、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部である必要はない。

【0084】

「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置する
ＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡの、翻訳開
始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡに対する主要な転写産物のプロ
セシング、ｍＲＮＡ安定性又は翻訳効率に影響し得る。翻訳リーダー配列の例は、（Ｔｕ
ｒｎｅｒ、Ｒ．及びＦｏｓｔｅｒ、Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）に記載されている。

【0085】

「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデ
ニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を与え得る制御シグナル
をコードするその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の
３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を与えることを特徴とする。様々な３’非
コード配列の使用については、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：
６７１－６８０（１９８９）により例示されている。

【0086】

「ＲＮＡ転写産物」とは、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写によ
り得られる産物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、
これは、一次転写産物と呼ばれるか、又は一次転写産物の転写後プロセシング由来のＲＮ
Ａ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、
イントロンがなく、細胞によりタンパク質へと翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」
とは、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、これから酵素逆転写酵素を用いて合成されるＤＮＡ
を指す。ｃＤＮＡは、１本鎖であるか、又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を
用いて２本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞内又は
インビトロでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写産物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」
とは、標的の一次転写産物又はｍＲＮＡの全てもしくは一部に相補的であり、標的遺伝子
の発現をブロックするＲＮＡ転写産物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アン
チセンスＲＮＡの相補性とは、具体的な遺伝子転写産物の何れかの部分との（即ち、５’
非コード配列、３’非コード配列、イントロン又はコード配列での）ものであり得る。「
機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ又は、翻訳され得ないが、
細胞性プロセスにおいて影響を有するその他のＲＮＡを指す。「相補」及び「逆相補（ｒ
ｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」という用語は、ｍＲＮＡ転写産物に関して本明
細書中で交換可能に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義するものである。

【0087】

「内在性ＲＮＡ」という用語は、天然であれ非天然であれ、本発明の組み換えコンスト
ラクトにより形質転換される前に（即ち、組み換え手段、突然変異誘発などにより導入さ
れる。）、宿主のゲノムに存在する何らかの核酸配列によりコードされる何らかのＲＮＡ
を指す。

【0088】

「非天然」という用語は、人工のものであり、天然で通常見られるものと一致しないこ
とを意味する。

【0089】

「操作可能に連結」という用語は、一方の機能が他方により制御されるような１つの核
酸断片における核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現を
制御可能である場合、そのプロモーターはコード配列に操作可能に連結されている（即ち
、コード配列がプロモーターの転写調節下にある。）。センス又はアンチセンス方向で、
コード配列を制御配列に操作可能に連結することができる。別の例において、直接又は間
接的に、標的ｍＲＮＡに対して５’又は標的ｍＲＮＡに対して３’に、又は標的ｍＲＮＡ
内で、本発明の相補的ＲＮＡ領域を操作可能に連結することができるか、又は標的ｍＲＮ
Ａに対して、第一の相補的領域が５’であり、その相補が３’である。

【0090】

「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、機能的最終産物の産生を指す。遺伝
子の発現は、遺伝子の転写及びｍＲＮＡの前駆体又は成熟タンパク質への翻訳を含む。「
アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲ
ＮＡ転写産物の産生を指す。「コサプレッション」とは、同一又は実質的に同様の外来又
は内在性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写産物の産生を指す（米国
特許第５，２３１，０２０号）。

【0091】

「成熟」タンパク質とは、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド、即ち、一次転写
産物において存在する何らかのプレ又はプロペプチドが除去されているものを指す。「前
駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの転写の一次産物を指し、即ち、プレ及びプロペプチド
がまだ存在するものである。プレ及びプロペプチドは、限定されないが、細胞内局在シグ
ナルであり得る。

【0092】

「安定な形質転換」とは、結果として遺伝的に安定な遺伝形質が得られる、宿主生物の
ゲノムへの核酸断片の移入を指す。一方、「一時的形質転換」とは、結果として統合又は
安定な遺伝なく遺伝子発現が起こる、宿主生物の核又はＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断
片の移入を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック
」生物と呼ばれる。「形質転換」という用語は、本明細書で使用する場合、安定的形質転
換及び一時的形質転換の両方を指す。

【0093】

本明細書中で使用される標準的組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当技術分野
で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９（本明細書中で以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ
」と呼ぶ。）においてより詳細に記載されている。

【0094】

「組み換え」という用語は、例えば、化学合成による、又は遺伝子操作技術による核酸
の単離セグメントの操作による、２つの異なった個別の配列のセグメントの人工的組み合
わせを指す。

【0095】

「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の繰り返しサイクルからなる、大量
の特定ＤＮＡセグメントの合成のための技術である（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）。通常、２本鎖ＤＮＡを加熱変
性させ、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングさ
せ、次いで中間温度で伸長させる。これらの連続的な３段階の１セットをサイクルと呼ぶ
。

【0096】

ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、短時間で鋳型の複製を繰り返すことによって
ＤＮＡを数百倍に増幅するために使用される強力な技術である。（Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３－
２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら、欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第
８４，７９６号；欧州特許出願第２５８，０１７号；欧州特許出願第２３７，３６２号；
Ｍｕｌｌｉｓ、欧州特許出願第２０１，１８４号；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８
３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ、米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら、米
国特許第４，６８３，１９４号）。このプロセスは、ＤＮＡ合成を開始させるために、特
異的なインビトロ合成オリゴヌクレオチドのセットを利用する。これらのプライマーの設
計は、分析するＤＮＡ配列に依存する。高温で鋳型を融解させ、プライマーを鋳型内の相
補的配列にアニーリングさせ、次いでＤＮＡポリメラーゼにより鋳型を複製する、多くの
サイクル（通常２０－５０）により、この技術を行う。

【0097】

アガロースゲルにおいて分離し、次いで臭化エチジウム染色し、ＵＶ透光で可視化する
ことにより、ＰＣＲ反応の産物を分析する。あるいは、産物に標識を組み込むために、放
射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加することができる。この場合、Ｘ線フィルムにゲルを曝露す
ることにより、ＰＣＲの産物を可視化する。放射性標識ＰＣＲ産物のさらなる長所は、個
々の増幅産物のレベルを定量できることである。

【0098】

「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」及び「組み換え発現コンストラ
クトという用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当業者にとっ
て周知の標準的方法を用いて細胞のゲノムに挿入することができる遺伝物質の機能的単位
を指す。このようなコンストラクトは、それ自身か、又はベクターと組み合わせて使用さ
れ得る。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者にとって周知のように、宿
主植物を形質転換するために使用するであろう方法に依存する。例えば、プラスミドを使
用することができる。当業者は、首尾よく形質転換し、選択し、本発明の単離核酸断片の
何れかを含有する宿主細胞を増殖させるために、ベクターに存在しなければならない遺伝
的エレメントを十分認識している。当業者はまた、異なる独立の形質転換事象の結果、異
なるレベル及びパターンの発現が得られること（Ｊｏｎｅｓら、（１９８５）ＥＭＢＯ
Ｊ．４：２４１１－２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８－８６）及び、従って、所望の発現レベル及びパターン
を示す株を得るために複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識するで
あろう。ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノザン分析、タンパク質発現のウエスタン
分析又は表現型分析により、このようなスクリーニングを行い得る。

【0099】

「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、様々な抗体の混合物を含有す
る「ポリクローナル」抗体調製物とは異なり、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を
共有する抗体を含有する抗体分子の調製物の１つを指すものとする。ファージ、細菌、酵
母又はリボソームディスプレイなどのいくつかの新規技術ならびにハイブリドーマ由来抗
体（例えば、標準的Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎハイブリドーマ法（（１９７５）
Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）などのハイブリドーマ技術により調製されたハ
イブリドーマによって分泌される抗体）に代表される古典的方法により、モノクローナル
抗体を生成させ得る。このように、非古典的方法により生じたものであり得るが、本発明
の非ハイブリドーマ由来アゴニスト性抗体もモノクローナル抗体と呼ばれる。

【0100】

本明細書で使用する場合、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有するその他の抗体
を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、球状凝集体に特異的に結合する単離
抗体は、球状凝集体以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかし
、球状凝集体に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対して交差反応性を有し得る。
さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであり得
る。

【0101】

本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用
語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結
合機能は、全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。このような抗体実
施形態はまた、二特異性、二重特異性又は多特異性形態でもあり得、２以上の様々な抗原
に特異的に結合する。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片
の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片
；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結され
た２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ
断片；（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ｄ
Ａｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）（これは１
つの可変ドメインを含有する。）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が
含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によりコー
ドされるが、これらは、組み換え法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって１価の分
子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーにより連結することが
できる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３参照。）。このような
１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるものとする。１
本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディーもこの範囲内に包含される。ダイアボディー
は、２価で、二特異性の抗体であり、ＶＨ及びＶＬのドメインが単一のポリペプチド鎖上
で発現されるが、使用しているリンカーが短すぎるため、同じ鎖上の２つのドメイン間で
対形成できず、それによりドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成せざるを得ず、２
つの抗原結合性部位が生じる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ
．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３参照）。このような
抗体結合特性は当技術分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ編、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ３－５４０－４１３５４－５）。

【0102】

またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、１以上のその他のタンパク質又はペプチド
と抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成されているより大きな免疫接着分子
の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作るための
ストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈ
ｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３－１０１）
及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作るための、システイン残基、マーカーペプチド
及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）
Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７－１０５８）が含まれる。全抗体の、それぞれ
パパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’
）_２断片などの抗体の一部を調製することができる。さらに本明細書中に記載のように、
標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができ
る。

【0103】

本明細書で使用する場合、「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段によって
調製、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞中にトランスフェク
トされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換え体から単離された抗
体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．Ｒ．、（１９９
７）ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．１５：６２－７０；Ａｚｚａｚｙ Ｈ．及びＨｉｇｈｓｍｉｔｈ
Ｗ．Ｅ．、（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５－４４５；Ｇａｖｉ
ｌｏｎｄｏ Ｊ．Ｖ．及びＬａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ２９：１２８－１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．及びＣｈａｍｅｓ Ｐ．（
２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３７１－３７８）、ヒト免疫グロ
ブリン遺伝子に対するトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された
抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２０、６２８７－６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ Ｓ－Ａ．及びＧｒｅｅｎ Ｌ．Ｌ．
（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １
３：５９３－５９７；Ｌｉｔｔｌｅ Ｍ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄ
ａｙ ２１：３６４－３７０参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子の他のＤＮＡ配列への
スプライシングを含む何らかの他の手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体を
含むものとする。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配
列由来の可変及び定常領域を有する。しかし、ある実施形態において、このような組み換
えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニック
である動物を使用する場合は、インビボ体細胞変異）が起こりやすく、従って組み換え抗
体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列由来であ
り、これらと関連している一方で、天然ではインビボのヒト抗体生殖細胞系列レパートリ
ー内に存在し得ない配列である。（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎ
ＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、１９９１も参照）。しかし、本
発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸
残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発又はイ
ンビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異）。（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９９０も参照）。

【0104】

「キメラ抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列及び別の種から
の定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変
領域を有する抗体など、を指す。

【0105】

「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む
が、この中でＶ_Ｈ及び／又はＶ_ＬのＣＤＲ領域の１以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列で
置換された抗体、例えば、マウスＣＤＲの１以上（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列
で置換されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、を指す。

【0106】

本発明の組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変領域を
有し、定常領域も含み得る（Ｋａｂａｔら（１９９１）前出参照）。しかし、ある実施形
態において、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配
列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合、インビボ体細胞突然変異誘発
）が起こりやすく、従って、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生
殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ領域由来であり、これらと関連する一方、ヒト抗体生殖細胞系列
レパートリー内にインビボでは天然に存在し得ない。しかし、ある実施形態において、こ
のような組み換え抗体は、選択的突然変異誘発又は復帰突然変異又は両方の結果である。

【0107】

「復帰突然変異」という用語は、ヒト抗体の体細胞突然変異アミノ酸のいくつか又は全
部を、相同生殖細胞系列抗体配列からの対応する生殖細胞系列残基で置換するプロセスを
指す。最大のホモロジーを有する配列を同定するために、本発明のヒト抗体の重鎖及び軽
鎖の配列を、個別に、ＶＢＡＳＥデータバンク中の生殖細胞系列配列とアラインする。Ｖ
ＢＡＳＥは、ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬデータライブラリの最新情報を含む、公開され
ている配列から作成される全てのヒト生殖細胞系列可変領域配列の包括的ディレクトリで
ある。このデータベースは、配列決定されたヒト抗体遺伝子の寄託先としてＭＲＣ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ
Ｋ）で開発された（ウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａ
ｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ－ｉｎｔｒｏ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１）。本発明のヒト抗体に
おける差異は、このような異なるアミノ酸をコードする定められたヌクレオチド位置にお
いて突然変異誘発することにより生殖細胞系列配列に戻される。従って、最終的ヒト抗体
において含まれるべきでないヒト抗体の何らかの所望の特性に影響を与えるために、抗原
結合及び突然変異後に見いだされる何らかのアミノ酸における直接的又は間接的役割につ
いて、復帰突然変異に対する候補として同定された各アミノ酸の役割を調べるべきである
。復帰突然変異を行うアミノ酸の数をできるだけ少なくするために、最も近い生殖細胞系
列配列とは異なるが第二の生殖細胞系列配列の対応するアミノ酸配列と同一であるアミノ
酸位置は不変のままであり得る（ただし、第二の生殖系列配列は、本発明のヒト抗体配列
と、当該アミノ酸の両側において少なくとも１０個、好ましくは１２個のアミノ酸が同一
であり同一線上であることが前提である。）。復帰突然変異は、抗体最適化の何れかの段
階で行い得る。

