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▶ ウォーグ ファーマシューティカルズ（ハンジュウ）カンパニー，リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-25
(45)【発行日】2022-05-09
(54)【発明の名称】アレルゲンの断片を含むポリペプチド構築物
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20220426BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20220426BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20220426BHJP
C07K 14/02 20060101ALI20220426BHJP
C07K 14/005 20060101ALI20220426BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220426BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220426BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220426BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220426BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220426BHJP
A61K 39/385 20060101ALI20220426BHJP
A61K 39/36 20060101ALI20220426BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220426BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220426BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/415
C12N15/29
C07K14/02
C07K14/005
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/385
A61K39/36
A61P37/08
C12N15/62 Z
【請求項の数】
27
(21)【出願番号】P 2019536695
(86)(22)【出願日】2017-09-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-12-12
(86)【国際出願番号】 EP2017073808
(87)【国際公開番号】W WO2018054993
(87)【国際公開日】2018-03-29
【審査請求日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】16189774.9
(32)【優先日】2016-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】521165220
【氏名又は名称】ウォーグ ファーマシューティカルズ（ハンジュウ）カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ホーホラトル，モニカ
(72)【発明者】
【氏名】ストルツ，フランク
(72)【発明者】
【氏名】ノイバウアー，アンジェラ
(72)【発明者】
【氏名】ヘニング，ライナー
(72)【発明者】
【氏名】ババエフ，エリヤフ
【審査官】池上 京子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２０７９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】EbioMedicine，2016年，vol.11，p.43-57
【文献】J Allergy Clin Immunol，2015年，vol.135, no,5，p.1207-1217
【文献】J Immunol，2013年，vol.190，p.3068-3078
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ ２１／００－２１／０８
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントを含むポリペプチド構築物であって、少なくとも２つの断片の各々は２０から５０個のアミノ酸残基からなり、少なくとも１つの断片は成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０に由来し、少なくとも１つの断片は成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基に由来し、
Ａｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンが、Ａｍｂ ａ １．０１０１、Ａｍｂ ａ １．０２０１、Ａｍｂ ａ １．０２０２、Ａｍｂ ａ １．０３０１、Ａｍｂ ａ １．０３０２、Ａｍｂ ａ １．０３０３、Ａｍｂ ａ １．０３０４、Ａｍｂ ａ １．０３０５、Ａｍｂ ａ １．０４０１、Ａｍｂ ａ １．０４０２、Ａｍｂ ａ １．０５０１およびＡｍｂ ａ １．０５０２からなる群から選択され、
成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基に由来する少なくとも１つの断片が、成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４３～２５３から３６７～３７３を含み、
少なくとも２つの断片が、担体タンパク質と融合しているか、またはコンジュゲートしている、ポリペプチド構築物。
【請求項2】
Ａｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンが、Ａｍｂ ａ １．０１０１、Ａｍｂ ａ １．０２０１、Ａｍｂ ａ １．０３０５またはＡｍｂ ａ １．０４０１である、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項3】
成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０に由来する少なくとも１つの断片が、成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から２０～４０、好ましくはアミノ酸残基１から２５～３５、より好ましくはアミノ酸残基１から２８～３０を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド構築物。
【請求項4】
少なくとも２つの断片が、２５から４５個、好ましくは２５から４０個、より好ましくは２６から３５個、より好ましくは２８から３４個のアミノ酸残基からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項5】
