特許 7063811 活性炭を用いた蛋白質の精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-25

(45)【発行日】2022-05-09

(54)【発明の名称】活性炭を用いた蛋白質の精製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20220426BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220426BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22

C07K16/00

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2018537398

(86)(22)【出願日】2017-08-31

(86)【国際出願番号】 JP2017031366

(87)【国際公開番号】W WO2018043645

(87)【国際公開日】2018-03-08

【審査請求日】2020-08-14

(31)【優先権主張番号】P 2016170265

(32)【優先日】2016-08-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001029

【氏名又は名称】協和キリン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】石原 尚

(72)【発明者】

【氏名】山田 剛士

(72)【発明者】

【氏名】菊池 信介

【審査官】鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１３－１８９４２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／０２４５１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／００５９６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／００５９６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１７－１３２７５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】BioProcess INTERNATIONAL，2015年10月，pp. 1-5，[検索日 2017.11.13], インターネット:<URL:https://www.entegris.com/content/dam/shared-product-assets/invue-concentration-monitors/article-comparison-concentration-measurement-technologies-bpi-1015.pdf>

【文献】J. Brew. Soc. Japan，1985年，Vol. 80, No. 2，pp. 143-146

【文献】J. Brew. Japan，Vol. 89, No. 2，pp. 162-164

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

活性炭を用いた蛋白質の精製方法であって、蛋白質含有水溶液の導電率を調整して得られる活性炭前処理液を活性炭に接触させ、非吸着モードで蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した目的の蛋白質を取得する精製方法であって、前記活性炭前処理液の導電率が０～１ｍＳ／ｃｍであり、前記活性炭前処理液に含まれる目的の蛋白質の濃度が５．５～２３ｍｇ／ｍＬである、精製方法。

【請求項2】

蛋白質含有水溶液を希釈、濃縮希釈または緩衝液置換して導電率を調整して得られる活性炭前処理液を用いる、請求項１に記載の精製方法。

【請求項3】

蛋白質含有水溶液に塩化ナトリウムを添加して導電率を調整して得られる活性炭前処理液を用いる、請求項１または２に記載の精製方法。

【請求項4】

更に活性炭前処理液を活性炭に接触させる負荷量および接触時間を調整する請求項１～３のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項5】

負荷量が０．１～０．３ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭で、かつ接触時間が８～２４時間である請求項４に記載の精製方法。

【請求項6】

負荷量が０．０５～０．１５ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭で、かつ接触時間が０．１～２４時間である請求項４に記載の精製方法。

【請求項7】

負荷量が０．０５～０．１５ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭で、かつ接触時間が２～２４時間である請求項４に記載の精製方法。

【請求項8】

活性炭前処理液を２以上の活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムに連続して通液する、請求項１～７のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項9】

活性炭前処理液を、活性炭膜または活性炭を充填したカラムに循環させることによって、連続的に活性炭に接触をさせる、請求項１～８のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項10】

蛋白質が天然または非天然の糖蛋白質である、請求項１～９のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項11】

糖蛋白質が抗体である、請求項１０に記載の精製方法。

【請求項12】

蛋白質がＰＥＧ化蛋白質である、請求項１～９のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項13】

不純物が宿主細胞蛋白質、蛋白質由来の重合体、蛋白質由来の分解物、ＤＮＡおよびウイルスから選ばれる少なくとも１である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の精製方法を含む、蛋白質の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、活性炭を用いた蛋白質の精製方法および該精製方法を含む蛋白質の大量、効率的かつ安価な製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子組換え技術の発達によって、種々の蛋白質を有効成分とする医薬品が供給されるようになった。特に近年は数多くの抗体を有効成分とする医薬品が開発、上市されている。また、これら蛋白質を大量、効率的かつ安価に製造することは、バイオ医薬品産業にとってますます重要な問題となっている。

【0003】

このような蛋白質は、一般にその目的とする蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを挿入した組換え細胞を培養することによって産生される。その培養液には、目的とする蛋白質の他に、多種多様の培地由来成分、宿主細胞由来成分または蛋白質由来の副生成物等の不純物が含まれているため、医薬品として要求される純度まで不純物を分離し目的の蛋白質（以下、目的蛋白質とも略す）を精製することおよび目的の蛋白質の回収率を上げて大量、効率的かつ安価に製造することを両立させることは、非常に困難かつ挑戦的である。

【0004】

蛋白質の精製方法は、一般に異なるモードのクロマトグラフィーの組み合わせで行われる。クロマトグラフィーは、例えば、電荷、親水性の程度または分子の大きさ等に基づいて、目的の蛋白質と不純物を分離する。

【0005】

特に、目的の蛋白質が抗体である時は、プロテインＡまたはプロテインＧが抗体のＦｃ鎖などの特定部位に結合する性質を利用して、抗体の精製にプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーがクロマトグラフィーの１つとして使用される（特許文献１）。

【0006】

しかし、一般に使用されているプロテインＡアフィニティ担体は、イオン交換担体または疎水担体等に比べて非常に高価であり、工業的な医薬品製造等で大規模に抗体を精製する場合には、使用する担体量も膨大となることから、その結果、製造コストの増大が避けられない課題となっている。

【0007】

この課題を解決するために、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの代わりに幅広い非特異的な吸着特性と天然由来等による安価な素材として、化学品製造、食品製造、下水や排水の処理、浄水処理および低分子医薬品製造等の工業分野にて吸着剤または脱色剤等の用途で使用されている活性炭を用いる精製方法が知られている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】日本国特表平５－５０４５７９号公報

【文献】国際公開第２０１４／０２４５１４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

活性炭を用いた蛋白質の精製において、活性炭処理工程後の精製工程としては、イオン交換担体または疎水担体等が使用され、一般には目的の抗体を特異的にこれら担体に吸着させ、吸着した担体を洗浄することで不純物と分離し、最後に目的の抗体を担体から溶出する吸着モードを使用する。

【0010】

この際、洗浄および溶出に用いるバッファーは異なる為、クロマトグラフィー装置の大型化に伴って、バッファータンク等の付属する製造設備も大型化または複雑化する。更に操作も煩雑となる為、結果としてこれら全ての精製工程が製造コスト増大の要因となっている。従って、活性炭処理工程で出来るだけ不純物を除去し、後段の精製工程を削減することは製造コストを下げる上で重要である。

【0011】

上記のような理由で、従来の活性炭を用いた蛋白質の精製方法よりも不純物を効率的に分離でき、且つ目的の蛋白質の回収率を上げることによって活性炭処理工程後の精製工程を削減し、大量、効率的かつ安価な医薬品の製造を可能とする蛋白質の精製方法が求められている。

【0012】

したがって本発明は、従来の活性炭を用いた蛋白質の精製方法に比べて顕著に不純物を低減することが出来、且つ高回収率を達成する蛋白質の精製方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究をした結果、驚くべきことに、安価な活性炭を用いて非吸着モードにて蛋白質と不純物とを分離する際に、予め希釈、濃縮希釈若しくは緩衝液置換、または塩化ナトリウムの添加等により、蛋白質含有水溶液の導電率を調整した活性炭前処理液を活性炭処理することによって、各種不純物含量が顕著に低下した目的蛋白質を高収率に取得出来ることを見出し、本発明を完成した。

【0014】

本発明は以下（１）～（１７）に関する。
（１）活性炭を用いた蛋白質の精製方法であって、蛋白質含有水溶液の導電率を調整して得られる活性炭前処理液を活性炭に接触させ、非吸着モードで蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した目的の蛋白質を取得する精製方法。
（２）活性炭前処理液の導電率が０～５ｍＳ／ｃｍである（１）に記載の精製方法。
（３）活性炭前処理液の導電率が０～２ｍＳ／ｃｍである（１）に記載の精製方法。
（４）活性炭前処理液の導電率が０～１ｍＳ／ｃｍである（１）に記載の精製方法。
（５）蛋白質含有水溶液を希釈、濃縮希釈または緩衝液置換して導電率を調整して得られる活性炭前処理液を用いる、（１）～（４）のいずれか１に記載の精製方法。
（６）蛋白質含有水溶液に塩化ナトリウムを添加して導電率を調整して得られる活性炭前処理液を用いる、（１）～（５）のいずれか１に記載の精製方法。
（７）更に活性炭前処理液を活性炭に接触させる負荷量および接触時間を調整する（１）～（６）のいずれか１に記載の精製方法。
（８）負荷量が０．１～０．３ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭で、かつ接触時間が８～２４時間である（７）に記載の精製方法。
（９）負荷量が０．０５～０．１５ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭で、かつ接触時間が０．１～２４時間である（７）に記載の精製方法。
（１０）負荷量が０．０５～０．１５ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭で、かつ接触時間が２～２４時間である（７）に記載の精製方法。
（１１）活性炭前処理液を２以上の活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムに連続して通液する、（１）～（１０）のいずれか１に記載の精製方法。
（１２）活性炭前処理液を、活性炭膜または活性炭を充填したカラムに循環させることによって、連続的に活性炭に接触をさせる、（１）～（１１）のいずれか１に記載の精製方法。
（１３）蛋白質が天然または非天然の糖蛋白質である、（１）～（１２）のいずれか１に記載の精製方法。
（１４）糖蛋白質が抗体である、（１３）に記載の精製方法。
（１５）蛋白質がＰＥＧ化蛋白質である、（１）～（１２）のいずれか１に記載の精製方法。
（１６）不純物が宿主細胞蛋白質、蛋白質由来の重合体、蛋白質由来の分解物、ＤＮＡおよびウイルスから選ばれる少なくとも１である、（１）～（１５）のいずれか１に記載の精製方法。
（１７）（１）～（１６）のいずれか１に記載の精製方法を含む、蛋白質の製造方法。
（１８）更に陰イオン交換膜、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーから選ばれる少なくとも１を使用する、（１７）に記載の製造方法。
（１９）（１７）または（１８）に記載の製造方法により製造された蛋白質。

【発明の効果】

【0015】

本発明の蛋白質の精製方法は、活性炭を用いて非吸着モードにて蛋白質と不純物とを分離する際に、蛋白質含有水溶液の導電率を調整して得られる活性炭前処理液を活性炭処理することによって、従来の活性炭を用いた蛋白質の精製方法に比べて不純物を効率的に分離し、且つ活性炭に吸着する目的蛋白質の量を低減して高い回収率で目的蛋白質を取得することが出来る。

【0016】

本発明により、特に抗体の精製において、従来の蛋白質の精製方法より製造コストの低減または労力の軽減が可能であり、且つ従来の蛋白質の精製方法と同等以上の不純物との分離特性を有する蛋白質の精製方法、該精製方法を含む蛋白質の製造方法が提供される。本発明の製造方法により製造された蛋白質は、医薬品として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、活性炭添加量と活性炭処理後の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度の関係について示す。横軸は活性炭添加量（ｍｇ）、縦軸はＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍＬ）の対数値を示す。黒ひし形はＭａｂ Ａを含むｐＨ調整清澄化液、黒三角はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液、×はＭａｂ Ｄを含むｐＨ調整清澄化液、＊はＭａｂ Ｅを含むｐＨ調整清澄化液を処理した結果を示す。

【図2】図２は、活性炭添加量と活性炭処理後の蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量の関係について示す。横軸は活性炭添加量（ｍｇ）、縦軸はＬＭＷｓ含量（％）を示す。黒ひし形はＭａｂ Ａを含むｐＨ調整清澄化液、黒三角はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液、×はＭａｂ Ｄを含むｐＨ調整清澄化液、＊はＭａｂ Ｅを含むｐＨ調整清澄化液を処理した結果を示す。

【図3】図３は、活性炭添加量と活性炭処理後の抗体濃度の関係について示す。横軸は活性炭添加量（ｍｇ）、縦軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。黒ひし形はＭａｂ Ａを含むｐＨ調整清澄化液、黒三角はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液、×はＭａｂ Ｄを含むｐＨ調整清澄化液、＊はＭａｂ Ｅを含むｐＨ調整清澄化液を処理した結果を示す。

【図4】図４は、各負荷量において、活性炭前処理液の希釈が回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。黒色は活性炭前処理液を希釈しなかった結果、白色は希釈した結果を示す。

【図5】図５は、各負荷量において、活性炭前処理液の希釈が宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。黒色は活性炭前処理液を希釈しなかった結果、白色は希釈した結果を示す。

【図6】図６は、各負荷量において、活性炭前処理液の希釈が、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。黒色は活性炭前処理液を希釈しなかった結果、白色は希釈した結果を示す。

【図7】図７は、各負荷量において、活性炭前処理液の希釈が蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。黒色は活性炭前処理液を希釈しなかった結果、白色は希釈した結果を示す。

【図8】図８は、活性炭前処理液の濃縮希釈が、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。

【図9】図９は、活性炭前処理液の濃縮希釈が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。濃縮希釈を行って際のＨＣＰ濃度は、濃縮希釈倍率を考慮して補正を行った。

【図10】図１０は、活性炭前処理液の濃縮希釈が、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。

【図11】図１１は、活性炭前処理液の濃縮希釈が、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。

【図12】図１２は、活性炭前処理液の導電率が、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。縦軸はＣ／Ｃ_０、横軸に導電率（ｍＳ／ｃｍ）を示す。

【図13】図１３は、活性炭前処理液の導電率が、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＨＭＷｓ含量（％）、横軸は導電率（ｍＳ／ｃｍ）を示す。

【図14】図１４は、活性炭前処理液の導電率が、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＬＭＷｓ含量（％）、横軸は導電率（ｍＳ／ｃｍ）を示す。

【図15】図１５は、活性炭前処理液の導電率が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。縦軸はＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍｇ－Ｐ）、横軸は導電率（ｍＳ／ｃｍ）を示す。

【図16】図１６は、活性炭前処理液に添加した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。縦軸はＣ／Ｃ_０、横軸はＮａＣｌ濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を示す。

【図17】図１７は、活性炭前処理液に添加した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＨＭＷｓ含量（％）、横軸はＮａＣｌ濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を示す。

【図18】図１８は、活性炭前処理液に添加した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＬＭＷｓ含量（％）、横軸はＮａＣｌ濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を示す。

【図19】図１９は、活性炭前処理液に添加した塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。縦軸はＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍｇ－Ｐ）、横軸はＮａＣｌ濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を示す。

【図20】図２０は、活性炭前処理液の抗体濃度が、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。縦軸はＣ／Ｃ_０、横軸は処理抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【図21】図２１は、活性炭前処理液の抗体濃度が、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＨＭＷｓ含量（％）、横軸は処理抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【図22】図２２は、活性炭前処理液の抗体濃度が、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＬＭＷｓ含量（％）、横軸は処理抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【図23】図２３は、活性炭前処理液の抗体濃度が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。縦軸はＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍｇ－Ｐ）、横軸は処理抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【図24】図２４は、活性炭処理時間が、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。縦軸はＣ／Ｃ_０、横軸は処理時間（ｈ）を示す。黒四角は負荷量０．０５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒ひし形は負荷量０．１ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒三角は負荷量０．１５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、×は負荷量０．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＊は負荷量０．２５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒丸は負荷量０．３ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＋は負荷量０．４ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白丸は負荷量０．８ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、－は負荷量１．６ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白ひし形は負荷量３．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭の結果を示す。

【図25】図２５は、活性炭処理時間が、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＨＭＷｓ（％）、横軸は処理時間（ｈ）を示す。黒四角は負荷量０．０５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒ひし形は負荷量０．１ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒三角は負荷量０．１５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、×は負荷量０．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＊は負荷量０．２５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒丸は負荷量０．３ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＋は負荷量０．４ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白丸は負荷量０．８ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、－は負荷量１．６ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白ひし形は負荷量３．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭の結果を示す。なお、活性炭処理前のＨＭＷｓは０．９３％である。また、負荷量１．６ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭で２４時間処理のＨＭＷｓは０．５１％、負荷量３．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭で２４時間処理のＨＭＷｓは０．５６％である。

