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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-22
(45)【発行日】2022-05-16
(54)【発明の名称】アレルギー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220425BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
G01N33/53 Q
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2018517081
(86)(22)【出願日】2017-05-11
(86)【国際出願番号】 JP2017017933
(87)【国際公開番号】W WO2017195871
(87)【国際公開日】2017-11-16
【審査請求日】2020-03-24
(31)【優先権主張番号】P 2016097337
(32)【優先日】2016-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２９年１月３１日、ウェブサイト（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１１１１／ｐａｉ．１２７０２／ｆｕｌｌ）上でＰｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙにて「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｏｍｕｃｏｉｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩｇＥ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｅｃｚｅｍａ」（ＤＯＩコード：１０．１１１１／ｐａｉ．１２７０２）を公開
(73)【特許権者】
【識別番号】511161373
【氏名又は名称】応用酵素医学研究所株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100188352
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 一弘
(74)【代理人】
【識別番号】100113860
【弁理士】
【氏名又は名称】松橋 泰典
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100198074
【弁理士】
【氏名又は名称】山村 昭裕
(74)【代理人】
【識別番号】100096013
【氏名又は名称】富田 博行
(72)【発明者】
【氏名】木戸 博
(72)【発明者】
【氏名】苛原 誠
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 宏一
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－０９５１３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５０２０３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５１１１５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００４／０２３４６１４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／１１０４５４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５０５５５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－１０７１５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】SUGIMOTO, Mayumi et al.，Differential response in allergen-specific IgE, IgGs, and IgA levels for predicting outcome of oral，Pediatr Allergy Immunol.，2016年01月09日，27(3)，276-282
【文献】CAUBET, JC et al.，Significance of ovomucoid- and ovalbumin-specific IgE/IgG4 ratios in egg allergy，J ALLERGY CLIN IMMUNOL，2012年01月24日，129，739-747
【文献】KANEMURA, Norio et al.，Low-affinity allergen-specific igE in cord blood and affinity maturation after birth，J ALLERGY CLIN IMMUNOL，2014年03月，Vol. 133, No. 3，904-905
【文献】中里恵美子，0歳アレルギー患児における食物特異的IgE, IgG4抗体値とアレルギー諸因子の関係について －2歳以上アレル，アレルギー，1991年，40(1)，8-20
【文献】FRECHTEL, G et al.，A case of allergy to human insulin associated with high IgG/IgE ratio for specific antibodies，J Invest Allergol Clin Immunol.，1994年，4(6)，320-323
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５０
Ｇ０１Ｎ ３７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳児が、乳幼児期にアレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測するために、以下の工程（ｄ）を実施するためのデータを収集する方法であって、工程（ａ）～（ｃ）を含む、前記方法。（ａ）乳幼児期にアレルギーを発症したか否かが既知の複数の生後６ヶ月の乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価をそれぞれ定量測定し、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成し、散布図のデータを二つのブロックに分割し、それぞれのグループについて回帰分析をした場合に、アレルギーを発症するリスクが低い集団に適用される一次関数＜１＞（Ｙ１＝ａＸ１－ｂ、但し、ａ＞０、ｂ＞０）とアレルギーを発症するリスクが高い集団に適用される一次関数＜２＞（Ｙ２＝ｃＸ２－ｄ、但し、ｃ＞ａ）とを算出し、判断基準とする工程；
（ｂ）生後６ヶ月の被検乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で定量測定した、被検乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価を前記散布図の、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットする工程；
（ｄ）一次関数＜１＞が適用されるブロックに属する被検乳児をアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児と予測し、一次関数＜２＞が適用されるブロックに属する被検乳児をアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児と予測する工程；
【請求項2】
試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価を、ＤＣＰチップを用いて定量測定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項3】
試料が血漿又は血清であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
さらに、乳児から採取した試料中のＩｇＧ２抗体価を判断基準に含めることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載の方法。
【請求項5】
乳児から採取した試料中のＩｇＧ２抗体価を判断基準に含める方法が、以下の工程（ｅ）～（ｇ）、及び工程（ｈ）を実施するためのデータを収集する工程を備えることを特徴とする請求項４記載の方法。（ｅ）アレルギーを発症したか否かが既知の複数の乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＧ２抗体価とをそれぞれ定量測定し、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成し、ＩｇＧ１抗体価とＩｇＧ２抗体価の相関関係を回帰分析により、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータに適用される一次関数３（Ｙ３＝ｅＸ３－ｆ、但し、ｅ＞０）として算出する判断基準を設定する工程；
（ｆ）被検乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＧ２抗体価とを定量測定する工程；
（ｇ）工程（ｆ）で定量測定した、被検乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２の抗体価を前記散布図の、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットする工程；
（ｈ）ＩｇＧ１値が、一次関数のＸ軸切片（ＩｇＧ１の抗体価＝ｆ／ｅＢｕｇ１／ｍＬ）より低値を示す乳児を、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児と予測する工程；
【請求項6】
さらに、乳児から採取した試料中のＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性が高い場合にアレルギーを発症するリスクがより高いと予測することを判断基準に含めることを特徴とする請求項１～５のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定し、予め統計処理されたＩｇＧ１からＩｇＥへのイムノグロブリンクラススイッチの程度に基づき作成された判断基準によって、前記乳児が、前記アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アレルギーとは、原因物質が体内に侵入することによって起きる、生体に不利益を与える反応の一つである。ヒトは異種生物を食料として消化・吸収することにより生命を維持しているので、消化しきれていない未消化異物が絶えず体内に取り込まれる状態にあるが、かかる未消化異物に対して生体の防御反応（アレルギー反応）が起きないように、経口免疫寛容（免疫トレランス）が通常働いているとされている。しかし、出生人口の５－１０％の乳児が生後１年までに何らかの食物アレルギーに罹患するとされており、その発症機序や発症予測法は未だ完全には解明されていない。
【0003】
アレルギーとしては、ＩｇＥ抗体が関与するとされる花粉症、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等が広く知られているが、ＩｇＥ依存性反応だけではなく、血液のＩｇＥレベルとアレルギー症状とが一致しない非ＩｇＥ依存性反応も関与するとの知見や、アレルギー原因物質の体内侵入によって誘導される抗原特異的抗体は、ＩｇＥ以外にもＩｇＡ、各種ＩｇＧがあり、これらの抗体の影響の総和がアレルギー症状を形成しているとの知見もある。治療に関しては、１種以上の抗原を含むワクチン接種プログラムに供する工程や、抗原を経口摂取する減感作療法が知られている。診断では、個々人からの生物学的サンプル中の抗原に対する特異的ＩｇＡ、各種ＩｇＧ、ＩｇＥ抗体レベルを測定する工程や、抗原の皮内テスト、または皮膚に微小な傷を付けて抗原を浸透させるスクラッチテスト（プリックテスト）の結果を総合的に判断して、アレルギーの進展状況、治療の評価を実施するが、未だ確定的な診断方法はない。これまでに、前記ワクチン接種プログラムの治療可能性の評価方法（例えば、特許文献１参照）や、食餌性アレルゲン物質を加えて唾液中抗体との抗原・抗体反応をさせて生じた唾液中のアレルゲン特異的イムノグロブリンとの反応性を測定し、健常者のＩｇＥやＩｇＧ等の測定値を比較し、その相関関係によって免疫検定ができること等が報告されている（例えば、特許文献２参照）。近年、抗原特異的各種免疫グロブリンの産生過程の詳細が、イムノグロブリンクラススイッチから解析されてきたことから（たとえば、非特許文献１及び２参照）アレルギーの病態を各種イムノグロブリン測定値と関連して評価する必要性に迫られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２００７－５２４０９６号公報
【文献】特開平１１－１４２４０３号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】Xiong H, Dolpady J, Wabl M, Curotto de Lafaille MA, LafailleJJ. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. J Exp Med 2012; 209:353-64.