ＡＥＤＬＱＥＩＬＰＶＮＥＴＲＲＬＴＴＳＧＡＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号２）、ＡＥＤＬＱＱＩＬＰＳＡＮＥＴＲＳＬＴＴＸ２ＧＴＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号３）、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳＶＮＥＴＲＳＬＱＡＸ２ＥＡＹＮＩＩＤＫＸ１（配列番号４）、ＡＥＤＶＥＥＦＬＰＳＡＮＥＴＲＲＳＬＫＡＸ２ＥＡＨＮＩＩＤＫＸ１（配列番号５）およびそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０に由来する少なくとも１つのアレルゲン断片を含み、Ｘ１は、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ２は、システインまたはセリンである、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項6】
Ｘ３ＲＸ４ＧＦＸ５ＱＶＶＮＮＮＹＸ６Ｘ７ＷＧＸ８ＹＡＸ９ＧＧＳＸ１０Ｘ１１ＰＴＩＬ（配列番号６）およびそれと少なくとも７０％の同一性を有するそのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端に由来する少なくとも１つの断片を含み、Ｘ３は、システイン、セリン、ロイシンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ４は、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ５は、フェニルアラニンまたはバリンであり、Ｘ６は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘ７は、アルギニンまたはリシンであり、Ｘ８は、トレオニンまたはセリンであり、Ｘ９は、イソロイシンまたはロイシンであり、Ｘ１０は、セリンまたはアラニンであり、Ｘ１１は、グリシン、セリンまたはアラニンである、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項7】
Ｘ１２ＤＰＶＬＴＰＸ１３ＱＸ１４ＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ１９（配列番号７）およびそれと少なくとも７０％の同一性を有するそのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端に由来する少なくとも１つの断片を含み、Ｘ１２は、セリンまたはバリンであり、Ｘ１３は、バリンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１４は、セリン、リシンまたはアスパラギンであり、Ｘ１５は、アラニンまたはセリンであり、Ｘ１６は、バリンまたはアラニンであり、Ｘ１７は、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ１８は、セリン、リシンまたはアルギニンであり、Ｘ１９は、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在しない、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項8】
Ｘ２０ＲＨＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＫＷＧＳＹＡＩＧＧＳＡＳＰＴＩＬ（配列番号８）、Ｘ２１ＲＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩＬ（配列番号９）、ＶＤＰＶＬＴＰＥＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＳＡＬＳＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２２（配列番号１０）およびＳＤＰＶＬＴＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２３（配列番号１１）からなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端に由来する少なくとも１つの断片を含み、Ｘ２０およびＸ２１は、独立して、システイン、ロイシン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ２２およびＸ２３は、独立して、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在しない、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項9】
担体タンパク質が、５０から３００個、好ましくは６０から２５０個、より好ましくは８０から２００個、より好ましくは１００から２００個のアミノ酸残基からなるウイルスタンパク質またはその断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項10】
ウイルスタンパク質がカプシドタンパク質である、請求項９に記載のポリペプチド構築物。
【請求項11】
ウイルスタンパク質がヘパドナウイルス科のウイルスに由来する、請求項９または１０に記載のポリペプチド構築物。
【請求項12】
ヘパドナウイルス科のウイルスがＢ型肝炎ウイルスである、請求項１１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項13】
Ｂ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質が、ＰｒｅＳ、ＰｒｅＳｌまたはＰｒｅＳ２である、請求項１２に記載のポリペプチド構築物。
【請求項14】
少なくとも２つのアレルゲン断片が、担体タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端と融合している、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項15】
前記少なくとも２つの断片のうちの少なくとも１つが担体タンパク質のＮ末端と融合しており、前記少なくとも２つの断片のうちの少なくとも１つが担体タンパク質のＣ末端と融合している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項16】
１から１０個、好ましくは２から８個、より好ましくは３から６個の、担体タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端と融合した断片を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項17】
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項18】
ブタクサ花粉アレルギーの予防または治療における使用のための請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項19】
少なくとも２つの断片が担体タンパク質と融合している、請求項１から１８のいずれか一項に定義されるポリペプチド構築物をコードする核酸分子。
【請求項20】
請求項１９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項21】
発現ベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項22】
細菌、真菌、昆虫、ウイルスまたは哺乳動物ベクターである、請求項２０または２１に記載のベクター。
【請求項23】
請求項１９に記載の核酸分子、または請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項24】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチド構築物、請求項１９に記載の核酸分子、または請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクターを含むワクチン製剤。