【図26】図２６は、活性炭処理時間が、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。縦軸はＬＭＷｓ（％）、横軸は処理時間（ｈ）を示す。黒四角は負荷量０．０５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒ひし形は負荷量０．１ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒三角は負荷量０．１５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、×は負荷量０．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＊は負荷量０．２５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒丸は負荷量０．３ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＋は負荷量０．４ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白丸は負荷量０．８ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、－は負荷量１．６ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白ひし形は負荷量３．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭の結果を示す。なお、活性炭処理前のＬＭＷｓは１２．６６％である。また、負荷量０．８ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭で２４時間処理のＬＭＷｓは６．１２％、負荷量１．６ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭で２４時間処理のＬＭＷｓは１０．６０％、負荷量３．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭で２４時間処理のＬＭＷｓは１１．７２％である。

【図27】図２７は、活性炭処理時間が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。縦軸はＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍｇ－Ｐ）、横軸は処理時間（ｈ）を示す。黒四角は負荷量０．０５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒ひし形は負荷量０．１ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒三角は負荷量０．１５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、×は負荷量０．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＊は負荷量０．２５ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、黒丸は負荷量０．３ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、＋は負荷量０．４ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白丸は負荷量０．８ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、－は負荷量１．６ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭、白ひし形は負荷量３．２ｍｇ ｍａｂ／ｍｇ活性炭の結果を示す。なお、活性炭処理前のＨＣＰ濃度は３７４２８．０ ｎｇ／ｍｇ－Ｐである。

【図28】図２８は、活性炭前処理液の循環処理が、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。

【図29】図２９は、活性炭前処理液の循環処理が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。

【図30】図３０は、活性炭前処理液の循環処理が、ＤＮＡ濃度に与える影響について示す。

【図31】図３１は、活性炭種の違いが、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。黒はＭａｂ Ａを含むｐＨ調整清澄化液、白はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液、斜線はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液の結果を示す。

【図32】図３２は、活性炭種の違いが、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。黒はＭａｂ Ａを含むｐＨ調整清澄化液、白はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液、斜線はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液の結果を示す。

【図33】図３３は、活性炭種の違いが、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。

【図34】図３４は、活性炭種の違いが、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。黒はＭａｂ Ａを含むｐＨ調整清澄化液、白はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液、斜線はＭａｂ Ｃを含むｐＨ調整清澄化液の結果を示す。

【図35】図３５は、活性炭膜種の違いが、収率に与える影響について示す。

【図36】図３６は、活性炭膜種の違いが、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。

【図37】図３７は、活性炭膜種の違いが、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量に与える影響について示す。

【図38】図３８は、活性炭膜種の違いが、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。

【図39】図３９は、活性炭平均細孔径と宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度の関係について示す。

【図40】図４０は、活性炭平均細孔径と蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量の関係について示す。

【図41】図４１は、活性炭平均細孔径と蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量の関係について示す。

【図42】図４２は、ｐＨ調整に用いる酸種が、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）に与える影響について示す。

【図43】図４３は、ｐＨ調整に用いる酸種が、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量に与える影響について示す。黒は活性炭処理前の結果、白が活性炭処理後の結果を示す。

【図44】図４４は、ｐＨ調整に用いる酸種が、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）に与える影響について示す。黒は活性炭処理前の結果、白が活性炭処理後の結果を示す。

【図45】図４５は、ｐＨ調整に用いる酸種が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度に与える影響について示す。

【図46】図４６は、Ｍａｂ Ａを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）の工程収率および総収率を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセス（１）、斜線は活性炭プロセス（２）の結果を示す。横軸は収率（％）を示す。

【図47】図４７は、Ｍａｂ Ａを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）における各工程の蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセス（１）、斜線は活性炭プロセス（２）の結果を示す。横軸はＨＭＷｓ含量（％）を示す。

【図48】図４８は、Ｍａｂ Ａを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）における各工程の蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセス（１）、斜線は活性炭プロセス（２）の結果を示す。横軸はＬＭＷｓ含量（％）を示す。

【図49】図４９は、Ｍａｂ Ａを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）における各工程の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセス（１）、斜線は活性炭プロセス（２）の結果を示す。横軸はＨＣＰ濃度（ｐｇ／ｍｇ－Ｐ）の対数値を示す。※は定量限界未満を示す。

【図50】図５０は、Ｍａｂ Ａを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）における各工程のＤＮＡ濃度を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセス（１）、斜線は活性炭プロセス（２）の結果を示す。横軸はＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。※は定量限界未満を示す。※※は未測定結果である。

【図51】図５１は、Ｍａｂ Ａを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）における各工程の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析のＰｒｅ－ｐｅａｋ含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセス（１）、斜線は活性炭プロセス（２）の結果を示す。横軸はＰｒｅ－ｐｅａｋ含量（％）を示す。

【図52】図５２は、Ｍａｂ Ａを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）における各工程の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析のＰｏｓｔ－ｐｅａｋ含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセス（１）、斜線は活性炭プロセス（２）の結果を示す。横軸はＰｏｓｔ－ｐｅａｋ含量（％）を示す。

【図53】図５３は、Ｍａｂ Ｂを精製したプロテインＡプロセスおよび活性炭プロセスの工程収率を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセスの結果を示す。横軸は収率（％）を示す。

【図54】図５４は、Ｍａｂ Ｂを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセスにおける各工程の蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセスの結果を示す。横軸はＨＭＷｓ含量（％）を示す。

【図55】図５５は、Ｍａｂ Ｂを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセスにおける各工程の蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセスの結果を示す。横軸はＬＭＷｓ含量（％）を示す。

【図56】図５６は、Ｍａｂ Ｂを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセスにおける各工程の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセスの結果を示す。横軸はＨＣＰ濃度（ｐｇ／ｍｇ－Ｐ）の対数値を示す。※は定量限界未満を示す。

【図57】図５７は、Ｍａｂ Ｂを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセスにおける各工程のＤＮＡ濃度を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセスの結果を示す。横軸はＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。※は定量限界未満を示す。

【図58】図５８は、Ｍａｂ Ｂを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセスにおける各工程の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析のＰｒｅ－ｐｅａｋ含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセスの結果を示す。横軸はＰｒｅ－ｐｅａｋ含量（％）を示す。

【図59】図５９は、Ｍａｂ Ｂを精製したプロテインＡプロセス、活性炭プロセスにおける各工程の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析のＰｏｓｔ－ｐｅａｋ含量を示す。黒はプロテインＡプロセス、白は活性炭プロセスの結果を示す。横軸はＰｏｓｔ－ｐｅａｋ含量（％）を示す。

【図60】図６０は、Ｍａｂ Ｂを精製した活性炭プロセス（１）～（３）の収率を示す。黒は活性炭プロセス（１）、白は活性炭プロセス（２）、斜線は活性炭プロセス（３）の結果を示す。横軸は収率（％）を示す。

【図61】図６１は、Ｍａｂ Ｂを精製した活性炭プロセス（１）～（３）における各工程の蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量を示す。黒は活性炭プロセス（１）、白は活性炭プロセス（２）、斜線は活性炭プロセス（３）の結果を示す。横軸はＨＭＷｓ含量（％）を示す。

【図62】図６２は、Ｍａｂ Ｂを精製した活性炭プロセス（１）～（３）における各工程の蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量を示す。黒は活性炭プロセス（１）、白は活性炭プロセス（２）、斜線は活性炭プロセス（３）の結果を示す。横軸はＬＭＷｓ含量（％）を示す。

【図63】図６３は、Ｍａｂ Ｂを精製した活性炭プロセス（１）～（３）における各工程の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度を示す。黒は活性炭プロセス（１）、白は活性炭プロセス（２）、斜線は活性炭プロセス（３）の結果を示す。横軸はＨＣＰ濃度（ｐｇ／ｍｇ－Ｐ）の対数値を示す。※は定量限界未満を示す。

【図64】図６４は、Ｍａｂ Ｂを精製した活性炭プロセス（１）～（３）における各工程のＤＮＡ濃度を示す。黒は活性炭プロセス（１）、白は活性炭プロセス（２）、斜線は活性炭プロセス（３）の結果を示す。横軸はＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。※は定量限界未満を示す。

【図65】図６５は、ＥＰＯまたは改変ＥＰＯのｐＨと活性炭吸着率の関係を示す。縦軸は蛋白質吸着率（％）を示す。黒ひし形は特製白鷺を用いた結果、黒四角は白鷺Ｐを用いた結果、黒三角は白鷺ＤＯ－５を用いた結果を示す。

【図66】図６６は、Ｇ－ＣＳＦ、ＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ、またはＰＥＧ化ＴＰＯのｐＨと活性炭吸着率の関係を示す。縦軸は蛋白質吸着率（％）を示す。黒ひし形は特製白鷺を用いた結果、黒四角は白鷺Ｐを用いた結果、黒三角は白鷺ＤＯ－５を用いた結果を示す。

【図67】図６７は、宿主細胞由来蛋白質のｐＨと活性炭吸着率の関係を示す。縦軸は蛋白質吸着率（％）を示す。白ひし形は特製白鷺を用いた結果、黒四角は白鷺Ｐを用いた結果、白三角は白鷺ＤＯ－５を用いた結果を示す。

【図68】図６８は、複数枚に分割した活性炭膜の接続方法の違いと回収率の関係を示す。白が直列、黒が並列に活性炭膜を接続した場合の結果を示す。横軸は回収率（％）を示す。

【図69】図６９は、複数枚に分割した活性炭膜の接続方法の違いと蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）含量の関係を示す。斜線が活性炭処理前、白が直列、黒が並列に活性炭膜を接続した場合の結果を示す。横軸はＨＭＷｓ含量（％）を示す。

【図70】図７０は、複数枚に分割した活性炭膜の接続方法の違いと蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）含量の関係を示す。斜線が活性炭処理前、白が直列、黒が並列に活性炭膜を接続した場合の結果を示す。横軸はＬＭＷｓ含量（％）を示す。

【図71】図７１は、複数枚に分割した活性炭膜の接続方法の違いと宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度の関係を示す。斜線が活性炭処理前、白が直列、黒が並列に活性炭膜を接続した場合の結果を示す。横軸はＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍｇ－Ｐ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、活性炭を用いた蛋白質の精製方法であって、蛋白質含有水溶液の導電率を調整して得られる活性炭前処理液を活性炭に接触させ、非吸着モードで蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した目的の蛋白質を高回収率で取得する精製方法に関する。

【0019】

本発明における蛋白質としては、高分子量蛋白質が挙げられるが、その中でも修飾等により親水性が付与された蛋白質が好ましく、例えば、天然若しくは非天然の糖蛋白質または水溶性ポリマーで修飾された蛋白質が挙げられる。

【0020】

糖蛋白質としては、例えば、抗体、エリスロポエチン、改変エリスロポエチン、ダルベポエチン、またはアンチトロンビン（α体若しくはβ体、またはそれらの混合物）等が挙げられる。

【0021】

水溶性ポリマーで修飾された蛋白質とは、少なくとも１つの水溶性ポリマー分子が直接またはリンカー等を介して間接的に結合した蛋白質を示す。水溶性ポリマーしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）等が挙げられる。

【0022】

水溶性ポリマーで修飾された蛋白質としては、例えば、ペグフィルグラスチムを含むＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、またはＰＥＧ化トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＴＰＯ）等のＰＥＧ化蛋白質が挙げられる。

【0023】

抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が挙げられ、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。抗体の種類としては、例えば、マウス抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体若しくはそれらのＦｃ領域等を改変した抗体、一価抗体、バイスペシフィック抗体等の多重特異性抗体、またはその抗体断片等が挙げられる。抗体の分子型としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｃ－融合蛋白、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ’_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＤｂまたはｓｃＤｂＦｃ等が挙げられる。

【0024】

抗体としては、抗原結合性を有する抗体であればいかなるものでもよく、例えば、腫瘍関連抗原を認識する抗体またはその抗体断片、アレルギー若しくは炎症に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、ウイルス若しくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片等が挙げられる。

【0025】

抗原としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－ＤＣ、ｉｎｔｅｇｌｉｎ、ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（ＣＡ９）、ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ－ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１（ＣＦＲ－１）、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ－４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－１８、ＤＦ３、Ｅ－ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ－２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ １（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ８（ＦＧＦ８）、ＦＧＦ８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ １０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（ＦＺＤ－４）、Ｇ２５０、Ｇ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２またはＧＭ３等）、ｇｌｏｂｏ Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ－９－６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＢ－ＥＧＦ）、ＨＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ ａｎｔｉｇｅｎ（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ等）、ＨＭ１．２４、ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｆａｔｇｌｏｂｕｌｅ（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（例えば、ＩＬ－６またはＩＬ－１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＩＬ－６ＲまたはＩＬ－１５Ｒ等）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－４（ＩＲＴＡ－４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ １、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ－１、ｌａｍｐ－２、ｌａｍｉｎｉｎ－５、Ｌｅｗｉｓ ｙ、ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ－５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ－４（ＰＦ－４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５－１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－７２（ＴＡＧ－７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ－ｂｅｔａ、Ｔｈｙ－１、Ｔｉｅ－１、Ｔｉｅ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ １（ＴＩＭ－１）、Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ３（ＴＩＭ－３）、ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＤＲ４またはＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ ＡＳＣ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ－２、ＴＷＥＡＫ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｎ１４、ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３等）、ｖｉｍｅｎｔｉｎまたはＶＬＡ－４等が挙げられる。

【0026】

抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられる。

【0027】

腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＤ２抗体［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）、ＵＳ５７２５８５６］、抗ＣＤ５２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）］、抗ＭＡＧＥ抗体［Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９（２０００）］、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦ－８抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１（１９８９）］、抗ｂＦＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦ－８Ｒ抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５（１９９０）］、抗ＩＧＦ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＳＭＡ抗体［Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６（１９９８）］、抗ＶＥＧＦ抗体［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７，４５９３（１９９７）］、抗ＶＥＧＦＲ抗体［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８（２０００）、国際公開第９６／３００４６号］、抗ＣＤ２０抗体［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０，５４８（１９９８）、米国特許第５７３６１３７号明細書］、抗ＣＤ１０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体（国際公開第９６／４０２０１号）、抗Ａｐｏ－２Ｒ抗体（国際公開第９８／５１７９３号）、抗ＡＳＣＴ２抗体（国際公開第２０１０／００８０７５号）、抗ＣＥＡ抗体［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（２３ ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ－５９４５ｓ（１９９５）］、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗Ａ３３抗体等が挙げられる。

【0028】

アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗インターロイキン１０抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［Ｌｙｍｐｈ．Ｃｙｔｏ．Ｒｅｓ．，１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６（１９９９）］、抗ケモカイン抗体［Ｐｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９（１９９４）］または抗ケモカイン受容体抗体［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３（１９９７）］等が挙げられる。

【0029】

循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００（１９９７）］、抗血液凝固因子抗体［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８（２０００）］、抗ＩｇＥ抗体、抗αＶβ３抗体またはα４β７抗体等が挙げられる。

【0030】

ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ｇｐ１２０抗体［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６（１９９９）］等が挙げられる。

【0031】

Ｆｃ－融合蛋白としては、例えば、ロムプラスミチム等が挙げられる。

【0032】

本発明の精製方法には、目的とする蛋白質および不純物を含む蛋白質含有水溶液が供される。

【0033】

蛋白質含有水溶液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿など生体から得られる水溶液、遺伝子組換え技術若しくは細胞融合技術を用いて得られる蛋白質を生産する細胞若しくは大腸菌等の菌類を培地中で培養して得られる培養液からなる水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られる水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られる水溶液、または糖、糖鎖若しくは水溶性ポリマーを蛋白質に化学的に反応して得られる水溶液等が挙げられる。

【0034】

蛋白質を生産する細胞としては、例えば、宿主細胞に所望の蛋白質をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換細胞等が挙げられる。

【0035】

宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞または昆虫細胞等の細胞株が挙げられる。

【0036】

宿主細胞としては、具体的には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ細胞、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞若しくはＳｆ２１等が挙げられる。