【0108】

「標識結合タンパク質」は、本発明の抗体又は抗体部分が誘導化されるか又は別の機能
的分子（例えば別のペプチド又はタンパク質）に連結される、タンパク質である。例えば
、本発明の標識結合タンパク質は、本発明の抗体又は抗体部分を別の抗体などの１以上の
その他の分子（例えば二特異的抗体又はダイアボディー）、検出可能な試薬、細胞毒性剤
、医薬物質及び／又は、別の分子（例えばストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジ
ンタグ）と抗体又は抗体部分の会合を媒介するタンパク質もしくはペプチドに機能的に連
結することにより（化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合などにより）得られ得る
。

【0109】

本発明の目的に対して、「グリコシル化結合タンパク質」は、抗体又はその抗原結合部
分が１以上の炭水化物残基を含有するタンパク質を含む。発生期のインビボタンパク質産
生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖（グリコシ
ル）残基が酵素により付加され得る（グリコシル化として知られるプロセス）。得られた
タンパク質は、共有結合されたオリゴ糖側鎖を有し、グリコシル化タンパク質又は糖タン
パク質として知られている。抗体は、Ｆｃドメインならびに可変ドメインにおいて１以上
の炭水化物残基を伴う糖タンパク質である。Ｆｃドメインの炭水化物残基は、Ｆｃドメイ
ンのエフェクター機能において重要な影響を有し、抗体結合又は抗体の半減期に対しては
あまり影響がない（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（２
００５）、ｐｐ．１１－１６）。一方、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合
活性に対して影響を有し得る。可変ドメインにおけるグリコシル化は、抗体結合親和性に
ネガティブな影響を有し得る（これは立体障害によると思われる。）（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら
、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１３６１－１３６７）か又はこの結果、
抗原に対する親和性が向上し得る（Ｗａｌｌｉｃｋ、Ｓ．Ｃ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１
９８８）１６８：１０９９－１１０９；Ｗｒｉｇｈｔ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９
１）１０：２７１７ ２７２３）。さらに、結合タンパク質のＯ－又はＮ－結合グリコシ
ル化部位が突然変異誘発されている、グリコシル化部位特異的突然変異誘発を行うことが
できる。当業者は、標準的な周知の技術を用いて、このような突然変異体を作製すること
ができる。生物学的活性を保持するが結合活性が増減しているグリコシル化部位特異的突
然変異誘発ももくろまれる。

【0110】

さらに、本発明の抗体又は抗原結合部分のグリコシル化を修飾することができる。例え
ば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体を作製し得る（即ち、この抗体は
グリコシル化されていない。）。例えば、抗原に対する抗体の親和性を向上させるために
、グリコシル化を変化させることができる。例えば、抗体配列内で１以上のグリコシル化
部位を変化させることにより、このような炭水化物修飾を行うことができる。例えば、結
果として１以上の可変領域グリコシル化部位が除去され、それによりその部位のグリコシ
ル化がなくなる、１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなグリコシル化に
より、抗原に対する抗体の親和性が向上し得る。このようなアプローチについては、国際
出願公開ＷＯ０３／０１６４６６Ａ２及び米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，
３５０，８６１号（それぞれ、その全体を参照により本明細書中に組み込む。）において
詳細に記載されている。

【0111】

さらに又はあるいは、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体又は分岐ＧｌｃＮ
Ａｃ構造が増加している抗体など、グリコシル化の改変型を有する修飾抗体を作製するこ
とができる。このような改変グリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能が向上する
ことが示されている。例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現
させることにより、このような炭水化物修飾を行うことができる。グリコシル化機構が変
化した細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組み換え抗体を発現させ、それによ
りグリコシル化が変化した抗体を産生させるために宿主細胞として使用することができる
（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：
２６７３３－２６７４０；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１
７６－１、ならびに、欧州特許ＥＰ１，１７６，１９５；国際出願公開ＷＯ０３／０３５
８３５及びＷＯ９９／５４３４２８０参照（それぞれ、その全体を参照により本明細書中
に組み込む。））。

【0112】

タンパク質グリコシル化は、関心のあるタンパク質のアミノ酸配列ならびにタンパク質
が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（例えば、グ
リコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ）を産生し得、利用可能な基質（ヌクレ
オチド糖）が異なり得る。このような要素のために、特定のタンパク質を発現させる宿主
の系に依存して、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基の構成が異なり得
る。本発明で有用なグリコシル残基には、以下に限定されないが、グルコース、ガラクト
ース、マンノース、フコース、ｎ－アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得る。好
ましくはグリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようなグリ
コシル残基を含む。

【0113】

異なるタンパク質グリコシル化の結果、タンパク質の特徴が異なり得ることは、当業者
にとって公知である。例えば、酵母などの微生物宿主において産生され、酵母内在性の経
路を利用してグリコシル化される治療用タンパク質の効力は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動
物細胞で発現される同じタンパク質の効力と比較して低くなり得る。このような糖タンパ
ク質はまたヒトにおいて免疫原性であり得、投与後のインビボ半減期が低下し得る。ヒト
及びその他の動物の特異的受容体は、特異的なグリコシル残基を認識し、血流からのその
タンパク質の急速な排出を促進し得る。その他の悪影響には、タンパク質折りたたみ、溶
解性、プロテアーゼに対する影響の受けやすさ、トラフィッキング、輸送、コンパートメ
ント化、分泌、その他のタンパク質又は因子による認識、抗原性又はアレルギー原性の変
化が含まれる。従って、熟練者は、グリコシル化の特異的組成及びパターン、例えば、ヒ
ト細胞又は意図する対象動物の種特異的細胞で産生されるグリコシル化組成及びパターン
と同一であるか、少なくとも似ているグリコシル化組成及びパターンを有する治療タンパ
ク質を好み得る。

【0114】

異種グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子改変することにより、宿主細
胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質の発現を行い得る。当技術分野で公知である
技術を用いて、熟練者は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す、抗体又はその抗原結合部
分を作製し得る。例えば、これらの酵母株で産生されるグリコシル化タンパク質（糖タン
パク質）が動物細胞、特にヒト細胞と同一であるタンパク質グリコシル化を示すよう、非
天然のグリコシル化酵素を発現するように、酵母株が遺伝子改変される（米国特許出願公
開第２００４００１８５９０号及び同第２００２０１３７１３４号及び国際出願公開ＷＯ
０５／１００５８４Ａ２）。

【0115】

さらに、当業者にとって当然のことながら、ライブラリのメンバー宿主細胞が様々なグ
リコシル化パターンの関心のあるタンパク質を産生するよう、様々なグリコシル化酵素を
発現するように遺伝子操作された宿主細胞のライブラリを用いて、関心のあるタンパク質
を発現させ得る。次いで、熟練者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する関心のあ
るタンパク質を選択し単離し得る。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パター
ンを有するタンパク質は、生物学的特性が改善又は変化している。

【0116】

本発明はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物に免
疫付与することにより、非ヒト、非マウス動物から、本発明のモノクローナル抗体を作製
するための方法を提供する。当技術分野で公知である方法を用いて、このような動物を作
製し得る。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウ
シ又はウマであり得る。免疫付与動物から抗体産生不死化ハイブリドーマを調製し得る。
免疫付与後、動物を屠殺し、当技術分野で周知であるように、脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫
細胞と融合させる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、前出を参照のこと。好ましい実
施形態において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞
株）。融合及び抗生物質選択後、抗原（例えば球状凝集体）もしくはその一部又は関心の
ある抗原を発現する細胞を用いて、ハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施
形態において、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）
、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて最初のスクリーニングを行う。ＥＬＩＳＡスクリーニン
グの例は、国際出願公開ＷＯ００／３７５０４（参照により本明細書中に組み込む。）で
与えられる。

【0117】

抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、下記で考察するように、強力なハ
イブリドーマ増殖、高抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特性についてさらにスク
リーニングする。ハイブリドーマを培養し、同系動物、免疫系を欠く動物（例えばヌード
マウス）においてインビボで、又はインビトロで細胞培養により、増殖させ得る。ハイブ
リドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は当業者にとって周知である。好ま
しくは、免疫付与される動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり
、脾臓Ｂ細胞をその非ヒト動物と同じ種由来の骨髄腫と融合させる。

【0118】

ある態様において、本発明は、アルツハイマー病の、治療、診断及び予防において使用
されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。好ましい実施形態にお
いて、このハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態におい
て、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの、非ヒト、非マウス種においてハ
イブリドーマを作製する。別の実施形態において、本ハイブリドーマはヒトハイブリドー
マであり、球状凝集体に対する抗体を発現するヒト細胞とヒト非分泌性骨髄腫を融合させ
る。

【0119】

米国特許第５，６２７，０５２号、国際出願公開ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏ
ｃｋ、Ｊ．Ｓ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：
７８４３－７８４８に記載のような、当技術分野で選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）と呼
ばれる手順を用いて、単一の単離リンパ球から、組み換え抗体を生成させ得る。この方法
において、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いて、関心のある抗体を分泌する１個の
細胞（例えば、免疫付与動物由来のリンパ球）をスクリーニンするが、ここで、抗原（例
えば球状凝集体）又はその断片は、ビオチンなどのリンカーを用いてヒツジ赤血球細胞に
カップリングされており、抗原に対する特異性を有する抗体を分泌する１個の細胞を同定
するために使用される。関心のある抗体分泌細胞の同定後、逆転写酵素－ＰＣＲにより重
及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを細胞からレスキューし、次いで、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞など
の哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えばヒト定常領域）に
関連して、これらの可変領域を発現させることができる。次に、例えばＩＬ－１８に対す
る抗体を発現する細胞を単離するためにトランスフェクト細胞を掬いだすことにより、イ
ンビボ選択リンパ球由来の増幅免疫グロブリン配列でトランスフェクトした宿主細胞をイ
ンビトロでさらに分析及び選択することができる。国際出願公開ＷＯ９７／２９１３１及
び国際出願公開ＷＯ００／５６７７２に記載のものなどのインビトロ親和性成熟法などに
よって、増幅免疫グロブリン配列をインビトロでさらに操作することができる。

【0120】

「キメラ抗体」という用語は、ある種からの重及び軽鎖の可変領域配列及び別の種から
の定常領域配列を含む抗体、例えばヒトの定常領域に連結されたマウス重及び軽鎖可変領
域を有する抗体を指す。

【0121】

「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、ある種からの重及び軽鎖の可変領域を含むが、
ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列で置換された抗
体、例えば、マウスＣＤＲの１以上（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されて
いるマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

【0122】

「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の種（例えばマウス）からの重及び軽鎖可変領
域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部分が、より「ヒトに近い」、
即ちよりヒト生殖細胞系列の可変配列に似ているように改変されている抗体を指す。ヒト
化抗体のあるタイプは、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬの配列中に導入されて対応
する非ヒトＣＤＲ配列に置換されている、ＣＤＲグラフト抗体である。特に、「ヒト化抗
体」という用語は、関心のある抗原に免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸
配列を有するフレームワーク（ＰＲ）領域及び実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有す
る相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体又はその変異体、誘導体、類似体もしくは断片
である。本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、ＣＤＲに関して、非ヒト
抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸
配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメイン
（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全てを含み、ここで
ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリン（即ちドナー抗体）のもの
に相当し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセン
サス配列のものである。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン（通常はヒト免
疫グロブリン）定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ある実施形態において、ヒト
化抗体は、軽鎖ならびに、少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。本抗体はま
た、重鎖の、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域も含み得る。ある実施形態
において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。その他の実施形態において、ヒト化
抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト
化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。

【0123】

このヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ及び何らかのアイソタ
イプ（以下に限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。）を
含む、免疫グロブリンの何らかのクラスから選択することができる。ヒト化抗体は、複数
のクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、当技術分野で周知である技術を用いて、
所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択し得る。

【0124】

ヒト化抗体の、フレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく
、例えば、その部位でＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレ
ームワークの何れかに相当しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の、置換、挿入
及び／又は欠失により、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに対して突然
変異誘発を行い得る。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異誘発は大
規模ではない。通常、ヒト化抗体残基の、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５
％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が親ＦＲ及びＣ
ＤＲ配列のものに相当する。本明細書で使用する場合、「コンセンサスフレームワーク」
という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を指す。さらに、
本明細書で使用する場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連免疫
グロブリン配列のファミリーにおいて最も高頻度に起こるアミノ酸（又はヌクレオチド）
から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｃ
ｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ １９８７参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位
置には、そのファミリーのその位置で最も高頻度に起こるアミノ酸がある。２種類のアミ
ノ酸が同等の頻度で起こる場合、何れかをコンセンサス配列に含めることができる。

【0125】

「活性」という用語は、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性などの活性を含む。

【0126】

「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合する能
力があるあらゆるポリペプチド決定基を含む。ある実施形態においては、エピトープ決定
基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面配
置を含み、ある実施形態においては、特定の３次元構造的特徴及び／又は特定の電荷的特
徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある実施形態において
、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を選択的に認
識した際に抗原に特異的に結合すると言われる。

【0127】

本明細書で使用する場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、（例えば、ＢＩＡｃ
ｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓ
ｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した、バイオセンサーマトリクス内
のタンパク質濃度の変化の検出による）リアルタイムの生体特異性相互作用の分析を可能
にする光学現象を指す。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３）
Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ Ｃｌｉｎ．５１：１９－２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９
９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５－１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ
．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８、２６８－２７７を参照のこと。

【0128】

本明細書で使用する場合、「Ｋ_ｏｎ」という用語は、当技術分野で公知のように、抗体
／抗原複合体を形成するための抗体の抗原への会合に対する「会合速度」定数を指すもの
とする。