【請求項25】
ブタクサ花粉アレルギーの治療または予防における使用のための請求項２４に記載のワクチン製剤。
【請求項26】
１０ｎｇから１ｇ、好ましくは１００ｎｇから１０ｍｇ、特に０．５μｇから２００μｇの前記ポリペプチド、核酸分子またはベクターを含む、請求項２４または２５に記載のワクチン製剤。
【請求項27】
少なくとも１種のアジュバント、薬学的に許容される賦形剤および／または防腐剤をさらに含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アレルゲン、好ましくはＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのアレルゲンによって引き起こされるアレルギーまたはアレルギー反応の治療または予防に使用されるワクチンの分野である。
【背景技術】
【0002】
世界中で３６００万人を超える人がブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）アレルギーに罹患している。高いアレルゲン性およびこの植物が新たな地理的地域に定着する高い可能性のために、患者の数は急速に増加している。鼻漏、くしゃみ、かゆみおよび結膜炎などの随伴症状は、生活の質に多大な影響を与える。驚くべきことに、ブタクサアレルギー患者の４０～５０％が喘息症状を発生するという事実もある。症状に対抗する薬物の他に、アレルゲン抽出物に基づいたアレルゲン特異的免疫療法（ＳＩＴ）のみが利用可能である。患者にとって大変残念なことに、この免疫療法は、慎重な用量増加（ｕｐｄｏｓｉｎｇ）が要求される多くの回数の注射を必要とし、致命的なアナフィラキシーを含む重度のＩｇＥ媒介性およびＴ細胞媒介性副作用を引き起こす可能性がある。新たな疾患修飾療法手法が緊急に必要であることが示唆される。
【0003】
国際公開第９３／０００７７号は、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのアレルゲンを含む治療用組成物を開示している。これらの組成物は、ブタクサアレルギーを患っている患者の経口治療に使用することができる。
【0004】
国際公開第９６／０１３５８９号において、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのアレルゲンの断片を含む医薬品が記載されている。
【0005】
また、国際公開第２００８／０９８７４９号は、これらのアレルゲンによって引き起こされるアレルギーの治療に使用することができるＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａアレルゲンの断片を開示している。
【0006】
国際公開第２０１３／００１３６２号は、主要なＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａアレルゲンである、Ａｍｂ ａ １に由来する複数の重複断片を含む組成物に関する。これらの断片はＡｍｂ ａ １アレルゲン全体を含むが、成熟Ａｍｂ ａ １分子のＮ末端を含まない。
【0007】
国際公開第２００１／０３５９９１号および国際公開第２００６／０９６４９７号において、免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含むポリヌクレオチドおよびＡｍｂ ａ １またはその抗原断片であり得る抗原を含むコンジュゲートが記載されている。
【0008】
国際公開第２００４／０００３５１号は、動物における免疫応答を増強するための組成物に関し、これらの組成物は、ウイルス様粒子、免疫刺激物質およびＡｍｂ ａ １のようなアレルゲンであり得る抗原を含む。
【0009】
国際公開第２０１０／０１８３７８号において、Ａｍｂ ａ １に由来するＴ細胞反応性断片が開示されている。これらの断片は、寛容化によってブタクサに対するアレルギーを予防または治療する際に使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】国際公開第９３／０００７７号
【文献】国際公開第９６／０１３５８９号
【文献】国際公開第２００８／０９８７４９号
【文献】国際公開第２０１３／００１３６２号
【文献】国際公開第２００１／０３５９９１号
【文献】国際公開第２００６／０９６４９７号
【文献】国際公開第２００４／０００３５１号
【文献】国際公開第２０１０／０１８３７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
患者においてアレルギーを治療または予防するために使用される公知のワクチンのほとんどは、個体に投与されたときに望ましくないＩｇＥ反応を示すか、またはアレルギー反応を効果的に予防することができる免疫応答を誘導することができない。
【0012】
したがって、本発明の目的は、ブタクサアレルギーを患っている個体を治療するためのポリペプチド構築物およびこのような構築物を含む調製物を提供することである。この調製物は、ブタクサ花粉曝露に対するアレルギー反応を予防し、ＩｇＥ媒介性副作用ならびにＩｇＥ反応性の低下およびアレルゲン特異的Ｔ細胞の活性化の低下による後期副作用を取り除くことができるはずである。さらに、これらの調製物は、治療に対する患者のコンプライアンスおよび順守を確実にするために、少ない回数の注射のみを患者に投与して長期間の利益を達成することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【0013】
Ａｍｂ ａ １はブタクサ花粉の主要なアレルゲンとして同定されている（Ｒａｆｎａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１９９１年）：１２２９～１２３６頁）。いくつかのＡｍｂ ａ １アイソフォームがブタクサ花粉に存在する。それらの配列は、遺伝子またはタンパク質データベース（例えば、ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｏｍｅ．ｏｒｇ、ＧｅｎＢａｎｋ）に記載され、開示されている。
【0014】
本発明は、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントを含むポリペプチド構築物であって、少なくとも２つの断片の各々は２０から５０個のアミノ酸残基からなり、少なくとも１つの断片は成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０に由来し、少なくとも１つの断片は成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基に由来する、ポリペプチド構築物に関する。
【0015】
上述の断片を含むポリペプチド構築物は、個体に投与されると、それぞれのアレルゲンとのアレルゲン特異的ＩｇＥ分子の結合を効果的に遮断できるＩｇＧ抗体の発現を誘導することが判明した。この阻害により、肥満細胞および好塩基球のＩｇＥ媒介性脱顆粒が阻止されるか、または少なくとも実質的に阻害される。
【0016】
本発明の別の態様は、本明細書に定義されるポリペプチド構築物をコードする核酸分子に関する。
【0017】
本発明のさらなる態様は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。
【0018】
本発明のさらに別の態様は、本発明による核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【0019】