【0037】

蛋白質を生産する細胞を培養する培地としては、各々の細胞の培養に適した培地であればいずれも用いられるが、例えば、動物細胞を培養する場合の培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる培地が用いられる。例えば、血清含有培地、血清アルブミン若しくは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地、または無蛋白培地等、いずれの培地も用いられるが、好ましくは無血清培地または無蛋白培地が用いられる。

【0038】

前記培地としては、具体的には、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０２培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ－ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ ３２５培地（以上、ＳＡＦＣバイオサイエンス社製、ＥＸ－ＣＥＬＬは登録商標）、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地（以上、インビトロジェン社製）若しくはＩＳ ＣＤ－ＣＨＯ培地（アーバインサイエンティフィック社製）、またはこれらの改変培地、混合培地もしくは濃縮培地等が用いられ、好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０２培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地またはＩＳ ＣＤ－ＣＨＯ培地等が用いられる。

【0039】

また、蛋白質を生産する細胞を培養する培地には、必要に応じて更に蛋白質を生産する細胞の生育に必要な生理活性物質または栄養因子等を添加することができる。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させるか、培養中に添加培地または添加溶液として培養液へ適宜追加供給する。追加供給の方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態でもよく、また、添加方法は連続または断続のいずれでもよい。

【0040】

蛋白質を生産するトランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫としては、例えば、蛋白質をコードする遺伝子が細胞内に組み込まれた非ヒト動物、植物または昆虫が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサル等が挙げられる。植物としては、例えば、タバコ、ポテト、トマト、ニンジン、ソイビーン、アブラナ、アルファルファ、コメ、小麦、大麦またはコーン等が挙げられる。昆虫としては、例えば、カイコ等が挙げられる。

【0041】

蛋白質含有水溶液の生産方法としては、例えば、国際公開第２００８／１２０８０１号、日本国特開平３－１９８７９２号公報、国際公開第２０１０／０１８８４７号、国際公開第２００７／０６２２４５号または国際公開第２００７／１１４４９６号等に記載の方法が挙げられる。

【0042】

また、本発明において、蛋白質含有水溶液としては、例えば、前述の生体から得られる水溶液、培養液からなる水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られる水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られる水溶液、または糖、糖鎖若しくは水溶性ポリマーを蛋白質に化学的に反応して得られる水溶液、等の他、これらの水溶液から目的とする蛋白質を精製する工程で得られる水溶液が挙げられる。具体的には、例えば、細胞除去液、沈殿物除去液、アルコール分画液、塩析分画液またはクロマトグラフィー溶出液等が挙げられる。

【0043】

細胞除去液としては、例えば、前述の生体から得られる水溶液、培養液からなる水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られる水溶液、糖、糖鎖若しくは水溶性ポリマーを蛋白質に化学的に反応して得られる水溶液、またはこれらの水溶液から目的とする蛋白質を精製する工程で得られる水溶液より、細胞を除去した溶液等が挙げられる。

【0044】

細胞除去液としては、具体的には、例えば、細胞を含有する水溶液より自然沈殿法、遠心分離法、超音波法、水性二相分配法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、精密ろ過などメンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法等によって細胞を除去して得られる溶液が挙げられる。

【0045】

デプスフィルターとしては、具体的には、例えば、ミリスタックプラスＨＣデプスフィルター、ミリスタックプラスＤＥデプスフィルター、ミリスタックプラスＣＥデプスフィルター、クラリソルブデプスフィルター（メルクミリポア社製、ミリスタックは登録商標）、スープラＰデプスフィルター（Ｐａｌｌ社製）、ザルトクリアーＰＢデプスフィルター、ザルトクリアーＰＣデプスフィルター（ザルトリウス社製）、ゼータプラスＳＰデプスフィルター、ゼータプラスＡＰデプスフィルター、ゼータプラスＬＡデプスフィルター、ゼータプラスデリピッドデプスフィルター、ゼータプラスＺＡデプスフィルター、ゼータプラスＥＸＴ荷電デプスフィルターまたはエンフェーズＡＥＸハイブリッドピューリファイアー（住友スリーエム社製、ゼータプラスは登録商標）等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0046】

メンブレンフィルターとしては、具体的には、例えば、ＳＨＣ膜（メルクミリポア社製）、ＳＨＦ膜（メルクミリポア社製）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）膜（メルクミリポア社製）、またはフロロダイン（登録商標）（Ｐａｌｌ社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0047】

沈殿物除去液としては、前述の生体から得られる水溶液、培養液からなる水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られる水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られる水溶液、糖、糖鎖若しくは水溶性ポリマーを蛋白質に化学的に反応して得られる水溶液、またはこれらの水溶液から目的とする蛋白質を精製する工程で得られる水溶液より、低ｐＨ処理またはカプリル酸、有機溶剤、ポリエチレングリコール、界面活性剤、塩、アミノ酸若しくはポリマー等の添加により凝集沈殿（フロキュレーション）または二相分離を行った後に、沈殿物を除去した溶液等が挙げられる。沈殿物の除去方法としては、例えば、自然沈降法、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法等が挙げられる。また、上述の沈殿物除去液の取得方法を複数組み合わせて取得された沈殿物除去液も本発明に包含される。

【0048】

低ｐＨ処理のｐＨとしては、好ましくはｐＨ３～６、より好ましくはｐＨ４～６であり、塩酸、酢酸、クエン酸またはリン酸等の酸の添加により調整される。

【0049】

アルコール分画液としては、例えば、前述の生体から得られる水溶液、培養液からなる水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られる水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られる水溶液、糖、糖鎖若しくは水溶性ポリマーを蛋白質に化学的に反応して得られる水溶液、またはこれらの水溶液から目的とする蛋白質を精製する工程で得られる水溶液より、アルコール等を添加することで調製された分画液等が挙げられる。具体的には、例えば、低温エタノール分画法等の手法で得られる分画液が挙げられる。

【0050】

塩析分画液としては、例えば、前述の生体から得られる水溶液、培養液からなる水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られる水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られる水溶液、糖、糖鎖若しくは水溶性ポリマーを蛋白質に化学的に反応して得られる水溶液、またはこれらの水溶液から目的とする蛋白質を精製する工程で得られる水溶液より、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム等の塩を添加し、蛋白質を析出させることで調製された分画液等が挙げられる。

【0051】

クロマトグラフィー溶出液としては、例えば、前述の生体から得られる水溶液、培養液からなる水溶液、トランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫等から得られる水溶液、無細胞蛋白質合成技術を用いて得られる水溶液、糖、糖鎖若しくは水溶性ポリマーを蛋白質に化学的に反応して得られる水溶液、またはこれらの水溶液から目的とする蛋白質を精製する工程で得られる水溶液をクロマトグラフィーに用いられる担体または膜に吸着させ、適当な溶出液で溶出すること、または非吸着させることにより得られた、蛋白質溶出液等が挙げられる。

【0052】

クロマトグラフィーに用いられる担体または膜としては、例えば、イオン交換担体、イオン交換膜、アフィニティ担体、ゲルろ過担体、疎水性相互作用担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、混合モード（マルチモーダル）担体等が挙げられる。

【0053】

イオン交換担体またはイオン交換膜としては、例えば、イオン交換基を有する分子、例えば、硫酸基、メチル硫酸基、スルフォフェニル基、スルフォプロピル基、カルボキシメチル基、４級アンモニウム基、４級アミノエチル基またはジエチルアミノエチル基等を、ベース担体または膜、例えば、セルロース、セファロース、アガロース、キトサン、アクリル酸重合体若しくはスチレン－ジビニルベンゼン共重合体などのポリマーおよびその誘導体（架橋ポリマーを含む）、シリカ粒子、ガラス粒子、セラミック粒子またはその表面処理粒子等で構成されたポリマー等に直接または間接的に結合した担体または膜が挙げられる。

【0054】

イオン交換担体またはイオン交換膜としては、具体的には、例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは登録商標）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ ＣＭ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＮＨ_２－７５０Ｆ（以上、東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬは登録商標）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標） Ｑ（以上、メルクミリポア社製、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌは商標）、セルファインＭＡＸ－Ｑ、セルファインＭＡＸ－Ｓ（以上、ＪＮＣ社製、セルファインは登録商標）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（Ｐａｌｌ社製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（以上、ザルトリウス社製、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄは登録商標）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ Ｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは登録商標）、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＸＳ（以上、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｐｏｒｏｓは登録商標）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標） Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ^－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＯ_３ ^－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＥ Ｈｉｃａｐ（以上、メルクミリポア社製、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌは商標）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ（ポール社製）またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標） Ｓ（ザルトリウス社製）、ダイヤイオンＰＫ、ダイヤイオンＰＡ、ダイヤイオンＣＲ、ダイヤイオンＣＲ、ダイヤイオンＡＭＰ（以上、三菱化学社製、ダイヤイオンは登録商標）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標登録） ＣＰＸ（メルクミリポア社製）、またはＱｙｕ Ｓｐｅｅｄ（商標） Ｄ（旭化成メディカル社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0055】

アフィニティ担体としては、目的とする蛋白質に親和性を有する分子、例えば、ヘパリン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはこれらの誘導体等を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられる。

【0056】

アフィニティ担体としては、具体的には、例えば、Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）、プロセップ－ヘパリン（メルクミリポア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ－Ｈｅｐａｒｉｎ－６５０（東ソー社製）、Ｈｅｐａｒｉｎ ＨｙｐｅｒＤ（Ｐａｌｌ社製）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｌ（以上、ＧＥヘルスケア社製、ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔは登録商標）、Ｐｒｏｓｅｐ ｖＡ Ｈｉｃａｐａｃｉｔｙ、Ｐｒｏｓｅｐ ｖＡ Ｕｌｔｒａ、Ｐｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａｐｌｕｓ（以上、メルクミリポア社製、Ｐｒｏｓｅｐは登録商標）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ－６５０Ｆ（東ソー社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＣ－６５０Ｆ（東ソー社製）、ＭａｂＳｐｅｅｄ（登録商標） ＲＰ１０１（三菱化学社製）、ＭａｂＳｐｅｅｄ（登録商標） ＲＰ１０２（三菱化学社製）、ＪＷＴ２０３（ＪＳＲ社製）、ＫａｎＣａｐ（登録商標）Ａ（カネカ社製）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ ＳＵＰｒＡ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＡＤＲＥＰＭＡ（登録商標） Ａ－２０（大阪ソーダ社製）、ＡＤＲＥＰＭＡ（登録商標） Ａ－５０（大阪ソーダ社製）、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）－ｖＡ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ（メルクミリポア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0057】

ゲルろ過担体としては、例えば、デキストラン、アリルデキストラン、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、セルロース、アガロース、スチレン、ジビニルベンゼン、ポリビニルアルコール、シリカまたはキトサン等で構成されたポリマーからなる担体が挙げられる。

【0058】

ゲルろ過担体としては、具体的には、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）シリーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷシリーズ、ＴＳＫｇｅｌ ＰＷシリーズ（以上、東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬは登録商標）、Ｂｉｏ ｇｅｌ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｂｉｏ ｇｅｌ Ｐ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（以上、バイオラッド社製）、セルファインＧＨ、セルファインＧＣＬ（以上、ＪＮＣ社製、セルファインは商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ０５、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ２０００、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ（以上、Ｐａｌｌ社製、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌは登録商標）またはフラクトゲル ＢｉｏＳＥＣ（メルクミリポア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0059】

疎水相互作用担体としては、疎水性を有する分子、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、オクチル基、エーテル基またはフェニル基等を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられる。

【0060】

疎水相互作用担体としては、具体的には、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ－ｓｕｂ）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｌｏｗ－ｓｕｂ）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（以上、ＧＥヘルスケア社製、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは登録商標）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｈｅｘｙｌ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｅｔｈｅｒ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＰＧ－６００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ－６００、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｓｕｐｅｒ Ｂｕｔｙｌ－５５０（以上、東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬは登録商標）、Ｍａｃｔｒｏ－Ｐｒｅｐ ｔ－Ｂｕｔｙｌ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ（以上、バイオラッド社製、Ｍａｃｔｒｏ－Ｐｒｅｐは登録商標）、ＱＭＡ Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ（登録商標）、Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）（以上、Ｐａｌｌ社製）、フラクトゲル Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓ）、フラクトゲル Ｐｒｏｐｙｌ（Ｓ）（以上、メルクミリポア社製、フラクトゲルは登録商標）、フェニル－セルロファイン（ＪＮＣ社製、セルロファインは登録商標）、ダイヤイオンＨＰ、ダイヤイオンＳＰ（以上、三菱化学社製、ダイヤイオンは登録商標）、ブチル化キトパール、フェニル化キトパール（以上、富士紡ホールディングズ社製、キトパールは登録商標）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

逆相担体としては、例えば、炭化水素基を固相マトリックスに、直接または間接的に結合した担体が挙げられる。炭化水素基としては、例えば、トリメチル基、ブチル基、フェニル基、オクチル基またはオクタデシル基およびこれらの末端を改変した官能基等が挙げられる。具体的には、例えば、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（登録商標） ＲＰＣシリーズまたはＳＯＵＲＣＥ（商標） ＲＰＣシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0062】

ヒドロキシアパタイト担体としては、例えば、ＣＨＴ（商標） Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ ＩまたはＴｙｐｅ ＩＩ（以上、バイオラッド社製）が挙げられるが、これに限定されない。また、フルオロアパタイト担体としては、例えば、ＣＦＴ（商標） Ｃｅｒａｍｉｃ Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅ（バイオラッド社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

硫酸化セルロース担体または硫酸化アガロース担体としては、例えば、セルファインサルフェイト、セルファインサルフェイトｍ、セルファインサルフェイトｃ、硫酸化セルロファインｍ、硫酸化セルロファインｃ、硫酸化セルファインｍまたは硫酸化セルファインｃ（以上、ＪＮＣ社製、セルファインは登録商標）またはＣａｐｔｏ（登録商標） ＤｅＶｉｒＳ（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0064】

混合モード担体としては、例えば、異なる選択性を有する２種類以上の官能基、好ましくは前記と同様のイオン交換基および前記と同様の疎水性相互作用基を、前記と同様のベース担体に直接または間接的に結合した担体が挙げられる。

【0065】

混合モード担体としては、具体的には、例えば、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（以上、ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏは登録商標）、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（以上、Ｐａｌｌ社製、ＨｙｐｅｒＣｅｌは商標）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍ（東ソー社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

上記クロマトグラフィーは、その目的に応じて吸着モードまたは非吸着モードで行われる。好ましくは、クロマトグラフィーのうち、少なくとも１つのクロマトグラフィーは吸着モードで行われる。

【0067】

前記クロマトグラフィーにおける吸着モードとは、該クロマトグラフィーに供する水溶液を該担体および／または該膜に接触させ、目的の蛋白質を該担体および／または該膜に吸着させた後、必要に応じて洗浄を行い、その後、ｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物等を変更した緩衝液で溶出させて目的の蛋白質を含む吸着画分を回収することを意味する。

【0068】

前記クロマトグラフィーにおける非吸着モードとは、該クロマトグラフィーに供する水溶液を該担体および／または該膜と接触させ、目的の蛋白質を該担体および／または該膜に吸着させずに目的の蛋白質を含む非吸着画分を回収することを意味する。

【0069】

前記クロマトグラフィーに供する水溶液、洗浄または溶出に使用する緩衝液は、ｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物等について、それぞれ好適な条件を選定する。クロマトグラフィーの条件を選定する上で、目的の蛋白質と分離したい化合物との物理化学的性質の違い、例えば、等電点、電荷、疎水性度、分子サイズまたは立体構造等の違いを利用することが出来る。

【0070】

吸着モードの溶出方法としては、目的の蛋白質と担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨ等を有する緩衝液を通液して溶出させる一段階溶出法、段階的に塩濃度またはｐＨ等を変化させて目的の蛋白質を溶出させるステップワイズ法または連続的に塩濃度またはｐＨ等を変化させて目的の蛋白質を溶出させるグラジエント法が挙げられる。

【0071】

該緩衝液を構成する塩としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。

【0072】

また前記塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせて用いることも出来る。更に、緩衝液成分には、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはヒスチジン等のアミノ酸、グルコース、スクロース、ラクトース若しくはシアル酸等の糖またはその誘導体等と組み合わせて用いることも出来る。

