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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-22
(45)【発行日】2022-05-17
(54)【発明の名称】組換えＤｓｂＣを発現する細菌宿主系統
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20220425BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220425BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220425BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220425BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20220425BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220425BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N1/21
C12N15/70 Z
C12P21/08
【請求項の数】
12
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2019200029
(22)【出願日】2019-11-01
(62)【分割の表示】P 2017209932の分割
【原出願日】2012-07-13
(65)【公開番号】P2020028299
(43)【公開日】2020-02-27
【審査請求日】2019-11-29
(31)【優先権主張番号】11173880.3
(32)【優先日】2011-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】507073918
【氏名又は名称】ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】100140109
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 新次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100120112
【氏名又は名称】中西 基晴
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】エリス、マーク
(72)【発明者】
【氏名】ハンフリーズ、デイビッド ポール
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】特許第６４３１３７０（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】国際公開第２０１１／０３６４５４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５２１９６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５３０４１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５３７２６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００３／０４８２０８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特許第５９６０６０８（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特許第５９６０６０７（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特許第５８９６５６９（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】GEORGIOU, G. and SEGATORI, L.，Curr. Opin. Biotechnol.，2005年，Vol.16，pp.538-545
【文献】KOLAJ, O. et al.，Microb. Cell Fact.，2009年，Vol.8，Art. No.9(pp.1-17)
【文献】ARAMINI, J.M. et al.，Biochemistry，2008年，Vol.47，pp.9715-9717
【文献】POLGAR, L.，Cell. Mol. Life Sci.，2005年，Vol.62，pp.2161-2172
【文献】BACHMANN, B.J.，Bacteriol. Rev.，1972年，Vol.36, No.4，pp.525-557
【文献】CHEN, C. et al.，Biotechnol. Bioeng.，2004年，Vol.85, No.5，pp.463-474
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であって；ａ）ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である、変異Ｔｓｐ遺伝子、
ｂ）アミノ酸Ｃ９４にミスセンス変異を有する、ｓｐｒ遺伝子、並びに
ｃ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド、及び
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド
を含む発現ベクター、
を含み；
ここで細胞が、上記変異Ｔｓｐ及びｓｐｒ遺伝子以外は、大腸菌Ｗ３１１０に対して同質遺伝子的であるゲノムを有し；そして
抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＣＤＲＨ１として配列番号１、ＣＤＲＨ２として配列番号２及びＣＤＲＨ３として配列番号３で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン並びにＣＤＲＬ１として配列番号４、ＣＤＲＬ２として配列番号５及びＣＤＲＬ３として配列番号６で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む可変ドメイン軽鎖を含む、
上記細胞。
【請求項2】
ＤｓｂＣがＮ末端又はＣ末端でヒスチジンタグを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項3】
発現ベクターが配列番号４５又は配列番号５１で与えられる配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項4】
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドが、配列番号８で与えられる軽鎖可変領域配列及び配列番号１０で与えられる重鎖可変領域を含む抗体をコードする、請求項１から３までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項5】
抗体がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項6】
前記Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントが、配列番号１２で与えられる配列を有する軽鎖及び配列番号１４又は１６で与えられる配列を有する重鎖を含む、請求項５に記載の細胞。
【請求項7】
変化したｓｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド内の変異により、９４位でアミノ酸システインからアラニンへの変化（Ｃ９４Ａ）が生じている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項8】
発現ベクターが、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するためのジシストロン性メッセージを含み、上流シストロンが前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含有し、下流シストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含有し、ジシストロン性メッセージがＩＧＳ１（配列番号３３）、ＩＧＳ２（配列番号３４）、ＩＧＳ３（配列番号３５）及びＩＧＳ４（配列番号３６）から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項9】
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するための方法であって、ａ）請求項１から８までのいずれか一項に記載の組換え大腸菌細胞を培養培地中、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに効果的な条件下で培養するステップと、
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを、組換え大腸菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップと
を含む上記方法。
【請求項10】
前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端終端の又は近くのアミノ酸に、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、ポリマー、核酸、放射性核種、及びレポーターグループからなる群から選択されるエフェクター分子を結合させるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
エフェクター分子がポリ（エチレングリコール）又はメトキシポリ（エチレングリコール）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記方法が、前記重鎖のＣ末端終端のシステイン残基のうちの１つに、リシル－マレイミド基を結合させるステップを含み、リシル残基のそれぞれのアミノ基が２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を共有結合させている、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換え細菌宿主系統、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関する。本発明は、このような細胞中で対象のタンパク質を生成するための方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
大腸菌などの細菌細胞は、グリコシル化を必要としない組換えタンパク質を生成するために一般的に用いられる。特に、プラスミドによって遺伝子の挿入を可能にする宿主細胞として細菌細胞が多用途であるという性質のため、組換えタンパク質を生成するのに大腸菌などの細菌細胞を用いると有利な点が多い。大腸菌は、ヒトインスリンを含めた多くの組換えタンパク質を生成するのに用いられている。
【0003】
細菌細胞を使用して組換えタンパク質を生成するのには多くの利点があるが、それでも不十分な細胞の健康状態の表現型を含む重大な限界が存在する。
【0004】
したがって、組換えタンパク質を生成するための有利な手段を提供する新しい細菌系統を提供する必要性がまだ存在する。
【0005】
体液性及び細胞性免疫の発生は、活性化されたヘルパーＴ細胞と抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）及びエフェクターＴ細胞との相互作用により組織化される。ヘルパーＴ細胞の活性化は、抗原特異的Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）とその同族ペプチドＭＨＣリガンドとの相互作用に依存するだけではなく、いくつかの細胞接着同時刺激分子による同調的結合及び活性化も必要とする。
【0006】
ＣＤ４０に結合する天然受容体はＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０－Ｌ＝ＣＤ１５４）、すなわち活性化依存性時間的制約性の形態でＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で発現される極めて重要な同時刺激分子である。ＣＤ１５４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット、好塩基球、マスト細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び血小板上でも、活性化後に発現される。ＣＤ４０は、Ｂ細胞及び他の抗原提示細胞を含む多くの細胞型の表面で構成的に広く発現される。
【0007】
ＣＤ１５４との会合後ＣＤ４０を通じたシグナル伝達は細胞事象のカスケードを開始し、ＣＤ４０受容体担持細胞の活性化及び最適ＣＤ４＋Ｔ細胞プライミングが生じる。さらに具体的には、ＣＤ１５４がＣＤ４０に結合することにより、Ｂ細胞の抗体分泌細胞及び記憶Ｂ細胞への分化が促進される。
【0008】
体液性と細胞性免疫応答の両方の機能を調節する際のＣＤ１５４の中心的役割により、治療的免疫調節のためにこの経路の阻害剤を使用することに対する大きな関心が引き起こされた。したがって、抗ＣＤ１５４抗体は、他の治療タンパク質又は遺伝子治療、アレルゲン、自己免疫及び移植に対する免疫応答の広範囲なモデルにおいて有益であることが明らかにされている（例えば、ＵＳ５，４７４，７７１号及びＷＯ２００８／１１８３５６を参照されたい。前記特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる）。
【0009】
治療的適用に適したＣＤ４０とＣＤ１５４の相互作用に干渉する大量の抗体又は抗体フラグメントを効率的に及びコスト効率よく生成する必要性が当技術分野には存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、
ａ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド、及び
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド
を含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
ａ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド、及び
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド
を含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【0011】
さらに具体的には、本発明は、
ａ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、
ｂ）野生型細胞と比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有し、
ｃ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを有する
ことを特徴とする、組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
ａ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、
ｂ）野生型細胞と比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有し、
ｃ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを有する
ことを特徴とする、組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【0012】
一実施形態では、前記細胞は、例えば、低減活性Ｔｓｐ表現型を抑制することができる野生型ｓｐｒ遺伝子又は変異ｓｐｒ遺伝子を含む。
【0013】
本発明のグラム陰性細菌細胞は、有利な増殖及びタンパク質生成表現型を示す。
【0014】
さらに具体的には、本発明は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）－タグを含み、好ましくは配列ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ（６×ヒスチジン）を含むＤｓｂＣポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【0015】
さらに具体的には、本発明は、配列番号４５又は配列番号５１に従った配列を有するポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチドを含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【0016】
本発明は、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。
【0017】
さらに具体的には、本発明は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）－タグを含み、好ましくは配列ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ－ｈｉｓ（６×ヒスチジン）を含むＤｓｂＣポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【0018】
さらに具体的には、本発明は、配列番号４５又は配列番号５１に従った配列を有するポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【0019】
本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するための方法であって、
ａ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに効果的な条件下で培養培地において上記に規定した組換えグラム陰性細菌細胞を培養するステップと、
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップと
を含む上記方法も提供する。
ａ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに効果的な条件下で培養培地において上記に規定した組換えグラム陰性細菌細胞を培養するステップと、
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップと
を含む上記方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本発明の一実施形態による細胞を生成するのに用いるためのベクターの構成を示す図である。
【図2】システイン残基を介してリシル－マレイミドリンカーに共有結合している修飾Ｆａｂ’フラグメントを含む化合物であって、リシル残基上のそれぞれのアミノ基にはメトキシＰＥＧ残基が共有結合しており、ｎは約４２０～４５０である前記化合物の構造を示す図である。
【図3】抗ＣＤ１５４ Ｆａｂ’発現系統であるＷ３１１０の増殖プロファイル及び抗ＣＤ１５４ Ｆａｂ’と組換えＤｓｂＣ発現系統であるＭＸＥ０１６の増殖プロファイルを示す図である（Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）。組換えＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６系統は、Ｗ３１１０系統と比べて最初のバッチ相において改善された増殖プロファイル及び増殖速度を示していることが分かる。
【図4】コントロール系統Ｗ３１１０と比べた組換えＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６系統由来のペリプラズム（黒記号）及び上清（白記号）からの全Ｆａｂ’収率（ｇ／Ｌ）を示す図である。ＤｓｂＣ発現系統は、Ｗ３１１０と比べて高いペリプラズムＦａｂ’発現を示している。さらに、ＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６系統は、Ｗ３１１０系統と比べて同等の細胞外Ｆａｂ’レベルを示している。
【図5】発酵抽出物の逆相ＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。抗ＣＤ１５４ Ｆａｂ’を発現している野生型Ｗ３１１０系統は、高レベルの分解カッパ軽鎖（軽鎖［ＬＣ］フラグメント）を示している。これとは対照的に、組換えＤｓｂＣ及び抗ＣＤ１５４ Ｆａｂ’を発現しているＭＸＥ０１６（Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）系統は、Ｔｓｐプロテアーゼ活性の欠如のせいでほとんどどんな軽鎖フラグメントも示していない。
【図6】Ｗ３１１０系統における及び組換えＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６（Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）系統における発酵からの抗ＣＤ１５４ Ｆａｂ’（ｇ／Ｌ）の収穫を示す図である。組換えＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６（Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）系統からの収穫のほうが実質的に高く、細胞外Ｆａｂ’は細胞溶解リスクのマーカーであり細胞外ＦａｂはペリプラズムＦａｂ’のために使用されるのと同じ工程を使用しては簡単には回収されないので有益である実質的に少ない細胞外Ｆａｂ’を示している。
【図7】抗ＣＤ１５４ Ｆａｂ’（ｇ／Ｌ）を発現している（ａ）と（ｂ）の両方の場合の（ａ）Ｗ３１１０細胞系統及び（ｂ）組換えＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６（Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）細胞系統の生存率を示す図である。組換えＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６細胞（Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）系統のほうが高い生存率を示している。
【図8】抗ＣＤ１５４ Ｆａｂ’を発現しているＭＸＥ０１６系統の発酵からの全Ｆａｂ’収率（ｇ／Ｌ）を示す図である。右の棒グラフはさらに組換えＤｓｂＣを発現しているＭＸＥ０１６系統を表している。組換えＤｓｂＣ系統を発現しているＭＸＥ０１６系統のほうが高い収率を示している。
【図9】変異を受けたｐｔｒ遺伝子内の領域のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す図である。
【図10】変異を受けたＴｓｐ遺伝子内の領域のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す図である。
【図11】変異を受けたＤｅｇＰ遺伝子内の領域のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す図である。
【0021】
配列の簡単な説明
【0022】
配列番号１は、抗ＣＤ１５４抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列を示す。
【0023】
配列番号２は、抗ＣＤ１５４抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列を示す。
【0024】
配列番号３は、抗ＣＤ１５４抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を示す。
【0025】
配列番号４は、抗ＣＤ１５４抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
【0026】
配列番号５は、抗ＣＤ１５４抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列を示す。
【0027】
配列番号６は、抗ＣＤ１５４抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を示す。
【0028】
