特許 7063885 標的にされた増大するＤＮＡ脱メチル化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-25

(45)【発行日】2022-05-09

(54)【発明の名称】標的にされた増大するＤＮＡ脱メチル化

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220426BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20220426BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220426BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N9/16 Z ZNA

C12N15/63 Z

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2019513954

(86)(22)【出願日】2017-09-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-10-17

(86)【国際出願番号】 US2017051411

(87)【国際公開番号】W WO2018053037

(87)【国際公開日】2018-03-22

【審査請求日】2020-09-01

(31)【優先権主張番号】62/535,113

(32)【優先日】2017-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/485,210

(32)【優先日】2017-04-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/393,944

(32)【優先日】2016-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】398066918

【氏名又は名称】ザ ジャクソン ラボラトリー

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＪＡＣＫＳＯＮ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】チェン， アルバート

(72)【発明者】

【氏名】タガバロウト， アジズ

(72)【発明者】

【氏名】ジレット， ナサニエル

【審査官】宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１４８９９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０３５４９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２３８５９３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】KIENHOFER S. et al.，Differentiation，2015年，90，p.59-68

【文献】MULLER U. et al.，Nucleic Acids Research，2014年，Vol.42, No.13，p.8592-8604

【文献】CHENG A. W. et al.，Cell Research，2016年01月15日，26，p.254-257

【文献】MORITA S. et al.，Nature Biotechnology，2016年08月29日，Vol.34 No.10，p.1060-1065, ONLINE METHODS

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ９／１６

Ｃ１２Ｎ １５／０９－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

脱メチル化複合体であって、該脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ｄＣａｓ９であるヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該ポリヌクレオチドに結合される、リボ核タンパク質複合体；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）ＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）ＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）脱メチル化エンハンサードメインであって、（１）前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインまたはその改変体であり、前記ＧＡＤＤ４５Ａドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有し、または（２）前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインまたはその改変体であり、前記ＮＥＩＬ２ドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有する、脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで該脱メチル化タンパク質結合体は、該１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合する該ＰＵＦドメインを介して該リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化タンパク質結合体、
を含む脱メチル化複合体。

【請求項2】

前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ１ドメイン、ＴＥＴ２ドメインまたはＴＥＴ３ドメインである、請求項１に記載の複合体。

【請求項3】

前記ＴＥＴ１ドメインは、配列番号５１の配列を有する、請求項２に記載の複合体。

【請求項4】

前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインである、請求項１に記載の複合体。

【請求項5】

前記ＧＡＤＤ４５ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の複合体。

【請求項6】

前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインである、請求項１に記載の複合体。

【請求項7】

前記ＮＥＩＬ２ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の複合体。

【請求項8】

前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１に記載の複合体。

【請求項9】

前記標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子、転写調節配列、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーの一部である、請求項１に記載の複合体。

【請求項10】

前記標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化核酸配列または過剰メチル化ＣｐＧ配列である、請求項１に記載の複合体。

【請求項11】

前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、長さ８ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の複合体。

【請求項12】

前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、同一である、請求項１に記載の複合体。

【請求項13】

前記ポリヌクレオチドは、１～５０個のＰＢＳ配列を含む、請求項１に記載の複合体。

【請求項14】

１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の複合体。

【請求項15】

前記ＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメイン、ＰＵＦｂドメイン、ＰＵＦｃドメイン、またはＰＵＦｗドメインを含む、請求項１に記載の複合体。

【請求項16】

前記ＰＵＦａドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、前記ＰＵＦｂドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、前記ＰＵＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、かつ／または前記ＰＵＦｗドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の複合体。

【請求項17】

非ヒト哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法であって、該方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む非ヒト哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）該非ヒト哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程であって、前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素がｄＣａｓ９である、工程；
（ｃ）該非ヒト哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列、および
（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）該非ヒト哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）ＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）ＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）脱メチル化エンハンサードメインであって、（１）前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインまたはその改変体であり、前記ＧＡＤＤ４５Ａドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有し、または（２）前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインまたはその改変体であり、前記ＮＥＩＬ２ドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有する、脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって該送達された脱メチル化タンパク質結合体は、該細胞において該標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する方法。

【請求項18】

キットであって、
（ｉ）請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体または該リボ核タンパク質複合体をコードする核酸；および
（ｉｉ）請求項１に記載の脱メチル化タンパク質結合体または該メチル化タンパク質結合体をコードする核酸、
を含む、キット。

【請求項19】

脱メチル化複合体であって、該脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ｄＣａｓ９であるヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（３）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列；ならびに
（４）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該ポリヌクレオチドに結合されるリボ核タンパク質複合体；
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有する第１のＰＵＦドメイン、および
（ｉｉ）該第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで該脱メチル化タンパク質結合体は、該第１のＰＢＳ配列に結合する該第１のＰＵＦドメインを介して該リボ核タンパク質複合体に結合する脱メチル化タンパク質結合体；ならびに
（ｃ）以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）該第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体
を含み、該脱メチル化エンハンサー結合体は、該第２のＰＢＳ配列に結合する該第２のＰＵＦドメインを介して該リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成し、（１）前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインまたはその改変体であり、前記ＧＡＤＤ４５Ａドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有し、または（２）前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインまたはその改変体であり、前記ＮＥＩＬ２ドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有する、脱メチル化複合体。

【請求項20】

非ヒト哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法であって、該方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む非ヒト哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）該非ヒト哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程であって、前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素がｄＣａｓ９である、工程；
（ｃ）該非ヒト哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（ｉｉｉ）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、および
（ｉｖ）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）該非ヒト哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第１のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）ＴＥＴ脱メチル化ドメインであって、該脱メチル化ドメインは、該第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結された脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程；ならびに
（ｅ）該非ヒト哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）該第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメインであって、（１）前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインまたはその改変体であり、前記ＧＡＤＤ４５Ａドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有し、または（２）前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインまたはその改変体であり、前記ＮＥＩＬ２ドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有する、脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体をコードする第４のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって該送達された脱メチル化タンパク質結合体は、該細胞において該標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する方法。

【請求項21】

前記ＰＵＦドメインがＮ末端およびＣ末端を有し、前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインが該ＰＵＦドメインの該Ｃ末端に作動可能に連結され、前記脱メチル化エンハンサードメインが該ＰＵＦドメインの該Ｎ末端に作動可能に連結される、請求項１に記載の脱メチル化複合体。

【請求項22】

前記ＰＵＦドメインがＮ末端およびＣ末端を有し、前記脱メチル化エンハンサードメインがＣ末端を有し、前記脱メチル化エンハンサードメインが該ＰＵＦドメインの該Ｃ末端に作動可能に連結され、前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインが該脱メチル化エンハンサードメインの該Ｃ末端に作動可能に連結される、請求項１に記載の脱メチル化複合体。

【請求項23】

前記ＰＵＦドメインがＮ末端およびＣ末端を有し、前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインが該ＰＵＦドメインの該Ｃ末端に作動可能に連結され、前記脱メチル化エンハンサードメインが該ＰＵＦドメインの該Ｎ末端に作動可能に連結される、請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

前記ＰＵＦドメインがＮ末端およびＣ末端を有し、前記脱メチル化エンハンサードメインがＣ末端を有し、前記脱メチル化エンハンサードメインが該ＰＵＦドメインの該Ｃ末端に作動可能に連結され、前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインが該脱メチル化エンハンサードメインの該Ｃ末端に作動可能に連結される、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するためのインビトロ方法であって、該方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）該哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程であって、前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素がｄＣａｓ９である、工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列、および
（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）ＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）ＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）脱メチル化エンハンサードメインであって、（１）前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインまたはその改変体であり、前記ＧＡＤＤ４５Ａドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有し、または（２）前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインまたはその改変体であり、前記ＮＥＩＬ２ドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有する、脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって該送達された脱メチル化タンパク質結合体は、該細胞において該標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する方法。

【請求項26】

哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するためのインビトロ方法であって、該方法は、
（ｆ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｇ）該哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程であって、前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素がｄＣａｓ９である、工程；
（ｈ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（ｉｉｉ）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、および
（ｉｖ）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｉ）該非ヒト哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第１のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）ＴＥＴ脱メチル化ドメインであって、該脱メチル化ドメインは、該第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結された脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程；ならびに
（ｊ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）該第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメインであって、（１）前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインまたはその改変体であり、前記ＧＡＤＤ４５Ａドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有し、または（２）前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインまたはその改変体であり、前記ＮＥＩＬ２ドメインの前記改変体のアミノ酸配列は、配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有する、脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体をコードする第４のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって該送達された脱メチル化タンパク質結合体は、該細胞において該標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年９月１３日に出願された米国仮出願番号第６２／３９３，９４４号、２０１７年４月１３日に出願された米国仮出願番号第６２／４８５，２１０号、および２０１７年７月２０日に出願された米国仮出願番号第６２／５３５，１１３号の利益を主張しており、これら仮出願は、それらの全体が、そしてすべての目的のために本明細書中に援用される。

【0002】

ＡＳＣＩＩファイルとして提出した「配列表」、表、またはコンピュータープログラムリスト付表への言及
ファイル５２８６７－５０１００２ＷＯ（２０１７年９月１３日作成、４７５キロバイト、マシーンフォーマットＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティングシステム）の中に書かれた配列表は、参考として援用される。

【背景技術】

【0003】

背景
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）は、十分な２構成要素ＤＮＡエンドヌクレアーゼを構成し、その特異性は、ｓｇＲＮＡ上の標的マッチング配列によって提供されると同時に、エンドヌクレアーゼ活性は、Ｃａｓ９タンパク質上にある。

【0004】

そのヌクレアーゼドメイン上に変異を有するヌクレアーゼ欠損型またはヌクレアーゼ欠損性Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）は、ｓｇＲＮＡと複合体化した場合にＤＮＡ結合活性を保持する。ｄＣａｓ９タンパク質は、エフェクタードメインまたはタンパク質タグを、ｓｇＲＮＡによってマッチした部位へのタンパク質融合によって繋留しかつ局在化し得、従って、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合酵素を構成する。ｄＣａｓ９は、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）またはリプレッサードメイン（例えば、ＫＲＡＢ）に融合され得、ｓｇＲＮＡによってガイドされて、標的遺伝子をそれぞれ活性化または抑制し得る。ｄＣａｓ９はまた、蛍光タンパク質と融合され得、染色体領域の生細胞蛍光標識を達成し得る。しかし、このようなシステムにおいて、僅か１個のＣａｓ９－エフェクター融合が可能である。なぜならｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９対形成は、排他的であるからである。また、タンパク質タグまたはエフェクター融合物の複数のコピーがある生物学的閾値またはシグナル検出閾値を達成するために必要である場合、ｄＣａｓ９タンパク質との直接融合によるエフェクターまたはタンパク質タグのマルチマー化は、このような融合物をコードする大きなＤＮＡを送達することの困難またはこのような大きなタンパク質をタンパク質サイズに起因して核へと移動するもしくは位置を変えることの困難のような制約によって、技術的に制限される。

【0005】

メチルシトシンは、ＣｐＧ ＤＮＡ配列のシトシン環の５位においてメチル基を共有結合的に付加するプロセスを介して生成されるエピジェネティックマークである。哺乳動物細胞では、５－メチルシトシン（５ｍＣ）の形成は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒されかつ維持される。脱メチル化経路（これはメチル基を除去して、非メチル化ＤＮＡを回復させる）は、タンパク質のｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ファミリーを要する。これらは、５ｍＣを非メチル化シトシンで置き換えることをもたらす最初のかつ重要な工程を触媒するＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼである。

【0006】

ＣｐＧメチル化は、細胞分化、遺伝子発現、および細胞ホメオスタシスの維持を形作るクロマチンの多面的なエピジェネティック改変の一部である。ＤＮＡメチル化は、インプリンティング、遺伝子のアレル発現の調整において主要な機構である。異常なＤＮＡメチル化は、種々の疾患（がん、インプリンティング障害および神経学的疾患が挙げられるが、これらに限定されない）に関わっている（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｋ．Ｄ．， ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ， ２００５． ６（８）： ｐ． ５９７－６１０）。

【0007】

標的細胞におけるメチル化状態を、ＤＮＡデメチラーゼおよび／またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼを導入することによって調節しようという試みが行われてきた。しかし、このような試みは、標的細胞のメチル化状態において非特異的な全体的な変化を生じる。

【0008】

その一方で、特定のゲノム遺伝子座におけるＣｐＧメチル化事象の因果関係は、生細胞において５ｍＣを非メチル化シトシンへと標的化変換するための単純な方法がないことに本質的に起因して、定義するのが未だに困難なままである。従って、シトシンメチル化の生物学を理解するために、およびシトシンメチル化／脱メチル化経路の質の変化と関連した疾患のための治療を開発するために、特定の遺伝子座におけるメチル化状態を編集することを可能にするツールが、当該分野で必要である。
特に、当該分野でこれらのおよび他の課題に対する解決策を、本明細書で開示する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｋ．Ｄ．， ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ， ２００５． ６（８）： ｐ． ５９７－６１０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明の簡単な要旨
一局面において、脱メチル化複合体が提供される。上記脱メチル化複合体は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記ポリヌクレオチドに結合される、リボ核タンパク質複合体；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端およびＮ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）上記ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）上記ＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結されて、タンパク質結合体を形成する脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで上記脱メチル化タンパク質結合体は、上記１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合するＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化タンパク質結合体、
を含む。

【0011】

別の局面において、哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法が提供される。上記方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）上記哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列、および
（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列，
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）Ｃ末端およびＮ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）上記ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）上記ＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結されて、タンパク質結合体を形成する脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって上記送達された脱メチル化タンパク質結合体は、上記細胞において上記標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する。

【0012】

一局面において、脱メチル化複合体が提供される。上記脱メチル化複合体は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記ポリヌクレオチドに結合される、リボ核タンパク質複合体；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有する脱メチル化エンハンサードメインであって、ここで上記脱メチル化エンハンサードメインのＮ末端は、上記ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される脱メチル化エンハンサードメイン；および
（ｉｉｉ）上記脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで上記脱メチル化タンパク質結合体は、上記１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合する上記ＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化タンパク質結合体、
を含む。

【0013】

別の局面において、哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法が提供される。上記方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）上記哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列，
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）Ｃ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有する脱メチル化エンハンサードメインであって、ここで上記脱メチル化エンハンサードメインのＮ末端は、上記ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される脱メチル化エンハンサードメイン；ならびに
（ｉｉｉ）上記脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって上記送達された脱メチル化タンパク質結合体は、上記細胞において上記標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する。

【0014】

一局面において、脱メチル化複合体が提供される。上記脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（３）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列；および
（４）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記ポリヌクレオチドに結合される、リボ核タンパク質複合体；
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有する第１のＰＵＦドメイン、および
（ｉｉ）上記第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで上記脱メチル化タンパク質結合体は、上記第１のＰＢＳ配列に結合する上記第１のＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合する、脱メチル化タンパク質結合体；ならびに
（ｃ）以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）上記第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体であって、ここで上記脱メチル化エンハンサー結合体は、上記第２のＰＢＳ配列に結合する上記第２のＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化エンハンサー結合体、
を含む。

【0015】

別の局面において、哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法が提供される。上記方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）上記哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（ｉｉｉ）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、および
（ｉｖ）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第１のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）脱メチル化ドメインであって、上記脱メチル化ドメインは、上記第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結された脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程；ならびに
（ｅ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）上記第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体をコードする第４のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって上記送達された脱メチル化タンパク質結合体は、上記細胞において上記標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する。

【0016】

別の局面において、キットが提供される。上記キットは、
（ｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含むリボ核タンパク質複合体またはこれらをコードする核酸；および
（ｉｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化タンパク質結合体またはこれらをコードする核酸、
を含む。

【0017】

別の局面において、キットが提供される。上記キットは、
（ｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含むリボ核タンパク質複合体またはこれらをコードする核酸；
（ｉｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化タンパク質結合体またはこれらをコードする核酸；および
（ｉｉｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化エンハンサー結合体またはこれらをコードする核酸、
を含む。

【0018】

別の局面において、本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化複合体を含む細胞が、提供される。

【0019】

本明細書で記載される任意の実施形態が、実施例の節に記載されるのみのものまたは本発明の一局面の下のみでのものを含め、具体的に権利放棄されるかまたは別段不適切でなければ、任意の１またはこれより多くの他の実施形態と組み合わされ得ることは、理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
脱メチル化複合体であって、該脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該ポリヌクレオチドに結合される、リボ核タンパク質複合体；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端およびＮ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）該ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）該ＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結されて、タンパク質結合体を形成する脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで該脱メチル化タンパク質結合体は、該１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合する該ＰＵＦドメインを介して該リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化タンパク質結合体、
を含む脱メチル化複合体。
（項目２）
前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ１ドメイン、ＴＥＴ２ドメインまたはＴＥＴ３ドメインである、項目１に記載の複合体。
（項目３）
前記ＴＥＴ１ドメインは、配列番号５１の配列を有する、項目２に記載の複合体。
（項目４）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインである、項目１～３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５）
前記ＧＡＤＤ４５ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、項目４に記載の複合体。
（項目６）
請前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインである、項目１～３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目７）
前記ＮＥＩＬ２ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を有する、項目５に記載の複合体。
（項目８）
前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項目１～７のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９）
前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ｄＣａｓ９である、項目１～８のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１０）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の一部である、項目１～９のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１１）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、転写調節配列の一部である、項目１～９のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１２）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーの一部である、項目１～９または１１のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１３）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化核酸配列である、項目１～１２のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１４）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化ＣｐＧ配列である、項目１～１３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１５）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、ｈＭＬＨ１プロモーターの一部である、項目１～９または１１～１４のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１６）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、Ｓｏｘ遺伝子の一部である、項目１～１０または１３～１４のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１７）
前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、長さ８ヌクレオチドを含む、項目１～１６のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１８）
前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、同一である、項目１～１７のいずれか１項に記載の複合体。
（項目１９）
前記ポリヌクレオチドは、１～５０個のＰＢＳ配列を含む、項目１～１８のいずれか１項に記載の複合体。
（項目２０）
１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目１～１９のいずれか１項に記載の複合体。
（項目２１）
前記ＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメイン、ＰＵＦｂドメイン、ＰＵＦｃドメイン、またはＰＵＦｗドメインを含む、項目１～２０のいずれか１項に記載の複合体。
（項目２２）
前記ＰＵＦａドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目２１に記載の複合体。
（項目２３）
前記ＰＵＦｂドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、項目２１に記載の複合体。
（項目２４）
前記ＰＵＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、項目２１に記載の複合体。
（項目２５）
前記ＰＵＦｗドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、項目２１に記載の複合体。
（項目２６）
哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法であって、該方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）該哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列、および
（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）Ｃ末端およびＮ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）該ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）該ＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結されて、タンパク質結合体を形成する脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって該送達された脱メチル化タンパク質結合体は、該細胞において該標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する方法。
（項目２７）
前記脱メチル化タンパク質結合体は、前記リボ核タンパク質複合体に、前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合する前記ＰＵＦドメインを介して結合して、脱メチル化複合体を形成する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のポリヌクレオチドは、第１のベクター内に含まれる、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
前記第２のポリヌクレオチドは、第２のベクター内に含まれる、項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記第３のポリヌクレオチドは、第３のベクター内に含まれる、項目２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記第１の、第２のまたは第３のベクターはいずれも、同じである、項目２６～３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記送達する工程は、トランスフェクションによって行われる、項目２６～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
キットであって、
（ｉ）項目１～２５のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体または該リボ核タンパク質複合体をコードする核酸；および
（ｉｉ）項目１～２５のいずれか１項に記載の脱メチル化タンパク質結合体または該メチル化タンパク質結合体をコードする核酸、
を含む、キット。
（項目３４）
トランスフェクション薬剤をさらに含む、項目３３に記載のキット。
（項目３５）
がん患者からサンプルを集めるためにサンプル収集デバイスをさらに含む、項目３３または３４に記載のキット。
（項目３６）
脱メチル化複合体であって、該脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該ポリヌクレオチドに結合される、リボ核タンパク質複合体；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有する脱メチル化エンハンサードメインであって、ここで該脱メチル化エンハンサードメインのＮ末端は、該ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される脱メチル化エンハンサードメイン；および
（ｉｉｉ）該脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで該脱メチル化タンパク質結合体は、該１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合する該ＰＵＦドメインを介して該リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化タンパク質結合体、
を含む脱メチル化複合体。
（項目３７）
前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ１ドメイン、ＴＥＴ２ドメインまたはＴＥＴ３ドメインである、項目３６に記載の複合体。
（項目３８）
前記ＴＥＴ１ドメインは、配列番号５１の配列を有する、項目３７に記載の複合体。
（項目３９）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインである、項目３６～３８のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４０）
前記ＧＡＤＤ４５ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、項目３９に記載の複合体。
（項目４１）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインである、項目３６～３８のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４２）
前記ＮＥＩＬ２ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を有する、項目４１に記載の複合体。
（項目４３）
前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項目３６～４２のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４４）
前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ｄＣａｓ９である、項目３６～４３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４５）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の一部である、項目３６～４４のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４６）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、転写調節配列の一部である、項目３６～４４のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４７）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーの一部である、項目３６～４４または４６のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４８）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化核酸配列である、項目３６～４７のいずれか１項に記載の複合体。
（項目４９）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化ＣｐＧ配列である、項目３６～４８のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５０）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、ｈＭＬＨ１プロモーターの一部である、項目３６～４４または４６～４９のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５１）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、Ｓｏｘ遺伝子の一部である、項目３６～４５または４８～４９のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５２）
前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、長さ８ヌクレオチドを含む、項目３６～５１のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５３）
前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、同一である、項目３６～５２のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５４）
前記ポリヌクレオチドは、１～５０個のＰＢＳ配列を含む、項目３６～５３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５５）
１またはこれより多くのＰＢＳ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目３６～５４のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５６）
前記ＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメイン、ＰＵＦｂドメイン、ＰＵＦｃドメイン、またはＰＵＦｗドメインを含む、項目３６～５５のいずれか１項に記載の複合体。
（項目５７）
前記ＰＵＦａドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目５６に記載の複合体。
（項目５８）
前記ＰＵＦｂドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、項目５６に記載の複合体。
（項目５９）
前記ＰＵＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、項目５６に記載の複合体。
（項目６０）
前記ＰＵＦｗドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、項目５６に記載の複合体。
（項目６１）
哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法であって、該方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）該哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）Ｃ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有する脱メチル化エンハンサードメインであって、ここで該脱メチル化エンハンサードメインのＮ末端は、該ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される脱メチル化エンハンサードメイン；ならびに
（ｉｉｉ）該脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって該送達された脱メチル化タンパク質結合体は、該細胞において該標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する方法。
（項目６２）
前記脱メチル化タンパク質結合体は、前記リボ核タンパク質複合体に、前記１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合する前記ＰＵＦドメインを介して結合して、脱メチル化複合体を形成する、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記第１のポリヌクレオチドは、第１のベクター内に含まれる、項目６１または６２に記載の方法。
（項目６４）
前記第２のポリヌクレオチドは、第２のベクター内に含まれる、項目６１～６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記第３のポリヌクレオチドは、第３のベクター内に含まれる、項目６１～６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記第１の、第２のまたは第３のベクターはいずれも、同じである、項目６１～６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記送達する工程は、トランスフェクションによって行われる、項目６１～６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
キットであって、
（ｉ）項目３６～６０のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体または該リボ核タンパク質複合体をコードする核酸；および
（ｉｉ）項目３６～６０のいずれか１項に記載の脱メチル化タンパク質結合体または該メチル化タンパク質結合体をコードする核酸、
を含むキット。
（項目６９）
トランスフェクション薬剤をさらに含む、項目６８に記載のキット。
（項目７０）
がん患者からサンプルを集めるためにサンプル収集デバイスをさらに含む、項目６８または６９に記載のキット。
（項目７１）
脱メチル化複合体であって、該脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（３）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列；ならびに
（４）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該ポリヌクレオチドに結合されるリボ核タンパク質複合体；
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有する第１のＰＵＦドメイン、および
（ｉｉ）該第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで該脱メチル化タンパク質結合体は、該第１のＰＢＳ配列に結合する該第１のＰＵＦドメインを介して該リボ核タンパク質複合体に結合する脱メチル化タンパク質結合体；ならびに
（ｃ）以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）該第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体であって、ここで該脱メチル化エンハンサー結合体は、該第２のＰＢＳ配列に結合する該第２のＰＵＦドメインを介して該リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化エンハンサー結合体、
を含む脱メチル化複合体。
（項目７２）
前記ＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ１ドメイン、ＴＥＴ２ドメインまたはＴＥＴ３ドメインである、項目７１に記載の複合体。
（項目７３）
前記ＴＥＴ１ドメインは、配列番号５１の配列を有する、項目７２に記載の複合体。
（項目７４）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインである、項目７１～７３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目７５）
前記ＧＡＤＤ４５ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、項目７４に記載の複合体。
（項目７６）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインである、項目７１～７３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目７７）
前記ＮＥＩＬ２ドメインは、配列番号８６の配列を有する、項目７６に記載の複合体。
（項目７８）
前記第１のＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメインである、項目７１～７７のいずれか１項に記載の複合体。
（項目７９）
前記ＰＵＦａドメインは、配列番号２の配列を有する、項目７８に記載の複合体。
（項目８０）
前記第２のＰＵＦドメインは、ＰＵＦｃドメインである、項目７１～７９のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８１）
前記ＰＵＦｃドメインは、配列番号４の配列を有する、項目８０に記載の複合体。
（項目８２）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、前記第２のＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結される、項目７１～８１のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８３）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、前記第２のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される、項目７１～８１のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８４）
前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項目７１～８３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８５）
前記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ｄＣａｓ９である、項目７１～４３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８６）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の一部である、項目７１～８５のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８７）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、転写調節配列の一部である、項目７１～８５のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８８）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーの一部である、項目７１～８５または８７のいずれか１項に記載の複合体。
（項目８９）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化核酸配列である、項目７１～８８のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９０）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化ＣｐＧ配列である、項目７１～８９のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９１）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、ｈＭＬＨ１プロモーターの一部である、項目７１～８５または８７～９０のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９２）
前記標的ポリヌクレオチド配列は、Ｓｏｘ遺伝子の一部である、項目７１～８６または８９～９０のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９３）
前記第１のまたは前記第２のＰＢＳ配列は、長さ８ヌクレオチドを含む、項目７１～９２のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９４）
前記第１のまたは前記第２のＰＢＳ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目７１～９３のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９５）
前記第１のまたは前記第２のＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメイン、ＰＵＦｂドメイン、ＰＵＦｃドメイン、またはＰＵＦｗドメインを含む、項目７１～９４のいずれか１項に記載の複合体。
（項目９６）
前記第１のまたは前記第２のＰＵＦａドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目９５に記載の複合体。
（項目９７）
前記第１のまたは前記第２のＰＵＦｂドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、項目９５に記載の複合体。
（項目９８）
前記第１のまたは前記第２のＰＵＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、項目９５に記載の複合体。
（項目９９）
前記第１のまたは前記第２のＰＵＦｗドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、項目９５に記載の複合体。
（項目１００）
哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法であって、該方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）該哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（ｉｉｉ）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、および
（ｉｖ）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで該ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、該結合配列を介して該第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第１のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）脱メチル化ドメインであって、該脱メチル化ドメインは、該第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結された脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程；ならびに
（ｅ）該哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）該第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体をコードする第４のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって該送達された脱メチル化タンパク質結合体は、該細胞において該標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する方法。
（項目１０１）
前記脱メチル化タンパク質結合体は、前記リボ核タンパク質複合体に、前記第１のＰＢＳ配列に結合する前記第１のＰＵＦドメインを介して結合する、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記脱メチル化エンハンサー結合体は、前記リボ核タンパク質複合体に、前記第２のＰＢＳ配列に結合する前記第２のＰＵＦドメインを介して結合する、項目１００または１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、前記第２のＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結される、項目１００～１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
前記脱メチル化エンハンサードメインは、前記第２のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される、項目１００～１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０５）
前記第１のポリヌクレオチドは、第１のベクター内に含まれる、項目１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０６）
前記第２のポリヌクレオチドは、第２のベクター内に含まれる、項目１００～１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
前記第３のポリヌクレオチドは、第３のベクター内に含まれる、項目１００～１０６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０８）
前記第４のポリヌクレオチドは、第４のベクター内に含まれる、項目１００～１０７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０９）
前記第１の、第２の、第３のまたは第４のベクターはいずれも、同じである、項目１００～１０８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１０）
前記送達する工程は、トランスフェクションによって行われる、項目１００～１０９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１１）
キットであって、
（ｉ）項目７１～９９のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体または該リボ核タンパク質複合体をコードする核酸；
（ｉｉ）項目７１～９９のいずれか１項に記載の脱メチル化タンパク質結合体または該脱メチル化タンパク質結合体をコードする核酸；および
（ｉｉｉ）項目７１～９９のいずれか１項に記載の脱メチル化エンハンサー結合体または該脱メチル化エンハンサー結合体をコードする核酸、
を含むキット。
（項目１１２）
トランスフェクション薬剤をさらに含む、項目１１１に記載のキット。
（項目１１３）
がん患者からサンプルを集めるためにサンプル収集デバイスをさらに含む、項目１１１または１１２に記載のキット。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】図１Ａ～１Ｄ。これらの図は、ｓｇＲＮＡ ３’末端へのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えなかったこと、ならびにアクチベーターの独立した補充および多量体化が、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムを使用して達成され得ることを示す。図１Ａは、従来の２ハイブリッドｄＣａｓ９融合デザイン（左上）を３ハイブリッドシステムへと分離することによってこの従来のデザインを改善する、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システム（右上）を示す模式図である。ここでｓｇＲＮＡ－ＰＢＳは、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡのＤＮＡ結合活性を、ＰＵＦ融合物によって提供されるエフェクター機能と橋渡しする。中央パネルは、Ｃ→Ｎの方向において８回反復、および５’→３’方向において８マー標的ＲＮＡとの相当する相互作用を示す、代表的ＰＵＦ（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ）ドメインの構造を表す。ＰＵＦ ＲＮＡ認識コード表は、認識される例示的な２残基およびその相当するＲＮＡ塩基を示す。下側のパネルでは、表記法の表は、４ ＰＵＦアイソタイプおよびその相当するＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）およびこれらの配列を単純化して記載するために採用した。図１Ｂ（上側パネル）は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４が、ｓｇＲＮＡの３’末端においてＰＢＳの数を変動させて挿入後にｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子に結合し活性化する能力を試験する実験の模式図である（例えば、ｄＣａｓ９：：ＶＰ６４構築物がＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化する能力に対するｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ（０個、５個、１５個、２５個、または４７個のＰＢＳを有する）の効果を試験するための実験設定）。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される場合の、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光における（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳａコントロールに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、３つのパラメーターで使用されるｓｇＲＮＡを記載する：ｓｇＲＮＡマッチは、ｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的に言及する；＃ＰＢＳおよびＰＢＳタイプは、それぞれ、ＰＢＳの数およびタイプを示し、ｓｇＲＮＡの最後に追加される。図１Ｃ（上側パネル）は、種々の数の追加されたＰＢＳを有する本発明のアクチベーターによってＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子の活性化を試験する実験を記載する模式図である。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（コントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｂ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳｂに対する）倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）およびＰＢＳの数およびタイプに関して使用されるｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ、ならびに濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的を記載する。図１Ｄ（上側パネル）は、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化するにあたって本発明のアクチベーターアイソタイプの独立性を試験する実験を図示する模式図である。その下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（ＰＵＦ／ＰＢＳアイソタイプ ｘに関するそれぞれのコントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｘ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－５×ＰＢＳｘに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）、ＰＢＳアイソタイプ（５×ＰＢＳ； 「－」は、ＰＢＳなしのｓｇＲＮＡを示す）および濃淡を付けたボックスによって示されるＤＮＡ標的（ｓｇＲＮＡマッチ）を示す。全てのグラフは、３回の反復測定の結果を示す。

【図1B】図１Ａ～１Ｄ。これらの図は、ｓｇＲＮＡ ３’末端へのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えなかったこと、ならびにアクチベーターの独立した補充および多量体化が、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムを使用して達成され得ることを示す。図１Ａは、従来の２ハイブリッドｄＣａｓ９融合デザイン（左上）を３ハイブリッドシステムへと分離することによってこの従来のデザインを改善する、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システム（右上）を示す模式図である。ここでｓｇＲＮＡ－ＰＢＳは、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡのＤＮＡ結合活性を、ＰＵＦ融合物によって提供されるエフェクター機能と橋渡しする。中央パネルは、Ｃ→Ｎの方向において８回反復、および５’→３’方向において８マー標的ＲＮＡとの相当する相互作用を示す、代表的ＰＵＦ（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ）ドメインの構造を表す。ＰＵＦ ＲＮＡ認識コード表は、認識される例示的な２残基およびその相当するＲＮＡ塩基を示す。下側のパネルでは、表記法の表は、４ ＰＵＦアイソタイプおよびその相当するＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）およびこれらの配列を単純化して記載するために採用した。図１Ｂ（上側パネル）は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４が、ｓｇＲＮＡの３’末端においてＰＢＳの数を変動させて挿入後にｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子に結合し活性化する能力を試験する実験の模式図である（例えば、ｄＣａｓ９：：ＶＰ６４構築物がＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化する能力に対するｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ（０個、５個、１５個、２５個、または４７個のＰＢＳを有する）の効果を試験するための実験設定）。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される場合の、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光における（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳａコントロールに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、３つのパラメーターで使用されるｓｇＲＮＡを記載する：ｓｇＲＮＡマッチは、ｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的に言及する；＃ＰＢＳおよびＰＢＳタイプは、それぞれ、ＰＢＳの数およびタイプを示し、ｓｇＲＮＡの最後に追加される。図１Ｃ（上側パネル）は、種々の数の追加されたＰＢＳを有する本発明のアクチベーターによってＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子の活性化を試験する実験を記載する模式図である。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（コントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｂ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳｂに対する）倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）およびＰＢＳの数およびタイプに関して使用されるｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ、ならびに濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的を記載する。図１Ｄ（上側パネル）は、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化するにあたって本発明のアクチベーターアイソタイプの独立性を試験する実験を図示する模式図である。その下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（ＰＵＦ／ＰＢＳアイソタイプ ｘに関するそれぞれのコントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｘ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－５×ＰＢＳｘに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）、ＰＢＳアイソタイプ（５×ＰＢＳ； 「－」は、ＰＢＳなしのｓｇＲＮＡを示す）および濃淡を付けたボックスによって示されるＤＮＡ標的（ｓｇＲＮＡマッチ）を示す。全てのグラフは、３回の反復測定の結果を示す。

【図1C】図１Ａ～１Ｄ。これらの図は、ｓｇＲＮＡ ３’末端へのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えなかったこと、ならびにアクチベーターの独立した補充および多量体化が、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムを使用して達成され得ることを示す。図１Ａは、従来の２ハイブリッドｄＣａｓ９融合デザイン（左上）を３ハイブリッドシステムへと分離することによってこの従来のデザインを改善する、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システム（右上）を示す模式図である。ここでｓｇＲＮＡ－ＰＢＳは、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡのＤＮＡ結合活性を、ＰＵＦ融合物によって提供されるエフェクター機能と橋渡しする。中央パネルは、Ｃ→Ｎの方向において８回反復、および５’→３’方向において８マー標的ＲＮＡとの相当する相互作用を示す、代表的ＰＵＦ（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ）ドメインの構造を表す。ＰＵＦ ＲＮＡ認識コード表は、認識される例示的な２残基およびその相当するＲＮＡ塩基を示す。下側のパネルでは、表記法の表は、４ ＰＵＦアイソタイプおよびその相当するＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）およびこれらの配列を単純化して記載するために採用した。図１Ｂ（上側パネル）は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４が、ｓｇＲＮＡの３’末端においてＰＢＳの数を変動させて挿入後にｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子に結合し活性化する能力を試験する実験の模式図である（例えば、ｄＣａｓ９：：ＶＰ６４構築物がＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化する能力に対するｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ（０個、５個、１５個、２５個、または４７個のＰＢＳを有する）の効果を試験するための実験設定）。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される場合の、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光における（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳａコントロールに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、３つのパラメーターで使用されるｓｇＲＮＡを記載する：ｓｇＲＮＡマッチは、ｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的に言及する；＃ＰＢＳおよびＰＢＳタイプは、それぞれ、ＰＢＳの数およびタイプを示し、ｓｇＲＮＡの最後に追加される。図１Ｃ（上側パネル）は、種々の数の追加されたＰＢＳを有する本発明のアクチベーターによってＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子の活性化を試験する実験を記載する模式図である。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（コントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｂ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳｂに対する）倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）およびＰＢＳの数およびタイプに関して使用されるｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ、ならびに濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的を記載する。図１Ｄ（上側パネル）は、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化するにあたって本発明のアクチベーターアイソタイプの独立性を試験する実験を図示する模式図である。その下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（ＰＵＦ／ＰＢＳアイソタイプ ｘに関するそれぞれのコントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｘ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－５×ＰＢＳｘに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）、ＰＢＳアイソタイプ（５×ＰＢＳ； 「－」は、ＰＢＳなしのｓｇＲＮＡを示す）および濃淡を付けたボックスによって示されるＤＮＡ標的（ｓｇＲＮＡマッチ）を示す。全てのグラフは、３回の反復測定の結果を示す。