【文献】Collins AM, Jackson KJ. A Temporal model of human IgE and IgG antibody function. Front Immunol 2013; 4: 235.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、乳幼児のアレルギーを発症するリスクを予測する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ＤＣＰ（Densely carboxylated protein）チップを用いて生後６ヶ月までの乳児の血漿試料における、卵白（Egg White：ＥＷ）に対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価を測定し、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成したところ、データ分布が、二つのブロックに分割されることを見いだした。それぞれのブロックに適用可能な一次関数を算出したところ、ＩｇＧ１＝１４００ＢＵｇ１において立上りを開始する一次関数［１］と、ＩｇＧ１＝１４００ＢＵｇ１に達する前に立上りを開始する一次関数［２］の２種類の一次関数を得た。生後１年経過時のアレルギー発症有無の診断において、卵白を経口摂取しても異常症状を示すことなく、免疫寛容を獲得していると診断された乳児（以下、「免疫寛容獲得乳児」ともいう）は、上記一次関数［１］が適用されるブロックに属し、一方で卵白アレルギーと診断された乳児の多くは、生後６ヶ月までに少なくとも１週間以上続く湿疹履歴があり、上記一次関数［２］が適用されるブロックに属することを確認した。
【0008】
このように、乳児の試料における、ＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価とを測定し、あらかじめ統計処理されたＩｇＧ１からＩｇＥへのイムノグロブリンクラススイッチ（以下、単に「クラススイッチ」ともいう）の程度に基づき、アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測することができることを確認した。さらに、免疫寛容獲得乳児では、ＩｇＧ２の増加を示すパターンを示したのに対し、卵白アレルギーと診断された乳児のほとんどはＩｇＧ１、ＩｇＧ２共に低い値を示したことからＩｇＧ１からＩｇＧ２へのクラススイッチにおいて、免疫寛容獲得乳児とアレルギー発症者との間で違いのあることを確認した。
【0009】
さらに一次関数［２］が適用されるブロックに属し、生後６ヶ月の間に湿疹を発症して、皮膚にステロイド塗布の治療を行った場合、生後１年経過時の食物アレルギー診断において、ステロイド塗布を行わない乳児に比べて卵白アレルギーの発症頻度の低いことを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１、及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定することにより、かかる乳児が、乳幼児期にアレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測するためのデータを収集することができる。
【0011】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定し、予め統計処理されたＩｇＧ１からＩｇＥへのイムノグロブリンクラススイッチの程度に基づき作成された判断基準によって、前記乳児が、乳幼児期に前記アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法。
［２］試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価を、ＤＣＰチップを用いて定量測定することを特徴とする上記［１］記載の方法。
［３］試料が血漿又は血清であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］統計処理が、ＩｇＥ抗体価と、ＩｇＧ１抗体価とをプロットして散布図を作成し、回帰分析により求められた一次関数を含むことを特徴とする上記［１］～［３］に記載の方法。
［５］アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測する方法が以下の（ａ）～（ｄ）の工程を備えることを特徴とする上記［１］～［４］のいずれか記載の方法。
（ａ）乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定する工程；
（ｂ）ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成する工程；
（ｃ）ＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価の相関関係を回帰分析により（１）アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータに適用される一次関数１（Ｙ１＝ａＸ１－ｂ、但し、ａ＞０、ｂ＞０）；及び／又は（２）アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児のデータに適用される一次関数２（Ｙ２＝ｃＸ２－ｄ、但し、ｃ＞ａ）として算出する工程；
（ｄ）一次関数１が適用されるブロックに属する乳児をアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児と予測し、一次関数２が適用されるブロックに属する乳児をアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児と予測する工程；
［６］さらに、乳児から採取した試料中のＩｇＧ２抗体価を判断基準に含めることを特徴とする上記［１］～［５］のいずれか記載の方法。
［７］乳児から採取した試料中のＩｇＧ２抗体価を判断基準に含める方法が以下の（ｅ）～（ｈ）の工程を備えることを特徴とする上記［６］記載の方法。
（ｅ）乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２の抗体価をそれぞれ定量測定する工程；
（ｆ）ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成する工程；
（ｇ）ＩｇＧ１抗体価とＩｇＧ２抗体価の相関関係を回帰分析により、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータに適用される一次関数３（Ｙ３＝ｅＸ３－ｆ、但し、ｅ＞０）として算出する工程；
（ｈ）ＩｇＧ１値が、一次関数のＸ軸切片（ＩｇＧ１の抗体価＝ｆ／ｅＢｕｇ１／ｍＬ）より低値を示す乳児を、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児と予測と予測する工程；
［８］さらに、乳児から採取した試料中のＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性の程度を判断基準に含めることを特徴とする上記［１］～［７］のいずれか記載の方法。
［１］乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定し、予め統計処理されたＩｇＧ１からＩｇＥへのイムノグロブリンクラススイッチの程度に基づき作成された判断基準によって、前記乳児が、乳幼児期に前記アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法。
［２］試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価を、ＤＣＰチップを用いて定量測定することを特徴とする上記［１］記載の方法。
［３］試料が血漿又は血清であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］統計処理が、ＩｇＥ抗体価と、ＩｇＧ１抗体価とをプロットして散布図を作成し、回帰分析により求められた一次関数を含むことを特徴とする上記［１］～［３］に記載の方法。
［５］アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測する方法が以下の（ａ）～（ｄ）の工程を備えることを特徴とする上記［１］～［４］のいずれか記載の方法。
（ａ）乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定する工程；
（ｂ）ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成する工程；
（ｃ）ＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価の相関関係を回帰分析により（１）アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータに適用される一次関数１（Ｙ１＝ａＸ１－ｂ、但し、ａ＞０、ｂ＞０）；及び／又は（２）アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児のデータに適用される一次関数２（Ｙ２＝ｃＸ２－ｄ、但し、ｃ＞ａ）として算出する工程；
（ｄ）一次関数１が適用されるブロックに属する乳児をアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児と予測し、一次関数２が適用されるブロックに属する乳児をアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児と予測する工程；
［６］さらに、乳児から採取した試料中のＩｇＧ２抗体価を判断基準に含めることを特徴とする上記［１］～［５］のいずれか記載の方法。
［７］乳児から採取した試料中のＩｇＧ２抗体価を判断基準に含める方法が以下の（ｅ）～（ｈ）の工程を備えることを特徴とする上記［６］記載の方法。
（ｅ）乳児から採取した試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２の抗体価をそれぞれ定量測定する工程；
（ｆ）ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成する工程；
（ｇ）ＩｇＧ１抗体価とＩｇＧ２抗体価の相関関係を回帰分析により、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータに適用される一次関数３（Ｙ３＝ｅＸ３－ｆ、但し、ｅ＞０）として算出する工程；
（ｈ）ＩｇＧ１値が、一次関数のＸ軸切片（ＩｇＧ１の抗体価＝ｆ／ｅＢｕｇ１／ｍＬ）より低値を示す乳児を、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児と予測と予測する工程；
［８］さらに、乳児から採取した試料中のＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性の程度を判断基準に含めることを特徴とする上記［１］～［７］のいずれか記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】タンパク質が固定化されたＤＣＰチップの模式図を示す。
【図2】８４人の乳児について、臍帯血試料；並びに、生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された試料；における、ＥＷに対する、（ａ）ＩｇＥ抗体、（ｂ）ＩｇＧ１抗体、（ｃ）ＩｇＧ２抗体の抗体価をそれぞれ測定したグラフである。
【図3】８４人の乳児について、臍帯血試料；並びに、生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された試料；における、β－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）に対する、（ａ）ＩｇＥ抗体、（ｂ）ＩｇＧ１抗体、（ｃ）ＩｇＧ２抗体の抗体価をそれぞれ測定したグラフである。
【図4】８４人の乳児について、生後２ヶ月（ａ）、４ヶ月（ｂ）、６ヶ月（ｃ）経過時に採血した試料におけるＢＬＧに対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価との相関関係をプロットしたグラフである。
【図5】８４人の乳児について、生後２ヶ月（ａ）、４ヶ月（ｂ）、６ヶ月（ｃ）の各経過時点に採血した試料におけるＥＷに対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価との相関関係をプロットしたグラフである。
【図6】８４人の乳児について、生後６ヶ月経過時に採血した試料におけるＥＷに対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価との相関関係をプロットしたグラフに、生後６ヶ月検診時の湿疹の有無、湿疹部位へのステロイドの塗布の有無及び、生後１年経過時の卵白アレルギー発症の診断についての情報を付加したグラフである。
【図7】８４人の乳児について、生後６ヶ月経過時に採血した試料におけるＢＬＧ（ａ）とＥＷ（ｂ）に対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＧ２抗体価との相関関係をプロットしたグラフである。
【図8】８４人の乳児について、生後６ヶ月経過時に採血した試料におけるＥＷに対するＩｇＧ２抗体価とＩｇＥ抗体価とをプロットしたグラフである。
【図9】７８人の母乳・混合栄養の乳児について、生後６ヶ月経過時に採血した試料におけるオボアルブミン（ＯＶＡ）に対するＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価とをプロットしたグラフである。