【0073】

本発明において蛋白質が抗体である場合、蛋白質含有水溶液としては、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーを用いずに得られた蛋白質含有水溶液、より好ましくはプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いずに得られた蛋白質含有水溶液が挙げられる。

【0074】

更に、蛋白質含有水溶液は、粒子等の不溶物が存在する場合には予めそれらを除去し、不溶物を除去した後に本発明の精製方法に供してもよい。粒子等の不溶物の除去方法としては、例えば、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法が挙げられる。

【0075】

本発明の活性炭を用いた蛋白質の精製方法に供される活性炭前処理液は、前述の蛋白質含有水溶液を希釈、濃縮希釈、緩衝液置換若しくは塩化ナトリウム等の塩の添加、またはこれらを組合せること等により導電率を調整することにより調製することができる。

【0076】

本発明者らは、前記活性炭前処理液を最適に調製し、また、該活性炭前処理液を用いて活性炭処理を最適な条件で実施することによって、不純物含量が顕著に低下した目的蛋白質を高回収率で取得できることを見出した。

【0077】

導電率は、水溶液が２つの電極間で電流を伝導する能力を示す。溶液中では、電流はイオン輸送によって流動するため、活性炭前処理液中に存在するイオン量が増加すると、高い導電率を有する。活性炭前処理液中に存在するイオン量を減少させて導電率を低下させることにより、不純物を効率的に分離でき、且つ活性炭に吸着する目的とする蛋白質の量を低減し、回収率を向上することができる。活性炭前処理液の好ましい導電率は０～５ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは０～２ｍＳ／ｃｍであり、特に好ましくは０～１ｍＳ／ｃｍである。導電率は、市販の導電率計を使用して測定できる。

【0078】

蛋白質含有水溶液を希釈して活性炭前処理液を調製する方法としては、例えば、超純水（ミリＱ水）等の水または導電率が１ｍＳ／ｃｍ未満である０．０５％ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ若しくは２６２ ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｄ－ｓｏｒｂｉｔｏｌ（ｐＨ５．５）緩衝液等で蛋白質含有水溶液を希釈し、好ましい導電率に調整する方法が挙げられる。希釈倍率は、例えば、２～２０倍である。

【0079】

蛋白質含有水溶液を濃縮希釈または緩衝液置換して活性炭前処理液を作製する方法としては、例えば、限外ろ過膜を用いた限外ろ過法、沈殿法、透析膜若しくはゲルろ過カラム等を用いて蛋白質含有水溶液を濃縮後に超純水やリン酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、マレイン酸、ホウ酸、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、またはＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液等で希釈する操作を１回又は複数回繰り返す方法、限外ろ過膜を用いた透析ろ過法を用いて超純水や緩衝液等に置換する方法または限外ろ過膜を用いた限外ろ過法で蛋白質含有水溶液を濃縮後に透析ろ過法を用いて超純水や緩衝液等に置換する方法等が挙げられる。この他、吸着カラムに目的蛋白質を吸着させ、超純水若しくは緩衝液等で溶出させることにより濃縮希釈または緩衝液置換し、活性炭前処理液を作製する方法が挙げられる。

【0080】

濃縮倍率は、例えば、５～２００倍であり、希釈倍率は、例えば、２～１００倍である。透析ろ過法を用いる際の超純水または緩衝液等の容量は、例えば、２～３０倍量である。これらを任意に組み合わせて調製してもよい。

【0081】

限外ろ過膜としては、通常の限外ろ過膜の他、プラスまたはマイナスの電荷が付加された限外ろ過膜も含まれ、具体的には、例えば、ペリコン３ウルトラセル膜、ペリコン３バイオマックス膜、ペリコン２ウルトラセル膜、ペリコン２バイオマックス膜（以上、メルクミリポア社製、ペリコンは登録商標）、オメガメンブラン（Ｐａｌｌ社製）、Ｋｖｉｃｋ膜（ＧＥヘルスケア社製）、ザルトコンカセット（ザルトリウス社製）またはＰＲＯＰＯＲ ＴＦＦ（パーカー・ハネフィン社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0082】

蛋白質含有水溶液に塩化ナトリウム等の塩を添加して導電率を調整し、活性炭前処理液を作製することができる。添加する塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウム等が挙げられ、塩化ナトリウムが好ましい。これらの塩は単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。調製された活性炭前処理液の最終塩濃度としては、好ましくは０～１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０～５ｍｍｏｌ／Ｌである。

【0083】

活性炭前処理液を構成する緩衝成分としては、例えば、リン酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、マレイン酸、ホウ酸、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジン等のアミノ酸等が挙げられる。これらの濃度は好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ～０．５ｍｏｌ／Ｌである。

【0084】

活性炭前処理液のｐＨは、好ましくは２～９であり、より好ましくは３～８である。特に、蛋白質が抗体である場合、活性炭前処理液のｐＨは、好ましくは２～８であり、より好ましくは３～７であり、特に好ましくは４～６であり、最も好ましくは４～５である。

【0085】

活性炭前処理液に含まれる目的の蛋白質の濃度は、好ましくは１～４５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは２～３０ｍｇ／ｍＬである。目的の蛋白質が抗体である場合には、好ましくは３～４５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは３～３０ｍｇ／ｍＬであり、特に好ましくは５．５～２３ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１１～２３ｍｇ／ｍＬである。

【0086】

本発明において、不純物としては、例えば、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）、変性、糖鎖成分の除去、酸化若しくは脱アミド等を受けた蛋白質由来の修飾体、ＤＮＡ、ウイルス、培地由来成分、培養添加物および／または宿主細胞から溶出した酵素類等が挙げられ、好ましくは宿主細胞蛋白質、蛋白質由来の重合体、蛋白質由来の分解物、ＤＮＡおよび／またはウイルスが挙げられる。より好ましくは、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、蛋白質由来の重合体（ＨＭＷｓ）、蛋白質由来の分解物（ＬＭＷｓ）、ＤＮＡおよびウイルスを同時に除くことが出来る。

【0087】

宿主細胞から溶出した酵素類としては、例えば、糖除去酵素類、蛋白質加水分解酵素類、酸化還元酵素類またはアミノ酸異性化酵素類等が挙げられる。

【0088】

糖除去酵素としては、具体的には、例えば、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガラクトシダーゼまたはグリカナーゼ等が挙げられる。蛋白質加水分解酵素としては、具体的には、例えば、セリンプロテアーゼ、エステラーゼ、システインプロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼまたはカテプシン等が挙げられる。

【0089】

酸化還元酵素としては、具体的には、例えば、チオレドキシンレダクターゼ等のチオレドキシン関連酵素等が挙げられる。アミノ酸異性化酵素としては、具体的には、例えば、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。

【0090】

ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、パルボウイルス、レオウイルスまたはヘルペスウイルス等が挙げられ、具体的には、例えば、ネズミ科リンパ腫ウイルス、マウスパルボウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、インフルエンザウイルス、またはバクシニアウイルス等が挙げられる。

【0091】

本発明の精製方法に用いられる活性炭としては、医薬品の製造に適した活性炭であればいずれも用いられ、１種類の活性炭を単独で使用しても、２種類以上の活性炭を単独または混合して用いてもよい。

【0092】

活性炭としては、例えば、鉱物系活性炭または植物系活性炭等が挙げられる。鉱物系活性炭としては、具体的には、例えば、石炭系活性炭、石油系活性炭等が挙げられる。植物系活性炭としては、具体的には、例えば、木質系活性炭またはやし殻活性炭等が挙げられ、好ましくは木質系活性炭が挙げられる。

【0093】

活性炭の原料としては炭素質の物質であればいずれも用いられるが、例えば、おが屑、木炭、素灰、草炭、ピート若しくは木材チップ等の木質、やし殻、亜炭、褐炭若しくは無煙炭等の石炭、石炭ピッチ、石油ピッチ、オイルカーボン、レーヨン、アクリロニトリルまたはフェノール樹脂等が挙げられる。

【0094】

活性炭の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、高温で塩化亜鉛若しくは燐酸等の薬品を添加、浸透させ、高温で炭化反応させる薬液賦活法または炭化した原料および水蒸気、二酸化炭素、空気若しくは燃焼ガス等のガスを高温で反応させるガス賦活法が挙げられる。好ましくは、塩化亜鉛賦活化法、燐酸を用いた酸賦活化法、または水蒸気賦活化法などが挙げられる。

【0095】

活性炭の形状としては、医薬品の製造に適した形状であればいずれも用いられるが、例えば、粉砕炭、顆粒炭、球状炭若しくはペレット炭等の粒状活性炭、ファイバー若しくはクロス等の繊維状活性炭、シート状、成形体若しくはハニカム状等の特殊成形活性炭、または粉末活性炭等が挙げられる。

【0096】

また、プラス若しくはマイナスの電荷が付加された活性炭またはポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、ヘパリン、セルロース若しくはポリウレタン等の表面修飾剤で修飾された活性炭も本発明の精製方法に用いられる活性炭に含まれる。さらに、ゾル－ゲル法により作製したカーボンゲルも本発明の精製方法に用いられる活性炭に含まれる。ゾル－ゲル法に用いられる原料としては、例えば、フェノール、メラミン、レゾルシノール、またはホルムアルデヒド等が挙げられる。

【0097】

活性炭の平均細孔直径としては、特に限定されないが、通常は０．１～２０ｎｍ、好ましくは０．５～５．０ｎｍ、より好ましくは２．０～５．０ｎｍ、さらに好ましくは３．０～５．０ｎｍである。活性炭の平均細孔径は窒素吸着等温吸着曲線よりＢＪＨ法を用いて算出することができる。

【0098】

活性炭としては、具体的には、例えば、カルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、特製白鷺、白鷺Ａ、白鷺Ｃ、白鷺Ｃ－１、白鷺ＤＯ－２、白鷺ＤＯ－５、白鷺ＤＯ－１１、白鷺ＤＣ、白鷺ＤＯ、白鷺Ｇｘ、白鷺Ｇ、白鷺ＧＨ、白鷺ＦＡＣ－１０、白鷺ＦＰＧ－１、白鷺Ｍ、白鷺Ｐ、白鷺ＰＨＣ、白鷺Ｇｃ、白鷺ＧＨ、白鷺ＧＭ、白鷺ＧＳ、白鷺ＧＴ、白鷺ＧＡＡ、白鷺ＧＯＣ、白鷺ＧＯＸ、白鷺ＡＰＲＣ、白鷺ＴＡＣ、白鷺ＭＡＣ、白鷺ＸＲＣ、白鷺ＮＣＣ、白鷺ＳＲＣＸ、白鷺Ｗｃ、白鷺ＬＧＫ、白鷺ＫＬ、白鷺ＷＨ、白鷺Ｗ、白鷺ＷＨＡ、白鷺ＬＨ、白鷺ＫＬ、白鷺ＬＧＫ、白鷺ＭＡＣ－Ｗ、白鷺Ｓ、白鷺Ｓｘ、白鷺Ｘ２Ｍ、白鷺Ｘ７０００、白鷺Ｘ７１００、白鷺ＤＸ７－３、モルシーボン（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、ＡＣＦ、ＧＬＣ（以上、クラレケミカル社製）、太閤Ａ、太閤Ｓ、太閤Ｋ、太閤ＫＡ、太閤Ｑ、太閤Ｙ（以上、フタムラ化学社製）、Ｎｏｒｉｔ ＧＳＰ、Ｎｏｒｉｔ ＣＮＩ、Ｎｏｒｉｔ ＧＢＧ、Ｎｏｒｉｔ ＴＥＳＴ ＥＵＲ、Ｎｏｒｉｔ ＳＵＰＲＡ ＥＵＲ、ＧＡＣ、ＣＮ、ＣＧ、ＣＡＰ／ＣＧＰ、ＳＸまたはＣＡ（以上、日本ノリット社製、Ｎｏｒｉｔは登録商標）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0099】

このうち、木質系の活性炭としては、例えば、特製白鷺、強力白鷺、白鷺Ｐ、白鷺Ｃ、白鷺Ａ（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、太閤Ｙ、太閤ＫＡ、太閤Ｍ、太閤Ａ（以上、フタムラ化学社製）、Ｎｏｒｉｔ ＧＳＰまたはＮｏｒｉｔ ＣＮＩ（以上、日本ノリット社製、Ｎｏｒｉｔは登録商標）等が挙げられる。

【0100】

本発明の活性炭を用いる精製方法の手段としては、特に限定されないが、例えば、バッチ法、膜処理法またはカラムクロマトグラフィー法等が挙げられ、それぞれの手段に応じて適切な活性炭の形状が選択される。必要に応じて、多孔性ポリマー若しくはゲルに活性炭を封入した粒子等の形態またはポリプロピレン若しくはセルロース等のサポート剤若しくは繊維等を用いて活性炭を吸着、固定若しくは成形した膜若しくはカードリッジ等の形態等にて使用することも出来る。

【0101】

活性炭を含む膜またはカードリッジとしては、具体的には、例えば、ＣＵＮＯ活性炭フィルターカードリッジ、ゼータプラス活性炭フィルターカードリッジ（住友スリーエム社製、ＣＵＮＯおよびゼータプラスは登録商標）、ミリスタックプラス活性炭フィルター（メルクミリポア社製、ミリスタックは登録商標）、スープラＡＫＳ１フィルター、ＡＫＳ１フィルター、Ｓｔａｘ（商標） ＡＫＳ１（以上、Ｐａｌｌ社製）、アドール（ユニチカ社製）、Ｋフィルター（登録商標）、活性炭シート（以上、東洋紡社製）、へマックス（クラレ社製）、ヘモソーバ（登録商標）（旭化成メディカル社製）、へモカラム（テルモ社製）、またはへセルス（帝人社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、木質系の活性炭を含む膜またはカートリッジとしては、例えば、ゼータプラス活性炭フィルターカートリッジ（住友スリーエム社製、ゼータプラスは登録商標）、スープラＡＫＳ１フィルター、ＡＫＳ１フィルター、またはＳｔａｘ（商標） ＡＫＳ１（以上、Ｐａｌｌ社製）等が挙げられる。

【0102】

また、目的の蛋白質および前記精製方法の手段により、用いる活性炭の充填密度、粒度、堅度、乾燥減量、強熱残分、比表面積または細孔容積等を適宜選択することも出来る。

【0103】

本発明の活性炭を用いた精製方法は、非吸着モードで行われる。非吸着モードとは、蛋白質含有水溶液を活性炭と接触させ、目的の蛋白質を該活性炭に吸着させずに非吸着画分を回収することを意味する。具体的には、予め前述の方法で導電率などを調整した活性炭前処理液を、活性炭への負荷量、接触時間等を調整した上で、活性炭に接触させ、目的の蛋白質を活性炭に吸着させずに不純物のみを活性炭に吸着させ、非吸着画分に不純物含量が低下した蛋白質を高い回収率にて回収する。

【0104】

予め上記方法で導電率などを調整した活性炭前処理液を活性炭に接触させる際の活性炭への負荷量および接触時間としては、負荷量が０．１～０．３ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭であれば８～２４時間が好ましく、１２～２４時間がより好ましい。また、負荷量が０．０５～０．１５ｍｇ蛋白質／ｍｇ活性炭であれば０．１～２４時間が好ましく、２～２４時間がより好ましく、２～１２時間が特に好ましい。

【0105】

また、活性炭を用いる精製方法に必要な活性炭量、及び１つの活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムあたりに含まれる活性炭量に応じて、複数の活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムに分割し、適宜組合せて用いることも出来る。例えば、複数の活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムは並列または直列に接続して、活性炭前処理液を通液する。

【0106】

特に、複数の活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムを直列に接続し、活性炭前処理液を連続して通液する場合に、活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムの数がより多いほど、より効果的に不純物を除去することが可能である。この場合、活性炭を含む膜、カートリッジまたは活性炭を充填したカラムの数は、少なくとも２以上であることが好ましく、より好ましくは２～２０、さらに好ましくは２～１０、特に好ましくは２～４である。