【図1D】図１Ａ～１Ｄ。これらの図は、ｓｇＲＮＡ ３’末端へのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えなかったこと、ならびにアクチベーターの独立した補充および多量体化が、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムを使用して達成され得ることを示す。図１Ａは、従来の２ハイブリッドｄＣａｓ９融合デザイン（左上）を３ハイブリッドシステムへと分離することによってこの従来のデザインを改善する、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システム（右上）を示す模式図である。ここでｓｇＲＮＡ－ＰＢＳは、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡのＤＮＡ結合活性を、ＰＵＦ融合物によって提供されるエフェクター機能と橋渡しする。中央パネルは、Ｃ→Ｎの方向において８回反復、および５’→３’方向において８マー標的ＲＮＡとの相当する相互作用を示す、代表的ＰＵＦ（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ）ドメインの構造を表す。ＰＵＦ ＲＮＡ認識コード表は、認識される例示的な２残基およびその相当するＲＮＡ塩基を示す。下側のパネルでは、表記法の表は、４ ＰＵＦアイソタイプおよびその相当するＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）およびこれらの配列を単純化して記載するために採用した。図１Ｂ（上側パネル）は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４が、ｓｇＲＮＡの３’末端においてＰＢＳの数を変動させて挿入後にｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子に結合し活性化する能力を試験する実験の模式図である（例えば、ｄＣａｓ９：：ＶＰ６４構築物がＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化する能力に対するｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ（０個、５個、１５個、２５個、または４７個のＰＢＳを有する）の効果を試験するための実験設定）。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定される場合の、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光における（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳａコントロールに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、３つのパラメーターで使用されるｓｇＲＮＡを記載する：ｓｇＲＮＡマッチは、ｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的に言及する；＃ＰＢＳおよびＰＢＳタイプは、それぞれ、ＰＢＳの数およびタイプを示し、ｓｇＲＮＡの最後に追加される。図１Ｃ（上側パネル）は、種々の数の追加されたＰＢＳを有する本発明のアクチベーターによってＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子の活性化を試験する実験を記載する模式図である。下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（コントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｂ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－０×ＰＢＳｂに対する）倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）およびＰＢＳの数およびタイプに関して使用されるｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ、ならびに濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡ標的を記載する。図１Ｄ（上側パネル）は、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化するにあたって本発明のアクチベーターアイソタイプの独立性を試験する実験を図示する模式図である。その下側パネルは、グラフの下にある凡例に示される種々の構築物でトランスフェクトした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の（ＰＵＦ／ＰＢＳアイソタイプ ｘに関するそれぞれのコントロールｄＣａｓ９／ＰＵＦｘ－ＶＰ６４／ｓｇＣｔｌ－５×ＰＢＳｘに対する）平均倍数変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す棒グラフである。その凡例は、使用されるＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ－ＶＰ６４）、ＰＢＳアイソタイプ（５×ＰＢＳ； 「－」は、ＰＢＳなしのｓｇＲＮＡを示す）および濃淡を付けたボックスによって示されるＤＮＡ標的（ｓｇＲＮＡマッチ）を示す。全てのグラフは、３回の反復測定の結果を示す。

【0021】

【図2AB】図２Ａ～２Ｃ。図２Ａおよび図２Ｂは、ＶＰ６４およびＰ６５－ＨＳＦ１を含む本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムのアセンブリに関する。図２Ａは、ＰＢＳ３２およびＰＢＳ６２７２の両方を含むｓｇＲＮＡによる補充を介して、ＰＵＦ（３－２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６－２／７－２）：：Ｐ６５－ＨＳＦ１のアセンブリを試験する実験の模式図である。その活性を、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光レポーター活性によって測定した。図２Ｂは、アクチベータータンパク質を、４×［ＰＢＳ３２－ＰＢＳ６２７２］ヘテロダイマー部位を有する非標的化（ｓｇＣｏｎｔｒｏｌ）およびＴｅｔ標的化（ｓｇＴｅｔＯ） ｓｇＲＮＡでのトランスフェクトから生じる相対的平均ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を示す棒グラフである。図２Ｃは、５×ＰＢＳａを有するコントロールｓｇＲＮＡまたは０個、１個、５個、１５個、もしくは２５個のコピーのＰＢＳａを有するＴｅｔＯ標的化ｓｇＲＮＡとともに活性化ドメインとしてＶＰ６４（ＰＵＦａ：：ＶＰ６４） 対 ｐ６５ＨＳＦ１（ＰＵＦａ：：ｐ６５ＨＳＦ１）を使用する本発明の３構成要素システムアクチベーターの比較を示す。棒は、コントロールｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｌ）を使用する実験に対するｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の平均倍数変化を（Ｓ．Ｅ．Ｍ．； ｎ＝３とともに）示す。その凡例は、ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ上のＰＢＳａの数（＃ＰＢＳａ）および濃淡を付けたボックスによって示されるＤＮＡマッチを示す。

【図2C】図２Ａ～２Ｃ。図２Ａおよび図２Ｂは、ＶＰ６４およびＰ６５－ＨＳＦ１を含む本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムのアセンブリに関する。図２Ａは、ＰＢＳ３２およびＰＢＳ６２７２の両方を含むｓｇＲＮＡによる補充を介して、ＰＵＦ（３－２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６－２／７－２）：：Ｐ６５－ＨＳＦ１のアセンブリを試験する実験の模式図である。その活性を、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光レポーター活性によって測定した。図２Ｂは、アクチベータータンパク質を、４×［ＰＢＳ３２－ＰＢＳ６２７２］ヘテロダイマー部位を有する非標的化（ｓｇＣｏｎｔｒｏｌ）およびＴｅｔ標的化（ｓｇＴｅｔＯ） ｓｇＲＮＡでのトランスフェクトから生じる相対的平均ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を示す棒グラフである。図２Ｃは、５×ＰＢＳａを有するコントロールｓｇＲＮＡまたは０個、１個、５個、１５個、もしくは２５個のコピーのＰＢＳａを有するＴｅｔＯ標的化ｓｇＲＮＡとともに活性化ドメインとしてＶＰ６４（ＰＵＦａ：：ＶＰ６４） 対 ｐ６５ＨＳＦ１（ＰＵＦａ：：ｐ６５ＨＳＦ１）を使用する本発明の３構成要素システムアクチベーターの比較を示す。棒は、コントロールｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｌ）を使用する実験に対するｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の平均倍数変化を（Ｓ．Ｅ．Ｍ．； ｎ＝３とともに）示す。その凡例は、ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ上のＰＢＳａの数（＃ＰＢＳａ）および濃淡を付けたボックスによって示されるＤＮＡマッチを示す。

【0022】

【図3A】図３Ａ～３Ｃ。これらの図は、ゲノム遺伝子座へＴＥＴ１（ＣＤ）を送達し、遺伝子活性化を媒介するにあたって、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥが、ｄＣａｓ９直接繋留システムより優れていることを示す。図３Ａは、指示標識（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）によって示されるＣｐＧ過剰メチル化の領域を有するｈＭＬＨ１プロモーターの模式的表示である。ヌクレオチドの番号付けは、ｈＭＬＨ１サイレンシングを伴う領域Ｃでの過剰メチル化の強い関連を報告する以前の研究に従う（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３）。過剰メチル化された領域Ｃの周りにデザインされたｓｇＲＮＡは、短い線の上の数字によって示され、ｓｇＲＮＡ－１および２は、それぞれ、センス鎖およびアンチセンス鎖を標的化する。図３Ｂは、Ｃａｓｉｌｉｏ構成要素ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ＰＵＦａまたはＰＵＦａ－ｐ６５ＨＳＦ１およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトした細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。図は、実験の各セットにおいて使用されるエフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏシステムを示す。適用においてそれぞれのエフェクターを反映するデータをプロットした。図３Ｃは、ｄＣａｓ９繋留エフェクターｄＣａｓ９－ＴＥＴ１（ＣＤ）Ｃ末端融合物、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ｄＣａｓ９ Ｎ末端融合物またはｄＣａｓ９－ｐ６５ＨＳＦ１およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。図は、実験の各セットにおいて使用されるｄＣａｓ９融合物を示す。使用されるそれぞれのエフェクターを反映するデータをプロットした。図３Ｂおよび図３ＣにおけるＰＵＭａ（別名ＰＵＦａ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）およびｐ６５ＨＳＦ１ドメインの文字「Ｎ」（すなわち、Ｎ末端）および「Ｃ」（すなわち、Ｃ末端）は、相当するタンパク質ドメインのＮ末端およびＣ末端に言及する。

【図3B】図３Ａ～３Ｃ。これらの図は、ゲノム遺伝子座へＴＥＴ１（ＣＤ）を送達し、遺伝子活性化を媒介するにあたって、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥが、ｄＣａｓ９直接繋留システムより優れていることを示す。図３Ａは、指示標識（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）によって示されるＣｐＧ過剰メチル化の領域を有するｈＭＬＨ１プロモーターの模式的表示である。ヌクレオチドの番号付けは、ｈＭＬＨ１サイレンシングを伴う領域Ｃでの過剰メチル化の強い関連を報告する以前の研究に従う（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３）。過剰メチル化された領域Ｃの周りにデザインされたｓｇＲＮＡは、短い線の上の数字によって示され、ｓｇＲＮＡ－１および２は、それぞれ、センス鎖およびアンチセンス鎖を標的化する。図３Ｂは、Ｃａｓｉｌｉｏ構成要素ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ＰＵＦａまたはＰＵＦａ－ｐ６５ＨＳＦ１およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトした細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。図は、実験の各セットにおいて使用されるエフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏシステムを示す。適用においてそれぞれのエフェクターを反映するデータをプロットした。図３Ｃは、ｄＣａｓ９繋留エフェクターｄＣａｓ９－ＴＥＴ１（ＣＤ）Ｃ末端融合物、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ｄＣａｓ９ Ｎ末端融合物またはｄＣａｓ９－ｐ６５ＨＳＦ１およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。図は、実験の各セットにおいて使用されるｄＣａｓ９融合物を示す。使用されるそれぞれのエフェクターを反映するデータをプロットした。図３Ｂおよび図３ＣにおけるＰＵＭａ（別名ＰＵＦａ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）およびｐ６５ＨＳＦ１ドメインの文字「Ｎ」（すなわち、Ｎ末端）および「Ｃ」（すなわち、Ｃ末端）は、相当するタンパク質ドメインのＮ末端およびＣ末端に言及する。

【図3C】図３Ａ～３Ｃ。これらの図は、ゲノム遺伝子座へＴＥＴ１（ＣＤ）を送達し、遺伝子活性化を媒介するにあたって、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥが、ｄＣａｓ９直接繋留システムより優れていることを示す。図３Ａは、指示標識（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）によって示されるＣｐＧ過剰メチル化の領域を有するｈＭＬＨ１プロモーターの模式的表示である。ヌクレオチドの番号付けは、ｈＭＬＨ１サイレンシングを伴う領域Ｃでの過剰メチル化の強い関連を報告する以前の研究に従う（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３）。過剰メチル化された領域Ｃの周りにデザインされたｓｇＲＮＡは、短い線の上の数字によって示され、ｓｇＲＮＡ－１および２は、それぞれ、センス鎖およびアンチセンス鎖を標的化する。図３Ｂは、Ｃａｓｉｌｉｏ構成要素ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ＰＵＦａまたはＰＵＦａ－ｐ６５ＨＳＦ１およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトした細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。図は、実験の各セットにおいて使用されるエフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏシステムを示す。適用においてそれぞれのエフェクターを反映するデータをプロットした。図３Ｃは、ｄＣａｓ９繋留エフェクターｄＣａｓ９－ＴＥＴ１（ＣＤ）Ｃ末端融合物、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ｄＣａｓ９ Ｎ末端融合物またはｄＣａｓ９－ｐ６５ＨＳＦ１およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。図は、実験の各セットにおいて使用されるｄＣａｓ９融合物を示す。使用されるそれぞれのエフェクターを反映するデータをプロットした。図３Ｂおよび図３ＣにおけるＰＵＭａ（別名ＰＵＦａ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）およびｐ６５ＨＳＦ１ドメインの文字「Ｎ」（すなわち、Ｎ末端）および「Ｃ」（すなわち、Ｃ末端）は、相当するタンパク質ドメインのＮ末端およびＣ末端に言及する。

【0023】

【図4A】図４Ａ～４Ｃ。図は、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥが、ＴＥＴ１活性をｈＭＬＨ１プロモーター領域に標的化することを介して、メチルシトシンの強い脱メチル化を媒介することを示す。図４Ａは、Ｃａｓｉｌｉｏ構成要素ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化の時間的推移である。グラフの上の図は、使用されるカルボキシ末端ＴＥＴ１（ＣＤ）融合モジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥシステムを描く。ｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を、細胞を分析するために採取したトランスフェクション後の時間に対してプロットした。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。図４Ｂは、示されるように抗ｈＭＬＨ１または抗βアクチンモノクローナル抗体を使用して示された細胞サンプルから抽出したタンパク質のウェスタンブロット分析である。トランスフェクトしなかった細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（非処理）または２．５μＭ ５’－アザシチジン（ＡｚａＣ）で処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞（２９３）、および非標的化コントロールガイドＲＮＡ（ＮＴＣ）の存在下でのトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したタンパク質を、ｈＭＬＨ１プロモーター領域を標的化するＣａｓｉｌｉｏ－Ｍｅ構成要素でトランスフェクトした時間推移サンプルに由来する抽出物と並行して分析した。図４Ｃは、ｈＭＬＨ１プロモーター領域の個々のＣｐＧのシトシンからチミンへのビスルファイト媒介性変換の頻度を示す。矢印は、標的化ｓｇＲＮＡの結合部位と重なり合うＣｐＧを示す。座標は、ｈＭＬＨ１転写開始部位に対するＣｐＧの位置を示す（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３）。ＨＥＫ２９３細胞（２９３）のｈＭＬＨ１プロモーターの遠位部分は、この分析に含めなかった。図４Ａ中のＰＵＭａ（別名ＰＵＦａ）およびＴＥＴ１（ＣＤ）ドメインの文字「Ｎ」は、その相当するタンパク質ドメインのＮ末端に言及する。

【図4B】図４Ａ～４Ｃ。図は、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥが、ＴＥＴ１活性をｈＭＬＨ１プロモーター領域に標的化することを介して、メチルシトシンの強い脱メチル化を媒介することを示す。図４Ａは、Ｃａｓｉｌｉｏ構成要素ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化の時間的推移である。グラフの上の図は、使用されるカルボキシ末端ＴＥＴ１（ＣＤ）融合モジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥシステムを描く。ｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を、細胞を分析するために採取したトランスフェクション後の時間に対してプロットした。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。図４Ｂは、示されるように抗ｈＭＬＨ１または抗βアクチンモノクローナル抗体を使用して示された細胞サンプルから抽出したタンパク質のウェスタンブロット分析である。トランスフェクトしなかった細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（非処理）または２．５μＭ ５’－アザシチジン（ＡｚａＣ）で処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞（２９３）、および非標的化コントロールガイドＲＮＡ（ＮＴＣ）の存在下でのトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したタンパク質を、ｈＭＬＨ１プロモーター領域を標的化するＣａｓｉｌｉｏ－Ｍｅ構成要素でトランスフェクトした時間推移サンプルに由来する抽出物と並行して分析した。図４Ｃは、ｈＭＬＨ１プロモーター領域の個々のＣｐＧのシトシンからチミンへのビスルファイト媒介性変換の頻度を示す。矢印は、標的化ｓｇＲＮＡの結合部位と重なり合うＣｐＧを示す。座標は、ｈＭＬＨ１転写開始部位に対するＣｐＧの位置を示す（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３）。ＨＥＫ２９３細胞（２９３）のｈＭＬＨ１プロモーターの遠位部分は、この分析に含めなかった。図４Ａ中のＰＵＭａ（別名ＰＵＦａ）およびＴＥＴ１（ＣＤ）ドメインの文字「Ｎ」は、その相当するタンパク質ドメインのＮ末端に言及する。

【図4C】図４Ａ～４Ｃ。図は、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥが、ＴＥＴ１活性をｈＭＬＨ１プロモーター領域に標的化することを介して、メチルシトシンの強い脱メチル化を媒介することを示す。図４Ａは、Ｃａｓｉｌｉｏ構成要素ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびグラフの下の濃淡を付けたボックスによって示されるｓｇＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化の時間的推移である。グラフの上の図は、使用されるカルボキシ末端ＴＥＴ１（ＣＤ）融合モジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥシステムを描く。ｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を、細胞を分析するために採取したトランスフェクション後の時間に対してプロットした。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。図４Ｂは、示されるように抗ｈＭＬＨ１または抗βアクチンモノクローナル抗体を使用して示された細胞サンプルから抽出したタンパク質のウェスタンブロット分析である。トランスフェクトしなかった細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（非処理）または２．５μＭ ５’－アザシチジン（ＡｚａＣ）で処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞（２９３）、および非標的化コントロールガイドＲＮＡ（ＮＴＣ）の存在下でのトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したタンパク質を、ｈＭＬＨ１プロモーター領域を標的化するＣａｓｉｌｉｏ－Ｍｅ構成要素でトランスフェクトした時間推移サンプルに由来する抽出物と並行して分析した。図４Ｃは、ｈＭＬＨ１プロモーター領域の個々のＣｐＧのシトシンからチミンへのビスルファイト媒介性変換の頻度を示す。矢印は、標的化ｓｇＲＮＡの結合部位と重なり合うＣｐＧを示す。座標は、ｈＭＬＨ１転写開始部位に対するＣｐＧの位置を示す（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３）。ＨＥＫ２９３細胞（２９３）のｈＭＬＨ１プロモーターの遠位部分は、この分析に含めなかった。図４Ａ中のＰＵＭａ（別名ＰＵＦａ）およびＴＥＴ１（ＣＤ）ドメインの文字「Ｎ」は、その相当するタンパク質ドメインのＮ末端に言及する。

【0024】

【図5AB】図５Ａ～５Ｃ。図は、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ Ｄｎｍｔエフェクターの種々の配置を試験したことを示す。図５Ａは、ｄＣａｓ９のＮ末端への（ｉ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｉｉ）Ｄｎｍｔ３Ｌ、および（ｉｉｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３Ｌ（ハイブリッド）のＣ末端領域の；ｄＣａｓ９のＣ末端への（ｉｖ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｖ）Ｄｎｍｔ３Ｌ、および（ｖｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３Ｌハイブリッドの直接融合物を示す。図５Ｂは、ＰＵＦドメインのＮ末端への（ｉ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｉｉ）Ｄｎｍｔ３Ｌ、および（ｉｉｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３ＬのＣ末端領域の；ＰＵＦドメインのＣ末端への（ｉｖ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｖ）Ｄｎｍｔ３Ｌおよび（ｖｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３ＬのＰＵＦエフェクター融合物を示す。図５Ｃは、Ｃａｓｉｌｉｏが、相当するＰＢＳを含むガイドを介して、種々のＰＵＦドメインに融合された種々のＤｎｍｔエフェクターを潜在的に補充し得ることを示す。

【図5C】図５Ａ～５Ｃ。図は、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ Ｄｎｍｔエフェクターの種々の配置を試験したことを示す。図５Ａは、ｄＣａｓ９のＮ末端への（ｉ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｉｉ）Ｄｎｍｔ３Ｌ、および（ｉｉｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３Ｌ（ハイブリッド）のＣ末端領域の；ｄＣａｓ９のＣ末端への（ｉｖ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｖ）Ｄｎｍｔ３Ｌ、および（ｖｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３Ｌハイブリッドの直接融合物を示す。図５Ｂは、ＰＵＦドメインのＮ末端への（ｉ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｉｉ）Ｄｎｍｔ３Ｌ、および（ｉｉｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３ＬのＣ末端領域の；ＰＵＦドメインのＣ末端への（ｉｖ）Ｄｎｍｔ３ａ、（ｖ）Ｄｎｍｔ３Ｌおよび（ｖｉ）Ｄｎｍｔ３ａ－３ＬのＰＵＦエフェクター融合物を示す。図５Ｃは、Ｃａｓｉｌｉｏが、相当するＰＢＳを含むガイドを介して、種々のＰＵＦドメインに融合された種々のＤｎｍｔエフェクターを潜在的に補充し得ることを示す。

【0025】

【図6】図６Ａ～６Ｂ。図は、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ ＤｎｍｔモジュールをＳＯＸ２プロモーターに標的化することによって誘導されるＳＯＸ２遺伝子発現変化を示す。図６Ａは、種々のｄＣａｓ９－Ｄｎｍｔ酵素およびコントロールガイドまたはＳＯＸ２プロモーターを標的化するガイドでトランスフェクトされた細胞における相対的ＳＯＸ２発現レベルを示す。図６Ｂは、種々のｄＣａｓ９－Ｄｎｍｔ酵素およびコントロールガイドまたはＳＯＸ２プロモーターを標的化するガイドでトランスフェクトされた細胞における相対的ＳＯＸ２発現レベルを示す。

【0026】

【図7A】図７Ａ～７Ｅは、ＧＡＤＤ４５Ａが、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされた遺伝子に付与するＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ能力をブーストすることを示す。図７Ａは、実験の各セットにおいて使用されるエフェクターモジュールの種々の組み合わせを示すＣａｓｉｌｉｏおよびＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。ｇＲＮＡの足場を、５コピーのＰＵＦａまたはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＤＡＤＤ４５Ａ（Ｇ－４５Ａ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎ メチル化シトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、およびｐ６５ＨＳＦ１転写アクチベーターに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図７Ｂは、指示標識によって示されるＣｐＧ過剰メチル化の領域を有するｈＭＬＨ１プロモーターの模式的表示である。ヌクレオチドの番号付けは、ｈＭＬＨ１サイレンシングを有する領域Ｃにおける過剰メチル化の強い関連に基づく（Ｄｅｎｇ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（９）：２０２９－２０３３， １９９９）。過剰メチル化された領域ＢおよびＣの周りでデザインされたｓｇＲＮＡは、短い線の上の数字によって示される。図７Ｃは、示されるようにＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、各実験において使用されるエフェクターおよびｓｇＲＮＡを示す。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。図７Ｄは、示されたＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥエフェクターモジュールでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット分析の結果を示す。レーン１－ トランスフェクトしなかった細胞；レーン２－ ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン３－ グリシン－セリンリンカーでサイレントバリエーションを有するＰＵＦａ－ＧＡＤＤＡ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン４－ ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；およびレーン５－ ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）。５０μｇのタンパク質を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、示された抗体でイムノブロットを行った。サイズマーカー（ｋＤａ単位）を示す。図７Ｅは、示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、非標的化ｇＲＮＡ、またはＰＵＦａ結合部位（ＰＢＳａ）またはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位（ＰＢＳａｃ）を含むｇＲＮＡの存在下での各実験において使用されるエフェクターを示す。ＰＢＳａ－ｇＲＮＡまたはＰＢＳａｃ－ｇＲＮＡでの実験を示すために棒グラフを描いた。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。

【図7B】図７Ａ～７Ｅは、ＧＡＤＤ４５Ａが、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされた遺伝子に付与するＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ能力をブーストすることを示す。図７Ａは、実験の各セットにおいて使用されるエフェクターモジュールの種々の組み合わせを示すＣａｓｉｌｉｏおよびＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。ｇＲＮＡの足場を、５コピーのＰＵＦａまたはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＤＡＤＤ４５Ａ（Ｇ－４５Ａ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎ メチル化シトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、およびｐ６５ＨＳＦ１転写アクチベーターに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図７Ｂは、指示標識によって示されるＣｐＧ過剰メチル化の領域を有するｈＭＬＨ１プロモーターの模式的表示である。ヌクレオチドの番号付けは、ｈＭＬＨ１サイレンシングを有する領域Ｃにおける過剰メチル化の強い関連に基づく（Ｄｅｎｇ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（９）：２０２９－２０３３， １９９９）。過剰メチル化された領域ＢおよびＣの周りでデザインされたｓｇＲＮＡは、短い線の上の数字によって示される。図７Ｃは、示されるようにＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、各実験において使用されるエフェクターおよびｓｇＲＮＡを示す。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。図７Ｄは、示されたＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥエフェクターモジュールでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット分析の結果を示す。レーン１－ トランスフェクトしなかった細胞；レーン２－ ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン３－ グリシン－セリンリンカーでサイレントバリエーションを有するＰＵＦａ－ＧＡＤＤＡ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン４－ ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；およびレーン５－ ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）。５０μｇのタンパク質を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、示された抗体でイムノブロットを行った。サイズマーカー（ｋＤａ単位）を示す。図７Ｅは、示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、非標的化ｇＲＮＡ、またはＰＵＦａ結合部位（ＰＢＳａ）またはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位（ＰＢＳａｃ）を含むｇＲＮＡの存在下での各実験において使用されるエフェクターを示す。ＰＢＳａ－ｇＲＮＡまたはＰＢＳａｃ－ｇＲＮＡでの実験を示すために棒グラフを描いた。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。

【図7CD】図７Ａ～７Ｅは、ＧＡＤＤ４５Ａが、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされた遺伝子に付与するＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ能力をブーストすることを示す。図７Ａは、実験の各セットにおいて使用されるエフェクターモジュールの種々の組み合わせを示すＣａｓｉｌｉｏおよびＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。ｇＲＮＡの足場を、５コピーのＰＵＦａまたはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＤＡＤＤ４５Ａ（Ｇ－４５Ａ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎ メチル化シトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、およびｐ６５ＨＳＦ１転写アクチベーターに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図７Ｂは、指示標識によって示されるＣｐＧ過剰メチル化の領域を有するｈＭＬＨ１プロモーターの模式的表示である。ヌクレオチドの番号付けは、ｈＭＬＨ１サイレンシングを有する領域Ｃにおける過剰メチル化の強い関連に基づく（Ｄｅｎｇ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（９）：２０２９－２０３３， １９９９）。過剰メチル化された領域ＢおよびＣの周りでデザインされたｓｇＲＮＡは、短い線の上の数字によって示される。図７Ｃは、示されるようにＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、各実験において使用されるエフェクターおよびｓｇＲＮＡを示す。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。図７Ｄは、示されたＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥエフェクターモジュールでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット分析の結果を示す。レーン１－ トランスフェクトしなかった細胞；レーン２－ ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン３－ グリシン－セリンリンカーでサイレントバリエーションを有するＰＵＦａ－ＧＡＤＤＡ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン４－ ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；およびレーン５－ ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）。５０μｇのタンパク質を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、示された抗体でイムノブロットを行った。サイズマーカー（ｋＤａ単位）を示す。図７Ｅは、示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、非標的化ｇＲＮＡ、またはＰＵＦａ結合部位（ＰＢＳａ）またはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位（ＰＢＳａｃ）を含むｇＲＮＡの存在下での各実験において使用されるエフェクターを示す。ＰＢＳａ－ｇＲＮＡまたはＰＢＳａｃ－ｇＲＮＡでの実験を示すために棒グラフを描いた。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。

【図7E】図７Ａ～７Ｅは、ＧＡＤＤ４５Ａが、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされた遺伝子に付与するＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ能力をブーストすることを示す。図７Ａは、実験の各セットにおいて使用されるエフェクターモジュールの種々の組み合わせを示すＣａｓｉｌｉｏおよびＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。ｇＲＮＡの足場を、５コピーのＰＵＦａまたはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＤＡＤＤ４５Ａ（Ｇ－４５Ａ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎ メチル化シトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、およびｐ６５ＨＳＦ１転写アクチベーターに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図７Ｂは、指示標識によって示されるＣｐＧ過剰メチル化の領域を有するｈＭＬＨ１プロモーターの模式的表示である。ヌクレオチドの番号付けは、ｈＭＬＨ１サイレンシングを有する領域Ｃにおける過剰メチル化の強い関連に基づく（Ｄｅｎｇ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（９）：２０２９－２０３３， １９９９）。過剰メチル化された領域ＢおよびＣの周りでデザインされたｓｇＲＮＡは、短い線の上の数字によって示される。図７Ｃは、示されるようにＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、各実験において使用されるエフェクターおよびｓｇＲＮＡを示す。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。図７Ｄは、示されたＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥエフェクターモジュールでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット分析の結果を示す。レーン１－ トランスフェクトしなかった細胞；レーン２－ ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン３－ グリシン－セリンリンカーでサイレントバリエーションを有するＰＵＦａ－ＧＡＤＤＡ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；レーン４－ ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）；およびレーン５－ ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）。５０μｇのタンパク質を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、示された抗体でイムノブロットを行った。サイズマーカー（ｋＤａ単位）を示す。図７Ｅは、示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化を示す。グラフの下のマトリックスの中の濃淡を付けたボックスは、非標的化ｇＲＮＡ、またはＰＵＦａ結合部位（ＰＢＳａ）またはＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位（ＰＢＳａｃ）を含むｇＲＮＡの存在下での各実験において使用されるエフェクターを示す。ＰＢＳａ－ｇＲＮＡまたはＰＢＳａｃ－ｇＲＮＡでの実験を示すために棒グラフを描いた。エラーバーは、三連の実験から導出されたｓ．ｅ．ｍ．を示す。

【0027】

【図8AB】図８Ａ～８Ｄ： ＮＥＩＬ２（しかしＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ３またはＴＤＧではない）は、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされた遺伝子に送達するためにＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ効率を増強する。図８Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬベースのエフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。単純化のために、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２およびＮＥＩＬ３を、ＮＥＩＬとして描いた。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２、およびＮＥＩＬ３（ＮＥＩＬ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎメチルシトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、ならびにＰＵＦａに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図８Ｂ 示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。棒の濃淡は、示されたＰＵＦａ融合物の種々の群を反映する。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。図８Ｃ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびＴＤＧベースのＰＵＦａ融合物エフェクターを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。タンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＴＤＧ、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎ メチルシトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、およびＰＵＦａに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図８Ｄ 示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。棒の濃淡は、示されるＰＵＦａ融合物を反映する。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。

【図8CD】図８Ａ～８Ｄ： ＮＥＩＬ２（しかしＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ３またはＴＤＧではない）は、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされた遺伝子に送達するためにＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ効率を増強する。図８Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬベースのエフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。単純化のために、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２およびＮＥＩＬ３を、ＮＥＩＬとして描いた。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２、およびＮＥＩＬ３（ＮＥＩＬ）、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎメチルシトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、ならびにＰＵＦａに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図８Ｂ 示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。棒の濃淡は、示されたＰＵＦａ融合物の種々の群を反映する。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。図８Ｃ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびＴＤＧベースのＰＵＦａ融合物エフェクターを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。タンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＴＤＧ、ＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｔｅｎ ｅｌｅｖｅｎ メチルシトシンジオキシゲナーゼ触媒ドメイン（１４１８～２１３６））、およびＰＵＦａに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図８Ｄ 示されるとおりのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。棒の濃淡は、示されるＰＵＦａ融合物を反映する。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。

【0028】

【図9A】図９Ａ～９Ｂ ＮＥＩＬ２ツーインワン（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）エフェクターは、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされたＭＬＨ１遺伝子に送達するために、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ効率を増強する。図９Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬ２ベースのエフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。タンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ２、ＴＥＴ１（ＣＤ）、およびＰＵＦａに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図９Ｂ ＭＬＨ１ ｇＲＮＡ（グレーの棒）または非標的化ｇＲＮＡ（黒の棒）の存在下で、示されたＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍを示す。

【図9B】図９Ａ～９Ｂ ＮＥＩＬ２ツーインワン（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）エフェクターは、ＴＥＴ１媒介性活性化をメチル化でサイレントにされたＭＬＨ１遺伝子に送達するために、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ効率を増強する。図９Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬ２ベースのエフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。タンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ２、ＴＥＴ１（ＣＤ）、およびＰＵＦａに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図９Ｂ ＭＬＨ１ ｇＲＮＡ（グレーの棒）または非標的化ｇＲＮＡ（黒の棒）の存在下で、示されたＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍを示す。

【0029】

【図10A】図１０Ａ～１０Ｂ ＮＥＩＬ２およびＴＥＴ１エフェクターモジュールの共標的化は、ＴＥＴ１媒介性ＭＬＨ１活性化を強く増強する。図１０Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬ２エフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシル末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位（５×ＰＢＳａおよび５×ＰＢＳｃ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ２、ＴＥＴ１（ＣＤ）、ＰＵＦａ、およびＰＵＦｃに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図１０Ｂ ＮＥＩＬ２エフェクターモジュールの非存在下（白の棒）および存在下で、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。ＰＵＦｃ－ＮＥＩＬ２（黒の棒）およびＮＥＩＬ２－ＰＵＦｃ（グレーの棒）が示される。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍを示す。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｂ ＮＥＩＬ２およびＴＥＴ１エフェクターモジュールの共標的化は、ＴＥＴ１媒介性ＭＬＨ１活性化を強く増強する。図１０Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬ２エフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。操作されたタンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシル末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、５コピーのＰＵＦａおよびＰＵＦｃ結合部位（５×ＰＢＳａおよび５×ＰＢＳｃ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ２、ＴＥＴ１（ＣＤ）、ＰＵＦａ、およびＰＵＦｃに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図１０Ｂ ＮＥＩＬ２エフェクターモジュールの非存在下（白の棒）および存在下で、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。ＰＵＦｃ－ＮＥＩＬ２（黒の棒）およびＮＥＩＬ２－ＰＵＦｃ（グレーの棒）が示される。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍを示す。

【0030】

【図11A】図１１Ａ－１１Ｂ 標的部位へのＮＥＩＬ２補充なしのＴＥＴ１媒介性ＭＬＨ１活性化。図１１Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬ２エフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。タンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、ＰＵＦｃ結合部位なしの５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ２、ＴＥＴ１（ＣＤ）、ＰＵＦａ、およびＰＵＦｃに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図１１Ｂ ＮＥＩＬ２エフェクターモジュールの非存在下（白の棒）および存在下で、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよび５コピーのＢＰＳａを含むｇＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。ＰＵＦｃ－ＮＥＩＬ２（黒の棒）およびＮＥＩＬ２－ＰＵＦｃ（グレーの棒）が示される。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。

【図11B】図１１Ａ－１１Ｂ 標的部位へのＮＥＩＬ２補充なしのＴＥＴ１媒介性ＭＬＨ１活性化。図１１Ａ 図は、各実験において使用されるＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよびＮＥＩＬ２エフェクターモジュールを示すＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームを描く。タンパク質融合物を、アミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ各図の左側および右側に配置して示す。その示されるｇＲＮＡ足場を、ＰＵＦｃ結合部位なしの５コピーのＰＵＦａ結合部位（５×ＰＢＳａ）を含むように質を変化させた。形状は自由裁量であり、ＮＥＩＬ２、ＴＥＴ１（ＣＤ）、ＰＵＦａ、およびＰＵＦｃに伴う一定の縮尺で描かれずに示される。図１１Ｂ ＮＥＩＬ２エフェクターモジュールの非存在下（白の棒）および存在下で、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターおよび５コピーのＢＰＳａを含むｇＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの相対的変化。ＰＵＦｃ－ＮＥＩＬ２（黒の棒）およびＮＥＩＬ２－ＰＵＦｃ（グレーの棒）が示される。エラーバーは、三連の実験から導出されたＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