本発明のさらなる態様は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド構築物、核酸分子またはベクターを含むワクチン製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】Ａｍｂ ａ １．０３０５のアミノ酸配列（配列番号１）およびその断片を示す図である。
【図2】ＩｇＥ ＥＬＩＳＡを用いて測定した図１の断片のＩｇＥ反応性を示す図である。対照として、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａの抽出物から精製した天然Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）および組換えにより産生したＡｍｂ ａ １（ｒＡｍｂ ａ １；図１に示した配列）を使用した。
【図5】ＩｇＥ ＥＬＩＳＡを用いて測定した図４Ａおよび４Ｂの構築物のＩｇＥ反応性を示す図である。Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａの抽出物から精製したＡｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）を対照として使用した。
【図6】阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。水酸化アルミニウム（ミョウバン）によりアジュバント化した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）図４Ａおよび４Ｂのポリペプチド構築物により免疫化したウサギの血清中に含まれる抗体は、分子を用いた阻害ＥＬＩＳＡにおいて阻害剤として使用した場合、ブタクサアレルギー個体由来のアレルゲン特異的ＩｇＥの、Ａｍｂ ａ １との結合を阻害することができる。野生型Ａｍｂ ａ １（ｒＡｍｂ ａ １、ｎＡｍｂ ａ １）により免疫化したウサギ由来の血清により得られたＩｇＥ結合の阻害を、対照として実験に含めた。
【図7】図６に示したものと同様の阻害ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す図である。阻害剤血清（すなわち、ポリペプチド構築物および対照としての野生型Ａｍｂ ａ １により免疫化したウサギ由来の血清）を、１：１０から１：１００の範囲の希釈により滴定した。阻害血清に存在するアレルゲン特異的抗体は患者のＩｇＥの結合を阻害することができる。各希釈における左から右の柱は、構築物Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ６および組換えＡｍｂ ａ １のそれぞれをウサギにワクチン接種することによって得られた血清を用いて得られた結果を示す。
【図9A】ポリペプチド構築物Ｋ４ＡおよびＫ４Ｂにより免疫化したウサギから得られた血清が、ブタクサアレルギー患者のＩｇＥの、アイソフォームＡｍｂ ａ １．０３０５（図９Ａ）ならびにＡｍｂ ａ １．０１０１および１．０４０１（図９Ｂ）との結合を阻害する能力を示す図である。
【図9B】ポリペプチド構築物Ｋ４ＡおよびＫ４Ｂにより免疫化したウサギから得られた血清が、ブタクサアレルギー患者のＩｇＥの、アイソフォームＡｍｂ ａ １．０３０５（図９Ａ）ならびにＡｍｂ ａ １．０１０１および１．０４０１（図９Ｂ）との結合を阻害する能力を示す図である。
【図10-1】野生型Ａｍｂ ａ １と比較した、ポリペプチド構築物Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５およびＫ６、ならびに構築物Ｋ４Ａ、Ｋ４Ｂ、Ｋ４Ｃ、Ｋ４ＤおよびＫ４Ｅのアレルゲン可能性を試験する好塩基球活性化アッセイ（ＢＡＴアッセイ）の結果を示す図である。
【図11A】単一ペプチドおよびこれらの血清の混合物によりウサギを免疫化することによって得られた血清を使用した阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ミョウバンによりアジュバント化した実施例１（図１１Ａ）のペプチド１から５および７から１１により免疫化したウサギの血清中に含まれる抗体（したがって、上述のペプチドに対する抗体を含む）、ならびにペプチド１＋９＋１１、２＋９＋１１、８＋９＋１１、３＋４＋５、５＋７＋８、１＋９＋１０＋１１（図１１Ｂ）およびペプチド２＋１１、１＋２、１＋８および１＋１１（図１１Ｃ）のそれぞれに対する抗体を含有するこれらの血清の混合物は、Ａｍｂ ａ １に対するブタクサアレルギー個体由来のアレルゲン特異的ＩｇＥの結合を阻害することができる。野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）により免疫化したウサギ由来の血清を用いて得られたＩｇＥ結合の阻害を、対照として実験に含めた。
【図11B】単一ペプチドおよびこれらの血清の混合物によりウサギを免疫化することによって得られた血清を使用した阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ミョウバンによりアジュバント化した実施例１（図１１Ａ）のペプチド１から５および７から１１により免疫化したウサギの血清中に含まれる抗体（したがって、上述のペプチドに対する抗体を含む）、ならびにペプチド１＋９＋１１、２＋９＋１１、８＋９＋１１、３＋４＋５、５＋７＋８、１＋９＋１０＋１１（図１１Ｂ）およびペプチド２＋１１、１＋２、１＋８および１＋１１（図１１Ｃ）のそれぞれに対する抗体を含有するこれらの血清の混合物は、Ａｍｂ ａ １に対するブタクサアレルギー個体由来のアレルゲン特異的ＩｇＥの結合を阻害することができる。野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）により免疫化したウサギ由来の血清を用いて得られたＩｇＥ結合の阻害を、対照として実験に含めた。
【図11C】単一ペプチドおよびこれらの血清の混合物によりウサギを免疫化することによって得られた血清を使用した阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ミョウバンによりアジュバント化した実施例１（図１１Ａ）のペプチド１から５および７から１１により免疫化したウサギの血清中に含まれる抗体（したがって、上述のペプチドに対する抗体を含む）、ならびにペプチド１＋９＋１１、２＋９＋１１、８＋９＋１１、３＋４＋５、５＋７＋８、１＋９＋１０＋１１（図１１Ｂ）およびペプチド２＋１１、１＋２、１＋８および１＋１１（図１１Ｃ）のそれぞれに対する抗体を含有するこれらの血清の混合物は、Ａｍｂ ａ １に対するブタクサアレルギー個体由来のアレルゲン特異的ＩｇＥの結合を阻害することができる。野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）により免疫化したウサギ由来の血清を用いて得られたＩｇＥ結合の阻害を、対照として実験に含めた。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明のポリペプチド構築物は、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントを含み、少なくとも２つの断片の各々は２０から５０個のアミノ酸残基からなり、少なくとも１つの断片は成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０に由来し、少なくとも１つの断片は成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基に由来する。
【0022】