【0129】

本明細書で使用する場合、「Ｋ_ｏｆｆ」という用語は、当技術分野で公知のように、抗
体／抗原複合体からの抗体の解離に対する「解離速度」定数を指すものとする。

【0130】

本明細書で使用する場合、「Ｋ_ｄ」という用語は、当技術分野で公知のように、特定の
抗体－抗原相互作用の「解離定数」を指すものとする。

【0131】

「標識結合タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、結合タンパク質の同
定を可能にする標識が組み込まれたタンパク質を指す。好ましくは、この標識は、例えば
、放射性標識アミノ酸の組み込み又はマークされたアビジンにより検出することができる
ビオチニル部分のポリペプチドへの結合など、検出可能マーカーである（例えば、光学的
方法又は比色法により検出することができる、蛍光マーカー又は酵素活性を含有するスト
レプトアビジン）。ポリペプチドに対する標識の例には、以下に限定されないが、次のも
のが含まれる：放射性同位元素又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ
、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ又は^１５３Ｓｍ
）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン又はランタニド蛍光体）、酵素標識（例え
ば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ
）；化学発光マーカー；ビオチニル基；第二のレポーターにより認識される予め定められ
たポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部
位、金属結合ドメイン又はエピトープタグ）；及びガドリニウムキレートなどの磁性物質
。

【0132】

「抗体共役物」という用語は、治療剤又は細胞毒性薬剤などの第二の化学部分に化学的
に連結された抗体などの、結合タンパク質を指す。「薬剤」という用語は、本明細書中で
、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は生体物質から調製された
抽出物を指すために使用される。好ましくは、治療用薬剤又は細胞毒性薬剤には、以下に
限定されないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エ
チジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビン
ブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン
ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテスト
ステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロ
ール及びプロマイシン、ならびにこれらの薬剤の類似物及びホモローグが含まれる。

【0133】

「結晶」及び「結晶化」という用語は、本明細書で使用する場合、結晶の形態で存在す
る、抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は、物質の固体状態の一形態である。

【0134】

「免疫付与する」という用語は、本明細書中で、その免疫レパートリーが天然の遺伝子
改変されていない生物であれ、又は人工的なヒト免疫レパートリーを提示するように改変
されたトランスジェニック生物であれ、免疫レパートリーに抗原を提示するプロセスを指
す。同様に、「免疫原製剤」は、アジュバント又は抗原の免疫原性を促進するその他の添
加物を含有する、抗原の処方物である。これの例は、ＧＬＰ－１受容体の精製形態のフロ
イント完全アジュバントとのマウスへの同時注射である。本明細書中で定義する場合、「
超免疫付与」は、強い免疫反応を発現させる意図での、宿主動物への、免疫原製剤におけ
る、連続的かつ複数回の抗原の提示の行為である。

【0135】

抗体の結合速度を測定するある方法は表面プラズモン共鳴による。「表面プラズモン共
鳴」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（Ｂｉａ
ｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｕｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔ
ａｗａｙ、ＮＪ）を使用した、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検
出によるリアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらな
る説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３）Ａｎｎａｌｅｓ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ（Ｐａｒｉｓ）５１：１９－２６；Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１
）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９９５
）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：１２５－
１３１及びＪｏｈｎｎｓｏｎら（１９９１）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １９８：２６８－２７７を参照のこと。

【0136】

「医薬的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒体
、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に
許容可能な担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセ
ロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せの１以上が含まれる。多くの場合、等
張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリ
ウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬的に許容可能な担体には、抗体又は抗体部分
の貯蔵期間又は有効性を高める、湿潤剤又は乳化剤、保存料又は緩衝剤などの、湿潤化物
質又は少量の補助物質などもさらに含まれ得る。

【0137】

本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有
効量」を含み得る。「治療的有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を
達成するのに有効な量を指す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者により決定さ
れ得、個体の、疾病のステ―ジ、年齢、性別及び体重、個体において所望の反応を誘発す
るための抗体又は抗体部分の活性などの因子に従い変化し得る。治療的有効量はまた、治
療上の有益な効果が抗体又は抗体部分の何らかの毒性又は有害な影響を上回るものでもあ
る。「予防的有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の予防結果を達成するのに有
効な量を指す。通常、疾患の前又は初期段階では、対象において予防的用量を使用するの
で、予防的有効量は治療的有効量より少量となろう。

【0138】

本発明の抗体及び抗体部分を例えば非経口投与に適切な医薬組成物に組み込むことがで
きる。好ましくは、本抗体又は抗体部分を０．１－２５０ｍｇ／ｍＬ抗体を含有する注射
用溶液として調製する。注射用溶液は、フリントガラス又はアンバーバイアル、アンプル
又はプレフィルドシリンジ中で、液体又は凍結乾燥製剤の何れかにより構成され得る。緩
衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ－ヒスチジン（１－５０ｍＭ
、最適には５－１０ｍＭ）であり得る。その他の適切な緩衝液には、以下に限定されない
が、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが
含まれる。０－３００ｍＭの濃度（液状製剤の場合、最適には１５０ｍＭ）で溶液の毒性
を変化させるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥製剤の場合、凍
結保護剤、基本的には０－１０％スクロース（最適には０．５－１．０％）を含有するこ
とができる。その他の適切な凍結保護剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。
凍結乾燥製剤の場合、充填剤、基本的には１－１０％マンニトール（最適には２－４％）
を含有することができる。安定化剤、基本的には１－５０ｍＭ Ｌ－メチオニン（最適に
は５－１０ｍＭ）を液状及び凍結乾燥製剤の両方で使用することができる。その他の適切
な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれ、０－０．０５％ポリソルベート－８０
（最適には０．００５－０．０１％）として含まれ得る。さらなる界面活性剤には、以下
に限定されないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。

【0139】

本発明の組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体
製剤、例えば溶液（例えば、注射用及び点滴用溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、
粉末、リポソーム及び座薬などが含まれる。好ましい剤形は、意図する投与方法及び治療
用途に依存する。通常の好ましい組成物は、注射用又は点滴用溶液、例えば他の抗体によ
るヒトの受動免疫法のために使用されるものと類似の組成物などである。好ましい投与方
法は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態にお
いて、本抗体は静脈内点滴又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において
、本抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。

【0140】

治療用組成物は、通常、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム又はその他の高い薬剤濃度
に適した秩序構造として処方することができる。滅菌注射用溶液は、活性化合物（即ち抗
体又は抗体部分）を、必要な量で、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した成分の
１つ又は組合せと共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製することができる。一
般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記で列挙したものからの必要なその他の成分を含
有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液を
調製するための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に何らかのさら
なる所望の成分を加えた粉末を、予めろ過滅菌したこれらの溶液から得る、真空乾燥及び
噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用す
ることにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び、界面活性
剤を使用することにより、維持することができる。組成物中に吸収を遅らせる物質、例え
ば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことにより、注射用組成物を持続的に吸収さ
せるようにすることができる。

【0141】

本発明の抗体及び抗体部分は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することがで
きるが、多くの治療用途に対して、好ましい投与の経路／方法は、皮下注射、静脈内注射
又は点滴である。当業者にとって当然のことながら、投与の経路及び／又は方法は、所望
の結果に依存して変化する。ある実施形態において、インプラント、経皮パッチ及びマイ
クロカプセル型送達系を含む制御放出製剤など、化合物を急速な放出から保護する担体を
用いて活性化合物を調製し得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、
コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用
することができる。このような処方物の調製のための多くの方法が特許取得されているか
、又は当業者に一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９
７８参照。

【0142】

ある実施形態において、例えば不活性希釈剤又は同化可能な可食担体と共に、本発明の
抗体又は抗体部分を経口投与し得る。硬殻又は軟殻のゼラチンカプセル、圧縮錠剤にこの
化合物（及び必要に応じてその他の成分）を封入するか、又は対象の食餌に直接混合し得
る。治療剤の経口投与の場合、賦形剤とともにこの化合物を配合し、経口摂取錠剤、口腔
錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用
し得る。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するために、この化合物をその不
活性化を防止する物質で被覆するか、又はこれらと一緒に投与することが必要であり得る
。

【0143】

補助的な活性物質を組成物中に配合することもできる。ある実施形態において、アルツ
ハイマー病又は関連疾患もしくは状態を治療するのに有用な１以上のさらなる治療剤と一
緒に、本発明の抗体又は抗体部分を処方、及び／又は一緒に投与する。例えば、本発明の
抗体の１つ又はその抗体部分を、その他の標的に結合する１以上のさらなる抗体とともに
同時処方及び／又は同時投与し得る。

【0144】

ある実施形態において、本発明のモノクローナル抗体又はその断片を当技術分野で公知
の半減期延長ビヒクルに連結し得る。このようなビヒクルには、以下に限定されないが、
Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが含まれる。このようなビヒク
ルは、例えば、米国出願０９／４２８，０８２及び公開ＰＣＲ出願ＷＯ９９／２５０４４
（これらをあらゆる目的のために参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている
。

【0145】

上述の手順に加えて、熟練者は、巨大分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構
築、操作及び単離、組み換え生物の作製及びクローンのスクリーニング及び単離に対する
具体的な条件及び手順を述べる標準的リソースに精通している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ、１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ、２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９９７）を参照）。

【0146】

モノクローナル抗体の使用
本発明のモノクローナル抗体（例えば８Ｆ５及び８ＣＦ）は、多くの興味深い有用性が
ある。例えば、上述のように、アルツハイマー病の、予防、治療及び診断において、本モ
ノクローナル抗体を使用し得る。さらに、抗－抗体の開発において、本抗体を使用し得る
。さらに、個々の抗体を産生するハイブリドーマにより、同一のモノクローナル抗体（即
ち試薬）の継続的な源を安定して産生することができ、よって、様々な実験ならびに治療
用途における抗体間の同一性が保証される。

【0147】

また、本発明の方法により、さらなる物質の調製での使用のための出発物質の適切な量
を調製できるようになり、言い換えれば、これは、アルツハイマー病の治療のためのモノ
クローナル抗体（又はその他の抗体）の産生において利用され得る。上記のように、本抗
体は、アルツハイマー病又は認知機能障害などのアルツハイマー病と同じ症状を特徴とす
るその他の関連する神経学的状態を予防するための受動免疫付与のためにも使用し得る。

【0148】

本発明のある診断実施形態において、本発明の抗体（例えば８Ｆ５）又はその一部で固
相を被覆する（又は、液相に存在する。）。次に、試験又は生体試料（例えば、全血、脳
脊髄液、血清など）を固相と接触させる。抗原（例えば球状凝集体）が試料中に存在する
場合、このような抗原が固相上の抗体に結合し、次いで、直接的又は間接的方法の何れか
により検出される。直接法は、複合体そのものの存在、従って抗原の存在を単純に検出す
ることを含む。間接的方法では、共役物を結合抗原に添加する。この共役物は、第二抗体
を含み、これは、シグナル生成化合物又は標識に結合された結合抗原に結合する。第二抗
体が結合抗原に結合すると、シグナル生成化合物が測定可能なシグナルを生成する。この
ようなシグナルは、試験試料中に抗原が存在することを示す。

【0149】

診断用免疫アッセイで使用される固相の例は、多孔及び非多孔材料、ラテックス粒子、
磁性粒子、微小粒子（例えば米国特許第５，７０５，３３０号参照）、ビーズ、膜、マイ
クロタイターウェル及びプラスチックチューブである。固相材料の選択及び共役物中に存
在する抗原又は抗体を標識する方法は、必要に応じて、所望のアッセイ方式の性能特性に
基づき決定される。

【0150】

上述のように、共役物（又は指標試薬）は、シグナル生成化合物又は標識に連結された
抗体（又はおそらく、アッセイによっては抗－抗体）を含む。このシグナル生成化合物又
は「標識」は、そのものが検出可能であるか、又は検出可能な産物を生成するための１以
上のさらなる化合物と反応し得る。シグナル生成化合物の例には、色原体、放射性同位元
素（例えば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ及び^１４Ｃ）、化学発光化合物
（例えばアクリジニウム）、粒子（可視性又は蛍光性）、核酸、錯化剤又は酵素などの触
媒（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオ
キシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）が含まれる。酵素を使用する
場合（例えば、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）、色
原、蛍光又は化学発光生成基質を添加することにより、検出可能なシグナルが生じる。時
間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法な
どのその他の検出系も有用である。

【0151】

上記免疫アッセイにより試験され得る体液の例には、血漿、全血、乾燥全血、脳脊髄液
又は組織及び細胞の水性もしくは有機－水性抽出物が含まれる。

【0152】

本発明はまた、試験試料中における抗体の存在を検出するための方法も包含する。この
方法は次の段階を含む：（ａ）抗－抗体／抗体複合体を形成させるのに十分な時間及び条
件下で、抗体を含有する疑いのある試験試料を患者試料中の抗体に特異的な抗－抗体と接
触させる段階（この抗－抗体は、患者試料中の抗体に結合する本発明の抗体である。）；
（ｂ）得られた抗－抗体／抗体複合体に共役物を添加する段階（この共役物は、検出可能
なシグナルを検出することができるシグナル生成化合物に連結された（抗－抗体に結合す
る）抗原を含む。）；及び（ｄ）シグナル生成化合物により生じたシグナルを検出するこ
とにより試験試料中に存在し得る抗体の存在を検出する段階。抗－抗体に対する抗体を含
む、対照又はキャリブレーターを使用し得る。

【0153】

本発明はまた、本明細書中に記載の抗体の１以上又はその一部と医薬的に許容可能なア
ジュバント（例えば、フロイントのアジュバント又はリン酸緩衝食塩水）と、を含有する
ワクチンも含む。