【図10】グループ１とグループ２において、ＯＶＡの結合を５０％阻害するアレルゲンの濃度、ＩＣ５０（ｎＭ）の値をそれぞれプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明のデータを収集する方法としては、乳児から採取した試料中のアレルゲンに対する抗原特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定し、予め統計処理されたＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの程度に基づき作成された判断基準によって、前記乳児が、前記アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予想するための方法であれば特に制限されず、本発明の乳児としては、アレルギーを発症するリスクを予測するという本発明の方法の効果を享受しうる点で、児童福祉法上の定義「生後から１歳未満まで」に特に限定されることはなく、例えば、免疫グロブリンのクラススイッチ、とりわけＩｇＧ１からのクラススイッチが明確になるといわれている生後４～８ヶ月、好ましくは５～７ヶ月経過時（平均値をとって以下「生後６ヶ月経過時」ともいう。）の乳児から試料を採取し、かかる乳児が生後８～１６ヶ月、好ましくは生後１０～１４ヶ月、より好ましくは生後１１～１３ヶ月経過時の乳幼児期にアレルゲンに対してアレルギーを発症することが確定されるリスクが高いか低いかを予測するためのデータを収集する方法を挙げることができる。さらに、出生後０～１２ヶ月のいずれかの時期にわたり、上記アレルゲンに対するＩｇＥ抗体価、ＩｇＧ１抗体価、必要に応じてＩｇＧ２抗体価を経時的に定量測定することにより、個人差を考慮して総合的に予測するためのデータを収集することもできる。なお、クラススイッチとは、体内に侵入した異物に対する生体反応において、各種抗原特異的な抗体の遺伝子座が遺伝子再構成されることにより、可変部を変えずに定常領域（Ｆｃ領域）の変換が起こることをいうが、ＩｇＭ→ＩｇＧ３→ＩｇＧ１→ＩｇＧ２→ＩｇＧ４への変換が起こるルートのほか、ＩｇＭ→ＩｇＧ３→ＩｇＧ１→ＩｇＥのルートがあることが知られている。
【0014】
本発明におけるアレルゲンとしては、ヒトにおいて、抗体の産生を誘導し得る任意の抗原タンパク質又はペプチドであれば特に制限されないが、卵類、牛乳類、牛肉等の肉類、サケ、マグロ等の魚類、エビ、カニ等の甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母、ゼラチンなどの食物アレルゲンとなるペプチドを例示することができ、中でもαｓ１－カゼイン、αｓ２－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン、α－ラクトアルブミン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）等の乳アレルゲンや、オボムコイド、オボアルブミン（ＯＶＡ）、コンアルブミン、又はこれらの混合物である卵白アレルゲン（ＥＷ）や、卵黄アレルゲンなどの卵アレルゲン、グリアジン、グルテン等の小麦アレルゲン、そばアレルゲンや、Ａｒａ ｈ１等の落花生アレルゲン、１１Ｓグロブリン等のごまアレルゲン、トロポミオシンタンパク質等の甲殻類アレルゲンを例示することができる。なお、抗体のアレルゲンに対する親和性を、ＩＣ５０値（結合を５０％阻害するアレルゲンの濃度）として算出する際に用いられるアレルゲンとしては、抗原濃度（ｎＭ）を指標とする点で、分子量の明らかな単一アレルゲンであることが望ましい。
【0015】
上記アレルゲンペプチドには、糖鎖修飾ペプチド、リン酸化ペプチド、アシール化ペプチド、アセチル化ペプチド、メチル化ペプチド、ユビキチン化ペプチド等の化学修飾ペプチドを含めることができ、かかる化学修飾ペプチドは、天然の化学修飾ペプチドであっても、人為的な化学修飾ペプチドであってもよい。さらに、アレルゲンエピトープを含むペプチドとして、ＭＨＣクラスII分子に結合する７～１５アミノ酸サイズ等のペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチドを用いると、患者抗体と数倍から数十倍高感度に反応する点で好ましい。かかるＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチド等のアレルゲンエピトープを含むペプチドは、ペプチド合成により作製することもできるが、アレルゲンのエピトープを含むプロテアーゼ分解ペプチドとして作製することもできる。かかるプロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、リジルエンドペプチダーゼを挙げることができる。
【0016】
本発明における試料としては、乳児から採取した試料であって、上記アレルゲンに対するＩｇＧやＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定することができる試料であれば特に限定されず、乳児から採取した血液、血清、血漿、唾液、涙液、鼻汁、尿等の体液を挙げることができるが、血清、血漿が好ましい。血清を試料として用いる場合は、例えば、乳児の上腕静脈より採血を行い、得られた血液を４℃にて一晩静置した後、遠心分離し、その上清を血清として用いることができる。あるいは、低侵襲的に耳朶や指先を微量採血針等で穿刺して得られる５０～１００μＬの微量血液をマイクロキャピラリーチューブで採取してそのまま用いることも可能である。
【0017】
本発明において発症するリスクの対象となるアレルギーとしては、特定のアレルゲンの経口感作、経皮感作等により、皮膚症状（掻痒感、じんましん、血管性浮腫、発赤、湿疹）、粘膜症状（眼症状：結膜充血・浮腫、掻痒感、流涙、眼瞼浮腫）、鼻症状（くしゃみ、鼻汁、鼻閉）、口腔咽頭症状（口腔・口唇・舌の違和感・腫脹、咽頭の痒み・イガイガ感）、消化器症状（腹痛、悪心、嘔吐、下痢、血便）、呼吸器症状（咽頭絞扼感、咽頭浮腫、嗄声、咳嗽、喘鳴、呼吸困難、喘息）、全身症状（アナフィラキシーショック頻脈、虚脱状態、意識障害、血圧低下）等を呈する症状をもたらす病態を挙げることができる。
【0018】
アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予想するための判断基準としては、予め統計処理されたＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの程度に基づき作成されたものであれば特に制限されず、本発明の乳児におけるＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの程度としては、ＩｇＧ１が十分に蓄積した後に起こるＩｇＥへのクラススイッチの程度と、ＩｇＧ１が十分に蓄積する前に起こるＩｇＥへのクラススイッチの程度とを挙げることができる。またＩｇＧ１からＩｇＧ２へのクラススイッチの程度を判断基準に加えることもでき、ＩｇＧ１からＩｇＧ２へのクラススイッチの程度としては、ＩｇＧ１が十分に蓄積した後に起こるＩｇＧ２へのクラススイッチの程度と、ＩｇＧ１が十分に蓄積せず、しかもＩｇＧ２の増加もみられない場合を挙げることができる。
【0019】
乳児においてＩｇＧ１が十分に蓄積した後にＩｇＥへのクラススイッチが起こる場合としては、経口免疫寛容が成立している場合を挙げることができ、かかる場合はアレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクが低いと予想することができる。また、同時にＩｇＧ１からＩｇＧ２へのクラススイッチも進行している場合を、経口免疫寛容が成立している場合に含めることができ、かかる場合はアレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクが低いと予想することができる。
【0020】
上記経口免疫寛容としては、母親が摂食したアレルゲンの未分解成分を、母乳を介して乳児が経口摂取することにより、又は乳児が人工乳を経口摂取することにより、乳児の体内に侵入した未分解物に対する異物反応として、乳児自身により産生されるＩｇＧ１の抗体値が閾値に達した後に、ＩｇＥの抗体価が増加し、その後減少に転ずることを挙げることができる。また、乳児自身により産生されるＩｇＧ１の抗体値が閾値に達した後に、ＩｇＧ２の抗体価が、ゆるやかに継続的に増加することを含めることができる。
【0021】
上記乳児自身により産生されるＩｇＧ１が十分に蓄積する前にＩｇＥへのクラススイッチが起こる場合としては、皮膚から経皮感作が起こっている場合を挙げることができ、かかる場合乳児において湿疹症状が観察できることが多い。かかる乳児においては、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高いと予想することができる。
【0022】
上記経皮感作としては、ＩｇＧ１抗体値が閾値に達する前でも、強いＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチが起きて、経口免疫寛容の機序を逸脱する場合を挙げることができ、かかる経口免疫寛容の機序を逸脱する場合としては、母親が摂取したアレルゲンの未分解成分が、母乳を介して乳児の皮膚に付着したり、環境中のアレルゲンが直接皮膚に付着することがきっかけとなり、湿疹等による皮膚のバリア機能が低下していることにより乳児の体内にアレルゲンが侵入する場合を挙げることができる。
【0023】
上記ＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの程度を統計処理する方法としては、例えば、乳児から採取した試料中のＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成し、ＩｇＧ１抗体価とＩｇＥ抗体価の相関関係を回帰分析により一次関数として算出する方法を挙げることができる。かかる統計処理を行うことにより、クラススイッチの時期やＩｇＧ１の閾値について、個人差やアレルゲンによる差があるデータであっても、関数の適用可能範囲（ブロック）におけるデータ群全体についての予想が可能となる点で有利である。
【0024】
上記統計処理により算出される一次関数としては、（１）アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータに適用される一次関数１（Ｙ１＝ａＸ１－ｂ、但し、ａ＞０、ｂ＞０）；及び（２）アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児のデータに適用される一次関数２（Ｙ２＝ｃＸ２－ｄ、但し、ｃ＞ａ）を挙げることができる。
【0025】
上記一次関数１は、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータで構成される場合に散布図上の全データに適用でき、上記一次関数２はアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児のデータのみで構成される場合に散布図上の全データに適用できる。上記いずれか１種類の一次関数を散布図上のすべてのデータに適用させるのが困難な場合は、データを２つのブロックに分割し、ブロック毎に、前記アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児のデータに適用される上記一次関数１と、前記アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児のデータに適用される一次関数２を算出することができる。上記１種類の一次関数を散布図上のすべてのデータに適用させるのが困難な場合に２つのブロックに分割する方法としては、上記一次関数１と一次関数２のそれぞれにおいて、相関係数が高くなるようにプログラムを組む；データ収集者、データ解析者等の当業者が実際のデータの分布状況から判断して２つのブロックに分割する；など、統計学上適切な措置をとることを挙げることができる。
【0026】
前記ＩｇＧ１の閾値としては、上記一次関数１において、グラフ上の一次関数１の立上りの位置と一致するＩｇＧ１の抗体価＝ｂ／ａ Ｂｕｇ１／ｍＬとして算出することができる。また、上記一次関数２において、グラフ上の立上りの位置におけるＩｇＧ１の抗体価（ｄ／ｃ）（但し、ｄ＞０が好ましい）は、ｂ／ａ Ｂｕｇ１／ｍＬよりも小さい。ＩｇＥ抗体価が高くても、ＩｇＧ１の閾値を超えている乳児は、アレルギーを発症するリスクがより低いと予測することができる。
【0027】
本発明のアレルギーを発症するリスクを予測のためのデータには、生後６ヶ月検診等における生後６ヶ月の乳児の試料中のＩｇＧ２の抗体価を含めることができ、ＩｇＧ１抗体価が上記閾値に達する前にＩｇＥへのクラススイッチが起こるためＩｇＧ２の抗体価が低値に留まっていることを、アレルギーを発症するリスクがより高いと予測することができる。また、生後６ヶ月の検診において少なくとも１週間以上持続する発疹を発症している履歴のある場合を、アレルギーを発症するリスクがより高いと予測するための判断基準にさらに含めることができる。
【0028】
本発明において、アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクの予想を受ける被検乳児は、被検乳児自身のデータが入力されることにより、本発明のデータを収集する方法における乳児に含めることができ、本発明における判断基準の精度をより高いものとすることができる。
【0029】
本発明のアレルギーを発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法を利用すると、アレルギー発症リスクを低減することができる。かかる低減方法としては、アレルギー発症のリスクが高いと予測された乳児に対して、発疹部位へのステロイドの経皮投与（塗布）等のアレルギー発症を防ぐ方法や、経口免疫寛容の促進法を挙げることができる。上記ステロイドの経皮投与方法としては、たとえばアトピー性皮膚炎診療ガイドライン２０１６年版（日本皮膚科学会ガイドライン）」（日皮会誌：１２６（２）：１２１－１５５、２０１６）に示されるように、重症度によって発疹部位に、様々な強度ランクのステロイドをガイドラインに従って通常１日１～２回塗布する方法を挙げることができる。上記経口免疫寛容の促進法としては、母乳中に含まれる抗原性の減弱した微量抗原に相当する抗原を、持続的に安全に経口摂取する方法を挙げることができる。