配列番号は７、抗ＣＤ１５４抗体（３４２）の可変軽鎖（ｇＬ４）のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0029】
配列番号８は、抗ＣＤ１５４抗体（３４２）の可変軽鎖（ｇＬ４）のアミノ酸配列を示す。
【0030】
配列番号９は、抗ＣＤ１５４抗体（３４２）の可変重鎖（ｇＨ１）のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0031】
配列番号１０は、抗ＣＤ１５４抗体（３４２）の可変重鎖（ｇＨ１）のアミノ酸配列を示す。
【0032】
配列番号１１は、抗ＣＤ１５４抗体フラグメントの軽鎖（ｇＬ４）の可変及び定常領域を含むポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0033】
配列番号１２は、抗ＣＤ１５４抗体フラグメントの軽鎖（ｇＬ４）の可変及び定常領域を含むアミノ酸配列を示す。
【0034】
配列番号１３は、ヒンジ領域に欠失のある可変及びＣＨ１領域を含む抗ＣＤ１５４抗体の重鎖フラグメントのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0035】
配列番号１４は、ヒンジ領域に欠失のある可変及びＣＨ１領域を含む抗ＣＤ１５４抗体の重鎖フラグメントのアミノ酸配列を示す。
【0036】
配列番号１５は、可変、ＣＨ１及びヒンジ領域を含む抗ＣＤ１５４抗体の重鎖フラグメントのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0037】
配列番号１６は、可変、ＣＨ１及びヒンジ領域を含む抗ＣＤ１５４抗体の重鎖フラグメントのアミノ酸配列を示す。
【0038】
配列番号１７は、シグナルペプチド（アミノ酸１～２２）を含む抗ＣＤ１５４抗体（３４２）のカッパ軽鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0039】
配列番号１８は、シグナルペプチド（アミノ酸１～２２）を含む抗ＣＤ１５４抗体（３４２）のカッパ軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【0040】
配列番号１９は、アグリコシル化ＩｇＧ４抗ＣＤ１５４抗体の全重鎖のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0041】
配列番号２０は、アグリコシル化ＩｇＧ４抗ＣＤ１５４抗体の全重鎖のアミノ酸配列を示す。
【0042】
配列番号２１は、ｇＬ４及びｇＨ１をコードするポリヌクレオチド配列を示す（ヒンジなし）。
【0043】
配列番号２２は、ｇＬ４及びｇＨ１をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【0044】
配列番号２３は、野生型大腸菌ｓｐｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８６６１０）のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0045】
配列番号２４は、野生型大腸菌ｓｐｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８６６１０）のアミノ酸配列を示す。
【0046】
配列番号２５は、シグナル配列を有する野生型大腸菌Ｔｓｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７５６３４）のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0047】
配列番号２６は、シグナルペプチドを有する野生型大腸菌Ｔｓｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７５６３４）のアミノ酸配列を示す。
【0048】
配列番号２７は、野生型大腸菌ＤｓｂＣ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ配列ＡＰ＿００３４５２）のアミノ酸配列を示す。
【0049】
配列番号２８は、ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子のポリヌクレオチド配列を示す。
【0050】
配列番号２９は、野生型大腸菌ＤｅｇＰのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0051】
配列番号３０は、野生型大腸菌ＤｅｇＰのアミノ酸配列を示す。
【0052】
配列番号３１は、点変異Ｓ２１０Ａ及びＡｓｅＩ制限マーカーを含むＤｅｇＰのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0053】
配列番号３２は、点変異Ｓ２１０Ａ及びＡｓｅＩ制限マーカーを含むＤｅｇＰのアミノ酸配列を示す。
【0054】
配列番号３３から３６は、それぞれジシストロン性遺伝子間配列（ＩＧＳ）ＩＧＳ１、ＩＧＳ２、ＩＧＳ３及びＩＧＳ４を示す。
【0055】
配列番号３７は、野生型大腸菌ＯｍｐＴのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0056】
配列番号３８は、野生型大腸菌ＯｍｐＴのアミノ酸配列を示す。
【0057】
配列番号３９は、ノックアウト変異大腸菌ＯｍｐＴのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0058】
配列番号４０は、ノックアウト変異大腸菌ＯｍｐＴのアミノ酸配列を示す。
【0059】
配列番号４１は、点変異Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａを含む変異大腸菌ＯｍｐＴのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0060】
配列番号４２は、点変異Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａを含む大腸菌ＯｍｐＴのアミノ酸配列を示す。
【0061】
配列番号４３は、野生型大腸菌ＤｓｂＣのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0062】
配列番号４４は、野生型大腸菌ＤｓｂＣのアミノ酸配列を示す。
【0063】
配列番号４５は、ＥｃｏＲＩ制限部位を欠きＨｉｓタグを有する大腸菌ＤｓｂＣのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0064】
配列番号４６は、ＥｃｏＲＩ制限部位を欠きＨｉｓタグを有する大腸菌ＤｓｂＣのアミノ酸配列を示す。
【0065】
配列番号４７は、プライマー６２８３Ｔｓｐ３’のポリヌクレオチド配列を示す。
【0066】
配列番号４８は、プライマー６２８３Ｔｓｐ５’のポリヌクレオチド配列を示す。
【0067】
配列番号４９は、野生型大腸菌ｐｔｒのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０６２２７に従ってプロテアーゼＩＩＩ）。
【0068】
配列番号５０は、野生型大腸菌ｐｔｒのアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０６２２７に従ってプロテアーゼＩＩＩ）。
【0069】
配列番号５１は、Ｈｉｓタグを有する野生型大腸菌ＤｓｂＣのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【0070】
配列番号５２は、Ｈｉｓタグを有する野生型大腸菌ＤｓｂＣのアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【0071】
Ｔｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）は、６０ｋＤａのペリプラズムプロテアーゼである。Ｔｓｐの最初に知られた基質はペニシリン結合性タンパク質－３（ＰＢＰ３）であったが（「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」（Ｈａｒａら、４７９９～８１３頁、Ｎａｇａｓａｗａら、５８９０～９３頁）、Ｔｓｐはファージテイルタンパク質を切断することもできることが後に発見され、したがってテイル特異的プロテアーゼ（Ｔａｉｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）（Ｔｓｐ）と新たに命名され（Ｓｉｌｂｅｒ、Ｋｅｉｌｅｒ、及びＳａｕｅｒ、２９５～９９頁、Ｓｉｌｂｅｒ及びＳａｕｅｒ、２３７～４０頁）、ｐｒｃ遺伝子のセグメントをＫａｎｒマーカーを含むフラグメントで置換することによって変異が作り出されたｐｒｃの欠失系統（ＫＳ１０００）について記載している。
【0072】
Ｔｓｐ（ｐｒｃ）活性を低減することは、対象のタンパク質のタンパク質分解を低減するのに望ましい。Ｆａｂタンパク質分解は、軽鎖不純物と呼ぶことができるフラグメントなどの不純物の存在として現れることがある。
【0073】
しかし、プロテアーゼｐｒｃを欠く細胞は、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖を示すことが見出された。Ｈａｒａらは、遺伝子外サプレッサー（ｓｐｒ）変異を含む熱耐性復帰変異体を単離した（Ｈａｒａら、６３～７２頁）。ｓｐｒは、１８ｋＤａの膜結合ペリプラズムプロテアーゼであり、ｓｐｒの基質は細胞分裂の間細胞壁の加水分解に関与する外膜におけるＴｓｐ及びペプチドグリカンである。ｓｐｒ遺伝子は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｐ０ＡＦＶ４（ＳＰＲ＿ＥＣＯＬＩ）と呼ばれている。
【0074】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、タンパク質がフォールディングするときのタンパク質内のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成及び切断を触媒する酵素である。宿主細胞中でタンパク質の発現を改善するジスルフィド結合の形成を触媒するタンパク質を同時発現することが知られている。ＷＯ９８／５６９３０は細菌細胞中で異種性のジスルフィド結合含有ポリペプチドを生成するための方法を開示しており、ＤｓｂＣ又はＤｓｂＧなどの原核生物のジスルフィドイソメラーゼが真核生物のポリペプチドと同時発現される。ＵＳ６，６７３，５６９は、外来タンパク質を生成するのに用いるためのＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤの各々をコードするポリヌクレオチドを含む人工オペロンを開示している。ＥＰ０７８６００９は、細菌において異種性のポリペプチドを生成するためのプロセスを開示しており、ＤｓｂＡ又はＤｓｂＣをコードする核酸の発現は、異種性のポリペプチドをコードする核酸の発現の誘導の前に誘発される。
【0075】
ＤｓｂＣは、大腸菌におけるジスルフィド結合の形成を触媒する大腸菌のペリプラズムにおいて見出された原核生物のタンパク質である。ＤｓｂＣは、２３６個（シグナルペプチドを含む）の長さのアミノ酸配列、及び分子量２５．６ＫＤａを有する（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．ｐ０ＡＥＧ６）。ＤｓｂＣは、１９９４年に始めて同定された（Ｍｉｓｓｉａｋａｓ、Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ、及びＲａｉｎａ、２０１３～２０頁、Ｓｈｅｖｃｈｉｋ、Ｃｏｎｄｅｍｉｎｅ、及びＲｏｂｅｒｔ－Ｂａｕｄｏｕｙ、２００７～１２頁）。
【0076】
驚くべきことに、グラム陰性細菌細胞におけるＤｓｂＣの過剰発現は、プロテアーゼＴｓｐを欠く細胞の培養中の溶解を低減することが見出されている。したがって、本発明者らは、対象のタンパク質を生成するための有利な性質を有する新規な系統を提供する。
【0077】
遺伝子修飾の上記の特異的な組合せを有するグラム陰性細菌細胞は、有利な増殖及びタンパク質生成の表現型を示す。
【0078】
一実施形態では、細胞のゲノムは、野生型細胞と比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要な修飾を除いて、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子的であることが好ましい。
【0079】
さらなる実施形態では、本発明の細胞は、野生型細胞と比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有しており、ＤｓｂＣ及び変化したｓｐｒタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む。この実施形態では、細胞のゲノムは、変異ｓｐｒ遺伝子及び野生型細胞と比べてＴｓｐタンパク質の発現の低減又は非存在をもたらす修飾を除いて、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子的であることが好ましい。
【0080】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は、文脈上別段の記載がなければ、本明細書において交換可能に用いられる。「ペプチド」は２０個以下のアミノ酸を意味するものとされる。
【0081】
「ポリヌクレオチド」の語は、文脈上別段の記載がなければ、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ並びにロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）等を含むがこれらに限定されないその類似物を含む。
【0082】
本明細書で用いられる「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語は、本明細書の文脈において「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されたい。
【0083】
本発明の文脈における非変異細胞又はコントロール細胞は、本発明の組換えグラム陰性細胞と同じ型の細胞であって、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを担持するように修飾されていない上記細胞を意味する。例えば、非変異細胞は野生型細胞であってよく、あらゆる組換えポリヌクレオチド（単数又は複数）を導入する修飾の前の本発明の細胞と同じ宿主細胞の集団に由来してよい。
【0084】
「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び「系統」の表現は交換可能に用いられる。
【0085】
「同質遺伝子的」の語は、本発明の文脈において、本発明を特徴付けるその中に組み込まれたエレメント、例えば、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、及び任意選択によってＴｓｐタンパク質の発現の低減又は非存在をもたらす修飾、及び任意選択によって変異ｓｐｒ遺伝子を除いて、細胞が野生型細胞と比べて同じ又は実質的に同じ核酸配列（単数又は複数）を含むことを意味する。この実施形態では、本発明の細胞はこれ以上天然に存在しない又はそのゲノムに遺伝的に操作された変化を含まない。
【0086】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが細胞のゲノムに挿入されている一実施形態では、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチド、及び任意選択によってＴｓｐタンパク質の発現の低減若しくは非存在又はプロテアーゼ活性が低減しているＴｓｐタンパク質の発現をもたらす修飾、及び任意選択によって野生型と比べた場合活性が低減しているタンパク質をコードする変異ｓｐｒ遺伝子を除いて、本発明の細胞は、存在することがある任意の天然に存在する変異を考慮に入れて、野生型細胞と比べて実質的に同じゲノム配列を有していてもよい。一実施形態では、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチドが細胞のゲノムに挿入されているが、本発明の細胞は、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチドを除いて、野生型細胞と比べて全く同じゲノム配列を有していてもよい。
【0087】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドは、細胞中に形質転換され、及び／又は宿主細胞のゲノム中に組み入れられた適切な発現ベクター上に存在していてよい。ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムに挿入されている実施形態では、本発明の細胞はＤｓｂＣをコードする挿入されたポリヌクレオチドのせいで野生型細胞とは異なっている。この実施形態では、宿主細胞のゲノムは、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを除いて、野生型細胞ゲノムと比べて同質遺伝子的であってもよい。
【0088】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドが細胞中の発現ベクター中にあり、それによって宿主細胞のゲノムの最小のかく乱をもたらすのが好ましい。
【0089】
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、細胞内に形質転換される及び／又は宿主細胞のゲノム内に組み込まれる適切な発現ベクター内に含まれていてもよい。ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドが宿主ゲノム内に挿入されている実施形態では、本発明の細胞は抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする挿入されたポリヌクレオチド（単数又は複数）のせいで野生型細胞とは異なる。この実施形態では、宿主細胞のゲノムは、抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド（単数又は複数）を除いて、野生型細胞ゲノムと比べて同質遺伝子的であってもよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞中の発現ベクター中にあり、それによって宿主細胞のゲノムの最小のかく乱をもたらすのが好ましい。
【0090】
一実施形態では、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは宿主ゲノム内に挿入されている。この実施形態では、ＤｓｂＣをコードする挿入された組換えポリヌクレオチド及び抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、及び任意選択によってＴｓｐタンパク質の発現の低減若しくは非存在又はプロテアーゼ活性が低減しているＴｓｐタンパク質の発現をもたらす修飾、及び任意選択によって野生型と比べた場合活性が低減しているタンパク質をコードする変異ｓｐｒ遺伝子のせいで、本発明の細胞は野生型細胞とは異なっている。この実施形態では、宿主細胞のゲノムは、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを除いて、野生型細胞ゲノムと比べて同質遺伝子的であってもよい。
【0091】
好ましい実施形態では、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは細胞内の同じ又は異なる発現ベクター中に存在しており、それによって宿主細胞のゲノムの最小限の破壊を引き起こす。この実施形態では、細胞のゲノムは野生型細胞のゲノムと比べて実質的に同じでも全く同じでもよい。
【0092】
一実施形態では、Ｔｓｐ活性が低減しており任意選択によってｓｐｒ遺伝子又はその変異体を有し、前記Ｔｓｐ活性への修飾及び前記ｓｐｒ遺伝子におけるいかなる変異も細胞ゲノムの変化を通じてもたらされる組換え大腸菌細胞が提供される。この実施形態に従った細胞は、ベクターＤｓｂＣ及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその結合フラグメントをコードするプラスミドなどのベクターで形質転換されてもよい。一実施形態では、ベクター又はプラスミドは細胞のゲノム内に組み込まれない。
【0093】
「野生型」の語は、本発明の文脈において、天然に存在していてもよいし環境から単離されてもよいグラム陰性細菌細胞の系統であり、いかなる組換えポリヌクレオチド又は遺伝的に操作された変異も担持していない系統を意味する。大腸菌の野生型系統の例は、Ｋ－１２系統であり、その血統系統Ｗ３１１０大腸菌系統Ｋ－１２は現在で９０年間培養されてきた（Ｂａｃｈｍａｎｎ ５２５～５７頁）。大腸菌系統Ｋ－１２及びＷ３１１０などのその血統系統は当技術分野では周知である。Ｗ３１１０系統は例えば、カタログ番号２７３２５で米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能である。Ｗ３１１０は遺伝子型：Ｆ－、λ－、ＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１、ｒｐｈ－１を有する。
【0094】
本発明者らは、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを発現するのに適しており、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供してきた。
【0095】
本発明による細胞は、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる。本明細書で用いられる「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築又は生成されるタンパク質を意味する。ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドは、野生型細菌細胞中に見出されるＤｓｂＣをコードする内在性のポリヌクレオチドに同一であってよい。或いは、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドは、例えば、ＥｃｏＲＩ部位などの制限部位及び／又はｈｉｓタグがＤｓｂＣタンパク質から取り除かれるように変更されている野生型ＤｓｂＣポリヌクレオチドの変異バージョンである。本発明において使用するための例となる修飾ＤｓｂＣポリヌクレオチドは、配列番号４５に示されており、この配列は配列番号４６に示されるｈｉｓタグ付きＤｓｂＣ配列をコードしている。
【0096】
ＤｓｂＣは、アミノ酸－ＣＸＸＣ－（ＸＸはアミノ酸ＧＹを表す）を含む活性部位の存在により特徴付けられる。ＤｓｂＣのバリアントには、それぞれのＸが独立して選択されるアミノ酸を表す－ＣＸＸＣ－が含まれる（但し、ＸＸはＧＹを表さない）。ＸＸの例には、ＮＹ、ＳＦ、ＴＦ、ＭＦ、ＧＦ、ＨＨ、ＶＨ、ＳＨ、ＲＦ、ＦＡ、ＧＡ、ＭＡ、ＧＩ又はＡＶが含まれる。
【0097】
一実施形態では、本発明の宿主細胞は、例えば、特に上記のように活性部位が変更されているＤｓｂＣのバリアントを含む。
【0098】
一実施形態では、ＤｓｂＣのバリアントは、例えば、インビトロアッセイにおいて測定された場合、少なくとも野生型タンパク質の生物活性を有する。
【0099】
一実施形態では、ＤｓｂＣのバリアントは、例えば、インビトロアッセイにおいて測定された場合、野生型タンパク質よりも大きな生物活性を有する。
【0100】
一実施形態では、ＤｓｂＣのバリアントは、活性部位－ＣＸＸＣ－（ＸＸはＮＹ、ＳＦ、ＴＦ、ＭＦ、ＧＦ、ＨＨ、ＶＨ、ＳＨを表す）に変更を有する。
【0101】
一実施形態では、ＤｓｂＣは野生型である。
【0102】
本発明者らは、細菌細胞中でのＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドの発現の選択により、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを発現するための改善された宿主細胞が提供されることを確認していた。本発明により提供される細胞は、野生型細菌細胞と比べて細胞の健康状態及び増殖の改善された表現型を有する。
【0103】
本明細書で用いられる改善された細胞の健康状態は、本発明の特長を保有していない細胞と比べて１つ又は複数の改善された特性、例えば、増殖期での若しくは細胞中での異種タンパク質の発現の誘導後の細胞溶解のより低い傾向又は当業者には公知の他の有益な特性を指すことを意図している。
【0104】