【0107】

前述の膜処理法またはカラムクロマトグラフィー法で精製を行う場合には、例えば、活性炭膜若しくは活性炭カードリッジまたは活性炭を充填した膜、カードリッジまたはカラムに活性炭前処理液を一回だけ通液してもよいが、連続的に活性炭前処理液を循環させ、複数回活性炭前処理液を活性炭に接触させる方法がより好ましい。

【0108】

また、活性炭を用いた前記精製方法における活性炭前処理液の流速、粘度等を適宜選択することも出来る。

【0109】

本発明において、前記活性炭前処理液を最適に調製し、また該活性炭前処理液を用いて活性炭処理を最適な条件で実施することによって、不純物含量が顕著に低下した目的蛋白質を高回収率で取得する本発明を完成することが出来る。

【0110】

具体的には、不純物含量として、宿主細胞蛋白質の含量（ｎｇ／ｍｇ－Ｐ）は、好ましくは蛋白質１ｍｇあたり１００ｎｇ以下、より好ましくは蛋白質１ｍｇあたり１０ｎｇ以下である。宿主細胞蛋白質の含量は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法または電気化学発光法等により測定することが出来る。

【0111】

蛋白質由来の重合体の含量（含有率）は、好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下である。蛋白質由来の分解物の含量（含有率）は、好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下である。蛋白質由来の重合体若しくは蛋白質由来の分解物の含量は、例えば、ゲルろ過ＨＰＬＣ法、イオン交換ＨＰＬＣ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、光散乱法または超遠心法等により測定することができる。ＤＮＡ濃度は、例えば、ピコグリーン法、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法またはＱＰＣＲ法等の分析法により測定することが出来る。

【0112】

また、ウイルス除去率を示すＬｏｇａｒｉｔｈｍ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＲＦ）は、好ましくは３以上、より好ましくは３．５以上である。ウイルス力価は、例えば、感染価による測定またはｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＰＣＲ）法等により測定することが出来る。

【0113】

ウイルス除去率は下記の計算式で測定することが出来る。
ＬＲＦ＝｛ｌｏｇ１０（Ｖ１）＋ｌｏｇ１０（Ｔ１）｝－｛ｌｏｇ１０（Ｖ２）＋ｌｏｇ１０（Ｔ２）｝
Ｖ１：負荷液量
Ｖ２：回収液量
Ｔ１：負荷液のウイルス力価
Ｔ２：回収液のウイルス力価

【0114】

本発明において、不純物含量が低下した目的蛋白質は、回収比率または回収率で測定することが出来る。本明細書において、回収率は収率とも記載する。

【0115】

目的蛋白質の回収比率は、好ましくは０．８０以上、より好ましくは０．８５以上、さらに好ましくは０．９０以上である。目的蛋白質の回収率は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。目的蛋白質の回収比率または回収率は、例えば、吸光度またはプロテインＡなどのアフィニティＨＰＬＣ法等により測定することが出来る。

【0116】

本発明において、例えば、目的蛋白質の回収比率は以下の計算式で算出することが出来る。
回収比率（Ｃ／Ｃｏ）＝活性炭処理後の目的蛋白質濃度（Ｃ）／活性炭処理前の目的蛋白質濃度（Ｃｏ）

【0117】

また、例えば、目的蛋白質の回収率は以下の計算式で算出することが出来る。
回収率＝（活性炭処理後の目的蛋白質濃度×回収液量／活性炭処理前の目的蛋白質濃度×活性炭処理前の液量）×１００

【0118】

本発明は、活性炭を用いて、目的の蛋白質と不純物とを分離し、不純物含量が低下した目的の蛋白質を取得する精製方法を含む、蛋白質の製造方法に関する。

【0119】

本発明の蛋白質の製造方法において、活性炭を用いた精製方法と組み合わせる他の精製方法としては、医薬品の製造に適した方法であればいずれも用いられるが、例えば、前述の蛋白質含有水溶液を調製する際に用いられるイオン交換膜（例えば、陰イオン交換膜）、クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび混合クロマトグラフィー）、アルコール分画、沈殿物除去、塩析、緩衝液交換、濃縮、希釈、ろ過、ウイルス不活性化、ウイルス除去等を用いることが出来る。活性炭を用いた精製方法と組み合わせる他の精製方法は、複数の種類、数を組み合わせてもよく、陰イオン交換膜、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび混合クロマトグラフィーから選ばれる少なくとも一つを使用することが好ましい。

【0120】

本発明において蛋白質が抗体である場合、活性炭を用いた精製方法と組み合わせるクロマトグラフィーとしては、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーを含まない製造方法、より好ましくはプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを含まない製造方法が挙げられる。蛋白質が抗体である場合、活性炭と組み合わせるクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーまたはその組み合わせが挙げられる。

【0121】

本発明の蛋白質の製造方法として、例えば、本発明において蛋白質が抗体である場合、活性炭を用いた精製方法の後に、引き続き非吸着モードで行われる陰イオン交換クロマトグラフィー、更に引き続き吸着モードで行われる陽イオン交換クロマトグラフィーを行う製造方法、または活性炭を用いた精製方法の後に、引き続き吸着モードで行われる陽イオン交換クロマトグラフィー、更に引き続き非吸着モードで行われる陰イオン交換クロマトグラフィーを行う製造方法等が挙げられる。

【0122】

更に好ましくは、例えば、活性炭を用いた精製方法と組み合わせる全てのクロマトグラフィーが非吸着モードで行われる蛋白質の製造方法（Ａｌｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が挙げられる。具体的には、例えば、蛋白質が抗体である場合、活性炭を用いた精製方法の後に、引き続き非吸着モードで行われる陰イオン交換クロマトグラフィーやカラムを用いない陰イオン交換膜を用いたクロマトグラフィーを行う製造方法等が挙げられる。

【実施例】

【0123】

以下、実施例により本発明について更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例において、蛋白質由来の重合体の含有率（以下、重合体含有率とも略す）はゲルろ過ＨＰＬＣ分析で目的蛋白質より高分子量側で検出されるピークの割合を示す。蛋白質由来の分解物の含有率（以下、分解物含有率とも略す）はゲルろ過ＨＰＬＣ分析で目的蛋白質より低分子量側で検出されるピークの割合を示す。

【0124】

実施例１ モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ、Ｃ、Ｄ、又はＥ）を用いた活性炭処理量の検討
モノクローナル抗体［Ｍａｂ Ａ、Ｃ、Ｄ（以上ＩｇＧ１）、又はＥ（ＩｇＧ４）］を含むＣＨＯ細胞培養液を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）することにより、細胞を除去し、各ＣＨＯ細胞培養上清を調製した。

【0125】

次いで、各ＣＨＯ細胞培養上清を酸またはアルカリでｐＨ４．５にそれぞれ調整した。１時間静置後、生成した沈殿を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）で除去し、各ｐＨ調整清澄化液を得た。

【0126】

次いで、得られた各ｐＨ調整清澄化液を約５ｍＬずつ１５ｍＬチューブに移し、活性炭［白鷺（登録商標）Ｐ：日本エンバイロケミカルズ社製］をそれぞれ２５、５０、１００、または２００ｍｇ添加して、混合した。混和液を室温で１７時間ローテーターを用いて撹拌した後、遠心分離（２，９００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）で活性炭を除去し、各活性炭処理液を得た。

【0127】

得られた各活性炭処理液の宿主細胞蛋白質濃度をＥＬＩＳＡ法により分析した。活性炭添加量と宿主細胞蛋白質濃度の関係を図１に示す。図１に示すように、何れのｐＨ調整清澄化液を処理した場合においても活性炭量に応じて宿主細胞蛋白質濃度が変化することが明らかになった。また、その関係は用いた各ｐＨ調整清澄化液によってその傾きは異なるが、宿主細胞蛋白質濃度の自然対数と極めて高い相関があることが明らかになった。

【0128】

以上より、活性炭添加量を増加させるだけで飛躍的に宿主細胞蛋白質の除去が可能であることが判った。

【0129】

各活性炭溶出液の分解物含量をゲルろ過ＨＰＬＣ法により分析した結果を図２に示す。図２に示すように、いずれの活性炭処理液においても活性炭添加量に応じて分解物が効果的に除去されていることが確認された。

【0130】

各活性炭処理液の抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析した。活性炭添加量と抗体濃度の関係を図３に示す。図３に示すように、何れのｐＨ調整清澄化液を処理した場合においても活性炭量に応じて抗体濃度が低下し、その関係は極めて高い相関であることが明らかになった。また、その傾きは抗体のサブクラスがＩｇＧ１であるＭａｂ Ａ、Ｍａｂ Ｃ、Ｍａｂ Ｄを含むｐＨ調整清澄化液を用いた場合は同様であり、サブクラスがＩｇＧ４であるＭａｂ Ｅは傾きが負に大きい値を示した。

【0131】

図１～図３に示す結果から、活性炭を用いて不純物を顕著に除去するためには活性炭の添加量を増加させることが効果的であるが、抗体自体も活性炭の増量により吸着量が増加するため、不純物の除去効率を向上させ、且つ回収率も向上させる活性炭処理条件を見出すことに必要があることが確認された。

【0132】

実施例２ 活性炭前処理液の希釈効果
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養液を精密ろ過して細胞を除去した後、酸またはアルカリでＣＨＯ細胞培養上清をｐＨ４．５に調整した。一時間静置後、生成した沈殿を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）で除去し、ｐＨ調整清澄化液を得た。

【0133】

得られたｐＨ調整清澄化液約５ｍＬ、またはｐＨ調整清澄化液約５ｍＬに緩衝液約５ｍＬを加えた２倍希釈液に活性炭［白鷺（登録商標）Ｐ：日本エンバイロケミカルズ社製］を負荷量が０．１～０．５ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭となるように添加し、室温で１７時間ローテーターを用いて撹拌後、遠心分離（２，９００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）して活性炭を除去し、各活性炭処理液を得た。

【0134】

希釈用緩衝液は、導電率が１ｍＳ／ｃｍ未満である０．０５％ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、２６２ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｄ－ｓｏｒｂｉｔｏｌ（ｐＨ５．５）を用いた。活性炭を添加していないｐＨ調整清澄化液、またはｐＨ調整清澄化液の２倍希釈液をコントロールとした。

【0135】

各負荷量の活性炭処理液の抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）を図４に示す。図４に示すように、活性炭量を増加して負荷量を低下させた結果、回収比率が低下した。回収比率はｐＨ調整清澄化液の希釈の有無で大きく影響を受けなかったが、希釈することによって低負荷量ではわずかに高値を示す傾向が確認された。

【0136】

各負荷量の活性炭処理液の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度をＥＬＩＳＡ法により分析した結果を図５に示す。希釈したサンプルは希釈倍率を乗じた値で示した。図５に示すように、低負荷量では宿主細胞蛋白質はｐＨ調整清澄化液を希釈することによってより除去されることが明らかになった。

【0137】

各負荷量の活性炭溶出液の重合体（ＨＭＷｓ）含有率および分解物（ＬＭＷｓ）含有率をゲルろ過ＨＰＬＣ法により、分析した結果をそれぞれ図６および図７に示す。図６および図７に示すように、重合体含有率および分解物含有率は希釈の有無によって大きく変動しなかった。

【0138】

以上の結果から、清澄化液を希釈した活性炭前処理液を調製することで、活性炭を増量して負荷量を下げた時に各種不純物の除去効果がより向上し、回収比率は同等か若干向上した。回収比率と各種不純物の除去効果との最も両立した負荷量は０．１５～０．２０ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭であった。

【0139】

実施例３ 活性炭前処理液の濃縮希釈効果
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養液を連続遠心した後、デプス膜（メルク社製：Ａ１ＨＣ）を用いて細胞を除去した。その細胞除去液を、ＭＦ膜［Ｐａｌｌ社製：フロロダイン（登録商標）］を通して酸またはアルカリでｐＨ４．５に調整した。４℃で６時間静置後、生成した沈殿をＳＨＣ膜（メルク社製）で除去した。得られたｐＨ調整清澄化液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ３０ｋＤ］で１０倍濃縮後、ミリＱ水を用いて２倍、５倍、または１０倍希釈した濃縮希釈液を得た。

【0140】

各濃縮希釈液約５ｍＬに活性炭（特製白鷺：日本エンバイロケミカルズ社製、白鷺は登録商標）を負荷量が０．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭となるように添加し、室温で１７時間ローテーターを用いて撹拌後、遠心分離（２，９００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）して活性炭を除去した各濃縮希釈液の活性炭処理液を得た。

【0141】

活性炭を添加していない各濃縮希釈液をコントロールとした。得られた各濃縮希釈液の活性炭処理液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）を図８に示す。図８に示すように、回収比率は、ｐＨ調整清澄化液の濃縮希釈により向上することが確認された。

【0142】

各濃縮希釈液の活性炭処理液の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度をＥＬＩＳＡ法により分析した結果を図９に示す。図９に示すように、宿主細胞蛋白質濃度はｐＨ調整清澄化液を濃縮希釈することによって低下し、希釈率を上げることでより効率的にＨＣＰを除去できることが明らかになった。

【0143】

各濃縮希釈液の活性炭処理液の重合体（ＨＭＷｓ）含有率および分解物（ＬＭＷｓ）含有率をそれぞれ図１０および図１１に示す。図１０に示すように、重合体含有率はｐＨ調整清澄化液を濃縮希釈することによって低下し、希釈率を上げることでより効率的にＨＭＷｓを除去できることが明らかになった。また、図１１に示すように、ＬＭＷｓはｐＨ調整清澄化液の濃縮希釈の有無に関わらず、いずれも効率的に除去できた。

【0144】

以上の結果から、ｐＨ調整清澄化液を濃縮希釈した活性炭前処理液を調製することによって、高い回収比率と宿主細胞蛋白質、重合体および分解物などの不純物の効果的除去を同時に達成できることが判った。

【0145】

実施例４ 活性炭処理に適した活性炭前処理液の導電率
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。１時間静置後、細胞および生成した沈殿をデプスフィルター［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］およびＭＦ膜（メルク社製：ＳＨＣ）で除去した。

【0146】

得られたｐＨ調整清澄化液をＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ３０ｋＤ］で５倍濃縮後、連続的にミリＱ水を加水して、抗体濃度２０ｍｇ／ｍＬで、導電率が０．１５ｍＳ／ｃｍ、０．３ｍＳ／ｃｍ、０．６ｍＳ／ｃｍ、１．２ｍＳ／ｃｍ、２．４ｍＳ／ｃｍ、４．８ｍＳ／ｃｍまたは９．６ｍＳ／ｃｍの各導電率調整液を得た。

【0147】

各導電率調整液約５ｇに活性炭（日本エンバイロケミカルズ社製：特製白鷺、白鷺は登録商標）を負荷量が０．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭になるように添加し、室温にて一晩撹拌した。撹拌後の各溶液を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）し、０．２μｍフィルターでろ過した各導電率の活性炭処理液を得た。活性炭を添加していない各導電率調整液をコントロールとした。

【0148】

得られた各導電率の活性炭処理液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）を図１２に示す。図１２に示すように、回収比率は低導電率の方が高くなる傾向を示し、５ｍＳ／ｃｍ以下では９０％以上の高い回収比率が確認された。

【0149】

各導電率の活性炭処理液の重合体含有率および分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析し、その結果を図１３および図１４に示す。図１３に示すように、導電率が低下するに従って、重合体含有率が低下し、１ｍＳ／ｃｍ以下では１％未満となった。また、図１４に示すように、分解物含有率は、導電率が低下するに従って低下し、０～１０ｍＳ／ｃｍでは全て１％未満となった。

【0150】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析し、その結果を図１５に示す。図１５に示すように、導電率が低下するに従って宿主細胞蛋白質含有量が低下し、５ｍＳ／ｃｍ以下で１０ｐｐｍ未満の低い宿主細胞蛋白質含有量が確認された。