【0154】

キットも本発明の範囲内に含まれる。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病又
は認知機能障害を特徴とする別の状態である疑いのある患者において抗原（例えば球状凝
集体）の存在を調べるためのキットを含む。特に、試験試料中の抗原の存在を調べるため
のキットは、ａ）本明細書中で定義されるような抗体又はその一部；及びｂ）検出可能な
シグナルを生成することができるシグナル生成化合物に連結された第二抗体（抗原に対す
る特異性を有する。）を含む共役物を含む。本キットは、抗原に結合する試薬を含む対照
又はキャリブレーターならびにキットの利用法及びキットの成分を詳述する指示書も含有
する。

【0155】

本発明はまた、試験試料中の抗体を検出するためのキットも含む。本キットは、ａ）関
心のある抗体に特異的な抗－抗体（例えば本発明の１つ）及びｂ）上記で定義されるよう
な抗原又はその一部を含み得る。抗原に結合する試薬を含有する対照又はキャリブレータ
ーも含まれ得る。より具体的には、本キットは、ａ）抗体に特異的な抗－抗体（本発明の
１つなど）及びｂ）検出可能なシグナルを生じさせることができるシグナル生成化合物に
連結された抗原（例えば球状凝集体）を含有する共役物を含み得る。繰り返すが、本キッ
トはまた、抗原に結合する試薬を含有するキャリブレータ―の対照も含み得、キットの使
用法及びキットの成分を述べる指示書又は添付文書も含み得る。

【0156】

本キットはまた、各容器に前もってセットされた固相が付いた、バイアル、ボトル又は
ストリップなどの１つの容器及び個々の共役物を含有するその他の容器も含み得る。これ
らのキットはまた、洗浄、処理及び指標試薬など、本アッセイを行うのに必要なその他の
試薬のバイアル又は容器も含有し得る。

【0157】

本発明が、上記の全長抗体を含むだけでなく、その一部又は断片、例えばそのＦａｂ部
分も含むことにも注意されたい。さらに、本発明は、例えば結合特異性、構造などに関し
て、本発明の抗体と同じ特性を有するあらゆる抗体を包含する。

【0158】

寄託情報：モノクローナル抗体８Ｆ５を産生するハイブリドーマ（ＭＬ５－８Ｆ５．１
Ｆ２．２Ａ２）を、ブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ
、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０に２００５年１２月１日付けで寄託
し、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－７２３８が付与された。

【0159】

モノクローナル抗体８Ｃ５を産生するハイブリドーマ（ＭＬ５－８Ｃ５．２Ｃ１．８Ｅ
６．２Ｄ５）を、ブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、
Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０に２００６年２月２８日付けで寄託し
、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－７４０７が付与された。

【図面の簡単な説明】

【0160】

【図1】図１は、Ａβ（１－４２）単量体、Ａβ（１－４０）及びｓＡＰＰと対比した、球状凝集体への、８Ｆ５の選択性を示す。

【図2】図２は、上清中の、原線維結合重及び軽鎖抗体（レーン４、６、８）及び対応する非結合遊離断片（レーン３、５、７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図3】図３は、軽度認知障害（ＭＣＩ、左）又はアルツハイマー病（ＡＤ、右）の患者由来のＣＳＦ試料中のＡβ４２及びＡβ４０含量を示す。

【図4】図４は、ＡＰＰトランスジェニックマウスの３群（即ち、６Ｇ１、８Ｆ５、ＰＢＳ）及び非トランスジェニックの同腹仔（野生型）の１群における、既知の物体と対比した未知の物体と過ごす時間としての、新規物体認識指数を示す。

【図5A】図５（Ａ）は本明細書中で「８Ｆ５」と呼ぶモノクローナル抗体をコードする可変重鎖のＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。

【図5B】図５（Ｂ）は、モノクローナル抗体８Ｆ５をコードする可変軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。

【図6A】図６（Ａ）はモノクローナル抗体８Ｆ５の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。

【図6B】図６（Ｂ）はモノクローナル抗体８Ｆ５の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。

【図7A】図７Ａは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、特に、ＡＰＰトランスジェニックマウス系統Ｔｇ２５７６及びＡＤ患者（ＲＺ５５）での、脳組織の斑としての、及び脳血管での大脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）としての、コンゴレッド染色による、アミロイド沈着の検証を示す。

【図7B】図７Ｂは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、ＡＤ患者（ＲＺ１６）におけるＡβ（アミロイド斑）の実質性沈着の染色が６Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０によってのみ起こり、一方、８Ｆ５及び８Ｃ５では染色が非常に弱いことを示す。

【図7C】図７Ｃは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、ＴＧ２５７６マウスにおけるＡβ（アミロイド斑）の実質性沈着の強い染色が６Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０によってのみ起こり、一方、８Ｆ５及び８Ｃ５では染色が非常に弱いことを示す。

【図7D】図７Ｄは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、画像解析を用いた組織学的画像におけるＡβ斑染色の分析の定量を示す。

【図7E】図７Ｅは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、画像解析を用いた組織学的画像におけるＡβ斑染色の分析の定量を示す。

【図7F】図７Ｆは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、画像解析を用いた組織学的画像におけるＡβ斑染色の分析の定量を示す。

【図7G】図７Ｇは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、画像解析を用いた組織学的画像におけるＡβ斑染色の分析の定量を示す。

【図7H】図７Ｈは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示し、Ａβの血管沈着（矢印）の強い染色が６Ｇ１及び市販の抗体６Ｅ１０でのみ起こり、一方、８Ｆ５又は８Ｃ５での染色は非常に弱かったことを示す。

【図8】図８は、Ａβ（１－４２）単量体、Ａβ（１－４０）及びｓＡＰＰと対比した、球状凝集体に対する８Ｃ５の選択性を示す。

【図9A】図９（Ａ）は、８Ｃ５の重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。

【図9B】図９（Ｂ）は、８Ｃ５の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。

【図10A】図１０（Ａ）は、モノクローナル抗体８Ｃ５の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。

【図10B】図１０（Ｂ）は、モノクローナル抗体８Ｆ５の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。

【0161】

次の非限定的な実施例により本発明を説明し得る。

【実施例】

【0162】

（実施例Ｉ（ａ））
モノクローナル抗体８Ｆ５及び８Ｃ５の産生
ＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ）中の、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、２００５、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
、９５、８３４－８４７に記載のようなＡ－ｂｅｔａ（１－４２）球状凝集体５０ミリグ
ラムを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスにｓｕｂ－ｑで免疫付与し、１ヵ月間隔で２回免疫促
進した。脾臓を回収し、脾臓細胞をマウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞と５：１の比でＰＥＧ法
により融合させた。２ｘ１０^５個細胞／ｍＬ、ウェルあたり２００ｍＬで、アザセリン／
ヒポキサンチン選択培地中で９６ウェル皿に融合細胞をプレーティングした。目で見える
コロニーが形成されるように細胞を増殖させ、直接ＥＬＩＳＡアッセイにより、Ａ－ｂｅ
ｔａオリゴマー反応性について上清をアッセイした。抗体発現が安定になったと思われる
まで、限界希釈により、Ａ－ｂｅｔａオリゴマーに対する抗体を分泌するハイブリドーマ
をサブクローニングした。

【0163】

（実施例ＩＩ）
Ａβ（１－４０）及びＡβ（１－４２）の単量体調製物と比較した、８Ｆ５及び８Ｃ５
の優先的な球状凝集体への結合
８Ｆ５の選択性を試験するために、２つの別々に溶解したＡβ（１－４２）単量体調製
物、ならびに単量体に対する代替物として新たに調製したＡβ（１－４０）を使用した。
２種類の実験を行った。第一の実験において、球状凝集体由来であるが配座異性体非特異
的ＭＡｂ ６Ｇ１（Ｓ．Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９５
：８３４（２００５））を捕捉抗体として用いて、サンドイッチ－ＥＬＩＳＡにより、Ａ
β球状凝集体選択性について８Ｆ５を試験した。ビオチン化８Ｆ５を第二及び配座異性体
選択的抗体として使用した。この実験を下記実施例２．１で述べる。

【0164】

下記実施例２．２で述べる第二の例において、ドットブロット免疫アッセイにより、Ａ
β（１－４２）単量体及びＡβ（１－４０）単量体と対比したオリゴマー選択性を調べた
。この実験において、Ａβ（１－４２）単量体と比較した場合、ならびにＡβ（１－４０
）単量体と比較した場合、８Ｆ５は、（８Ｆ５と同様の領域にマッピングされるが、線状
ペプチドＡβ（１７-２４）による免疫付与由来である既知の抗体４Ｇ８（Ａｂｃａｍ
Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と比べて）Ａβ（１－４２）球状凝集体への優先
的な結合を示した。

【0165】

（実施例２．１）：モノクローナル抗体８Ｆ５及び８Ｃ５のオリゴマー選択性
ａ）Ａβ（１－４２）球状凝集体の調製：
９ｍｇ Ａβ（１－４２）Ｆａ．Ｂａｃｈｅｍを１．５ｍＬ ＨＦＩＰ（１．１．１．
３．３．３ヘキサフルオロ－２－プロパノール）中で溶解し、３７℃にて１．５時間イン
キュベートした。溶液をスピードバック中で蒸発させ、３９６μＬ ＤＭＳＯ中で懸濁し
た（５ｍＭ保存溶液）。超音波水浴中で２０秒間、試料を超音波破砕し、１０分間振盪し
、－２０℃で一晩保存した。

【0166】

４．５ｍＬ ＰＢＳ（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４
）で試料を希釈し、０．５ｍＬ ２％ＳＤＳ水溶液を添加した（０．２％ＳＤＳ含量）。
混合物を３７℃で７時間インキュベートし、１６ｍＬ Ｈ_２Ｏで希釈し、３７℃で１６時
間さらにインキュベートした。その後、Ａβ（１－４２）球状凝集体溶液を３０００ｇで
２０分間遠心した。３０ｋＤａセントリプレップにより上清を０．５ｍＬに濃縮した。濃
縮液を５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；３５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４に対して６℃にて一晩
透析した。続いて、Ａβ（１－４２）球状凝集体濃縮液を１００００ｇで１０分間遠心し
た。次に、上清を等分し、－２０℃で保存した。

【0167】

ｂ）ＨＦＩＰ前処理した単量体Ａβ（１－４２）の調製：
３ｍｇヒトＡβ（１－４２）、（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ）カタログ番号Ｈ－１３６８を
１．７ｍＬエッペンドルフチューブ中の０．５ｍＬ ＨＦＩＰ中で溶解し（６ｍｇ／ｍＬ
懸濁液）、透明な溶液が得られるまで３７℃にて１．５時間振盪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ
Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒ、１４００ｒｐｍ）した。スピードバック濃縮器中で試料を
乾燥させ（１．５時間）、１３．２μＬ ＤＭＳＯ中で懸濁し、１０秒間振盪し、次いで
、超音波浴中で破砕処理（２０秒）し、１０分間振盪した（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ
Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒ中で、１４００ｒｐｍ）。

【0168】

６ｍＬ ２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％プルロニックＦ
６８；ｐＨ７．４を添加し、室温で１時間撹拌した。試料を３０００ｇで２０分間遠心し
た。上清を捨て、０．６ｍＬ ２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；１％
プルロニックＦ６８；ｐＨ７．４中で沈殿物を溶解させた。３．４ｍＬの水を添加し、室
温で１時間撹拌し、次いで３０００ｇで２０分間遠心した。上清の８ｘ０．５ｍＬ分注物
を－２０℃で保存した。

【0169】

ｃ）ＮＨ_４ＯＨ中の単量体Ａβ（１－４２）の調製
１ｍｇ Ａβ（１－４２）固形粉末（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．カタログ番号Ｈ－１３６
８）を０．５ｍＬ ０．１％ＮＨ_４ＯＨ水（新たに調製）中で溶解し（２ｍｇ／ｍＬ）、
すぐに３０秒間室温で振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のために－２０℃で試料
を保存した。

【0170】

ｄ）単量体Ａβ（１－４０）の調製：
エッペンドルフチューブ中の０．２５ｍＬ ＨＦＩＰ中で１ｍｇ ヒトＡβ（１－４０
）、（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．カタログ番号Ｈ－１１９４）を懸濁した（４ｍｇ／ｍＬ懸
濁液）。３７℃にて１．５時間このチューブを振盪し（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ
Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒ中で、１４００ｒｐｍ）、透明な溶液を得て、その後、スピー
ドバック濃縮器中で乾燥させた（１．５時間）。４６μＬ ＤＭＳＯ中で試料を再溶解し
（２１．７ｍｇ／ｍＬ溶液）、１０秒間振盪し、次いで超音波浴中で２０秒間超音波破砕
した。１０分間振盪（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒ中、１４
００ｒｐｍ）した後、さらなる使用のために－２０℃で試料を保存した。

【0171】

ｅ）抗ＡβマウスＭＡｂ ８Ｆ５のビオチン化：
水中で新たに溶解した２μＬ ２０ｍｇ／ｍＬ スルホ－ＮＨＳ－ビオチン（Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｉｎｃ．カタログ番号２１４２０）にＰＢＳ中の５００μＬ 抗ＡβマウスＭＡｂ
８Ｆ５（０．６４ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３０分間振盪（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ
Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒ中、１４００ｒｐｍ）し、透析チューブ中で６℃で１６時間
、５００ｍＬ ２０ｍＭ Ｎａ Ｐｉ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４に対して透析
した。さらなる使用のために－２０℃で透析液を保存した。８Ｃ５を適宜にビオチン化し
た。