詳細な説明
脱メチル化エンハンサー複合体
本明細書で提供されその実施形態を含む組成物および方法は、ＴＥＴ脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ触媒ドメイン）またはその機能的フラグメントを、脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＧＡＤＤ４５Ａドメイン、ＮＥＩＬ２ドメイン）と一緒に特定のゲノム遺伝子座（例えば、ＣｐＧアイランド）に送達することによって、増強された脱メチル化活性の標的化送達を可能にし、そしてそれによって上記エンハンサードメインがない場合に対して上記遺伝子座の増強された脱メチル化ＤＮＡを誘導するメチル化編集（ＭＥ）プラットフォームを提供する。本明細書で提供される脱メチル化ドメインおよび脱メチル化エンハンサードメインは、ヌクレアーゼ欠損性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）ならびにＰＵＦドメイン、脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１触媒ドメイン）および脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＧＡＤＤ４５ＡドメインまたはＮＥＩＬ２ドメイン）を含むタンパク質結合体に結合したポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む複合体を使用することによって、哺乳動物細胞のゲノム中の特定の部位に送達され得る。

【0032】

ある種の局面において、脱メチル化タンパク質結合体は、（ｉ）Ｃ末端およびＮ末端を有するＰＵＦドメイン；（ｉｉ）そのＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および（ｉｉｉ）そのＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結されて、タンパク質結合体を形成する脱メチル化エンハンサードメインを含み、脱メチル化タンパク質結合体は、１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合するＰＵＦドメインを介してリボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する。

【0033】

ある種の他の局面において、脱メチル化タンパク質結合体は、（ｉ）Ｃ末端を有するＰＵＦドメイン；（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有する脱メチル化エンハンサードメインであって、ここで脱メチル化エンハンサードメインのＮ末端は、そのＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される脱メチル化エンハンサードメイン；ならびに（ｉｉｉ）上記脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメインを含み、そしてその脱メチル化タンパク質結合体は、１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合するＰＵＦドメインを介してリボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する。

【0034】

他のある種の局面において、脱メチル化タンパク質結合体は、（ｉ）Ｃ末端を有する第１のＰＵＦドメイン、および（ｉｉ）その第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメインを含み、ここでその脱メチル化タンパク質結合体は、その第１のＰＢＳ配列に結合するその第１のＰＵＦドメインを介してそのリボ核タンパク質複合体に結合し；そして脱メチル化エンハンサー結合体は、（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および（ｉｉ）その第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメインを含み、ここでその脱メチル化エンハンサー結合体は、その第２のＰＢＳ配列に結合するその第２のＰＵＦドメインを介してリボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する。

【0035】

脱メチル化エンハンサードメインは、脱メチル化ドメイン（脱メチル化タンパク質結合体）と同じＰＵＦドメインに作動可能に連結され得る。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、別個のＰＵＦドメイン（脱メチル化エンハンサー結合体）を通じてガイドＲＮＡに接続され得る。

【0036】

本明細書で提供されその実施形態を含む脱メチル化複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＰｕｍｉｌｉｏタンパク質を含む３構成要素ハイブリッドシステムに基づく。本発明の目的のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＰｕｍｉｌｉｏタンパク質を含む３構成要素ハイブリッドシステムはまた、Ｃａｓｉｌｉｏシステムと交換可能に言及され得、そしてそのＣａｓｉｌｉｏシステムに基づくメチル化編集（ＭＥ）プラットフォームは、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥとときおり言及される。本質的に、その脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴデメチラーゼ）は、ＣａｓｉｌｉｏシステムにおいてＰＢＳに結合するＰｕｍｉｌｉｏタンパク質またはその機能的フラグメント（ＰＵＦドメイン）に融合され、従って、このようなドメインを、Ｃａｓｉｌｉｏシステムによって特異的に認識される目的の任意の標的遺伝子座の近位に橋渡しする。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１で開示され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは参考としておよび全ての目的のために援用される）として公開された３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体システムの任意の局面または実施形態は、本明細書で提供される発明のために使用され得る。

【0037】

本明細書で提供されその実施形態を含む組成物および方法は、ＤＮＡデメチラーゼを標的細胞へと導入することによって標的遺伝子のメチル化状態を調節しようとした過去の試みを超えて、本発明が、脱メチル化酵素を上記脱メチル化酵素のエンハンサーと一緒に送達することによって、標的化された遺伝子の遺伝子座の増大した脱メチル化を可能にするという点で有利である。このようなシステムは、標的遺伝子に優れた脱メチル化活性を提供して、メチル化状態の質を変化させる。

【0038】

ＴＥＴ脱メチル化ドメインを含む複合体の脱メチル化効率が、その複合体の中に脱メチル化エンハンサーを含めることによって有意に増大され得ることを示したのは、出願人らが初めてであった。驚くべきことに、本発明者らは、エンハンサードメインを含めるに際して脱メチル化効率の増大が、以下に依存することを発見した：（ｉ）存在するエンハンサータンパク質のタイプ；（ｉｉ）そのエンハンサードメインが脱メチル化タンパク質結合体のＰＵＦドメインに連結される配向、および（ｉｉｉ）その脱メチル化エンハンサードメインがＰＵＦドメインに連結されかつ脱メチル化ドメインに接続される様式（例えば、Ｎ末端からＣ末端へ、その結合体は、ＰＵＦドメイン、これに脱メチル化エンハンサードメインが連結され、これに脱メチル化ドメインが連結されたもの、またはＰＵＦドメイン、これに脱メチル化ドメインが連結され、これに脱メチル化エンハンサードメインが連結されたものを含み得る）。出願人らは、脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１触媒ドメイン）がＰＵＦドメインのＣ末端に連結されている複合体が、脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１触媒ドメイン）がＰＵＦドメインのＮ末端に連結された複合体と比較して、有意により有効であることを見出した。出願人らはさらに、Ｃ末端連結したＴＥＴ活性（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、またはＴＥＴ３の脱メチル化活性）が、特定の脱メチル化エンハンサー（例えば、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＮＥＩＬ２）を脱メチル化複合体の中に含めることによって増大され得ることを示した。さらに、出願人らは驚くべきことに、特定の脱メチル化エンハンサーのみがＴＥＴドメインの脱メチル化を効率的に増強していることを示した。実際に、そのエンハンサーがＮＥＩＬグリコシラーゼ（例えば、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２、またはＮＥＩＬ３）である場合、脱メチル化は、ＮＥＩＬ２の存在下でのみ増強されるが、ＮＥＩＬ１またはＮＥＩＬ３の存在下では増強されず、特異性を示す。

【0039】

本明細書で言及される場合の脱メチル化ドメインは、標的核酸を脱メチル化し得るタンパク質ドメインである。ある種の実施形態において、その脱メチル化ドメインは、脱メチル化酵素の触媒ドメイン（例えば、ＴＥＴ１の触媒ドメイン）を含む。ある種の実施形態において、その脱メチル化ドメインは、脱メチル化酵素の触媒ドメインである。

【0040】

本明細書で提供される場合の「脱メチル化エンハンサードメイン（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）」、「脱メチル化エンハンサータンパク質（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「脱メチル化エンハンサー酵素（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｎｚｙｍｅ）」は、アクチベーター（例えば、本明細書で記載される脱メチル化エンハンサードメイン）の非存在下での脱メチル化酵素または脱メチル化ドメインの活性または機能と比較して、その脱メチル化酵素または脱メチル化ドメインの活性または機能に正に影響を及ぼし得る（例えば、増大させ得る）タンパク質、タンパク質ドメインまたはタンパク質部分に言及する。従って、ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、少なくとも部分的に、部分的にまたは完全に、刺激を増大させ得るか、活性化を増大もしくは可能にし得るか、または脱メチル化酵素を活性化し得る。活性（活性化）の増大の量は、脱メチル化エンハンサードメインの非存在下でのコントロールとの比較において、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または１００％超であり得る。ある種の実施形態において、その活性は、脱メチル化エンハンサードメインの非存在下での活性より１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、または１０倍超である。従って、ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＴＥＴ脱メチル化ドメインの脱メチル化を、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増大させる。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＴＥＴ脱メチル化ドメインの脱メチル化を、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増大させる。

【0041】

細胞において標的遺伝子座を脱メチル化するために有用な脱メチル化タンパク質結合体および脱メチル化エンハンサー結合体が、本明細書で提供される。その脱メチル化タンパク質結合体は、本明細書で記載されるＰＵＦドメイン、そのＰＵＦドメインのＣ末端に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン、ＴＥＴ１触媒ドメイン）および脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＮＥＩＬ２ドメインまたはＧＡＤＤ４５Ａドメイン）を含む。その脱メチル化エンハンサードメインは、そのＰＵＦドメインのＮ末端またはＣ末端に連結され得る。脱メチル化エンハンサードメインがＰＵＦドメインのＮ末端に連結される場合、ＴＥＴ脱メチル化ドメインおよび脱メチル化エンハンサードメインは、直接連結されないが、ＰＵＦドメインを通じて接続される。脱メチル化エンハンサードメインがＰＵＦドメインのＣ末端に連結される場合、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＰＵＦドメインをＴＥＴ脱メチル化ドメインに接続する。言い換えると、ＰＵＦドメインのＣ末端は、脱メチル化エンハンサードメインに連結され、この脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端は、ＴＥＴ脱メチル化ドメインに連結される。あるいは、本明細書で提供される複合体は、第１のＰＵＦドメインおよび脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン）を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここでそのＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＰＵＦドメインのＣ末端に連結される脱メチル化タンパク質結合体、ならびに第２のＰＵＦドメインおよび脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＮＥＩＬ２ドメインまたはＧＡＤＤ４５Ａドメイン）を含む脱メチル化エンハンサー結合体を含み得る。

【0042】

ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、ＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、第２のＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、第２のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される。

【0043】

ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインである。ある種の実施形態において、そのＧＡＤＤ４５ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインである。ある種の実施形態において、そのＮＥＩＬ２ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ１ドメインではない。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ３ドメインではない。

【0044】

本明細書で提供されその実施形態を含む複合体は、（ｉ）脱メチル化ドメインおよび脱メチル化エンハンサードメインに作動可能に連結されたＰＵＦドメイン（脱メチル化タンパク質結合体）、（ｉｉ）脱メチル化ドメインに作動可能に連結された第１のＰＵＦドメイン（脱メチル化タンパク質結合体）、または（ｉｉｉ）脱メチル化エンハンサードメインに作動可能に連結された第２のＰＵＦドメイン（脱メチル化エンハンサー結合体）をそれぞれ含む脱メチル化結合体（例えば、脱メチル化タンパク質結合体、脱メチル化エンハンサー結合体）を含む。従って、本明細書で提供されるとおりの脱メチル化タンパク質結合体は、（ｉ）脱メチル化ドメインおよび脱メチル化エンハンサードメインに作動可能に連結されたＰＵＦドメイン、または（ｉｉ）脱メチル化ドメインに連結された第１のＰＵＦドメインを含む。脱メチル化エンハンサードメインは、脱メチル化エンハンサードメインに連結された第２のＰＵＦドメインを含む。

【0045】

タンパク質結合体が脱メチル化結合体である場合、その脱メチル化ドメインは、ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されて、タンパク質結合体を形成する。脱メチル化エンハンサードメインは、ＰＵＦドメインのＣ末端に、ＰＵＦドメインのＮ末端に連結され得るか、または脱メチル化エンハンサードメインは、別個のＰＵＦドメインに連結された（すなわち、ＰＵＦドメインは、脱メチル化ドメインに連結されない）ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）を結合し得る。脱メチル化エンハンサードメインおよび脱メチル化ドメインがポリヌクレオチドを別個に結合する場合、その脱メチル化ドメインは、脱メチル化タンパク質結合体の一部を形成し、第１のＰＵＦドメインに連結され、そしてその脱メチル化エンハンサードメインは、脱メチル化エンハンサータンパク質結合体の一部を形成し、第２のＰＵＦドメインに連結される。その脱メチル化タンパク質結合体は、第１のＰＢＳ配列への第１のＰＵＦドメインの結合を通じてそのポリヌクレオチドを結合し、その脱メチル化エンハンサータンパク質結合体は、第２のＰＢＳ配列への第２のＰＵＦドメインの結合を通じてそのポリヌクレオチドを結合する。

【0046】

従って、一局面において、脱メチル化複合体が提供される。上記脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここでそのヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記ポリヌクレオチドに結合される、リボ核タンパク質複合体；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端およびＮ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）上記ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；および
（ｉｉｉ）上記ＰＵＦドメインのＮ末端に連結されて、タンパク質結合体を形成する脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで上記脱メチル化タンパク質結合体は、１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合する上記ＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化タンパク質結合体、
を含む。

【0047】

一局面において、脱メチル化複合体が提供される。上記脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記ポリヌクレオチドに結合されるリボ核タンパク質複合体；ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有する脱メチル化エンハンサードメインであって、ここで上記脱メチル化エンハンサードメインのＮ末端は、上記ＰＵＦドメインＣ末端に作動可能に連結される脱メチル化エンハンサードメイン；および
（ｉｉｉ）上記脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン；
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで上記脱メチル化タンパク質結合体は、上記１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合するＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化タンパク質結合体、
を含む。

【0048】

一局面において、脱メチル化複合体が提供される。上記脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；ならびに
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（３）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列；および
（４）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリボ核タンパク質複合体であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記ポリヌクレオチドに結合されるリボ核タンパク質複合体；
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有する第１のＰＵＦドメイン、および
（ｉｉ）上記第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで上記脱メチル化タンパク質結合体は、上記第１のＰＢＳ配列に結合する第１のＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合する脱メチル化タンパク質結合体；ならびに
（ｃ）以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）上記第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体であって、ここで上記脱メチル化エンハンサー結合体は、上記第２のＰＢＳ配列に結合する上記第２のＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化エンハンサー結合体、
を含む。

【0049】

ある種の実施形態において、ＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ１ドメイン（すなわち、ＴＥＴ１触媒ドメイン）、ＴＥＴ２ドメイン（すなわち、ＴＥＴ２触媒ドメイン）またはＴＥＴ３ドメイン（すなわち、ＴＥＴ３触媒ドメイン）である。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ１ドメインである。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ２ドメインである。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ３ドメインである。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ１触媒ドメインである。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ２触媒ドメインである。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ脱メチル化ドメインは、ＴＥＴ３触媒ドメインである。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ１ドメインは、配列番号５１の配列を有する。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインである。ある種の実施形態において、そのＧＡＤＤ４５ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインである。ある種の実施形態において、そのＮＥＩＬ２ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を有する。

【0050】

リボ核タンパク質複合体
本明細書で提供される場合の「リボ核タンパク質複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）」は、核タンパク質およびリボ核酸を含む複合体をいう。本明細書で提供される場合の「核タンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）とは、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を結合し得るタンパク質をいう。その核タンパク質がリボ核酸を結合する場合、それは、「リボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）」といわれる。リボ核タンパク質とリボ核酸との間の相互作用は、直接的、例えば、共有結合によって、または間接的、例えば、非共有結合的な結合（例えば、静電的相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファン・デル・ワールス相互作用（例えば、双極子－双極子、双極子－誘起双極子、ロンドン分散力）、環スタッキング（π効果）、疎水性相互作用など）によってであり得る。ある種の実施形態において、そのリボ核タンパク質は、リボ核酸に非共有結合的に結合されるＲＮＡ結合モチーフを含む。例えば、ＲＮＡ結合モチーフ中の正に荷電した芳香族アミノ酸残基（例えば、リジン残基）は、ＲＮＡの負の核酸ホスフェート骨格と静電的相互作用を形成し得、それによって、リボ核タンパク質複合体を形成し得る。リボ核タンパク質の非限定的な例としては、リボソーム、テロメラーゼ、ＲＮＡｓｅＰ、ｈｎＲＮＰ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）および低分子核ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＰ）（ｓｎＲＮＰ）が挙げられる。そのリボ核タンパク質は、酵素であり得る。ある種の実施形態において、そのリボ核タンパク質は、エンドヌクレアーゼである。ある種の実施形態において、そのリボ核タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。従って、ある種の実施形態において、そのリボ核タンパク質複合体は、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素およびリボ核酸を含む。ある種の実施形態において、そのヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。本明細書で提供される核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、そのＮＬＳが連結される、タンパク質ドメインまたはタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素）の核輸送を提供する。

【0051】

ある種の実施形態において、そのヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ヌクレアーゼ欠損性ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｄＣａｓ９）である。ある種の実施形態において、そのヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ヌクレアーゼ欠損性Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）である。

【0052】

ポリヌクレオチド
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列、（２）そのヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、ｄＣａｓ９）に対する結合配列、および（３）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列（例えば、第１の（３）および第２の（４）ＰＢＳ配列）を含む。ある種の実施形態において、その複合体は、そのポリヌクレオチドに結合したｄＣａｓ９を含み、それによって、リボ核タンパク質複合体を形成する。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドは、リボ核酸である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡである。本明細書で提供される場合の「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」または「ｇＲＮＡ」は、核タンパク質を結合し得、それによってリボ核タンパク質複合体を形成し得るリボヌクレオチド配列に言及する。

【0053】

ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、１本鎖リボ核酸である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、長さが１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個またはこれより多くの核酸残基である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、長さが１０～３０個の核酸残基である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、長さが２０個の核酸残基である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）の長さは、長さが少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個またはこれより多くの核酸残基または糖残基であり得る。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、長さが５～５０個、１０～５０個、１５～５０個、２０～５０個、２５～５０個、３０～５０個、３５～５０個、４０～５０個、４５～５０個、５～７５個、１０～７５個、１５～７５個、２０～７５個、２５～７５個、３０～７５個、３５～７５個、４０～７５個、４５～７５個、５０～７５個、５５～７５個、６０～７５個、６５～７５個、７０～７５個、５～１００個、１０～１００個、１５～１００個、２０～１００個、２５～１００個、３０～１００個、３５～１００個、４０～１００個、４５～１００個、５０～１００個、５５～１００個、６０～１００個、６５～１００個、７０～１００個、７５～１００個、８０～１００個、８５～１００個、９０～１００個、９５～１００個、またはこれより多くの残基である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、長さが１０～１５個、１０～２０個、１０～３０個、１０～４０個、または１０～５０残基である。

【0054】

ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドの転写は、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターまたはＵｂｃプロモーター）、または誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答正プロモーターまたはステロイド応答性プロモーター）の制御下にある。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドは、ベクターである。

【0055】

ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（本発明の方法において使用するための）をコードするベクターは、哺乳動物（ヒト；非ヒト霊長類；非ヒト哺乳動物；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）；家畜哺乳動物（例えば、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ウシ）；またはペット哺乳動物（例えば、ネコまたはイヌ））；鳥類、魚類、昆虫、蠕虫、酵母、もしくは細菌に由来する細胞において活性である。

【0056】

ある種の実施形態において、そのベクターは、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、もしくはレンチウイルスベクター、またはＡＡＶベクター）、またはトランスポゾン（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン）である。そのベクターは、宿主細胞へと一過性にトランスフェクトされ得るか、または感染もしくは転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって宿主ゲノムへと組み込まれ得る。

【0057】

ＤＮＡ標的化配列
そのポリヌクレオチドは、標的部位（例えば、標的ポリヌクレオチド配列）に相補的なヌクレオチド配列を含み、これは、本明細書で「ＤＮＡ標的化配列（ＤＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」といわれる。そのＤＮＡ標的化配列は、相補的な標的ポリヌクレオチド配列（それによって、そのリボ核タンパク質複合体の配列特異性を提供する）へのリボ核タンパク質複合体の結合を媒介し得る。従って、ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）またはその一部は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列を結合する。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドの相補体は、その標的ポリヌクレオチド配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＤＮＡ標的化配列の相補体は、その標的ポリヌクレオチド配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

【0058】

ＤＮＡ標的化配列が、標的ポリヌクレオチド配列に対して１００％相補的であってもそうでなくてもよいことは、注記されるべきである。ある種の実施形態において、そのＤＮＡ標的化配列は、８～２５ヌクレオチド（ｎｔ）、１２～２２ヌクレオチド、１４～２０ｎｔ、１６～２０ｎｔ、１８～２０ｎｔ、または８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、または２５ｎｔにわたってその標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。ある種の実施形態において、その相補的領域は、１２～２２ｎｔの連続するストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を、好ましくはそのＤＮＡ標的化配列の３’末端において含む。ある種の実施形態において、そのＤＮＡ標的化配列の５’末端は、標的ポリヌクレオチド配列と８ヌクレオチドまでのミスマッチを有する。ある種の実施形態において、ＤＮＡ結合配列は、その標的ポリヌクレオチド配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的である。

【0059】

関連する実施形態において、相補的な標的ポリヌクレオチド配列と比較して、ＤＮＡ標的化配列の３’末端において１５ヌクレオチド以下のマッチが存在し、複合体の中のヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ欠損性野生型Ｃａｓ９タンパク質（ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質）であり、これは、その状況下では、標的ＤＮＡ（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質）を結合するが、切断しない。ある種の実施形態において、そのヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ欠損性Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）である。

【0060】

そのＤＮＡ標的化配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムのｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡの機能的に類似または等価である。しかし、本発明の状況において、ＤＮＡ標的化配列は、任意の特定のｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡに由来しなくてもよいが、標的ポリヌクレオチド配列の配列に基づいて自由裁量でデザインされ得る。

【0061】

ＤＮＡ標的化配列は、標的ＤＮＡ（またはその標的ＤＮＡの相補鎖）内の特定の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。言い換えると、そのＤＮＡ標的化配列は、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的様式でその標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列と相互作用する。よって、ＤＮＡ標的化配列のヌクレオチド配列は変動し得、それは、その本発明のポリヌクレオチドおよび標的ＤＮＡが相互作用するその標的ＤＮＡ内の位置を決定する。そのＤＮＡ標的化配列は、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように（例えば、遺伝的操作によって）改変またはデザインされ得る。ある種の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、相補鎖のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ））配列のすぐ３’側にあり、これは、５’－ＣＣＮ－３’であり得る（ここでＮは、任意のＤＮＡヌクレオチドである）。すなわち、この実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列の相補鎖は、５’－ＮＧＧ－３’である（ここでＮは、任意のＤＮＡヌクレオチドである）ＰＡＭ配列の直ぐ５’側にある。関連する実施形態において、その相補鎖のＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９とマッチする。

【0062】

ＤＮＡ標的化配列は、１２ヌクレオチド～１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、そのＤＮＡ標的化配列は、１２ヌクレオチド（ｎｔ）～８０ｎｔ、１２ｎｔ～５０ｎｔ、１２ｎｔ～４０ｎｔ、１２ｎｔ～３０ｎｔ、１２ｎｔ～２５ｎｔ、１２ｎｔ～２０ｎｔ、または１２ｎｔ～１９ｎｔの長さを有し得る。例えば、そのＤＮＡ標的化配列は、１９ｎｔ～２０ｎｔ、１９ｎｔ～２５ｎｔ、１９ｎｔ～３０ｎｔ、１９ｎｔ～３５ｎｔ、１９ｎｔ～４０ｎｔ、１９ｎｔ～４５ｎｔ、１９ｎｔ～５０ｎｔ、１９ｎｔ～６０ｎｔ、１９ｎｔ～７０ｎｔ、１９ｎｔ～８０ｎｔ、１９ｎｔ～９０ｎｔ、１９ｎｔ～１００ｎｔ、２０ｎｔ～２５ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、２０ｎｔ～３５ｎｔ、２０ｎｔ～４０ｎｔ、２０ｎｔ～４５ｎｔ、２０ｎｔ～５０ｎｔ、２０ｎｔ～６０ｎｔ、２０ｎｔ～７０ｎｔ、２０ｎｔ～８０ｎｔ、２０ｎｔ～９０ｎｔ、または２０ｎｔ～１００ｎｔの長さを有し得る。

【0063】

標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列のヌクレオチド配列は、少なくとも１２ｎｔの長さを有し得る。例えば、その標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列は、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも３５ｎｔまたは少なくとも４０ｎｔの長さを有し得る。例えば、標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列は、１２ヌクレオチド（ｎｔ）～８０ｎｔ、１２ｎｔ～５０ｎｔ、１２ｎｔ～４５ｎｔ、１２ｎｔ～４０ｎｔ、１２ｎｔ～３５ｎｔ、１２ｎｔ～３０ｎｔ、１２ｎｔ～２５ｎｔ、１２ｎｔ～２０ｎｔ、１２ｎｔ～１９ｎｔ、１９ｎｔ～２０ｎｔ、１９ｎｔ～２５ｎｔ、１９ｎｔ～３０ｎｔ、１９ｎｔ～３５ｎｔ、１９ｎｔ～４０ｎｔ、１９ｎｔ～４５ｎｔ、１９ｎｔ～５０ｎｔ、１９ｎｔ～６０ｎｔ、２０ｎｔ～２５ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、２０ｎｔ～３５ｎｔ、２０ｎｔ～４０ｎｔ、２０ｎｔ～４５ｎｔ、２０ｎｔ～５０ｎｔ、または２０ｎｔ～６０ｎｔの長さを有し得る。標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列のヌクレオチド配列は、少なくとも１２ｎｔの長さを有し得る。

【0064】

いくつかの例では、標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列は、長さが２０ヌクレオチドである。いくつかの場合では、標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列は、長さが１９ヌクレオチドである。

【0065】

ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列との間の％相補性は、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。いくつかの場合では、ＤＮＡ標的化配列と標的ポリヌクレオチド配列との間の％相補性は、その標的ポリヌクレオチド配列の７個または８個連続する最も５’側のヌクレオチドにわたって１００％である。いくつかの場合では、ＤＮＡ標的化配列と標的ポリヌクレオチド配列との間の％相補性は、２０個連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。いくつかの場合では、ＤＮＡ標的化配列と標的ポリヌクレオチド配列との間の％相同性は、その標的ポリヌクレオチド配列の７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個連続する最も５’側のヌクレオチドにわたって１００％であり（すなわち、ＤＮＡ標的化配列の７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個連続する最も３’側のヌクレオチド）、残りにわたって０％の低さである。このような場合では、ＤＮＡ標的化配列は、長さがそれぞれ、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のヌクレオチドであると考えられ得る。

【0066】

標的ポリヌクレオチド配列
本明細書で提供される場合の「標的ポリヌクレオチド配列（ｔａｒｇｅｔ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、細胞によって発現される核酸配列である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、外因性核酸配列である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、内因性核酸配列である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、細胞遺伝子の一部を形成する。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子の一部である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、Ｓｏｘ遺伝子の一部である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、転写調節配列の一部である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーの一部である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化核酸配列である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、過剰メチル化ＣｐＧ配列である。ある種の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ｈＭＬＨ１プロモーターの一部である。

【0067】

ある種の実施形態において、標的配列は、ＲＮＡである。ある種の実施形態において、標的配列は、ＤＮＡである。本明細書中の記載において、第１のセグメントは、一般に、その標的配列がＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）である場合、「ＤＮＡ標的化配列（ＤＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」といわれる。その標的配列がＲＮＡである関連する実施形態において、本明細書中以下の記載は概して、冗長性を回避するために、「ＤＮＡ標的化配列」への言及が「ＲＮＡ標的化配列（ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と置き換えられることを除いて、同様に当てはまる。すなわち、ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補的なヌクレオチド配列を含む。

【0068】

ある種の実施形態において、その３つのセグメント（１）～（３）は、その順序で、５’→３’に配置される。ある種の実施形態において、その３つのセグメント（１）～（４）は、その順序で、５’→３’に配置される。

【0069】

ある種の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、単一のＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり得、これは、「単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」、または「ｓｇＲＮＡ」を含み得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、２つのＲＮＡ分子を含む（例えば、結合配列（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質結合配列またはｄＣａｓ９結合配列））におけるハイブリダイゼーションを介して一緒に結合される）。従って、本発明のポリヌクレオチドは、２分子ポリヌクレオチドおよび単一分子ポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の両方に言及して、包括的である。

【0070】

ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列に、その付近に、またはその中にある。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、ＣｐＧアイランド内にある。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡの低メチル化または過剰メチル化によって特徴づけられる疾患または状態と関連することが公知である。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、がん抑制遺伝子または発癌遺伝子内に（例えば、その腫瘍抑制遺伝子または発癌遺伝子の転写調節配列／エレメント内に）ある。

【0071】

ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、この標的ポリヌクレオチド配列のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の直ぐ３’側にある。例えば、ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列のＰＡＭ配列は、５’－ＣＣＮ－３’であり、ここでＮは、任意のＤＮＡヌクレオチドである。他の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列のＰＡＭ配列は、使用されるべき特定のヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質またはホモログまたはオルソログとマッチする。

【0072】

当該分野で公知であるように、ＤＮＡに成功裡に結合するべきヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質に関して、ゲノムＤＮＡ中の標的ポリヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ配列に相補的でなければならず、かつ正確なプロトスペーサー隣接モチーフまたはＰＡＭ配列が直ぐ次に続かなければならない。そのＰＡＭ配列は、標的ポリヌクレオチド配列中に存在するが、ガイドＲＮＡ配列中には存在しない。正確な標的ポリヌクレオチド配列、続いてＰＡＭ配列を有する任意のＤＮＡ配列は、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質によって結合される。ある種の実施形態において、そのＰＡＭ配列は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に開示されかつＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、参考としておよび全ての目的のために援用される）として公開されるＰＡＭ配列のうちのいずれかである。

【0073】

実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ある種の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。ある種の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子配列を結合する。

【0074】

結合配列
ある種の実施形態において、複合体は、ポリヌクレオチドの結合配列を結合することを通じて、ポリヌクレオチドに結合され、それによってリボ核タンパク質複合体を形成するｄＣａｓ９を含む。ある種の実施形態において、その結合配列は、ヘアピン構造を形成する。ある種の実施形態において、その結合配列は、長さが３０～１００ｎｔ、３５～５０ｎｔ、３７～４７ｎｔ、または４２ｎｔである。例示的な結合配列は、配列番号６の配列 ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡである。別の例示的な結合配列は、配列番号７の配列 ＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡである。

【0075】

ある種の実施形態において、その結合配列は、配列番号６の配列を含む。ある種の実施形態において、その結合配列は、配列番号７の配列を含む。ある種の実施形態において、その結合配列は、配列番号６の配列である。ある種の実施形態において、その結合配列は、配列番号７の配列である。

【0076】

本発明のポリヌクレオチドの結合配列（タンパク質結合セグメントまたはタンパク質結合配列）は、低下したエンドヌクレアーゼ活性を有するかまたはエンドヌクレアーゼ活性を欠く、改変されたｄＣａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ニッカーゼまたはｄＣａｓ９）に結合する。単純にするために、改変されたＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質）に結合し得る、その結合配列（タンパク質結合セグメントまたはタンパク質結合配列）は、「Ｃａｓ９結合配列（Ｃａｓ９－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または結合配列（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と本明細書中で単純に言及され得る。しかし、本発明の結合配列（Ｃａｓ９結合配列）がｄＣａｓ９に結合する場合に、その結合配列がｗｔ Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼに結合するのを妨げられないことは、理解されるべきである。ある種の実施形態において、本発明の結合配列（Ｃａｓ９結合配列）は、ｄＣａｓ９、ならびにｗｔ Ｃａｓ９および／またはＣａｓ９ニッカーゼに結合する。

【0077】

その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質、またはｄＣａｓ９タンパク質）と相互作用するかまたは結合し、これらは一緒に、ＤＮＡ標的化配列によって認識される標的ポリヌクレオチド配列に結合する。その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）は、互いにハイブリダイズして、２本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補的ストレッチを含む。ヌクレオチドのこれらの２つの相補的ストレッチは、リンカーまたはリンカーヌクレオチドとして公知の介在ヌクレオチドによって共有結合的に連結され得（例えば、１分子ポリヌクレオチドの場合には）、結合配列（Ｃａｓ９結合配列）の２本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖、または「Ｃａｓ９結合ヘアピン」）を形成するようにハイブリダイズし、従って、ステム－ループ構造を生じる。あるいは、ある実施形態において、ヌクレオチドのその２つの相補的ストレッチは、共有結合的に連結されなくてもよいが、代わりに、相補的配列の間のハイブリダイゼーションによって一緒に保持される（例えば、本発明の二分子ポリヌクレオチドの場合）。

【0078】

その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）は、１０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、例えば、１０ヌクレオチド（ｎｔ）～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、または９０ｎｔ～１００ｎｔの長さを有し得る。例えば、そのＣａｓ９結合配列は、１５ヌクレオチド（ｎｔ）～８０ｎｔ、１５ｎｔ～５０ｎｔ、１５ｎｔ～４０ｎｔ、１５ｎｔ～３０ｎｔ、３７ｎｔ～４７ｎｔ（例えば、４２ｎｔ）、または１５ｎｔ～２５ｎｔの長さを有し得る。

【0079】

その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、６塩基対（ｂｐ）～５０ｂｐの長さを有し得る。例えば、その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、６ｂｐ～４０ｂｐ、６ｂｐ～３０ｂｐ、６ｂｐ～２５ｂｐ、６ｂｐ～２０ｂｐ、６ｂｐ～１５ｂｐ、８ｂｐ～４０ｂｐ、８ｂｐ～３０ｂｐ、８ｂｐ～２５ｂｐ、８ｂｐ～２０ｂｐまたは８ｂｐ～１５ｂｐの長さを有し得る。例えば、その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、８ｂｐ～１０ｂｐ、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～１８ｂｐ、１８ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐ、３０ｂｐ～３５ｂｐ、３５ｂｐ～４０ｂｐ、または４０ｂｐ～５０ｂｐの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、３６塩基対の長さを有する。その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖を結合するようにハイブリダイズするヌクレオチド配列の間の％相補性は、少なくとも６０％であり得る。例えば、その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するようにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の％相補性は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり得る。いくつかの場合では、その結合配列（Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するようにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の％相補性は、１００％である。

【0080】

ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドはさらに、ＤＮＡ標的化配列を結合配列（Ｃａｓ９結合配列）に連結するリンカー配列を含む。そのリンカーは、３ヌクレオチド～１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、そのリンカーは、３ヌクレオチド（ｎｔ）～９０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～８０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～７０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～６０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～５０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～４０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～３０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～２０ｎｔまたは３ヌクレオチド（ｎｔ）～１０ｎｔの長さを有し得る。例えば、そのリンカーは、３ｎｔ～５ｎｔ、５ｎｔ～１０ｎｔ、１０ｎｔ～１５ｎｔ、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～２５ｎｔ、２５ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～３５ｎｔ、３５ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、または９０ｎｔ～１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、そのリンカーは、４ｎｔである。

【0081】

適切な結合配列（Ｃａｓ９結合配列、すなわち、Ｃａｓ９ハンドル）に含まれ得るヌクレオチド配列の非限定的例は、ＷＯ２０１３／１７６７７２の配列番号５６３～６８２に示される（ＷＯ２０１３／１７６７７２（その全体においておよび全ての目的のために参考として援用される）の例えば、図８および９を参照のこと）。

【0082】

いくつかの場合では、適切な結合配列（Ｃａｓ９結合配列）は、上記で列挙した配列のうちのいずれか１つから、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、または５ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含む。

【0083】

ＰＢＳ配列
本明細書で提供される場合の用語「ＰＢＳ」または「ＰＵＦ結合部位（ＰＵＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」とは、Ｐｕｍｉｌｉｏ／ｆｅｍ－３ ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）によって結合される部位をいう。ＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）は、ガイドＲＮＡの一部を形成し得、本明細書で提供されるとおりのＰＵＦタンパク質またはＰＵＦドメイン（例えば、ＰＵＦａ、ＰＵＦｂ、ＰＵＦｃまたはこれらの機能的フラグメント）の、上記ガイドＲＮＡへの結合を提供し得る。そのＰＵＦ結合部位は、ＰＢＳに特徴的であり、ＰＵＦタンパク質によって直接的に結合され得る核酸配列（すなわち、ＰＢＳ配列またはＰＵＦ結合部位配列）を含む。本明細書で提供されるポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）はさらに、１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列を含む。局面において、脱メチル化複合体は、脱メチル化ドメインとは異なるＰＵＦドメインに連結される脱メチル化エンハンサードメインを含む。従って、その脱メチル化ドメインは、第１のＰＢＳ配列を結合する第１のＰＵＦドメインを通じてそのポリヌクレオチドに結合され得、その脱メチル化エンハンサードメインは、第２のＰＢＳ配列に結合される第２のＰＵＦドメインを通じてそのポリヌクレオチドに結合され得る。その第１のおよび第２のＰＢＳ配列は、異なっていてもよいし、同じであってもよい。ある種の実施形態において、その１またはこれより多くのＰＢＳ配列（例えば、第１のまたは第２のＰＢＳ配列）は、長さ８ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態において、その１またはこれより多くのＰＢＳ配列（例えば、第１のまたは第２のＰＢＳ配列）は、同一である。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドは、１～５０個のＰＢＳ配列を含む。ある種の実施形態において、１またはこれより多くのＰＢＳ配列（例えば、第１のまたは第２のＰＢＳ配列）は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１で開示され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、その全体においておよび全ての目的のために参考として援用される）として公開されるＰＢＳ配列（例えば、第１のまたは第２のＰＢＳ配列）のうちのいずれか一方は、本明細書で提供される組成物および方法のために企図される。