驚くべきことに、個体に投与すると、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンのＮ末端由来の少なくとも１つの断片およびＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンのＣ末端由来の少なくとも１つの断片を含む本発明のポリペプチド構築物が、アレルゲン特異的ＩｇＥ分子のアレルゲンとの結合を効果的に遮断することができるＩｇＧ分子の形成を誘導することができることが判明した。明らかに、成熟アレルゲンのＮ末端およびＣ末端由来の断片の存在は、主張した驚くべき効果を得るために必要とされる。
【0023】
本明細書に使用する場合、「ポリペプチド構築物」とは、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントを含むコンジュゲートまたは融合タンパク質を指す。本発明のポリペプチド構築物は、他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、担体タンパク質）または少なくとも２つの断片に隣接する他の化学部分を含んでもよい。
【0024】
本明細書に使用する場合、「Ａｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲン」という用語は、Ａｍｂ ａ １の既知のアイソフォームの群を指す。これは、特に、アイソフォームＡｍｂ ａ １．０１０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６５）、Ａｍｂ ａ １．０２０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６６）、Ａｍｂ ａ １．０２０２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９８７）、Ａｍｂ ａ １．０３０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６８）、Ａｍｂ ａ １．０３０２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２７７６１バリアントＬ４８Ｙ）、Ａｍｂ ａ １．０３０３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６９）、Ａｍｂ ａ １．０３０４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９８８）、Ａｍｂ ａ １．０３０５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９８９）、Ａｍｂ ａ １．０４０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６７０）、Ａｍｂ ａ １．０４０２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９９３）、Ａｍｂ ａ １．０５０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６７１）およびＡｍｂ ａ １．０５０２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９９５）を含む。したがって、「Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲン」は、成熟アレルゲンがアイソフォームの上記の同定された群から選択されることを意味する。
【0025】
本明細書に使用する場合、「コンジュゲート」という用語は、少なくとも２つのコンジュゲーションパートナーの、別のパートナーとの共有結合の結果として形成される分子を指すことを意図する。本発明の「コンジュゲート」は、本発明の少なくとも２つの断片を含む。２つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の間のコンジュゲーションは、例えば、コンジュゲーションパートナーの１つに付加されたＮ末端システインまたはＣ末端システインアミド残基を介して達成され、遊離スルフヒドリル基を含有する分子を生じる。前記末端システイン残基に、任意のマレイミド活性化ポリペプチドまたはタンパク質がコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションパートナーが末端にシステイン残基を有しない場合、アミン（リシン）またはカルボン酸（グルタミン酸、アスパラギン酸または５’－リン酸）をコンジュゲーションパートナーにカップリングするためにＥＤＣ（ｌ－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）化学物質が利用され得る。次いでペプチドと担体との間の架橋が、例えば、ＭＢＳ（ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）カップリング剤により行われる。
【0026】
少なくとも２つの断片が、アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体の形成をより効果的に誘導することを可能にするコンジュゲーション産物を得るために、担体タンパク質にカップリングされ得る。例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシもしくはヒト血清アルブミンが担体タンパク質として使用され得る。オボアルブミン、チログロブリン、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドのような他の担体タンパク質もまた、使用され得る。
【0027】
本発明のポリペプチド構築物はまた、融合タンパク質であってもよい。本明細書に使用する場合、「融合タンパク質」とは、アレルゲン断片および／または他のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドが、単一および特有の１つの組換えポリペプチド鎖として発現され、調製されるタンパク質またはポリペプチドを指す。
【0028】
成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片は、直接またはリンカーを介してのいずれかで、互いにおよび／または他のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。このようなリンカーは、ペプチドもしくはポリペプチドまたはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に共有結合することができる任意の他の化学部分であってもよい。
【0029】
本明細書に使用する場合、「成熟アレルゲンの」および「成熟アレルゲンに由来する」という用語は、本発明による断片のアミノ酸配列が、断片化または切断によってアレルゲンのアミノ酸配列から得られることを意味する。したがって、少なくとも２つの断片は、それらが由来する成熟アレルゲンの２０から５０個の連続したアミノ酸残基からなる。
【0030】