【0172】

ｆ）Ａβ試料に対するサンドイッチ－ＥＬＩＳＡ：

【0173】

ｇ）試薬リスト：
１．Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ カ
タログ番号：４３９４５４
２．結合抗体：抗－ＡβマウスＭＡｂ ６Ｇ１、ＰＢＳ中で溶解；濃度：０．４ｍｇ／
ｍＬ；－２０℃で保存。
３．コーティング緩衝液：１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム；ｐＨ９．６
４．ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ
カタログ番号：１１１２５８９
５．ＰＢＳＴ－緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４
６．ウシアルブミン フラクションＶ、プロテアーゼ不含；Ｓｅｒｖａ カタログ番号
：１１９２６．０３；４℃で保存。
７．ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ－緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ；０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４＋０．５％ＢＳＡ
８．Ａβ（１－４２）－球状凝集体標準保存液：５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；３５ｍＭ
ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中の溶液；濃度：１０．７７ｍｇ／ｍＬ；－２０℃で保存。
９．Ａβ（１－４２）単量体 ＨＦＩＰ処理標準保存液：３ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；２
１ｍＭ ＮａＣｌ；０．１５％プルロニックＦ６８；ｐＨ７．４中の溶液；濃度：０．４
５ｍｇ／ｍＬ；－２０℃で保存。
１０．ＮＨ_４ＯＨ中のＡβ（１－４２）単量体標準保存液；０．１％ＮＨ_４ＯＨ中の溶
液、濃度：２ｍｇ／ｍＬ；－２０℃で保存。
１１．Ａβ（１－４０）単量体ＨＦＩＰ処理標準保存液；ＤＭＳＯ中の溶液；濃度：２
１．７ｍｇ／ｍＬ；－２０℃で保存。
１２．ビオチン化抗－ＡβマウスＭＡｂ クローン８Ｆ５；ＰＢＳ中の溶液；濃度：０
．２４ｍｇ／ｍＬ；－８０℃で保存。
１３．ストレプトアビジン－ＰＯＤ共役物；Ｆａ．Ｒｏｃｈｅカタログ番号：１０８９
１５３。
１４．染色：ＴＭＢ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨカタログ番号：
９２８１７０６０；ＤＭＳＯ中４２ｍＭ；水中３％Ｈ_２Ｏ_２；１００ｍＭ酢酸ナトリウム
ｐＨ４．９。
１５．２Ｍスルホン酸溶液添加により染色を停止。

【0174】

試薬の調製：次のプロトコールを利用した：
１．結合抗体：ｍＭＡｂ ６Ｇ１保存溶液を凍結融解し、コーティング緩衝液中で１：
４００希釈。
２．ブロッキング試薬：ブロッキング試薬を１００ｍＬの水中で溶解し、ブロッキング
保存溶液を調製し、１０ｍＬずつ分注した液を－２０℃で保存。ブロッキングするために
各プレートに対して、２７ｍＬ水で３ｍＬブロッキング保存溶液を希釈。
３．Ａβ標準溶液：
ａ）Ａβ（１－４２）－球状凝集体
－１０７６μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに１μＬ Ａβ（１－４２）－球状凝集体
標準保存液を添加＝１０μｇ／ｍＬ
－４９５０μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに５０μＬ １０μｇ／ｍＬ Ａβ（１－
４２）－球状凝集体標準溶液を添加＝１００ｎｇ／ｍＬ
ｂ）Ａβ（１－４２）単量体ＨＦＩＰ－処理
－４４０μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに１０μＬ Ａβ（１－４２）単量体ＨＦＩ
Ｐ－前処理標準保存液を添加＝１０μｇ／ｍＬ
－４９５０μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに５０μＬ １０μｇ／ｍＬ Ａβ（１－
４２）単量体ＨＦＩＰ－前処理標準溶液を添加＝１００ｎｇ／ｍＬ
ｃ）ＮＨ_４ＯＨ中のＡβ（１－４２）単量体
－９９５μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡにＮＨ_４ＯＨ中の５μＬ Ａβ（１－４２）
単量体標準保存液を添加＝１０μｇ／ｍＬ
－４９５０μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡにＮＨ_４ＯＨ中の５０μＬ １０μｇ／ｍ
Ｌ Ａβ（１－４２）単量体標準溶液を添加＝１００ｎｇ／ｍＬ
ｄ）Ａβ（１－４０）単量体ＨＦＩＰ－前処理
－４９μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに１μＬ Ａβ（１－４０）単量体ＨＦＩＰ前
処理標準保存液を添加＝４３０μｇ／ｍＬ
－４２０μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに１０μＬ ４３０μｇ／ｍＬ Ａβ（１－
４０）単量体ＨＦＩＰ前処理標準溶液を添加＝１０μｇ／ｍＬ
－４９５０μＬ ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに５０μＬ １０μｇ／ｍＬ Ａβ（１－
４０）単量体ＨＦＩＰ前処理標準溶液を添加＝１００ｎｇ／ｍＬ

【0175】

【表1】

【0176】

１．一次抗体：ビオチン化ｍＭＡｂ ８Ｆ５：ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ－緩衝液中で
濃縮ビオチン化抗－ＡβｍＡｂ ８Ｆ５を希釈した。希釈係数は１／１２００＝０．２μ
ｇ／ｍＬであった。抗体はすぐに使用した。

【0177】

２．標識試薬：０．５ｍＬ水中で凍結乾燥したストレプトアビジン－ＰＯＤ共役物を再
構成。５００μＬグリセロールを添加し、１００μＬ分注物をさらなる使用のために－２
０℃で保存。濃縮標識試薬をＰＢＳＴ－緩衝液中で希釈。希釈係数は１／１００００。す
ぐに使用。

【0178】

３．染色溶液ＴＭＢ：２０ｍＬ １００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．９をＴＭＢ溶液２
００μＬ及び２９．５μＬ ３％過酸化水素水と混合。すぐに使用。

【0179】

【表2】

【0180】

使用利用：
１．ウェルあたり１００μＬの抗－Ａβ ｍＭＡｂ ６Ｇ１溶液を添加し、４℃で一晩
インキュベート。
２．抗体溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
３．ウェルあたり２６０μＬのブロッキング溶液を添加し、室温で２時間インキュベー
ト。
４．ブロッキング溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
５．標準を調製後、ウェルあたり標準１００μＬをプレートに添加。室温で２時間及び
４℃にて一晩インキュベート。
６．標準溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
７．ウェルあたり２００μＬの一次ビオチン化抗体 ８Ｆ５溶液を添加し、室温で１．
５時間インキュベート。
８．抗体溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
９．ウェルあたり２００μＬの標識溶液を添加し、室温で１時間インキュベート。
１０．標識溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
１１．各ウェルにＴＭＢ溶液１００μＬを添加し、室温でインキュベート（５－１５分
間）。
１２．染色を観察し、バックグラウンド染色開始後、停止溶液をウェルあたり５０μＬ
添加。
１３．４５０ｎｍでＵＶ読み取り。
１４．標準曲線から結果を計算。
１５．評価

【0181】

抗体８Ｆ５について図１で、抗体８Ｃ５について図８で結果を示す。ＬｏｇＥＣ５０値
は、別に調製した２種類のＡβ（１－４２）単量体（それぞれ２．７４５及び３．００３
）及びＡβ（１－４０）単量体（２．８２５）に対する換算値と比較して、Ａβ（１－４
２）球状凝集体抗原に対して著しく低い（１．９５８）。これらのデータから、Ａβ（１
－４２）単量体と対比して、Ａβ（１－４２）球状凝集体に対して抗体 ８Ｆ５が約１０
倍の選択性を有することが示される。

【0182】

抗体８Ｃ５を用いてほぼ同様の結果が得られ、これらを図８で示す。

【0183】

（実施例２．２）：モノクローナル抗体８Ｆ５及び８Ｃ５のオリゴマー選択性
－ドットブロット法によるＡβ球状凝集体に対するＡβ単量体の差別化：４Ｇ８に対す
る、８Ｆ５及び８Ｃ５の比較。

【0184】

ＰＢＳ中１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬの範囲で、Ａβ（１－４２
）球状凝集体、Ａβ１－４２単量体及びＡβ１－４０単量体の連続希釈液を調製した。各
試料のうち１μＬをニトロセルロース膜上にドット添加した。二次抗体としてアルカリホ
スファターゼにカップリングされた抗－マウスＩｇＧ及び染色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いて検出するために、マウス
モノクローナル抗体４Ｇ８及び８Ｆ５（０．２μｇ／ｍＬ）を使用した。１０ｐｍｏｌの
抗原濃度において、濃度計（ＧＳ８００、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳ
Ａ）を使用して強度について検出シグナルを分析した（反射密度＝ＲＤ）。全てのＡβ型
に対して、この濃度において、測定した反射密度は濃度計検出の直線範囲にあった。類似
のプロトコールで他方の抗体８Ｃ５を使用した。結果を下記表１で示す。

【0185】

【表3】

【0186】

特に、上記の結果から、８Ｆ５及び８Ｃ５は、４Ｇ８（これは、Ａβ（１７－２４）に
マッピングされる。（即ち直鎖状配列））に対する市販の抗－Ａβ（１－４２）抗体と比
較して、異なる結合プロファイルを示すことが分かる。より具体的には、８Ｆ５及び８Ｃ
５は、Ａβ４２単量体と対比して球状凝集体結合に対する選択性（４段目参照；１．４と
１を比較）ならびにＡβ４０と対比して球状凝集体結合に対する選択性（５段目；１６．
９と４．２を比較）を示す。標準的４Ｇ８よりもこれら２種類の結合選択性が向上してい
ることから、上述のように、８Ｆ５及び／又は８Ｃ５の使用において副作用が減少するは
ずである（例えば斑結合）。

【0187】

（実施例ＩＩＩ）
Ａβ（１－４２）原線維に対する８Ｆ５及び８Ｃ５の結合
８Ｆ５抗体は可溶性球状凝集体に対して生成されたので、８Ｆ５は沈着斑又は原線維物
質に結合しないはずであるという仮説を立てた。従って、重合化Ａβ原線維懸濁液に対す
る８Ｆ５の結合について次の実施例に記載のように試験を行った。

【0188】

Ａβ（１－４２）原線維の調製：１ｍｇ Ａβ（１－４２）（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．
、カタログ番号：Ｈ－１３６８）を５００μＬ ０．１％ＮＨ_４ＯＨ水溶液（エッペンド
ルフチューブ）中で溶解させ、試料を室温で１分間撹拌し、次いで１００００ｇで５分間
遠心した。上清をピペットで新しいエッペンドルフチューブに移し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタ
ンパク質濃度アッセイ（ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｉｎｃ．アッセイ法）に従い、Ａβ（１－４２
）濃度を測定した。

【0189】

この新たに調製したＡβ（１－４２）溶液１００μＬを３００μＬ ２０ｍＭ ＮａＨ
_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４で中和し、次いで２％ＨＣｌでｐＨ７．４
に調整した。この試料を３７℃にてさらに２０時間インキュベートし、遠心した（１０分
間、１００００ｇ）。上清を捨て、ボルテックス撹拌機で１分間撹拌しながら、４００μ
Ｌ ２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４で原線維ペレットを
再懸濁し、次いで遠心した（１０分間、１００００ｇ）。上清を捨てた後、この再懸濁手
順を繰り返し、最終原線維懸濁液をさらなる遠心により沈降させた（１０分間、１０００
０ｇ）。上清をもう一度捨て、ボルテックス撹拌機で１分間撹拌しながら３８０μＬ ２
０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中で最終ペレットを再懸濁
した。等量に分注した試料を冷凍庫で－２０℃で保存した。

【0190】

８０μＬ原線維懸濁液を３２０μＬ ２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣ
ｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４、緩衝液と混合し、室温で５分間撹拌し、次
いで超音波破砕（２０秒）した。遠心後（１０分間、１００００ｇ）、ボルテックス撹拌
機で撹拌しながら、１９０μＬ ２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４でペレットを再懸濁した。

【0191】

－Ａβ（１－４２）原線維への抗体の結合
この原線維懸濁液の１０μＬ分注液を次のものとインキュベートした：
ａ）１０μＬ ２０ｍＭ Ｎａ Ｐｉ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４、
ｂ）１０μＬ ０．１μｇ／μＬ ｍＭＡｂ ６Ｅ１０ Ｓｉｇｎｅｔ Ｉｎｃ．カタ
ログ番号９３２０（２０ｍＭ ｃ）ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４
中）、
ｄ）１０μＬ ０．１μｇ／μＬ ｍＭＡｂ ４Ｇ８ Ｓｉｇｎｅｔ Ｉｎｃ．カタロ
グ番号９２２０（２０ｍＭ Ｎａ Ｐｉ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中）、
ｅ）１０μＬ ０．１μｇ／μＬ ｍＭＡｂ ８Ｆ５（８Ｃ５）（２０ｍＭ Ｎａ Ｐ
ｉ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中）。

【0192】

３７℃にて２０時間試料をインキュベートした。最後に試料を遠心した（１００００ｇ
で１０分間）。未結合抗体分画を含有する上清を回収し、２０μＬ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試
料緩衝液と混合した。ボルテックス撹拌機で１分間撹拌しながら５０μＬ ２０ｍＭ Ｎ
ａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４緩衝液でペレット分画を洗浄し、次い
で遠心した（１０分間、１００００ｇ）。２０μＬの２０ｍＭ Ｎａ Ｐｉ；１４０ｍＭ
ＮａＣｌ；０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４緩衝液中で最終ペレットを再懸濁
し、２０μＬ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液中で溶解させた。

【0193】

－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
上清及び再懸濁ペレット試料を９８℃にて５分間加熱し、次の条件下で４－２０％Ｔｒ
ｉｓ／グリシンゲルに添加した：
ＳＤＳ－試料緩衝液：０．３ｇ ＳＤＳ；０．７７ｇ ＤＴＴ；４ｍＬ １Ｍ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ ｐＨ６．８；８ｍＬグリセロール；１ｍＬ １％ブロモフェノールブルー（
エタノール中）；５０ｍＬ ４－２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲル：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｉｎｃ．、番号ＥＣ６０２５ＢＯＸに水を添加。
ランニング緩衝液：７．５ｇ Ｔｒｉｓ；３６ｇグリシン；２．５ｇ ＳＤＳ；２．５
Ｌまで水を添加。
２０ｍＡでＰＡＧＥを行った。クーマシーブルーＲ２５０によりゲルを染色した。