【0030】
本発明において、ＩｇＧ１及びＩｇＥ、さらにはＩｇＧ２の抗体価をそれぞれ定量測定する方法としては、乳児から採取した試料中の、アレルゲンに結合したＩｇＧ１、ＩｇＥ、及びＩｇＧ２それぞれの抗体の濃度を抗体価（Binding Unit：ＢＵ）／ｍＬとして定量することができる方法であれば特に限定されず、好ましくは、各種抗原を固定化することができ、かかる固定化された特定の抗原に対する抗体が存在する場合に、抗原抗体反応を定量的に測定することができるチップを用いて測定する方法を挙げることができ、具体的には、Kamemura N, et al. J Allergy Clin Immunol 2012;130:113-121や、Suzuki K. et al. Anal Chim Acta 2011; 706:321-327に記載されている定量測定する方法を挙げることができる。
【0031】
本発明のアレルギーを発症するリスクを予測のためのデータには、生後６ヶ月の乳児の試料中のＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性の程度を含めることができる。具体的には、ＩｇＥ抗体の抗原（アレルゲン）への親和性の測定が可能な量のＩｇＥ抗体が試料中に認められる乳児において、ＩｇＥの親和性を測定した場合に、アレルゲンに対するＩｇＥの親和性が高い場合にアレルギーを発症するリスクがより高いと予測することができ、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性が低い場合にアレルギーを発症するリスクがより低いと予測することができる。上記親和性の測定が可能なＩｇＥ量としては、測定の信頼限界値以上であることが求められる。アレルゲン毎に測定限界値は異なるが、例えば、ＯＶＡに対するＩｇＥの親和性の場合、１００ＢＵｅ／ｍＬ以上を挙げることができる。
【0032】
上記ＩｇＥ抗体の、特定のアレルゲンに対する親和性を測定する方法としては、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等の公知の測定手段により、抗体の親和性を測定する方法を挙げることができるが、抗原抗体反応における競合阻害を利用して、アレルゲンに対する抗体の結合活性を定量的に比較解析する、ＥＬＩＳＡ競合阻害法を好適に例示することができる。具体的手順としては、アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体を含む試料に、濃度０（試料中にアレルゲンが存在しない）から、一定時間にすべてのＩｇＥ抗体にアレルゲンが結合できる十分な濃度に至るまで、段階的に調製された既知の濃度のアレルゲンを競合物質として添加し、一定時間反応させる（前段階反応）。特定の濃度のアレルゲンを含む溶液において、アレルゲンに対する親和性のより大きいＩｇＥ抗体が、添加されたアレルゲンに結合する割合はより高く、親和性のより小さいＩｇＥ抗体が、添加されたアレルゲンに結合する割合はより低い。
【0033】
上記段階的に調製された既知の濃度としては、試料中に存在する抗体量等に基づき、当業者が適宜決定した濃度を用いることができるが、例えば、血漿を希釈する場合には、０ｎＭ、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ（最終濃度）等のアレルゲンの濃度を挙げることができる。なお、競合阻害に用いるアレルゲンの濃度は、個々のアレルゲンによって異なる。上記前段階反応における一定時間としては、例えば、１５分～２時間、好ましくは３０分～１時間を挙げることができる。
【0034】
上記前段階反応後の溶液を、アレルゲンが固定化されているＤＣＰチップ等の結合感度の非常に高い担体に供し、上記遊離抗体を固定化されているアレルゲンに結合させる等の従来公知の方法により反応させ、さらに標識二次抗体と反応させた後に、標識量を算出する。上記親和性のより低いＩｇＥ抗体については、前段階反応後の溶液中に存在する遊離一次抗体の量はより多くなり、固定化されているアレルゲンに結合する抗体量は多くなる。一方、上記親和性のより高い抗体については、前段階反応後の溶液中に存在する遊離一次抗体の量はより少なくなるので、固定化されているアレルゲンに結合する抗体量は少なくなる。
【0035】
上述のとおり、標識二次抗体の標識量として検出される各抗体の抗原（アレルゲン）に対する親和性は、検出量がより少なければより高く、検出量がより多ければより低いと判定される。ＩｇＥ抗体のアレルゲンとの親和性の数値化は、前段階反応において、競合アレルゲンの存在しない濃度０の溶液について、検出される標識二次抗体の標識量を１００％とした場合に、標識量が５０％となる抗原濃度（例えば上記の例では（ｎＭ））をＩＣ５０値として表現することができる。
【0036】
上記標識二次抗体としては、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｔｔｏ５３２、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体などを挙げることができる。
【0037】
上記チップとしては、非特異的吸着が少ない点において有利であることから、担体の表面にカーボン層が形成されたチップや、ペプチドを固定するために有利であることから、化学修飾基が導入されたチップや活性化処理が行われたチップが好ましく、なかでもＤＣＰチップが好ましい。
【0038】
上記担体としては、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、プラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス等との混合体を挙げることができる。
【0039】
上記担体の表面に形成されるカーボン層としては、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等からなる層を挙げることができる。
【0040】
上記担体の表面又は担体の表面に形成されるカーボン層に導入される化学修飾基としては、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基等を挙げることができる。
【0041】
上記アミノ基を導入する方法としては、チップの担体の表面やカーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射する方法や、チップの担体の表面やカーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、かかる塩素化されたチップの担体の表面やカーボン層にアンモニアガス中で紫外線照射する方法や、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類を、塩素化されたチップの担体の表面やカーボン層と反応させる方法を挙げることができる。
【0042】
上記カルボキシル基を導入する方法としては、例えば、上記アミノ化したチップの担体の表面やカーボン層に、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等のジカルボン酸又はポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸等の多価カルボン酸を反応させる方法を挙げることができる。
【0043】
上記エポキシ基を導入する方法としては、例えば、前記のようにアミノ化したチップの担体の表面やカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させる方法や、カーボン層が含有する炭素＝炭素の二重結合に有機過酸を反応させる方法を挙げることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸等を挙げることができる。
【0044】
上記ホルミル基を導入する方法としては、上記アミノ化したチップの担体の表面やカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させる方法を挙げることができる。
【0045】
上記化学修飾基を導入したチップは、活性化試薬により活性化処理をした後にアレルゲンペプチドを固定化させることもできる。アレルゲンペプチドを固定化させる方法としては、基板表面に導入されたカルボキシル基（－ＣＯＯＨ基）を利用し、アミノ基（－ＮＨ２基）を持つアレルゲンペプチドを1-Etyl-3-(3-dimethylamino propyl)-carbodiimide hydrochloride（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ:Water-Soluble Carbodiimide Hydrochloride）や、N-Hydroxy-succinimide（ＮＨＳ）やその他の化学架橋剤を用いて共有結合により固定化させる方法を挙げることができる。
【0046】
前記ＤＣＰチップとしては、シリコン基板表面にカーボン層をＤＬＣ処理した基板、あるいは、ガラススライドの表面に、アミノ基含有化合物かその重合体及び／又は共重合体を処理した静電層を施し、さらにジカルボン酸又は多価カルボン酸等を重ねて処理後、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及び／又はガルボジイミド類で活性化したチップや、担体の表面や上記カーボン層に化学修飾基が導入されたチップや、さらに活性化処理が行われたチップなどを挙げることができる。
【0047】
上記アレルゲンペプチドをチップに固定化する際には、タンパク質／ペプチドの機能を維持するため、及び／又は、タンパク質／ペプチドの基板への結合量を増加させるために、ＰＥＧ(polyethylene glycol)；ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)；グリシン；ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）；グリセロール、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、又はシクロデキストリン等の溶解液；から選ばれる１又は２以上をスポッティング添加剤として混合してスポッティングする方法を挙げることができる。これらのスポッティング添加剤は、ＣＡＰＳ(N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液に溶解して用いることもできる。
【0048】
上記チップにペプチドの固定化を行った後には、ブロッキング処理を行うことが好ましい。かかるブロッキング処理は、バックグラウンドを低下させると同時に、相対的に蛍光強度や発色強度を上昇させ、測定感度を向上させることができる。上記ブロッキング剤としては、生体成分を含まないブロッキング剤を用いることが好ましい。生体成分を含まない成分を使用することにより、牛血清アルブミン等の生体成分を含むブロッキング剤を用いた場合と比べ、動物性アレルゲンとの交叉反応を減少させ、バックグラウンドノイズやシグナル減退を防止できる。具体的には、Pierce Protein-Free Blocking Buffer（サーモフィッシャー社製）、ｂｌφｋノイズキャンセリング試薬（メルクミリポア社製）、Ｐｒｏ－Ｂｌｏｃｋ（ＳｃｙＴｅｃ社製）、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社製）等のプロテインフリー・ブロッキングバッファーを挙げることができる。これらのブロッキング剤を希釈せずに添加後、一晩ブロッキング反応を行った後、ブロッキング剤を洗浄し、水分を除去することが好ましい。
【0049】
本発明においてチップを用いて抗体価を定量測定する方法としては、少なくとも試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１抗体や、ＩｇＥ抗体、必要に応じてＩｇＧ２抗体を検出し、抗体価を定量測定することができる公知のイムノアッセイであれば特に限定されず、上記チップ上で行う標識二次抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を好適に挙げることができ、標識二次抗体としては、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｔｔｏ５３２、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体、標識抗ヒトＩｇＥ抗体、標識抗ヒトＩｇＧ抗体、標識抗ヒトＩｇＡ抗体、標識抗ヒトＩｇＭ抗体や、標識抗アレルゲン抗体を例示することができる。上記二次抗体としては、抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も使用することができ、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【0050】
上記アレルゲンを固定化させたチップ、及びそれを用いたＩｇＧ１、ＩｇＥ、必要に応じてＩｇＧ２抗体等の抗体の定量測定方法としては、公知のチップや方法を用いることもでき、例えば特開２００６－２６７０５８号公報、特開２００６－２６７０６３号公報、特開２０１５－１６９６１６号公報に記載のチップや方法を具体的に含めることができる。
【0051】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【0052】
［実施例１］
（検体）