【0084】

ある種の実施形態において、１またはこれより多くのＰＢＳ配列（例えば、第１のまたは第２のＰＢＳ配列）の各々は、８ヌクレオチドを有する。１つの例示的なＰＢＳ配列は、配列番号８の配列（５’－ＵＧＵＡＵＧＵＡ－３’）を有し得、これは、ＰＵＦドメインＰＵＦ（３－２）によって結合され得る。別の例示的なＰＢＳは、配列番号９の配列（５’－ＵＵＧＡＵＡＵＡ－３’）を有し得、これは、ＰＵＦドメインＰＵＦ（６－２／７－２）によって結合され得る。さらなるＰＢＳ配列およびその相当するＰＵＦドメインは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、その全体においておよび全ての目的のために参考として援用される）として公開される。

【0085】

本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＳ配列の１より多くのコピーを有し得る。ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドは、１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、１０コピー、１５コピー、２０コピー、２５コピー、３０コピー、３５コピー、４０コピー、４５コピー、４６コピー、４７コピー、４８コピー、４９コピー、または５０コピーのＰＢＳ配列（例えば、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー、１０コピー、１１コピー、１２コピー、１３コピー、１４コピー、または１５コピーのＰＢＳ配列）を含む。ある種の実施形態において、そのＰＢＳ配列コピー数の範囲は、Ｌ～Ｈ（ここでＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、または４０のうちのいずれか１つであり、そしてここでＨは、ＨがＬより大きい限りにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、または１００のうちのいずれか１つである）。各ＰＢＳ配列は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。

【0086】

ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドは、１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、１０コピー、１５コピー、２０コピー、２５コピー、３０コピー、３５コピー、４０コピー、４５コピー、４６コピー、４７コピー、４８コピー、４９コピー、もしくは５０コピーの、または１～５０コピー、２～４５コピー、３～４０コピー、５～３５コピー、５～１０コピー、１０～２０コピーの同一または異なるＰＢＳ配列を含む。

【0087】

ある種の実施形態において、そのポリヌクレオチドは、５～１５コピーのＰＢＳ配列、または５～１４コピー、５～１３コピー、５～１２コピー、５～１１コピー、５～１０コピー、もしくは５～９コピーのＰＢＳ配列を含む。

【0088】

ある種の実施形態において、ｇＲＮＡ－ＰＢＳ配列の量および／またはトランスフェクトもしくは発現されるタンパク質結合体（メチル化または脱メチル化タンパク質結合体）の量は、ＰＢＳ／ＰＵＦドメイン結合を最大化するように調節される。例えば、これは、より強いプロモーターによってＰＵＦドメインの発現を増大させるか、または誘導性プロモーター（例えば、Ｄｏｘ誘導性プロモーター）を使用することによって、達成され得る。

【0089】

ある種の実施形態において、ＰＢＳ配列および／またはスペーサー配列の間の間隔は、システム効率を改善するために最適化される。例えば、間隔の最適化は、特定のタンパク質結合体（メチル化または脱メチル化タンパク質結合体）の影響を受け得、個々のタンパク質として働くタンパク質結合体（メチル化または脱メチル化タンパク質結合体）と、機能するために十分近くに配置される必要があり得るそれらタンパク質結合体（メチル化または脱メチル化タンパク質結合体）（例えば、タンパク質複合体）との間で異なり得る。

【0090】

ある種の実施形態において、１またはこれより多くのスペーサー領域は、２つの隣接するＰＢＳ配列を分離する。そのスペーサー領域は、３ヌクレオチド～１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、そのスペーサーは、３ヌクレオチド（ｎｔ）～９０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～８０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～７０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～６０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～５０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～４０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～３０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）～２０ｎｔまたは３ヌクレオチド（ｎｔ）～１０ｎｔの長さを有し得る。例えば、そのスペーサーは、３ｎｔ～５ｎｔ、５ｎｔ～１０ｎｔ、１０ｎｔ～１５ｎｔ、１５ｎｔ～２０ｎｔ、２０ｎｔ～２５ｎｔ、２５ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～３５ｎｔ、３５ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、または９０ｎｔ～１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、そのスペーサーは、４ｎｔである。

【0091】

ある種の実施形態において、ＰＢＳ配列は、配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号２７の配列を含む。ある種の実施形態において、ＰＢＳ配列は、配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号２７の配列である。

【0092】

ある種の実施形態において、第１のまたは第２のＰＢＳ配列は、長さ８ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態において、第１のまたは第２のＰＢＳ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

【0093】

タンパク質結合体
ＰＵＦドメイン
ＰＵＦタンパク質（後にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＰｕｍｉｌｉｏおよびＣ． ｅｌｅｇａｎｓ ｆｅｒｎ－３結合因子と名付けられた）は、ｍＲＮＡ安定性および翻訳の媒介に関与することが公知である。これらのタンパク質は、ＰＵＦドメインとして公知の特有のＲＮＡ結合ドメインを含む。そのＲＮＡ結合ＰＵＦドメイン（例えば、ヒトＰｕｍｉｌｉｏ １タンパク質（本明細書でＰＵＭともいわれる）のもの）は、アンチパラレル様式で連続する塩基を結合する８回反復を含み（各反復は、ＰＵＦモチーフまたはＰＵＦ反復と称される）、各反復は、単一の塩基を認識する－すなわち、ＰＵＦ反復Ｒ１～Ｒ８は、それぞれ、ヌクレオチドＮ８～Ｎ１を認識する。例えば、ＰＵＭは、８個の縦列反復から構成され、各反復は、αヘリックスから構成される密に充填されたドメインへと折りたたまれる３４アミノ酸からなる。

【0094】

本明細書で提供されその実施形態を含む複合体は、脱メチル化タンパク質結合体（例えば、脱メチル化タンパク質結合体、脱メチル化エンハンサー結合体）を含み、その脱メチル化タンパク質結合体は、それぞれ、（ｉ）脱メチル化ドメインおよび脱メチル化エンハンサードメインに作動可能に連結されたＰＵＦドメイン、または（ｉｉ）脱メチル化ドメインに作動可能に連結された第１のＰＵＦドメインおよび脱メチル化エンハンサードメインに作動可能に連結された第２のＰＵＦドメインを含む。そのタンパク質結合体が脱メチル化結合体である場合、その脱メチル化ドメインは、ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されて、タンパク質結合体を形成する。その脱メチル化エンハンサードメインは、ＰＵＦドメインのＣ末端に、ＰＵＦドメインのＮ末端に連結され得るか、またはその脱メチル化エンハンサードメインは、別個のＰＵＦドメイン（すなわち、脱メチル化ドメインに連結されていないＰＵＦドメイン）に連結されたポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）に結合し得る。脱メチル化エンハンサードメインおよび脱メチル化ドメインは、別個にポリヌクレオチドを結合する場合、その脱メチル化ドメインは、脱メチル化タンパク質結合体の一部を形成し、第１のＰＵＦドメインに連結され、その脱メチル化エンハンサードメインは、脱メチル化エンハンサータンパク質結合体の一部を形成し、第２のＰＵＦドメインに連結される。その脱メチル化タンパク質結合体は、第１のＰＢＳ配列への第１のＰＵＦドメインの結合を通じてそのポリヌクレオチドを結合し、その脱メチル化エンハンサータンパク質結合体は、第２のＰＢＳ配列への第２のＰＵＦドメインの結合を通じてポリヌクレオチドに結合する。

【0095】

本明細書で使用される場合、用語「ＰＵＦドメイン（ＰＵＦ ｄｏｍａｉｎ）」とは、野生型または天然に存在するＰＵＦドメイン、ならびに天然のもしくは既存のＰＵＦドメイン（たとえば、プロトタイプヒトＰｕｍｉｌｉｏ １ ＰＵＦドメイン）に基づく／由来するＰＵＦホモログドメインをいう。本発明のＰＵＦドメインは、ＲＮＡ配列（例えば、８マーＲＮＡ配列）に特異的に結合し、ここでＰＵＦドメインとＲＮＡ配列との間の全体的な結合特異性は、ＰＵＦドメイン内の各ＰＵＦモチーフ／ＰＵＦ反復とその相当する単一ＲＮＡヌクレオチドとの間の配列特異的結合によって定義される。

【0096】

また、本発明の範囲に含まれるのは、本発明のＰＵＦドメインまたはその融合物の機能的改変体である。用語「機能的改変体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）、とは、本明細書で使用される場合、親ＰＵＦドメインと実質的またはかなりの配列同一性または類似性を有するＰＵＦドメインであって、その機能的改変体は、その機能的改変体の中のＰＵＦドメインが改変体であるそのＰＵＦドメインの生物学的活性を保持するもの－例えば、結合親和性に関して類似の程度、同程度またはより高い程度まで、および／または親ＰＵＦドメインと実質的に同じもしくは同一の結合特異性で、標的ＲＮＡを認識する能力を保持するもの、に言及する。その機能的改変体ＰＵＦドメインは、例えば、親ＰＵＦドメインとアミノ酸配列において少なくとも３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％または９８％超、同一であり得る。その機能的改変体は、例えば、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換、例えば、ＰＵＦドメインの足場における保存的アミノ酸置換（すなわち、ＲＮＡと相互作用しないアミノ酸）を有する親ＰＵＦドメインのアミノ酸配列を含み得る。代わりにまたはさらに、その機能的改変体は、少なくとも１個の非保存的アミノ酸置換を有する親ＰＵＦドメインのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が、その機能的改変体の生物学的活性に干渉しないかまたは阻害しないことは、好ましい。その非保存的アミノ酸置換は、その機能的改変体の生物学的活性を増強し得、その結果、その機能的改変体の生物学的活性は、その親ＰＵＦドメインと比較した場合に増大されるか、またはそのＰＵＦドメインの安定性を所望のレベルへと（例えば、足場におけるアミノ酸の置換に起因して）質を変化させ得る。そのＰＵＦドメインは、特定のアミノ酸配列または本明細書に記載される配列から本質的になり得、その結果、他の構成要素（例えば、他のアミノ酸）は、その機能的改変体の生物学的活性を実質的に変化させない。ある種の実施形態において、ＰＵＦドメインは、Ｐｕｍｉｌｉｏ相同性ドメイン（ＰＵ－ＨＵＤ）である。特定の実施形態において、そのＰＵ－ＨＵＤは、ヒトＰｕｍｉｌｉｏ １ドメインである。ある種の実施形態において、そのＰＵＦドメインは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１で開示され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８として公開される、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４０９３３で開示され、ＷＯ ２０１１／１６００５２Ａ２として公開される、およびＳｐａｓｓｏｖ ＆ Ｊｕｒｅｃｉｃ（「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＵＭ１ ａｎｄ ＰＵＭ２ ｇｅｎｅｓ， ｈｕｍａｎ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｍｉｌｉｏ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」， Ｇｅｎｅ， ２９９：１９５－２０４， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００２）で開示されるＰＵＦドメインのうちのいずれかいつの配列を有する（これらは、その全体においておよび全ての目的のために参考として援用される）。

【0097】

ある種の実施形態において、ＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメイン、ＰＵＦｂドメイン、ＰＵＦｃドメイン、あまたはＰＵＦｗドメインを含む。ある種の実施形態において、そのＰＵＦａドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、そのＰＵＦｂドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、そのＰＵＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、そのＰＵＦｗドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、第１のＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメインである。ある種の実施形態において、そのＰＵＦａドメインは、配列番号２の配列を有する。ある種の実施形態において、第２のＰＵＦドメインは、ＰＵＦｃドメインである。ある種の実施形態において、そのＰＵＦｃドメインは、配列番号４の配列を有する。

【0098】

ある種の実施形態において、その第１のまたは第２のＰＵＦドメインは、ＰＵＦａドメイン、ＰＵＦｂドメイン、ＰＵＦｃドメイン、またはＰＵＦｗドメインを含む。ある種の実施形態において、その第１のまたは第２のＰＵＦａドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、その第１のまたは第２のＰＵＦｂドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、その第１のまたは第２のＰＵＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、第１のまたは第２のＰＵＦｗドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。

【0099】

本発明のポリヌクレオチドは、１またはこれより多くの縦列配列を含み、これらの各々は、特定のＰＵＦドメイン（以下）によって特異的に認識および結合され得る。ＰＵＦドメインは、ＰＵＦドメインの個々のＰＵＦモチーフとこれらが認識する単一ＲＮＡヌクレオチドとの間のヌクレオチド特異的相互作用に基づいて実質的に任意のＰＢＳ配列に結合するように操作され得るので、そのＰＢＳ配列は、それらの相当するＰＵＦドメインを結合する任意のデザインされた配列であり得る。

【0100】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳは、８マーのヌクレオチド長を有する。他の実施形態において、本発明のＰＢＳは、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６またはこれより多くのＲＮＡヌクレオチドを有する。ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳは、配列番号１０の配列（５’－ＵＧＵＡＵＡＵＡ－３’）を有し、ｗｔヒトＰｕｍｉｌｉｏ １ ＰＵＦドメインを結合する。

【0101】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号８の配列（５’－ＵＧＵＡＵＧＵＡ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（３－２）を結合する。

【0102】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号９の配列（５’－ＵＵＧＡＵＡＵＡ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（６－２／７－２）を結合する。

【0103】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号１１の配列（５’－ＵＧＧＡＵＡＵＡ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（６－２）を結合する。

【0104】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号１２の配列（５’－ＵＵＵＡＵＡＵＡ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（７－２）を結合する。

【0105】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号１３の配列（５’－ＵＧＵＧＵＧＵＧ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ^５３１を結合する。

【0106】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号１４の配列（５’－ＵＧＵＡＵＡＵＧ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（１－１）を結合する。

【0107】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号１２の配列（５’－ＵＵＵＡＵＡＵＡ－３’）または配列番号１５の配列（５’－ＵＡＵＡＵＡＵＡ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（７－１）を結合する。

【0108】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号１６の配列（５’－ＵＧＵＡＵＵＵＡ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（３－１）を結合する。

【0109】

ある種の実施形態において、本発明のＰＢＳ配列は、配列番号１７の配列（５’－ＵＵＵＡＵＵＵＡ－３’）を有し、ＰＵＦドメインＰＵＦ（７－２／３－１）を結合する。

【0110】

実施形態において、そのＰＵＦドメインＰＵＦ（３－２）は、配列番号１８の配列を有する。ある種の実施形態において、そのＰＵＦドメインＰＵＦ（６－２／７－２）は、配列番号１９の配列を有する。ある種の実施形態において、そのＰＵＦドメインＰＵＦ^５３１は、配列番号２２の配列を有する。ある種の実施形態において、そのＰＵＦドメインは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の配列を含む。ある種の実施形態において、そのＰＵＦドメインは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の配列である。

【0111】

出願人は、６５，５３６の８マーＰＢＳ配列およびその特定のＰＢＳ配列を結合し得るそれらの相当するＰＵＦドメイン配列（以下を参照のこと）を作製した。出願人はまた、所定の８マーＰＢＳ配列を結合するその６５，５３６の個々のＰＵＦドメイン配列のうちのいずれかを検索するｐｙｔｈｏｎスクリプトを作製した。例えば、８マー ＵＵＧＡＵＧＵＡ（配列番号２７）に関して、１つの考えられるＰＵＦドメイン配列は、配列番号２８：

【化1】

であり得る。

【0112】

ＰＵＦ（３－２） 配列番号１８

【化2】

【0113】

ＰＵＦ（３－２）（配列番号１８）は、ＰＵＦ反復３において２つの点変異（Ｃ９３５Ｓ／Ｑ９３９Ｅ）を有し、ＮＲＥの６位において変異を有するコグネートＲＮＡ（Ａ６Ｇ； 配列番号２７（５’－ＵＧＵＡＵＧＵＡ－３’））を認識する。

【0114】

ＰＵＦ（６－２／７－２） 配列番号１９

【化3】

【0115】

ＰＵＦ（６－２／７－２）（配列番号１９）は、反復６および７において、それぞれ、二重の点変異（Ｎ１０４３Ｓ／Ｑ１０４７ＥおよびＳ１０７９Ｎ／Ｅ１０８３Ｑ）を有し、ＮＲＥの２位および３位において２つの変異を有するコグネートＲＮＡ配列（ＧＵ／ＵＧ； 配列番号９（５’－ＵＵＧＡＵＡＵＡ－３’））を認識する。

【0116】

関連ＰＵＦ（６－２）は、反復６において点変異（Ｎ１０４３Ｓ／Ｑ１０４７Ｅ）を有し、ＮＲＥの３位において変異を有するコグネートＲＮＡ配列（配列番号１１（５’－ＵＧＧＡＵＡＵＡ－３’））を認識する。

【0117】

別の関連ＰＵＦ（７－２）は、反復７において点変異（Ｓ１０７９Ｎ／Ｅ１０８３Ｑ）を有し、ＮＲＥの２位において変異を有するコグネートＲＮＡ配列（配列番号１２（５’－ＵＵＵＡＵＡＵＡ－３’））を認識する。

【0118】

ＰＵＦ^５３１ 配列番号２２

【化4-1】

【化4-2】

【0119】

そのＰＵＦドメイン ＰＵＦ^５３１（配列番号２２）は、野生型ＰＵＦ反復１、３および５において変異（Ｑ８６７Ｅ／Ｑ９３９Ｅ／Ｃ９３５Ｓ／Ｑ１０１１Ｅ／Ｃ１００７Ｓ）を有し、配列番号１３の配列（５’－ＵＧＵＧＵＧＵＧ－３’）を認識する。そのＰＵＦ^５３１は、野生型ＰＵＦ ＲＮＡと比較して、その新たな標的配列を非常に高い親和性で認識し得る。

【0120】

別の改変されたＰＵＦドメイン ＰＵＦ（１－１）は、ＰＵＦ反復１において１つの点変異（Ｑ８６７Ｅ）を有し、ＮＲＥの８位において変異を有するコグネートＲＮＡ（Ａ８Ｇ； 配列番号１４（５’－ＵＧＵＡＵＡＵＧ－３’））を認識する。

【0121】

さらに別の改変されたＰＵＦドメインＰＵＦ（７－１）は、ＰＵＦ反復７において１つの点変異（Ｅ１０８３Ｑ）を有し、ＮＲＥの２位において変異を有するコグネートＲＮＡ（Ｇ２Ｕ； 配列番号１２（５’－ＵＵＵＡＵＡＵＡ－３’）；またはＧ２Ａ； 配列番号１５（５’－ＵＡＵＡＵＡＵＡ－３’））を認識する。

【0122】

なお別の改変されたＰＵＦドメインＰＵＦ（３－１）は、ＰＵＦ反復３において１つの点変異（Ｃ９３５Ｎ）を有し、ＮＲＥの６位において変異を有するコグネートＲＮＡ（Ａ６Ｕ； 配列番号１６（５’－ＵＧＵＡＵＵＵＡ－３’））を認識する。

【0123】

さらに改変されたＰＵＦ（７－２／３－１）は、反復７および３において点変異（Ｃ９３５Ｎ／Ｓ１０７９Ｎ／Ｅ１０８３Ｑ）を有し、ＮＲＥの２位および６位において変異を有するコグネートＲＮＡ配列（配列番号１７（５’－ＵＵＵＡＵＵＵＡ－３’））を認識する。

【0124】

実施形態において、ＰＵＦドメインは、配列番号２９の配列を有する。

【化5-1】

【化5-2】

【0125】

配列番号３０

【化6-1】

【化6-2】

【0126】

配列番号３１

【化7-1】

【化7-2】

【0127】

本明細書で提供される脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン）、またはメチル化ドメイン（例えば、Ｄｎｍｔ３ａドメイン）もしくは脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＮＥＩＬ２ドメイン、ＧＡＤＤ４５Ａドメイン）は、本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含むＰＵＦドメインに連結され得る。あるいは、本明細書で提供される脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン）、またはメチル化ドメイン（例えば、Ｄｎｍｔ３ａドメイン）もしくは脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＮＥＩＬ２ドメイン、ＧＡＤＤ４５Ａドメイン）は、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）に連結され得る。本明細書で提供される脱メチル化ドメインまたは脱メチル化エンハンサードメインが、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）に直接連結（融合）される場合、化学的リンカーは、その脱メチル化ドメインまたはメチル化ドメインを、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼに連結し得る。ある種の実施形態において、その化学的リンカーは、ペプチドリンカーである。ある種の実施形態において、その化学的リンカーは、ポリグリシンリンカーである。ある種の実施形態において、脱メチル化ドメインまたは脱メチル化エンハンサードメインは、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）のＣ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、脱メチル化ドメインまたは脱メチル化エンハンサードメインは、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）のＮ末端に連結される。

【0128】

本明細書で提供される脱メチル化ドメインまたは脱メチル化エンハンサードメインが、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）に直接連結（融合）される場合、その脱メチル化ドメインまたは脱メチル化エンハンサードメインおよびそのヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）は、ｄＣａｓ９－脱メチル化ドメイン結合体またはｄＣａｓ９－脱メチル化エンハンサードメイン結合体を形成する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン）結合体は、配列番号５２の配列を有する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－脱メチル化ドメイン結合体は、配列番号５３の配列を有する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－メチル化（例えば、Ｄｎｍｔ３ａ）ドメイン結合体は、配列番号５９の配列を有する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－メチル化ドメイン結合体は、配列番号６０の配列を有する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－メチル化ドメイン結合体は、配列番号６１の配列を有する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－メチル化ドメイン結合体は、配列番号６２の配列を有する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－メチル化ドメイン結合体は、配列番号６３の配列を有する。ある種の実施形態において、ｄＣａｓ９－メチル化ドメイン結合体は、配列番号６４の配列を有する。

【0129】

本明細書で提供される複合体は、ＰＵＦドメインまたはヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質）に作動可能に連結されたさらなる生体活性ドメインを含み得る。従って、本発明によれば、異種ポリペプチド（「融合パートナー（ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ）」ともいわれる）は、本発明のポリヌクレオチド上のＰＢＳのうちの少なくとも１つに結合する、本明細書で提供されその実施形態を含む脱メチル化または脱メチル化エンハンサータンパク質結合体のＰＵＦドメインに融合され得る。さらに、所望される場合、同じまたは異なる融合パートナーがまた、必要に応じて、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合され得る。従って、本明細書で記載されるように、別段放棄されなければ、その融合パートナーのうちのいずれかが、本明細書で提供されその実施形態を含む脱メチル化または脱メチル化エンハンサータンパク質結合体のＰＵＦドメインに融合され、必要に応じて、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合されることが意図される。ＰＵＦドメインに融合される融合パートナーは、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）（以下）に融合される選択肢的な融合パートナーと同じであってもことなっていてもよい。ある種の実施形態において、その融合パートナーは、生体活性部分である。ある種の実施形態において、その融合パートナーは、検出可能な部分または治療部分である。

【0130】

その融合パートナーは、活性（例えば、酵素活性）を示し得る。適切な融合パートナーとしては、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されず、そのうちのいずれかは、ＤＮＡを直接改変する（例えば、ＤＮＡのメチル化）か、またはＤＮＡ会合ポリペプチド（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質）を改変することに指向され得る。さらなる融合パートナーとしては、種々の蛍光タンパク質、ポリペプチド、改変体、またはこれらの機能的ドメイン（例えば、ＧＦＰ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、Ｙｐｅｔ、ＢＦＰｍｓ１、ｒｏＧＦＰ）、およびビリルビン誘導性蛍光タンパク質（例えば、ＵｎａＧ、ｄｓＲｅｄ、ｅｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰｓ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、ＩｒｉｓＦＰなど））が挙げられ得る。

【0131】

国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、参考として全ての目的のために援用される）として公開される融合パートナーのうちのいずれかは、本発明のために企図される。

【0132】

実施形態において、その融合パートナーは、脱メチル化ドメインである。ある種の実施形態において、その融合パートナーは、脱メチル化エンハンサードメインである。

【0133】

本発明のＰＵＦドメインのうちのいずれかは、例えば、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ａｂｉｌら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８：７， ２０１４を参照のこと）（これは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｋｉｔ ＃ １０００００００５１）において入手可能である）を使用して作製され得る。

【0134】

脱メチル化および脱メチル化エンハンサードメイン
細胞において標的遺伝子座を脱メチル化するために有用な脱メチル化タンパク質結合体および脱メチル化エンハンサー結合体が、本明細書で提供される。その脱メチル化タンパク質結合体は、本明細書で記載されるＰＵＦドメイン、ＴＥＴ脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン）および脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＮＥＩＬ２ドメインまたはＧＡＤＤ４５Ａドメイン）を含む。あるいは、本明細書で提供される複合体は、第１のＰＵＦドメインおよび脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン）を含む脱メチル化タンパク質結合体、ならびに第２のＰＵＦドメインおよび脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、ＮＥＩＬ２ドメインまたはＧＡＤＤ４５Ａドメイン）を含む脱メチル化エンハンサー結合体を含む。

【0135】

ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、第２のＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、第２のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される。

【0136】

ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ（ＧＡＤＤ４５Ａ）ドメインである。ある種の実施形態において、そのＧＡＤＤ４５ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ２ドメインである。ある種の実施形態において、そのＮＥＩＬ２ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ１ドメインではない。ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、ＮＥＩＬ３ドメインではない。

【0137】

本明細書で提供される場合の「脱メチル化エンハンサードメイン（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）」、「脱メチル化エンハンサータンパク質（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「脱メチル化エンハンサー酵素（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｎｚｙｍｅ）」とは、アクチベーター（例えば、本明細書で記載される脱メチル化エンハンサードメイン）の非存在下での脱メチル化酵素または脱メチル化ドメインの活性または機能と比較して、脱メチル化酵素または脱メチル化ドメインの活性または機能に正の影響を及ぼし（増大させ）得る、タンパク質、タンパク質ドメインまたはタンパク質部分に言及する。従って、ある種の実施形態において、その脱メチル化エンハンサードメインは、少なくとも部分的に、部分的にまたは完全に、刺激を増大させ得るか、活性化を増大もしくは可能にし得るか、または脱メチル化酵素を活性化し得る。活性（活性化）における増大の量は、脱メチル化エンハンサードメインの非存在下でのコントロールとの比較において、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または１００％超であり得る。ある種の実施形態において、その活性は、脱メチル化エンハンサードメインの非存在下での活性の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、または１０倍超である。

【0138】

本明細書で提供される結合体に関して、ＤＮＡ脱メチル化ドメインは、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ １（ＴＥＴ１）ドメインを含み得る。ある種の実施形態において、そのＤＮＡ脱メチル化ドメインは、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ２（ＴＥＴ２）ドメインを含む。ある種の実施形態において、そのＤＮＡ脱メチル化ドメインは、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ３（ＴＥＴ３）ドメインを含む。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ１ドメインは、配列番号５１の配列を含む。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ１ドメインは、配列番号５１の配列である。

【0139】

ある種の実施形態において、そのＴＥＴタンパク質は、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼである。ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼは、５ｍＣを非メチル化シトシンで置き換えることをもたらす最初のかつ重要な工程を触媒する。

【0140】

ＴＥＴ１デメチラーゼ触媒ドメイン（ＣＤ）がＰＵＦドメインのＣ末端に融合された場合に、その観察されたデメチラーゼ活性が、ＴＥＴ１デメチラーゼ触媒ドメイン（ＣＤ）がＰＵＦドメインのＮ末端に融合された場合と比較して、驚くほどより高いことを発見した。従って、ある種の実施形態において、その脱メチル化タンパク質結合体（ＰＵＦドメイン融合タンパク質）は、ＰＵＦドメインのＣ末端に融合されたＴＥＴ１機能的ドメインを含む。ある種の実施形態において、そのＰＵＦドメインは、ＰＵＦａである。ある種の実施形態において、標的遺伝子の転写は、１０倍超、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１２５倍、１３５倍、１５０倍、２００倍またはこれより高く増大される。ある種の実施形態において、標的遺伝子は、ＳＯＸである。

【0141】

ある種の実施形態において、標的遺伝子は、２またはこれより多くの標的ポリヌクレオチド配列を含む。ある種の実施形態において、上記同じまたは異なるＰＵＦドメインのうちの少なくとも２つが、デメチラーゼドメインまたはデメチラーゼエンハンサードメインに融合される。

【0142】

実施形態において、脱メチル化タンパク質結合体は、配列番号５４または配列番号５５の配列を含む。ある種の実施形態において、脱メチル化タンパク質結合体は、配列番号５４または配列番号５５の配列である。

【0143】

実施形態において、脱メチル化タンパク質結合体は、配列番号１０４の配列を含む。ある種の実施形態において、脱メチル化タンパク質結合体は、配列番号１０４の配列である。ある種の実施形態において、脱メチル化タンパク質結合体は、配列番号１０５の配列を含む。ある種の実施形態において、脱メチル化タンパク質結合体は、配列番号１０５の配列である。

【0144】

実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０６の配列を含む。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０６の配列である。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０７の配列を含む。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０７の配列である。

【0145】

実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０８の配列を含む。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０８の配列である。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０９の配列を含む。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、配列番号１０９の配列である。

【0146】

さらなる複合体
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ、および改変されたＣａｓ９タンパク質、例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質を含む複合体を提供する。ある種の実施形態において、その複合体は、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質を含む。

【0147】

ある種の実施形態において、その複合体は、１もしくはこれより多くのＰＢＳに結合した１もしくはこれより多くのＰＵＦドメインまたはその融合物をさらに含み得る。ある種の実施形態において、ＰＵＦドメインの各々は、エフェクタードメインに融合される。ある種の実施形態において、ＰＵＦドメインのうちの少なくとも２つは、異なるエフェクタードメインに融合される。

【0148】

ある種の実施形態において、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）、ＰＵＦドメイン、および／またはエフェクタードメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。

【0149】

ある種の実施形態において、その複合体は、ポリヌクレオチドのＤＮＡ標的化配列を通じて標的ポリヌクレオチド配列に結合される。

【0150】

ある種の実施形態において、エフェクタードメインは、ＴＥＴ（Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）タンパク質、またはデメチラーゼ触媒活性を保持するそのフラグメントである。例えば、そのＴＥＴタンパク質は、ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼであり得る。

【0151】

ある種の実施形態において、ＰＵＦドメイン融合タンパク質は、ＰＵＦドメイン（例えば、ＰＵＦａ）のＣ末端に融合されたＴＥＴ１機能的ドメインを含む。

【0152】

ある種の実施形態において、ＰＵＦドメイン融合タンパク質は、ＰＵＦドメイン（例えば、ＰＵＦａ）のＮ末端に融合されたＤｎｍｔ機能的ドメインを含む。

【0153】

細胞
別の局面において、本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化複合体を含む細胞が、提供される。ある種の実施形態において、その細胞は、哺乳動物細胞である。ある種の実施形態において、その細胞は、がん細胞である。ある種の実施形態において、その細胞は、がん細胞であり、そして／またはその標的遺伝子は、過剰メチル化されたプロモーター領域を有するｈＭＬＨ１である。例えば、その標的ポリヌクレオチド配列は、ｈＭＬＨ１の過剰メチル化されたプロモーター領域内にあってもよく、その標的ポリヌクレオチド配列のメチル化は、がん細胞におけるｈＭＬＨ１のダウンレギュレーションと関連する。

【0154】

ある種の実施形態において、そのがん細胞は、胃がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および結腸直腸がん（例えば、ＨＮＰＣＣ）に由来する。胃がんは、腸窩タイプ腫瘍（ｆｏｖｅｏｌａｒ ｔｙｐｅ ｔｕｍｏｒ）、および高発病率のカシミール渓谷における胃がんを含み得る。

【0155】

本発明の別の局面は、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、および複合体のうちのいずれかを含む宿主細胞を提供する。

【0156】

ある種の実施形態において、その宿主細胞は、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする第２のベクターをさらに含む。ある種の実施形態において、その第２のベクターは、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合された脱メチル化（エフェクター）ドメインをさらにコードする。そのＣａｓ９タンパク質（例えば、ｗｔ、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。

【0157】

ある種の実施形態において、その宿主細胞は、１またはこれより多くのＰＵＦドメイン（各々は、脱メチル化（エフェクター）ドメインに縮合される）をコードする第３のベクターをさらに含み得る。その１またはこれより多くのＰＵＦドメインの発現は、独立して、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。

【0158】

ある種の実施形態において、その第２のベクターは、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）またはメチル化もしくは脱メチル化（エフェクター）ドメインに融合された核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらにコードし得、そして／あるいはその第３のベクターは、ＰＵＦドメインまたはメチル化もしくは脱メチル化（エフェクター）ドメインに融合された核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらにコードし得る。

【0159】

ある種の実施形態において、異なるベクターによってコードされ得る配列は、同じベクター上にあってもよい。例えば、ある種の実施形態において、その第２のベクターは、そのベクターと同じであってもよく、そして／またはその第３のベクターは、そのベクターもしくはその第２のベクターと同じであってもよい。

【0160】

その宿主細胞は、生きている動物の中にあってもよいし、培養細胞であってもよい。

【0161】

方法
本明細書で提供される方法および複合体は、とりわけ、脱メチル化活性の多面的な送達プラットフォームを提供する。本明細書で提供される方法および複合体を使用して、脱メチル化ドメインおよび脱メチル化エンハンサードメイン（例えば、脱メチル化酵素および脱メチル化エンハンサーまたはこれらの機能的フラグメント）を含む脱メチル化タンパク質結合体、または脱メチル化タンパク質結合体および脱メチル化エンハンサー結合体の組み合わせは、逐次的にまたは同時に細胞に送達され得る。本明細書で提供される脱メチル化タンパク質結合体、または脱メチル化タンパク質結合体および脱メチル化エンハンサー結合体の組み合わせの細胞への送達は、標的化された遺伝子座のメチル化状態を微細に調整することを可能にする。本発明はさらに、複数の脱メチル化タンパク質結合体の送達を提供し、ここでその結合体は、同じであっても異なっていてもよい。複数の脱メチル化タンパク質結合体が細胞に送達される場合、その結合体は、複数の結合体（各々は、ＰＵＦドメインに連結される）の一部を形成し得、そして／またはそれらは、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、ｄＣａｓ９）に直接融合され得る。さらに、およびガイドＲＮＡの標的遺伝子特異性によって、本発明は、細胞における異なる標的部位へと増強された脱メチル化活性を同時に送達することを可能にする。脱メチル化ドメイン（例えば、ＴＥＴ１ドメイン）と、常に特異的なエンハンサータンパク質（例えば、ＧＡＤＤ４５ＡまたはＮＥＩＬ２）とを対形成することに起因して、本明細書で提供される複合体を使用する脱メチル化が、例えば、エンハンサードメインの非存在下での脱メチル化と比較して、または脱メチル化活性をヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、ｄＣａｓ９）に直接連結することと比較して、より効率的であることを示したのは、出願人らが初めてであった。

【0162】

本明細書で提供されその実施形態を含む脱メチル化のための方法に関して、上記で記載される複合体のエレメントのうちのいずれかが、使用され得る。従って、ある種の実施形態において、その方法は、本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含むヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、ｄＣａｓ９）をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程を包含する。従って、その方法は、第２のポリヌクレオチド（これは、本明細書で記載されその実施形態を含むポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ標的化配列、結合配列および本明細書で提供される１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列をコードする）を送達する工程を包含し得る。