本発明の細胞は、野生型細菌細胞と比べて、抗体又は抗体フラグメントなどの改善されたタンパク質生成収率を示す。改善されたタンパク質収率は、タンパク質生成速度であっても、及び／又は細胞からのタンパク質生成の期間であってもよい。改善されたタンパク質収率は、ペリプラズマのタンパク質収率でも、及び／又は上清のタンパク質収率でもよい。組換え細菌細胞は、抗体又はそのフラグメントなどのタンパク質の生成速度を速めることが可能であることがあり、したがって同じ量の対象のタンパク質が、非変異細菌細胞に比べてより短時間で生成され得る。対象のタンパク質の生成速度がより速いのは、細胞の増殖の最初の期間にわたって、例えば、タンパク質発現の誘導後最初の５時間、１０時間、２０時間、又は３０時間にわたって、特に著しいことがある。
【0105】
本発明による細胞が、ペリプラズム及び／又は培地において、抗体のおよそ１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、又は４．０ｇ／Ｌの、収率を発現するのが好ましい。
【0106】
有利なことに、低減したＴｓｐタンパク質活性及び／又はＤｓｂＣの同時発現により、本明細書では軽鎖フラグメント（ＬＣ）と呼ばれる望ましくない不純物の生成が低減する。例えば、図５を参照されたい。
【0107】
当業者であれば、発酵法、ＥＬＩＳＡ、及びタンパク質Ｇ ＨＰＬＣを含めた当技術分野においてよく知られている方法を用いて、それが望ましい収率の対象のタンパク質を有するか否かを見るために、候補の細胞クローンを試験することが容易にできる。適切な発酵法は、（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．１９３～２０２頁；Ｂａｃｋｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．３５８～６５頁）に記載されており、これらの文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。当業者であれば、タンパク質Ｇ ＨＰＬＣ、円偏光二色性、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析、及びエピトープ親和性測定方法など、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、タンパク質が正確にフォールディングされているか否かを見るために分泌されたタンパク質を試験することも容易にできる。
【0108】
一実施形態では、本発明の細胞は、例えば、大腸菌Ｗ３１１０ Ｋ－１２系統などの対応する野生型細胞と比べて、以下のような１つ又は複数のさらなるタンパク質も発現する又は過剰発現する：
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｉｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉｄ、並びに／或いは、
タンパク質の分泌若しくは翻訳を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに／或いは、
ジスルフィド結合の形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ。
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｉｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉｄ、並びに／或いは、
タンパク質の分泌若しくは翻訳を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに／或いは、
ジスルフィド結合の形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ。
【0109】
１つ又は複数の上記のタンパク質を、細胞のゲノム中に組み入れてもよく、且つ／又は発現ベクター中に挿入してもよい。
【0110】
一実施形態では、本発明の細胞は、以下のさらなるタンパク質のうちの１つ又は複数を発現しない又は、例えば、大腸菌Ｗ３１１０ Ｋ－１２系統などの対応する野生型細胞のレベルよりも少なくとも５０％、７５％又は９０％低いレベルで発現する：
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤ、
タンパク質の分泌又は翻訳を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに
ジスルフィド結合の形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ。
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤ、
タンパク質の分泌又は翻訳を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに
ジスルフィド結合の形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ。
【0111】
一実施形態では、本発明の細胞は、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ及びその組合せから選択される１つ又は複数のさらなるタンパク質も発現する。
【0112】
一実施形態では、前記細胞は、以下の変異遺伝子、
ａ）変異ｓｐｒ遺伝子、
ｂ）低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である変異Ｔｓｐ遺伝子、
ｃ）シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、
ｄ）低減したプロテアーゼ活性を有するプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である変異ｐｔｒ遺伝子、及び
ｅ）例えば、配列番号４２に示される低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又は、例えば、配列番号４０に示されるノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である変異ＯｍｐＴ遺伝子
のうちの１つ又は複数をさらに含む。
ａ）変異ｓｐｒ遺伝子、
ｂ）低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である変異Ｔｓｐ遺伝子、
ｃ）シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、
ｄ）低減したプロテアーゼ活性を有するプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である変異ｐｔｒ遺伝子、及び
ｅ）例えば、配列番号４２に示される低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又は、例えば、配列番号４０に示されるノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である変異ＯｍｐＴ遺伝子
のうちの１つ又は複数をさらに含む。
【0113】
本発明の基本的実施形態では、グラム陰性細菌細胞は、染色体Ｔｓｐが欠損しているなどのノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を担持していない。
【0114】
後者の変異は、Ｔｓｐプロテアーゼ活性がエルボー領域において抗体産物を切断し、それによって副産物をかなりの量で生成し目的の産物の収率を低減させ得るので、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体及びそのフラグメントの生成には特に重要である。
【0115】
したがって、一実施形態では、本発明の細胞は、変異Ｔｓｐ遺伝子であって、低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子であり、ＣＤ１５４に特異的な抗体又はフラグメントに加えてＤｓｂＣタンパク質もコードする上記遺伝子を含む。
【0116】
本発明の実施形態において、細胞は変異ｓｐｒ遺伝子をさらに含んでいる。ｓｐｒタンパク質は、大腸菌膜結合ペリプラズムプロテアーゼである。
【0117】
Ｓｐｒタンパク質の野生型アミノ酸配列を、Ｎ末端にシグナル配列を有する配列番号２４において示す（ＵｎｉＰｒｏｔ受諾番号Ｐ０ＡＦＶ４によるアミノ酸１～２６）。本発明におけるＳｐｒタンパク質配列のアミノ酸番号付けはシグナル配列を含んでいる。したがって、Ｓｐｒタンパク質のアミノ酸１は、配列番号２４に示す最初のアミノ酸（Ｍｅｔ）である。
【0118】
本発明による細胞が変異ｓｐｒ遺伝子を含んでいる実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子が細胞の染色体ｓｐｒ遺伝子であるのが好ましい。変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞に関連する不利な表現型を抑制することができるＳｐｒタンパク質をコードしている。変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞は、良好な細胞増殖速度を有し得るが、これらの細胞の一つの制限は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向があることである。したがって、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向がある。
【0119】
変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞は、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖を示す。しかし、本発明の細胞が有するｓｐｒ変異は、低減したＴｓｐ活性を有する細胞中に導入した場合、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖のこの表現型を抑制し、したがって、細胞は、特に高い細胞密度で溶解の低減を表す。この細胞の「熱感受性の増殖」の表現型は、当業者であれば、フラスコ振盪又は高い細胞密度の発酵技術の間に容易に測定することができる。細胞溶解の抑制は、特にペリプラズムにおいて増殖速度の改善及び／又は組換えタンパク質の生成から見られ、Ｔｓｐ変異体及び野生型ｓｐｒを有する細胞に比べて、ｓｐｒ変異体を有し、低減したＴｓｐ活性を有する細胞によって示される。
【0120】
本発明による細胞は、好ましくはＮ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、Ｈ１４５、Ｇ１４７、Ｈ１５７、及びＷ１７４から選択される１つ又は複数のアミノ酸、より好ましくはＣ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、Ｈ１５７、及びＷ１７４から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変化を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる。好ましくは、変異体ｓｐｒ遺伝子は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸、より好ましくはＣ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変化を有するｓｐｒタンパク質をコードしている。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなるアミノ酸変化もないのが好ましい。好ましくは、変異体のｓｐｒ遺伝子は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に、より好ましくはＳ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変化を有するｓｐｒタンパク質をコードする。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなるアミノ酸変化もないのが好ましい。
【0121】
本発明者らは、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の増殖の表現型を抑制することができるｓｐｒ変化を同定している。
【0122】
本発明者らはまた、驚くべきことに、組換えＤｓｂＣ遺伝子、変異ｓｐｒ遺伝子を有し、野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有する細胞は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞に比べて増大した細胞増殖速度、及び増大した細胞生存期間を示すことも見出した。特に、組換えＤｓｂＣ遺伝子、ｓｐｒタンパク質の変化を有し、低減したＴｓｐタンパク質活性を有する細胞は、培養中に変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞に比べて低減した細胞溶解を示す。
【0123】
上記のｓｐｒアミノ酸の１つ又は複数の変化は、アミノ酸をコードするヌクレオチドの１個、２個、又は３個に対するあらゆる適切なミスセンス変異の結果であってよい。変異は、アミノ酸残基を、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができる変異ｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸へ変化させる。ミスセンス変異は、アミノ酸を、野生型アミノ酸に比べて異なるサイズであり、且つ／又は異なる化学性質を有するアミノ酸へ変化させることができる。
【0124】
一実施形態において、変化は、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７のアミノ酸残基の触媒三残基の１つ、２つ、又は３つに対するものである（Ａｒａｍｉｎｉら、９７１５～１７頁）。
【0125】
したがって、変異ｓｐｒ遺伝子は、
アミノ酸Ｃ９４に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｈ１４５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｈ１５７に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｃ９４及びＨ１４５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｃ９４及びＨ１５７に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｈ１４５及びＨ１５７に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７に影響を与える変異
を含んでいてよい。
アミノ酸Ｃ９４に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｈ１４５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｈ１５７に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｃ９４及びＨ１４５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｃ９４及びＨ１５７に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｈ１４５及びＨ１５７に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７に影響を与える変異
を含んでいてよい。
【0126】
この実施形態において、ｓｐｒタンパク質がいかなるさらなるアミノ酸変化も有さないのが好ましい。
【0127】
Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つが、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変化されてよい。例えば、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つは、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変化されてよい。したがって、ｓｐｒタンパク質は、Ｃ９４Ａ（すなわち、９４位のシステインはアラニンに変化する）、Ｈ１４５Ａ（すなわち、１４５位のヒスチジンはアラニンに変化する）及びＨ１５７Ａ（すなわち、１５７位のヒスチジンはアラニンに変化する）を生じる変異のうちの１つ、２つ又は３つを有し得る。ｓｐｒ遺伝子が、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質を生成することが見出されているＨ１４５Ａに導くミスセンス変異を含んでいるのが好ましい。
【0128】
本明細書の置換変異体に対する呼称は、１つの文字とそれに続く１つの数字とそれに続く１つの文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字はアミノ酸置換が行われるアミノ酸位置を表し、２番目の文字は野生型アミノ酸を置換するのに用いられるアミノ酸を指定する。
【0129】
好ましい一実施形態において、変異体のｓｐｒタンパク質は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変化、好ましくはＳ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変化を含んでいる。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質がいかなるさらなる変異を有さないのが好ましい。したがって、変異ｓｐｒ遺伝子は、
アミノ酸Ｎ３１に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｒ６２に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｉ７０に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｑ７３に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ９５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｖ９８に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｑ９９に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｒ１００に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｌ１０８に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｙ１１５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｄ１３３に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｖ１３５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｌ１３６に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｇ１４０に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｒ１４４に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｇ１４７に影響を与える変異
を含んでいてよい。
アミノ酸Ｎ３１に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｒ６２に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｉ７０に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｑ７３に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ９５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｖ９８に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｑ９９に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｒ１００に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｌ１０８に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｙ１１５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｄ１３３に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｖ１３５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｌ１３６に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｇ１４０に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｒ１４４に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｇ１４７に影響を与える変異
を含んでいてよい。
【0130】
一実施形態において、変異体ｓｐｒ遺伝子は、アミノ酸：
Ｓ９５及びＹ１１５、又は
Ｎ３１、Ｑ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｑ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｑ７３及びＧ１４０、又は
Ｑ７３及びＲ１００、又は
Ｒ６２、Ｑ９９及びＲ１４４、又は
Ｑ９９及びＲ１４４
に影響を与える複数の変異を含んでいる。
Ｓ９５及びＹ１１５、又は
Ｎ３１、Ｑ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｑ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｑ７３及びＧ１４０、又は
Ｑ７３及びＲ１００、又は
Ｒ６２、Ｑ９９及びＲ１４４、又は
Ｑ９９及びＲ１４４
に影響を与える複数の変異を含んでいる。
【0131】
Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７の１つ又は複数のアミノ酸は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変化されてよい。例えば、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、及びＲ１４４の１つ又は複数は、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変化されてよい。
【0132】
好ましい一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、１つ又は複数の以下の変化を含んでいる：Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、及びＧ１４７Ｃ。ｓｐｒタンパク質が１つ又は複数の以下の変化を含んでいるのが好ましい：Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、及びＧ１４７Ｃ。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなるアミノ酸変化もないのが好ましい。
【0133】
一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｃ９４Ａ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、及びＧ１４７Ｃ、特にＣ９４Ａから選択されるアミノ酸変化を１つのみ有する。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなるアミノ酸変化もないのが好ましい。
【0134】