徳島大学の倫理委員会の承認と健康保険鳴門病院（徳島県）の倫理委員会の承認（承認番号：＃１３１４）の上で、十分なインフォームドコンセントのもとに承認の得られた臨床検体として、健康保険鳴門病院より供与された、８４名の新生児の臍帯血試料；生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された血液（血漿試料）；並びに各新生児の母体の血液（母体血漿試料）を検体として用いた。８４名の新生児及びその母体の内訳を以下の表１に示す。
（検体）
徳島大学の倫理委員会の承認と健康保険鳴門病院（徳島県）の倫理委員会の承認（承認番号：＃１３１４）の上で、十分なインフォームドコンセントのもとに承認の得られた臨床検体として、健康保険鳴門病院より供与された、８４名の新生児の臍帯血試料；生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された血液（血漿試料）；並びに各新生児の母体の血液（母体血漿試料）を検体として用いた。８４名の新生児及びその母体の内訳を以下の表１に示す。
【0053】
【表1】
【0054】
前記８４名の乳児は、母乳（母体からの卵抗原を含むと推定される）、人工栄養（牛乳からのミルク抗原を含むと推定される）、及び混合栄養（卵抗原及びミルク抗原を含むと推定される）のいずれかによる栄養摂取が行われ、生後６ヶ月までに離乳食を摂取することはなかった。生後６ヶ月経過時の検診において、半数の乳児に湿疹を認めた。
【0055】
［測定手順］
（チップの作製）
アレルゲンとしての抗原タンパク質として、全卵白（Egg White－ＥＷ）（徳島大学製）、ＯＶＡ（SIGMA社製）及びβ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ、SIGMA社製）を用いた。
（チップの作製）
アレルゲンとしての抗原タンパク質として、全卵白（Egg White－ＥＷ）（徳島大学製）、ＯＶＡ（SIGMA社製）及びβ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ、SIGMA社製）を用いた。
【0056】
シリカガラス表面に、アミノ基含有静電層を施し、さらにポリアクリル酸による負の電荷を帯びるカルボキシル基を導入した基板を化学架橋剤（１００ｍＭ ＷＳＣ・ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮＨＳ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））中で、遮光した状態で室温にて３０分間振盪しながら再活性化処理を行った。反応後の化学架橋剤を廃棄後、基板をＭｉｌｌｉＱ水で振盪しながら１分間の洗浄を２回行った後、直ちに卓上遠心機（ＡｌｌｅｇｒａＴＭＸ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｒ，Beckman Coulter社製）を用いて水分を除去し、活性化チップを調製した。
【0057】
（アレルゲンのカップリング反応）
５～３０％ＤＭＳＯ又は５～３０％ＰＥＧ３００を添加した溶液に、抗原タンパク質としてＥＷ（徳島大学製）、ＯＶＡ（SIGMA社製）及びＢＬＧを０．２５～１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して、抗原タンパク質溶液を調製した。かかる調製された各々の抗原タンパク質溶液を３８４穴プレート平底（Corning社製）に分注し、マイクロアレイ作製装置（ＯｍｎｉＧｒｉｄＡｃｃｅｎｔ，DIGILAB社製）により、上記活性化チップ上に４ｎＬスポット後、１５℃～３０℃にて１～１８時間乾燥し、抗原タンパク質を固定化した。タンパク質が固定化されたＤＣＰチップの模式図を図１に示す。
５～３０％ＤＭＳＯ又は５～３０％ＰＥＧ３００を添加した溶液に、抗原タンパク質としてＥＷ（徳島大学製）、ＯＶＡ（SIGMA社製）及びＢＬＧを０．２５～１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して、抗原タンパク質溶液を調製した。かかる調製された各々の抗原タンパク質溶液を３８４穴プレート平底（Corning社製）に分注し、マイクロアレイ作製装置（ＯｍｎｉＧｒｉｄＡｃｃｅｎｔ，DIGILAB社製）により、上記活性化チップ上に４ｎＬスポット後、１５℃～３０℃にて１～１８時間乾燥し、抗原タンパク質を固定化した。タンパク質が固定化されたＤＣＰチップの模式図を図１に示す。
【0058】
（未反応活性基のブロッキング反応）
上記抗原タンパク質が固定化されたチップにブロッキング試薬のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社製）を反応穴槽（ウェル）に添加し、遮光下冷蔵(４℃)にて静置し終夜反応させた。
上記抗原タンパク質が固定化されたチップにブロッキング試薬のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社製）を反応穴槽（ウェル）に添加し、遮光下冷蔵(４℃)にて静置し終夜反応させた。
【0059】
（アレルゲン特異抗体との捕捉反応）
上記ブロッキング試薬をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、再度反応プレートに移し、洗浄液（５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を８ｍＬ添加後、５分間ゆらした後にアスピレーターで洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）で３回洗浄した。遠心機（Allegra（商標）、Ｘ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ(BECKMAN COULTER社製)）で、遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)して、チップ表面の水滴を除去した。サンプル希釈液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で適宜希釈して、希釈一次抗体液を調製し、かかる希釈一次抗体液を、反応ウェルに１０μＬ添加し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
上記ブロッキング試薬をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、再度反応プレートに移し、洗浄液（５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を８ｍＬ添加後、５分間ゆらした後にアスピレーターで洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）で３回洗浄した。遠心機（Allegra（商標）、Ｘ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ(BECKMAN COULTER社製)）で、遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)して、チップ表面の水滴を除去した。サンプル希釈液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で適宜希釈して、希釈一次抗体液を調製し、かかる希釈一次抗体液を、反応ウェルに１０μＬ添加し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
【0060】
（二次抗体との反応）
上記の操作で得られた希釈検体液（一次抗体）をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０μＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は ５５５ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ（ＨｙＴｅｓｔ社製）（希釈液としてＩＭＭＵＮＯ ＳＨＯＴ Ｐｌａｔｉｍｕｎ／１％牛血清アルブミンを使用した。最終希釈濃度１０μｇ／ｍＬ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３ＭＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５μｇ／ｍＬ)、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製、(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５ μｇ／ｍＬ)を二次抗体液として調製した。かかる二次抗体液を、スライド上の各反応ウェルに１０μＬ分注し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
上記の操作で得られた希釈検体液（一次抗体）をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０μＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は ５５５ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ（ＨｙＴｅｓｔ社製）（希釈液としてＩＭＭＵＮＯ ＳＨＯＴ Ｐｌａｔｉｍｕｎ／１％牛血清アルブミンを使用した。最終希釈濃度１０μｇ／ｍＬ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３ＭＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５μｇ／ｍＬ)、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製、(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５ μｇ／ｍＬ)を二次抗体液として調製した。かかる二次抗体液を、スライド上の各反応ウェルに１０μＬ分注し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
【0061】
［抗原に捕捉された抗体の検出］
上記希釈二次抗体液をアスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに入れＤｏｕｂｌｅ－ＳｈａｋｅｒＮＲ３(TAITEC社製)を用いて洗浄作業を５分間３回繰返し行った。その後、精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加え１分間３回すすぎ、上記遠心機で水滴を除去し乾燥させた。蛍光スキャナー（３D Gene Scanner、東レ社製）で蛍光強度を測定(Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ)し、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。測定単位は、抗原と抗原抗体反応により結合した抗体価として、Binding Unit（ＢＵ）で表し、チップに固定化した既知の濃度のそれぞれの標準抗体の蛍光強度の検量線から測定して表した。なお標準抗体としては、ＩｇＥ標準抗体、ＩｇＧ標準抗体、ＩｇＧ２標準抗体、ＩｇＧ３標準抗体、ＩｇＧ４標準抗体、ＩｇＡ標準抗体を用いた。以下、ＩｇＥはＢＵｅで表記し、１ＢＵｅ＝２．３ｎｇ、ＩｇＧ１はＢＵｇ１で表記し、１ＢＵｇ１＝１．０μｇ、ＩｇＧ２はＢＵｇ２で表記し、１ＢＵｇ２＝１．０μｇ、ＩｇＧ３はＢＵｇ３で表記し、１ＢＵｇ３＝１．０μｇ、ＩｇＧ４はＢＵｇ４で表記し、１ＢＵｇ４＝１．０μｇ、ＩｇＡはＢＵａで表記し、１ＢＵａ＝１．０μｇとして表記する。
上記希釈二次抗体液をアスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに入れＤｏｕｂｌｅ－ＳｈａｋｅｒＮＲ３(TAITEC社製)を用いて洗浄作業を５分間３回繰返し行った。その後、精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加え１分間３回すすぎ、上記遠心機で水滴を除去し乾燥させた。蛍光スキャナー（３D Gene Scanner、東レ社製）で蛍光強度を測定(Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ)し、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。測定単位は、抗原と抗原抗体反応により結合した抗体価として、Binding Unit（ＢＵ）で表し、チップに固定化した既知の濃度のそれぞれの標準抗体の蛍光強度の検量線から測定して表した。なお標準抗体としては、ＩｇＥ標準抗体、ＩｇＧ標準抗体、ＩｇＧ２標準抗体、ＩｇＧ３標準抗体、ＩｇＧ４標準抗体、ＩｇＡ標準抗体を用いた。以下、ＩｇＥはＢＵｅで表記し、１ＢＵｅ＝２．３ｎｇ、ＩｇＧ１はＢＵｇ１で表記し、１ＢＵｇ１＝１．０μｇ、ＩｇＧ２はＢＵｇ２で表記し、１ＢＵｇ２＝１．０μｇ、ＩｇＧ３はＢＵｇ３で表記し、１ＢＵｇ３＝１．０μｇ、ＩｇＧ４はＢＵｇ４で表記し、１ＢＵｇ４＝１．０μｇ、ＩｇＡはＢＵａで表記し、１ＢＵａ＝１．０μｇとして表記する。
【0062】
［試験例１］
８４名の乳児について、臍帯血試料；並びに、生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された血漿試料におけるＥＷに対するＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体の抗体価をそれぞれ測定した。結果を図２（ａ）～（ｃ）に示す。
８４名の乳児について、臍帯血試料；並びに、生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された血漿試料におけるＥＷに対するＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体の抗体価をそれぞれ測定した。結果を図２（ａ）～（ｃ）に示す。