【0163】

別の局面において、哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法が提供される。上記方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）上記哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；および
（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）Ｃ末端を有するＰＵＦドメイン；
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有する脱メチル化エンハンサードメインであって、ここで上記脱メチル化エンハンサードメインのＮ末端は、ＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される脱メチル化エンハンサードメイン；ならびに
（ｉｉｉ）上記脱メチル化エンハンサードメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって、上記送達された脱メチル化タンパク質結合体は、上記細胞において上記標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する。

【0164】

一局面において、脱メチル化複合体が提供される。上記脱メチル化複合体は、
（ａ）以下：
（ｉ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素；および
（ｉｉ）以下を含むポリヌクレオチド：
（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（２）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（３）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列；および
（４）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含むリポ核タンパク質であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記ポリヌクレオチドに結合されるリボ核タンパク質複合体；
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｃ末端を有する第１のＰＵＦドメイン、および
（ｉｉ）上記第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＴＥＴ脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体であって、ここで上記脱メチル化タンパク質結合体は、上記第１のＰＢＳ配列に結合する上記第１のＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合する脱メチル化タンパク質結合体；ならびに
（ｃ）以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）上記第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体であって、ここで上記脱メチル化エンハンサー結合体は、上記第２のＰＢＳ配列に結合する上記第２のＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する脱メチル化エンハンサー結合体、
を含む。

【0165】

別の局面において、哺乳動物細胞において標的核酸配列を脱メチル化するための方法が提供される。上記方法は、
（ａ）脱メチル化を要する標的核酸を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
（ｂ）上記哺乳動物細胞に、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを送達する工程；
（ｃ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素に対する結合配列；
（ｉｉｉ）第１のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、および
（ｉｖ）第２のＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列、
を含む第２のポリヌクレオチドを送達する工程であって、ここで上記ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、上記結合配列を介して上記第２のポリヌクレオチドに結合される工程；
（ｄ）上記哺乳動物細胞に、以下：
（ｉ）第１のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）脱メチル化ドメインであって、上記脱メチル化ドメインは、上記第１のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結された脱メチル化ドメイン、
を含む脱メチル化タンパク質結合体をコードする第３のポリヌクレオチドを送達する工程；ならびに
（ｅ）上記哺乳動物細胞に以下：
（ｉ）第２のＰＵＦドメイン；および
（ｉｉ）上記第２のＰＵＦドメインに作動可能に連結された脱メチル化エンハンサードメイン、
を含む脱メチル化エンハンサー結合体をコードする第４のポリヌクレオチドを送達する工程であって、それによって上記送達された脱メチル化タンパク質結合体は、上記細胞において上記標的核酸配列を脱メチル化する工程、
を包含する。

【0166】

ある種の実施形態において、上記脱メチル化タンパク質結合体は、１またはこれより多くのＰＢＳ配列に結合するＰＵＦドメインを介して上記リボ核タンパク質複合体に結合して、脱メチル化複合体を形成する。ある種の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第１のベクター内に含まれる。ある種の実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、第２のベクター内に含まれる。ある種の実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、第３のベクター内に含まれる。ある種の実施形態において、その第１、第２または第３のベクターは、同じである。ある種の実施形態において、送達する工程は、トランスフェクションによって行われる。

【0167】

ある種の実施形態において、脱メチル化タンパク質結合体は、第１のＰＢＳ配列に結合する第１のＰＵＦドメインを介してリボ核タンパク質複合体に結合する。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサー結合体は、第２のＰＢＳ配列に結合する第２のＰＵＦドメインを介してリボ核タンパク質複合体に結合する。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、第２のＰＵＦドメインのＮ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、脱メチル化エンハンサードメインは、第２のＰＵＦドメインのＣ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第１のベクター内に含まれる。ある種の実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、第２のベクター内に含まれる。ある種の実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、第３のベクター内に含まれる。ある種の実施形態において、第４のポリヌクレオチドは、第４のベクター内に含まれる。ある種の実施形態において、その第１の、第２の、第３のまたは第４のベクターはいずれも、同じである。ある種の実施形態において、その送達する工程は、トランスフェクションによって行われる。

【0168】

ある種の実施形態において、本発明の方法は、複数のベクターまたはベクターのライブラリー（各々は、本発明のポリヌクレオチドをコードする）を利用し、ここでそのベクターのうちの２つは、そのコードされるポリヌクレオチドにおいて、それらそれぞれのＤＮＡ標的化配列、Ｃａｓ９結合配列、および／またはコピー数、同一性（配列、結合特異性など）またはＰＢＳの相対的な順序が異なる。関連する実施形態において、ベクターを使用する代わりに、非ベクターコード配列が使用される。

【0169】

ある種の実施形態において、その方法は、複数の本発明のベクターを細胞に導入する工程をさらに包含し、ここでそのベクターのうちの２つは、そのコードされたポリヌクレオチドにおいて、それらそれぞれのＤＮＡ標的化配列、Ｃａｓ９結合配列、および／またはコピー数、同一性、もしくはＰＢＳの相対的順序が異なる。関連する実施形態において、ベクターを使用する代わりに、非ベクターコード配列が使用される。

【0170】

処置方法
細胞において標的核酸を増強して脱メチル化するための方法は、とりわけ、異常なＤＮＡメチル化に関連するかまたはこれによって引き起こされる疾患（例えば、がん）の処置のために使用され得る。がんにおけるシチジンデアミナーゼのエピジェネティック（ＤＮＡメチル化）および遺伝的（変異）作用の両方の役割、および広く行きわたった脱メチル化における考えられる役割が提唱されている。本発明は、がん細胞内の脱メチル化または脱メチル化状態の質を変化させることによって、がん疾患プロセスを改善／処置するにあたって実用的な適用を有する。本明細書で適用される方法および組成物を使用して、メチル化した遺伝子は、それらの発現をもたらし得る、インビボで脱メチル化の標的となり得る（メチル化は、大抵の場合、抑制的な改変である）。

【0171】

全てのがんではないにしても、大部分は、エピジェネティック変化（顕著なことには、腫瘍抑制遺伝子のメチル化およびサイレンシングを含む）を受ける。腫瘍抑制遺伝子の脱メチル化は、がん表現型を改善し得る。よって、脱メチル化をインビボで腫瘍抑制遺伝子に標的化するための方法は、がん治療に対する非常に有望な手段である。

【0172】

シチジンデアミナーゼ活性をがんにおける目的の遺伝子に標的化することとしては、例えば、シチジンデアミナーゼを腫瘍抑制因子ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｐ５３タンパク質のジンクフィンガーＤＮＡコア結合領域）の融合が挙げられ得る。多くのがんでは、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインの変異が、形質転換に寄与し得ると考えられる。さらに、多くの腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３標的を含む）のプロモーター領域は、がん細胞においてメチル化されている。

【0173】

本発明の分子および薬学的組成物は、それらの抗がん／抗腫瘍形成効果に関してインビトロおよびエキソビボアッセイを利用することによって評価され得る。１つの適切なアッセイでは、本発明の分子を発現する核酸ベクターは、がん細胞へとトランスフェクトされる。ベクター骨格のみ、またはベクターとシチジンデアミナーゼドメインが非機能的にされた（以下でより詳細に記載される）本発明の分子でトランスフェクトされたがん細胞株を含む適切なコントロールが確立される。本発明の分子でトランスフェクトされたがん細胞株にはあるが、コントロール細胞にはない誘導されたアポトーシスは、本発明の分子の抗がん効果を示す。

【0174】

別の局面において、必要性のある被験体においてがんを処置するための方法が提供される。その方法は、治療上有効な量の、本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化複合体またはメチル化複合体を被験体に投与し、それによって、その被験体においてがんを処置する工程を包含する。好ましい実施形態において、その方法は、治療上有効な量の、本明細書で提供されるとおりの脱メチル化複合体を被験体に投与する工程を包含する。

【0175】

別の局面において、薬学的組成物が提供される。その薬学的組成物は、治療上有効な量の、本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化複合体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。

【0176】

本明細書で提供される方法および組成物のさらなる適用は、発生中の遺伝子発現を調節することを包含する。例えば、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインの存在は、発生におけるまたは細胞周期の間の特定の時期に活性化される遺伝子の特定の部分セットの標的化された脱メチル化を可能にする。例えば、ＰＵＦドメインに融合される場合の（例えば、Ｏｃｔ４またはＳＯＸ－２）タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、多能性または幹細胞様表現型の促進に関連する細胞運命決定に関与する遺伝子に指向される脱メチル化活性を提供し得る。あるいは、脱メチル化ドメインは、ＰＵＦ結合ドメインへのリンカーを介して連結され得る。必要に応じて利用され得るＤＮＡ結合ドメインとしては、Ｔボックス転写因子またはステロイドホルモンレセプターＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＲＡＲおよびＲＸＲ ＤＮＡ結合ドメイン）に由来するものが挙げられる。にもかかわらず、本発明の脱メチル化タンパク質結合体は、多能性遺伝子のプロモーターを脱メチル化し、分化の間に細胞のメチル化状態の質を変化させるために十分であり得る。

【0177】

さらなる方法
本発明の別の局面は、本発明の任意の方法に従って、がん細胞における標的遺伝子の転写および／またはメチル化状態を調節するための方法を提供し、ここでそのがん細胞は、異常なＤＮＡメチル化と関連するかまたはこれによって特徴づけられる。

【0178】

本発明の関連する局面は、本発明の任意の方法に従って、患者においてがん細胞中の標的遺伝子の転写および／またはメチル化状態を調節するための方法を提供し、ここでそのがん細胞は、異常なＤＮＡメチル化と関連するかまたはこれによって特徴づけられる。

【0179】

本発明の別の関連する局面は、標的遺伝子の異常なＤＮＡメチル化（例えば、ＣｐＧメチル化）と関連する疾患または状態の処置の必要性のある患者を処置するための方法を提供し、上記方法は、その患者において標的遺伝子の転写および／またはメチル化状態を調節するために、その標的遺伝子付近またはその標的遺伝子において本発明の複合体の形成を可能にする工程を包含する。

【0180】

本発明の別の関連する局面は、標的遺伝子の異常なＤＮＡメチル化（例えば、ＣｐＧメチル化）と関連する疾患または状態の処置の必要性のある患者を処置するための方法を提供し、上記方法は、本発明の方法のうちのいずれかに従って、その患者において標的遺伝子の転写および／またはメチル化状態を調節する工程を包含する。

【0181】

本発明の別の関連する局面は、標的遺伝子の異常なＤＮＡメチル化（例えば、ＣｐＧメチル化）と関連する疾患または状態の処置の必要性のある患者を処置するための方法を提供し、上記方法は、その患者において標的遺伝子の転写および／またはメチル化状態を調節するために、その標的遺伝子付近またはその標的遺伝子において本発明の複合体の形成を可能にする工程を包含する。

【0182】

関連する局面において、本発明は、処置の必要性のある患者においてがんを処置するための方法を提供し、ここで上記がんは、ｈＭＬＨ１の異常なＤＮＡメチル化と関連するかまたはこれによって特徴づけられ、上記方法は、本発明の方法のうちのいずれか１つに従って、その患者においてｈＭＬＨ１の転写および／またはメチル化状態を調節する工程を包含する。例えば、ある種の実施形態において、ＰＵＦドメイン融合タンパク質は、ＰＵＦドメイン（例えば、ＰＵＦａ）のＣ末端に融合されたＴＥＴ１機能的ドメインを含み得る。ある種の実施形態において、ｈＭＬＨ１の過剰メチル化されたプロモーター領域のメチル化レベルは、低下される。ある種の実施形態において、ｈＭＬＨ１の転写／翻訳は、増大される。

【0183】

ある種の実施形態において、その標的遺伝子は、ｈＭＬＨ１である。

【0184】

ある種の実施形態において、その疾患は、がんである。ある種の実施形態において、その疾患は、インプリンティング障害である。ある種の実施形態において、その疾患は、神経学的疾患である。

【0185】

ある種の実施形態において、そのがんは、腫瘍抑制遺伝子または発癌遺伝子の、それぞれ過剰メチル化または低メチル化と関連するかまたはこれによって特徴づけられる。

【0186】

ある種の実施形態において、そのがんは、胃がん（腸窩タイプ腫瘍および高発病率のカシミール渓谷における胃がんが挙げられる）、食道がん、頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および結腸直腸癌（例えば、ＨＮＰＣＣ）である。

【0187】

本発明のなお別の局面は、本発明の複合体を標的ポリヌクレオチド配列においてアセンブリするための方法を提供し、上記方法は、標的ポリヌクレオチド配列に以下を接触させるかまたは近位にもたらす工程：（１）本発明のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ、または本発明のベクターのうちのいずれか１つ、または複数のベクター；（２）ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）、またはヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする本発明の第２のベクターのうちのいずれか；ならびに（３）ＰＵＦドメインのうちの１もしくはこれより多く（各々は、エフェクタードメインに融合される）、またはＰＵＦドメイン融合物をコードする第３のベクターのうちのいずれか１つ。ある種の実施形態において、その融合物は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはデメチラーゼとのものである。

【0188】

ある種の実施形態において、その複合体は、細胞の内部でアセンブリされ、その標的ポリヌクレオチド配列は、その細胞のゲノムＤＮＡの一部であり、ここで本発明のベクター、ベクター、第２のベクター、および第３のベクターは、その細胞に導入される。

【0189】

本発明の関連する局面は、細胞において複数の標的遺伝子の転写を調節するための方法を提供し、上記方法は、上記細胞に、本発明の複数のベクター、ｄＣａｓ９タンパク質のコード配列、および１またはこれより多くのＰＵＦドメイン融合物のコード配列を導入する工程を包含し、ここでその標的遺伝子の各々は、（１）標的ポリヌクレオチド配列において、複数のベクター、ｄＣａｓ９タンパク質、およびＰＵＦドメイン融合物のうちの１つによってコードされるポリヌクレオチドの３構成要素複合体のアセンブリを；ならびに（２）標的ポリヌクレオチド配列を含む標的遺伝子の転写調節を可能にする標的ポリヌクレオチド配列を含む。

【0190】

関連する局面において、本発明はまた、細胞中の複数の標的遺伝子におけるエピジェネティック調節（例えば、転写活性に直接的に関連しないクロマチンのエピジェネティック状態の調節）のための方法を提供し、上記方法は、本発明の複数のベクター、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質のコード配列、および１またはこれより多くのＰＵＦドメイン融合物のコード配列を上記細胞に導入する工程を包含し、ここでその標的遺伝子の各々は、（１）標的ポリヌクレオチド配列において、複数のベクターのうちの１つによってコードされるポリヌクレオチド、ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９ ニッカーゼ、およびＰＵＦドメイン融合物の３構成要素複合体のアセンブリを；ならびに（２）標的ポリヌクレオチド配列を含む標的遺伝子のエピジェネティック調節を可能にする、標的ポリヌクレオチド配列を含む。上記方法は、例えば、エピジェネティック状態（例えば、クロマチンを開く）を同時に変化させて、閉じたクロマチン部位に（例えば、それらの部位での切断およびゲノム編集を増大させるために）結合するヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）のアクセス／安定性を獲得するために、有用であり得る。

【0191】

ある種の実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子の転写は、増強／刺激される一方で、少なくとももう１つの標的遺伝子の転写は阻害される。

【0192】

本発明の一局面において、細胞において標的ポリヌクレオチド配列を有する標的遺伝子の転写および／またはメチル化状態を調節するための方法が提供され、上記方法は、
（ａ）上記細胞に、ＰＵＦドメイン融合タンパク質のコード配列を導入する工程であって、ここで上記ＰＵＦドメイン融合タンパク質は、ＰＵＦドメイン、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性ドメインまたはＤＮＡデメチラーゼ活性ドメインを含む工程；
（ｂ）上記細胞に、ｄＣａｓ９タンパク質のコード配列を導入する工程；および
（ｃ）上記細胞に、ポリヌクレオチドまたは上記ポリヌクレオチドのコード配列を導入する工程であって、ここで上記ポリヌクレオチドは、
（ｉ）上記標的ポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡ標的化配列；
（ｉｉ）１またはこれより多くのコピーのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列であって、ここで上記１またはこれより多くのコピーのＰＢＳの各々は、同じまたは異なるＰＵＦドメイン融合タンパク質に結合する１またはこれより多くのコピーのＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）配列；ならびに
（ｉｉｉ）上記ｄＣａｓ９タンパク質に結合し得るＣａｓ９結合配列、
を含む工程を包含し、ここで上記ＰＵＦドメイン融合タンパク質、上記ｄＣａｓ９タンパク質、および上記ポリヌクレオチドは、上記細胞の標的遺伝子内の標的ポリヌクレオチド配列において複合体を形成し、それによって上記標的遺伝子の転写および／またはメチル化状態を調節する。

【0193】

ＰＵＦドメイン融合タンパク質のコード配列、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９タンパク質）のコード配列、および上記ポリヌクレオチド（または上記ポリヌクレオチドをコードするベクター）が、一緒に（例えば、同じベクター上に全てのコード配列を含めることによって、異なるコード配列をコードする異なるベクターを共トランスフェクトすることによって、など）、または別個に、所望の場合に任意の順序または順番で細胞に導入され得ることは、注記されるべきである。ある種の好ましい実施形態において、ＰＵＦドメイン融合タンパク質のコード配列、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９タンパク質）のコード配列、および上記ポリヌクレオチド（または上記ポリヌクレオチドをコードするベクター）は、上記細胞に共導入される。

【0194】

さらに、本発明の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）工程が別個に行われるべきである場合、それらが必ず任意の特定の順序で行われなければならないことは、意図しない。

【0195】

標的ポリヌクレオチド配列は、任意のＤＮＡ配列であり得る。ある種の実施形態において、その標的ポリヌクレオチド配列は、１またはこれより多くの転写調節エレメントを含むか、またはこれらに隣接する。ある種の実施形態において、その転写調節エレメントは、以下のうちの１またはこれより多くを含む：コアプロモーター、近位プロモーターエレメント、エンハンサー、サイレンサー、絶縁因子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、および遺伝子座制御領域。

【0196】

キット
別の局面において、キットが提供される。上記キットは、
（ｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含むリボ核タンパク質複合体またはこれをコードする核酸；および
（ｉｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化タンパク質結合体またはこれをコードする核酸、
を含む。

【0197】

別の局面において、キットが提供される、上記キットは、
（ｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含むリボ核タンパク質複合体またはこれをコードする核酸；
（ｉｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化タンパク質結合体またはこれをコードする核酸；および
（ｉｉｉ）本明細書で提供されるとおりのその実施形態を含む脱メチル化エンハンサー結合体またはこれをコードする核酸、
を含む。

【0198】

実施形態において、本発明のキットは、以下を含み得る：ａ）本発明のポリヌクレオチドまたはこれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、ベクター）；必要に応じて、ｂ）本発明のヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）またはこれをコードする（これをコードする発現可能なｍＲＮＡを含む）ベクター；および必要に応じて、ｃ）１またはこれより多くの本発明の脱メチル化またはメチル化タンパク質結合体（ＰＵＦドメイン融合物）（各々は、異なる脱メチル化またはメチル化タンパク質結合体（ＰＵＦドメイン融合物）の中で同じであっても異なってもよい脱メチル化またはメチル化ドメイン（エフェクタードメイン）に融合されたＰＵＦドメインを含む）、あるいはこれをコードする（これをコードする発現可能なｍＲＮＡを含む）ベクター。

【0199】

ある種の実施形態において、ａ）～ｃ）のうちの１またはこれより多くが、同じベクターによってコードされ得る。

【0200】

ある種の実施形態において、上記キットはまた、ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つを宿主細胞に導入することを容易にする１またはこれより多くの緩衝液または試薬（例えば、形質転換、トランスフェクション、または感染のための試薬）を含む。

【0201】

例えば、本発明のキットはさらに、１種またはこれより多くのさらなる試薬を含み得、ここでこのようなさらなる試薬は、緩衝液；洗浄緩衝液；コントロール試薬；コントロール発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド；ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質もしくはｄＣａｓ９またはＰＵＦドメイン融合物のＤＮＡからのインビトロ生成のための試薬；などから選択され得る。

【0202】

本発明のキットの構成要素は、別個に容器の中に存在し得るか；または単一の容器の中に含まれ得る。

【0203】

上述の構成要素に加えて、本発明のキットは、上記キットの構成要素を使用して、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含み得る。本発明の方法を実施するための説明書は一般に、適切な記録媒体上に記録される。例えば、その説明書は、基材（例えば、紙またはプラスチックなど）上に印刷され得る。よって、その説明書は、パッケージ挿入物として上記キットの中に、上記キットまたはその構成要素の容器の表示の中に（すなわち、パッケージまたはサブパッケージと関連付けられる）存在し得るなど。他の実施形態において、その説明書は、適切なコンピューター読み取り可能な記憶媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなど）上に存在する電子的な記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書は、キットの中には存在しないが、遠隔の情報源からその説明書を（例えば、インターネットを介して）得るための手段が提供される。この実施形態の例は、その説明書が閲覧され得るおよび／またはその説明書がダウンロードされ得るウェブアドレスを含むキットである。その説明書と同様に、その説明書を得るためのこれの手段は、適切な基材上に記録される。

【0204】

上記で一般的に記載される本発明とともに、本発明の種々の特徴は、以下でさらに詳しく述べられる。本発明の特徴が、別個の実施形態、またはさらには本発明の異なる局面の下での別個の実施形態の状況で記載される場合にすら、１つの実施形態の組みあわせにおいて提供され得ることは、理解されるべきである。逆に、１つの実施形態の状況で記載される本発明の種々の特徴はまた、別個に、または任意の適切な部分組みあわせにおいて提供され得る。本発明に関する実施形態の全ての組みあわせは、本発明によって具体的に包含され、各組みあわせおよびあらゆる組みあわせが個々にかつ明示的に開示されるかのように、本明細書で開示される。さらに、種々の実施形態およびその構成要素の全ての部分組みあわせはまた、本発明によって具体的に包含され、各々のおよびあらゆるこのような組みあわせが個々にかつ明示的に本明細書で開示されるかのように、本明細書で開示される。

【0205】

定義
別段定義されなければ、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ 第２版， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９９４）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ １９８９）を参照のこと。本明細書で記載されるものに類似または等価な任意の方法、デバイスおよび材料は、本発明の実施において使用され得る。以下の定義は、本明細書で頻繁に使用されるある種の用語の理解を促進するために提供され、本開示の範囲を限定することは意味されない。

【0206】

「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」とは、１本鎖、２本鎖、もしくは多数鎖の形態、またはこれらの相補体のいずれかにあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびこれらのポリマーをいう。用語「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、ヌクレオチドの直鎖状の配列をいう。用語「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、代表的には、ポリヌクレオチドの単一のユニット、すなわち、モノマーをいう。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの改変バージョンであり得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例としては、１本鎖および２本鎖のＤＮＡ、１本鎖および２本鎖のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、ならびに１本鎖および２本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。核酸は、直鎖状または分枝状であり得る。例えば、核酸は、ヌクレオチドの直鎖であり得るか、または核酸は、例えば、その核酸がヌクレオチドの１またはこれより多くのアームまたは分枝を含むように、分枝状であり得る。必要に応じて、その分枝状の核酸は、デンドリマーなどのようなより高次構造を形成するように反復した分枝状である。

【0207】

核酸（ホスホチオエート骨格を有する核酸を含む）は、１またはこれより多くの反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、用語、反応性部分（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）は、別の分子（例えば、核酸またはポリペプチド）と、共有結合的、非共有結合的または他の相互作用を通じて反応し得る任意の基を含む。例示によれば、核酸は、タンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸と、共有結合的、非共有結合的または他の相互作用を通じて反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。

【0208】

その用語はまた、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連結を含む核酸を包含し、これらは、合成であり、天然に存在し、そして天然に存在せず、参照核酸と類似の結合特性を有し、そしてその参照ヌクレオチドに類似の様式で代謝される。このようなアナログの例としては、ホスホジエステル誘導体（例えば、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（ホスホチオエートとしても公知）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、またはＯ－メチルホスホロアミダイト連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）が挙げられる）；ならびにペプチド核酸骨格および連結が挙げられるが、これらに限定されない。他のアナログ核酸は、正の骨格；非イオン性骨格、改変された糖、および非リボース骨格（例えば、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴまたはロックされた核酸（ＬＮＡ））を有するものを含み、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓａｎｇｈｕｉ ＆ Ｃｏｏｋ編に記載されるものが挙げられる。１またはこれより多くの炭素環式糖を含む核酸はまた、核酸の１つの定義の中に含まれる。リボース－ホスフェート骨格の改変は、種々の理由から、例えば、生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増大させるために、またはバイオチップ上のプローブとして、行われ得る。天然に存在する核酸およびアナログの混合物が、作製され得る；あるいは、異なる核酸アナログの混合物、ならびに天然に存在する核酸およびアナログの混合物が作製され得る。ある種の実施形態において、ＤＮＡにおけるヌクレオチド間連結は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、または両方の組みあわせである。

【0209】

本明細書で使用される場合、提供される値の範囲は、特定された値を含む。当業者によって認識されるように、このような特定された値は合理的に、当該分野で一般に許容可能な測定を使用して、標準偏差を含む。ある種の実施形態において、その標準偏差は、その特定された値の±１０％に及ぶ範囲を含む。

【0210】

用語「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、アミノ酸残基のポリマーに言及するために本明細書で交換可能に使用され、ここでそのポリマーは、アミノ酸からならない部分に結合体化されてもよい。その用語は、１またはこれより多くのアミノ酸残基が、相当する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。その用語は、大環状ペプチド、非ペプチド官能基で改変されたペプチド、ペプチド模倣物、ポリアミド、およびマクロラクタムに当てはまる。「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、単一の部分として組換え発現される２またはこれより多くの別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質に言及する。

【0211】

用語「ペプチジル（ｐｅｐｔｉｄｙｌ）」および「ペプチジル部分（ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、一価のペプチドを意味する。

【0212】

用語「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」とは、天然に存在するおよび合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似の様式で機能する、アミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物に言及する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後に改変されるそれらアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合されるα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに言及する。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似の様式で機能する化合物に言及する。用語「天然に存在しないアミノ酸（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」および「非天然アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」とは、アミノ酸アナログ、合成アミノ酸、および天然には見出されないアミノ酸模倣物に言及する。

【0213】

アミノ酸は、それらの一般に公知の三文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字記号のいずれかによって、本明細書で言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に許容された一文字コードによって言及され得る。

【0214】

アミノ酸またはヌクレオチド塩基の「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、Ｎ末端（または５’末端）に対するその位置に基づいて、参照配列における各アミノ酸（またはヌクレオチド塩基）を逐次的に同定する数字によって示される。最適なアラインメントを決定する場合に考慮に入れられなければならない欠失、挿入、短縮、融合などに起因して、一般に、Ｎ末端から単純に数えることによって決定される試験配列中のアミノ酸残基数は、参照配列におけるその相当する位置の数字と必ずしも同じではない。例えば、改変体が、整列された参照配列に比較して欠失を有する場合、その改変体には、欠失の部位において、その参照配列における位置に相当するアミノ酸が存在しない。整列された参照配列において挿入が存在する場合、その挿入は、参照配列において番号付けされたアミノ酸位置に一致しない。短縮または融合の場合には、参照配列または整列された配列のいずれかの中に、その相当する配列の中のいかなるアミノ酸にも相当しないアミノ酸のストレッチが存在し得る。

【0215】

用語「に言及して番号付けされる（ｎｕｍｂｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ）」または「に相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の番号付けの状況で使用される場合に、その所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が特定された参照配列と比較される場合のその参照配列の残基の番号付けに言及する。

【0216】

「保存的に改変された改変体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関しては、保存的に改変された改変体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれら核酸に、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列に言及する。遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置において、そのコドンは、そのコードされるポリペプチドの質を変化させずに、記載される相当するコドンのうちのいずれかへと質が変化され得る。このような核酸バリエーションは、「サイレントバリエーション（ｓｉｌｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、これは、保存的に改変されたバリエーションのうちの１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列はまた、その核酸のあらゆる考えられるサイレントバリエーションを記載する。当業者は、核酸における各コドン（通常は、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常は、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を得るために改変され得ることを認識する。よって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、発現生成物に関して各記載される配列に必然的に含まれるが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。

【0217】

アミノ酸配列に関して、コードされた配列の中で単一のアミノ酸または小さなパーセンテージのアミノ酸の質を変化させる、これらアミノ酸を付加するまたは欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、その質の変化が、あるアミノ酸をある化学的に類似のアミノで置換することを生じる場合の「保存的に改変された改変体」であることを、当業者は認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。このような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、およびアレルに加えて存在し、そしてこれらを排除しない。

【0218】

以下の８つの群は各々、互いに関して保存的置換であるアミノ酸を含む： １）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）； ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）； ７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

【0219】

「配列同一性のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここでその比較ウインドウの中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、その２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。そのパーセンテージは、配列同一性のパーセンテージを得るために、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を生成し、そのマッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、そしてその結果に１００をかけ算することによって計算される。

【0220】

用語「同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」またはパーセント「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、２またはこれより多くの核酸またはポリペプチド配列の状況において、比較ウインドウ、または以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、もしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定される場合の指定された領域にわたって、最大の一致のために比較および整列される場合、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定された領域、例えば、本発明のポリペプチド配列全体または本発明のポリペプチド個々のドメインの特定された領域にわたって６０％ 同一性、必要に応じて、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性）を有する、２またはこれより多くの配列または部分配列に言及する。次いで、このような配列は、「実質的に同一（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」であるといわれる。この定義はまた、試験配列の相補体に言及する。必要に応じて、その同一性は、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００～５００または１０００もしくはより多くのヌクレオチドである領域にわたって、存在する。

【0221】

配列比較のために、代表的には１つの配列が参照配列として機能し、その参照配列に対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターに登録され、部分配列座標が指定され（必要であれば）、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または代替のパラメーターが指定され得る。次いで、その配列比較アルゴリズムは、そのプログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0222】

「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」とは、本明細書で使用される場合、例えば、全長配列または２０～６００個、５０～２００個、もしくは１００～１５０個のアミノ酸またはヌクレオチドからなる群より選択される連続する位置の数のうちのいずれか１つのセグメントへの言及を含み、その中で配列は、その２つの配列が最適に整列された後に、同数の連続する位置の参照配列に対して比較され得る。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらアルゴリズムのコンピューター化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照のこと）によって、行われ得る。

【0223】

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における長さＷの短いワード（これは、データベース配列の中の同じ長さのワードと整列された場合に、マッチするかまたはある正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかである）を同定することによって高スコアの配列対（ＨＳＰ）を先ず同定することを包含する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， 前出）として言及される。これらの最初の隣接ワードヒットは、検索を開始して、それらを含むより長いＨＳＰを見出すためのシードとして機能する。そのワードヒットは、その累積アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿って両方の方向で拡げられる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（マッチする残基の対に関する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを計算するためにスコア化マトリクスが使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される：その累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減少する；その累積スコアが、１もしくはこれより多くの負のスコア化残基アラインメントの蓄積に起因して、ゼロもしくはゼロ未満になる；またはいずれかの配列の末端に達する。そのＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。

【0224】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こる確率の示度を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小和確率が０．２未満、より好ましくは０．０１未満、および最も好ましくは０．００１未満である場合に、参照配列に類似であると見做される。

【0225】

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である示度は、以下で記載されるように、その第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、その第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して惹起される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、代表的には、例えば、その２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の示度は、以下で記載されるように、その２つの分子またはそれらの相補体が互いにストリンジェントな条件したでハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の示度は、同じプライマーがその配列を増幅するために使用され得ることである。

【0226】

「標識（ｌａｂｅｌ）」または「検出可能な部分（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、^３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用されるとおり）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよびタンパク質または例えば、放射性標識を、標的ペプチドと特異的に反応性のペプチドもしくは抗体に組み込むことによって検出可能にし得る他の実態が挙げられる。標識への抗体の結合体化に関して当該分野で公知の任意の適切な方法は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに記載される方法を使用して、使用され得る。

【0227】

本明細書で提供される場合の「生体活性部分（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）は、細胞、組織または生物への投与に際して、上記細胞、組織または生物の生物学的機能に対して検出可能な効果を有する部分に言及する。ある種の実施形態において、その検出可能な効果は、生物学的効果である。ある種の実施形態において、その検出可能な効果は、治療的効果である。ある種の実施形態において、その検出可能な効果は、診断的な効果である。

【0228】

「標識されたタンパク質またはポリペプチド（ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、共有結合的に、リンカーもしくは化学結合を通じて、または非共有結合的に、イオン結合、ファン・デル・ワールス結合、静電的結合、もしくは水素結合を通じて、のいずれかで、標識されたタンパク質またはポリペプチドの存在が、その標識されたタンパク質またはポリペプチドに結合した標識の存在を検出することによって検出され得るように、標識に結合されるものである。あるいは、高親和性相互作用を使用する方法は、結合パートナーの対のうちの一方が、他方（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）に結合する場合に同じ結果を達成し得る。

【0229】

「生物学的サンプル（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」または「サンプル（ｓａｍｐｌｅ）」とは、被験体もしくは患者から得られるかまたは彼らに由来する材料に言及する。生物学的サンプルとしては、生検または剖検サンプルのような組織の切片、および組織学的目的で採取された凍結切片が挙げられる。このようなサンプルは、体液（例えば、血液および血液画分および血液製剤（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球など）、喀痰、組織、培養細胞（例えば、初代培養物、外植片、および形質転換した細胞）、糞便、尿、滑液、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞などを含む。生物学的サンプルは、代表的には、真核生物（例えば、霊長類、例えば、チンパンジーもしくはヒト；ウシ；イヌ；ネコ；ウサギ、例えば、モルモット、ラット、マウス；ウサギのような哺乳動物；または鳥類；爬虫類；または魚類）から得られる。

【0230】

「細胞（ｃｅｌｌ）」とは、本明細書で使用される場合、代謝的機能またはそのゲノムＤＮＡを保存または複製するために十分な他の機能を有する細胞に言及する。細胞は、当該分野で周知の方法によって同定され得る（例えば、無傷な膜の存在、特定の色素による染色、後代を生み出す能力、または配偶子の場合には、第２の配偶子と合わさって、生きている子孫を生み出す能力が挙げられる）。細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞を含み得る。原核生物細胞としては、細菌が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物細胞としては、酵母細胞、ならびに植物および動物（例えば、哺乳動物）に由来する細胞、昆虫（例えば、スポドプテラ）およびヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0231】

遺伝子に言及して本明細書で使用される場合の文言「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」または「発現される（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」は、その遺伝子の転写および／または翻訳生成物を意味する。細胞中のＤＮＡ分子の発現のレベルは、細胞内に存在する相当するｍＲＮＡの量または細胞によって生成されるそのＤＮＡによってコードされる得タンパク質の量のいずれかに基づいて決定され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １８．１－１８．８８）。

【0232】

トランスフェクトされる遺伝子の発現は、細胞において一過性にまたは安定して起こり得る。「一過性の発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」の間には、そのトランスフェクトされた遺伝子は、細胞分裂の間に娘細胞へと移動されない。その発現がそのトランスフェクトされた細胞に制限されることから、その遺伝子の発現は、経時的に失われる。対照的に、トランスフェクトされた遺伝子の安定な発現は、その遺伝子が、そのトランスフェクトされた細胞に選択の有利性を付与する別の遺伝子と共トランスフェクトされる場合に起こり得る。このような選択の有利性は、細胞に示されるある種の毒素に対する抵抗性であり得る。

【0233】

用語「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」とは、所定の細胞または生物の外側に端を発する分子または物質（例えば、核酸またはタンパク質）に言及する。逆に、用語「内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」とは、所定の細胞または生物に対して天然であるか、またはそれらの内部に端を発する分子または物質に言及する。