さらなる一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、以下から選択される複数の変化を有する：
Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ
Ｎ３１Ｙ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、
Ｒ１００Ｇ及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ及びＲ１００Ｇ、
Ｒ６２Ｃ、Ｑ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ、又は
Ｑ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ。
Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ
Ｎ３１Ｙ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、
Ｒ１００Ｇ及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ及びＲ１００Ｇ、
Ｒ６２Ｃ、Ｑ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ、又は
Ｑ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ。
【0135】
変異体のｓｐｒ遺伝子が、Ｃ９４Ａ、Ｄ１３３Ａ、Ｈ１４５Ａ、及びＨ１５７Ａ、特にＣ９４Ａから選択されるアミノ酸変化を有するｓｐｒタンパク質をコードするのが好ましい。
【0136】
さらなる一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子はアミノ酸変化Ｗ１７４Ｒを有するｓｐｒタンパク質をコードする。代替の一実施形態において、ｓｐｒタンパク質はアミノ酸変化Ｗ１７４Ｒを有さない。
【0137】
本発明による細胞は、野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有する。「野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性」の表現は、細胞のＴｓｐ活性が野生型細胞のＴｓｐ活性に比べて低減していることを意味する。細胞を、Ｔｓｐの活性を低減するのに適するあらゆる手段によって修飾することができる。
【0138】
一実施形態において、低減したＴｓｐ活性は、Ｔｓｐ及び／又は関連の調節性の発現配列をコードする内因性ポリヌクレオチドの修飾による。修飾は、Ｔｓｐ遺伝子の転写及び翻訳を低減又は停止することができ、或いは野生型Ｔｓｐタンパク質に比べて低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質の発現を提供することができる。
【0139】
一実施形態において、関連の調節性の発現配列を、Ｔｓｐ発現を低減するように修飾する。例えば、Ｔｓｐ遺伝子に対するプロモーターを遺伝子の発現を防止するように変異させてもよい。
【0140】
好ましい一実施形態において、本発明による細胞は、低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を有している。染色体のＴｓｐ遺伝子が変異しているのが好ましい。
【0141】
本明細書で用いられる「Ｔｓｐ遺伝子」は、ペニシリン結合性タンパク質－３（ＰＢＰ３）及びファージテイルタンパク質に対して作用することができるペリプラズムプロテアーゼであるプロテアーゼＴｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）をコードする遺伝子を意味する。野生型Ｔｓｐ遺伝子の配列を配列番号２５に示し、野生型Ｔｓｐタンパク質の配列を配列番号２６に示す。
【0142】
変異Ｔｓｐ遺伝子、又はＴｓｐをコードする変異Ｔｓｐ遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子のいずれかを意味する。
【0143】
「低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、変異Ｔｓｐ遺伝子が野生型の非変異Ｔｓｐ遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。
【0144】
変異Ｔｓｐ遺伝子が、野生型の非変異Ｔｓｐタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＴｓｐタンパク質をコードするのが好ましい。変異Ｔｓｐ遺伝子が、プロテアーゼ活性を有さないＴｓｐタンパク質をコードするのがより好ましい。この実施形態において、細胞は染色体Ｔｓｐを欠くのではなく、すなわち、Ｔｓｐ遺伝子配列はあらゆる形態のＴｓｐタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【0145】
低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＴｓｐ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＴｓｐタンパク質のプロテアーゼ活性は、Ｋｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｅｉｌｅｒ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ ２８８６４～６８頁）に記載されている方法などの当技術分野において適切な任意の方法により当業者により容易に試験することができる。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれ、Ｔｓｐのプロテアーゼ活性は試験された。
【0146】
ＴｓｐはＫｅｉｌｅｒら（上述）において、残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５を含む活性部位を有すると報告されており、残基Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２はＴｓｐの構造を維持するのに重要である。Ｋｅｉｌｅｒら（上述）は、アミノ酸変化Ｓ４３０Ａ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ、及びＴ４５２Ａを導く変異Ｔｓｐ遺伝子には検出可能なプロテアーゼ活性がなかったという所見を報告している。Ｓ４３０Ｃを導く変異Ｔｓｐ遺伝子は野生型活性の約５～１０％を示したことがさらに報告されている。したがって、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＴｓｐ変異は、Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２の１つ又は複数の残基の変化を導くミスセンス変異などの変異を含むことがある。低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＴｓｐ変異が、活性部位の残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５の１つ、２つ、又は３つ全てに影響を与えるミスセンス変異などの変異を含むことができるのが好ましい。
【0147】
したがって、変異Ｔｓｐ遺伝子は以下を含むことができる：
アミノ酸Ｓ４３０に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｄ４４１に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｋ４５５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ４３０及びＤ４４１に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ４３０及びＫ４５５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｄ４４１及びＫ４５５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５に影響を与える変異。
アミノ酸Ｓ４３０に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｄ４４１に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｋ４５５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ４３０及びＤ４４１に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ４３０及びＫ４５５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｄ４４１及びＫ４５５に影響を与える変異、又は
アミノ酸Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５に影響を与える変異。
【0148】
残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２の１つ又は複数が、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変化していてよい。適切な変化の例には、Ｓ４３０Ａ、Ｓ４３０Ｃ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ、及びＴ４５２Ａがある。変異Ｔｓｐ遺伝子は、活性部位残基の変化を導く１つ、２つ、又は３つの変異を含むことができ、例えば、遺伝子は以下を含むことができる：
Ｓ４３０Ａ、若しくはＳ４３０Ｃ、及び／又は
Ｄ４４１Ａ及び／又は
Ｋ４５５Ａ若しくはＫ４５５Ｈ、若しくはＫ４５５Ｒ。
Ｓ４３０Ａ、若しくはＳ４３０Ｃ、及び／又は
Ｄ４４１Ａ及び／又は
Ｋ４５５Ａ若しくはＫ４５５Ｈ、若しくはＫ４５５Ｒ。
【0149】
Ｔｓｐ遺伝子がＳ４３０Ａ又はＳ４３０Ｃを導く変異を有するのが好ましい。
【0150】
「ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、Ｔｓｐ遺伝子が、Ｔｓｐタンパク質を欠く細胞を提供するために、野生型遺伝子によってコードされるＴｓｐタンパク質の発現を防ぐ１つ又は複数の変異を含んでいることを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳されない。ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は、タンパク質の発現をもたらさないように、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異され得る。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによってノックアウトされてよい。
【0151】
好ましい一実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによって変異されない。一実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流、及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってＴｓｐタンパク質の発現を防いでいる。開始コドンに対する変異は、開始コドンの１つ、２つ、又は３つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは、挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、コード配列の５’末端に２つのＡＴＧコドンを含んでおり、ＡＴＧコドンの１つ又は両方はミスセンス変異によって変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、図１０に示す通り、第２のＡＴＧコドン（コドン３）からＴＣＧコドンに変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、或いは、又はさらに、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンを含んでいてよい。ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、開始コドンに対するミスセンス変異、及び１つ又は複数の挿入された終止コドンの両方を含んでいるのが好ましい。好ましい一実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は第５のコドンから「Ｔ」を欠失するように変異されており、それによって、図１０に示す通り、コドン１１及び１６に終止コドンをもたらすフレームシフトを生じている。好ましい一実施形態において、図１０に示す通り、コドン２１に第３のインフレーム終止コドンを作り出すように、Ｔｓｐ遺伝子はＡｓｅＩ制限部位を挿入するように変異される。
【0152】
好ましい一実施形態において、ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は配列番号２５のＤＮＡ配列を有し、これは開始コドンの上流にＡＴＧＡＡＴの６個のヌクレオチドを含んでいる。配列番号２５のノックアウト変異Ｔｓｐ配列においてなされた変異を図１０に示す。一実施形態において、変異Ｔｓｐ遺伝子は、配列番号２５のヌクレオチド７から２０４８のＤＮＡ配列を有する。
【0153】
本発明の実施形態において、細胞は変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる。本明細書で用いられる「ＤｅｇＰ」は、ＤｅｇＰタンパク質（ＨｔｒＡとしても知られている）をコードする遺伝子を意味し、ＤｅｇＰタンパク質はシャペロン及びプロテアーゼとしての二重機能を有する。野生型ＤｅｇＰ遺伝子の配列を配列番号２９に示し、非変異のＤｅｇＰタンパク質の配列を配列番号３０に示す。
【0154】
低温でＤｅｇＰはシャペロンとして機能し、高温でＤｅｇＰはプロテアーゼとしての機能を優先する。
【0155】
細胞がＤｅｇＰ変異を含んでいる実施形態において、細胞におけるＤｅｇＰ変異は、シャペロン活性を有するが完全なプロテアーゼを有さないＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を提供する。
【0156】
「シャペロン活性を有する」の表現は、本発明の文脈において、変異ＤｅｇＰタンパク質が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質に比べて同じ、又は実質的に同じシャペロン活性を有することを意味する。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質のシャペロン活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのが好ましい。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型ＤｅｇＰに比べて同じシャペロン活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのがより好ましい。
【0157】
「低減したプロテアーゼ活性を有する」の表現は、本発明の文脈において、変異ＤｅｇＰタンパク質が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのが好ましい。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、プロテアーゼ活性のないＤｅｇＰタンパク質をコードするのがより好ましい。細胞は、染色体のＤｅｇＰを欠くのではなく、すなわち、ＤｅｇＰ遺伝子配列は、あらゆる形態のＤｅｇＰタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【0158】
シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＤｅｇＰ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ及びシャペロンの活性は、当業者であれば、ＤｅｇＰのプロテアーゼ及びシャペロン活性がＤｅｇＰの天然の基質であるＭａｌＳ上で試験される方法などのあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【0159】
ＤｅｇＰはセリンプロテアーゼであり、アミノ酸残基Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の触媒三塩基からなる活性中心を有する。シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＤｅｇＰ変異は、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つに影響を与えるミスセンス変異などの変異を含んでいてよい。
【0160】
したがって、変異ＤｅｇＰ遺伝子は以下を含んでいてよい：
アミノ酸Ｈｉｓ１０５に影響を与える変異、又は、
アミノ酸に影響を与える変異、又は、
アミノ酸に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ｈｉｓ１０５及びＡｓｐ１３５に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ｈｉｓ１０５及びＳｅｒ２１０に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０に影響を与える変異。
アミノ酸Ｈｉｓ１０５に影響を与える変異、又は、
アミノ酸に影響を与える変異、又は、
アミノ酸に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ｈｉｓ１０５及びＡｓｐ１３５に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ｈｉｓ１０５及びＳｅｒ２１０に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０に影響を与える変異、又は、
アミノ酸Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０に影響を与える変異。
【0161】
Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つは、シャペロン活性、及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変化されていてよい。例えば、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つは、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変化されてよい。さらなる適する変異は、例えば、Ａｓｐ１３５がＬｙｓ又はＡｒｇに変化され、極性のＨｉｓ１０５がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、又はＬｅｕなどの非極性のアミノ酸に変化され、小型の親水性のＳｅｒ２１０がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、又はＴｙｒなどの大型又は疎水性の残基に変化されるなど、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つの、反対の性質を有するアミノ酸への変化である。ＤｅｇＰ遺伝子が、図１１に示す通り、シャペロン活性を有するがプロテアーゼを有さないタンパク質を生成することが見出されている変更Ｓ２１０Ａを含んでいるのが好ましい。
【0162】
ＤｅｇＰは、タンパク質－タンパク質相互作用を媒介する、ＰＤＺ１（残基２６０～３５８）及びＰＤＺ２（残基３５９～４４８）の２つのＰＤＺドメインを有する。本発明の一実施形態において、ｄｅｇＰ遺伝子は、ＰＤＺ１ドメイン及び／又はＰＤＺ２ドメインを欠失するように変異される。ＰＤＺ１及びＰＤＺ２の欠失は、ＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ活性の完全な喪失及び野生型ＤｅｇＰタンパク質に比べて低下したシャペロン活性をもたらし、ＰＤＺ１又はＰＤＺ２いずれかの欠失は、野生型ＤｅｇＰタンパク質に比べて５％のプロテアーゼ活性及び同様のシャペロン活性をもたらす。
【0163】
変異ＤｅｇＰ遺伝子は、例えば、図１１に示す通り、同定及びスクリーニング方法において助けとなるためにＡｓｅＩなど、サイレントの天然に存在しない制限部位も含んでいてよい。
【0164】
点変異Ｓ２１０Ａ及びＡｓｅＩ制限マーカー部位を含んでいる変異ＤｅｇＰ遺伝子の好ましい配列を配列番号３１に提供し、コードされるタンパク質配列を配列番号２７に示す。配列番号３２の変異ＤｅｇＰ配列になされた変異を図１１に示す。
【0165】
細胞が、シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる本発明の実施形態において、本発明が提供する１つ又は複数の細胞は、変異細胞に比べて細胞からの正確にフォールディングされたタンパク質の収率の改善を提供することができ、ＤｅｇＰ遺伝子は、染色体欠損ＤｅｇＰなど、ＤｅｇＰ発現を防ぐノックアウトＤｅｇＰに対して変異されている。ＤｅｇＰの発現を防ぐノックアウト変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる細胞においてＤｅｇＰのシャペロン活性は完全に失われるが、本発明による細胞においてＤｅｇＰのシャペロン活性は保持され、完全なプロテアーゼ活性は失われる。これらの実施形態において、本発明による１つ又は複数の細胞は、タンパク質のタンパク質分解性を防ぐようにプロテアーゼ活性は低減されており、宿主細胞におけるタンパク質において正確なフォールディング及び輸送を可能にするようにシャペロン活性は維持されている。
【0166】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ＯｍｐＴ配列番号３９を欠くなど、ノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子を有さない。
【0167】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｄｅｇＰを欠くなど、ノックアウト変異ＤｅｇＰ遺伝子を有さない。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、変異ＤｅｇＰ遺伝子を有さない。
【0168】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｐｔｒを欠くなど、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を有さない。
【0169】
一実施形態では、本発明のグラム陰性細菌細胞は変異ｓｐｒ遺伝子を担持していない。
【0170】
あらゆる適切なグラム陰性細菌を、本発明の組換え細胞を生成するための親細胞として用いることができる。適切なグラム陰性細菌には、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、軟腐病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、及び大腸菌が含まれる。親細胞が大腸菌であるのが好ましい。本発明において大腸菌のあらゆる適切な系統を用いることができるが、Ｋ－１２ Ｗ３１１０などの野生型Ｗ３１１０系統を用いるのが好ましい。
【0171】
予め作り出され、組換えタンパク質を発現するのに用いられる系統に付随する欠点は、大腸菌系統において、例えば、ｐｈｏＡ、ｆｈｕＡ、ｌａｃ、ｒｅｃ、ｇａｌ、ａｒａ、ａｒｇ、ｔｈｉ、及びｐｒｏなど、細胞の代謝及びＤＮＡ複製に関与する遺伝子の変異の使用を伴う。これらの変異は、細胞の増殖、安定性、ペリプラズム漏出、組換えタンパク質発現収率、及び毒性に対する効果を含めた、宿主細胞に対する多くの有害効果を有し得る。これらのゲノムの変異を１つ又は複数有する系統、特にこれらの変異を多数有する系統は、細菌の増殖速度を、産業的なタンパク質生成に適さないレベルまで低減する適応度の喪失を表し得る。さらに、あらゆる上記のゲノムの変異は、予測不可能な有害な方法で、シス及び／又はトランスにおいて他の遺伝子に影響を及ぼし、それによって系統の表現型、適応度、及びタンパク質のプロファイルを変更し得る。さらに、大幅に変異した細胞を使用することは、商用、特に治療剤に使用するための組換えタンパク質を生成するのに一般に適さない、というのは、このような系統は一般的に欠陥のある代謝経路を有しており、したがって最小の培地又は化学的に規定された培地において不十分にしか増殖せず、又は全く増殖しないことがあるからである。