【0151】

以上の結果から、ｐＨ調整清澄化液の導電率を好ましくは０～５ｍＳ／ｃｍに、より好ましくは０～２ｍＳ／ｃｍに、特に好ましくは０～１ｍＳ／ｃｍに調整することによって、高い回収比率と宿主細胞蛋白質、重合体および分解物などの不純物の効果的除去を同時に達成できることが判った。

【0152】

実施例５ 活性炭処理に適した活性炭前処理液の塩化ナトリウム濃度
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。１時間静置後、細胞および生成した沈殿をフィルターデプスフィルター［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］およびＳＨＣ膜（メルク社製）で除去した。

【0153】

得られたｐＨ調整清澄化液をＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ３０ｋＤ］で５倍濃縮後、連続的にミリＱ水を加水して導電率を１ｍＳ／ｃｍ以下に調整した。この溶液に塩化ナトリウムを添加して、抗体濃度２０ｍｇ／ｍＬで、塩化ナトリウム濃度が０ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１６０ｍｍｏｌ／Ｌの各塩化ナトリウム濃度調整液を得た。

【0154】

各塩化ナトリウム濃度調整液約５ｇに活性炭（日本エンバイロケミカルズ社製：特製白鷺、白鷺は登録商標）を負荷量が０．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭になるように添加し、室温にて一晩撹拌した。撹拌後の各溶液を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）し、メンブランフィルター（０．２μｍフィルター）でろ過した各塩化ナトリウム濃度の活性炭処理液を得た。活性炭を添加していない各塩化ナトリウム濃度調整液をコントロールとした。

【0155】

得られた各塩化ナトリウム濃度の活性炭処理液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）を図１６に示す。図１６に示すように、低塩化ナトリウム濃度になるに従って回収比率が高くなり、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下では９０％以上の高い回収比率が確認された。

【0156】

各塩化ナトリウム濃度の活性炭処理液の重合体含有率および分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析し、その結果を図１７および図１８に示す。図１７に示すように、塩化ナトリウム濃度が低下するに従って重合体含有率が低下し、５ｍｍｏｌ／Ｌ以下で重合体含有率が１％未満となった。また、図１８に示すように、分解物含有率は、塩化ナトリウム濃度が低下するに従って低下傾向を示し、塩化ナトリウム濃度が０～１６０ｍｍｏｌ／Ｌでは分解物含有率は全て１％未満となった。

【0157】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析した結果を図１９に示す。図１９に示すように、塩化ナトリウム濃度が低下するに従って宿主細胞蛋白質含有量が低下し、塩化ナトリウム濃度が４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下では１０ｐｐｍ未満の低い宿主細胞蛋白質含有量が確認された。

【0158】

以上の結果から、ｐＨ調整清澄化液の塩化ナトリウム濃度を好ましくは０～１０ｍｍｏｌ／Ｌに、より好ましくは０～５ｍｍｏｌ／Ｌに調整することによって、高い回収比率と宿主細胞蛋白質、重合体および分解物などの不純物の効果的除去を同時に達成できることが判った。

【0159】

実施例６ 活性炭処理に適した活性炭前処理液の抗体濃度
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。１時間静置後、細胞および生成した沈殿をデプスフィルター［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］およびＳＨＣ膜（メルク社製）で除去した。

【0160】

得られたｐＨ調整清澄化液をＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ３０ｋＤ］で濃縮／ミリＱ水加水を繰り返すことで導電率を１ｍＳ／ｃｍ以下に調整した。この溶液にミリＱ水を添加して、抗体濃度が４５．１ｍｇ／ｍＬ、２２．５ｍｇ／ｍＬ、１１．４ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、２．８ｍｇ／ｍＬおよび１．４ｍｇ／ｍＬの各抗体濃度調整液を得た。

【0161】

各抗体濃度調整液約５ｇに活性炭（日本エンバイロケミカルズ社製：特製白鷺、白鷺は登録商標）を負荷量が０．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭になるように添加し、室温にて一晩撹拌した。撹拌後の各溶液を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）し、メンブランフィルター（０．２μｍフィルター）でろ過した各抗体濃度の活性炭処理液を得た。活性炭を添加していない各抗体濃度調整液をコントロールとした。

【0162】

得られた各抗体濃度の活性炭溶出液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）を図２０に示す。図２０に示すように、何れの抗体濃度でも９０％以上の高い回収比率が確認された。

【0163】

各抗体濃度の活性炭溶出液の重合体含有率および分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析し、その結果を図２１および図２２に示す。図２１に示すように、抗体濃度が低下するに従って重合体含有率が低下し、抗体濃度が２３ｍｇ／ｍＬ以下で重合体含有率が１％未満となった。また、図２２に示すように、抗体濃度が増加するに従って分解物含有率が低下し、抗体濃度が１１ｍｇ／ｍＬ以上で分解物含有率は全て１％未満となった。

【0164】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析し、その結果を図２３に示す。図２３に示すように、抗体濃度が増加するに従って宿主細胞蛋白質含有量が低下し、抗体濃度が５．５ｍｇ／ｍＬ以上で１０ｐｐｍ未満の低い宿主細胞蛋白質含有量が確認された。

【0165】

以上の結果から、ｐＨ調整清澄化液の抗体濃度を好ましくは５．５～２３ｍｇ／ｍＬに、より好ましくは１１～２３ｍｇ／ｍＬに調整することによって、高い回収比率と宿主細胞蛋白質、重合体および分解物などの不純物の効果的除去を同時に達成できることが判った。

【0166】

実施例７ 活性炭処理に適した負荷量と活性炭処理時間
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。１時間静置後、細胞および生成した沈殿をフィルターデプスフィルター［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］およびＳＨＣ膜（メルク社製）で除去した。

【0167】

得られたｐＨ調整清澄化液をＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ３０ｋＤ］で濃縮／ミリＱ水加水を繰り返すことで導電率を１ｍＳ／ｃｍ以下に低下させた。この溶液にミリＱ水を添加して、抗体濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。

【0168】

得られた溶液約５ｇに活性炭（日本エンバイロケミカルズ社製：特製白鷺、白鷺は登録商標）を負荷量０．０５～３．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭になるように添加し、処理時間２～２４時間（２、４、８、１２または２４時間）で活性炭処理した。処理後の各溶液を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）し、メンブランフィルター（０．２μｍフィルター）でろ過した各活性炭処理液を得た。活性炭を添加していないものをコントロールとした。各負荷量および処理時間で処理した活性炭処理液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析した。

【0169】

その結果、図２４に示すように、負荷量０．０５ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭では２４時間処理で回収比率（Ｃ／Ｃｏ）の低下が認められたが、その他の負荷量では２４時間処理でも回収比率は維持された。

【0170】

各活性炭処理液の重合体含有率および分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて解析し、その結果を図２５および図２６に示す。図２５に示すように、負荷量０．０５～３．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭および処理時間２～２４時間の何れの検討条件でも重合体含有率が１％未満となった。また、図２６に示すように、分解物含有率は、負荷量が低くなるに従って、また、処理時間が長くなるに従って低下し、負荷量が０．０５～０．３ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭で処理時間が１２～２４時間で分解物含有率が全て１％未満となった。

【0171】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析し、各活性炭処理液の分析結果を図２７に示す。図２７に示すように、負荷量が低くなるに従って、また、処理時間が長くなるに従って、宿主細胞蛋白質含有量が低下し、負荷量が０．０５～０．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭で処理時間が８～２４時間で宿主細胞蛋白質含有量が１０ｐｐｍ未満になった。

【0172】

図２４～２７の結果から、いずれの不純物も十分に除去でき、且つ回収比率も高い負荷量と活性炭処理時間の組み合わせは、負荷量が０．１～０．３ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭で且つ処理時間が８～２４時間、又は負荷量が０．０５～０．１５ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭で且つ処理時間が２～１２時間であることが確認された。

【0173】

実施例８ 活性炭膜の一回通液処理と循環通液処理による不純物除去効果
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養液１８５Ｌを酸またはアルカリでｐＨ４．５に調整した。ｐＨ調整ＣＨＯ細胞培養液を一時間静置後、細胞分離デプス膜［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］を用いて細胞を除去し、ＳＨＣ膜（メルク社製）を用いてｐＨ調整清澄化液を得た。

【0174】

ｐＨ調整清澄化液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３］を用いて５Ｌまで濃縮し、純水を用いて１８．５Ｌまで希釈し、濃縮希釈液を調製した。濃縮希釈液のうち、１７．５Ｌを２．８ｍ^２の活性炭膜［Ｐａｌｌ社製：Ｓｔａｘ（商標） ＡＫＳ１］に一回通液し一回通液処理液を得た。次いで、室温で１６時間循環通液した後、循環液を回収した。更に、１８．５Ｌの純水を活性炭膜に通液し回収後、これを循環液と合わせて混和した。得られた混和回収液を、ＳＨＣ膜（メルク社製）に通液し、循環通液処理液を得た。

【0175】

ゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて各活性炭膜処理液の分解物含有率を分析した結果を図２８に示す。図２８に示すように、活性炭膜に一回通液することで著しく分解物含量が低下し、循環通液することでさらに低下した。

【0176】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析し、その結果を図２９に示す。図２９に示すように、活性炭膜に一回通液することで３０分の一まで宿主細胞蛋白質含有量が低下し、循環通液することで一回通液の８０分の一のレベルまで顕著に低下した。

【0177】

各活性炭膜処理液のＤＮＡ濃度をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ法により分析した結果を図３０に示す。図３０に示すように、活性炭膜に一回通液するだけでＤＮＡ濃度は定量限界未満まで除去されることが明らかになった。

【0178】

以上の結果から、活性炭膜処理は一回通液処理よりも循環通液処理の方が効果的に不純物を除去可能であることが確認された。

【0179】

実施例９ 活性炭処理に適した活性炭種
精密ろ過により清澄化したモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ、Ｃ、Ｄ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酸またはアルカリでｐＨ４．５にそれぞれ調整した。一時間静置後、生成した沈殿を遠心分離（１３，２００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）で除去し、各ｐＨ調整清澄化液を得た。

【0180】

次いで、得られた各ｐＨ調整清澄化液約２ｍＬに図３１および図３２に示す各活性炭（日本エンバイロケミカルズ社製、Ｎｏｒｉｔ社製、フタムラ化学社製）を２０～４０ｍｇ添加し、混合した。混和液は、室温で１６時間ローテーターを用いて撹拌し、遠心分離（１３，２００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）で活性炭を除去し、各活性炭処理液を得た。

【0181】

各活性炭処理液の抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収比率（Ｃ／Ｃ_０）を図３１に示す。また、得られた各活性炭処理液の宿主細胞蛋白質濃度をＥＬＩＳＡ法により分析した結果を図３２に示す。

【0182】

図３１および図３２に示すように、全ての活性炭について宿主細胞蛋白質の除去性が確認されたが、特に木質系活性炭である強力白鷺、太閤Ｙ、特製白鷺、白鷺Ｐ、白鷺Ａ、白鷺Ｃ（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、太閤ＫＡ、太閤Ａ（フタムラ化学社製）、Ｎｏｒｉｔ Ｃ ＧＳＰ、Ｎｏｒｉｔ ＣＮＩ（以上、日本ノリット社製、Ｎｏｒｉｔは登録商標）、および木質とビートからなる活性炭であるＮｏｒｉｔ ＧＢＧ（日本ノリット社製、Ｎｏｒｉｔは登録商標）は特に宿主細胞蛋白質の除去性が高いことが確認された。さらに、木質系活性炭のなかでも特に塩化亜鉛賦活化活性炭である強力白鷺、太閤Ｙ、特製白鷺は高い宿主細胞蛋白質の除去性を有していることが確認された。

【0183】

次に、各活性炭溶出液の重合体含有率および分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて、分析した結果を図３３および図３４に示す。

【0184】

図３３に示すように、重合体含有率はＭａｂ Ａにおいて著しい低減が確認された。塩化亜鉛賦活化木質系活性炭である強力白鷺、特製白鷺（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、太閤Ｙ（フタムラ化学社製）、あるいは水蒸気賦活化木質系活性炭である白鷺Ｐ、白鷺Ａ、白鷺Ｃ（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、太閤ＫＡ、太閤Ａ（以上、フタムラ化学社製）で特に大きな重合体含有率の低下を確認した。

【0185】

また、図３４に示すように、分解物含有率はいずれの抗体においても活性炭処理による低減が確認された。活性炭の中でも、木質系活性炭である強力白鷺、特製白鷺、白鷺Ｐ、白鷺Ａ、白鷺Ｃ（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、太閤Ｙ、太閤ＫＡ、太閤Ａ（以上、フタムラ化学社製）、Ｎｏｒｉｔ Ｃ ＧＳＰ、Ｎｏｒｉｔ ＣＮＩ、および木質とビートからなる活性炭であるＮｏｒｉｔ ＧＢＧ（以上、日本ノリット社製、Ｎｏｒｉｔは登録商標）で処理することによって著しい分解物含有率の低下が確認された。特に、塩化亜鉛賦活化木質系活性炭である強力白鷺、特製白鷺（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）、太閤Ｙ（フタムラ化学社製）で処理することにより、分解物含有率は効果的に低下することが確認された。

【0186】

実施例１０ 活性炭膜処理に適した活性炭種
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。１時間静置後、細胞および生成した沈殿をデプスフィルター［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］およびＳＨＣ膜（メルク社製）で除去した。

【0187】

得られたｐＨ調整清澄化液をＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ３０ｋＤ］で濃縮／ミリＱ水加水を繰り返すことで導電率を１ｍＳ／ｃｍ以下に低下させた。この溶液にミリＱ水を添加して、抗体濃度３０ｍｇ／ｍＬに調整した。

【0188】

得られた溶液を表１に示す活性炭膜および処理条件で通液し、ろ過した溶液を再度活性炭膜に戻す循環処理を室温にて１６時間実施した。その後、循環液および膜内部に残った抗体を回収した各活性炭膜処理液を得た。活性炭膜処理していないものをコントロールとした。

【0189】

【表1】

【0190】

得られた各活性炭膜処理液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収率を図３５に示す。図３５に示すように、特製白鷺、強力白鷺（以上、日本エンバイロケミカルズおよび３Ｍ社製、白鷺は登録商標）またはＡＫＳ１フィルター（Ｐａｌｌ社製）で、８０％以上の高い回収率が得られた。

【0191】

各活性炭膜処理液の重合体含有率および分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析し、その結果を図３６および図３７に示す。図３６および図３７に示すように、何れの膜種でも、重合体含有率および分解物含有率が１％未満となった。

【0192】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析し、その結果を図３８に示す。図３８に示すように、何れの膜種でも、宿主細胞蛋白質含有量はおよそ１０ｐｐｍ未満であった。

【0193】

以上の結果から、何れの活性炭膜種でもほぼ同様に低レベルまで不純物除去効果を有することが確認されたが、特製白鷺、強力白鷺（以上、日本エンバイオケミカルズおよび3M社製、白鷺は登録商標）またはＡＫＳ１フィルター（Ｐａｌｌ社製）ではより高い回収率が得られた。

【0194】

実施例１１ 活性炭処理に適した活性炭細孔径
Ｍａｂ Ａを含有するｐＨ調整清澄化液を各種活性炭で処理した際の、活性炭の平均細孔径と活性炭処理後のＨＣＰ濃度との関係を図３９に示す。活性炭の平均細孔径は窒素吸着等温吸着曲線よりＢＪＨ法を用いて算出した。

【0195】

図３９に示すように、平均細孔径とＨＣＰ濃度には相関があり、平均細孔径が大きくなるに従ってＨＣＰ濃度の著しい低下が確認された。特に、平均細孔径が３．２ｎｍを超える活性炭で処理することによってＨＣＰ濃度が効果的に低下することが確認された。

【0196】

Ｍａｂ Ａ含有ｐＨ調整清澄化液を各種活性炭で処理した際の、活性炭の平均細孔径と活性炭処理後の重合体含有率、分解物含有率との関係をそれぞれ図４０および図４１に示す。図４０および図４１に示すように、平均細孔径と重合体含有率、分解物含有率には相関があり、平均細孔径が大きくなるに従ってこれらの含有率の著しい低下が確認された。特に、平均細孔径が３．２ｎｍを超える活性炭で処理することによってこれらの含有率が効果的に低下することが確認された。