本明細書に定義する場合、「成熟アレルゲン」とは、シグナルペプチドを欠く処理されたアレルゲンのアミノ酸配列を指す。アレルゲン自体は、依然としてシグナルペプチドを含有するそれぞれの遺伝子によってコードされる。アレルゲンのシグナルペプチドは、配列アラインメントを含む当該分野において公知の方法によって同定され得る（例えば、Ｂｅｎｄｔｓｅｎ ＪＤら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３４０（２００４年）：７８３～９５頁；Ｂｊｏｅｒｋｌｕｎｄ ＡＫら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１（２００５年）：３９～５０頁を参照のこと）。成熟アレルゲンのアミノ酸配列を同定する簡単な方法は、アレルゲン源から成熟アレルゲンを単離し、そのＮ末端を配列決定することである。これらの配列データは、成熟アレルゲンおよびシグナルペプチドのアミノ酸配列を同定するために同じアレルゲンをコードする遺伝子またはｍＲＮＡの配列と比較することができる。したがって、「成熟アレルゲン」の配列は、そのｍＲＮＡおよび／または遺伝子によってコードされ、シグナルペプチドの可能な切断とは別に、一次翻訳ｍＲＮＡまたは遺伝子産物の翻訳後修飾によって得られる可能性がある切断産物を含まない。「成熟アレルゲン」は、シグナルペプチドを欠くｍＲＮＡ分子によってコードされるアミノ酸配列を反映する。
【0031】
本発明によれば、ポリペプチド構築物は、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントを含んでもよい。断片の数は、２から２０まで、好ましくは２から１９まで、より好ましくは２から１８まで、より好ましくは２から１７まで、より好ましくは２から１６まで、より好ましくは２から１５まで、より好ましくは２から１４まで、より好ましくは２から１３まで、より好ましくは２から１２まで、より好ましくは２から１１まで、より好ましくは２から１０まで、より好ましくは２から９まで、より好ましくは２から８まで、より好ましくは２から７まで、より好ましくは２から６まで、より好ましくは２から５まで変化し得る。本発明のポリペプチド構築物に使用される断片は、成熟アレルゲンにおいて互いに隣接して位置していないこと、および同じアミノ酸配列からならない少なくとも２つの断片が選択されることが特に好ましい。しかしながら、同じ断片の１つより多いコピーが本発明のポリペプチド構築物に存在する場合、この構築物は、別のアミノ酸配列からなる本明細書に定義される少なくとも１つのさらなる断片を含む必要がある。
【0032】
本発明のポリペプチド構築物は、同じ断片の１つまたは複数のコピーを含んでもよい。本発明のポリペプチド構築物は、同じ断片の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つのコピーを含むことが特に好ましい。本発明の特に好ましい実施形態において、ポリペプチド構築物は、同じ断片の３つ、４つ、５つまたは６つ、好ましくは４つのコピーを含む。
【0033】
さらに、本発明のポリペプチド構築物はまた、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａの成熟アレルゲンの断片のバリアントを含んでもよい。これらのバリアントは、特に好ましい１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【0034】
本発明のバリアントは「保存的」置換を有してもよく、置換アミノ酸は類似の構造的または化学的特性を有する。保存的アミノ酸置換の１つの種類は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリンおよびアスパラギン－グルタミンである。本発明のバリアントはまた、「非保存的」置換（例えば、グリシンのトリプトファンによる置き換え）を有してもよい。また、同様の微細な変化には、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方が含まれ得る。本明細書に記載されるペプチドおよび分子のバリアントは、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満の変化（置換、欠失および挿入のいずれかに関わらず）を有する。
【0035】
成熟アレルゲンの断片の特に好ましいバリアントは、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンに天然に存在する１つまたは複数のシステイン残基の置換または欠失を含む。これらのシステイン残基の１つまたは複数は、任意の他のアミノ酸残基で置換されてもよく、システイン残基がセリンで置換されることが特に好ましい。あるいは、断片のバリアントのシステイン残基の１つまたは複数は欠失される。驚くべきことに、減少した数（欠失または置換された）のシステイン残基を有するか、またはほとんどもしくは全てのシステイン残基を欠いている断片は、依然として全てまたはほぼ全ての天然に存在するシステイン残基を含む非修飾断片と比較して、さらに高いＩｇＥ阻害を示すことが判明した。
【0036】
本発明のポリペプチド構築物の少なくとも２つの断片が低アレルギー特性を示すことが特に好ましい。本明細書に使用する場合、「低アレルギー性」という用語は、個体に投与されると、減少したアレルギー反応を誘導するか、またはアレルギー反応を誘導しない、本発明の断片の能力を指す。断片またはポリペプチド構築物が低アレルギー性であるかどうかをどのように決定するかについて当該分野において公知の方法が存在する。例えば、ポリペプチドまたは断片のＩｇＥ反応性は、ブタクサアレルギー個体由来の血清を使用してＥＬＩＳＡによって測定することができ、野生型アレルゲンのＩｇＥ反応性と比較することができる。低アレルギー性断片は、野生型アレルゲンと比較して減少したＩｇＥ反応性を示す。個体においてアレルギー反応を誘導するアレルゲンの「低アレルギー性」断片の減少したまたは欠損した能力は、前記アレルゲン性ポリペプチドからＩｇＥ結合エピトープを除去または破壊することによって得られる。成熟野生型アレルゲンの断片化は、多くの場合、このような分子を得るための十分に確立された方法である。本発明のポリペプチド構築物は、野生型アレルゲンと比較して、アレルゲン特異的ＩｇＥ分子に対して、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の減少したＩｇＥ結合能もしくは結合親和性を示すか、またはさらにより好ましくはＩｇＥ結合能もしくは結合親和性を示さない。
【0037】
本明細書に使用する場合、「ＩｇＥ結合能」は、特異的アレルゲン性ポリペプチドと結合することができるＩｇＥと結合する分子の能力である。ポリペプチドおよびタンパク質のＩｇＥ結合能は、例えば、成熟アレルゲンに予め曝露されている１人または複数の個体（すなわち、アレルギー個体）から得られた血清を使用して、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。
【0038】
ポリペプチド構築物の少なくとも２つの断片は、Ｔ細胞エピトープを含んでもよいか、または含まなくてもよい。Ｔ細胞エピトープは当該分野において公知の方法（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ）によって同定することができる。
【0039】