【0172】
好ましい実施形態では、細胞は、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを導入する最小限の変異のみを、並びに任意選択によってＴｓｐプロテアーゼ活性を低減させる変異、並びに任意選択によってｓｐｒ遺伝子又はその変異体を担持している。
【0173】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチドが細胞のゲノム内に挿入されている一実施形態では、ＤｓｂＣ及び／又は前記抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを導入する最小限の変異のみが細胞のゲノムに加えられている。ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び前記抗体をコードするポリヌクレオチドが同じ又は異なる発現ベクターに存在しているさらなる実施形態では、前記ゲノムは野生型細胞ゲノムに対して同質遺伝子的であるのが好ましい。
【0174】
一実施形態において、細胞は、細胞の増殖及び／又は対象のタンパク質を発現する能力に対して有害な効果を有し得るいかなる他の変異を有さない。したがって、本発明の１つ又は複数の組換え宿主細胞は、ゲノム配列に対して遺伝子操作した変異を含んでいる細胞に比べて、改善されたタンパク質発現及び／又は改善された増殖の特徴を表し得る。本発明が提供する細胞はまた、細胞のゲノムに対するかく乱を含んでいる細胞に比べて、治療用タンパク質の生成に用いるのにより適している。
【0175】
好ましい実施形態では、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、並びに任意選択によってＴｓｐプロテアーゼ活性を低減させる変異、並びに任意選択によってｓｐｒ遺伝子又はその変異体以外は、細胞は野生型大腸菌細胞に対して同質遺伝子的である。
【0176】
一実施形態では、ＤｓｂＣ及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを発現するのに適したプラスミドを用いて使用するための、低減したＴｓｐ活性及びｓｐｒ遺伝子又はその変異体を有する以外は、大腸菌Ｗ３１１０系統に対して同質遺伝子的な細胞が提供される。
【0177】
さらに好ましくは、本発明の細胞は、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド以外は、大腸菌Ｗ３１１０系統に対して同質遺伝子的である。
【0178】
本発明により提供される細胞は、ＣＤ１５４に対して特異性のある抗原結合抗体フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む。
【0179】
本明細書で用いられる「細胞が含む」は、関係する実体が細胞のゲノムに組み込まれる場合、又は細胞が、前記実体を含有する及び一般には前記実体を発現するためのプラスミドなどのベクターを含有する場合を指すことが意図されている。
【0180】
前記抗体又は抗体フラグメントは、多価、多重特異的、ヒト化、完全ヒト又はキメラでもよい。抗体又は抗体フラグメントはあらゆる種からのものであってよいが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、又はヒト化フラグメントに由来しているのが好ましい。抗体フラグメントは、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＡ）又はサブクラスに由来していてよく、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、若しくはヒトを含めたあらゆる種から得ることができる。抗体フラグメントの部分は、１つを超える種から得ることができ、例えば、抗体フラグメントはキメラであってよい。一例において、定常領域はある種からであり、可変領域は別の種からである。
【0181】
抗体フラグメントは、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフラグメント；軽鎖又は重鎖モノマー又はダイマー；並びにダイアボディー；トリアボディー；テトラボディー；ミニボディー；ドメイン抗体又は一本鎖抗体、例えば、重鎖と軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーにより結合している一本鎖Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ又はＷＯ２００９／０４０５６２に記載されるＦａｂ－ｄＡｂなどの二重特異性抗体でもよい。同様に、重鎖及び軽鎖可変領域は、必要に応じて他の抗体ドメインと組み合わせてもよい。抗体フラグメントは当技術分野では公知である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ １１２６～３６頁）。
【0182】
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体は、好ましくはＷＯ２００８／１１８３５６（この特許文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗体３４２である、又はＷＯ２００８／１１８３５６に記載される抗体３４２のＣＤＲ若しくは可変重鎖及び軽鎖領域を含む。ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体フラグメントは、好ましくはＷＯ２００８／１１８３５６に記載される抗体３４２由来である、並びに／又は前記抗体のＣＤＲ若しくは可変重鎖及び軽鎖領域を含む。
【0183】
一実施形態では、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントは、可変ドメインが３個のＣＤＲを含み、ＣＤＲがＣＤＲＨ１では配列番号１、ＣＤＲＨ２では配列番号２及びＣＤＲＨ３では配列番号３から選択される重鎖を含む。
【0184】
一実施形態では、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントは、可変ドメインが３個のＣＤＲを含み、ＣＤＲがＣＤＲＬ１では配列番号４、ＣＤＲＬ２では配列番号５及びＣＤＲＬ３では配列番号６から選択される軽鎖を含む。
【0185】
一実施形態では、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤＲＨ１では配列番号１の配列、ＣＤＲＨ２では配列番号２の配列、及びＣＤＲＨ３では配列番号３の配列を含む重鎖を含む。
【0186】
一実施形態では、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤＲＬ１では配列番号４の配列、ＣＤＲＬ２では配列番号５の配列、及びＣＤＲＬ３では配列番号６の配列を含む軽鎖を含む。
【0187】
一実施形態では、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤＲＨ１では配列番号１の配列、ＣＤＲＨ２では配列番号２の配列、及びＣＤＲＨ３では配列番号３の配列を含む重鎖、並びにＣＤＲＬ１では配列番号４の配列、ＣＤＲＬ２では配列番号５の配列、及びＣＤＲＬ３では配列番号６の配列を含む軽鎖を含む。
【0188】
抗体はＣＤＲグラフト化抗体分子であるのが好ましく、典型的には可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含んでいる。
【0189】
抗体は配列番号１１の軽鎖可変ドメイン（配列番号７）及び重鎖可変ドメイン（配列番号９）を含むのが好ましい。
【0190】
好ましくは、抗体はＦａｂフラグメントである。好ましくは、Ｆａｂフラグメントは配列番号１４として与えられる配列を含む又はからなる重鎖、及び配列番号１２として与えられる配列を含む又はからなる軽鎖を有する。配列番号１４及び配列番号１２に与えられるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１１に与えられるヌクレオチド配列によりコードされるのが好ましい。
【0191】
或いは、抗体フラグメントは、修飾がその重鎖のＣ末端終端へのエフェクター又はレポーター分子の結合を可能にする１つ又は複数のアミノ酸の付加である修飾Ｆａｂフラグメントであることが好ましい。好ましくは、さらなるアミノ酸は、当技術分野で公知のように、エフェクター又はレポーター分子を結合させることができる１つ又は２つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する（例えば、ＷＯ９８／２５９７１参照。前記特許文献はその全体を本明細書に組み込まれる）。
【0192】
本発明の細胞は前記抗体をコードするＤＮＡ配列を含む。前記ＤＮＡ配列は前記抗体の重鎖及び軽鎖をコードするのが好ましい。
【0193】
一好ましい実施形態では、前記ＤＮＡ配列は軽鎖をコードしており、本明細書に示される配列を含む。
【0194】
前記ＤＮＡ配列は、例えば、化学処理により生成される合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組合せを含んでいてもよい。
【0195】
抗体の定常領域ドメインは、存在すれば、抗体分子の提案される機能、及び特に必要とされることもあるエフェクター機能を考慮して選択されてもよい。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、抗体分子が治療的使用を目的としており抗体エフェクター機能が必要とされる場合は、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用してもよい。或いは、抗体分子が治療を目的としており抗体エフェクター機能が必要とされない、例えば、ＣＤ１５４活性を遮断するだけのための場合は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用してもよい。
【0196】
前記抗体は、炎症性疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維性障害並びに癌を含む疾患又は障害の治療において有用であり得る。
【0197】
「炎症性疾患」又は「自己免疫障害」及び「免疫疾患若しくは障害」の語には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性関節炎、スチル病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ＡＮＣＡ関連血管炎及びヴェゲナー肉芽腫炎を含む血管炎、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、リウマチ性自己免疫肝炎多発性筋痛、ギランバレー症候群、抗リン脂質抗体症候群、突発性血小板減少症、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、尋常性天疱瘡、皮膚筋炎、水疱性類天疱瘡、ヘノッホシェーンライン紫斑病、マックルウェールズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、セリアック病、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植及び移植片対宿主病が含まれる。
【0198】
「線維性障害」の語は、本明細書で使用されるように、多くの場合修復又は反応性過程としての器官又は組織における過剰な線維結合組織の形成又は発生を特徴とする障害のことである。線維性障害は、肺（例えば、制限なしに突発性肺線維症、間質性肺疾患）、肝臓、腸、腎臓、心臓若しくは皮膚などの単一器官を侵す、又は例えば、制限なしに全身性硬化症において多臓器を侵すことがある。線維性障害の語は、皮膚の瘢痕にも関係する。皮膚の瘢痕には、ケロイド瘢痕、例えば、制限なしに皮膚火傷後に起こる痙縮瘢痕、肥厚性瘢痕及びにきび瘢痕が含まれるがこれらに限定されない。
【0199】
本発明の宿主細胞はまた、１つ又は複数のさらなる対象のタンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチドを含んでいてよい。
【0200】
本発明による組換えグラム陰性細菌細胞はあらゆる適切な手段によって生成され得る。
【0201】
当業者であれば、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び前記抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入するのに使用してもよい適切な技法を承知している。ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドは、Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（Ｌｉｎｋ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ ６２２８～３７頁）に記載されているｐＫＯ３などの適切なベクターを使用して細胞のゲノムに組み込ませてもよい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【0202】
或いは、又はさらに、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び／又は抗体をコードするポリヌクレオチドは、組換え発現カセット中に非組入れであってもよい。一実施形態において、ＤｓｂＣをコードするタンパク質コード配列、抗体をコードする１つ又は複数のタンパク質コード配列、及び１つ又は複数の制御発現配列を典型的に含んでいる、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は抗体をコードするポリヌクレオチドを有するために、本発明において発現カセットが用いられる。１つ又は複数の制御発現配列はプロモーターを含んでいてよい。１つ又は複数の制御発現配列は、終止配列などの３’非翻訳領域も含んでいてよい。適切なプロモーターを以下により詳しく論じる。
【0203】
一実施形態では、ＤｓｂＣ及び／又は前記抗体若しくはそのフラグメントをコードする遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれて、安定的細胞系を生み出す。
【0204】
一実施形態において、本発明による細胞は、プラスミドなどの１つ又は複数のベクターを含んでいる。ベクターが上記に規定した１つ又は複数の発現カセットを含んでいるのが好ましい。宿主細胞は、上記のＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含むことが好ましい。好ましくは、発現ベクターは、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列及び重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【0205】
好ましい実施形態では、発現ベクターは大腸菌発現ベクターである。
【0206】
一実施形態において、抗体をコードするポリヌクレオチド配列、及びＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドを別々の発現ベクター中に挿入する。
【0207】
生成物の生成において、第１のベクターが軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターが重鎖ポリペプチドをコードする、２つのベクターを細胞系に形質転換してもよい。或いは、ベクターが軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含んでいる、単一のベクターを用いてもよい。
【0208】
或いは、抗体をコードするポリヌクレオチド配列及びＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドを１つのベクター中に挿入する。ベクターが、抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含んでいるのが好ましい。
【0209】
本発明は、ＤｓｂＣ及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。前記発現ベクターは、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド配列及び前記抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む多シストロン性ベクターである。
【0210】
多シストロン性のベクターは、ポリヌクレオチド配列のベクター中への繰返し連続クローニングを可能にする有利なクローニング方法によって生成することができる。方法は、ＡｓｅＩ及びＮｄｅＩ制限部位の「ＡＴ」末端などの１対の制限部位の適合性の付着末端を用いるものである。コード配列を含んでおり、ＡｓｅＩ－ＮｄｅＩフラグメントなどの適合性の付着末端を有するポリヌクレオチドを、ＮｄｅＩなどのベクターにおける制限部位中にクローニングしてもよい。ポリヌクレオチド配列の挿入は５’制限部位を破壊するが、ＮｄｅＩなどの新たな３’制限部位を作り出し、次いでこの新たな制限部位を用いて、適合性の付着末端を含んでいるさらなるポリヌクレオチド配列を挿入してもよい。次いでこのプロセスを繰り返してさらなる配列を挿入する。ベクター中に挿入された各ポリヌクレオチド配列は、終止コドンに対して３’の非コード配列を含んでおり、終止コドンはスクリーニング用のＳｓｐＩ部位、シャインダルガノリボソーム結合性配列、Ａリッチスペーサー、及び開始コドンをコードするＮｄｅＩ部位を含んでいてよい。
【0211】
ある抗体の軽鎖（ＬＣ）、ある抗体の重鎖（ＨＣ）をコードするポリヌクレオチド配列、ＤｓｂＣポリヌクレオチド配列、及びさらなるポリヌクレオチド配列を含んでいるベクターの創製を示す図を図１に示す。
【0212】
本発明の細胞は上記に規定した発現ベクターを含むことが好ましい。
【0213】
細胞が以下の１つ又は複数のさらなるタンパク質：
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤ、並びに／又は
タンパク質の分泌又は転位置を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに／又は
ジスルフィド結合形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ
も発現する実施形態において、前記１つ又は複数のさらなるタンパク質は、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又はＣＤ１５４に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチドと同じベクターに挿入された１つ又は複数のポリヌクレオチドから発現され得る。或いは、１つ又は複数のポリヌクレオチドを別々のベクター中に挿入してもよい。
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤ、並びに／又は
タンパク質の分泌又は転位置を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに／又は
ジスルフィド結合形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ
も発現する実施形態において、前記１つ又は複数のさらなるタンパク質は、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又はＣＤ１５４に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする１つ若しくは複数のポリヌクレオチドと同じベクターに挿入された１つ又は複数のポリヌクレオチドから発現され得る。或いは、１つ又は複数のポリヌクレオチドを別々のベクター中に挿入してもよい。
【0214】
発現ベクターは、適切なベクター中に上記で定義した１つ又は複数の発現カセットを挿入することによって生成することができる。或いは、ポリヌクレオチド配列の発現を指示するための制御発現配列が発現ベクターに含まれていてよく、したがってポリヌクレオチドのコード領域だけが発現ベクターを完成するのに必要とされ得る。
【0215】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又はＣＤ１５４に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを、細胞中で細胞に適するプロモーターの制御下で発現させるために、複製可能なベクター、典型的には自律的複製発現ベクター中に挿入するのが適切である。多くのベクターがこの目的で当技術分野において知られており、好適なベクターの選択は核酸のサイズ及び特定の細胞型に依存し得る。
【0216】
本発明によるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するのに用いることができる発現ベクターの例には：
プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２若しくはｐＡＣＹＣ１８４、及び／又は
ウイルスのベクター、例えば、細菌のファージ
転位性遺伝要素、例えば、トランスポゾン
が含まれる。
プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２若しくはｐＡＣＹＣ１８４、及び／又は
ウイルスのベクター、例えば、細菌のファージ
転位性遺伝要素、例えば、トランスポゾン
が含まれる。
【0217】
このような発現ベクターは、通常、プラスミドのＤＮＡ複製開始点、抗生物質の選択マーカー、プロモーター、及びマルチクローニング部位によって分離されている転写ターミネーター（発現カセット）、及びリボソーム結合部位をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。
【0218】
本発明において用いられるプロモーターは、関連のポリヌクレオチドに直接連結していてよく、又は代替として好適な位置に、例えば、関連のポリペプチドが関連のプロモーターに挿入された場合に関連のプロモーターに対して作用することができるようなベクター中に位置していてよい。一実施形態において、プロモーターは、それに対してプロモーターが作用するポリヌクレオチドのコード部分の前に、例えば、ポリヌクレオチドの各コード部分の前の関連のプロモーターに位置している。本明細書で用いられる「前」はプロモーターが、コードするポリヌクレオチド部分に関して５プライムエンドに位置することを意味するものとされる。
【0219】
プロモーターは、宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なプロモーターには、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、Ｉｐｐ、Ａｒａｂ、ｔｅｔ、及びＴ７が含まれる。
【0220】
用いられる１つ又は複数のプロモーターは誘導プロモーターであってよい。ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド、及び抗体をコードするポリヌクレオチドが１つのベクター中に挿入されている実施形態において、ＤｓｂＣ及び抗体をコードするヌクレオチド配列は、単一のプロモーター又は別々のプロモーターの制御下にあってよい。ＤｓｂＣ及び抗体をコードするヌクレオチド配列が別々のプロモーターの制御下にある実施形態において、プロモーターは独立に誘導プロモーターであってよい。
【0221】
細菌系において用いるためのプロモーターは、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能にリンクしているシャインダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も一般に含んでいる。プロモーターは、制限酵素の消化によって細菌の供給源のＤＮＡから除去し、所望のＤＮＡを含んでいるベクター中に挿入することができる。
【0222】
発現ベクターが、ＷＯ０３／０４８２０８又はＷＯ２００７／０３９７１４（これらの内容は参照によってその全体を本明細書に組み入れられる）に記載されている抗体又はその抗原結合性フラグメントを生成するためのジシストロン性のメッセージも含んでいるのが好ましい。好ましくは、抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含んでいる上流のシストロン、及び対応する重鎖をコードするＤＮＡを含んでいる下流のシストロン、並びにジシストロン性の遺伝子間配列（ＩＧＳ）が、ＩＧＳ１（配列番号３３）、ＩＧＳ２（配列番号３４）、ＩＧＳ３（配列番号３５）、及びＩＧＳ４（配列番号３６）から選択される配列を含んでいるのが好ましい。