【0197】

実施例１２ 活性炭前処理液に適した酸またはアミノ酸添加
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を酢酸でｐＨ４．５に調整した。１時間静置後、細胞および生成した沈殿をデプスフィルター［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］およびＳＨＣ膜（メルク社製）で除去した。

【0198】

得られたｐＨ調整清澄化液をＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ３０ｋＤ］で濃縮／ミリＱ水加水を繰り返すことで溶液の導電率を低下させた。ミリＱ水にて、抗体濃度約２０ｍｇ／ｍＬに調整後、図４２～４４に示す酸またはアミノ酸溶液を添加してｐＨ４．２５に調整した各活性炭前処理液を準備した。

【0199】

次いで、得られた各ｐＨ調整液約５ｇに活性炭（日本エンバイロケミカルズ社製、特製白鷺、白鷺は登録商標）を負荷量０．２ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭で添加し、室温で１６時間撹拌した。その後、各溶液を遠心分離（２，９００ｇ、１０分）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２μｍフィルター）し、各活性炭処理液を得た。活性炭を添加していない各酸またはアミノ酸添加溶液をコントロールとした。

【0200】

各活性炭処理液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、回収比率（Ｃ／Ｃｏ）を図４２に示す。図４２に示すように、５０％酢酸、３Ｍクエン酸、または３Ｍグリシンを添加した場合、特に高い回収比率（Ｃ／Ｃｏ）を示した。

【0201】

各活性炭溶出液の重合体含有率および分解物含有率はゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析した。活性炭処理による各酸またはアミノ酸添加による重合体含有率および分解物含有率を図４３および図４４に示す。図４３に示すように、２Ｍアルギニンを除いて、何れの各酸またはアミノ酸を添加しても重合体含有率が１％未満となった。図４４に示すように、分解物含有率は、検討した各酸またはアミノ酸では、何れも分解物含有率が全て１％未満となった。

【0202】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析した。各酸またはアミノ酸添加による宿主細胞蛋白質含有量を図４５に示す。図４５に示すように、各酸またはアミノ酸添加では、何れも１０ｐｐｍ未満の低いＨＣＰであった。

【0203】

以上の結果から、不純物の除去効果が高く、且つ回収比率も高い活性炭前処理液に適した酸またはアミノ酸の添加としては、５０％酢酸、３Ｍクエン酸、または３Ｍグリシンが特に好ましかった。

【0204】

実施例１３ Ｍａｂ Ａ精製［活性炭プロセス（１）］
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養液を酸またはアルカリでｐＨ４．５に調整した。一時間静置後、細胞分離デプス膜［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］を用いて細胞を除去し、ＳＨＣ膜（メルク社製）を通してｐＨ調整清澄化液を得た。

【0205】

ｐＨ調整清澄化液２０Ｌを、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３］を用いて４００ｍＬに濃縮後、ミリＱ水を用いて４０００ｍＬに希釈した濃縮希釈液を調製した。濃縮希釈液のうち、３７００ｍＬを２つの３Ｌ スピナーフラスコ（コーニング社製）に移し、それぞれ強力白鷺（日本エンバイロケミカルズ社製、白鷺は登録商標）を８１．４１ｇ添加後、室温で１６時間混合撹拌して活性炭混合液を調整した。活性炭混合液を遠心分離し、上澄液を回収した。

【0206】

更に、沈殿した活性炭にそれぞれミリＱ水を２２０ｍＬ添加して懸濁し、再度遠心分離を行って上澄液を回収した。この操作をもう一度繰り返し、得られた上澄液を全て混和した。混和した上澄液をＳＨＣ膜（メルク社製）を用いて清澄化した活性炭処理液４５８０ｍＬを得た。

【0207】

活性炭処理液に２ｍｏｌ／Ｌ酢酸を添加してｐＨを３．５に調整後、１時間保持することでウイルス不活化を実施した。ウイルス不活化後、３ｍｏｌ／Ｌトリス溶液を用いてｐＨを８．０に調整したウイルス不活化処理液を得た。

【0208】

ウイルス不活化処理液のうち、２Ｌを予め１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換膜［旭化成メディカル社製：Ｑｙｕ Ｓｐｅｅｄ（商標） Ｄ、１５０ｍＬ］に通液した。次いで、平衡化緩衝液を通液し非吸着画分を回収後、２Ｍ酢酸でｐＨを５．０に調整したＱＳＤ処理液を得た。

【0209】

ＱＳＤ処理液を予め１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラム［メルク社製：Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＣＰＸ、５０ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ］に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。次に、平衡化緩衝液と０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた直線塩濃度勾配（１０カラム容量）により、ＣＰＸ溶出液を得た。

【0210】

ＣＰＸ溶出液を、予めミリＱ水で平衡化したウイルス除去膜［旭化成メディカル社製：Ｐｌａｎｏｖａ（商標） ２０Ｎ、０．０１ｍ^２］に通液し、ウイルスろ過膜処理液を得た。ウイルスろ過膜処理液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３、０．１１ｍ^２］を用いて１２０ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２４５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、濃縮・緩衝液置換液を得た。

【0211】

濃縮・緩衝液置換液に２．２０ｇ／Ｌのポリソルベート８０および２４５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトール含有１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２）をポリソルベート８０の終濃度が０．２ｇ／Ｌになるように添加後、フィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、活性炭プロセス（１）精製品を得た。

【0212】

実施例１４ Ｍａｂ Ａ精製［活性炭プロセス（２）］
実施例１３で得られたウイルス不活化処理液２Ｌを、予め１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂［東ソー社製：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＮＨ_２－７５０Ｆ、３２ｍｍ ＩＤｘ２４ｃｍ］に通液した。次いで、平衡化緩衝液を通液し、カラム非吸着画分を回収後、２Ｍ酢酸でｐＨを５．０に調整したＮＨ_２ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ処理液を得た。

【0213】

ＮＨ_２ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ処理液を、予めミリＱ水で平衡化したウイルス除去膜［旭化成メディカル社製：Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標） ２０Ｎ、０．０１ｍ^２］に通液し、ウイルスろ過膜処理液を得た。ウイルスろ過膜処理液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３、０．１１ｍ^２］を用いて１２０ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２４５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、濃縮・緩衝液置換液を得た。

【0214】

濃縮・緩衝液置換液に２．２０ｇ／Ｌのポリソルベート８０および２４５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２）をポリソルベート８０の終濃度が０．２ｇ／Ｌになるように添加後、フィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、活性炭プロセス（２）精製品を得た。

【0215】

比較例１ Ｍａｂ Ａ精製（プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを含むプロセス）
実施例１３と同一のモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ａ）を含むＣＨＯ細胞培養液を遠心分離して細胞を除去し、得られた上清をデプス膜［ミリポア社製：ミリスタック（登録商標）ＰＯＤフィルター］および精密ろ過膜を用いて清澄化液を得た。

【0216】

清澄化液を、予め１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラム［ＧＥヘルスケア社製：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標） ＳｕＲｅ］に添加した。添加終了後、５カラム容量の１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）および平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。

【0217】

次に、５カラム容量の１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液（ｐＨ３．２）により溶出したカラム溶出画分をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液としてプールした。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加してｐＨを３．５に調整し、１時間保持することでウイルス不活化を実施した。ウイルス不活化後、０．５Ｍトリス溶液を用いてｐＨを７．０に中和し、デプスフィルター［ミリポア社製：ミリスタック（登録商標）ＰＯＤフィルター］を通してウイルス不活化処理液を得た。

【0218】

ウイルス不活化処理液を、予め１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは登録商標）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液し、カラム非吸着画分をプールした後、１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液でｐＨ５．０に調整したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を得た。

【0219】

Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、予め５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム［メルク社製：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標） ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐ］に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。

【0220】

次に平衡化緩衝液と０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた直線塩濃度勾配（１０カラム容量）によりＦｒａｃｔｏｇｅｌ回収液を得た。

【0221】

Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ回収液を、予め５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したウイルス除去膜［旭化成メディカル社製：Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標） ２０Ｎ］に通液し、ウイルスろ過膜処理液を得た。

【0222】

ウイルスろ過膜処理液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３］を用いた１２０ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２４５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトール含有１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、濃縮・緩衝液置換液を得た。

【0223】

濃縮・緩衝液置換液に２．２０ｇ／Ｌのポリソルベート８０および２４５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．２）をポリソルベート８０の終濃度が０．２ｇ／Ｌになるように添加後、フィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、プロテインＡプロセス精製品を得た。

【0224】

プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと活性炭プロセス（１）および活性炭プロセス（２）の比較を行った結果を以下に示す。

【0225】

プロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により濃度定量を用いて分析した精製各工程の回収率および精製工程全体を通じた総回収率を図４６に示す。ゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析した精製中間体および最終精製品の重合体含有率の結果を図４７に、分解物含有率の結果を図４８にそれぞれ示す。

【0226】

図４６～４８に示すように、活性炭プロセス（１）および（２）では、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーに比べて回収率が若干低下するものの、５０％以上もの回収率を示し、重合体および分解物が効果的に除去された。

【0227】

精製中間体および最終精製品の宿主細胞蛋白質濃度をＥＬＩＳＡ法により分析した結果を図４９に示す。図４９に示すように、活性炭プロセス（１）および（２）では、プロテインＡクロマトグラフィーと比較して宿主細胞蛋白質が１００倍以上除去されることが明らかになった。また、原薬においても活性炭プロセス（１）および（２）の方がプロテインＡプロセスよりも宿主細胞蛋白質濃度が低かった。

【0228】

精製中間体および最終精製品のＤＮＡ濃度をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ法により分析した結果を図５０に示す。活性炭プロセス（１）および（２）では、プロテインＡクロマトグラフィーと比較して１８００分の１未満の濃度まで低下していることが明らかになった。

【0229】

また、陽イオン交換ＨＰＬＣ法を用いて分析した精製中間体および最終精製品のｐｒｅ－ｐｅａｋ含有率およびｐｏｓｔ－ｐｅａｋ含有率の結果を図５１および図５２に示す。図５１および図５２に示すように、活性炭処理により、ｐｏｓｔ－ｐｅａｋ含有率はプロテインＡプロセスよりも低下し、より均一な抗体組成物となっていることが確認された。

【0230】

以上の結果から、従来のプロテインＡプロセスに比べて濃縮希釈により前処理液を調製する活性炭プロセス（１）および（２）では重合体、分解物、宿主細胞蛋白質、ＤＮＡおよびｐｏｓｔ－ｐｅａｋ等の不純物がいずれも効果的に除去された。

【0231】

その結果、医薬品品質レベルまでこれら不純物を除去するために従来のプロテインＡプロセスでは陰イオン交換と陽イオン交換の両イオン交換クロマトグラフィーが必要であったが、活性炭プロセス（１）および（２）ではどちらか一方のイオン交換クロマトグラフィーのみで医薬品品質レベルまで不純物が除去できることが確認された。

【0232】

実施例１５ Ｍａｂ Ｂ精製（活性炭プロセス）
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養液１８５Ｌを酸またはアルカリでｐＨ４．５に調整した。ｐＨ調整ＣＨＯ細胞培養液を一時間静置後、細胞分離デプス膜［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］を用いて細胞を除去し、ＳＨＣ膜（メルク社製）を用いてｐＨ調整清澄化液を得た。

【0233】

ｐＨ調整清澄化液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３］を用いて５Ｌまで濃縮し、純水を用いて１８．５Ｌまで希釈し、濃縮希釈液を調製した。濃縮希釈液のうち、１７．５Ｌを２．８ｍ^２の活性炭膜［Ｐａｌｌ社製：Ｓｔａｘ（商標） ＡＫＳ１］に一晩循環通液した後、循環液を回収した。更に、１８．５Ｌの純水を活性炭膜に通液し回収後、これを循環液と合わせて混和した。得られた混和回収液を、ＳＨＣ膜（メルク社製）に通液し、活性炭処理液を得た。

【0234】

活性炭処理液２８．８Ｌに３ｍｏｌ／Ｌトリスを添加し、ｐＨを７．０に調整後、予め１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換膜［旭化成メディカル社：Ｑｙｕ Ｓｐｅｅｄ（商標） Ｄ、１５０ｍＬ］に通液した。次いで、陰イオン交換膜に平衡化緩衝液を通液し、膜非吸着画分をＱＳＤ処理液として回収した。

【0235】

ＱＳＤ処理液に５０％（Ｗ／Ｗ）酢酸を添加してｐＨを３．５に調整し、１時間保持することでウイルス不活化を実施した。ウイルス不活化後、３Ｍトリス溶液を用いてｐＨを５．０に調整し、ウイルス不活化処理液を得た。

【0236】

ウイルス不活化処理液２６．９Ｌを、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３、０．１１ｍ^２］を用いて１２０ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、濃縮・緩衝液置換液を得た。濃縮・緩衝液置換液をフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、活性炭プロセス精製品を得た。

【0237】

比較例２ Ｍａｂ Ｂ精製（プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを含むプロセス） 実施例１５と同一のモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養液を遠心分離して細胞を除去し、デプス膜［ミリポア社製：ミリスタック（登録商標）ＰＯＤフィルター］および精密ろ過膜を用いて清澄化液を得た。

【0238】

清澄化液を、予め１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラム［ＧＥヘルスケア社製：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標） ＳｕＲｅ］に添加した。添加終了後、５カラム容量の１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）および平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。

【0239】

洗浄後、５カラム容量の１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液（ｐＨ３．２）により溶出したカラム溶出画分をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液としてプールした。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加してｐＨを３．５に調整し、１時間保持することでウイルス不活化を実施した。ウイルス不活化後、０．５Ｍトリス溶液を用いてｐＨを７．０に中和し、デプスフィルター［ミリポア社製：ミリスタック（登録商標）ＰＯＤフィルター］を通してウイルス不活化処理液を得た。

【0240】

ウイルス不活化処理液を、予め１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは登録商標）に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液し、カラム非吸着画分をプールした後、１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液でｐＨ５．０に調整したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を得た。

【0241】

Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、予め５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム［メルク社製：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標） ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐ］に添加した。

【0242】

添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。次に０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）からなる溶出緩衝液によりＦｒａｃｔｏｇｅｌ回収液を得た。

【0243】

Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ回収液を、予め５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したウイルス除去膜［旭化成メディカル社製：Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標） ２０Ｎ、０．０１ｍ^２］に通液し、ウイルスろ過膜処理液を得た。

【0244】

ウイルスろ過膜処理液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３］を用いて１２０ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、濃縮・緩衝液置換液を得た。濃縮・緩衝液置換液をフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、プロテインＡプロセス精製品を得た。

【0245】

プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと活性炭プロセスとを含むプロセスの比較を以下に示す。

【0246】

プロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により濃度定量を用いて分析した精製各工程の回収率を図５３に示す。図５３に示すように、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと活性炭プロセスでは同レベルの回収率が得られた。

【0247】

ゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析した精製中間体および最終精製品の重合体含有率の結果を図５４に、分解物含有率の結果を図５５に示す。図５４および図５５に示すように、重合体、分解物ともに活性炭プロセスではプロテインＡプロセスと同レベル除去されていることが確認された。

【0248】

宿主細胞蛋白質濃度をＥＬＩＳＡ法により分析した結果を図５６に示す。図５６に示すように、活性炭処理後の宿主細胞蛋白質濃度は、プロテインＡクロマトグラフィー後と比較して４００分の１の濃度まで低下していることが明らかになった。

【0249】

精製中間体および最終精製品のＤＮＡ濃度をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ法により分析した結果を図５７に示す。図５７に示すように、活性炭処理後のＤＮＡ濃度は、プロテインＡクロマトグラフィー後と比較して１０００分の１未満の濃度まで低下していることが明らかになった。