本発明の好ましい実施形態によれば、Ａｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンは、Ａｍｂ ａ １．０１０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６５）、Ａｍｂ ａ １．０２０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６６）、Ａｍｂ ａ １．０２０２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９８７）、Ａｍｂ ａ １．０３０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６８）、Ａｍｂ ａ １．０３０２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２７７６１バリアントＬ４８Ｙ）、Ａｍｂ ａ １．０３０３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６６９）、Ａｍｂ ａ １．０３０４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９８８）、Ａｍｂ ａ １．０３０５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９８９）、Ａｍｂ ａ １．０４０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６７０）、Ａｍｂ ａ １．０４０２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９９３）、Ａｍｂ ａ １．０５０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３２６７１）およびＡｍｂ ａ １．０５０２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＷ３０９９５）からなる群から選択される。
【0040】
Ａｍｂ ａ １アイソフォームである、Ａｍｂ ａ １．０１０１、Ａｍｂ ａ １．０２０１、Ａｍｂ ａ １．０３０５およびＡｍｂ ａ １．０４０１は、ブタクサアレルギーを患っている人々のほとんどがこれらのアイソフォームと特に反応性であることが判明したので、特に好ましい。したがって、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来するアレルゲンの少なくとも２つの断片のうちの少なくとも１つは、これらのＡｍｂ ａ １アイソフォームの１つまたは複数に由来する。
【0041】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０に由来する少なくとも１つの断片は、成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から２０～４０、好ましくはアミノ酸残基１から２５～３５、より好ましくはアミノ酸残基１から２８～３０を含む。
【0042】
「アミノ酸残基１から２０～４０」は、上記に示されるように、断片が、アミノ酸残基１から、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９を含む２０から４０の範囲の整数を含んでもよいか、またはそれらからなっていてもよいことを意味する。これは本明細書に示される全てのアミノ酸範囲に適用可能である。
【0043】
本発明のポリペプチド構築物はまた、アレルゲンの他の部分に由来する断片を含んでもよい。例えば、成熟アレルゲンのアミノ酸残基８０～８５から１６０～１７０に由来し得る本発明のポリペプチド構築物の少なくとも１つのさらなる断片は、成熟アレルゲンのアミノ酸残基８８～９０から１５１～１５３、好ましくはアミノ酸残基８８～９０から１１７～１１９または１１８～１２０から１５１～１５３を含む。
【0044】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基に由来する少なくとも１つの断片は、成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０から３６７～３７３、好ましくはアミノ酸残基２４０から３６７～３７３、より好ましくはアミノ酸残基２４３～２５３から３６７～３７３を含む。
【0045】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基に由来する少なくとも１つの断片は、成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０から３１０～３２０、好ましくはアミノ酸残基２４０～２６０から３００～３１０、より好ましくはアミノ酸残基２４８～２５３から２７８～２８３を含む。
【0046】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基に由来する少なくとも１つの断片は、成熟アレルゲンのアミノ酸残基３１０～３２０から３６７～３７３、好ましくはアミノ酸残基３２０～３３０から３６７～３７３、より好ましくはアミノ酸残基３２８～３３４から３６１～３６７を含む。
【0047】
本発明のポリペプチド構築物の一部である少なくとも２つの断片は、上記に同定した断片の群から選択される。１つまたは複数のポリペプチド構築物において組み合わされる特に好ましい断片は、
－ 成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０、好ましくは１から２０～４０、より好ましくは１から２５～３５、より好ましくはアミノ酸残基１から２８～３０に由来する少なくとも１つの断片、
－ 成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基、好ましくは成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０から３１０～３２０、より好ましくはアミノ酸残基２４０～２６０から３００～３１０、より好ましくはアミノ酸残基２４８～２５３から２７８～２８３に由来する少なくとも１つの断片、および／または
－ 成熟アレルゲンのアミノ酸残基３１０～３２０から３６７～３７３、好ましくはアミノ酸残基３２０～３３０から３６７～３７３、より好ましくはアミノ酸残基３２８～３３４から３６１～３６７を含む少なくとも１つの断片
を含む。
－ 成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０、好ましくは１から２０～４０、より好ましくは１から２５～３５、より好ましくはアミノ酸残基１から２８～３０に由来する少なくとも１つの断片、
－ 成熟アレルゲンの２４０から開始してＣ末端で終了するアミノ酸残基、好ましくは成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０から３１０～３２０、より好ましくはアミノ酸残基２４０～２６０から３００～３１０、より好ましくはアミノ酸残基２４８～２５３から２７８～２８３に由来する少なくとも１つの断片、および／または
－ 成熟アレルゲンのアミノ酸残基３１０～３２０から３６７～３７３、好ましくはアミノ酸残基３２０～３３０から３６７～３７３、より好ましくはアミノ酸残基３２８～３３４から３６１～３６７を含む少なくとも１つの断片
を含む。
【0048】
本明細書に使用する場合、「少なくとも１つの断片はアミノ酸残基ＸからＹに由来する」という用語は、断片が、成熟アレルゲンのアミノ酸残基Ｘから開始してアミノ酸残基Ｙで終了するアミノ酸ストレッチを含むか、またはそれからなることを意味する。
【0049】
本発明によるポリペプチド構築物に存在する少なくとも２つの断片は、独立して、２５から４５個、好ましくは２５から４０個、より好ましくは２６から３５個、より好ましくは２８から３４個のアミノ酸残基からなっていてもよい。
【0050】
本発明の特に好ましい実施形態において、少なくとも２つの断片は、独立して、本明細書に定義される領域における成熟アレルゲンの２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の連続するアミノ酸残基からなっていてもよい。