【0223】
好ましい発現ベクターは、上記の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖及び重鎖を生成するためのトリシストロン性メッセージ並びに組換えＤｓｂＣを生成するための、好ましくはｈｉｓタグを含むメッセージを含む。
【0224】
ターミネーターは宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なターミネーターはｒｒｎＢである。
【0225】
プロモーター及びターミネーターを含むさらなる適切な転写レギュレーター並びにタンパク質ターゲティング法は、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｋｒｉｄｅｓ ５１２～３８頁）に見ることができ、前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【0226】
発現ベクター中に挿入されたＤｓｂＣポリヌクレオチドが、ＤｓｂＣシグナル配列及びＤｓｂＣコード配列をコードする核酸を含んでいるのが好ましい。ＤｓｂＣタンパク質は、例えば、タンパク質：ＯｍｐＡ、ＭａｌＢ、ＰｅｌＢ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＳ、ＬｐｐＡ、ＤｓｂＡ由来のシグナルペプチドなどの他のシグナルペプチドへの遺伝子融合によりペリプラズム下に向けてもよい。ベクターは、好ましくは宿主の染色体を独立に複製するために、ベクターの１つ又は複数の選択された宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含んでいるのが好ましい。このような配列は様々な細菌ではよく知られている。
【0227】
一実施形態において、ＤｓｂＣ及び／又は対象のタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端にヒスチジンタグを含んでいる。
【0228】
抗体分子は、細胞から分泌されることもあり、又は適切なシグナル配列によってペリプラズムに対して標的化することもある。或いは、抗体分子は細胞の原形質内に蓄積することもある。抗体分子がペリプラズムに対して標的化するのが好ましい。
【0229】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、別のポリペプチド、好ましくは、成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドとの融合物として発現されてよい。選択される異種性のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるものでなければならない。天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物の宿主細胞では、シグナル配列は原核生物のシグナル配列によって置換される。適切なシグナル配列には、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＬａｍＢ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが含まれる。細胞が前記抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド及び前記抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む実施形態では、それぞれのポリヌクレオチドがＯｍｐＡなどのシグナル配列を含んでいてもよい。
【0230】
上記に列挙した成分の１つ又は複数を含んでいる適切なベクターの構築は、標準のライゲーション技術を用いるものである。単離したプラスミド又はＤＮＡフラグメントを、必要とするプラスミドを生成するのに望ましい形態において、切断し、誂え、再ライゲーション（ｒｅ－ｌｉｇａｔｅｄ）する。ベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。
【0231】
分子生物学の標準技法を使用して前記抗体をコードするＤＮＡ配列を調製してもよい。目的のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技法を使用して完全に又は部分的に合成してもよい。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を必要に応じて使用してもよい。
【0232】
ポリヌクレオチドに関して本明細書に記載する本発明の実施形態は、ベクター、発現カセット、及び／又はこの中に用いられる成分を含んでいる宿主細胞など、関連する態様をこれらに適用することができる限り、本発明の代替の実施形態に等しく適用されるものである。
【0233】
本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するための方法であって、
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現させるのに効果的な条件下で培養培地において上記に規定した組換えグラム陰性細菌細胞を培養するステップと、
組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地からＣＤ１５４に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントを回収するステップと
を含む方法も提供する。
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現させるのに効果的な条件下で培養培地において上記に規定した組換えグラム陰性細菌細胞を培養するステップと、
組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地からＣＤ１５４に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントを回収するステップと
を含む方法も提供する。
【0234】
本発明の方法において用いるのが好ましいグラム陰性細菌細胞及び抗体は、上記に詳しく記載したものである。
【0235】
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド、及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを当技術分野において知られているあらゆる適切な手段を用いて宿主細胞中に組み入れることができる。上記で論じた通り、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び抗体をコードするポリヌクレオチドが、細胞中に形質転換される同じ又は別々の発現ベクターの部分として組み入れられるのが典型的である。
【0236】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド、及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを、塩化ルビジウム、ＰＥＧ、又は電気穿孔を用いるなど、標準の技術を用いて細胞中に形質転換してもよい。
【0237】
本発明による方法は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで上首尾に形質転換されている安定な細胞の選択を促進する選択系も用いることができる。選択系は通常、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの同時形質転換を使用する。一実施形態において、細胞中に形質転換された各ポリヌクレオチドは、１つ又は複数の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいる。したがって、ＤｓｂＣ及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドの形質転換、並びにマーカーをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドの形質転換は一緒に生じ、選択系を用いて所望のタンパク質を生成するこれらの細胞を選択することができる。
【0238】
１つ又は複数のマーカーを発現することができる細胞は、細胞中に組み入れられる選択系のポリペプチド／遺伝子又はポリペプチド成分によって付与される性質（例えば、抗生物質耐性）のために、例えば、毒素又は抗生物質の添加など、ある種の人工的に課せられた条件下で生存／増殖／繁殖することができる。１つ又は複数のマーカーを発現することができない細胞は、人工的に課せられた条件下で生存／増殖／繁殖することができない。人工的に課せられる条件は、所望により幾分強力であるように選択され得る。
【0239】
本発明においてあらゆる適切な選択系を用いることができる。典型的に、選択系は、例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はアンピリシン耐性の遺伝子など、既知の抗生物質に対して耐性をもたらすベクターの１つ又は複数の遺伝子中に含まれていることに基づいていてよい。関連の抗生物質の存在下で増殖する細胞は、これらが抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子及び所望のタンパク質の両方を発現するように選択されてよい。
【0240】
抗体及び／又はＤｓｂＣを発現させるために、誘導可能な発現系、又は構成的なプロモーターを本発明において用いることができる。適切な誘導可能な発現系及び構成的なプロモーターは、当技術分野においてよく知られている。
【0241】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド、及び抗体をコードするポリヌクレオチドが、同じ又は別々の誘導プロモーターの制御下にある一実施形態において、抗体をコードするポリヌクレオチド（単数又は複数）及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドは、培養培地に誘導因子を加えることによって誘導される。
【0242】
形質転換細胞を培養するのにあらゆる適切な培地を用いることができる。例えば、培地中で増殖するように上首尾に形質転換されている細胞だけを可能にするように、培地は抗生物質を含み得るなど、培地を特定の選択系に適応させてもよい。
【0243】
培地から得た細胞を、所望により、さらにスクリーニング及び／又は精製にかけてもよい。方法は、所望により対象のタンパク質を抽出及び精製する１つ又は複数のステップをさらに含むことができる。
【0244】
抗体又はその抗原結合フラグメントを、原形質、ペリプラズム、又は上清からを含む、系統から回収及び精製することができる。適切な方法には、イムノ－アフィニティカラム、又はイオン交換カラム上での分画化、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、疎水性－相互作用クロマトグラフィー、シリカ上クロマトグラフィー、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ及びＤＥＡＥなどのイオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、硫酸アンモニウム沈澱、及びゲルろ過が含まれる。
【0245】
一実施形態において、方法は、ＤｓｂＣから抗体又はその抗原結合フラグメントを分離することをさらに含む。
【0246】
抗体又はその抗原結合フラグメントを、培養培地及び／又は原形質抽出物及び／又はペリプラズム抽出物から、従来の抗体精製手順、例えば、タンパク質Ａ－セファロース、タンパク質Ｇクロマトグラフィー、タンパク質Ｌクロマトグラフィー、チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）、混合モード樹脂（ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅ ｒｅｓｉｎｓ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム、エタノール、又はＰＥＧ分画／沈澱、イオン交換膜、膨張床吸着クロマトグラフィー（ＥＢＡ）、又は擬似移動床クロマトグラフィーなどによって適切に分離することができる。
【0247】
方法は、対象のタンパク質の発現量を測定し、高発現レベルの対象のタンパク質を有する細胞を選択するさらなるステップも含むことができる。
【0248】
本明細書に記載する１つ又は複数の方法のステップを、バイオリアクターなどの適切な容器において組み合わせて行ってもよい。
【0249】
発現後、前記抗体は、例えば、エフェクター分子などの別の実体にコンジュゲートすることによりさらに処理してもよい。したがって、本発明の方法は、エフェクター分子を前記抗体に結合させるさらなるステップを含んでいてもよい。
【0250】
本明細書で用いられるエフェクター分子の語には、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素（例えば、細菌若しくは植物起源の酵素的に活性な毒素及びこれらのフラグメント、例えば、リシン（ｒｉｃｉｎ）及びそのフラグメント）生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成の、又は天然に存在するポリマー、核酸及びこれらのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーターグループ、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が含まれる。エフェクター分子は、あらゆる適切な方法によって抗体又はそのフラグメントに付着していてよく、例えば、抗体フラグメントは、ＷＯ２００５／００３１７３１又はＷＯ２００５／００３１７０（これらの内容は参照によってその全体を本明細書に組み入れられる）に記載されている通り、少なくとも１つのエフェクター分子で付着するように修飾されていてよい。ＷＯ２００５／００３１７１又はＷＯ２００５／００３１７０も適切なエフェクター分子も記載している。
【0251】
前記抗体は、共有結合架橋構造により、重金属原子又はリシンなどの毒素をキレート化するための大環状分子を結合させていてもよい。或いは、組換えＤＮＡ技術の手順を使用して、完全な免疫グロブリン分子のＦｃフラグメント（ＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジドメイン）、ＣＨ２とＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメインが、酵素若しくは毒素分子などの機能的非免疫グロブリンタンパク質により置き換えられている、又はペプチド結合によりそこに結合させている抗体分子を生成してもよい。抗体が、エフェクター又はレポーター分子の結合を可能にする１つ又は複数のアミノ酸をその重鎖のＣ末端終端に有している修飾Ｆａｂフラグメントである実施形態では、さらなるアミノ酸は、エフェクター又はレポーター分子を結合させ得る１つ又は２つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成することが好ましい。
【0252】
好ましいエフェクター基はポリマー分子であり、この分子を修飾Ｆａｂフラグメントに結合させてインビボでのその半減期を増加させ得る。
【0253】
前記ポリマー分子は、一般には、合成又は天然に存在するポリマー、例えば、任意選択で置換された直線状若しくは枝分かれ鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は枝分かれ若しくは非枝分かれ多糖類、例えばホモ若しくはヘテロ多糖類でもよい。
【0254】
上記の合成ポリマー上に存在してもよい特定の任意選択の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特定の例には、任意選択で置換された直線状又は枝分かれ鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、又はその誘導体、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）などの任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が含まれる。特定の天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が含まれる。本明細書で使用される「誘導体」は反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応基などを含むことが意図されている。反応基は直接的に又はリンカー部分を通じてポリマーに連結されていてもよい。そのような基の残基は、いくつかの場合に、抗体フラグメントとポリマー間の連結基として生成物の一部を形成することは認識されるであろう。
【0255】
ポリマーのサイズは望みどおりに変化させてもよいが、一般には、５００Ｄａ～５００００Ｄａ、好ましくは５０００Ｄａ～４００００Ｄａ、さらに好ましくは２５０００Ｄａ～４００００Ｄａの平均分子量範囲になる。ポリマーサイズは、特に生成物の目的の使用に基づいて選択し得る。したがって、例えば、炎症の治療において使用するために、例えば生成物が循環を離れて組織に浸透するように意図されている場合、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する小分子量ポリマーを使用するのが有利であることもある。生成物が循環中に残る適用では、例えば、２５０００Ｄａ～４００００Ｄａの範囲の分子量を有するさらに高分子量のポリマーを使用するのが有利なこともある。
【0256】
特に好ましいポリマーには、ポリ（エチレングリコール）又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体などの、特に約２５０００Ｄａ～約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーが含まれる。
【0257】
修飾抗体フラグメントに結合しているそれぞれのポリマー分子は、フラグメント内に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合し得る。共有結合は一般にジスルフィド結合、又は特に硫黄－炭素結合になる。
【0258】
必要な場合には、前記抗体フラグメントは１つ又は複数のエフェクター又はレポーター分子が結合し得る。前記エフェクター又はレポーター分子は、フラグメント中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基を通じて、抗体フラグメントに結合し得る。１つ又は複数のエフェクター又はレポーター分子は、前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端終端の又はその近くのアミノ酸に結合していてもよい。
【0259】
活性化されたポリマーは、上記のポリマー修飾された抗体フラグメントの調製における出発物質として使用し得る。活性化されたポリマーは、αハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応基を含有するどんなポリマーであってもよい。そのような出発物質は市販のものを（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）入手してもよいし、従来の化学的手順を使用して市販の出発物質から調製してもよい。
【0260】
エフェクター又はレポーター分子に連結されている抗体フラグメントを得るのが望ましい場合は、これは、必要に応じて活性化されたポリマーとの反応前又は後のどちらかでエフェクター又はレポーター分子に直接的に又はカップリング剤を介してのどちらかで前記抗体フラグメントが連結される標準化学的又は組換えＤＮＡ手順により調製してもよい。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／６２３３１及びＷＯ９２／２２５８３に記載されている手順が含まれる。或いは、前記エフェクター又はレポーター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ－Ａ－０３９２７４５に記載されている組換えＤＮＡ手順を使用して達成し得る。
【0261】
好ましくは、本発明の方法により提供される修飾Ｆａｂフラグメントは、ＥＰ－Ａ－０９４８５４４に開示されている方法に従ってペグ化されている（すなわち、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））がそれに共有結合している）。好ましくは、前記抗体は図２に示されるペグ化された修飾Ｆａｂフラグメントである。図２に示されるように、修飾Ｆａｂフラグメントは、重鎖の修飾されたヒンジ領域のＣ末端終端でシステイン残基のうちの１つにリシル－マレイミド由来基を結合させており、前記リシル残基の２つのアミノ基のそれぞれが、メトキシポリ（エチレングリコール）残基の全平均分子量が約４００００Ｄａになるように、約２００００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を共有結合させており、さらに好ましくはリシル－マレイミド由来基は［１－［［［２－［［３－（２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル）－１－オキソプロピル］アミノ］エチル］アミノ］－カルボニル］－１，５－ペンタンジイル］ビス（イミノカルボニル）である。リシン残基はマレイミド基に共有結合している。リシン残基上のアミン基のそれぞれには、およそ２００００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合している。したがって、全エフェクター分子の全分子量はおよそ４００００Ｄａである。
【0262】
したがって、本発明の方法は好ましくは、重鎖のＣ末端終端でシステイン残基の１つにリシル－マレイミド基を結合させるステップを含み、リシル残基のそれぞれのアミノ基は約２００００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を共有結合させている。
【0263】
一実施形態において、汚染性の宿主タンパク質の物理的性質は、アミノ酸タグをＣ末端又はＮ末端に添加することによって変更される。好ましい一実施形態において、変更される物理的性質は等電点であり、アミノ酸タグはＣ末端に付着するポリアスパラギン酸タグである。一実施形態において、前記タグの添加によって変更される大腸菌タンパク質は、ジペプチド結合性タンパク質（ＤｐｐＡ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、及びリン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）である。詳しい一実施形態において、大腸菌のリン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）のｐＩは、アスパラギン酸残基を６個含んでいるポリアスパラギン酸タグ（ＰｏｌｙＤ）をＣ末端に加えることよって７．２から５．１に低減される。
【0264】
単独で、又はＮ末端若しくはＣ末端にタグを加えることとの組合せのいずれかで、その物理的性質を変更するための、汚染性の大腸菌タンパク質の特定の残基の修飾も好ましい。このような変更は、ｐＩ又は疎水性を変更するためのタンパク質又はアミノ酸置換基のサイズを変更するための挿入又は欠失を含むことができる。一実施形態において、これらの残基はタンパク質の表面上に位置する。好ましい一実施形態において、タンパク質のｐＩを低減するために、ＰｈｏＳタンパク質の表面残基が変更される。機能的なＰｈｏＳタンパク質を維持するために、リン酸塩の結合において重要であると関係付けられている残基（ＵＳ５，３０４，４７２）を回避するのが好ましい。
【実施例】
【0265】
細胞系
全ての実験に対して、親の野生型細胞系として大腸菌細胞系Ｗ３１１０を用いた。
全ての実験に対して、親の野生型細胞系として大腸菌細胞系Ｗ３１１０を用いた。
【0266】
以下の変異を有する細胞系を作り出した：
ａ．変異Ｔｓｐ遺伝子、
ｂ．変異Ｔｓｐ遺伝子及び組換えＤｓｂＣを有する、
ｃ．変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子、