【0194】

結果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色から、主に原線維懸濁液の上清に抗体の重及
び軽鎖が存在することが示され（レーン７、図２）、残りの原線維懸濁液にはわずかな抗
体物質しか示されず、同時に、４．５ｋＤに部分的に脱重合したＡβも示された。８Ｆ５
及び８Ｃ５とは対照的に、他の抗－Ａβ抗体は可溶性分画に現れなかった（６Ｅ１０、レ
ーン３、図２）か、又は原線維結合分画（レーン６、図２）と比較して少なかった（４Ｇ
８、レーン５、図２）。

【0195】

原線維結合及び上清分画中の抗体の重鎖からの反射密度値を測定し、次の式に従い計算
することにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から原線維型Ａβへの相対的結合を評価した：
原線維結合Ａｂ分画＝ＲＤ_{原線維分画}ｘ１００％／（ＲＤ_{原線維分画}＋ＲＤ_上清分画）

【0196】

次の値を得た。

【0197】

【表4】

【0198】

これらのデータから、標準的抗体６Ｅ１０と比較して、結合した８Ｆ５及び８Ｃ５が有
意に少ないことが示される。

【0199】

（実施例ＩＶ）
Ａβ（１－４０）と比較した内在性Ａβ（１－４２）球状凝集体の選択的結合
Ａβのオリゴマー概念に基づき、抗－Ａβオリゴマー抗体がまたインビボでも、特に軽
度認知障害及びＡＤ患者において、Ａβ（１－４０）よりもＡβ（１－４２）オリゴマー
に対して選択的結合を示し得ることが重要である。Ａβ（１－４０）よりもＡβ（１－４
２）種を低下させる概念は、ＮＳＡＩＤを介したＡＤの治療に対する治療アプローチにお
いて使用されている（Ｗｅｇｇｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４１４、２１２－２１６（２００
１））。Ａβ（１－４０）との関連でＡβ（１－４２）を低下させるＮＳＡＩＤは、アル
ツハイマー病の治療の中で最も高い有効性を示すことが確認されている。Ａβ（１－４２
）／Ａβ（１－４０）比は、選択的治療ならびに診断目的のために重要である。

【0200】

アルツハイマー病患者及びＭＣＩの患者からのＣＳＦ試料を用いて分析を行った。図３
で示される結果及び下記で述べる結果から、８Ｆ５は、より凝集の少ないＡβ（１－４０
）を上回りＡβ（１－４２）に対して高い比を検出するので、８Ｆ５は、６Ｅ１０のよう
なＡβ抗体を上回る大きな長所を有すると結論付けることができる。この長所によって、
ＭＣＩ及びＡＤ患者において、Ａβ（１－４２）型オリゴマーをより選択的に診断し、中
和することができるようになる。

【0201】

Ａ）オリゴマー選択的抗ＡβマウスＭＡＢ ８Ｆ５を用いた免疫沈降後の、ＭＣＩ及び
ＡＤ患者のＣＳＦにおける内在性アミロイドβ（１－４２）及びアミロイドβ（１－４０
）レベル：
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂへの抗－Ａβ ｍＭＡｂの固定化：
ａ）ｍＭＡｂ ６Ｅ１０ Ｓｉｇｎｅｔ Ｉｎｃ．、カタログ番号９３２０
ｂ）ｍＭＡｂ ８Ｆ５
０．４ｇ ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏ－ｔｅｃｈ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｎｏ．１７－０
４３０－０１）を１０ｍＬの１ｍＭ ＨＣｌ水溶液に添加し、室温で３０分間インキュベ
ートした。ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを１０ｍＬの１ｍＭ ＨＣｌで３回洗浄し、
１０ｍＬの１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３；５００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．３で２回洗浄し
た。各固定化抗体に対して、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３；５００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８
．３中の９５０μＬ ０．５ｍｇ／ｍＬ抗－Ａβ ｍＭＡｂ溶液に、１００μＬ ＣＮＢ
ｒ活性化セファロース４Ｂマトリクスを添加した。室温で２時間振盪後、１００００ｇで
５分間、試料を遠心した。次に、５００μＬ １００ｍＭエタノールアミン；１００ｍＭ
ＮａＨＣＯ_３；５００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．３緩衝液をビーズに添加し、試料を室
温で１時間振盪した。抗－Ａβ ｍＭＡｂ－セファロース試料を１００００ｇで５分間遠
心し、５００μＬの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４で５
回洗浄した。６℃で保存する前に、０．０２％最終濃度までアジ化ナトリウムを添加する
ことにより試料を安定化した。

【0202】

免疫沈降：
ａ）ｍＭＡｂ ６Ｅ１０－セファロース
ｂ）ｍＭＡｂ ８Ｐ５－セファロース
２００μＬ ２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４でヒト脳脊髄液試料２００μＬを希釈した。２μＬ
抗－Ａβ ｍＭＡｂ－セファロースマトリクスにこれらの試料を添加し、室温で２時間撹
拌した。これらの試料を１００００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、５０μＬ ＰＢＳ
で抗－Ａβ ｍＭＡｂ－セファロースを２回洗浄し、１分間撹拌し、遠心した（１０００
０ｇで５分間）。上清を捨て、５０μＬ ２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４
ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中でセファロースビーズを懸濁し、次いで、室温で１分間撹
拌して、１００００ｇで５分間遠心した。次の段階において、抗－Ａβ ｍＭＡｂ－セフ
ァロースビーズを５０μＬ ５０％ＣＨ_３ＣＮ；０．２％ＴＦＡ（水中）で処理した。室
温で１０分間振盪した後、試料を１００００ｇで５分間遠心した。上清を回収し、１．５
ｍＬエッペンドルフチューブに移した。５０μＬの水と試料を混合し、スピードバック濃
縮器中で蒸発させた。４μＬ ７０％ＨＣＯＯＨ中でペレットを再溶解し、室温で１０分
間振盪し、７６μＬ １Ｍ Ｔｒｉｓ溶液及び７２０μＬ ２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４Ｎ
ａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４で中和し
た。

【0203】

ＣＳＦ中のＡβ（１－４０）；（１－４２）単量体型の判定のための試料：
ａ）免疫沈降を行わないＣＳＦ試料中のＡβ含量：
３４２μＬの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０；ｐＨ７．４で１５８μＬのＣＳＦを希釈した。この１：３．１６希釈液をサンド
イッチＥＬＩＳＡに対して用い、評価中に考慮に入れた。
ｂ）免疫沈降後のＣＳＦ試料中のＡβ含量：
上述の手順からの試料を分析に用いた。

【0204】

ＣＳＦ中のＡβ（１－４０）の判定のために使用したサンドイッチ－ＥＬＩＳＡプロト
コール
試薬リスト：
１．Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅカタ
ログ番号：４３９４５４
２．結合抗体抗
抗－Ａβ ｍＡｂクローン６Ｅ１０；Ｓｉｇｎｅｔカタログ番号９３２０；濃度：０．
４ｍｇ／ｍＬ Ｂｒａｄｆｏｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）；－２０℃で保存。
３．カップリング緩衝液：１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム；ｐＨ９．６
４．ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ
カタログ番号：１１１２５８９
５．ＰＢＳＴ－緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４
６．Ａβ（１－４０）標準物質：Ａβ（１－４０）固形粉末；Ｂａｃｈｅｍカタログ番
号：Ｈ－１１９４；－２０℃で保存。
７．一次抗体：抗－Ａβ（１－４０）ウサギｐＡｂ；アフィニティー精製；ＰＢＳ中の
溶液；濃度：０．０３９ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｎｅｔカタログ番号９１３０－００５；－２
０℃で保存。
８．標識試薬：抗－ウサギ－ＰＯＤ共役物；Ｆａ．Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅ
ｓｅａｒｃｈカタログ番号：１１１－０３６－０４５；
９．染色：ＴＭＢ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨカタログ番号：９
２８１７０６０；ＤＭＳＯ中４２ｍＭ；３％Ｈ_２Ｏ_２水；１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ
４．９
１０．停止溶液 ２Ｍスルホン酸

【0205】

試薬調製のために使用したプロトコール：
１．結合抗体：抗－Ａβ ｍＡｂ ６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ Ｉｎｃ、カタログ番号９
３２０）を０．７μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈する。
２．ブロッキング試薬：ブロッキング保存溶液の調製のために、１００ｍＬ Ｈ_２Ｏ中
でブロッキング試薬を溶解させ、１０ｍＬずつ分注して－２０℃で保存する。１枚のＥＬ
ＩＳＡプレートをブロッキングするために、ブロッキング保存溶液３ｍＬを２７ｍＬ Ｈ
_２Ｏで希釈する。
３．Ａβ（１－４０）単量体型標準希釈液：
Ａ）Ａβ（１－４０）単量体標準保存液：２５０μＬ ０．１％ＮＨ_４ＯＨ中で０．５
ｍｇ Ａβ（１－４０）を溶解。濃度：２ｍｇ／ｍＬ；新たに調製；すぐに使用。
Ｂ）９９５μＬ ＰＢＳＴに５μＬ Ａβ（１－４０）－単量体標準保存液を添加＝１
０μｇ／ｍＬ。
Ｃ）４９９５μＬ ＰＢＳＴに５μＬの１０μｇ／ｍＬ Ａβ（１－４０）－単量体標
準溶液を添加＝１０ｎｇ／ｍＬ。
標準曲線

【0206】

【表5】

【0207】

【表6】

４．一次抗体：ＰＢＳＴ緩衝液中で抗－Ａβ（１－４０）ｐＡｂ濃縮液を希釈。希釈係
数は１／２００＝０．２μｇ／ｍＬ。すぐに使用。
５．二次抗体：凍結乾燥抗－ウサギ－ＰＯＤ共役物を０．５ｍＬ Ｈ_２Ｏ中で溶解し、
５００μＬグリセロールと混合する。次に抗体濃縮液を１００μＬずつ分注して－２０℃
で保存する。この濃縮液をＰＢＳＴ緩衝液中で１：１０，０００希釈する。この抗体溶液
をすぐに使用する。
６．ＴＭＢ溶液：１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９ ２０ｍＬを２００μＬ Ｔ
ＭＢ溶液及び３％過酸化水素２９．５μＬと混合する。この溶液をすぐに使用する。

【0208】

【表7】

【0209】

使用手順：
１．ウェルあたり１００μＬの結合抗体溶液を添加し、４℃で一晩インキュベート。
２．抗体溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
３．ウェルあたり２６０μＬのブロッキング溶液を添加し、室温で２時間インキュベー
ト。
４．ブロッキング溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
５．標準物質及び試料調製後、標準及び試料をウェルあたり１００μＬプレートに添加
し、室温で２時間、及び４℃で一晩インキュベート。
６．標準／試料溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
７．ウェルあたり２００μＬの一次抗体溶液を添加し、室温で１．５時間インキュベー
ト。
８．抗体溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
９．ウェルあたり２００μＬの標識溶液を添加し、室温で１時間インキュベート。
１０．標識溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
１１．各ウェルにＴＭＢ溶液１００μＬを添加し、室温でインキュベート（５－１５分
間）。
１２．発色を観察し、停止溶液をウェルあたり５０μＬ添加。
１３．４５０ｎｍで読み取り。
１４．標準曲線から結果を計算。
１５．評価。
未知試料からの吸光度が検量線の直線範囲にない場合、適切な試料希釈でＥＬＩＳＡを繰
り返す。

【0210】

ＣＳＦ中のＡβ（１－４２）単量体型の測定のために使用するサンドイッチ－ＥＬＩＳ
Ａプロトコール
試薬リスト：
１．Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅカタ
ログ番号４３９４５４
２．結合抗体：抗－Ａβ ｍＡｂクローン６Ｅ１０；Ｓｉｇｎｅｔカタログ番号９３２
０；濃度：０．４ｍｇ／ｍＬ Ｂｒａｄｆｏｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）；－２０℃で保存。
３．コーティング緩衝液：１００ｍＭ 炭酸水素ナトリウム；ｐＨ９．６
４．ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ
カタログ番号：１１１２５８９
５．ＰＢＳＴ－緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４
６．Ａβ（１－４２）標準物質：Ａβ（１－４２）固形粉末；Ｂａｃｈｅｍカタログ番
号：Ｈ－１３６８；－２０℃で保存。
７．一次抗体：抗－Ａβ（１－４２）ウサギｐＡｂ；アフィニティー精製；ビオチン化
；５０％グリセロールを含むＰＢＳ中の溶液；濃度：０．２５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｎｅｔ
カタログ番号９１３７－００５；－２０℃で保存。
８．標識試薬：抗－ウサギ－ＰＯＤ共役物；Ｆａ．Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅ
ｓｅａｒｃｈ カタログ番号：１１１－０３６－０４５
９．染色：ＴＭＢ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨカタログ番号：９
２８１７０６０；ＤＭＳＯ中４２ｍＭ ３％ Ｈ_２Ｏ_２（水中）１００ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ４．９
停止溶液：２Ｍスルホン酸