【0250】

また、陽イオン交換ＨＰＬＣ法を用いて分析した精製中間体および最終精製品のｐｒｅ－ｐｅａｋ含有率およびｐｏｓｔ－ｐｅａｋ含有率の結果を図５８および図５９に示す。図５９に示すように、活性炭処理により、ｐｏｓｔ－ｐｅａｋ含有率はプロテインＡプロセスよりも低下し、より均一な抗体組成物となっていることが確認された。

【0251】

以上の結果から、従来のプロテインＡプロセスに比べて濃縮希釈により前処理液を調製し、活性炭膜に循環させるプロセスにおいても重合体、分解物、宿主細胞蛋白質、ＤＮＡおよびｐｏｓｔ－ｐｅａｋ等の不純物がいずれも効果的に除去された。

【0252】

その結果、医薬品品質レベルまでこれら不純物を除去するために従来のプロテインＡプロセスでは陰イオン交換と陽イオン交換の両イオン交換クロマトグラフィーが必要であったが、活性炭膜に循環させるプロセスではカラムを用いない陰イオン交換膜のみで医薬品品質レベルまで不純物が除去でき、且つ従来のプロテインＡプロセスと同レベルの高回収率を達成できることが確認された。

【0253】

実施例１６ Ｍａｂ Ｂ精製［活性炭プロセス（１）］
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養液４００Ｌを酸またはアルカリでｐＨ４．５に調整した。ｐＨ調整ＣＨＯ細胞培養液を一時間静置後、細胞分離デプス膜［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］を用いて細胞を除去し、ＭＦ膜［Ｐａｌｌ社製：フロロダイン（登録商標）］を用いてｐＨ調整清澄化液を得た。

【0254】

ｐＨ調整清澄化液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３］を用いて１６Ｌまで濃縮し、純水を１６Ｌ加えて希釈する濃縮希釈を３回繰り返して実施した。さらに、同様の濃縮を行った後、純水を加えて４０Ｌまで希釈した濃縮希釈液を得た。

【0255】

濃縮希釈液のうち、３８Ｌを１１．４ｍ^２の活性炭膜［Ｐａｌｌ社製：Ｓｔａｘ（商標） ＡＫＳ１］に通液後、次いで、ＳＨＣ膜（メルク社製）を通液させる循環工程を一晩連続的に実施した。この循環工程で得られた循環液を回収後、２６．４Ｌの純水を活性炭膜およびＳＨＣ膜に通液して洗浄液１を回収した。再度同量の純水を活性炭膜およびＳＨＣ膜に通液して洗浄液２を回収し、洗浄液１、洗浄液２および循環液を合わせて混和し、活性炭処理液を得た。

【0256】

活性炭処理液８２．６Ｌに３ｍｏｌ／Ｌトリスを添加し、ｐＨを７．０に調整し、予め１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換膜［旭化成メディカル社製：Ｑｙｕ Ｓｐｅｅｄ（商標） Ｄ、５５０ｍＬ］に通液した。次いで、平衡化緩衝液を通液し、非吸着画分をＱＳＤ処理液として回収した。

【0257】

ＱＳＤ処理液に５０％（Ｗ／Ｗ）酢酸を添加してｐＨを３．５に調整し、１時間保持することでウイルス不活化を実施した。ウイルス不活化後、３Ｍトリス溶液を用いてｐＨを５．０に調整し、ウイルス不活化処理液を得た。

【0258】

ウイルス不活化処理液９７Ｌをウイルス除去膜［旭化成メディカル社製：Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標） ２０Ｎ、１．００ｍ^２］に通液した。次いで２Ｌの純水を通液し、ウイルス除去膜処理液を得た。ウイルス除去膜処理液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３、４．５６ｍ^２］を用いて８２ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、ＳＨＣ膜（メルク社製）に通液して濃縮・緩衝液置換液を得た。

【0259】

濃縮・緩衝液置換液に２．５５ｇ／Ｌ ポリソルベート８０および２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）をポリソルベート８０の終濃度が０．０５％となるように添加後、フィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、活性炭プロセス精製品（１）を得た。

【0260】

実施例１７ Ｍａｂ Ｂ精製［活性炭プロセス（２）］
実施例１６で得られた活性炭処理液１Ｌに３Ｍトリス溶液を添加してｐＨを７．０に調整し、予め１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂（東ソー社製：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＮＨ_２－７５０Ｆ、２６ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ）に通液した。次いで、平衡化緩衝液を通液し、カラム非吸着画分をＮＨ_２ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ処理液として回収した。

【0261】

ＮＨ_２ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ処理液に５０％（Ｗ／Ｗ）酢酸を添加してｐＨを３．５に調整し、１時間保持することでウイルス不活化を実施した。ウイルス不活化後、３Ｍトリス溶液を用いてｐＨを５．０に調整し、ウイルス不活化処理液を得た。

【0262】

ウイルス不活化処理液をウイルス除去膜［旭化成メディカル社製：Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標） ２０Ｎ、０．０１ｍ^２］に通液した。次いで１００ｍＬのミリＱ水を通液し、ウイルス除去膜処理液を得た。ウイルス除去膜処理液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３、０．１１ｍ^２］を用いて８２ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、濃縮・緩衝液置換液を得た。

【0263】

濃縮・緩衝液置換液に２．５５ｇ／Ｌ ポリソルベート８０および２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）をポリソルベート８０の終濃度が０．０５％となるように添加後、フィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、活性炭プロセス精製品（２）を得た。

【0264】

実施例１８ Ｍａｂ Ｂ精製［活性炭プロセス（３）］
実施例１６で得られたウイルス不活化処理液２．５Ｌを、予め１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）からなる平衡化緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラム［メルク社製：Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＣＰＸ、５０ｍｍ ＩＤｘ２０ｃｍ］に添加した。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。

【0265】

次に、平衡化緩衝液と０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた直線塩濃度勾配（１０カラム容量）により、ＣＰＸ溶出液を得た。

【0266】

ＣＰＸ溶出液をウイルス除去膜［旭化成メディカル社製：Ｐｌａｎｏｖａ（商標） ２０Ｎ、０．０１ｍ^２］に通液した。次いで１００ｍＬのミリＱ水を通液し、ウイルス除去膜処理液を得た。ウイルス除去膜処理液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３、０．１１ｍ^２］を用いて８２ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮後、２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）への緩衝液置換を行い、濃縮・緩衝液置換液を得た。

【0267】

濃縮・緩衝液置換液に２．５５ｇ／Ｌ ポリソルベート８０および２６２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ－ソルビトール含有１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸緩衝液（ｐＨ５．２）をポリソルベート８０の終濃度が０．０５％となるように添加後、フィルターろ過（０．２２μｍフィルター）し、活性炭プロセス精製品（３）を得た。

【0268】

実施例１６～１８に記載の活性炭プロセス（１）～（３）の比較を以下に示す。

【0269】

プロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により濃度定量を用いて分析した各精製工程の回収率を図６０に示す。ゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて分析した精製中間体および最終精製品の重合体含有率の結果を図６１に、分解物含有率の結果を図６２に示す。図６１および図６２に示すように、重合体、分解物ともに活性炭プロセス（１）～（３）ではほぼ同レベルで除去されていることが確認された。

【0270】

精製中間体および最終精製品の宿主細胞蛋白質濃度をＥＬＩＳＡ法により分析した結果を図６３に示す。図６３に示すように、宿主細胞蛋白質は活性炭プロセス（１）～（３）ではほぼ同レベルで除去されていることが確認された。

【0271】

精製中間体および最終精製品のＤＮＡ濃度をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ法により分析した結果を図６４に示す。図６４に示すように、ＤＮＡは活性炭プロセス（１）～（３）ではほぼ同レベルで除去されていることが確認された。

【0272】

実施例１９ 活性炭への高糖鎖付加蛋白質およびＰＥＧ化蛋白質の吸着試験
糖鎖含有率の高い蛋白質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）、糖鎖付加数を増やした改変エリスロポエチン（改変ＥＰＯ）を用いて活性炭吸着検討を行った。

【0273】

１５ｍＬチューブに特製白鷺（日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）活性炭１０ｍｇを秤量し、予め２．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した蛋白質溶液２．５ｍＬとｐＨ４．０～９．０まで１．０刻みで調製した各緩衝液２．５ｍＬを添加し、室温で１７時間撹拌した。このとき、１ｍｇ当たりの活性炭に付加する蛋白質量は０．５ｍｇとなる。

【0274】

その後、遠心分離（２９００×ｇ、１０分間）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）により活性炭を除去し、吸光度法により残存する蛋白質濃度を測定した。同様の手順で白鷺Ｐ、白鷺ＤＯ－５（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）についても検討を行った。

【0275】

活性炭処理に用いた緩衝液のｐＨと吸着率の関係について図６５～図６７に示す。その結果、糖鎖含有率の高いＥＰＯおよび改変ＥＰＯはｐＨ４～９で吸着率が低いが、宿主細胞由来蛋白質はｐＨ４～６で吸着率が高いため、活性炭を用いた非吸着モードによる精製に使用可能であることが判った。

【0276】

また、未修飾Ｇ－ＣＳＦおよびそのＰＥＧ化蛋白質であるＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ、ＰＥＧ化ＴＰＯを用いて活性炭吸着検討を行った。１５ｍＬチューブに特製白鷺（日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）活性炭１０ｍｇを秤量し、予め２．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した蛋白質溶液２．５ｍＬとｐＨ４．０～９．０まで１．０刻みで調製した各緩衝液２．５ｍＬを添加し、室温で１７時間撹拌した。このとき、１ｍｇ当たりの活性炭に付加する蛋白質量は０．５ｍｇとなる。

【0277】

その後、遠心分離（２９００×ｇ、１０分間）、続いてメンブランフィルターろ過（０．２２μｍフィルター）により活性炭を除去し、吸光度法により残存する蛋白質濃度を測定した。同様の手順で白鷺Ｐ、白鷺ＤＯ－５（以上、日本エンバイオケミカルズ社製、白鷺は登録商標）についても検討を行った。活性炭処理に用いた緩衝液のｐＨと吸着率の関係について図６６に示す。

【0278】

その結果、図６６に示すように、未修飾Ｇ－ＣＳＦとＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦを比較すると、ＰＥＧ化することにより、最大吸着率が著しく低下することが明らかになった。また、同じくＰＥＧ化されたＰＥＧ化ＴＰＯでも吸着率が低いため、活性炭を用いた非吸着モードによる精製に使用可能であることが判った。

【0279】

実施例２０ 活性炭へのウイルスの吸着試験
３種類の抗体溶液（Ｍａｂ Ｂ、Ｍａｂ ＡおよびＭａｂ Ｅ）を用いて活性炭膜によるレトロウイルスの除去検討を行った。

【0280】

Ｍａｂ Ｂ、Ｍａｂ ＡおよびＭａｂ Ｅを抗体濃度３０～６０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０～５．０、導電率０～２ｍＳ／ｃｍに調整した。それぞれの抗体溶液に対して、レトロウイルスのモデルウイルスであるネズミ科リンパ腫ウイルスＭｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＭｕＬＶ）を５ｖｏｌ％添加し、各２５ｍＬのウイルス添加液を２２ｍ^２の活性炭膜（Ｐａｌｌ社製：ＡＫＳ１フィルター）に１．５ｍＬ／ｍＬの流速で通液した。

【0281】

この時、膜を１回通液させて回収する条件（１回通液）と、循環通液を行って回収する条件（循環通液）の２通りを実施した。また、循環通液に関しては４、８、２３時間後に回収し、それぞれの時点で回収液に含まれるウイルス量をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＰＣＲ）で見積もった。結果を表２に示す。

【0282】

【表2】

【0283】

表２に示すように、活性炭膜通液によってＭｕＬＶが効果的に除去されることを確認した。１回通液と循環通液を比較すると両者に顕著な差は見られなかった。活性炭膜通液によって得られるＬｏｇａｒｉｔｈｍ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＲＦ）（３～４）はＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティクロマトグラフィーで一般的に得られるＬＲＦ（１～３）よりも大きい結果となった。

【0284】

また、３種類の抗体溶液（Ｍａｂ Ｂ、Ｍａｂ ＡおよびＭａｂ Ｅ）を用いて活性炭膜によるパルボウイルスの除去検討を行った。

【0285】

Ｍａｂ Ｂ、Ｍａｂ ＡおよびＭａｂ Ｅを抗体濃度３０～６０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０～５．０、導電率０～２ｍＳ／ｃｍに調整した。それぞれの抗体溶液に対して、パルボウイルスのモデルウイルスであるマウスパルボウイルス Ｍｉｎｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｍｉｃｅ（ＭＶＭ）を５ｖｏｌ％添加し、各２５ｍＬのウイルス添加液を２２ｍ^２の活性炭膜（Ｐａｌｌ社製：ＡＫＳ１フィルター）に１．５ｍＬ／ｍＬの流速で通液した。

【0286】

この時、膜を１回通液させて回収する条件（１回通液）と、循環通液を行って回収する条件（循環通液）の２通りを実施した。また、循環ろ過に関しては４、８、２３時間後に回収し、それぞれの時点で回収液に含まれるウイルス力価を感染価に基づいて見積もった。結果を表３に示す。

【0287】

【表3】

【0288】

表３に示すように、活性炭膜通液によってＭＶＭが効果的に除去されることを確認した。１回通液と循環通液を比較すると両者に顕著な差は見られなかった。活性炭膜通液によって得られるＬｏｇａｒｉｔｈｍ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＲＦ）（３～６）はＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティクロマトグラフィーで一般的に得られるＬＲＦ（１～３）よりも大きい結果となった。

【0289】

実施例２１ 活性炭膜の接続方法による不純物除去効果
モノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｂ）を含むＣＨＯ細胞培養液を酸でｐＨ４．５に調整した。ｐＨを調整したＣＨＯ細胞培養液を一時間静置後、細胞分離デプス膜［メルク社製：Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）］を用いて細胞を除去し、ＳＨＣ膜（メルク社製）を用いてｐＨ調整清澄化液を得た。

【0290】

ｐＨ調整清澄化液を、ＵＦ膜［メルク社製：Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３］を用いて濃縮し、ミリＱ水を用いて希釈し、濃縮希釈液の導電率を１ｍＳ／ｃｍ以下とした。濃縮希釈液の抗体濃度は１５ｍｇ／ｍＬに調製した。

【0291】

この濃縮希釈液のうち６１．３ｍＬを、負荷量が０．１ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭になるように直列に４個接続した２２ｃｍ^２の活性炭膜（Ｐａｌｌ社製：ＡＫＳ１フィルター）に表４の条件にて接触時間０．２時間で一回通液し、活性炭膜処理液を得た。

【0292】

また、濃縮希釈液のうち６１．３ｍＬを、負荷量が０．１ｍｇ抗体／ｍｇ活性炭になるように並列に４個接続した２２ｃｍ^２の活性炭膜（Ｐａｌｌ社製：ＡＫＳ１フィルター）に表４の条件で接触時間０．２時間で一回通液し、活性炭膜処理液を得た。活性炭膜処理していないものをコントロールとした。

【表4】

【0293】

得られた各活性炭膜処理液とコントロールの抗体濃度をプロテインＡアフィニティＨＰＬＣ法により分析し、算出した回収率を図６８に示す。図６８に示すように、直列および並列接続ともに約８０％の高い回収率が得られた。

【0294】

ゲルろ過ＨＰＬＣ法を用いて各活性炭膜処理液の重合体含有率を分析した結果を図６９に、分解物含有率を分析した結果を図７０に示す。図６９に示すように、直列および並列接続で重合体含有率が０．７％から０．６％に低下した。また、図７０に示すように直列接続の方が分解物含量がより低下した（直列接続：０．８％、並列接続：１．３％）。

【0295】

蛋白質１ｍｇあたりの宿主細胞蛋白質含有量はＥＬＩＳＡ法を用いて分析し、その結果を図７１に示す。図７１に示すように活性炭膜を直列接続した方が並列接続よりも顕著に宿主細胞蛋白質含有量が低下した。

【0296】

以上の結果から、活性炭膜処理は並列接続よりも直列接続の方が効果的に不純物を除去可能であることが確認された。

【0297】

本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。

【0298】

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年８月３１日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６－１７０２６５）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】