ｄ．変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子及び組換えＤｓｂＣを有する。
ａ．変異Ｔｓｐ遺伝子、
ｂ．変異Ｔｓｐ遺伝子及び組換えＤｓｂＣを有する、
ｃ．変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子、
ｄ．変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子及び組換えＤｓｂＣを有する。
【0267】
（例１）
変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞系ＭＸＥ００１（ΔＴｓｐ）の生成
ＭＸＲ００１系統を以下の通り生成した：
Ｔｓｐカセットを、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ制限フラグメントとして、同様に制限したｐＫＯ３プラスミド中に移動させた。ｐＫＯ３プラスミドは、温度感受性変異体のｐＳＣ１０１複製開始点（ＲｅｐＡ）を、染色体の組入れ事象に対して強化及び選択するためのクロラムフェニコールマーカーと一緒に用いる。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子は、ショ糖上で増殖させた大腸菌に致死的であり、したがって（クロラムフェニコールマーカー及びｐＳＣ１０１開始点と一緒に）用いて脱組込み（ｄｅ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）及びプラスミドキュアリング事象に対して強化及び選択するのに用いられる。この方法は以前に記載されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、４６１７～２２頁、及びＢｌｏｍｆｉｅｌｄら、１４４７～５７頁）。ｐＫＯ３系は全ての選択マーカーを、挿入された遺伝子以外の宿主ゲノムから除去する。
変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞系ＭＸＥ００１（ΔＴｓｐ）の生成
ＭＸＲ００１系統を以下の通り生成した：
Ｔｓｐカセットを、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ制限フラグメントとして、同様に制限したｐＫＯ３プラスミド中に移動させた。ｐＫＯ３プラスミドは、温度感受性変異体のｐＳＣ１０１複製開始点（ＲｅｐＡ）を、染色体の組入れ事象に対して強化及び選択するためのクロラムフェニコールマーカーと一緒に用いる。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子は、ショ糖上で増殖させた大腸菌に致死的であり、したがって（クロラムフェニコールマーカー及びｐＳＣ１０１開始点と一緒に）用いて脱組込み（ｄｅ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）及びプラスミドキュアリング事象に対して強化及び選択するのに用いられる。この方法は以前に記載されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、４６１７～２２頁、及びＢｌｏｍｆｉｅｌｄら、１４４７～５７頁）。ｐＫＯ３系は全ての選択マーカーを、挿入された遺伝子以外の宿主ゲノムから除去する。
【0268】
以下のプラスミドを構築した。
ＥｃｏＲＩ及びＡｓｅＩ制限マーカーを含んでいる、配列番号２８に示すノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいるｐＭＸＥ１９１。
ＥｃｏＲＩ及びＡｓｅＩ制限マーカーを含んでいる、配列番号２８に示すノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいるｐＭＸＥ１９１。
【0269】
次いで、プラスミドを、内容が参照によってその全体を本明細書に組み入れられるＭｉｌｌｅｒ及びＮｉｃｋｏｌｏｆｆ（Ｍｉｌｌｅｒ及びＮｉｃｋｏｌｏｆｆ、１０５～１３頁）に見られる方法を用いて調製した、電気的コンピテント大腸菌Ｗ３１１０細胞中に形質転換した。
【0270】
１日目：大腸菌細胞４０μｌを、冷却したＢｉｏＲａｄ０．２ｃｍ電気穿孔キュベット中、ｐＫＯ３ ＤＮＡ（１０ｐｇ）１μｇと混合し、その後２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００Ωで電気穿孔した。２×ＰＹ１０００μｌを直ちに加え、３０℃のインキュベーター中で１時間、２５０ｒｐｍで振盪することによって細胞を回収した。細胞を２×ＰＹ中１／１０に段階希釈し、その後１００μｌのアリコートを、クロラムフェニコール２０μｇを含み３０℃及び４３℃に予め温めた２×ＰＹ寒天平板上に塗抹した。平板を３０℃及び４３℃で一夜インキュベートした。
【0271】
２日目：３０℃で増殖させたコロニーの数により電気穿孔の効果が推定されたが、４３℃の増殖を生存したコロニーは潜在的な組入れ事象を表している。４３℃の平板から単一のコロニーを拾い、２×ＰＹ１０ｍｌ中に再懸濁した。この１００μｌを、ショ糖５％（ｗ／ｖ）を含み３０℃に予め温めた２×ＰＹ寒天平板上に塗抹して単一のコロニーを生成させた。平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【0272】
３日目：ここでコロニーは、潜在的な同時の脱組込み及びプラスミドキュアリング事象を表す。脱組込み及びキュアリング事象が増殖における初期に生じた場合、大部分のコロニー塊はクローンとなる。単一のコロニーを拾い、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌ又は５％（ｗ／ｖ）ショ糖のいずれかを含む２×ＰＹ寒天上にレプリカプレーティングした。平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【0273】
４日目：ショ糖上で増殖し、且つクロラムフェニコール上で死滅した両方のコロニーは、潜在的な染色体の置換及びプラスミドキュアリング事象を表している。これらを拾い、変異特異的なオリゴヌクレオチドでＰＣＲによってスクリーニングした。正確なサイズのＰＣＲ陽性のバンドを生じたコロニーを削除して、ショ糖５％（ｗ／ｖ）を含む２×ＰＹ寒天上で単一のコロニーを生成し、平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【0274】
５日目：ＰＣＲ陽性、クロラムフェニコール感受性、及びショ糖耐性の大腸菌の単一のコロニーを用いてグリセロール株、化学的コンピテント細胞を作製し、５’及び３’に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーとのＰＣＲ反応用のＰＣＲ鋳型として作用させて、Ｔａｑポリメラーゼを用いた直接ＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ生成物を生成した。
【0275】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位（配列番号２８）を含んでいるＴｓｐ遺伝子の領域をＰＣＲ増幅することによって、変異Ｔｓｐ遺伝子を有するゲノムＤＮＡの上首尾な修飾を確認するために細胞系統ＭＸＥ００１を試験した。次いで、変異遺伝子における天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位の存在を確認するために、ＡｓｅＩ制限酵素でのインキュベートの前及び後に、ＤＮＡの増幅した領域をゲル電気泳動によって分析した。この方法を以下の通り行った。
【0276】
以下のオリゴを用いて、ＰＣＲを用い、ＭＸＥ００１及びＷ３１１０から調製した大腸菌細胞可溶化物からゲノムＤＮＡを増幅した。
【化1】
【0277】
細胞のコロニー１個を、１×ＰＣＲバッファー２０μｌ中９５℃で１０分間加熱することによって、可溶化物を調製した。混合物を室温に放冷し、次いで１３２００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、「細胞可溶化物」のラベルを付けた。
【0278】
Ｔｓｐオリゴヌクレオチド対を用いて各系統を増幅した。
【0279】
ＤＮＡを標準のＰＣＲ手順を用いて増幅した。
５μｌ バッファー×１ （Ｒｏｃｈｅ）
１μｌ ｄＮＴＰ混合物（Ｒｏｃｈｅ、１０ｍＭ混合物）
１．５μｌ ５’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
１．５μｌ ３’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
２μｌ 細胞可溶化物
０．５μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ ５Ｕ／μｌ）
３８．５μｌ Ｈ２Ｏ
ＰＣＲサイクル
９４℃ １分
９４℃ １分
５５℃ １分（３０サイクル繰返し）
７２℃ １分
７２℃ １０分
５μｌ バッファー×１ （Ｒｏｃｈｅ）
１μｌ ｄＮＴＰ混合物（Ｒｏｃｈｅ、１０ｍＭ混合物）
１．５μｌ ５’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
１．５μｌ ３’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
２μｌ 細胞可溶化物
０．５μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ ５Ｕ／μｌ）
３８．５μｌ Ｈ２Ｏ
ＰＣＲサイクル
９４℃ １分
９４℃ １分
５５℃ １分（３０サイクル繰返し）
７２℃ １分
７２℃ １０分
【0280】
反応が完了したら２５μｌをＡｓｅＩでの消化用に新たな微量遠心管に移した。ＰＣＲ反応２５μｌに、Ｈ２Ｏ１９μｌ、バッファー３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））５μｌ、ＡｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））１μｌを加え、混合し、３７℃で２時間インキュベートした。
【0281】
残りのＰＣＲ反応に、ローディングバッファー（×６）５μｌを加え、２０μｌを０．８％ＴＡＥ２００ｍｌアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））上にローディングし、エチジウムブロマイド（貯蔵液１０ｍｌ／ｍｌを５μｌ）を加え、１００Ｖで１時間泳動させた。サイズマーカー（ＰｅｒｆｅｃｔＤＮＡマーカー０．１～１２ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））１０μｌを最終レーンにローディングした。
【0282】
ＡｓｅＩ消化が完了したら、ローディングバッファー（×６）１０μｌを加え、２０μｌを０．８％ＴＡＥアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））上にローディングし、エチジウムブロマイド（１０ｍｌ／ｍｌ貯蔵液を５μｌ）を加え、１００Ｖで１時間泳動した。サイズマーカー（ＰｅｒｆｅｃｔＤＮＡマーカー０．１～１２ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））１０μｌを最終レーンにローディングした。ゲルを両方ともＵＶトランスイルミネーターを用いて可視化した。
【0283】
増幅したゲノムフラグメントは、Ｔｓｐに対して２．８ｋｂの正確なサイズバンドを示した。引き続きＡｓｅＩで消化させると、Ｔｓｐ欠損系統ＭＸＥ００１に導入されたＡｓｅＩ部位の存在が確認されたが、Ｗ３１１０コントロールでは確認されなかった。
【0284】
ＭＸＥ００１：Ｔｓｐプライマーセットを用いてゲノムＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡをＡｓｅＩで消化して２．２ｋｂｐｓ及び０．６ｋｂｐｓのバンドを生成した。
【0285】
Ｗ３１１０のＰＣＲ増幅したＤＮＡは、ＡｓｅＩ制限酵素によって消化されなかった。
【0286】
（例２）
変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞系統、並びに変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞系統の生成
ｓｐｒ変異を、相補性アッセイを用いて生成し選択した。
変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞系統、並びに変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞系統の生成
ｓｐｒ変異を、相補性アッセイを用いて生成し選択した。
【0287】
ｓｐｒ遺伝子（配列番号２３）を、１０００ｂｐあたり１つから２つの変異を導入するＣｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）ランダム変異ダイバーシティＰＣＲキットを用いて変異させた。変異ｓｐｒＰＣＲ ＤＮＡを、ｓｐｒ変異体と一緒にＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を発現する誘導発現ベクター（ＷＯ０１／９４５８５に記載のような）［ｐＴＴＯ ＣＤＰ８７０］中にクローニングした。次いで、このライゲーションを、Ｍｉｌｌｅｒら（Ｍｉｌｌｅｒ及びＮｉｃｋｏｌｏｆｆ、１０５～１３頁）において見られる方法を用いて、Ｔｓｐの欠失のあるバリアント（ΔＴｓｐ）を含む大腸菌系統（ＭＸＥ００１と呼ばれる）中に電気的形質転換した。以下のプロトコールを用いた。電気的コンピテントＭＸＥ００１ ４０μｌ、ライゲーション２．５μｌ（ＤＮＡ１００ｐｇ）を０．２ｃｍ電気穿孔キュベット中に加え、以下の条件、２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００ΩでＢｉｏＲａｄ（登録商標）Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（登録商標）を用いて電気的形質転換を行った。電気的形質転換後、Ｓ．ＯＣ．培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）カタログ：１８０４５～０８８）１ｍｌ（３７℃に予め加温）を加え、穏やかに振盪して細胞を３７℃１時間回復させた。
【0288】
細胞をＨｙｐｏｔｏｎｉｃ寒天［酵母菌抽出物５ｇ／Ｌ、トリプトン２．５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ（全てＤｉｆｃｏ（登録商標）］上に塗抹し、４０℃でインキュベートした。コロニーを形成した細胞をＨＬＢ上に４３℃で再塗抹し、ＭＸＥ００１系統に対して低浸透圧条件下高温で増殖する能力の回復を確認した。選択したクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、配列決定してｓｐｒ変異を同定した。
【0289】
この方法を用いて、ｓｐｒタンパク質における、以下の通りΔＴｓｐ表現型を補足する８つの単一の変異、１つのダブル変異、及び２つの複数の変異を単離した：
１．Ｖ９８Ｅ
２．Ｄ１３３Ａ
３．Ｖ１３５Ｄ
４．Ｖ１３５Ｇ
５．Ｇ１４７Ｃ
６．Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ
７．Ｉ７０Ｔ
８．Ｎ３１Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、Ｇ１４０Ｃ
９．Ｒ６２Ｃ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１４４Ｃ
１０．Ｌ１０８Ｓ
１１．Ｌ１３６Ｐ
１．Ｖ９８Ｅ
２．Ｄ１３３Ａ
３．Ｖ１３５Ｄ
４．Ｖ１３５Ｇ
５．Ｇ１４７Ｃ
６．Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ
７．Ｉ７０Ｔ
８．Ｎ３１Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、Ｇ１４０Ｃ
９．Ｒ６２Ｃ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１４４Ｃ
１０．Ｌ１０８Ｓ
１１．Ｌ１３６Ｐ
【0290】
上記で同定した１から５の個々の変異、並びにｓｐｒ（Ｃ９４Ａ、Ｈ１４５Ａ、Ｈ１５７Ａ）及びＷ１７４Ｒの３つの触媒三残基の変異を用いて、複合のΔＴｓｐ／変異体ｓｐｒ系統を作製するための例１からのｓｐｒ変異系統又はＭＸＥ００１系統を作り出すために、いずれかの野生型Ｗ３１１０大腸菌系統（遺伝子型：Ｆ－ＬＡＭ－ＩＮ（ｒｒｎＤ－ＲＲｎＥ）１ｒｐｈ１（ＡＴＣＣカタログｎｏ．２７３２５）を用いて新たな系統を生成した。
【0291】
ＭＸＥ００１を作製するための例１に記載した通り、遺伝子置換ベクター系を用いて、ｐＫＯ３相同組換え／置換プラスミドを用いて、以下の変異体の大腸菌細胞系統を作製した（Ｌｉｎｋら、上述）。
【表1】
【0292】
変異体ｓｐｒ組入れカセットを、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ制限フラグメントとして、同様に制限したｐＫＯ３プラスミド中に移動した。
【0293】
全ての実験では、大腸菌細胞系Ｗ３１１０が、野生型細胞系及び大腸菌細胞系Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ（ＭＸ０１６）として使用された。
【0294】
（例３）
抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’及びＤｓｂＣ発現用のプラスミドの生成
抗ＣＤ１５４Ｆａｂ（それぞれ配列番号１３及び１１）の重鎖及び軽鎖配列の両方、並びにＤｓｂＣをコードする配列（配列番号２７）を含んでいるプラスミドを構築した。
抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’及びＤｓｂＣ発現用のプラスミドの生成
抗ＣＤ１５４Ｆａｂ（それぞれ配列番号１３及び１１）の重鎖及び軽鎖配列の両方、並びにＤｓｂＣをコードする配列（配列番号２７）を含んでいるプラスミドを構築した。
【0295】
抗ＣＤ１５４Ｆａｂ及びＤｓｂＣ（ペリプラズムポリペプチド）に対する発現ベクターであるプラスミドｐＭＸＥ３５１（ｐＴＴＯＤ＿ＤｓｂＣ）を、従来の制限クローニング法を用いて構築した。プラスミドｐＭＸＥ３５１は以下の特徴：強力なｔａｃプロモーター及びｌａｃオペレーター配列を含んでいた。図１に示す通り、プラスミドは独特のＥｃｏＲＩ制限部位をＦａｂ’重鎖のコード領域の後に含んでおり、その後に非コード配列、次いで独特のＮｄｅＩ制限部位が続いた。ＤｓｂＣ遺伝子を、Ｗ３１１０粗製染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲクローニングした。ＥｃｏＲＩ部位は、ＰＣＲ産物が５’ＥｃｏＲＩ部位に続いて強リボソーム結合部位、続いてＤｓｂＣの天然の開始コドン、シグナル配列及び成熟配列、最後にＣ末端Ｈｉｓタグと最終的に非コードＮｄｅＩ部位をコードするようにＰＣＲオーバーラップ伸長により野生型ＤｓｂＣ配列から取り除かれた。ＥｃｏＲＩ－ＮｄｅｌＩ ＰＣＲフラグメントを制限し、３個全てのポリペプチド：Ｆａｂ’軽鎖、Ｆａｂ’重鎖、及びＤｓｂＣが単一のポリシストロン性のｍＲＮＡ上にコードされるように発現ベクター中にライゲートした。
【0296】
Ｆａｂ軽鎖、重鎖遺伝子、及びＤｓｂＣ遺伝子を、単一のポリシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌のペリプラズムに対するポリペプチドの転移を指示する大腸菌ＯｍｐＡタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを軽鎖及び重鎖の遺伝子配列両方の５’末端に融合した。転写を二重転写ターミネーターｒｒｎＢ ｔｌｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は構成的に発現されるＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって抑制解除が誘導されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はｐ１５Ａであり、これは低コピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質選択用にテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいた。
【0297】
（例４）
大腸菌Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１６（大腸菌Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）における変異細胞系における抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現
大腸菌Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａにおける抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現
大腸菌Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ細胞系統（ＭＸＥ０１６）は、例３において作製されたプラスミドｐＭＸＥ３５１で形質転換された。前記系統の形質転換は、Ｃｈｕｎｇ Ｃ．Ｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｕｎｇ，Ｎｉｅｍｅｌａ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ２１７２～７５頁）に見られる方法を使用して実施された。
大腸菌Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１６（大腸菌Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ）における変異細胞系における抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現
大腸菌Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａにおける抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現
大腸菌Ｗ３１１０ΔＴｓｐ、ｓｐｒＣ９４Ａ細胞系統（ＭＸＥ０１６）は、例３において作製されたプラスミドｐＭＸＥ３５１で形質転換された。前記系統の形質転換は、Ｃｈｕｎｇ Ｃ．Ｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｕｎｇ，Ｎｉｅｍｅｌａ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ２１７２～７５頁）に見られる方法を使用して実施された。
【0298】
大腸菌Ｗ３１１０における抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’の発現
大腸菌Ｗ３１１０細胞系統を、抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’に対する発現ベクターであるプラスミドｐＴＴＯＤで形質転換したが、この発現ベクターは、従来の制限クローニング法を用いて構築されたものである。プラスミドｐＴＴＯＤは以下の特徴：強力なｔａｃプロモーター及びｌａｃオペレーター配列を含んでいた。Ｆａｂ軽鎖及び重鎖遺伝子を、単一のジシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌ＯｍｐＡタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、ポリペプチドの大腸菌ペリプラズムへの移動を指示する軽鎖及び重鎖両方の遺伝子配列５’末端に融合させた。転写を二重転写ターミネーターｒｒｎＢ ｔｌｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は構成的に発現されるＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって抑制解除が誘導されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はｐ１５Ａであり、低コピー数を維持した。前記プラスミドは、抗生物質選択のためにテトラサイクリン耐性遺伝子を含有していた。前記系統の形質転換は、Ｃｈｕｎｇ Ｃ．Ｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｕｎｇ，Ｎｉｅｍｅｌａ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ２１７２～７５頁）に見られる方法を使用して実施された。