【0234】

用語「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」、「トランスフェクトする（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）」または「形質導入する（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）」とは、交換可能に使用され得、核酸分子および／またはタンパク質を細胞へと導入するプロセスとして定義される。核酸は、非ウイルスベースまたはウイルスベースの方法を使用して、細胞へと導入され得る。その核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする配列であり得る。代表的には、核酸ベクターは、タンパク質発現に必要なエレメント（例えば、プロモーター、転写開始部位など）を含む。トランスフェクションの非ウイルス的方法は、核酸分子を細胞へと導入する送達システムとしてウイルスＤＮＡもウイルス粒子も使用しない任意の適切な方法を含む。例示的な非ウイルス的トランスフェクション方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、ヒートショックを通じてのトランスフェクション、マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｉｆｅｃｔｉｏｎ）およびエレクトロポレーションが挙げられる。ウイルスベースの方法に関しては、任意の有用なウイルスベクターが、本明細書で記載される方法において使用され得る。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの局面において、その核酸分子は、当該分野で周知の標準的手順に従ってレトロウイルスベクターを使用して細胞へと導入される。用語「トランスフェクション」または「形質導入得」は、外部環境から細胞へとタンパク質を導入することにも言及する。代表的には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜をその目的のタンパク質に組みあわせ（ｃｒｏｓｓ）得るペプチドまたはタンパク質の付着に依拠する。例えば、Ｆｏｒｄら（２００１） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１－４ ａｎｄ Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ（２００７） Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１１９－２０を参照のこと。

【0235】

核酸は、これが別の核酸配列との機能的関係性に配置される場合に、「作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」る。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、これがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響を及ぼすのであれば、その配列に作動可能に連結される；またはリボソーム結合部位は、これが翻訳を促進するように配置されるのであれば、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が互いに近くにあり、そして分泌リーダーの場合には、連続しておりかつ読み取り相の中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続していなくてもよい。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の実施に従って使用される。

【0236】

用語「遺伝子（ｇｅｎｅ）」とは、タンパク質の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味する；遺伝子は、そのコード領域の前および後ろにある領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。そのリーダー、トレイラーならびにイントロンは、遺伝子の転写および翻訳の間に必要である調節エレメントを含む。さらに「タンパク質遺伝子生成物（ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、特定の遺伝子から発現されるタンパク質である。

【0237】

本明細書で記載される特定のタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）に関して、その名付けられたタンパク質は、タンパク質転写因子活性を維持する（例えば、天然のタンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内）そのタンパク質の天然に存在する形態、または改変体もしくはホモログのうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態において、改変体またはホモログは、天然に存在する形態と比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態において、そのタンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照によって同定されるとおりのタンパク質である。他の実施形態において、そのタンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照またはその機能的フラグメントもしくはホモログによって同定されるとおりのタンパク質である。

【0238】

従って、本明細書で言及される場合の「メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ１（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＴＥＴ１）」または「ＴＥＴ１」タンパク質は、ＴＥＴ１ジオキシゲナーゼ酵素活性を維持する（例えば、ＴＥＴ１と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内で）ＴＥＴ１ジオキシゲナーゼまたはその改変体もしくはホモログの組換えまたは天然に存在する形態のうちのいずれかを含む。いくつかの局面において、その改変体またはホモログは、天然に存在するＴＥＴ１タンパク質と比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ８ＮＦＵ７によって同定されるタンパク質、またはこれに対して実質的同一性を有する改変体もしくはホモログに実質的に同一である。

【0239】

従って、本明細書で言及される場合の「メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ２（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＴＥＴ２）」または「ＴＥＴ２」タンパク質は、ＴＥＴ２ジオキシゲナーゼ酵素活性を維持する（例えば、ＴＥＴ２と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内で）ＴＥＴ２ジオキシゲナーゼまたはその改変体もしくはホモログの組換えまたは天然に存在する形態のうちのいずれかを含む。いくつかの局面において、その改変体またはホモログは、天然に存在するＴＥＴ２タンパク質と比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ２タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６Ｎ０２１によって同定されるタンパク質、またはこれに対して実質的同一性を有する改変体もしくはホモログに実質的に同一である。

【0240】

従って、本明細書で言及される場合の「メチルシトシンジオキシゲナーゼＴＥＴ３（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＴＥＴ３）」または「ＴＥＴ３」タンパク質は、ＴＥＴ３ジオキシゲナーゼ酵素活性を維持する（例えば、ＴＥＴ３と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内で）ＴＥＴ３ジオキシゲナーゼまたはその改変体もしくはホモログの組換えまたは天然に存在する形態のうちのいずれかを含む。いくつかの局面において、その改変体またはホモログは、天然に存在するＴＥＴ３タンパク質と比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＴＥＴ３タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｏ４３１５１によって同定されるタンパク質、またはこれに対して実質的同一性を有する改変体もしくはホモログに実質的に同一である。

【0241】

ＴＥＴファミリーの酵素（例えば、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３）は、５ｍＣから５ｈｍＣへの変換、ならびに５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）および５ カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）へのそのさらなる酸化を触媒する（Ｉｔｏら， ２０１０）。ＴＥＴジオキシゲナーゼは、Ｃ５のメチル基を酸化して、５－ヒドロキシメチル－（ｈｍＣ）（Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ ａｎｄ Ｈｅｉｎｔｚ， ２００９）、５－ホルミル－（ｆＣ）（Ｍａｉｔｉ ａｎｄ Ｄｒｏｈａｔ， ２０１１）および５－カルボキシルシトシン（ｃａＣ）（Ｈｅら， ２０１１）を生じる。

【0242】

本明細書で言及される場合の「Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ」または「ＧＡＤＤ４５Ａ」タンパク質は、ＧＡＤＤ４５Ａタンパク質活性／機能を維持する（例えば、ＧＡＤＤ４５Ａと比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内で）ＧＡＤＤ４５Ａタンパク質またはその改変体もしくはホモログの組換えまたは天然に存在する形態のうちのいずれかを含む。いくつかの局面において、その改変体またはホモログは、天然に存在するＧＡＤＤ４５Ａタンパク質と比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＧＡＤＤ４５Ａタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ２４５２２によって同定されるタンパク質、またはこれに対して実質的同一性を有する改変体もしくはホモログに実質的に同一である。

【0243】

ＧＡＤＤ４５Ａは、ＮＥＲベースのおよびＢＥＲベースのＤＮＡ脱メチル化における調節タンパク質ファミリーの一部を形成する（例えば、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４５ａ、－ｂ、－ｇ）。ＧＡＤＤ４５タンパク質は、いかなる明らかな酵素活性をも欠いており、脱メチル化標的遺伝子とＤＮＡ修復装置との間のアダプターとして作用する。いかなる特定の理論にも拘束されないが、一般には、ＧＡＤＤ４５ａおよびＴＥＴ１が互いに直接結合すると考えられる。

【0244】

従って、本明細書で言及される場合の「ＮＥＩＬ２グリコシラーゼ（ＮＥＩＬ２ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）」または「ＮＥＩＬ２」タンパク質は、ＮＥＩＬ２グリコシラーゼ酵素活性を維持する（例えば、ＮＥＩＬ２と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内で）ＮＥＩＬ２グリコシラーゼまたはその改変体もしくはホモログの組換えまたは天然に存在する形態のうちのいずれかを含む。いくつかの局面において、その改変体またはホモログは、天然に存在するＮＥＩＬ２グリコシラーゼと比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＮＥＩＬ２グリコシラーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９６９Ｓ２によって同定されるタンパク質、またはこれに対して実質的同一性を有する改変体もしくはホモログに実質的に同一である。

【0245】

ＮＥＩＬグリコシラーゼは、クロマチンにおけるホルミル化およびカルボキシル化シトシンを切り出し得る。ＮＥＩＬグリコシラーゼはまた、ＴＥＴ媒介性シトシン酸化の後にＢＥＲを開始し得る。ＮＥＩＬグリコシラーゼは、従って、活性な脱メチル化およびエピジェネティックにサイレントにされた遺伝子の再活性化の代替経路を構成し得る。

【0246】

本明細書で言及される場合の「ＤＮＭＴ３ａ」、「ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ－５）－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３Ａ）」または「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３ａ）」タンパク質は、ＤＮＭＴ３ａ酵素活性を維持する（例えば、ＤＮＭＴ３ａと比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内で）ＤＮＭＴ３ａ酵素またはその改変体もしくはホモログの組換えまたは天然に存在する形態のうちのいずれかを含む。いくつかの局面において、その改変体またはホモログは、天然に存在するＤＮＭＴ３ａタンパク質と比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＤＮＭＴ３ａタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９Ｙ６Ｋ１によって同定されるタンパク質、またはこれに対して実質的同一性を有する改変体もしくはホモログに実質的に同一である。

【0247】

本明細書で言及される場合の「ＤＮＭＴ３Ｌ」、「ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ｌ（ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ－５）－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３Ｌ）」または「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｌ（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３Ｌ）」タンパク質は、ＤＮＭＴ３Ｌ酵素活性を維持する（例えば、ＤＮＭＴ３Ｌと比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性の範囲内で）ＤＮＭＴ３Ｌ酵素またはその改変体もしくはホモログの組換えまたは天然に存在する形態のうちのいずれかを含む。いくつかの局面において、その改変体またはホモログは、天然に存在するＤＮＭＴ３Ｌタンパク質と比較して、その配列の完全配列または一部（例えば、５０個、１００個、１５０個または２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。ある種の実施形態において、そのＤＮＭＴ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷ３によって同定されるタンパク質、またはこれに対して実質的同一性を有する改変体もしくはホモログに実質的に同一である。

【0248】

ＭＬＨ１（ＭｕｔＬホモログ１）は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子、ｍｕｔＬ（これは、ミスマッチ認識、鎖の識別、および鎖の除去の間のタンパク質－タンパク質相互作用を媒介する）のヒトホモログである。そのヒト遺伝子、ｈＭＬＨ１は、第３染色体上に位置する。ｈＭＬＨ１における欠損は一般に、遺伝性非ポリポーシス大腸がん（ＨＮＰＣＣ）において観察されるマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）と関連する。さらに、そのｈＭＬＨ１の欠損する発現は、多くのがん（胃がん（腸窩タイプ腫瘍、および高発病率のカシミール渓谷における胃がんを含む）、食道がん、頭頚部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および結腸直腸癌（例えば、ＨＮＰＣＣ）が挙げられる）において観察されてきた。これらのがんにおいて、ｈＭＬＨ１の欠損の大部分は、ｈＭＬＨ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化に起因した。

【0249】

Ｃａｓ９タンパク質
本明細書で使用される場合、本明細書で言及される場合の用語「Ｃａｓ９タンパク質（Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、エンドヌクレアーゼ活性に関する２つの触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）のうちの一方が活性に欠陥があるかまたは活性を欠いているヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質、およびエンドヌクレアーゼ活性に関する両方の触媒部位が活性に欠陥があるかまたは活性を欠いているｄＣａｓ９タンパク質を含む。ある種の実施形態において、そのＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質である。ある種の実施形態において、そのＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠いているかまたはヌクレアーゼ欠損性である。ある種の実施形態において、そのＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼである（例えば、例えば、そのニッカーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０Ａに相当する位置に変異を有するＣａｓ９ニッカーゼであり得る；またはそのニッカーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＨ８４０Ａに相当する位置において変異を有するＣａｓ９ニッカーゼであり得る）。ある種の実施形態において、そのＣａｓ９タンパク質は、ｄＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａに相当する位置において変異を有するｄＣａｓ９）である。

【0250】

ある種の実施形態において、「改変されたＣａｓ９タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質ではないＣａｓ９をいう。ある種の実施形態において、その改変されたＣａｓ９タンパク質は、ｄＣａｓ９である。ある種の実施形態において、その改変されたＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼである。

【0251】

その改変されたＣａｓ９タンパク質（ニッカーゼまたはｄＣａｓ９）は、低下したヌクレアーゼ活性を有し得るか、または一方もしくは両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位においてヌクレアーゼ活性を欠いている。ある種の実施形態において、そのｄＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９の両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）における点変異に起因して、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている。例えば、その点変異は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９においてそれぞれ、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａであり得るか、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ以外の種におけるその相当する残基にあり得る。ある種の実施形態において、その改変されたＣａｓ９タンパク質は、ｗｔ Ｃａｓ９のうちの一方の部位（しかし両方の部位ではない）においてエンドヌクレアーゼ触媒活性を欠いており、ｄｓＤＮＡ標的上にニックを作りだし得る（Ｃａｓ９ニッカーゼ）。

【0252】

ある種の実施形態において、そのＣａｓ９ニッカーゼタンパク質は、野生型Ｃａｓ９の一方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）における点変異に起因して、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている。その点変異は、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａであり得る。

【0253】

ある種の実施形態において、そのｄＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損性であるが、ポリヌクレオチドと複合体化される場合のＤＮＡ結合能力を保持する。

【0254】

ある種の実施形態において、そのｄＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９の両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）での点変異に起因して、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている。その点変異は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａであり得る。

【0255】

ある種の実施形態において、その改変されたＣａｓ９タンパク質は、低下したエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を有するか、またはその活性を欠いている。例えば、本発明の方法における使用に適した改変されたＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼであり得るか、または野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２（その全体においておよび全ての目的のために本明細書に参考として援用される）の図３および配列番号８に示されるとおりのアミノ酸配列を含む野生型Ｃａｓ９ポリペプチド）のエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性の２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満を示す。いくつかの実施形態において、そのｄＣａｓ９は、検出可能なエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を実質的に有しない。ｄＣａｓ９が低下した触媒活性を有する場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７の変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有する場合）のいくつかの実施形態において、そのポリペプチドはなお、部位特異的様式で標的ＤＮＡに結合し得る。なぜならそれは、本発明のポリヌクレオチドのＣａｓ９結合配列と相互作用する能力を保持する限りにおいて、本発明のポリヌクレオチドのＤＮＡ標的化配列によって標的ポリヌクレオチド配列へとなおガイドされるからである。

【0256】

そのＣａｓ９タンパク質、そのホモログまたはフラグメントのうちのいずれか１つは、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２５８９に開示され、ＷＯ２０１３／１７６７７２（これはその全体においておよび全ての目的のために参考として援用される）として公開されるＣａｓ９タンパク質と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、本明細書で提供される複合体および方法のために企図される。

【0257】

いくつかの場合では、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）は、必要に応じて、以下を含む融合ポリペプチドである： ｉ）異種ポリペプチド（「融合パートナー」ともいわれる）（これは、ＰＵＦドメイン（以下）へと融合される融合パートナーと同じであっても異なっていてもよい）に共有結合的に連結されたＣａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損性ｗｔ Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）。

【0258】

「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」または「必要性のある被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ ｉｎ ｎｅｅｄ ｔｈｅｒｅｏｆ）」とは、本明細書で提供されるとおりの組成物または薬学的組成物の投与によって処置され得る疾患または状態に罹患しているまたはその傾向にある生きている生物に言及する。非限定的例としては、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、および他の非哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、患者は、ヒトである。

【0259】

用語「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」または「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、本明細書で提供される化合物、薬学的組成物、または方法で処置され得る患者または被験体の身体の状態または健康状態に言及する。ある種の実施形態において、その疾患は、がんである（例えば、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頚がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えば、メルケル細胞がん）、精巣がん、白血病、リンパ腫（マントル細胞（Ｍａｎｔｅｌ ｃｅｌｌ）リンパ腫）、頭頚部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽腫）。

【0260】

本明細書で使用される場合、用語「がん（ｃａｎｃｅｒ）」とは、哺乳動物において見出されるがん、新生物または悪性腫瘍の全てのタイプ（白血病、リンパ腫、黒色腫、神経内分泌腫瘍、癌腫および肉腫が挙げられる）をいう。本明細書で提供される化合物、薬学的組成物、または方法で処置され得るがんの例としては、以下が挙げられる：リンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫）、肉腫、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、子宮頚がん、結腸がん、食道がん、胃がん、頭頚部がん、腎臓がん、骨髄腫、甲状腺がん、白血病、前立腺がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ、ＥＲ陽性、ＥＲ陰性、化学療法抵抗性、ハーセプチン抵抗性、ＨＥＲ２陽性、ドキソルビシン抵抗性、タモキシフェン抵抗性、乳管癌（ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小葉癌、原発性、転移性）、卵巣がん、膵臓がん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、肺扁平上皮癌、腺癌、大細胞肺癌、小細胞肺がん、カルチノイド、肉腫）、多形膠芽腫、神経膠腫、黒色腫、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膠芽腫、卵巣がん、肺がん、扁平上皮がん（例えば、頭部、頸部、または食道）、結腸直腸がん、白血病（例えば、リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病）、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫。さらなる例としては、以下が挙げられる：甲状腺、内分泌システム、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頚部、食道、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮または髄芽腫のがん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経膠腫、多形膠芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前癌性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽腫、食道がん、尿生殖路のがん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵臓内分泌部または外分泌部の新生物、甲状腺髄様がん、甲状腺髄様癌、黒色腫、結腸直腸がん、甲状腺乳頭がん、肝細胞癌、乳頭パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｉｐｐｌｅ）、葉状腫瘍、小葉癌、乳管癌、膵星細胞のがん、肝星細胞のがん、または前立腺がん。

【0261】

疾患（例えば、がん（例えば、白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫））と関連する物質または物質活性または機能の状況において用語「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」または「と関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」とは、その疾患（例えば、がん（例えば、白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫））が、その物質または物質活性または機能によって（全体としてまたは部分的に）引き起こされるか、またはその疾患の症状が、その物質または物質活性または機能によって（全体としてまたは部分的に）引き起こされることを意味する。

【0262】

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「緩和する（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」または「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」とは、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、有益なまたは所望の結果（治療上の利益および／または予防上の利益が挙げられるが、これらに限定されない）を得るためのアプローチに言及する。治療上の利益とは、処置されているその根底にある障害の根絶または改善を意味する。また、治療上の利益は、改善が患者において観察されるようにその根底にある障害と関連する生理学的症状の１またはこれより多くの根絶または改善とともに達成されるが、にもかかわらずその患者は、その根底にある障害になお悩まされている可能性がある。予防上の利益に関しては、組成物は、特定の疾患を発症するリスクにある患者に、または疾患の生理学的症状のうちの１またはこれより多くを報告する患者に、この疾患の診断がたとえ行われていない可能性があるとしても、投与され得る。処置としては、以下が挙げられる：その疾患の防止、すなわち、その疾患の臨床症状を、その疾患の誘導の前に防御的な組成物の投与によって発生させないようにすること；その疾患の抑制、すなわち、その疾患の臨床症状を、誘導的な事象の後であるが、その疾患の臨床的出現または再発の前に、防御的な組成物の投与によって発生させないようにすること；その疾患の阻害、すなわち、臨床症状の発生を、それらの最初の出現後に防御的な組成物の投与によって阻止すること；その疾患の再発の防止および／またはその疾患の軽減、すなわち、臨床症状の退縮を、それらの最初の出現後に防御的な組成物の投与によって引き起こすこと。例えば、本明細書中のある種の方法は、がん（例えば、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頚がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えば、メルケル細胞がん）、精巣がん、白血病、リンパ腫、頭頚部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽腫）を処置する。例えば、本明細書中のある種の方法は、がんの出現、増殖、転移、もしくは進行を減少もしくは低減または防止することによってがんを処置するか；またはがんの症状を減少させることによってがんを処置する。がん（例えば、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頚がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えば、メルケル細胞がん）、精巣がん、白血病、リンパ腫、頭頚部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽腫）の症状は、公知であるかまたは当業者によって決定され得る。

【0263】

本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、プロテアーゼの発現によって特徴づけられる疾患もしくは状態の１もしくはこれより多くの症状の影響、またはプロテアーゼの発現によって特徴づけられる疾患または状態の症状を低減するための方法に言及する。従って、開示される方法において、処置は、確立された疾患、状態、またはその疾患もしくは状態の症状の重篤度における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減に言及し得る。例えば、疾患を処置するための方法は、被験体におけるその疾患の１またはこれより多くの症状において、コントロールと比較して１０％の低減がある場合、処置であると考えられる。従って、その低減は、天然のまたはコントロールレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の間の任意の％低減であり得る。処置が、その疾患、状態、またはその疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去に必ずしも言及しないことは、理解される。さらに、本明細書で使用される場合、減少、低減または阻害への言及は、コントロールレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超の変化を含み、このような用語は、完全な排除を含み得るが、必ずしも含まない。

【0264】

「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、述べられた目的を達成する（例えば、その有効量が投与される効果を達成する、疾患を処置する、酵素活性を低減する、疾患または状態の１またはこれより多くの症状を低減する）ために十分な量である。「有効量」の一例は、疾患の症状の処置、防止または低減に寄与するために十分な量であり、この量は、「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」ともいわれ得る。症状（およびこの語句の文法的に等価なもの）の「低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」は、症状の重篤度もしくは頻度の減少、または症状の除去を意味する。薬物の「予防上有効な量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、被験体に投与される場合に、意図した予防上の効果（例えば、傷害、疾患、病状もしくは状態の発生（もしくは再発）を防止するかもしくは遅らせること、あるいは傷害、疾患、病状もしくは状態、またはそれらの症状の発生（もしくは再発）の可能性を低減すること）を有する薬物の量である。完全な予防上の効果は、１用量の投与によって必ずしも起こるわけではなく、一連の用量の投与後にのみ起こってもよい。従って、予防上有効な量は、１またはこれより多くの投与において投与されてもよい。「活性減少量（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）」とは、本明細書で使用される場合、アンタゴニストがない場合と比較して、酵素またはタンパク質の活性を減少させるために必要とされるアンタゴニストの量に言及する。「機能妨害量（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）」とは、本明細書で使用される場合、アンタゴニストがない場合と比較して、酵素またはタンパク質の機能を妨害するために必要とされるアンタゴニストの量に言及する。薬学的生成物の所定のクラスに適切な投与量に関しては、文献中にガイドラインが見出され得る。例えば、所定のパラメーターに関して、有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または少なくとも１００％の増大または減少を示す。有効性はまた、「－倍」の増大または減少として表され得る。例えば、治療上有効な量は、コントロールに対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、またはこれより高い効果を有し得る。その正確な量は、処置の目的に依存し、公知の技術を使用して当業者に拠って確認され得る（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ． １－３， １９９２）； Ｌｌｏｙｄ， Ｔｈｅ Ａｒｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）； Ｐｉｃｋａｒ， Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， 第２０版， ２００３， Ｇｅｎｎａｒｏ編， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと）。

【0265】

本明細書で使用される場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、被験体への、経口投与、坐剤としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病変内、髄腔内、鼻内もしくは皮下の投与、または遅延放出デバイス（例えば、ミニ浸透圧ポンプ）の移植を意味する。投与は、任意の経路（非経口および経粘膜（例えば、口内、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、または経皮が挙げられる）によるものである。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、および頭蓋内が挙げられる。他の送達様式としては、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が挙げられるが、これらに限定されない。「共投与する（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」とは、本明細書で記載される組成物が、１またはこれより多くのさらなる治療（例えば、がん治療（例えば、化学療法、ホルモン療法、放射線療法、または免疫療法））の投与と同時、直前または直後に、投与されることを意味する。本発明の化合物は、その患者に単独で投与されてもよいし、共投与されてもよい。共投与は、化合物を、個々にまたは組みあわせて（１種より多くの化合物）、同時または逐次的に投与することを含むことが意味される。従って、調製物はまた、所望される場合、他の活性物質と（例えば、代謝的分解を低減するために）組み合わされ得る。本発明の組成物は、経皮的に、局所経路によって、アプリケータースティック、液剤、懸濁物、エマルジョン、ゲル、クリーム剤、軟膏、パスタ剤、ゼリー、塗布物（ｐａｉｎｔ）、散剤、およびエアロゾルとして処方されて、送達され得る。

【0266】

経口投与に適した製剤は、（ａ）液体溶液（例えば、有効量の、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ ４００）中で懸濁された本明細書で提供される複合体）；（ｂ）カプセル剤、顆粒分包（ｓａｃｈｅｔ）または錠剤（各々は、液体、固体、粒剤またはゼラチンとして所定の量の活性成分を含む）；（ｃ）適切な液体中の懸濁物；および（ｄ）適切なエマルジョンからなり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性のキャリアのうちの１またはこれより多くを含み得る。ロゼンジ形態は、香味料（例えば、スクロース）中の活性成分、ならびに活性成分に加えて、当該分野で公知のキャリアを含む不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアエマルジョン、ゲルなど）中の活性成分を含むトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）を含み得る。

【0267】

薬学的組成物はまた、大きなゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド（例えば、キトサン）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス官能化セファロース（ＴＭ）、アガロース、セルロースなど）、ポリマー状のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）を含み得る。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能し得る。

【0268】

直腸投与に適した製剤としては、例えば、坐剤（これは、パッケージされた核酸と坐剤基剤とからなる）が挙げられる。適切な坐剤基剤としては、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が挙げられる。さらに、選択された化合物と、基剤（例えば、液体グリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素が挙げられる）との組みあわせからなるゼラチン直腸カプセル剤を使用することも可能である。

【0269】

非経口投与に適した製剤（例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下経路による）は、水性および非水性の、等張性滅菌注射溶液（これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、およびその製剤を意図したレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る）、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁物（これは、懸濁剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤、および保存剤を含み得る）を含む。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内にまたは髄腔内に投与され得る。非経口投与、経口投与、および静脈内投与は、好ましい投与法である。化合物の製剤は、単一用量および複数用量のシールされた容器（例えば、アンプルおよびバイアル）で提示され得る。

【0270】

注射溶液および懸濁物は、以前に記載された種類の滅菌散剤、粒剤、および錠剤から調製され得る。エキソビボ治療のために核酸によって形質導入された細胞はまた、上記のように静脈内にまたは非経口的に投与され得る。

【0271】

薬学的調製物は、好ましくは、単一投与形態にある。このような形態では、その調製物は、活性構成要素の適切な量を含む単位用量へとさらに分けられる。単位投与形態は、パッケージされた調製物であり得、そのパッケージは、別個の量の調製物（例えば、パッケージされた錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の散剤）を含む。また、その単位投与形態は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、もしくはロゼンジ自体であり得るか、またはパッケージされた形態にあるこれらのうちの適切な数のいずれかであり得る。その組成物は、所望であれば、他の適合性の治療剤をも含み得る。

【0272】

併用投与は、別個の製剤または単一の薬学的製剤を使用する共投与、およびいずれかの順序での連続投与を企図し、ここで好ましくは、両方の（または全ての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。

【0273】

本明細書で提供される組成物の有効用量は、多くの異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか、動物であるのか、他の薬物療法が投与されているか、および処置が予防的であるか、治療的であるか、が挙げられる）に依存して変動する。しかし、当業者は、指標にするためにがんを処置および防止するための承認された組成物の投与量から判断して、適切なおよび／または等しい用量を直ちに認識する。

【0274】

「薬学的に受容可能な賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」および「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、活性薬剤の投与を補助する物質、および被験体による吸収を補助する物質に言及し、そして患者に対して顕著に有害な毒性効果を引き起こすことなく、本発明の組成物の中に含まれ得る。薬学的に受容可能な賦形剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、通常生理食塩水溶液、乳酸加リンゲル液、通常スクロース、通常グルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味料、香味料、塩類溶液（例えば、リンゲル液）、アルコール、油、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、および着色剤などが挙げられる。このような調製物は、滅菌され得、所望であれば、本発明の化合物と有害に反応しない補助剤（例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色剤、および／または芳香物質など）と混合され得る。当業者は、他の薬学的賦形剤が、本発明において有用であることを認識する。

【0275】

用語「薬学的に受容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔ）」とは、当該分野で周知の種々の有機性および無機性の対イオンに由来する塩に言及し、これらとしては、例示に過ぎないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなど；およびその分子が塩基性官能基を含む場合は、有機酸および無機酸の塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩など）が挙げられる。

【0276】

用語「調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」とは、活性化合物の、カプセル剤を提供するキャリアとしての被包物質での製剤を含むことが意図され、そのカプセル剤の中では、活性構成要素（他のキャリアありまたはなし）はキャリアによって囲まれ、よってそのキャリアがその活性構成要素と会合した状態になる。同様に、カシェ剤およびロゼンジが含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、およびロゼンジは、経口投与に適した個体投与形態として使用され得る、
その薬学的調製物は、必要に応じて、単位投与形態にある。このような形態では、その調製物は、活性構成要素の適切な量を含む単位用量へとさらに分けられる。その単位投与形態は、パッケージされた調製物であり得、そのパッケージは、別個の量の調製物（例えば、パッケージされた錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の散剤）を含む。また、その単位投与形態は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、もしくはロゼンジ自体であり得るか、またはパッケージされた形態にあるこれらのうちの適切な数のいずれかであり得る。その単位投与形態は、凍結分散物のものであり得る。

【0277】

本発明の組成物はさらに、徐放および／または快適性を提供する構成要素を含み得る。このような構成要素としては、高分子量のアニオン性粘液模倣性ポリマー、ゲル化ポリサッカリドおよび微細に分割された薬物キャリア物質が挙げられる。これらの構成要素は、米国特許第４，９１１，９２０号；同第５，４０３，８４１号；同第５，２１２，１６２号；および同第４，８６１，７６０号の中でより詳細に考察される。これら特許の内容全体は、それらの全体においておよび全ての目的のために本明細書に参考として援用される。本発明の組成物はまた、身体の中でのゆっくりとした放出のためにマイウロスフェアとして送達され得る。例えば、マイクロスフェアは、薬物含有マイクロスフェアの皮内注射を介して（これは、皮下にゆっくりと放出する（Ｒａｏ， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｅｄ． ７：６２３－６４５， １９９５を参照のこと））；生分解性および注射用ゲル製剤として（例えば、Ｇａｏ Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １２：８５７－８６３， １９９５を参照のこと）；または経口投与用のマイクロスフェアとして（例えば、Ｅｙｌｅｓ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４９：６６９－６７４， １９９７を参照のこと）、投与され得る。ある種の実施形態において、本発明の組成物の製剤は、細胞膜と融合するかまたはエンドサイトーシスされるリポソームの使用によって、すなわち、リポソームに結合したレセプターリガンド（これは細胞の表面膜タンパク質レセプターに結合して、エンドサイトーシスを生じる）を使用することによって、送達され得る。リポソームを、特に、そのリポソーム表面が、標的細胞に対して特異的なレセプターリガンドを有するか、または特定の器官に別の方法で優先的に指向される場合に使用することによって、本発明の組成物をインビボで標的細胞へと送達することに焦点が当てられ得る（例えば、Ａｌ－Ｍｕｈａｍｍｅｄ， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ． １３：２９３－３０６， １９９６； Ｃｈｏｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：６９８－７０８， １９９５； Ｏｓｔｒｏ， Ａｍ． Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｐｈａｒｍ． ４６：１５７６－１５８７， １９８９を参照のこと）。本発明の組成物はまた、ナノ粒子として送達され得る。

【0278】

他の適切な配列
本明細書で提供されその実施形態を含む複合体および方法に関して、ポリヌクレオチド（例えば、第１のまたは第２のポリヌクレオチド）は、（例えば、ＲＮＡ（例えば、本発明のポリヌクレオチド）の一部を形成するそれぞれのポリヌクレオチドの安定性に影響を及ぼす安定性制御配列（例えば、転写ターミネーターセグメント）を含み得る。適切な安定性制御配列の一例は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）である。本発明のポリヌクレオチドの転写ターミネーターセグメントは、１０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、例えば、１０ヌクレオチド（ｎｔ）～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、または９０ｎｔ～１００ｎｔの全長を有し得る。例えば、その転写ターミネーターセグメントは、１５ヌクレオチド（ｎｔ）～８０ｎｔ、１５ｎｔ～５０ｎｔ、１５ｎｔ～４０ｎｔ、１５ｎｔ～３０ｎｔまたは１５ｎｔ～２５ｎｔの長さを有し得る。

【0279】

いくつかの場合では、その転写終結配列は、真核生物において機能するものである。いくつかの場合では、その転写終結配列は、原核生物において機能するものである。安定性制御配列（例えば、転写終結セグメント、または増大した安定性を提供するためにＤＮＡ標的化ＲＮＡの任意のセグメントにおいて）に含まれ得るヌクレオチド配列の非限定的な例としては、ＷＯ ２０１３／１７６７７２（その全体においておよび全ての目的のために本明細書に参考として援用される）の配列番号６８３～６９６に示される配列が挙げられ、例えば、ＷＯ ２０１３／１７６７７２の配列番号７９５、ρ非依存性転写終結部位を参照のこと。

【0280】

転写の調節
本明細書で提供されるメチル化タンパク質結合体の脱メチル化は、本発明のポリヌクレオチドのＤＮＡ標的化配列によって、標的ＤＮＡにおける特定の位置（すなわち、標的ポリヌクレオチド配列）へと標的化され、その標的ＤＮＡの遺伝子座特異的改変を発揮する（例えば、局所的なクロマチン状態を改変する）。いくつかの場合では、その変化は、一過性（例えば、転写抑制または活性化）である。いくつかの場合では、その変化は、遺伝性である（例えば、エピジェネティック改変が、標的ＤＮＡに対してまたは標的ＤＮＡ、例えば、ヌクレオソームヒストンと関連したタンパク質に対して行われる場合）。

【0281】

本明細書で提供されその実施形態を含む複合体を使用する方法の生物学的効果は、任意の好都合な方法（例えば、遺伝子発現アッセイ；クロマチンベースのアッセイ、例えば、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＣｈｉＰ）、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ Ａｓｓａｙ（ＣｉＡ）など；など）によって検出され得る。

【0282】

従って、ある種の実施形態において、本発明の転写調節法は、宿主細胞において標的核酸の選択的調節（例えば、低減または増大）を提供する。例えば、標的核酸の転写の「選択的（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）」低減は、ＤＮＡ標的化配列／改変されたＣａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体の非存在下でのその標的核酸の転写のレベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９０％超、その標的核酸の転写を低減する。標的核酸の転写の選択的低減は、その標的核酸の転写を低減するが、非標的核酸の転写を実質的に低減せず、例えば、非標的核酸の転写は、あるとすれば、ＤＮＡ標的化配列／改変されたＣａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体の非存在下での非標的核酸の転写レベルと比較して、１０％未満低減される。

【0283】

他方で、標的ＤＮＡの転写の「選択的」増大は、本明細書で提供されその実施形態を含む複合体（例えば、ＤＮＡ標的化配列／改変されたＣａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体）の非存在下での標的ＤＮＡの転写レベルと比較して、少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍）、その標的ＤＮＡの転写を増大させ得る。標的ＤＮＡの転写の選択的増大は、その標的ＤＮＡの転写を増大させるが、非標的ＤＮＡの転写を実質的に増大させない。例えば、非標的ＤＮＡの転写は、あるとすれば、本明細書で提供されその実施形態を含む複合体（例えば、ＤＮＡ標的化配列／改変されたＣａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体）の非存在下でのその非標的ＤＮＡ核酸の転写のレベルと比較して、５倍未満（例えば、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．８倍未満、１．６倍未満、１．４倍未満、１．２倍未満、または１．１倍未満）増大される。

【0284】

いくつかの実施形態において、複数の本発明のポリヌクレオチドは、同じ標的ＤＮＡ上でまたは異なる標的ＤＮＡ上で、異なる位置での転写を同時に調節するために、同じ細胞の中で同時に使用され得る。いくつかの実施形態において、２またはこれより多くの本発明のポリヌクレオチドは、同じ遺伝子または転写物または遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態において、２またはこれより多くの本発明のポリヌクレオチドは、異なる関連しない遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態において、２またはこれより多くの本発明のポリヌクレオチドは、異なるが関連する遺伝子座を標的化する。

【0285】

本発明のポリヌクレオチドは、小さくかつ強いので、それらは、同じ発現ベクター上に同時に存在し得、そしてさらには、同じ転写制御の下に（そのように望まれるのであれば）あり得る。いくつかの実施形態において、２もしくはこれより多く（例えば、３もしくはこれより多く、４もしくはこれより多く、５もしくはこれより多く、１０ もしくはこれより多く、１５もしくはこれより多く、２０もしくはこれより多く、２５もしくはこれより多く、３０もしくはこれより多く、３５もしくはこれより多く、４０もしくはこれより多く、４５もしくはこれより多く、または５０もしくはこれより多く）の本発明のポリヌクレオチドが、同じまたは異なるベクターから、標的細胞の中で同時に発現される。その発現された本発明のポリヌクレオチドは、種々の細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、およびＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するオルソゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９タンパク質）によって異なって認識され得る。

【0286】

複数の本発明のポリヌクレオチドを発現するために、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（参考として全ての目的のために援用される）として公開されるＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって媒介される人工ＲＮＡプロセシングシステムは、本明細書で提供される発明のために使用され得る。