【0211】

試薬調製で使用する方法：
１．結合抗体：抗－Ａβ ｍＡｂクローン６Ｅ１０をコーティング緩衝液中で１：４０
０希釈。
２．ブロッキング試薬：１００ｍＬ水中でブロッキング試薬を溶解し、ブロッキング保
存溶液を調製し、１０ｍＬずつ分注して－２０℃で保存。各プレートをブロッキングする
ために、３ｍＬブロッキング保存溶液を２７ｍＬの水で希釈。
３．Ａβ（１－４２）単量体型、標準希釈液：
Ａβ（１－４２）単量体標準保存液：２５０μＬ ０．１％ＮＨ_４ＯＨ中で０．５ｍｇ
Ａβ（１－４２）を溶解；濃度：２ｍｇ／ｍＬ；新たに調製；すぐに使用。
９９５μＬ ＰＢＳＴに５μＬのＡβ（１－４２）－単量体標準保存液を添加＝１０μ
ｇ／ｍＬ。
４９９５μＬ ＰＢＳＴに５μＬの１０μｇ／ｍＬ Ａβ（１－４２）－単量体標準溶
液を添加＝１０ｎｇ／ｍＬ。

【0212】

【表8】

【0213】

【表9】

【0214】

使用手順：
１．一次抗体：ＰＢＳＴ緩衝液中で抗－Ａβ（１－４２）ｐＡｂ濃縮液を希釈。希釈係
数は１／１２５０＝０．２μｇ／ｍＬ。すぐに使用。
２．標識試薬：０．５ｍＬの水中で抗－ウサギ－ＰＯＤ共役物の凍結乾燥物を再構成。
５００μＬグリセロールを添加し、さらなる使用のために、－２０℃で１００μＬずつ分
注して保存。
ＰＢＳＴ－緩衝液中で濃縮標識試薬を希釈。希釈係数は１／５０００。すぐに使用。
３．ＴＭＢ溶液：２０ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ４．９をＴＭＢ溶液２０
０μＬ及び２９．５μＬ ３％過酸化水素水と混合。すぐに使用。

【0215】

【表10】

【0216】

使用手順：
１．ウェルあたり１００μＬの結合抗体溶液を添加し、４℃にて一晩インキュベート。
２．抗体溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
３．ウェルあたり２６０μＬのブロッキング溶液を添加し、室温で２時間インキュベー
ト。
４．ブロッキング溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
５．標準物質及び試料を調製後、標準物質及び試料をウェルあたり１００μＬプレート
に添加。室温で２時間及び４℃で一晩インキュベート。
６．標準／試料溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
７．ウェルあたり２００μＬの一次抗体溶液を添加し、室温で１．５時間インキュベー
ト。
８．抗体溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
９．ウェルあたり２００μＬの標識溶液を添加し、室温で１時間インキュベート。
１０．標識溶液を捨て、２５０μＬ ＰＢＳＴ－緩衝液でウェルを３回洗浄。
１１．各ウェルにＴＭＢ溶液１００μＬを添加し、室温でインキュベート（５－１５分
間）。
１２．染色を観察し、停止溶液をウェルあたり５０μＬ添加。
１３．４５０ｎｍで読み取り。
１４．標準曲線から結果を計算。
１５．評価。
未知試料からの吸光度が検量線の直線範囲にない場合、適切な試料希釈でＥＬＩＳＡを繰
り返す。

【0217】

【表11】

【0218】

上記の結果から、次のことが示される：
ａ．６Ｅ１０のような非球状凝集体選択的抗体と比較して、８Ｆ５（又は８Ｃ５）のよ
うな球状凝集体優先的抗体は、病状とは独立に、Ａβ４０に比してＡβ４２に選択的に結
合する。Ａβ４０よりもＡβ４２を優先的に排除することは、ＡＤ治療（例えば、Ｒ－フ
ルビロフェン、Ｆｌｕｒｉｚａｎ（Ｍｙｒｉａｄ Ｉｎｃ．により公開された臨床治験で
のＡＤ治療において有効性が示されている。）の使用による。）における概念に従うので
、この結果は、アルツハイマー病に対する奏功する治療であることを示す。この概念は、
Ｓ．Ｗｅｇｇｅｎら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００３）２７８（３４）：３１８３
１－７）により発表された。結果を図３で示す。

【0219】

ｂ．８Ｆ５（又は８Ｃ５）のような球状凝集体優先的抗体は、健常者対照と比較して患
者において、Ａβ４０よりもＡβ４２に非常によく結合する。上述のように、Ａβ４０よ
りもＡβ４２を優先的に排除することは、ＡＤ治療（例えばＲ－フルビプロフェンのよう
な非ステロイド系抗炎症剤の使用による。）における概念として続くので、この結果から
、アルツハイマー病に対する奏功する治療であることがさらによく示唆される（図３参照
。）。

【0220】

Ｂ）球状凝集体非選択的抗体６Ｅ１０と比較した、球状凝集体選択的抗－ＡβマウスＭ
ＡＢ ８Ｆ５又は８Ｃ５を用いた免疫沈降後の、ヒトＣＳＦ中の内在性アミロイドβ（１
－４２）及びアミロイドβ（１－４０）レベル：
ｂ１）ダイナビーズＭ－２８０ ヒツジ抗－マウスＩｇＧによる免疫沈降（ＩＰ）
Ａβ－抗体溶液：標準的精製手順に従い、ハイブリドーマから次の純粋な抗体を得た：
－ｍＭＡｂ ６Ｅ１０；Ｆａ．Ｓｉｇｎｅｔ番号９３２０；ＰＢＳ緩衝液中１ｍｇ／ｍ
Ｌ
－ｍＭＡｂ ８Ｆ５；ＰＢＳ緩衝液中１．６５ｍｇ／ｍＬ
－ｍＭＡｂ ８Ｃ５；ＰＢＳ緩衝液中１．４４ｍｇ／ｍＬ
ダイナビーズ Ｍ－２８０ヒツジ抗－マウスＩｇＧ：
ヒツジ抗－マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、カタログ番号：１１２．
０２）を磁気ビーズ（ダイナビーズ）に共有結合させる。
モノクローナルマウス抗体によるダイナビーズの活性化
－ダイナビーズ（ダイナビーズ Ｍ－２８０ ヒツジ抗－マウスＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ；製品番号１１２．０２）の保存懸濁液を泡立たないよう慎重に振盪した。
－１ｍＬを無菌的に取り、１．５ｍＬ反応バイアルに移した。
－１ｍＬ免疫沈降（ＩＰ）－洗浄緩衝液（ＩＰ－洗浄緩衝液：ＰＢＳ（２０ｍＭ Ｎａ
Ｈ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）でダイ
ナビーズを５分間３回洗浄した。
－洗浄手順中、上清を慎重に除去し、一方、磁気選別機スタンド（ＭＳＳ）を用いてダ
イナビーズを反応バイアルの側面に固定化した。
－１ｍＬ ＰＢＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中の４０μｇ Ａβ－抗体とともに、洗
浄したダイナビーズをインキュベートした。
－４℃で振盪しながら、一晩インキュベートすることにより活性化を行った。
－１ｍＬ ＩＰ－洗浄緩衝液（ＰＢＳ（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．４）、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）で活性化ダイナビーズを３０分、４回
洗浄した（再びＭＳＳを使用）。
－活性化ダイナビーズを１ｍＬ ＰＢＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２（ｗ／
ｖ）％Ｎａ－アジドで再懸濁し；ボルテックスにかけ、短時間遠心した。
－さらなる使用まで、抗体活性化ダイナビーズを４℃で保存した。

【0221】

ＣＳＦ試料調製：
アルツハイマー病患者からの４００μＬ ＣＳＦを４μＬ完全プロテアーゼ阻害剤カク
テル（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．カタログ番号：１６９７４９８、１ｍＬの水中で１錠を溶解
）に添加し、０．８μＬの５００ｍＭ ＰＭＳＦをメタノール中で溶解した。１０分後、
１．６ｍＬの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０、ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）を添加した。

【0222】

ヒトＡＤ－ＣＳＦからのＡβ種の免疫沈降：
２５μＬの抗－Ａβ－ダイナビーズ懸濁液に調製済みＣＳＦ試料の２５０μＬ分注液を
添加した。
－６℃にて１６時間撹拌しながら免疫沈降させた。５分間、３回、１ｍＬ ＰＢＳ／０
．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて、最後に１ｍＬ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７
．５緩衝液を用いて３分間、１回、続くビーズの洗浄を行った。洗浄手順中、上清を慎重
に除去し、一方、磁気選別機スタンド（ＭＳＳ）を用いてダイナビーズを反応バイアルの
側面に固定化した。

【0223】

最後の洗浄段階後、残渣上清を完全に除去した。β－メルカプトエタノール不含の２５
μＬ試料緩衝液（０．３６Ｍビストリス、０．１６Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ、１％ＳＤＳ（ｗ／
ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）
をエッペンドルフチューブに添加し、ヒートブロック中で９５℃にて５分間加熱すること
により、Ａβペプチド及び対応する抗体をダイナビーズから除去した。室温に冷ました後
、磁気選別機スタンド（ＭＳＳ）を用いてダイナビーズを反応バイアルの側面に固定化し
、上清を別のエッペンドルフチューブに移した（ＩＰ溶出液）。

【0224】

尿素－ＰＡＧＥとそれに続くウエスタンブロット法によるＡβ免疫沈降の分析：
Ｈ．Ｗ．Ｋｌａｆｋｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３７
、２４－２９（１９９６）により最初に記載された手順及び後にＪ．Ｗｉｌｔｆａｎｇら
、Ｊ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８１、４８１－４９６、２００２によって
も使用された手順に従う、８Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動系及び続くウエスタ
ンブロット分析により、Ａβ１－４０及びＡβ１－４２種の定量を行った。実験手順にお
いて２点のみ細かい変更を行った：
１）スタッキングゲル中のＳＤＳ濃度を０．１％（ｗ／ｖ）から０．２５％（ｗ／ｖ）
に調整した。
２）ウエスタンブロットに対して、抗体１Ｅ８（Ｓｅｎｅｔｅｋ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）を抗
－ヒトアミロイドβ（Ｎ）（８２Ｅ１）マウスＩｇＧ ｍＡｂ（ＩＢＬ、カタログ番号：
１０３２３）に変更した。

【0225】

免疫沈降試料の１５μＬ ＩＰ溶出液分注物を８Ｍ尿素ＰＡＧＥに添加した。１００Ｖ
（１５分間）で電気泳動を行い、６０Ｖで続けた。青色の試料ローディング色素の一番先
頭がゲルの末端から０．５ｃｍになったところで電気泳動を停止した。

【0226】

ウエスタンブロット手順：
７．５ｃｍｘ９ｃｍニトロセルロース０．４５μｍ（ＢｉｏＲａｄ Ｉｎｃ．）上でセ
ミドライブロットチャンバー（ＢｉｏＲａｄ Ｉｎｃ．、７５ｍＡで４５分間）において
ウエスタンブロット分析を行った。
ブロッティング緩衝液：６ｇ Ｔｒｉｓ；２８．１ｇグリシン；５００ｍＬメタノール
；水で２．５Ｌに調整。

【0227】

ニトロセルロースブロットを１０分間１００℃にてＰＢＳ中で煮沸した。ＲＴで１時間
、ＰＢＳＴ中の５０ｍＬ ５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて処理することによりこのブロッ
トを飽和させた。液相を除去後、次の洗浄段階を２回行った：ＲＴで１０分間、５０ｍＬ
ＴＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液；０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．５）を用いて、及び続いて、ＲＴにて１０分間、５０ｍＬ ＴＢ
Ｓ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液；ｐＨ７．５）を用いた
。さらなる発色のために、最終洗浄緩衝液をブロットから捨て、１５ｍＬの抗体Ｉ溶液（
０．２μｇ／ｍＬ ８２Ｅ１＝１：５００（１５ｍＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末
（Ｌａｓａｎａ Ｉｎｃ．）含有ＴＢＳ中）を６℃で２０時間添加した。緩衝液を除去し
た後、上述の３回の洗浄段階を行った。ＲＴで１時間、抗体溶液ＩＩ（抗－マウス－ＰＯ
Ｄの１：１００００希釈液（１５ｍＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末（Ｌａｓａｎａ
Ｉｎｃ．）含有ＴＢＳ中）とともにこのブロットをインキュベートした。緩衝液を除去
した後、上述の３回の洗浄段階を行った。

【0228】

最後の洗浄緩衝液を除去した後、２ｍＬ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅ
ｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｅｎｈａｎｃ
ｅｒ及び２ｍＬ過酸化水素水を混合した。暗所で５分間プレインキュベートしたブロット
上に新たに調製した溶液を注いだ。ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム（ＢｉｏＲａ
ｄ）を用いて化学発光を記録した。

【0229】

イメージングパラメータ：
－露光時間１８０秒
３０秒、６０秒、１２０秒及び１８０秒後に画像を記録
露光時間が１８０秒の画像から結果を得た。

【0230】

【表12】

【0231】

上記の結果から、８Ｆ５又は８Ｃ５などの球状凝集体優先的抗体は、６Ｅ１０などの非
球状凝集体選択的抗体と比較して、ヒトＣＳＦ中のＡβ４０よりもＡβ４２によく結合す
ることが示される。上述のように、Ａβ４０よりもＡβ４２を選択的に排除することは、
ＡＤ治療（例えばＲ－フルビプロフェンの使用による（上記参照）。）における概念とし
て続くので、この結果から、アルツハイマー病に対して奏功する治療であることが示唆さ
れる。

【0232】

（実施例Ｖ）
８Ｆ５は、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて新規物体認識を向上させる。

【0233】

抗体８Ｆ５で内部Ａβ（１－４２）球状凝集体エピトープを中和することによる、認知
に対する陽性効果を試験するために、ＡＰＰトランスジェニックマウスを用いた受動免疫
付与実験を行い、この実験において、マウスが以前に探知した物体を記憶する能力につい
てマウスを試験した。ある程度の１回目と２回目の物体遭遇の間の遅延の後、ＡＰＰトラ
ンスジェニックマウスは既に探知した物体を認識することができない。この実験は、動物
の本来の好奇心に基づくものであり、既に探知した物体への関心を著しく欠くことは、物
体認識を示す。