大腸菌Ｗ３１１０細胞系統を、抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’に対する発現ベクターであるプラスミドｐＴＴＯＤで形質転換したが、この発現ベクターは、従来の制限クローニング法を用いて構築されたものである。プラスミドｐＴＴＯＤは以下の特徴：強力なｔａｃプロモーター及びｌａｃオペレーター配列を含んでいた。Ｆａｂ軽鎖及び重鎖遺伝子を、単一のジシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌ＯｍｐＡタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、ポリペプチドの大腸菌ペリプラズムへの移動を指示する軽鎖及び重鎖両方の遺伝子配列５’末端に融合させた。転写を二重転写ターミネーターｒｒｎＢ ｔｌｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は構成的に発現されるＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって抑制解除が誘導されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はｐ１５Ａであり、低コピー数を維持した。前記プラスミドは、抗生物質選択のためにテトラサイクリン耐性遺伝子を含有していた。前記系統の形質転換は、Ｃｈｕｎｇ Ｃ．Ｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｕｎｇ，Ｎｉｅｍｅｌａ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ２１７２～７５頁）に見られる方法を使用して実施された。
【0299】
（例５）
高密度発酵を用いた変異大腸菌系統の増殖及び変異大腸菌系統における抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’の発現
例４において生成した系統を、抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’の増殖及び発現を比べる発酵実験において試験した。
高密度発酵を用いた変異大腸菌系統の増殖及び変異大腸菌系統における抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’の発現
例４において生成した系統を、抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’の増殖及び発現を比べる発酵実験において試験した。
【0300】
増殖培地、接種及び発酵ステップ。発酵工程は、細胞バンクのバイアルから接種材料を調製し、生成発酵槽の播種前にいくつかの前培養段階（フラスコ及び反応器）を通じて増殖させることにより開始される。生成発酵槽では、細胞はバッチ及びフェドバッチモードで限定培地において高密度まで増殖される。目的の細胞密度に到達すると、Ｆａｂ’の発現がＩＰＴＧの添加により誘導される。Ｆａｂ’発現は大腸菌ペリプラズム空間に標的され、前記空間でＦａｂ’は誘導期を通じて蓄積する。炭素源供給は誘導期の間適用されて発現及び細胞増殖を制御する。温度、溶存酸素（ｐＯ２）及びｐＨは、最適培養条件内に培養を維持するように制御される。
【0301】
バイオマス濃度及び増殖速度の測定
６００ｎｍでの培養物の光学密度を測定することによってバイオマス濃度を決定した。
６００ｎｍでの培養物の光学密度を測定することによってバイオマス濃度を決定した。
【0302】
ペリプラズム抽出
細胞を、遠心分離によって培養物試料から回収した。さらなる分析用に上清の分画を（－２０℃で）保持した。細胞ペレット分画を、抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、元の培養体積に再懸濁した。およそ１０～１６時間、６０℃でインキュベートした後、遠心分離によって抽出物を澄明にし、上清分画を分析用に（－２０℃で）新しく使用するか保持した。
細胞を、遠心分離によって培養物試料から回収した。さらなる分析用に上清の分画を（－２０℃で）保持した。細胞ペレット分画を、抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、元の培養体積に再懸濁した。およそ１０～１６時間、６０℃でインキュベートした後、遠心分離によって抽出物を澄明にし、上清分画を分析用に（－２０℃で）新しく使用するか保持した。
【0303】
Ｆａｂ’定量
ペリプラズム抽出物及び培養物上清中のＦａｂ’濃度を、Ｆａｂ’によって、タンパク質Ｇ ＨＰＬＣを用いて決定した。ＨｉＴｒａｐ（登録商標）タンパク質Ｇ ＨＰ１ｍｌカラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標）又は同等物）に分析物（およそ中性のｐＨ、３０℃、０．２μｍろ過）を２ｍｌ／分でローディングし、カラムを２０ｍＭリン酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、次いで５０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７の注入を用いてＦａｂ’を溶出した。溶出されたＦａｂ’をＡｇｉｌｉｅｎｔ（登録商標）１１００又は１２００ＨＰＬＣシステム上Ａ２８０によって測定し、既知濃度の精製Ｆａｂ’タンパク質の検量線を参照することによって定量した。
ペリプラズム抽出物及び培養物上清中のＦａｂ’濃度を、Ｆａｂ’によって、タンパク質Ｇ ＨＰＬＣを用いて決定した。ＨｉＴｒａｐ（登録商標）タンパク質Ｇ ＨＰ１ｍｌカラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標）又は同等物）に分析物（およそ中性のｐＨ、３０℃、０．２μｍろ過）を２ｍｌ／分でローディングし、カラムを２０ｍＭリン酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、次いで５０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７の注入を用いてＦａｂ’を溶出した。溶出されたＦａｂ’をＡｇｉｌｉｅｎｔ（登録商標）１１００又は１２００ＨＰＬＣシステム上Ａ２８０によって測定し、既知濃度の精製Ｆａｂ’タンパク質の検量線を参照することによって定量した。
【0304】
（例６）
変異大腸菌系統の発酵抽出物中の軽鎖フラグメントのレベル
例２に提示されている発酵物を、ペリプラズム抽出物中の抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’の軽鎖フラグメントレベルについて試験した。
変異大腸菌系統の発酵抽出物中の軽鎖フラグメントのレベル
例２に提示されている発酵物を、ペリプラズム抽出物中の抗ＣＤ１５４Ｆａｂ’の軽鎖フラグメントレベルについて試験した。
【0305】
軽鎖フラグメント定量。Ｆａｂ’及びＦａｂ’タンパク質分解フラグメントのレベルの定量的評価は、高温逆相ＨＰＬＣにより達成した。分離は、温度８０℃でＰｏｒｏｓｈｅｌｌ（登録商標）３００ＳＢ－Ｃ８逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、製品番号６６０７５０－９０６）上で実施する。平衡溶媒はＨＰＬＣ水、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡであり、溶出溶媒は８０対２０（ｖ／ｖ）１－プロパノール対アセトニトリル、０．０３％（ｖ／ｖ）ＴＦＡである。分離は、流速２．０ｍＬ／分、１６～３８％溶媒Ｂの直線勾配を用いて４．４分で実施する。検出は２１４ｎｍでのＵＶ吸光度によった。データは手動積分により処理し、Ｆａｂタンパク質分解フラグメントの量は無傷のＦａｂピークに対する％ピーク面積として表した。
【0306】
本発明は、本発明の方法により生成される抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む治療用又は診断用組成物も提供する。
【0307】
本発明は、本発明の方法により生成される抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に混合することを含む、治療用又は診断用組成物の調製のための方法も提供する。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
ａ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド
を含む組換えグラム陰性細菌細胞。
［態様２］
ＤｓｂＣがＮ末端又はＣ末端でヒスチジンタグを含む、態様１に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様３］
発現ベクターが配列番号４５又は配列番号５１で与えられる配列を有するポリヌクレオチドを含む、態様１又は２に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様４］
抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＣＤＲＨ１では配列番号１、ＣＤＲＨ２では配列番号２及びＣＤＲＨ３では配列番号３で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン並びにＣＤＲＬ１では配列番号４、ＣＤＲＬ２では配列番号５及びＣＤＲＬ３では配列番号６で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む可変ドメイン軽鎖を含む、態様１から３までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様５］
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドが、配列番号８で与えられる軽鎖可変領域配列及び配列番号１０で与えられる重鎖可変領域を含む抗体をコードする、態様４に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様６］
抗体がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントである、態様１から５までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様７］
前記Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントが、配列番号１２で与えられる配列を有する軽鎖及び配列番号１４又は１６で与えられる配列を有する重鎖を含む、態様６に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様８］
グラム陰性菌細胞が、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含む第一の発現ベクター及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む第二の発現ベクターを含む、態様１から７までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様９］
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターが、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドをさらに含む、態様１から７までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１０］
野生型細胞と比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有しており、変化したｓｐｒタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む、態様１から９までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１１］
Ｔｓｐをコードするポリヌクレオチドがノックアウト変異を含み、変化したｓｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドがアミノ酸Ｃ９４に影響を与える変異を含む、態様１０に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１２］
変化したｓｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド内の変異により、９４位でアミノ酸システインからアラニンへの変化（Ｃ９４Ａ）が生じている、態様１１に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１３］
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド以外は、細胞が野生型細菌細胞に対して同質遺伝子的である、態様１から１２までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１４］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、態様１から１３までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１５］
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するためのジシストロン性メッセージを含み、上流シストロンが前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含有し、下流シストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含有し、ジシストロン性メッセージがＩＧＳ１（配列番号３３）、ＩＧＳ２（配列番号３４）、ＩＧＳ３（配列番号３５）及びＩＧＳ４（配列番号３６）から選択される配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
［態様１６］
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントが、態様４から７までのいずれか一項に記載の通りである、態様１５に記載の発現ベクター。
［態様１７］
ＤｓｂＣが態様２又は３に記載の通りである、態様１５又は１６に記載の発現ベクター。
［態様１８］
態様１５から１７までのいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、態様１から１４までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１９］
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するための方法であって、
ａ）態様１から１４まで又は１８のいずれか一項に記載の組換えグラム陰性細菌細胞を培養培地中、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに効果的な条件下で培養するステップと、
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを、組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップと
を含む上記方法。
［態様２０］
前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端終端の又は近くのアミノ酸にエフェクター分子を結合させるステップをさらに含む、態様１９に記載の方法。
［態様２１］
エフェクター分子がポリ（エチレングリコール）又はメトキシポリ（エチレングリコール）を含む、態様２０に記載の方法。
［態様２２］
前記方法が、前記重鎖のＣ末端終端のシステイン残基のうちの１つに、リシル－マレイミド基を結合させるステップを含み、リシル残基のそれぞれのアミノ基が約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を共有結合させている、態様２１に記載の方法。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
ａ）ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド
を含む組換えグラム陰性細菌細胞。
［態様２］
ＤｓｂＣがＮ末端又はＣ末端でヒスチジンタグを含む、態様１に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様３］
発現ベクターが配列番号４５又は配列番号５１で与えられる配列を有するポリヌクレオチドを含む、態様１又は２に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様４］
抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＣＤＲＨ１では配列番号１、ＣＤＲＨ２では配列番号２及びＣＤＲＨ３では配列番号３で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン並びにＣＤＲＬ１では配列番号４、ＣＤＲＬ２では配列番号５及びＣＤＲＬ３では配列番号６で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む可変ドメイン軽鎖を含む、態様１から３までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様５］
前記１つ又は複数のポリヌクレオチドが、配列番号８で与えられる軽鎖可変領域配列及び配列番号１０で与えられる重鎖可変領域を含む抗体をコードする、態様４に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様６］
抗体がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントである、態様１から５までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様７］
前記Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントが、配列番号１２で与えられる配列を有する軽鎖及び配列番号１４又は１６で与えられる配列を有する重鎖を含む、態様６に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様８］
グラム陰性菌細胞が、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含む第一の発現ベクター及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む第二の発現ベクターを含む、態様１から７までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様９］
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターが、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドをさらに含む、態様１から７までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１０］
野生型細胞と比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有しており、変化したｓｐｒタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む、態様１から９までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１１］
Ｔｓｐをコードするポリヌクレオチドがノックアウト変異を含み、変化したｓｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドがアミノ酸Ｃ９４に影響を与える変異を含む、態様１０に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１２］
変化したｓｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド内の変異により、９４位でアミノ酸システインからアラニンへの変化（Ｃ９４Ａ）が生じている、態様１１に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１３］
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド以外は、細胞が野生型細菌細胞に対して同質遺伝子的である、態様１から１２までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１４］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、態様１から１３までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１５］
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及びＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するためのジシストロン性メッセージを含み、上流シストロンが前記抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含有し、下流シストロンが対応する重鎖をコードするＤＮＡを含有し、ジシストロン性メッセージがＩＧＳ１（配列番号３３）、ＩＧＳ２（配列番号３４）、ＩＧＳ３（配列番号３５）及びＩＧＳ４（配列番号３６）から選択される配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
［態様１６］
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントが、態様４から７までのいずれか一項に記載の通りである、態様１５に記載の発現ベクター。
［態様１７］
ＤｓｂＣが態様２又は３に記載の通りである、態様１５又は１６に記載の発現ベクター。
［態様１８］
態様１５から１７までのいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、態様１から１４までのいずれか一項に記載のグラム陰性細菌細胞。
［態様１９］
ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成するための方法であって、
ａ）態様１から１４まで又は１８のいずれか一項に記載の組換えグラム陰性細菌細胞を培養培地中、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに効果的な条件下で培養するステップと、
ｂ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを、組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップと
を含む上記方法。
［態様２０］
前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端終端の又は近くのアミノ酸にエフェクター分子を結合させるステップをさらに含む、態様１９に記載の方法。
［態様２１］
エフェクター分子がポリ（エチレングリコール）又はメトキシポリ（エチレングリコール）を含む、態様２０に記載の方法。
［態様２２］
前記方法が、前記重鎖のＣ末端終端のシステイン残基のうちの１つに、リシル－マレイミド基を結合させるステップを含み、リシル残基のそれぞれのアミノ基が約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を共有結合させている、態様２１に記載の方法。
【0308】
本発明を、好ましい実施形態を参照にして特に示し、記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定される通り、本発明の範囲から逸脱することなしに形態及び詳細において様々な変更を行うことができることが理解されよう。
参考文献リスト
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】