【0063】
（結果）
図２（ａ）より明らかなとおり、ＥＷに対するＩｇＥの抗体価は、臍帯血においては、胎盤を経由して母体から移行したＥＷ抗原により胎児期に産生される低親和性ＩｇＥが微量で検出された。データには乳児の母乳摂取の有無の区別は示されていないが、ＩｇＥ抗体価は、母乳摂取している乳児において生後４ヶ月以降に急上昇した。理由としては、母親が食べた卵の未分解成分が母乳を介して乳児の体内に侵入し、卵白アレルゲンに対する抗体反応がおこり、ＩｇＥ抗体価が上昇したものと考えられるが、これは多くの乳児が自然に体験する経口免疫トレランスの一過程と理解することができる。一方、ＩｇＥ抗体価の上昇がほとんど確認されない乳児もおり、かかる乳児においては母乳に含まれる抗原量が少ないためか、あるいは乳児の免疫系が緩やかに発達しているため、生後６ヶ月までの間における抗原特異的ＩｇＧ１の蓄積が不十分で、ＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの切り換えが遅れているためと推定される。
図２（ａ）より明らかなとおり、ＥＷに対するＩｇＥの抗体価は、臍帯血においては、胎盤を経由して母体から移行したＥＷ抗原により胎児期に産生される低親和性ＩｇＥが微量で検出された。データには乳児の母乳摂取の有無の区別は示されていないが、ＩｇＥ抗体価は、母乳摂取している乳児において生後４ヶ月以降に急上昇した。理由としては、母親が食べた卵の未分解成分が母乳を介して乳児の体内に侵入し、卵白アレルゲンに対する抗体反応がおこり、ＩｇＥ抗体価が上昇したものと考えられるが、これは多くの乳児が自然に体験する経口免疫トレランスの一過程と理解することができる。一方、ＩｇＥ抗体価の上昇がほとんど確認されない乳児もおり、かかる乳児においては母乳に含まれる抗原量が少ないためか、あるいは乳児の免疫系が緩やかに発達しているため、生後６ヶ月までの間における抗原特異的ＩｇＧ１の蓄積が不十分で、ＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの切り換えが遅れているためと推定される。
【0064】
図２（ｂ）及び（ｃ）から明らかなとおり、ＥＷに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２の抗体価は、臍帯血において顕著に高いが急速に減少している。出生直後の乳児の場合、母体から胎盤を通過して胎児期に移行した母体由来の大量のＩｇＧ１やＩｇＧ２が検出され、乳児自身の産生するＥＷに対するＩｇＧ１やＩｇＧ２は、母体由来のＩｇＧが消える出生後２～４ヶ月以降に検出され始めることが、図２（ｂ）及び（ｃ）に示されている。また、図２（ａ）から明らかなとおり、ＩｇＥは母子移行しないにもかかわらず、臍帯血中に卵白（ＥＷ）に対するＩｇＥが検出されているが、かかる結果は、胎児期に胎盤を通過して胎児に移行したＩｇＧ－抗原複合体により、胎児が抗原に感作され、胎児自身が産生した低親和性ＩｇＥが検出された結果であるという、本発明者が既に確認している事項（Kamemura N, et al. Low-affinity allergen-specific IgE in cord blood and affinity maturation after birth. J Allergy Clin Immunol 2014;133:904-905）と一致する。ＥＷについては、免疫寛容パターンを示す群と免疫寛容パターンを示さない群が混在していたと考えられたことから、さらに検討を続けた。
【0065】
［試験例２］
前記８４名の乳児について、臍帯血試料；並びに、生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された試料におけるＢＬＧに対するＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体の抗体価をそれぞれ測定した。結果を図３（ａ）～（ｃ）に示す。
図３（ａ）から明らかなとおり、ＢＬＧに対するＩｇＥ抗体価は生後２ヶ月までは微量であり、微量の抗原感作を示している。牛乳に少量含まれ本来母乳には含まれなＢＬＧは、抗原性が比較的強いため人工乳の製造過程で極力除去する操作がおこなわれているが、現在の技術では完全に除去することは困難で、育児用粉ミルクでは０．５～１．３％程度粉ミルク中に残存しているとされ、そのため人工乳の摂取でＢＬＧが感作される。大多数の乳児において、ＢＬＧ抗原感作の場合、抗体量が出生直後から増加してその後低下する山型の“免疫寛容パターン”が成立していることが確認された。１歳の時点で８４名全員がミルクに対する免疫寛容を獲得していたことから、上記の山型の“免疫寛容パターン”を取らずに６ヶ月まで上昇しているケースであっても、その後、１歳までの間に同様の“免疫寛容パターン”の経過をとったと推定される。
前記８４名の乳児について、臍帯血試料；並びに、生後２ヶ月経過時、４ヶ月経過時、及び６ヶ月経過時に採取された試料におけるＢＬＧに対するＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体の抗体価をそれぞれ測定した。結果を図３（ａ）～（ｃ）に示す。
図３（ａ）から明らかなとおり、ＢＬＧに対するＩｇＥ抗体価は生後２ヶ月までは微量であり、微量の抗原感作を示している。牛乳に少量含まれ本来母乳には含まれなＢＬＧは、抗原性が比較的強いため人工乳の製造過程で極力除去する操作がおこなわれているが、現在の技術では完全に除去することは困難で、育児用粉ミルクでは０．５～１．３％程度粉ミルク中に残存しているとされ、そのため人工乳の摂取でＢＬＧが感作される。大多数の乳児において、ＢＬＧ抗原感作の場合、抗体量が出生直後から増加してその後低下する山型の“免疫寛容パターン”が成立していることが確認された。１歳の時点で８４名全員がミルクに対する免疫寛容を獲得していたことから、上記の山型の“免疫寛容パターン”を取らずに６ヶ月まで上昇しているケースであっても、その後、１歳までの間に同様の“免疫寛容パターン”の経過をとったと推定される。
【0066】
生後６ヶ月までの各種抗ＢＬＧ抗体の出現は、イムノグロブリン遺伝子座の位置の順番に、（ＩｇＭ）→ＩｇＧ３→ＩｇＧ１→ＩｇＧ２→ＩｇＧ４へと進むクラススイッチと、ＩｇＧ３→ＩｇＧ１→ＩｇＥへと進むクラススイッチが存在するが、各イムノグロブリンの出現には時間差のあることと、ＩｇＧ１とＩｇＥは増加した後に減少経過をたどるが、ＩｇＧ２は多くの場合例外はあるものの、増加傾向が続くことが確認された。経時変化では、ＩｇＧ１の出現が早く、生後２ヶ月、あるいは４ヶ月でピークを示す例が多く見られた一方、ＩｇＧ２、ＩｇＥは、ＩｇＧ１に遅れて増加を始めることが確認された。今回調査した８４名は、１年後の抗原負荷試験でミルクアレルギーと診断された乳児はおらず、全員が経口免疫寛容状態になっていると診断された。したがって、図３（ａ）～（ｃ）は経口免疫寛容獲得する場合の、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２の変動パターンが示されていると考えられる。
【0067】
［実施例２］
［ＢＬＧに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価の相関］
前記８４人の乳児について、生後２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月経過時に採血した血漿におけるＢＬＧに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価とをそれぞれ測定し、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成した。結果を図４（ａ）（生後２ヶ月）、（ｂ）（生後４ヶ月）、及び（ｃ）（生後６ヶ月）に示した。
［ＢＬＧに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価の相関］
前記８４人の乳児について、生後２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月経過時に採血した血漿におけるＢＬＧに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価とをそれぞれ測定し、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成した。結果を図４（ａ）（生後２ヶ月）、（ｂ）（生後４ヶ月）、及び（ｃ）（生後６ヶ月）に示した。
【0068】
（結果）
図４（ａ）及び（ｂ）において、生後２ヶ月及び４ヶ月におけるＢＬＧに対するＩｇＧ１の抗体価とＩｇＥの抗体価の関係について回帰分析を行い、いずれもＩｇＧ１が２０００ＢＵｇ１／ｍＬを超えた時点から、ＩｇＧ１→ＩｇＥへのクラススイッチが開始された。
図４（ａ）及び（ｂ）において、生後２ヶ月及び４ヶ月におけるＢＬＧに対するＩｇＧ１の抗体価とＩｇＥの抗体価の関係について回帰分析を行い、いずれもＩｇＧ１が２０００ＢＵｇ１／ｍＬを超えた時点から、ＩｇＧ１→ＩｇＥへのクラススイッチが開始された。
【0069】
図４（ｃ）において、生後６ヶ月におけるＢＬＧに対するＩｇＧ１とＩｇＥの抗体価の関係について回帰分析を行った。生後２ヶ月～４ヶ月と同様、ＩｇＧ１が２０００ＢＵｇ１／ｍＬにおいて立上りを開始する一次関数（Ｙ＝０．１６７７Ｘ-３３５．４）を得た。図４（ａ）～（ｃ）いずれにおいても、抗原感作を受ける時間の経過と共に、ＩｇＧ１の蓄積が確認され、ＩｇＥへの移行は、ほとんどの場合ＩｇＧ１が２０００Ｂｕｇ１／ｍＬを超えるまでは起こらなかった。ミルクアレルギーを発症した幼児はいなかったことから、ＢＬＧの場合は、経口免疫寛容を獲得し、アレルギーの発症リスクが低いと予想できるパターンにおいては、上記一次関数が適用できる範囲内にデータが存在し、ＩｇＧ１からＩｇＥへの移行を開始する閾値が２０００Ｂｕｇ１であると確認した。なお、ＩｇＧ１→ＩｇＥへのクラススイッチに関する閾値と一次関数は抗原の種類によって異なる値を示すが、いずれの抗原においても類似のパターンでクラススイッチが進行すると推定される。
【0070】
［実施例３］
［ＥＷに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価の相関］
前記８４人の乳児について、生後２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月経過時に採血した血漿におけるＥＷに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価とをそれぞれ測定し、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成した。結果を図５（ａ）（生後２ヶ月）、（ｂ）（生後４ヶ月）、及び（ｃ）（生後６ヶ月）に示した。
［ＥＷに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価の相関］
前記８４人の乳児について、生後２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月経過時に採血した血漿におけるＥＷに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ１抗体価とをそれぞれ測定し、ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成した。結果を図５（ａ）（生後２ヶ月）、（ｂ）（生後４ヶ月）、及び（ｃ）（生後６ヶ月）に示した。
【0071】
（結果）
図５（ａ）から明らかなとおり、生後２ヶ月においては、ＩｇＧ１の抗体価は、低い値にとどまっており、ＩｇＧ１の蓄積は進んでいない。また、母体から移行したＩｇＧ１が存在する生後２ヶ月の抗体価は参考にならないとも考えられた。図５（ｂ）から明らかなとおり、生後４ヶ月においてはＥＷに対するＩｇＧ１の蓄積が確認された。例外はあるもののほとんどの乳児では、生後４ヶ月のグラフは、ＢＬＧと類似のＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの閾値の存在を示唆している。
図５（ａ）から明らかなとおり、生後２ヶ月においては、ＩｇＧ１の抗体価は、低い値にとどまっており、ＩｇＧ１の蓄積は進んでいない。また、母体から移行したＩｇＧ１が存在する生後２ヶ月の抗体価は参考にならないとも考えられた。図５（ｂ）から明らかなとおり、生後４ヶ月においてはＥＷに対するＩｇＧ１の蓄積が確認された。例外はあるもののほとんどの乳児では、生後４ヶ月のグラフは、ＢＬＧと類似のＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチの閾値の存在を示唆している。
【0072】
一方、図５（ｃ）においては、散布図全体に分布するデータに適用可能な一次関数は、実際のデータの分布状況から、二つのブロックにデータを分割したうえで、それぞれのグループに適用可能な一次関数を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．６．０７のソフトにより算出したところ、ＥＷに対するＩｇＧ１とＩｇＥの抗体価の相関関係について、ＩｇＧ１＝１４００ＢＵｇ１において立上りを開始する一次関数〈１〉（Ｙ＝０．１２７４Ｘ－１７８．３６，Ｘ≧１４００の場合）と、ＩｇＧ１＝１４００ＢＵｇ１より少ない値で立上りを開始する一次関数〈２〉（Ｙ＝２．１３１Ｘ－８５２．９４，Ｘ＜１４００，Ｙ≧３００の場合）を得た。一次関数［２］が適用できるブロックに属する乳児は、その９０．９％が生後６ヶ月までに１週間以上持続する湿疹の既往歴があり、しかも１歳の時点で鶏卵アレルギーを発症した５名中４名がこのブロックに属していたことから、食物アレルギーのハイリスクグループと予想した。なお、このブロックには所属せずに卵白アレルギーを発症した例外的な乳幼児１名は、一次関数〈１〉、〈２〉のいずれにも属せず、高いＩｇＥと高いＩｇＧ１を示したが、後述するが、ＩｇＧ１→ＩｇＧ２へのクラススイッチが比較的不十分で、ＩｇＧ２が２００ＢＵｇ２／ｍＬを僅かに超えた低値に留まっていた。