【0287】

宿主細胞
転写を調節する本発明の方法は、インビボおよび／またはエキソビボおよび／またはインビトロで有糸分裂細胞または有糸分裂後細胞において転写調節を誘導するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡの標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることによって特異性を提供するので、有糸分裂および／または有糸分裂後の細胞は、種々の宿主細胞のうちのいずれかであり得る。ここで適切な宿主細胞としては、細菌細胞；古細菌の細胞；単細胞の真核生物細胞；植物細胞；藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈなど）；真菌細胞；動物細胞；無脊椎動物（例えば、昆虫、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）に由来する細胞；真核生物寄生生物（例えば、マラリア原虫（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）；蠕虫；など）；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）に由来する細胞；哺乳動物細胞（例えば、齧歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞など）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な宿主細胞としては、天然に存在する細胞；遺伝的に改変された細胞（例えば、実験において、例えば、「人の手」によって遺伝的に改変される細胞）；ならびにインビトロでいずれかの方法で操作される細胞が挙げられる。いくつかの場合では、宿主細胞は、単離または培養される。

【0288】

任意のタイプの細胞が、目的のものであり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；任意のステージにある胚のインビトロもしくはインビボでの胚細胞（例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞などのステージのゼブラフィッシュの胚；など））。細胞は、樹立された細胞株に由来してもよいし、それらは初代細胞であってもよい。ここで「初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）」、「初代細胞株（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）」、および「初代培養物（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、被験体に由来し、培養の制限された継代（すなわち、分割）の数にわたってインビトロで増殖することを可能にした細胞および細胞培養物をいうために、本明細書で交換可能に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されていてもよいが、危機ステージ（ｃｒｉｓｉｓ ｓｔａｇｅ）を経るほど十分な回数は継代されていない培養物を含む。初代細胞系統は、インビトロで１０継代未満にわたって維持され得る。標的細胞は、多くの実施形態において単細胞生物であるか、または培養物中で増殖される。

【0289】

細胞が初代細胞である場合、このような細胞は、任意の都合の良い方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって都合良く採取され得る一方で、組織（例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃など）に由来する細胞は、生検によって最も都合良く採取される。適切な溶液が、その採取した細胞の分散または懸濁のために使用され得る。このような溶液は一般に、平衡塩類溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液など）であり、都合の良いことには、低濃度（例えば、５～２５ｍＭ）の受容可能な緩衝液とともに、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子が補充される。都合の良い緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、ホスフェート緩衝液、ラクテート緩衝液などが挙げられる。その細胞は、直ぐに使用されてもよいし、長期間貯蔵、凍結されてもよい（融解および再使用され得る）。このような場合には、その細胞は通常、このような凍結温度で細胞を保存するために、１０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％ 血清、４０％ 緩衝化培地、または当該分野で一般に使用される他の溶液の中で凍結され、凍結した培養細胞を融解するために当該分野で一般に公知の様式で融解される。

【0290】

宿主細胞への核酸の導入
本発明のポリヌクレオチド、これをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、あるいは本発明のヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９タンパク質）または脱メチル化もしくはメチル化タンパク質結合体（ＰＵＦドメイン融合物）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、種々の周知の方法のうちのいずれかによって宿主細胞へと導入され得る。

【0291】

宿主細胞に核酸を導入するための方法は、当該分野で公知であり、任意の公知の方法が、幹細胞または祖先細胞へと核酸（例えば、ベクターまたは発現構築物）を導入するために使用され得る。適切な方法としては、例えば、ウイルスもしくはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍら， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ｐｉｉ： Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９．ｄｏｉ：１０．１０１６ ／ ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照のこと）などが挙げられる。

【0292】

従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。いくつかの場合では、本発明の核酸はまた、ヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９タンパク質）および／または脱メチル化もしくはメチル化タンパク質結合体（ＰＵＦドメイン融合物）をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0293】

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、宿主細胞（または宿主細胞の集団）へと、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９タンパク質）および／または脱メチル化もしくはメチル化タンパク質結合体（ＰＵＦドメイン融合物）をコードするヌクレオチド配列を含む１またはこれより多くの核酸（例えば、ベクター）を導入する工程を包含する。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含む宿主細胞は、インビトロにある。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含む宿主細胞は、インビボにある。本発明のポリヌクレオチドおよび／またはヌクレアーゼ欠損性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９タンパク質）および／または本発明の脱メチル化もしくはメチル化タンパク質結合体（ＰＵＦドメイン融合物）をコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ここでその発現ベクターは、組換え発現ベクターであり得る。

【0294】

いくつかの実施形態において、その組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照のこと）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物などである。

【0295】

適切な発現ベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Ｌｉら， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．， ３５：２５４３－２５４９， １９９４； Ｂｏｒｒａｓら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ６：５１５－５２４， １９９９； Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：７７００－７７０４， １９９５； Ｓａｋａｍｏｔｏら， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ５：１０８８－１０９７， １９９９； ＷＯ ９４／１２６４９， ＷＯ ９３／０３７６９； ＷＯ ９３／１９１９１； ＷＯ ９４／２８９３８； ＷＯ ９５／１１９８４およびＷＯ ９５／００６５５を参照のこと）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉら， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ９：８１－８６， １９９８， Ｆｌａｎｎｅｒｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：６９１６－６９２１， １９９７； Ｂｅｎｎｅｔｔら， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７－２８６３， １９９７； Ｊｏｍａｒｙら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ４：６８３－６９０， １９９７， Ｒｏｌｌｉｎｇら， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０：６４１－６４８， １９９９； Ａｌｉら， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ５：５９１－５９４， １９９６； ＷＯ ９３／０９２３９におけるＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉら， Ｊ． Ｖｉｒ．， ６３：３８２２－３８２８， １９８９； Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら， Ｖｉｒｏｌ．， １６６： １５４－１６５， １９８８；およびＦｌｏｔｔｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： １０６１３－１０６１７， １９９３を参照のこと）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４： １０３１９－２３， １９９７； Ｔａｋａｈａｓｈｉら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７３：７８１２－７８１６， １９９９を参照のこと）に基づくウイルスベクター）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ＨＩＶウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、および乳癌ウイルス（ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）のようなレトロウイルスに由来するベクター）；など。

【0296】

多くの適切な発現ベクターは、当業者に公知であり、多くは、市販されている。以下のベクターは、例示によって提供される；真核生物宿主細胞に関して：ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、任意の他のベクターは、これが宿主細胞と適合性である限りにおいて使用され得る。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、参考としておよび全ての目的のために援用される）として公開されるベクターのうちのいずれか１つは、本明細書で提供されその実施形態を含む複合体および方法のために企図される。

【0297】

例示的有用性
本発明に従って転写を調節するための方法は、種々の適用（研究適用；診断適用；産業適用；および処置適用が挙げられるにおける用途を見出す。

【0298】

研究適用は、例えば、発生、代謝、下流遺伝子の発現などに対する標的核酸の転写を低減または増大することの効果を例えば決定することを包含し得る。

【0299】

ハイスループットゲノム分析は、本発明の転写調節方法（ここでは、本発明のポリヌクレオチドのＤＮＡ標的化配列のみが変動される必要がある一方で、結合配列（Ｃａｓ９結合配列）およびＰＢＳ配列は、（いくつかの場合では）一定に保持され得る）を使用して行われ得る。ゲノム分析において使用される複数の核酸を含むライブラリー（例えば、本発明のライブラリー）は、本発明のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここで各核酸は、異なるＤＮＡ標的化配列、共通する結合配列（Ｃａｓ９結合配列）、および共通するＰＢＳ配列を含む）を含む。チップは、５×１０^４個を超える本発明の特有のポリヌクレオチドを含み得る。

【0300】

適用は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、参考としておよび全ての目的のために援用される）として公開されるとおりの大規模表現型決定、遺伝子から機能マッピング（ｇｅｎｅ－ｔｏ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ）、およびメタゲノム分析を含む。

【0301】

本明細書で開示される本発明の方法はまた、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、参考としておよび全ての目的のために援用される）として公開されるとおりの代謝操作の分野における用途を見出し得る。

【0302】

本明細書で開示される方法はまた、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、参考としておよび全ての目的のために援用される）として公開されるとおりのコントロールの一体のネットワーク（すなわち、カスケード）をデザインするために使用され得る。

【0303】

本発明の転写調節法はまた、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１に記載され、ＷＯ２０１６１４８９９４ Ａ８（これは、参考としておよび全ての目的のために援用される）として公開されるとおりの創薬および標的検証のために使用され得る。

【0304】

本明細書で記載される例および実施形態は、例証目的に過ぎず、これらに鑑みて種々の改変または変更が、当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されるべきであることは、理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体において参考として援用される。

【実施例】

【0305】

実施例１： ４７コピーの操作されたＰｕｍｉｌｉｏ結合部位の挿入を有するｓｇＲＮＡ足場は、機能的なままである
この実施例は、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムが、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体の機能に実質的に影響を及ぼすことなしに、ｓｇＲＮＡの３’末端において少なくとも４７コピーの操作された８マーのＰｕｍｉｌｉｏホモログドメイン結合配列（ＰＢＳ）を有し得ることを示す。

【0306】

特に、ＰＢＳをｓｇＲＮＡの３’末端に追加することで、ｓｇＲＮＡ機能に影響が及ぼされるか否かを試験するために、一連の改変されたＴｅｔ標的化（ｓｇＴｅｔＯ）または非標的化コントロール（ｓｇＣｏｎｔｒｏｌ） ｓｇＲＮＡを、生成し、ＰＵＦ（３－２）（単にＰＵＦａともいわれる）［ＰＢＳ３２またはＰＢＳａ：配列番号８（５’－ＵＧＵＡＵｇＵＡ－３’）］、ＰＵＦ（６－２／７－２）（単にＰＵＦｂともいわれる）［ＰＢＳ６２７２またはＰＢＳｂ：配列番号９（５’－ＵｕｇＡＵＡＵＡ－３’）］に対する、０コピー、５コピー、１５コピー、２５コピー、および４７コピーの８マーＰｕｍｉｌｉｏホモログドメイン結合配列（ＰＢＳ）とともに生成した。図１Ａを参照のこと。ＨＥＫ２９３Ｔ／ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞株におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化させるように、これらの構築物がｄＣａｓ９－ＶＰ６４転写アクチベーターを指向する能力を試験した。

【0307】

細胞を、異なるｓｇＲＮＡ足場を有するｄＣａｓ９－ＶＰ６４でトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後に蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって分析した（図１Ｂ）。全てのコントロール非標的化ｓｇＲＮＡは、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化しなかった。その一方で、異なる数のＰＢＳを有する全てのＴｅｔ標的化ｓｇＲＮＡは、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化するようにｄＣａｓ９－ＶＰ６４を指向できた。これは、少なくとも４７コピーの８マー部位の挿入が、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４をその標的に指向するにあたってｓｇＲＮＡの活性に実質的に影響を与えないことを示す（図１Ｃ）。

【0308】

試験条件下で、ならびにＰＵＦａ－ＶＰ６４／ＰＢＳａおよびＰＵＦｂ－ＶＰ６４／ＰＢＳｂの両方に関して、ｓｇＲＮＡに追加した５～１０コピーのＰＢＳは、その標的導入遺伝子を最もよく活性化できた。その一方で、１５コピー、２０コピー、および４７コピーのＰＢＳは、わずかに低い、それでもなお実質的な導入遺伝子活性化をもたらした（図１Ｃ）。

【0309】

実施例２： 本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムは、コグネート８マー結合部位を有する操作されたＰｕｍｉｌｉｏの特性に起因して、互いにオルソゴナルである。
この実施例は、異なってプログラムされたＰＵＦドメインと、それらのコグネート８マーモチーフを有するそれらの相当するｓｇＲＮＡとの間の特異性が、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムの各々の間で独立性またはオルソゴナルであることを提供することを示す。

【0310】

ＰＵＦ（３－２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６－２／７－２）：：ＶＰ６４の融合物（これらは、それぞれ、５’－ＵＧＵＡＵｇＵＡ－３’結合部位を有するｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ３２）および５’－ＵｕｇＡＵＡＵＡ－３’結合部位を有するｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ６２７２と相互作用する）を作製し、ｄＣａｓ９とともにｔｄＴｏｍａｔｏ発現のスイッチを入れるそれらの活性を試験した。さらに、２つのさらなる対、ＰＢＳｗ（５’－ＵＧＵＡＵＡＵＡ－３’）を認識するＰＵＦｗ－ＶＰ６４およびＰＢＳｃ（５’－ＵｕｇＡＵｇＵＡ－３’）を認識するＰＵＦｃ－ＶＰ６４も構築して、それらがｄＣａｓ９とともに同じＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化する濃緑を試験した（図１Ｄ）。

【0311】

図１Ｄに示されるように、ＰＵＦ：：ＶＰ６４は、コグネート結合部位を有するｓｇＲＮＡを提供した場合にのみ、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化し得る。このことは、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムが、ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ上でのＰＵＦドメインおよびそれらの８マー結合部位の対形成に基づいて、エフェクター機能の独立性またはオルソゴナルであることを提供することを示す。印象的なことには、ＰＢＳａおよびＰＢＳｗ結合部位は、１ヌクレオチド異なるのみであるが、それらの遺伝子活性化は、標的特異的なままであり、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムの高い特異性を示す。

【0312】

実施例３： 本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムは、標的遺伝子座においてタンパク質複合体のアセンブリを可能にする
この実施例は、２またはこれより多くの異なるタンパク質構成要素を有する複合体が、ｓｇＲＮＡ上でアセンブリされ得、本発明のシステムを使用して規定の遺伝子座において機能し得ることを示す。

【0313】

具体的には、ｐ６５－ＨＳＦ１は、強力なアクチベータードメインであることが近年示された。互いに隣に配置されたＰＢＳ３２およびＰＢＳ６２７２の両方を有するｓｇＲＮＡ、ならびに２つの異なる部位を占有するＰＵＦ（３－２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６－２／７－２）：：ｐ６５－ＨＳＦ１融合物を生成した（図２Ａ）。ＰＵＦ（３－２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６－２／７－２）：：ｐ６５－ＨＳＦ１両方の共トランスフェクションは、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を誘導し、強度は、単一のアクチベーター単独のトランスフェクトから生じる蛍光強度の合計であった。これは、ＰＵＦ（３－２）およびＰＵＦ（６－２／７－２）の両方に対する結合部位有するｓｇＲＮＡが、両方のタイプの両方の融合タンパク質が標的化されたゲノム部位上でアセンブリすることを可能にすることを示す。

【0314】

近年の論文は、転写活性化ドメインとしてのＶＰ６４およびｐ６５ＨＳＦ１の両方を試験し、ｐ６５ＨＳＦ１がより強力なアクチベーターであることを見出した。これら２つの転写活性化ドメインを直接比較するために、ｐ６５ＨＳＦ１ ＰＵＦ融合物（ＰＵＦａ－ｐ６５ＨＳＦ１）およびＶＰ６４ ＰＵＦ融合物（ＰＵＦａ－ＶＰ６４）を、異なる数のＰＢＳａを有するｓｇＲＮＡを使用して、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化するために、使用した（図２Ｃ）。ＰＵＦａ－ｐ６５ＨＳＦ１は、ＰＵＦａ－ＶＰ６４の３倍まで高い活性化を提供した。活性化は、わずか１つのＰＢＳａですら観察された（以前は、ＰＵＦａ－ＶＰ６４モジュールで観察されなかった）。従って、ｐ６５ＨＳＦ１は、ＶＰ６４より強力な転写活性化ドメインであることが確認される。

【0315】

クローニング。 ベクター、それらのＡｄｄｇｅｎｅ登録へのリンクのリストを、以下の表Ｓ１に提供する。クローニングストラテジーおよび配列の詳細な説明は、以下で示される。

【0316】

Ｎ末端ＮＬＳを有するＰＵＦａ［ＰＵＦ（３－２）］およびＰＵＦｂ［ＰＵＦ（６－２／７－２）］を、これらのコード配列を含む構築物からＳｇｒＡＩおよびＰａｃＩ部位を含むプライマーで増幅し、ｐＡＣ１６４：ｐｍａｘ－ｄＣａｓ９Ｍａｓｔｅｒ＿ＶＰ６４に由来するＳｇｒＡＩ－ｄＣａｓ９－ＦｓｅＩを置き換えて、ｐＡＣ１３５５：ｐｍａｘ－ＮＬＳＰＵＦａ＿ＶＰ６４およびｐＡＣ１３５６：ｐｍａｘ－ＮＬＳＰＵＦｂ＿ＶＰ６４を作製するために使用した。ＮＬＳＰＵＦｂの反復４までの５’フラグメントおよび反復５からＮＬＳＰＵＦａの末端までの３’フラグメントとの融合ＰＣＲを使用して、ｐＡＣ１３５７：ｐｍａｘ－ＮＬＳＰＵＦｗ＿ＶＰ６４を作製した。ＮＬＳＰＵＦａの５’フラグメントとＮＬＳＰＵｂの３’フラグメントとの融合ＰＣＲを使用して、ｐＡＣ１３５８：ｐｍａｘ－ＮＬＳＰＵＦｃ＿ＶＰ６４を作製した。

【0317】

ｐ６５ＨＳＦ１アクチベーターＯＲＦを、ＦｓｅＩ ＰａｃＩ部位を有するＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１＿ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ： ６１４２３）から増幅して、ｐＡＣ１６４中のＶＰ６４を置き換え、ｐＡＣ１４１０：ｐｍａｘ－ｄＣａｓ９＿ｐ６５ＨＳＦ１を作製、ならびにｐＡＣ１３５５およびｐＡＣ１３５８中のＶＰ６４を置き換えて、それぞれ、ｐＡＣ１３９３：ｐｍａｘ－ＮＬＳＰＵＦａ＿ｐ６５ＨＳＦ１およびｐＡＣ１４１１：ｐｍａｘ－ＮＬＳＰＵＦｃ＿ｐ６５ＨＳＦ１を作製した。

【0318】

そのＦｓｅＩ－ｐ６５ＨＳＦ１－ＰａｃＩフラグメントを、ｐＡＣ１３９３から放出し、ベクターとしてのＳｇｒＡＩ－ＰａｃＩで消化したｐＡＣ１３５６およびｐＡＣ１３６０から放出されたＳｇｒＡＩ－ＮＬＳＰＵＭｂフラグメントとライゲーションして、ｐＡＣ１４１３：ＰＢ３－ｎｅｏ（－）－ｐｍａｘ－ＮＬＳＰＵＦｂ＿ｐ６５ＨＳＦ１を作製した。そのＢＦＰＫＲＡＢフラグメントを、ｐＨＲ－ＳＦＦＶ－ｄＣａｓ９－ＢＦＰ－ＫＲＡＢ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４６９１１）から増幅し、これを使用して、ｐＡＣ１３６０に由来するＣｌｏｖｅｒ配列を置き換えて、ｐＡＣ１４１４： ＰＢ３－ｎｅｏ（－）－ｐｍａｘ－ＢＦＰＫＲＡＢ＿ＮＬＳＰＵＦａを作製した。次いで、ＮｈｅＩ－ＣＡＧＧＳ－ＮＬＳＰＵＦｂ＿ｐ６５ＨＳＦ１－ＮｈｅＩフラグメントを、ｐＡＣ１４１３から増幅し、ＮｈｅＩで消化したｐＡＣ１４１４へと挿入して、ＢＦＰＫＲＡＢ－ＮＬＳＰＵＦａおよびＮＬＳＰＵＦｂ－ｐ６５ＨＳＦ１に関する二重発現ベクター（ｐＡＣ１４１４： ＰＢ３－ＮＬＳＰＵＦｂ＿ｐ６５ＨＳＦ１（－）ｎｅｏ（－）－ＢＦＰＫＲＡＢ２＿ＮＬＳＰＵＦａ）を作製した。

【0319】

改善されたリンカー配列および３つの特別のＮＬＳをＮ末端に、および１つのさらなるＮＬＳをＰＵＦのＣ末端に、ならびにＮ末端（ＳｇｒＡＩ，ＣｌａＩ）およびＣ末端（ＦｓｅＩ－ＰａｃＩ）挿入のためのクローニング部位を有する４つのゲートウェイドナーベクターを、作製した（ｐＡＣ１４０４～１４０８）。ＨＡＴ配列を、マウスＣｒｅｂｂｐ遺伝子からマウスｃＤＮＡを用いて、ＦｓｅＩ－ＰａｃＩ部位を含むプライマーで増幅し、ｐＡＣ１６４へと挿入して、ｐＡＣ１３６４： ｐｍａｘ－ｄＣａｓ９Ｍａｓｔｅｒ＿ＣＢＰＨＡＴを作製し、ｐＡＣ１４０５へと挿入して、ｐＡＣ１４１５： ｐＣＲ８－４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳ＿ＣＢＰＨＡＴを作製した。ＨＡＴ配列を、ＳｇｒＡＩ－ＡｃｌＩ部位を含む別のプライマー対で増幅し、ｐＡＣ１４０５のＳｇｒＡＩ－ＣｌａＩ部位へとクローニングして、ｐＡＣ１４１６： ｐＣＲ８－ＣＢＰＨＡＴ＿４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳを作製した。ｐＡＣ１４１５およびｐＡＣ１４１６を、ｐＡＣ９０：ｐｍａｘ－ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４８２２２）へと組み換えて、それぞれ、発現ベクターｐＡＣ１４１７： ｐｍａｘ－４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳ＿ＣＢＰＨＡＴおよびｐＡＣ１４１８： ｐｍａｘ－ＣＢＰＨＡＴ＿４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳを作製した。ＦｓｅＩ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰａｃＩフラグメントを、ｍＣｈｅｒｒｙ配列を含むプラスミドから増幅し、ＳｇｒＡＩ－ｄＣａｓ９－ＦｓｅＩでＰＢ３－ｎｅｏ（－）－ｐｍａｘへとライゲーションして、ｐＡＣ１４１９： ＰＢ３－ｎｅｏ（－）－ｐｍａｘ－ｄＣａｓ９Ｍａｓｔｅｒ＿ｍＣｈｅｒｒｙを生成した。

【0320】

ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳのための発現ベクターを、以下のように構築した： 先ず、ガイド配列のオリゴクローニングのためのＢｂｓＩおよびＰＢＳの挿入のための３’ ＢｓａＩ（ターミネーターの直ぐ上流）を有する、ｓｇＦ＋Ｅに基づくｓｇＲＮＡ足場を、ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として発注し、ｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４２２３０）へとクローニングし、ＡｆｌＩＩＩ－ＮｏｔＩ領域を置き換えて、ベクターｐＡＣ１３９４： ｐＸ－ｓｇＦＥ－ＢｓａＩ（ＡＧＡＴ）を作製した。次いで、一方の側に５’－ＡＧＡＴ－３’オーバーハングおよび他方の側に５’－ＡＴＣＴ－３’が隣接したｇｇｃ－スペーサーによって各々分離された５×ＰＢＳａ部位をコードするオリゴを、Ｔ４ＰＮＫで処理し、ＢｓａＩ（適合性のオーバーハングを作製するため）で消化したｐＡＣ１３９４へとアニールおよびライゲーションした。次いで、クローンを、異なる数のＰＢＳに関するオリゴ挿入物の１コピー（５×ＰＢＳ）、２コピー（１０×ＰＢＳ）などについてスクリーニングした。１×ＰＢＳおよび２×ＰＢＳベクターに関しては、それらを、１つのＰＢＳ部位を含むオリゴを使用して構築した。次いで、各標的に対するガイド配列を、以前に記載されたように、ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ発現ベクター上へとＢｂｓＩ部位を介してクローニングした。ＧＦＰ発現マーカーを有するｓｇＲＮＡ発現ベクターに関しては、それらを、ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ発現カセットをｐＸベクターからＰＢ－ＧＦＰベクター上へとＡｓｃＩ部位を介して移入することによって構築した。その異なるｓｇＲＮＡ発現構築物を、表Ｓ１に列挙する。

【0321】

実験用の細胞培養物。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｏｎｚａ）、４％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。インキュベーター条件は、３７℃および５％ ＣＯ_２であった。活性化実験のために、細胞を、１２ウェルプレートに１００，０００細胞／ウェルにおいて播種し、その翌日に、２００ｎｇのｄＣａｓ９構築物、１００ｎｇの改変されたｓｇＲＮＡおよび１００ｎｇのＰＵＦ融合物で、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を４８時間増殖させ、ＲＮＡ抽出または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のいずれかのために採取した。二重活性化－抑制実験のために、トランスフェクションを同じままにしたが、細胞を、１２ウェルプレートへと１５０，０００細胞／ウェルにおいて播種し、７２時間増殖させ、その後、ＦＡＣＳのために採取した。ＯＣＴ４およびＳＯＸ２二重活性化－抑制での実験のために、細胞を、ＲＮＡ抽出の前に、ＢＦＰ（アクチベーター－リプレッサーモジュールＰＵＦｂ－ｐ６５ＨＳＦ１／ＢＦＰＫＲＡＢ－ＰＵＦａに関して）、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｄＣａｓ９ｍＣｈｅｒｒｙに関して）およびＧＦＰ（ＥＧＦＰを共発現するベクター上のｓｇＲＮＡ－ＰＢＳに関して）によって三重ソートした。画像化実験のために、細胞を、２２×２２×１顕微鏡カバーグラスを有する６ウェルプレートへと、３００，０００細胞／ウェルにおいて播種し、その翌日に、５０ｎｇのｄＣａｓ９構築物、５００ｎｇの改変されたｓｇＲＮＡ、および５０ｎｇのＰＵＦ－蛍光融合物で、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、４８時間増殖させ、次いで、免疫染色した。

【0322】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析。 細胞を、トリプシンを用いて採取し、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ｄＰＢＳ）で洗浄し、１２５ｇで５分間遠心分離し、次いで、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡライブラリーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキットを使用して、１μｇのＲＮＡで作製した。ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、内因性コントロールとしてＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０３９２９０９７， ＶＩＣ）、ならびに標的としてＯＣＴ４（Ｈｓ００９９９６３２， ＦＡＭ）およびＳＯＸ２（Ｈｓ０１０５３０４９， ＦＡＭ）を使用してデザインした。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩとＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、２μｌの１：１０希釈したｃＤＮＡを各反応のために使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために使用した。活性化を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ７機器で分析した。遺伝子発現レベルを、「ΔΔＣｔ」アルゴリズムによって計算し、コントロールサンプルに対して正規化した。

【0323】

蛍光活性化セルソーティング。 細胞をトリプシン処理し、１０分間、２％ パラホルムアルデヒドで固定した。その後、その細胞を１２５ｇで５分間遠心分離し、ｄＰＢＳ中に再懸濁した。サンプルを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。数千の事象を、各実施で集めた。

【0324】

上記の実験において使用した構築物のうちのいくつかの配列、および関連する配列を、本明細書中以下に列挙する。

【化8】

上記の配列において、ＮＬＳ配列は、残基６～１２であり、ＰＵＦａ（配列番号２）は、残基１５～３６３であり、ＶＰ６４は、残基３７１～４２１である。

【化9-1】

【化9-2】

上記の配列において、ＮＬＳ配列は、残基６～１２であり、ＰＵＦｂ（配列番号３）は、残基１５～３６３であり、ＶＰ６４は、残基３７１～４２１である。

【化10】

上記の配列において、ＮＬＳ配列は、残基６～１２であり、ＰＵＦｗ（配列番号５）は、残基１５～３６３であり、ＶＰ６４は、残基３７１～４２１である。

【化11】

上記の配列において、ＮＬＳ配列は、残基６～１２であり、ＰＵＦｃ（配列番号４）は、残基１５～３６３であり、ＶＰ６４は、残基３７１～４２１である。

【0325】

実施例４： 本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システム（Ｃａｓｉｌｉｏ）およびｄＣａｓ９繋留化酵素を使用する、標的化されたＤＮＡ脱メチル化およびメチル化
単純化するために、本発明の３構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／システムは、本明細書で「Ｃａｓｉｌｉｏ」ともいわれ得る。

【0326】

Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥとＴｅｔ１エフェクターとを使用して、この実施例は、ｈＭＬＨ１転写、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてエピジェネティックにサイレントにされた遺伝子およびプロモーター領域における過剰メチル化に起因する他のがん細胞の強い活性化を示した。ｈＭＬＨ１転写の再活性化は、ＭＬＨ１タンパク質の発現（の回復）をもたらす。この実施例は、ｈＭＬＨ１プロモーター領域へのＴＥＴ１活性のＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ媒介性送達が、標的化されたＣｐＧアイランド内での強いシトシン脱メチル化を誘導することが示された。これは、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥがエピゲノムのメチルシトシンマークの編集に対する強いプラットフォームであるという概念実証を提供する。

【0327】

他方で、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥをＤｎｍｔエフェクターでＳＯＸ２プロモーターへと標的化すると、遺伝子抑制がもたらされることもまた示された。これは、指向されたＤｎｍｔ媒介性ＤＮＡメチル化が、所望の遺伝子座において遺伝子発現またはエピジェネティック状態を改変する可能性を示す。

【0328】

結果
遺伝子発現に対する特定のゲノム遺伝子座への脱メチル化酵素のＣａｓｉｌｉｏ媒介性送達の効果。特定のゲノム遺伝子座への脱メチル化酵素の送達を可能にする単純であるが効果的なツールを開発して、そのエピジェネティックメチル化状態の標的化された質の変化を可能にするために、そのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥシステムを操作した。これを、ヌクレアーゼ欠損性ｄＣａｓ９、Ｐｕｍｉｌｉｏ（ＰＵＦ）ＲＮＡ結合ドメインのための部位を含む改変されたｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ）、およびエフェクタータンパク質に融合されたＰｕｍｉｌｉｏ ＲＮＡ結合ドメインから作製されるエフェクターモジュールを使用する３構成要素Ｃａｓｉｌｉｏプラットフォームに対して確立した（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１４９１； ６２／１３２，６４４；および６２／２２１，２４９を参照のこと；Ｃｈｅｎｇ， Ａ．Ｗ．，ら， Ｃａｓｉｌｉｏ： ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－Ｐｕｍｉｌｉｏ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， ２０１６． ２６（２）： ｐ． ２５４－７（参考として援用される）もまた参照のこと）。ｄＣａｓ９は、２本鎖破壊を生じることなしに、ｓｇＲＮＡと複合体化した場合にＤＮＡを結合し、ＲＮＡプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質として働き、その特異性は、システムのｓｇＲＮＡ構成要素における配列によって決定される。ＰＵＦドメインは、ｄＣａｓ９のｓｇＲＮＡ媒介性ＤＮＡ結合に干渉することなく、ｓｇＲＮＡの３’末端に複数コピーで追加される任意の８マーＲＮＡ配列（ＰＢＳ）に結合するように、プログラムされ得る（Ｃｈｅｎｇ， Ａ．Ｗ．，ら， Ｃａｓｉｌｉｏ： ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－Ｐｕｍｉｌｉｏ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， ２０１６． ２６（２）： ｐ． ２５４－７）。ｓｇＲＮＡ上に複数コピーでＰＢＳが存在することで、ゲノム部位へのＰＵＦ－エフェクターモジュールの複数コピーの繋留が可能になり、従って、適用における任意のエフェクターモジュールへの応答の強い増幅の達成を強化する。

【0329】

特定のゲノム遺伝子座でのＣａｓｉｌｉｏ媒介性シトシン脱メチル化およびその後の遺伝子活性化を可能にするために、ＴＥＴ１－エフェクターモジュールを、残基１４１８～２１３６を含むＴＥＴ１触媒ドメイン（ＴＥＴ１（ＣＤ））へのＰＵＦａのＮ末端またはＣ末端の融合物として構築した。ｈＭＬＨ１のプロモーター領域（その過剰メチル化は、ｈＭＬＨ１発現のサイレント化を誘導することが公知である（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３））を、この研究の標的として選択した。

【0330】

ＭＬＨ１タンパク質は、細胞のメチル指向性ミスマッチ修復システムの構成要素である。ｈＭＬＨ１は、実際に、他のがん細胞と同様に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてサイレントにされているので、それらが脱メチル化媒介性遺伝子活性化を誘導する能力において、ＴＥＴ１－エフェクターを試験するために良好な細胞モデルを示す。９つのｓｇＲＮＡを、プロモーター領域の周りにデザインした。そのプロモーターのメチル化は、がん細胞においてｈＭＬＨ１のダウンレギュレーションと関連する（図３Ａ）（Ｄｅｎｇ， Ｇ．，ら， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｎ ａ ｓｍａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９９． ５９（９）： ｐ． ２０２９－３３）。

【0331】

そのシステムを試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣｔまたはＮｔ－融合ＴＥＴ１－エフェクターおよび３または２個のｓｇＲＮＡの組み合わせを含むＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトした。ｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡの相対的レベルを、トランスフェクションの６０時間後の細胞から抽出したＲＮＡおよびｑＲＴ－ＰＣＲ測定の正規化のための内因性コントロールとしてのＧＡＰＤＨを使用することによってＴａｑＭａｎアッセイで決定した。このことは、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ） Ｃ末端融合物エフェクターが、強いｈＭＬＨ１発現を回復させ、ｓｇＲＮＡｓ ３＋７の存在下でバックグラウンドを超えて１３５倍に達することを示した（図３Ｂ）。しかし、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ＰＵＦａ Ｎ末端エフェクター融合物は、その同じｓｇＲＮＡ組み合わせの存在下で、おそらく立体障害に起因して遙かに弱い活性化（最良でも２０倍）を示した。なぜならＴＥＴ１（ＣＤ）は、天然にＴＥＴ１全長タンパク質のＣ末端に位置するからである。従って、これは、特定のゲノム遺伝子座への脱メチル化酵素のＣａｓｉｌｉｏ媒介性送達が、遺伝子発現の強い質の変化を可能にすることを示す。

【0332】

ｈＭＬＨ１発現の得られたＴＥＴ１媒介性活性化と、ｈＭＬＨ１プロモーターに転写因子および転写機構を補充することによって誘導された活性化とを比較するために、ＴＥＴ１－エフェクターを、ｐ６５ＨＳＦ１－エフェクターで置き換えた。その同じｓｇＲＮＡ組み合わせを使用したところ、これは、より高い活性化を示し、バックグラウンドを超えて２００倍に達した（図３Ｂ）。これは、従って、ｈＭＬＨ１発現のＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ媒介性活性化が、強い転写アクチベーターモジュール（例えば、ｐ６５ＨＳＦ１）によって得られる活性化のうちの約７０％を達成し得ることを示し、このことは、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥが、ゲノムのメチル化状態および関連するサイレンシング活性の質を変えるために脱メチル化酵素の効率的標的化および送達を可能にする効率的ツールであることを示す。

【0333】

遺伝子発現に対する特定の遺伝子座へのｄＣａｓ９繋留化脱メチル化酵素の送達の効果。ｄＣａｓ９タンパク質への直接融合物は、特定のゲノム遺伝子座へとエフェクターを標的化するために広く使用され、ＴＥＴ１（ＣＤ）を送達して、脱メチル化および関連する遺伝子活性化を誘導するためにも近年使用されてきた（Ｍｏｒｉｔａ， Ｓ．，ら， Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｄＣａｓ９－ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ ａｎｄ ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１６； Ｘｕ， Ｘ．，ら， Ａ ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ， ２０１６． ２： ｐ． １６００９）。

【0334】

Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥとの比較において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｈＭＬＨ１発現を活性化するｄＣａｓ９－ＴＥＴ１（ＣＤ）直接融合効率を評価するために、ＴＥＴ１（ＣＤ）へのｄＣａｓ９のＮ末端およびＣ末端融合物を、構築した。Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ実験におけるようにｓｇＲＮＡの同じ組み合わせを使用したところ、ｄＣａｓ９－ＴＥＴ１（ＣＤ） Ｃ末端融合物は、ｍＲＮＡレベルにおける相対的変化によって示されるように、ｈＭＬＨ１の比較的弱い活性化を示した（図３Ｃ）。ｄＣａｓ９－ＴＥＴ１（ＣＤ）誘導性活性化は、並行した実験において同じｓｇＲＮＡ組み合わせでＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥを使用して得られた活性化の最良でも約１４％を表す（ｍＲＮＡレベルにおいて１９倍の変化 対 １３５倍の変化）。対照的に、ＴＥＴ１（ＣＤ）－ｄＣａｓ９融合物は、そのそれぞれのＣ末端融合物より遙かに弱い活性化を示した。このことは、考えられる立体障害が、ｄＣａｓ９またはＰＵＦａタンパク質のいずれかにＮ末端で融合した場合にＴＥＴ１活性化に影響を及ぼすことを示す（図３Ｂおよび３Ｃ）。