【0234】

（実施例Ｖ．１）：
モノクローナル抗体８Ｆ５による認識指数の向上：
動物：３ヵ月齢の、ＦＶＢｘＣ５７Ｂ１バックグラウンド（ＡＰＰ／Ｌ、ＲｅＭＹＮＤ
、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）のアルツハイマー病の単一のトランスジェニックマウ
スモデルの雌マウス及び、ＦＶＢｘＣ５７Ｂ１バックグラウンドの野生型対照として陰性
同腹仔を使用した。全マウスの遺伝子型を３週齢でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
り調べ、ＰＣＲの結果が分かり、試験開始前に２回目のＰＣＲによって二重にチェックし
た後、固有の識別番号を与えた。全マウスを無作為化し、齢をマッチさせ、即ち、コンピ
ュータによってこれらに無作為の番号を与え、処置に対して無作為に割り振った。動物を
新しいケージの状況に慣れさせるために試験開始１８日前に処置群により動物をケージに
入れた。前もってろ過した滅菌水（ＵＶランプ）及び標準的なマウス餌を自由に摂取でき
るようにした。通気の良い貯蔵室の乾燥し涼しい状態下で餌を保管した。水及び餌の量を
毎日調べ、必要な場合に補給し、１週間に２回新しいものに交換した。標準的な金属性ケ
ージタイプＲＶＳ Ｔ２（面積５４０ｃｍ^２）において逆転昼－夜リズム：（午後７時か
ら開始し、１４時間明るくし／１０時間暗くする。）でマウスを飼育した。このケージに
固体床及び層状の敷料を備え付けた。ケージあたりのマウス数は動物福祉の法律に従い制
限した。行動テスト開始の５日前に、マウスをマクロロンタイプ２ケージに移し、行動テ
ストに備え、実験室環境に適応させるために実験室に運んだ。

【0235】

処置（受動免疫付与）：
３種類の別個の実験を行い、これらの実験において、マウス（少なくとも１群あたり９
匹）に対して第１、８及び１５日に腹腔内注射（２４０μＬ／マウスで５００μｇ）を行
った。モノクローナル抗体６Ｇ１、８P５及びその他の非開示抗体（全てリン酸緩衝食塩
水中で溶解）又は３２０μＬリン酸緩衝食塩水でマウスを処置した。

【0236】

新規物体認識テスト：
３回目の処置日に新規物体認識テストを行った。使用したプロトコールは、Ｄｅｗａｃ
ｈｔｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２２（９）
：３４４５－３４５３）により記載の方法に従った。垂直壁が黒色で、床が半透明であり
、ボックスの下に置かれたランプで薄暗い照明が当てられているプレキシグラスのオープ
ンフィールドボックス（５２ｘ５２ｘ４０ｃｍ）に１時間マウスを慣らした。翌日、動物
を同じボックスに入れ、１０分間の獲得試行を行った。この試行中、２個の同一の物体Ａ
（オレンジ色の樽又は緑色の立方体、±４ｃｍの同様のサイズ）があるオープンフィール
ドにマウスを個別に入れ、持続時間（ｔｉｍｅ_ＡＡ）及び物体Ａを探る頻度（Ｆｒｅｑ_Ａ
Ａ）（動物の鼻が＜１ｃｍの距離で物体に向けられ、マウスが物体の方に向いて活発にス
ニッフィングしている場合）をコンピュータ化システムにより記録した（Ｅｔｈｏｖｉｓ
ｉｏｎ、Ｎｏｌｄｕｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｇｅｎｉ
ｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。２．５時間後に行った１０分間の想起試行（２回
目の試行）の間、新規物体（物体Ｂ、緑色の立方体又はオレンジ色の樽）をオープンフィ
ールドに既に馴染んだ物体（物体Ａ）と一緒に置いた（それぞれ、Ｆｒｅｑ_Ａ及びＦｒｅ
ｑ_Ｂ及びＴｉｍｅ_Ａ及びＴｉｍｅ_Ｂ）。両方の物体を探った持続時間に対する新規物体を
探った持続時間の比［Ｔｉｍｅ_Ｂ／（Ｔｉｍｅ_Ａ＋Ｔｉｍｅ_Ｂ）ｘ１００］として定義し
た認識指数（ＲＩ）を使用して、非空間的記憶を測定した。獲得試行中に物体Ａを探った
持続時間及び頻度（Ｔｉｍｅ_ＡＡ及びＦｒｅｑ_ＡＡ）を使用して、好奇心を測定した。

【0237】

全３種類の試験（図４）から、モノクローナル抗体６Ｇ１もしくは８Ｆ５又はリン酸緩
衝食塩水投与を受けたＡＰＰトランスジェニックマウス及びリン酸緩衝食塩水投与を受け
た非トランスジェニック同腹仔を組み合わせることにより、データ解析を行った。古い物
体と新規の物体とを区別しないマウスの認識指数は５０である。古い物体を認識するマウ
スは、好ましくは新規物体を探り、従ってその認識指数は＞５０となる。新規物体を専ら
探るマウスの認識指数は１００である。群ごとの平均認識指数をチャンスレベル、即ち５
０、に対してｔ検定により比較した。全群の平均認識指数もＡＮＯＶＡ及び、続いて事後
ｔ検定により比較した。ＰＢＳと野生型群との間の差から、このパラダイムにおいてＡＰ
Ｐトランスジェニックマウスの認知障害が示唆された。ＰＢＳ注射マウスは、チャンスレ
ベルであったが（即ち、５０と有意差はない。）が、一方、その他の全てのマウスは物体
認識を示した（図４：星印）。抗体処置ＡＰＰトランスジェニックマウスのパフォーマン
スを対照群と比較したところ、ＰＢＳ処置群に対しては有意差が見られたが、野生型マウ
スに対しては見られず（図４：丸印）、このことから、これらのＡＰＰトランスジェニッ
クマウスにおいて、抗体８Ｆ５での処置により認知障害が軽減したことが示唆される。

【0238】

（実施例ＶＩ）
老齢ＡＰＰトランスジェニックマウス及びアルツハイマー病患者の髄膜血管におけるア
ミロイド斑及びアミロイドの形態での、原線維性アミロイドベータペプチドに対する抗体
８Ｆ５及び８Ｃ５の特異的反応のインシトゥ分析
抗体８Ｆ５及び８Ｃ５の原線維性Ａβペプチド沈着に対する染色性が低いことから、こ
れらの治療効果には、Ａβペプチドの原線維性沈着型ではなく可溶性球状型への結合が介
在することが示唆される。原線維性Ａβペプチドへ結合する抗体により、凝集体の分解が
速くなり得、可溶性Ａβ濃度が続いて上昇し得るので（言い換えると、神経毒性であると
考えられ、微小出血を導き得る。）、単量体ではなく可溶性球状凝集体に影響を与える抗
体療法が好ましい。

【0239】

方法：
これらの実験に対して、いくつかの脳物質試料を使用した：２名のＡＤ患者（ＲＺ１６
及びＲＺ５５）からの皮質組織及び１９ヵ月齢のＴｇ２５７６マウス（ＡＰＰＳＷＥ＃０
０１３４９、Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）又は１２ヵ月齢のＡＰＰ／
Ｌマウス（ＲｅＭＹＮＤ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの皮質組織。

【0240】

これらのマウスは、ヒトＡＰＰを過剰発現し、家族性アルツハイマー病突然変異があり
、約１１ヵ月齢での脳実質でβ－アミロイド沈着が形成され、約１８ヵ月齢ではより大き
い大脳血管においてβ－アミロイド沈着が形成される。これらの動物に深く麻酔をかけ、
血液を流し出すために経心臓的に０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を灌流させた。次
に、頭蓋から脳を取り出し、縦方向に分けた。この脳の一方の半球を瞬間凍結し、４％パ
ラホルムアルデヒドに浸漬することにより他方を固定した。ＰＢＳ中の３０％スクロース
に浸すことによって、浸漬固定した半球を凍結防止し、凍結ミクロトーム上に置いた。前
脳全体を４０μｍ横断切片に切り、ＰＢＳ中に回収し、続く染色手順に対して使用した。
アルツハイマー病患者からの新皮質試料をＢｒａｉｎ－Ｎｅｔ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙから凍結試料として得て、凍結融解中に４％パラホルムアルデヒド中で浸漬固定し
、次いでマウス組織のように処理した。

【0241】

次のプロトコールを使用して、コンゴレッドで個々の切片を染色した：
材料：
－アミロイド色素コンゴレッドキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；ＨＴ－６０）、
これはアルコール性ＮａＣｌ溶液、ＮａＯＨ溶液及びコンゴレッド溶液から成る。
－染色キュベット
－顕微鏡スライド ＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓ及びカバースリップ
－エタノール、キシロール、包埋剤
試薬：
－ＮａＣｌ溶液でＮａＯＨを１：１００希釈し、アルカリ性食塩水を得る。
－コンゴレッド溶液でアルカリ性食塩水を１：１００希釈して、アルカリ性コンゴレッ
ド溶液を得る（調製後１５分以内に使用、ろ過）
－切片をスライド上に置き、乾燥させる。
－最初にアルカリ性食塩水中で３０－４０分間、次いでアルカリ性コンゴレッド溶液中
で３０－４０分間、染色キュベット中でスライドをインキュベート。

【0242】

－新鮮なエタノールで３回すすぎ、キシロールで包埋。

【0243】

Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用
いて染色を最初に写真撮影し、定量的に評価。赤色は、斑の形態及びより大きい髄膜血管
の両方においてアミロイド沈着を示す。後に、抗体染色の評価はこれらの構造に焦点を当
てた。

【0244】

次のプロトコールに従い、個々の抗体の０．０７－０．７μｇ／ｍＬを含有する溶液と
ともに切片をインキュベートすることにより、染色を行った。
材料
－ＴＢＳ洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ緩衝食塩水；１０ｘ濃縮液；Ｄａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓ３３０６、ＤＡＫＯ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）Ａｑ
ｕａ ｂｉｄｅｓｔ中で１：１０）
－メタノール中０．３％Ｈ_２Ｏ_２
－ブロッキング血清として、ロバ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）、ＴＢＳＴ中５％
－ＴＢＳＴ中で一定濃度に希釈したモノクローナルマウス－抗－球状凝集体抗体
－二次抗体：ビオチン化ロバ－抗－マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ／Ｄｉ
ａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ；７１５－０６５－１５０；ＴＢＳＴ中で
１：５００に希釈）
－ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｒｅｘ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｋ０３７７、Ｄ
ＡＫＯ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
－ペルオキシダーゼ基質キットジアミノベンジジン（＝ＤＡＢ；ＳＫ－４１００；Ｖｅ
ｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）
－ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド及びカバースリップ
－キシロール不含包埋剤（Ｍｅｄｉｔｅ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｘ－ｔ
ｒａ Ｋｉｔｔ）
手順：
－浮いている切片を氷冷０．３％Ｈ_２Ｏ_２に移し、３０分間インキュベート
－ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄
－ロバ血清／ＴＢＳＴとともに２０分間インキュベート
－一次抗体とともに室温で２４時間インキュベート
－ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄
－ブロッキング血清とともに２０分間インキュベート
－ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄
－二次抗体とともに周囲温度で６０分間インキュベート
－ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄
－ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｒｅｘとともに周囲温度で６０分間インキュベート
－ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄
－ＤＡＢとともに２０分間インキュベート
－切片をスライド上に載せ、スライドを風乾させ、アルコールでスライドを脱水してス
ライドを包埋

【0245】

顕微鏡下での切片の視覚的な観察以外に、ＩｍａｇｅＰｒｏ５．０画像解析システムを
用いて組織学的画像から無作為に選択した１０個の斑を光学的に摘出し、その平均グレー
スケール値を調べることにより、さらにアミロイド染色を定量した。光学密度値は、染色
物質の平均バックグラウンド密度をアミロイド斑の密度から差し引くことにより、グレー
スケール値から計算した（０％－周囲バックグラウンドを上回る斑染色なし、１００％－
透過なし／最高染色）。ＡＮＯＶＡを用いて、それぞれ抗体６Ｅ１０／４Ｇ８と６Ｇ１、
８Ｃ５及び８Ｆ５との間の差を統計的有意差について検定した。

【0246】

結果：
記載の全抗体染色物質がコンゴ染色性のアミロイド沈着であることが分かった（図７（
Ａ））。球状凝集体優先的抗体８Ｆ５及び８Ｃ５は、実質及び髄膜のＡβペプチドの好コ
ンゴ性の沈着の染色が抗体６Ｇ１及び６Ｅ１０よりも有意に少なかった（図７（Ｂ）－（
Ｃ）、（Ｈ））。実質アミロイド斑染色の定量的分析から、全ての抗体が斑に結合するこ
とが明らかになったが（対照を上回る統計的に有意な密度）、抗体８Ｆ５及び８Ｃ５の結
合は、参照抗体６Ｅ１０（ＡβのＮ－末端配列に対して作製）の結合よりも有意に低く、
参照抗体４Ｇ８（ＡβのＮ－末端配列に対して作製）以下であった（図７（Ｄ）－図（Ｇ
））。抗体８Ｆ５及び８Ｃ５は、Ａβ単量体又はＡβ配列の一部を認識する抗体よりもア
ミロイド沈着への結合が少ない。原線維性Ａβペプチドに結合する抗体での処置によって
、脳組織においてアミロイド斑が急速に分解し、次いで可溶性Ａβ濃度が上昇し得（これ
は、言い換えると、神経毒性であると考えられ、微小出血を引き起こし得る。）及び／又
は血管アミロイドが急速に分解し得る（これもまた、微小出血を引き起こし得る。）。従
って、単量体ではなく可溶性球状凝集体に影響を与える抗体療法が好ましい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

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