【0073】
［実施例４］
［生後６ヶ月検診における湿疹の有無とステロイド治療］
（ＥＷ）
上記図５（ｃ）をもとに、生後６ヶ月検診時の湿疹の有無と、湿疹部位へのステロイドの塗布の有無についての情報を付加し、湿疹がでている乳児（有湿疹群）を▲（三角）で示し、湿疹のない乳児（無湿疹群）を○（まる）として、湿疹患者でステロイド治療者を（■）、１歳の時点で卵白アレルギー発症者を◇で記載して、改めて図６に表した。なお、ステロイド介入の多くは、生後４ヶ月から６ヶ月の間に行われた。
［生後６ヶ月検診における湿疹の有無とステロイド治療］
（ＥＷ）
上記図５（ｃ）をもとに、生後６ヶ月検診時の湿疹の有無と、湿疹部位へのステロイドの塗布の有無についての情報を付加し、湿疹がでている乳児（有湿疹群）を▲（三角）で示し、湿疹のない乳児（無湿疹群）を○（まる）として、湿疹患者でステロイド治療者を（■）、１歳の時点で卵白アレルギー発症者を◇で記載して、改めて図６に表した。なお、ステロイド介入の多くは、生後４ヶ月から６ヶ月の間に行われた。
【0074】
図６から明らかなとおり、上記一次関数〈２〉が適用できるブロックにおいては、湿疹が高率（約９０．９％）で発症していた。特に湿疹症状の強い１９人について湿疹部位にステロイド剤を「アトピー性皮膚炎診療ガイドライン」に沿って１日１～２回塗布した。なお、ＩｇＧ１値が低いにも係わらずＩｇＥ抗体価が急増加した乳児は、ほとんどが湿疹を伴う乳児であり、母乳に含まれるＥＷ抗原が湿疹によってバリア機能が障害された皮膚に接触して経皮感作が引き起こされたと推定した。このＩｇＥ増加の機序は、経口感作で起こるＩｇＧ１→ＩｇＥクラススイッチとは別の経皮感作機序でＩｇＧ１→ＩｇＥクラススイッチが引き起こされた結果と推定した。すなわち、免疫寛容の発動するＩｇＧ１の閾値に達する前に、経皮感作機序でＩｇＧ１→ＩｇＥクラススイッチが起きて、ＩｇＥ抗体価が急増加したと推定した。
【0075】
（ＢＬＧ）
湿疹症状が出ている乳児においてではあるが、生後６ヶ月検診においてＢＬＧ特異的ＩｇＥ抗体価はいずれも低かったため、ＢＬＧに対するアレルギーを発症するリスクは非常に低いと予想した。なお、ＢＬＧの場合、生後２ヶ月ですでに免疫寛容の発動するＩｇＧ１の閾値に達している乳児が半数以上いることもアレルギーの発症率が低いことの原因の一つであると考えられる。すなわち、クラススイッチが進みＩｇＧ１が閾値を超えると、例え湿疹が発症して経皮感作リスクが生じても、上記一次関数〈２〉の状況は起こりにくいことが示唆された。
湿疹症状が出ている乳児においてではあるが、生後６ヶ月検診においてＢＬＧ特異的ＩｇＥ抗体価はいずれも低かったため、ＢＬＧに対するアレルギーを発症するリスクは非常に低いと予想した。なお、ＢＬＧの場合、生後２ヶ月ですでに免疫寛容の発動するＩｇＧ１の閾値に達している乳児が半数以上いることもアレルギーの発症率が低いことの原因の一つであると考えられる。すなわち、クラススイッチが進みＩｇＧ１が閾値を超えると、例え湿疹が発症して経皮感作リスクが生じても、上記一次関数〈２〉の状況は起こりにくいことが示唆された。
【0076】
［ステロイド治療法の指針とアレルギー発症］
上記８４人について生後１年経過時に卵と牛乳について、食物摂取試験を行いアレルギー発症の診断を行い、図６に示す卵白アレルギー５人を確定した。ミルクアレルギーに該当する乳児はいなかった。５０％の乳児（４２名）が湿疹に罹患して、そのうち１９名にステロイドホルモン剤が塗布されているが、塗布例は上記一次関数〈１〉、〈２〉両群間でほぼ均等に分布していた。上記一次関数〈１〉の群は、すでに経口免疫寛容が成立すると予測される群であることから、ステロイドホルモン剤塗布の有無にかかわらず卵白アレルギーの発症は無い。従って、本検査法により一次関数〈１〉の群と認定されれば、ステロイドホルモン剤の経皮投与は、強度の弱いステロイドホルモン剤による対症療法が推奨される。一方上記一次関数〈２〉の群は、すでに経皮感作が起こっていると推定され、しかも卵白アレルギーの発症が集中していることから、実施されたステロイドの経皮投与法では不十分で、対症療法を超える強度の強いステロイドホルモン剤が適切であったと推定された。このように、本「アレルギー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法」を用いることで、経皮感作を防ぐために、適切な時期に適切な強度のステロイドホルモン剤を選択することができると推定された。
上記８４人について生後１年経過時に卵と牛乳について、食物摂取試験を行いアレルギー発症の診断を行い、図６に示す卵白アレルギー５人を確定した。ミルクアレルギーに該当する乳児はいなかった。５０％の乳児（４２名）が湿疹に罹患して、そのうち１９名にステロイドホルモン剤が塗布されているが、塗布例は上記一次関数〈１〉、〈２〉両群間でほぼ均等に分布していた。上記一次関数〈１〉の群は、すでに経口免疫寛容が成立すると予測される群であることから、ステロイドホルモン剤塗布の有無にかかわらず卵白アレルギーの発症は無い。従って、本検査法により一次関数〈１〉の群と認定されれば、ステロイドホルモン剤の経皮投与は、強度の弱いステロイドホルモン剤による対症療法が推奨される。一方上記一次関数〈２〉の群は、すでに経皮感作が起こっていると推定され、しかも卵白アレルギーの発症が集中していることから、実施されたステロイドの経皮投与法では不十分で、対症療法を超える強度の強いステロイドホルモン剤が適切であったと推定された。このように、本「アレルギー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法」を用いることで、経皮感作を防ぐために、適切な時期に適切な強度のステロイドホルモン剤を選択することができると推定された。
【0077】
［実施例５］
［ＢＬＧ、ＥＷに対するＩｇＧ２抗体価とＩｇＧ１抗体価の相関］
図７は、ＢＬＧ（ａ）、ＥＷ（ｂ）に対する生後６ヶ月経過時の８４人のＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチを示すグラフである。経口免疫寛容を誘導する場合は、ＩｇＧ１→ＩｇＥクラススイッチの他に、ほぼ同時にＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチが起きる。ＩｇＧ２の産生はその後ＩｇＧ４へクラススイッチされてゆくことから、経口免疫寛容の成立には重要と推定される（James LK, et al. Long-term tolerance after allergen immunotherapy is accompanied by selective persistence of blocking antibodies. J Allergy Clin Immunol 2011;127:509-516; Sugimoto M, et al. Differential response in allergen-specific IgE, IgGs, and IgA levels for predicting outcome of oral immunotherapy. Pediatr Allergy Immunol 2016;27(3):276-282）。
図７（ａ）では、ＢＬＧに対するＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチを示している。ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成すると、その一次関数は、（Ｙ＝０．２２８９Ｘ－４５７．８，Ｘ≧２０００の場合）を得た。この場合、ＩｇＧ１の閾値は２０００ＢＵｇ１で、ＩｇＧ１→ＩｇＥへのクラススイッチにおける閾値と同じ値であつた。このことは、経口免疫寛容の成立しているＢＬＧの場合、ＩｇＧ１からＩｇＥとＩｇＧ２へのクラススイッチは、ＩｇＧ１の閾値を超えたらほぼ同時に進行することを示唆する。図７（ｂ）は、ＥＷに対するＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチを示している。ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成すると、その一次関数は、（Ｙ＝０．０２９３Ｘ＋４１．０）を得た。ＩｇＧ１→ＩｇＥへのクラススイッチにおける閾値と同じであると考えられるので、ＩｇＧ１→ＩｇＧ２の閾値は１４００ＢＵｇ１であると推定された。なお、卵白アレルギーを発症した５人の乳児のＩｇＧ２値は全員が２００ＢＵｇ２以下で、ＩｇＧ２の産生の低さが、卵白アレルギーの発症に関与していることを示唆した。
［ＢＬＧ、ＥＷに対するＩｇＧ２抗体価とＩｇＧ１抗体価の相関］
図７は、ＢＬＧ（ａ）、ＥＷ（ｂ）に対する生後６ヶ月経過時の８４人のＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチを示すグラフである。経口免疫寛容を誘導する場合は、ＩｇＧ１→ＩｇＥクラススイッチの他に、ほぼ同時にＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチが起きる。ＩｇＧ２の産生はその後ＩｇＧ４へクラススイッチされてゆくことから、経口免疫寛容の成立には重要と推定される（James LK, et al. Long-term tolerance after allergen immunotherapy is accompanied by selective persistence of blocking antibodies. J Allergy Clin Immunol 2011;127:509-516; Sugimoto M, et al. Differential response in allergen-specific IgE, IgGs, and IgA levels for predicting outcome of oral immunotherapy. Pediatr Allergy Immunol 2016;27(3):276-282）。
図７（ａ）では、ＢＬＧに対するＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチを示している。ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成すると、その一次関数は、（Ｙ＝０．２２８９Ｘ－４５７．８，Ｘ≧２０００の場合）を得た。この場合、ＩｇＧ１の閾値は２０００ＢＵｇ１で、ＩｇＧ１→ＩｇＥへのクラススイッチにおける閾値と同じ値であつた。このことは、経口免疫寛容の成立しているＢＬＧの場合、ＩｇＧ１からＩｇＥとＩｇＧ２へのクラススイッチは、ＩｇＧ１の閾値を超えたらほぼ同時に進行することを示唆する。図７（ｂ）は、ＥＷに対するＩｇＧ１→ＩｇＧ２クラススイッチを示している。ＩｇＧ１抗体価をＸ軸に、ＩｇＧ２抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成すると、その一次関数は、（Ｙ＝０．０２９３Ｘ＋４１．０）を得た。ＩｇＧ１→ＩｇＥへのクラススイッチにおける閾値と同じであると考えられるので、ＩｇＧ１→ＩｇＧ２の閾値は１４００ＢＵｇ１であると推定された。なお、卵白アレルギーを発症した５人の乳児のＩｇＧ２値は全員が２００ＢＵｇ２以下で、ＩｇＧ２の産生の低さが、卵白アレルギーの発症に関与していることを示唆した。
【0078】
［実施例６］
［ＥＷに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ２抗体価の相関］
８４人の乳児のなかで、５人が卵白アレルギーが発症したことから、ＩｇＧ１がクラススイッチすることによるＩｇＧ２とＩｇＥとの相関を、ＥＷに対するＩｇＧ２抗体価とＩｇＥ抗体価とをそれぞれ測定し、散布図を作成した。結果を図８に示した。卵白アレルギー発症者５人を◇で示し、湿疹があった４２人を▲で、湿疹がなかった４２人を○で示した。
［ＥＷに対するＩｇＥ抗体価とＩｇＧ２抗体価の相関］
８４人の乳児のなかで、５人が卵白アレルギーが発症したことから、ＩｇＧ１がクラススイッチすることによるＩｇＧ２とＩｇＥとの相関を、ＥＷに対するＩｇＧ２抗体価とＩｇＥ抗体価とをそれぞれ測定し、散布図を作成した。結果を図８に示した。卵白アレルギー発症者５人を◇で示し、湿疹があった４２人を▲で、湿疹がなかった４２人を○で示した。
【0079】
図８から明らかなとおり、卵白アレルギー発症者においては、ＩｇＥの増加レベルと比較してＩｇＧ２の増加が顕著に低かった。ＩｇＧ１からＩｇＥへのクラススイッチが進み、ＩｇＧ１からＩｇＧ２へのクラススイッチが進まない場合に、一年経過後に高い確率で卵白アレルギーが出現することが確認された。その原因として、卵白アレルギー発症乳児５人中４人が湿疹の発症者であることから、湿疹による卵白アレルゲンの経皮感作が誘因になっていると推定された。残り１人の卵白アレルギー発症乳児は、生後６ヶ月の時点では、湿疹はなく、ＩｇＥ値、ＩｇＧ１値、ＩｇＧ２値のいずれの上昇も認められなかったことから、生後６ヶ月以後に何らかの抗原感作が起きたと推定した。
【0080】
［実施例７］
［ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性の測定］
ＥＷの主要成分の一つであるＯＶＡを分子量の明らかな単一アレルゲンとして使用した。前記８４人の乳児のうち、母乳中に含まれるＯＶＡに曝されるリスクのあると考えられる母乳栄養児３１人と混合栄養児４７人との計７８人について、６ヶ月経過時に採取された血漿試料におけるＯＶＡに対するＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体の抗体価をそれぞれ測定した。また、ＩｇＥ抗体のＯＶＡに対する親和性を測定した。
［ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性の測定］