【0335】

ｄＣａｓ９－ＴＥＴ１で得られたｈＭＬＨ１活性化と、転写アクチベーターの活性化とを比較するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、同じｓｇＲＮＡ組み合わせとともに、ｄＣａｓ９－ｐ６５ＨＳＦ１でトランスフェクトした。ｍＲＮＡレベルの分析から、ｈＭＬＨ１のｄＣａｓ９－ＴＥＴ１活性化が、転写アクチベーターｄＣａｓ９融合物で得られた活性の最良でも２倍であることが示された（図３Ｃ）。従って、これは、特定の遺伝子座へのＴＥＴ１標的化が、おそらく標的部位でのエピジェネティックＤＮＡメチル化の質の変化を介して、遺伝子を活性化し得ることを示す。しかし、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥで得られたｈＭＬＨ１活性化は、ｄＣａｓ９－ＴＥＴ１（ＣＤ）直接融合物で得られる活性化より有意に効率的である。このことは、多くの生物学的および病的システムにおけるサイトカイン過剰メチル化の関わり合いを解読する有効かつ適応可能なツールとしてのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームの大きな可能性を示す。

【0336】

脱メチル化酵素のＣａｓｉｌｉｏ媒介性送達は、標的化されたゲノム遺伝子座のメチル化状態の質を変化させる。ｈＭＬＨ１転写の示されたＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ誘導性活性化が、標的化されたプロモーター領域内のＴＥＴ１媒介性シトシン脱メチル化の結果であるという証拠は、ビスルファイト変換後のｈＭＬＨ１プロモーターのＤＮＡ配列決定に由来した。ゲノムＤＮＡのビスルファイト処理は、非メチル化シトシンを脱アミノ化して、チミンとしてその後複製されるウラシルを生じる。しかし、メチル化シトシンは、ウラシルへの変換から保護されるので、直接配列決定による単一ヌクレオチド分解においてシトシンメチル化状態を決定することが可能になる。

【0337】

Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ媒介性転写活性化後のｈＭＬＨ１プロモーター領域内のＣｐＧアイランドのメチル化状態における変化を評価するために、時間的推移実験を行った。この実験では、シトシンメチル化、ならびに転写活性化、およびタンパク質発現の分析のために、トランスフェクションの３日後、４日後、５日後、および６日後に細胞を集めた。ＨＥＫ２９３Ｔを、Ｃｔ融合ＰＵＦａ－ＴＥＴ１エフェクターおよび２つのｓｇＲＮＡ（ＲＮＡガイド３および７）の組み合わせを含むＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ構成要素でトランスフェクトした。ＴａｑＭａｎアッセイから、ｈＭＬＨ１転写の活性化がこれらの一過性のトランスフェクションの過程の間に維持されることが示された（図４Ａ）。従って、これは、６日間の実験の間にｈＭＬＨ１ ｍＲＮＡレベルの持続した変化を示す。

【0338】

抽出したゲノムＤＮＡのビスルファイト処理およびその後のＰＣＲ増幅後にクローニングしたｈＭＬＨ１プロモーターＤＮＡフラグメントの配列決定から、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ標的化によって誘導されるビスルファイト変換の増大した頻度によって示されるように、ｈＭＬＨ１プロモーター内のＣｐＧのメチル化の状況の劇的変化が示された（図４Ｃ）。トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３Ｔ細胞では有意なシトシンからウラシルへの変換は得られなかったが、過剰メチル化されたＤＮＡに関して予測されたように、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、有意な脱メチル化が示され、標的化ＲＮＡの結合部位の近くで最高の活性化が観察された（図４Ｃ（矢印））。Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ媒介性脱メチル化活性は、実験の過程の間に持続され、比較的弱い活性にも拘わらず、ガイドＲＮＡの結合部位から３００ｐｂ離れて拡がったようである。

【0339】

コントロール実験では、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３細胞（そのｈＭＬＨ１プロモーターは、低メチル化され、かつ転写的に活性である）も分析した。図４Ｃ（黒の棒）に示されるように、その配列決定された領域は、予測されるように、高頻度のシトシン変換を示した。５’アザシチジン（ＡｚａＣ）薬物、インヒビターまたはシトシンメチルトランスフェラーゼで６日間処理した、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３Ｔ細胞も、分析した。これはまた、プロモーター領域内の複数のＣｐＧ部位上で増大したビスルファイト変換頻度を示した（図４Ｃ、紫の棒）。

【0340】

ＭＬＨ１タンパク質合成に対するＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ標的化の効果を決定するために、ウェスタンブロット分析を、ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞、ならびにトランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３細胞およびＡｚａＣ処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した全タンパク質に対して抗ｈＭＬＨ１モノクローナル抗体を使用して行った。その結果は、トランスフェクトした細胞が検出可能な量のＭＬＨ１タンパク質を生成し、トランスフェクション後５日目および６日目までに最高レベルに達することを示した（図４Ｂ）。しかし、トランスフェクトした細胞によって生成されたＭＬＨ１の量は、構成的にｈＭＬＨ１を発現するＨＥＫ２９３細胞によって生成されるタンパク質レベルより有意に低い。ＭＬＨ１合成のＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ媒介性誘導は、なお顕著であり、例えば、複数のガイドＲＮＡをティリング（ｔｉｌｌｉｎｇ）して、ｈＭＬＨ１発現のより良好な活性化の達成に向けてＣｐＧ脱メチル化の範囲および効率を高めることによって改善され得る。

【0341】

Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥがＴＥＴ１活性をｈＭＬＨ１プロモーター領域活性化転写へと送達するという事実を、関連するＣｐＧアイランドのメチル化状態の劇的な誘導性変化とともにまとめると、その知見は、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥがエピゲノムのメチルシトシンマークを編集する強いプラットフォームであるという概念実証を提供する。この技術は、多くの生物学的および病理学的システムにおけるメチルシトシンエピゲノムマーカーの因果関係を高分離能で対処する研究調査の新たな領域へと道を開く。

【0342】

メチルトランスフェラーゼサイレント遺伝子発現のＣａｓｉｌｉｏ媒介性送達。 プログラム可能なメチルトランスフェラーゼを、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３Ｌ、またはｄＣａｓ９のＮ末端もしくはＣ末端へのハイブリッドＤｎｍｔ３ａ－３Ｌの触媒ドメインのいずれかの直接融合物によって構築した（図５Ａ）。ｄＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ－ＰＢＳ（Ｄｎｍｔエフェクターを有するＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ；図５Ｂ）とともに使用するために、ＰＵＦａへのこれらエフェクターのＮ末端またはＣ末端融合物もまた構築した。Ｄｎｍｔ３ａ－ＰＵＦを有するＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥは、直接融合物と比較して、ＳＯＸ２遺伝子発現のより強い抑制を達成した。これは、指向されたＤＮＡメチル化のためにＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥを使用する優れた活性を示す（図６Ａおよび６Ｂ）。

【0343】

材料および方法
Ｔｅｔ１エフェクターによるＤＮＡ脱メチル化

【0344】

細胞培養およびトランスフェクション。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃および５％ ＣＯ_２に設定したインキュベーターの中で、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｏｎｚａ）、４％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。示された細胞を、新たに希釈した薬物を含む培地を毎日交換して、示されたように２．５μＭまたは５μＭの５－アザシチジン（ｓｉｇｍａ）で処理した。細胞を、１２ウェルプレートへと１５０，０００細胞／ウェルで播種し、その翌日に、１００ｎｇのｄＣａｓ９構築物、１００ｎｇの改変されたｓｇＲＮＡ構築物および２００ｎｇのＰＵＦ融合物で、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用いて製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってトランスフェクトした。ｄＣａｓ９直接融合実験では、細胞を、２００ｎｇ ｄＣａｓ９融合構築物および２００ｎｇの改変されたｓｇＲＮＡ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの６０時間後に、または示された別の方法で採取し、細胞ペレットを、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびタンパク質の抽出のために使用した。

【0345】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析。 細胞を採取し、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ｄＰＢＳ）で洗浄し、１２５×ｇにおいて５分間遠心分離し、次いで、急速凍結したペレットを、－８０℃で貯蔵した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従って抽出した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキットを使用して、２００ｎｇ～１μｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、内因性コントロールとしてＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０３９２９０９７， ＶＩＣ）を、および標的としてｈＭＬＨ１（Ｈｓ００１７９８６６， ＦＡＭ）を使用してデザインした。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩとＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、２μｌの希釈したｃＤＮＡを各反応のために使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために使用した。活性化を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ７機器で分析した。遺伝子発現レベルを、「ΔΔＣｔ」アルゴリズムによって計算し、コントロールサンプルに対して正規化した。

【0346】

ビスルファイト変換および配列決定。 ゲノムＤＮＡを、全て、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従って抽出した。そのキットは、ゲノムＤＮＡならびにＲＮＡおよび総タンパク質を同じ細胞ペレットから並行した下流分析のために抽出することを可能にする。ビスルファイト変換実験を、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔおよび抽出したゲノムＤＮＡを使用することによって、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従って行った。次いで、ビスルファイト処理したＤＮＡをテンプレートとして供して、ｈＭＬＨ１プロモーター領域全体を網羅する３５０～４００ｂｐ長の２つのＤＮＡフラグメントを、ＺｙｍｏＴａｑ ＰｒｅＭｉｘを使用して、製造業者の説明書（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従ってＰＣＲ増幅した。次いで、そのＰＣＲフラグメントを、ＳＬＩＣによってＥｃｏＲＩで直線状にしたＰＵＣ１９プラスミドへと、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用してクローニングした（Ｊｅｏｎｇ， Ｊ．Ｙ．，ら， Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２０１２． ７８（１５）： ｐ． ５４４０－３）。次いで、各サンプルにつき６個の独立した陽性クローンを、ｈＭＬＨ１プロモーター領域の個々のＣｐＧにおけるシトシンからチミンへの変換頻度を決定するために、サンガーシーケンス法（Ｓｉｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に供した。

【0347】

ウェスタンブロット分析。 細胞抽出物（３０μｇ）に由来するタンパク質を、１０％ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、次いで、１００Ｖにおいて１時間、ＳＤＳを含むＢｊｅｒｒｕｍ Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｂｕｆｆｅｒを使用してニトロセルロース膜に転写した。次いで、ＴＢＳ－Ｔ中５％ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ－Ｇｒａｄｅ Ｂｌｏｃｋｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）でブロッキングした膜を、４℃において一晩、示された抗体とともにインキュベートし、そのタンパク質バンドを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体およびＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用して、製造業者の説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って検出した。Ｇ：Ｂｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用してゲルを画像化した。

【0348】

ＤｎｍｔエフェクターによるＤＮＡメチル化

【0349】

ｄＣａｓ９発現細胞株の樹立。 トランスフェクションの前日に、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートに１２０万個の細胞／ウェルにおいて播種した。その細胞を、スーパーコイルドパッケージングプラスミド（ｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐｏｌ）、ｐＬＰ２（ｒｅｖ）、およびＶＳＶ－Ｇ（エンベロープ））およびｄＣａｓ９レンチウイルス発現プラスミドでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通じてトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に、培地を新鮮なものと交換した。トランスフェクションの２４時間後に、２ｍｌのレンチウイルスを含む培地を集め、１０分間、２，０００ｒｐｍにおいて遠心分離して、細胞デブリを辞去した。その上清を、４５μｍ孔フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用して濾過し、そのレンチウイルスを－８０℃において必要なときまで凍結した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１２ウェルプレートへと１５０，０００細胞／ウェルにおいて播種）を、５μｇ／ｍｌ ポリブレンを補充した培養培地中の５００μｌのｄＣａｓ９レンチウイルスで、１２時間形質導入し、その後、形質導入後３日目に、ブラストサイジン抗生物質で選択した。

【0350】

トランスフェクション。 ＨＥＫ２９３Ｔ、およびＨＥＫ２９３Ｔ／ｄＣａｓ９細胞株を、１２ウェルプレートへと１５０，０００細胞／ウェルにおいて播種した。細胞を、２００ｎｇのＤｎｍｔエフェクター構築物および２００ｎｇのｓｇＲＮＡ－ＰＢＳで、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、その細胞を、ＧＦＰ（ｓｇＲＮＡ発現構築物は、ＧＦＰによってマークされる）に関して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）でソートし、１２ウェルまたは２４ウェルのプレートへと再プレートした。

【0351】

定量的逆転写ＰＣＲ。 細胞を、トランスフェクションの７～１０日後に、１００μｌのトリプシン、５００μｌのＤＭＥＭ、および５００μｌのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ｄＰＢＳ）を用いて採取し、７００ｇで５分間遠心分離した。ＲＮＡを、ペレット化した細胞からＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して抽出した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキットを使用して、２μｇのＲＮＡでｃＤＮＡ合成を行った。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、内因性コントロールとしてＧＡＰＤＨを、および標的としてＳＯＸ２を用いて完了した。
配列
ＭＬＨ１およびＳＯＸ２遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡスペーサー配列のリスト

【表1-1】

【表1-2】

タンパク質配列のリスト

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

タンパク質配列のリスト

【表3-1】

【表3-2】

【0352】

実施例１１

【0353】

プログラム可能なＣａｓｉｌｉｏおよびｄＣａｓ９繋留化酵素を使用する標的化されたＤＮＡ脱メチル化およびメチル化

【0354】

ゲノムＤＮＡからのメチルシトシン（ｍＣ）の活性な削除は、ＴＥＴ１媒介性反復ｍＣ酸化、および酸化した中間体を非メチル化シトシンへとその後変換する塩基除去修復（ＢＥＲ）またはヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路を要する。興味深いことには、ｍＣ脱メチル化効率は、ＧＡＤＤ４５Ａタンパク質（Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ－Ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｌｐｈａ）、ゲノム安定性の維持、ＤＮＡ修復および細胞増殖の抑制に関与する多面的な核因子（Ｎｉｅｈｒｓ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２（４）： ２２０－２２７， ２０１２； Ｂａｒｒｅｔｏら， Ｎａｔｕｒｅ ４４５（７１２８）：６７１－６７５， ２００７； Ｓｃｈｕｅｒｍａｎｎら， ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ） ４４：９２－１０２， ２０１６）によって増強されるようである。ＧＡＤＤ４５Ａはまた、ＴＥＴ１と、およびＢＥＲ酵素チミンＤＮＡグリコシラーゼＴＤＧと相互作用することが見出された（Ｋｉｅｎｈｏｆｅｒら， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９０（１－３）：５９－６８， ２０１５； Ｌｉら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３（８）：３９８６－３９９７， ２０１５）。

【0355】

本発明者らが近年開発したＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームが標的化されたゲノム遺伝子座を脱メチル化する効率を増強するために、本発明者らは、ＴＥＴ１触媒ドメインおよびＧＡＤＤ４５Ａを特定のゲノム遺伝子座へと同時に補充することを可能にして、ｍＣ除去プロセスを簡素化することによって、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥを増強しようとした。ＴＥＴ１（ＣＤ）の近位におけるまたは標的化されたゲノム部位におけるＴＥＴ１（ＣＤ）へのタンパク質融合物としてのＧＡＤＤ４５Ａの存在は、ＴＥＴ１活性を刺激し、そして／またはＤＮＡ修復装置の重要なプレイヤーを補充して、ｍＣ酸化とＤＮＡ修復とを効率的に繋ぎ、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ二重標的化の結果は、ＴＥＴ１（ＣＤ）単独の標的化と比較して、遺伝子発現のより大きな質の変化をもたらす。

【0356】

結果

【0357】

本発明者らは、従って、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）へのプラスミドによりコードされるＧＡＤＤ４５Ａタンパク質融合物を作製し（図７Ａ）、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）単独で得られたｈＭＬＨ１活性化と比較して、ＧＡＤＤ４５Ａタンパク質融合物の各々の存在下で、ｈＭＬＨ１発現の活性化の効率を測定した。これは、６つのガイドＲＮＡの存在下でのＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターが、ｈＭＬＨ１発現の有意な活性化を示し、転写アクチベーターエフェクターｐ６５ＨＳＦ１で得られたものより３０％高いことを示した（図７Ｂおよび７Ｃ（棒３および８））。興味深いことに、ＧＡＤＤ４５Ａを、ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターへとＰＵＦａドメインを介して融合して、ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）を生成した場合、ｈＭＬＨ１発現は、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて増大した相対的発現によって示されるように、およそ９倍増強された（図７Ａおよび７Ｃ（棒３および５））。その一方で、ｈＭＬＨ１活性化は、ＧＡＤＤ４５Ａが、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターにおいてＴＥＴ１（ＣＤ）に直接融合された場合に、４倍のみ増強された（図７Ｃ（棒３および４））。これは、ＧＡＤＤＡ４５Ａが、エフェクター融合物のＮ末端に存在する場合により露出されて、ＴＥＴ１および／または下流のＤＮＡ修復活性を刺激するために必要とされる相互作用を作製することを示す。これは実際に、ＧＡＤＤ４５ＡおよびＴＥＴ１（ＣＤ）をツーインワンエフェクターとして活用すると、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ媒介性遺伝子活性化の効率がかなりブーストされるという概念実証を示す。その活性化は、ＴＥＴ１（ＣＤ）構成要素の増強された活性化および／またはｍＣ酸化と非メチル化シトシンを回復させるＤＮＡ修復経路とを効率的に繋ぐことによって媒介されるようである。

【0358】

２つの構成要素、ＧＡＤＤ４５ＡおよびＴＥＴ１（ＣＤ）をゲノム部位へと二重標的化して、そのメチル化状態および関連する遺伝子発現の質を変化させる別の方法は、そのタンパク質を、２つの独立したＰＵＦ（例えば、ＴＥＴ１（ＣＤ）に対してはＰＵＦａおよびＧＡＤＤ４５Ａに対してはＰＵＦｃ）へと融合し、その相当するＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）を含む改変されたｇＲＮＡ足場を使用することである（図７Ａ）。相当するｇＲＮＡｓ－ＰＢＳａｃの存在下でのＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびＰＵＦｃ－ＧＡＤＤ４５Ａの二重発現は、ＴＥＴ１（ＣＤ）媒介性ｈＭＬＨ１活性化の有意な刺激を示し、ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦｃは、ＰＵＦｃ－ＧＡＤＤ４５Ａ融合物と比較して、より高い活性を示した（図７Ｅ、棒４、５、６）。ＦｌａｇタグがＧＡＤＤ４５Ａ融合物に追加された場合に、類似の傾向が得られた（図７Ｅ、棒４、１１、１２）。しかし、ＧＡＤＤ４５Ａが触媒として機能しないＴＥＴ１（ＣＤ）（Ｈ１６７１Ｙ Ｄ１６７３Ａ）－ＰＵＦａ融合物の存在下で発現された場合、ｈＭＬＨ１発現は検出されなかった。これは、遺伝子活性化の得られたＧＡＤＤ４５Ａ媒介性刺激が、ＴＥＴ１の酸化的活性を必要とすることを示す。同様に、ＧＡＤＤＡ４５Ａ融合物がＴＥＴ１（ＣＤ）融合物の非存在下で発現された場合に、活性は検出されなかった。これは、ＧＡＤＤ４５Ａ単独では、その観察された遺伝子活性化が媒介されないことを示す。さらに、ＧＡＤＤ４５Ａ ＰＵＦｃ融合物がＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびＰＢＳａのみを含むｇＲＮＡと共発現された場合に、遺伝子活性化のさらなる刺激は得られなかった（図７Ｄ）。まとめると、データは、ＧＡＤＤ４５ＡのＣａｓｉｌｉｏ媒介性標的化が、ＴＥＴ１媒介性遺伝子活性化を刺激し、その刺激は、ＴＥＴ１活性、ならびにＧＲＮＡ足場を介して近位へのＧＡＤＤ４５ＡおよびＴＥＴ１（ＣＤ）の繋留の両方に依存することを示す。

【0359】

まとめると、Ｃａｓｉｌｉｏプラットフォームを使用するＴＥＴ１（ＣＤ）およびＧＡＤＤ４５Ａの二重標的化は、メチル化状態の質の変化のために必要とされるＴＥＴ１の酸化的活性を刺激しかつ非メチル化シトシンを回復させるために必要なＤＮＡ修復経路の重要なプレイヤーを標的化されたゲノム部位へと補充することをおそらく可能にするツーインワンエフェクターを提供することによって、遺伝子活性化の顕著な質の変化を可能にする。

【0360】

メチル化でサイレントにされた遺伝子の異なる活性化レベルが、その配置ならびにエフェクターＧＡＤＤ４５ＡおよびＴＥＴ１（ＣＤ）融合物のタイプを単に変化させることによって得られ得るとともに、ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）が最高の活性を与えることを指摘することは、重要である。これは、本発明者らのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームに、表現型を回復させるかまたは過剰メチル化でサイレントにされた遺伝子と関連する疾患状態を改善するために、遺伝子活性化を微細に調整して、必要とされる発現レベルに達する特有の能力を与える。

【0361】

メチル化でサイレントにされた遺伝子を活性化するためのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥ効率のＧＡＤＤ４５Ａ媒介性増強が、増大したＭＬＨ１タンパク質合成と関連するという証拠は、抗ｈＭＬＨ１モノクローナル抗体を使用する全細胞抽出物のウェスタンブロット分析に由来した。これは、ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）融合物を発現した細胞におけるＭＬＨ１タンパク質の検出可能な量を示し、ＧＡＤＤ４５Ａ－ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）は、バンド強度によって示されるように、より高いタンパク質量を示した（図７Ｄ）。これは、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて得られる刺激の種々のレベルと一致する。対照的に、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）融合物単独を発現した細胞は、これらのトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの３日後に集めた場合に、ＭＬＨ１のいかなる検出可能な量も示さなかった（本発明者らは、５日間のインキュベーションがＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）媒介性活性化に伴うＭＬＨ１の有意な量を検出するために必要であることを以前に示した（図７Ｃおよび７Ｅ））。データはともに、ＧＡＤＤ４５ＡをＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームへ付加すると、その効率が増大して、メチル化でサイレントにされた遺伝子を活性化することを示した。

【0362】

配列のリスト

【0363】

ＭＬＨ１遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡスペーサー配列およびＰＢＳａｃを有するｇＲＮＡ足場をコードする配列のリスト

【表4】

本実施例において使用されるタンパク質配列のリストを、以下に提供する。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【0364】

実施例１２ プログラム可能なＣａｓｉｌｉｏおよびｄＣａｓ９繋留化酵素を使用する標的化されたＤＮＡ脱メチル化およびメチル化
メチルシトシンは、ＣｐＧ ＤＮＡ配列のシトシン環の５位においてメチル基を共有結合的に付加するプロセスによって作製されるエピジェネティックマークである。哺乳動物細胞では、５－メチルシトシン（５ｍＣ）マークの形成は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒および維持される。脱メチル化経路（これは、メチル基を除去して非メチル化ＤＮＡを回復させる）は、タンパク質のｔｅｎ－ｅｌｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ファミリーを要する。ＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼは、５ｍＣから５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）および５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）中間体への反復性の酸化を触媒する。後者２つの中間体、５ｆＣおよび５ｃａＣは、その酸化した塩基を切断し、それを非メチル化シトシンで置き換える塩基除去修復（ＢＥＲ）装置の基質として働くようである。

【0365】

ＤＮＡグリコシラーゼは、損傷した塩基を切り出し、そして塩基を回復させるためにＢＥＲ装置によって後にプロセシングされる脱プリン／脱ピリミジン部位（ＡＰ部位）基質を生成する、初期のかつ重要な工程を触媒する。チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）ベースのＢＥＲ経路は、ＴＥＴ１媒介性活性脱メチル化に機能的に関連していた。なぜならそれらは、５ｆＣおよび５ｃａＣ上で特異的に作用し、ＮＥＩＬ１およびＮＥＩＬ２グリコシラーゼ／ＡＰ－リアーゼ活性が、ＴＤＧをＡＰ部位から置き換えて、ＢＥＲ装置の下流のプロセシングのための１本鎖ＤＮＡ破壊基質を作り出すことによって、非メチル化シトシンの回復を促進することを示したからである。

【0366】

本発明者らは、我々の元々のＣａｓｉｌｉｏプラットフォームに基づいて構築した、ＴＥＴ１活性の標的化された送達を可能にする我々が以前に開発したＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥを使用して、ＴＥＴ１およびＤＮＡグリコシラーゼエフェクターをｈＭＬＨ１プロモーター領域のＣｐＧアイランドに同時に送達し、読み出しとしてのメチル化でサイレントにされた遺伝子の活性化を使用することによって脱メチル化の効率を比較した。本発明者らは、試験したＤＮＡグリコシラーゼエフェクター、ＴＤＧ、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２およびＮＥＩＬ３の中で、ＮＥＩＬ２のみが、ｈＭＬＨ１のＴＥＴ１媒介性活性化を増強することを示した。本発明者らは、ＮＥＩＬ２が、１本鎖タンパク質融合物または別個のエフェクターのいずれかとしてＴＥＴ１と共送達された場合に、遺伝子活性化の強いブーストを得た。ＮＥＩＬ２がＴＥＴ１媒介性遺伝子活性化を増強する能力は、ＮＥＩＬ２エフェクターをプロモーター領域に標的化することを必要とした。ＴＥＴ１酸化的活性とＮＥＩＬ２グリコシラーゼ／ＡＰ－リアーゼ活性とを、単純かつプログラム可能なＣａｓｉｌｉｏプラットフォームを使用して繋ぐと、メチル化でサイレントにされた遺伝子の強い脱メチル化媒介性転写活性化が可能になり、従って、Ｃａｓｉｌｉｏプラットフォームが、前例のない特徴を、それらの関連活性の相乗効果を与えるために、独立した経路のプレイヤーの活用に対して可能にするという概念実証を提供する。この知見は、本発明者らのＣａｓｉｌｉｏ－ＭＥプラットフォームの能力を増大させ、そして重要な生物学的プロセスを研究する新たな適用の開発、およびメチル化関連疾患の新たな治療の開発への道を開く。

【0367】

結果

【0368】

ツーインワンエフェクターとしてのＴＥＴ１およびＤＮＡグリコシラーゼのＣａｓｉｌｉｏ媒介性共送達

【0369】

この研究では、本発明者らは、標的化されたゲノム遺伝子座へのＤＮＡグリコシラーゼおよびＴＥＴ１の触媒ドメイン（ＴＥＴ１（ＣＤ））の共送達が、相乗効果を有し得、ＴＥＴ１媒介性遺伝子活性化を増強し得るか否かを決定した。本発明者らは、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）へのＤＮＡグリコシラーゼタンパク質融合物をコードするＣａｓｉｌｉｏベースのプラスミドを作製した（図８Ａ、８Ｃ）。本発明者らは、次いで、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）またはＤＮＡグリコシラーゼタンパク質融合物（ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３またはＴＤＧ）をコードするプラスミドの各々のいずれかでトランスフェクトした細胞において、ｈＭＬＨ１活性化の効率を測定した。

【0370】

本発明者らは、ＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）エフェクターが、予測されるようにｈＭＬＨ１発現を活性化することを示した（図８Ｂ（白い棒））。しかし、そして本発明者らが驚いたことには、ＮＥＩＬ２エフェクター融合物のみが、ｈＭＬＨ１の増強された活性化を示した（図８Ｂ 棒４および５）。際だって対照的に、ＴＤＧ、ＮＥＩＬ１、およびＮＥＩＬ３エフェクター融合物は、ｈＭＬＨ１の活性化に対して何ら増強効果を示さなかった（図８Ｂ、Ｄ）。ＮＥＩＬ２の存在下では、ｈＭＬＨ１活性化は、ＴＥＴ１エフェクター単独で得られたものより３倍高かったのに対して、ＮＥＩＬ１、ＮＥＩＬ３およびＴＤＧでそれぞれ、全く阻害効果が得られなかったかまたは阻害効果が得られた。このデータは、ＮＥＩＬ２が（そしてＮＥＩＬ１およびＮＥＩＬ３ではない）特異的に関連する活性が、５ｍＣ削除プロセスをブーストし、より高い遺伝子活性化をもたらすことを示す。

【0371】

ＮＥＩＬ２グリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ活性で得られる相乗効果的影響を確認するために、本発明者らは、特異性に関するコントロールとして非標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含める実験を行った。図９Ａ～９Ｂに示されるように、遺伝子活性化の４倍の増大は、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて増大した相対的発現によって示されるように、ＮＥＩＬ２がＰＵＦａ－ＴＥＴ１ＣＤ融合物に存在する場合に得られた。ＮＥＩＬ２がＰＵＦａのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれに融合されたかとは無関係に、同様の活性化が得られた（図９Ａ、９Ｂ）。

【0372】

対照的に、非標的化ｇＲＮＡがｈＭＬＨ１ ｇＲＮＡに置き換わった場合には、活性は得られなかった。これは、ＭＬＨ１プロモーター領域へのエフェクターの特異的標的化が、観察される活性化のために必要とされることを示す（図９Ｂ）。これは、ツーインワンエフェクターとしてのＮＥＩＬ２およびＴＥＴ１（ＣＤ）の活用が、Ｃａｓｉｌｉｏ－ＭＥ媒介性遺伝子活性化の効率をかなりブーストするという証拠を提供する。本発明者らは、ＭＬＨ１活性化の効率において観察された獲得が、ＴＥＴ１によるｍＣ酸化をＮＥＩＬ２媒介性ＢＥＲ経路に効果的に繋いで、標的化された部位での非メチル化シトシンの回復を簡素化することによって媒介され得る可能性があると推測した。

【0373】

独立したエフェクターモジュールとしてのＴＥＴ１およびＮＥＩＬ２のＣａｓｉｌｉｏ媒介性共送達

【0374】

Ｃａｓｉｌｉｏプラットフォームを使用して、本発明者らは、ＴＥＴ１（ＣＤ）およびＮＥＩＬ２エフェクターをゲノム部位へと二重標的化して、これらの酵素を、別個のＲＮＡ配列を結合するようにプログラムされた２つの独立したＰＵＦタンパク質へと繋留する代替の方法を試験した。その目的のために、本発明者らは、ＴＥＴ１（ＣＤ）をＰＵＦａに、およびＮＥＩＬ２をＰＵＦｃに融合し、コグネートＰＵＦ結合部位（ＰＢＳａおよびＰＢＳｃ）を含む改変されたｇＲＮＡ足場を使用した（図１０Ａ）。

【0375】

ＰＢＳａ／ｃ両方を有するｇＲＮＡの存在下でのＰＵＦａ－ＴＥＴ１（ＣＤ）およびＰＵＦｃ－ＮＥＩＬ２の二重発現は、ＴＥＴ１（ＣＤ）媒介性ｈＭＬＨ１活性化の有意な刺激を示した（図１０Ｂ）。ＮＥＩＬ２は、ＰＵＦｃのいずれかの末端に融合された場合に、ＲＴ－定量的ＰＣＲによって示されるように、ｈＭＬＨ１発現において７倍の増大を示した（図１０Ｂ）。ＮＥＩＬ２媒介性刺激がエフェクターの共標的化を必要とするという証拠は、ＮＥＩＬ２およびＴＥＴ１（ＣＤ）ＰＵＦ融合物がＰＢＳａを含むが、ＰＢＳｃを欠くｇＲＮＡ足場の存在下で発現された実験に由来した（図１１Ａ）。このデータは、ＮＥＩＬ２およびＴＥＴ１エフェクターの共発現が、ｇＲＮＡがＰＢＳｃを欠いた場合にＴＥＴ１媒介性遺伝子活性化に対して影響を有しないことを示した（図１１Ｂ）。これは、その得られた相乗効果がＮＥＩＬ２の過剰発現の一般的効果に由来しないが、それらの関連活性ならびに効率的ｍＣ削除および遺伝子活性化を繋ぐことを可能にするために、ＴＥＴ１エフェクターの近位へのその標的化を必要とすることを示す。

【0376】

まとめると、本データは、ＮＥＩＬ２のＣａｓｉｌｉｏ媒介性標的化が、１本鎖融合物としてまたはＲＮＡ足場へのＰＵＦ媒介性結合を介して、近位へとＮＥＩＬ２およびＴＥＴ１を橋渡しすることを必要とする様式で、ＴＥＴ１媒介性遺伝子活性化を刺激することを明らかに示す。より高い活性化レベルが、ＮＥＩＬ２非依存的モジュールで達成された。これは、このようにして、ツーインワンまたは独立したエフェクターモジュールとしてＮＥＩＬ２／ＴＥＴ１エフェクターを使用することによって、遺伝子活性を調整するハンドルを提供する。

【0377】

要約すると、Ｃａｓｉｌｉｏプラットフォームを使用するＴＥＴ１（ＣＤ）およびＮＥＩＬ２の二重標的化は、ＴＥＴ１酸化的活性とＢＥＲのＮＥＩＬ２開始とを繋ぐことをおそらく可能にするＮＥＩＬ２エフェクターモジュールを提供することによって、遺伝子活性化の顕著な質の変化を可能にし、非メチル化シトシンを回復させるために必要なＤＮＡ修復経路の重要なプレイヤーを標的化されたゲノム部位へとその後補充することをもたらす。

【0378】

材料および方法

【0379】

細胞培養およびトランスフェクション

【0380】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃および５％ ＣＯ_２に設定したインキュベーターの中で、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｏｎｚａ）、４％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。細胞を、１２ウェルプレートへと１５０，０００細胞／ウェルにおいて播種し、その翌日に、１００ｎｇのｄＣａｓ９構築物、１００ｎｇの改変されたｓｇＲＮＡ構築物および２００ｎｇのＰＵＦ融合物で、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬を用いて製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの３日後に、または示された別の方法で採取し、細胞ペレットを、ＲＮＡ抽出のために使用した。

【0381】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析

【0382】

細胞を採取し、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ｄＰＢＳ）で洗浄し、１２５×ｇにおいて５分間遠心分離し、次いで、急速凍結したペレットを、－８０℃で貯蔵した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従って抽出した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキットを使用して、２００ｎｇ～２μｇのＲＮＡでｃＤＮＡライブラリーを作製した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、内因性コントロールとしてＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０３９２９０９７， ＶＩＣ）を、および標的としてｈＭＬＨ１（Ｈｓ００１７９８６６， ＦＡＭ）を使用してデザインした。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩとＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、２μｌの希釈したｃＤＮＡを各反応のために使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために使用した。活性化を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ７機器で分析した。遺伝子発現レベルを、、「ΔΔＣｔ」アルゴリズムによって計算し、コントロールサンプルに対して正規化した。

【0383】

配列

【0384】

ｈＭＬＨ１遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡスペーサー配列ならびにＰＢＳａおよびＰＢＳｃを有するｇＲＮＡ足場をコードする配列のリスト

【表6】

タンパク質配列のリスト

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【表7-4】

【表7-5】

【表7-6】

【表7-7】

参考文献

【0385】

Barreto G., Schafer A., Marhold J., Stach D., Swaminathan S.K., Handa V., Doderlein G., Maltry N., Wu W., Lyko F., Niehrs C. Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation. Nature. 2007;445:671－675.

【0386】

Le May N., Mota-Fernandes D., Velez-Cruz R., Iltis I., Biard D., Egly J.M. NER factors are recruited to active promoters and facilitate chromatin modification for transcription in the absence of exogenous genotoxic attack. Mol. Cell. 2010;38:54－66

【0387】

Schmitz K.M., Schmitt N., Hoffmann-Rohrer U., Schafer A., Grummt I., Mayer C. TAF12 recruits Gadd45a and the nucleotide excision repair complex to the promoter of rRNA genes leading to active DNA demethylation. Mol. Cell. 2009;33:344－353

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【0389】

Maiti A., Drohat A.C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 2011;286:35334－35338.

【0390】

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【0391】

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【0392】

Kienhofer, S., et al., GADD45a physically and functionally interacts with TET1. Differentiation, 2015. 90(1-3): p. 59－68.

【0393】

Muller, U., et al., TET-mediated oxidation of methylcytosine causes TDG or NEIL glycosylase dependent gene reactivation. Nucleic Acids Res, 2014. 42(13): p. 8592－604.

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2AB】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5AB】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7CD】

【図7E】

【図8AB】

【図8CD】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

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