ＥＷの主要成分の一つであるＯＶＡを分子量の明らかな単一アレルゲンとして使用した。前記８４人の乳児のうち、母乳中に含まれるＯＶＡに曝されるリスクのあると考えられる母乳栄養児３１人と混合栄養児４７人との計７８人について、６ヶ月経過時に採取された血漿試料におけるＯＶＡに対するＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体の抗体価をそれぞれ測定した。また、ＩｇＥ抗体のＯＶＡに対する親和性を測定した。
【0081】
（チップの作製）
アレルゲンとしての抗原タンパク質として、ＯＶＡ（SIGMA社製）を用いたほかは、実施例１の［測定手順］（チップの作製）及び（アレルゲンのカップリング反応）の手順に従い、抗原タンパク質としてＯＶＡが固定化されているＤＣＰチップを作製した。
アレルゲンとしての抗原タンパク質として、ＯＶＡ（SIGMA社製）を用いたほかは、実施例１の［測定手順］（チップの作製）及び（アレルゲンのカップリング反応）の手順に従い、抗原タンパク質としてＯＶＡが固定化されているＤＣＰチップを作製した。
【0082】
（ＯＶＡ特異抗体との捕捉反応）
使用前にブロッキング試薬（Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社製））を反応ウェルに添加し、遮光下冷蔵(４℃)にて終夜静置後、上記ブロッキング試薬をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、再度反応プレートに移し、洗浄液（５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を８ｍＬ添加後、５分間ゆらした後にアスピレーターで洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）で３回洗浄した。遠心機（Allegra（商標）、Ｘ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ(BECKMAN COULTER社製)）で、遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)して、チップ表面の水滴を除去した。
使用前にブロッキング試薬（Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社製））を反応ウェルに添加し、遮光下冷蔵(４℃)にて終夜静置後、上記ブロッキング試薬をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、再度反応プレートに移し、洗浄液（５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を８ｍＬ添加後、５分間ゆらした後にアスピレーターで洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）で３回洗浄した。遠心機（Allegra（商標）、Ｘ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ(BECKMAN COULTER社製)）で、遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)して、チップ表面の水滴を除去した。
【0083】
（一次抗体反応）
各乳児の血漿を、ＩｇＥ測定ではサンプル希釈液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２－５倍に、ＩｇＧ１とＩｇＧ２の測定では上記サンプル希釈液で５０倍に希釈した後、１０μＬずつをＤＣＰチップのウェルに添加し、遮光下３７℃にて１時間静置した。
各乳児の血漿を、ＩｇＥ測定ではサンプル希釈液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２－５倍に、ＩｇＧ１とＩｇＧ２の測定では上記サンプル希釈液で５０倍に希釈した後、１０μＬずつをＤＣＰチップのウェルに添加し、遮光下３７℃にて１時間静置した。
【0084】
（二次抗体との反応）
上記の操作で得られた希釈された血漿（一次抗体）をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０μＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は ５５５ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ（ＨｙＴｅｓｔ社製））（希釈液としてＩＭＭＵＮＯ ＳＨＯＴ Ｐｌａｔｉｍｕｎ／１％牛血清アルブミンを使用した。最終希釈濃度１０μｇ／ｍＬ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５ μｇ／ｍＬ)、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５μｇ／ｍＬ)を調製した。かかる二次抗体液を、各反応ウェルに１０μＬ分注し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
上記の操作で得られた希釈された血漿（一次抗体）をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０μＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は ５５５ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ（ＨｙＴｅｓｔ社製））（希釈液としてＩＭＭＵＮＯ ＳＨＯＴ Ｐｌａｔｉｍｕｎ／１％牛血清アルブミンを使用した。最終希釈濃度１０μｇ／ｍＬ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５ μｇ／ｍＬ)、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）又は５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）(希釈液として２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／１％牛血清アルブミン／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。最終希釈濃度１．５μｇ／ｍＬ)を調製した。かかる二次抗体液を、各反応ウェルに１０μＬ分注し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
【0085】
生後６ヶ月経過時に採血した血漿における、ＯＶＡに対するＩｇＧ１抗体価をＸ軸にＩｇＥ抗体価をＹ軸にプロットして散布図を作成した。結果を図９に示した。
【0086】
図９から明らかなとおり、散布図全体に分布するデータから二つのブロックにデータを分割したうえで、それぞれのグループに適用可能な一次関数をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．６．０７のソフトにより算出した。ブロック１はＩｇＧ１が２０００ＢＵｇ１/ｍＬを示す群で、ブロック２はＩｇＧ１が２０００ＢＵｇ１/ｍＬ以下で、ＩｇＥが３００ＢＵｅ／ｍＬ以上を示す群である。ＯＶＡに対するＩｇＧ１とＩｇＥの抗体価の相関関係について、ＩｇＧ１＝２０００ＢＵｇ１において立上りを開始する一次関数１（Ｙ＝０．１０８６Ｘ－１６０．２，Ｘ≧２０００の場合）（以下、「１次関数＜１＞」ともいう）と、ＩｇＧ１＝２０００ＢＵｇ１より少ない値で立上りを開始する一次関数２（Ｙ＝１．３７２Ｘ－４７．６１９，Ｘ＜２０００，Ｙ≧３００の場合）（以下、「１次関数＜２＞」ともいう）を得た。
【0087】
上記７８人の母乳栄養児と混合栄養児について、図９において、１次関数＜１＞に属する乳児のうち、破線で囲んだＩｇＧ１が２０００ＢＵｇ１／ｍＬ以上で、ＩｇＥ抗体の抗原親和性測定が可能な１００ＢＵｅ／ｍＬ以上を示す乳児のうちランダムに１０名を選択してグループ［１］とした。また、一次関数＜２＞に属する乳児のうち、実線で囲んだＩｇＧ１が２０００ＢＵｇ１／ｍＬ以下で、ＩｇＥ抗体が５００ＢＵｅ／ｍＬ以上を示す乳児のうちランダムに１０名を選択してグループ［２］とした。
【0088】
グループ［１］に属する乳児１０名とグループ［２］に属する乳児１０名、合計２０名について、各血漿試料中のＩｇＥのＯＶＡに対する親和性について検討を行った。各乳児の血漿に、サンプル希釈液（２０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４／０．３Ｍ ＫＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解したＯＶＡ（０、０．２、２、２０、２００、２０００ｎＭ）を等量加え、ＯＶＡの最終濃度を（０、０．１、１、１０、１００、２０００ｎＭ）になるように調整した反応液を、２５℃にて３０分反応させる前段階反応（競合阻害反応）を行った。かかる溶液を、上記ＤＣＰチップに供し、３７℃にて１時間反応させた。
【0089】
その後アスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０ｍＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次いで５５５ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ抗体を抗体希釈液（ＩＭＭＵＮＯ ＳＨＯＴ Ｐｌａｔｉｍｕｎ／１％牛血清アルブミン）で最終希釈濃度１０μｇ／ｍＬ）に希釈することにより調製した二次抗体液を、スライド上の各反応ウェルに分注し、遮光下に３７℃にて２時間静置して、抗ヒトＩｇＥ二次抗体と反応させた。再度洗浄液（５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０μＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。残存蛍光量を蛍光スキャナー（３D Gene Scanner、東レ社製）で蛍光強度を測定(Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ)することにより、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。競合アレルゲンの存在しない、すなわち濃度が０のオボアルブミンを競合物質として添加した場合の蛍光強度を１００％としたときに、蛍光強度が５０％を示す抗原濃度を以下の表２の「ＩｇＥ ＩＣ５０」の項目に示す。また、図１０に、一次関数［１］と一次関数［２］に属する各乳児におけるＩＣ５０の値を図式化したものを示す。
【0090】
【表2】
【0091】
（結果）
グループ［１］のＩＣ５０値は中央値５２．２７ｎＭ、平均値４５．８２ｎＭを示した。グループ［２］のＩＣ５０値は中央値６．６０５ｎＭ、平均値８．３０ｎＭを示した、図１０にから明らかなとおりＩＣ５０（ｎＭ）の値において、グループ［１］とグループ［２］の両群間に有意差（Ｐ＝０．００１）（マン－ホイットニーＵテストによる）が確認された。これらの結果から、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児が属する１次関数［１］に属する乳児におけるＩｇＥは抗原に対する低親和性を特徴とし、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児のデータに適用される１次関数［２］に属する乳児におけるＩｇＥは抗原に対する高親和性を特徴とすることが判明し、アレルギーの発症リスクを予測する上で、抗原親和性を示すＩＣ５０値の測定が重要な指標として用いることができることが確認された。
グループ［１］のＩＣ５０値は中央値５２．２７ｎＭ、平均値４５．８２ｎＭを示した。グループ［２］のＩＣ５０値は中央値６．６０５ｎＭ、平均値８．３０ｎＭを示した、図１０にから明らかなとおりＩＣ５０（ｎＭ）の値において、グループ［１］とグループ［２］の両群間に有意差（Ｐ＝０．００１）（マン－ホイットニーＵテストによる）が確認された。これらの結果から、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが低い乳児が属する１次関数［１］に属する乳児におけるＩｇＥは抗原に対する低親和性を特徴とし、アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクが高い乳児のデータに適用される１次関数［２］に属する乳児におけるＩｇＥは抗原に対する高親和性を特徴とすることが判明し、アレルギーの発症リスクを予測する上で、抗原親和性を示すＩＣ５０値の測定が重要な指標として用いることができることが確認された。
【0092】
（まとめ）
以上の結果から、一次関数１に属するＩｇＥは抗原ＯＶＡに対して低親和性を示すことを特徴とし、一次関数２に属するＩｇＥは抗原ＯＶＡに対して高親和性を示すことを特徴とすることが判明し、アレルゲンに対して低親和性を示すＩｇＥを含む乳児は、アレルギーの発症リスクが低く、高親和性を示すＩｇＥを含む乳児は、卵のアレルギーの発症リスクが高いと判定でき、アレルギーの発症リスクを予測する上で、親和性を示すＩＣ５０値の測定が重要な指標となることを確認した。
以上の結果から、一次関数１に属するＩｇＥは抗原ＯＶＡに対して低親和性を示すことを特徴とし、一次関数２に属するＩｇＥは抗原ＯＶＡに対して高親和性を示すことを特徴とすることが判明し、アレルゲンに対して低親和性を示すＩｇＥを含む乳児は、アレルギーの発症リスクが低く、高親和性を示すＩｇＥを含む乳児は、卵のアレルギーの発症リスクが高いと判定でき、アレルギーの発症リスクを予測する上で、親和性を示すＩＣ５０値の測定が重要な指標となることを確認した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