【0051】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、ＡＥＤＬＱＥＩＬＰＶＮＥＴＲＲＬＴＴＳＧＡＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号２）、ＡＥＤＬＱＱＩＬＰＳＡＮＥＴＲＳＬＴＴＸ２ＧＴＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号３）、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳＶＮＥＴＲＳＬＱＡＸ２ＥＡＹＮＩＩＤＫＸ１（配列番号４）、ＡＥＤＶＥＥＦＬＰＳＡＮＥＴＲＲＳＬＫＡＸ２ＥＡＨＮＩＩＤＫＸ１（配列番号５）およびそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０に由来する少なくとも１つのアレルゲン断片を含み、Ｘ１は、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ２は、システインまたはセリンである。
【0052】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、Ｘ３ＲＸ４ＧＦＸ５ＱＶＶＮＮＮＹＸ６Ｘ７ＷＧＸ８ＹＡＸ９ＧＧＳＸ１０Ｘ１１ＰＴＩＬ（配列番号６）およびそれと少なくとも７０％の同一性を有するそのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端に由来する少なくとも１つの断片を含み、Ｘ３は、システイン、セリン、ロイシンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ４は、ヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ５は、フェニルアラニンまたはバリンであり、Ｘ６は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘ７は、アルギニンまたはリシンであり、Ｘ８は、トレオニンまたはセリンであり、Ｘ９は、イソロイシンまたはロイシンであり、Ｘ１０は、セリンまたはアラニンであり、Ｘ１１は、グリシン、セリンまたはアラニンである。
【0053】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、Ｘ１２ＤＰＶＬＴＰＸ１３ＱＸ１４ＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ１９（配列番号７）およびそれと少なくとも７０％の同一性を有するそのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端に由来する少なくとも１つの断片を含み、Ｘ１２は、セリンまたはバリンであり、Ｘ１３は、バリンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１４は、セリン、リシンまたはアスパラギンであり、Ｘ１５は、アラニンまたはセリンであり、Ｘ１６は、バリンまたはアラニンであり、Ｘ１７は、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ１８は、セリン、リシンまたはアルギニンであり、Ｘ１９は、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在しない。
【0054】
本発明のポリペプチド構築物は、好ましくは、Ｘ２０ＲＨＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＫＷＧＳＹＡＩＧＧＳＡＳＰＴＩＬ（配列番号８）、Ｘ２１ＲＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩＬ（配列番号９）、ＶＤＰＶＬＴＰＥＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＳＡＬＳＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２２（配列番号１０）およびＳＤＰＶＬＴＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２３（配列番号１１）からなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端に由来する少なくとも１つの断片を含み、Ｘ２０およびＸ２１は、独立して、システイン、ロイシン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ２２およびＸ２３は、独立して、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在しない。
【0055】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、ＰＬＷＩＩＦＥＲＤＭＶＩＲＬＤＫＥＭＶＶＮＳＤＫＴＩＤＧＲＧ（配列番号１２）、ＰＬＷＩＩＦＡＲＤＭＶＩＲＬＤＲＥＬＡＩＮＮＤＫＴＩＤＧＲＧ（配列番号１３）、ＰＬＷＩＩＦＫＮＤＭＶＩＮＬＮＱＥＬＶＶＮＳＤＫＴＩＤＧＲＧ（配列番号１４）、ＰＬＷＩＩＦＫＲＮＭＶＩＨＬＮＱＥＬＶＶＮＳＤＫＴＩＤＧＲＧ（配列番号１５）およびそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基８０～８５から１６０～１７０に由来する少なくとも１つのアレルゲン断片を含む。
【0056】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、ＡＫＶＥＩＩＮＡＧＦＴＬＮＧＶＫＮＶＩＩＨＮＩＮＭＨＤＶＫＶＮＰＧ（配列番号１６）、ＡＫＶＥＩＩＮＡＧＦＡＩＹＮＶＫＮＩＩＩＨＮＩＩＭＨＤＩＶＶＮＰＧ（配列番号１７）、ＶＫＶＥＩＩＮＧＧＬＴＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＶＫＶＬＰＧ（配列番号１８）、ＶＫＶＮＩＶＮＡＧＬＴＬＭＮＶＫＮＩＩＩＨＮＩＮＩＨＤＩＫＶＣＰＧ（配列番号１９）およびそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基８０～８５から１６０～１７０に由来する少なくとも１つのアレルゲン断片を含む。
【0057】
ポリペプチド構築物は、ＡＧＤＥＮＩＥＤＲＧＭＬＡＴＶＡＦＮＴＦＴＤＮＶＤＱＲＭＰＲ（配列番号２０）、ＤＦＤＥＲＧＭＬＣＴＶＡＦＮＫＦＴＤＮＶＤＱＲＭＰＮ（配列番号２１）、ＡＤＤＴＨＶＱＤＫＧＭＬＡＴＶＡＦＮＭＦＴＤＮＶＤＱＲＭＰＲ（配列番号２２）、ＡＤＤＴＨＹＱＤＫＧＭＬＡＴＶＡＦＮＭＦＴＤＨＶＤＱＲＭＰＲ（配列番号２３）およびそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端に由来する少なくとも１つのアレルゲン断片を含む。
【0058】
本発明のポリペプチド構築物の少なくとも２つの断片は、上記の同定されたアレルゲン断片から選択される。また、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａアレルゲンのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンから得られる断片と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアレルゲン断片のバリアントも包含される。上述の特定の断片の好ましいバリアントは、システイン残基におけるアミノ酸置換および／または欠失を含み、システイン残基は、例えば、セリン残基で置換されてもよい。
【0059】
第２のアミノ酸に対する第１のアミノ酸配列の同一性の程度は、ある特定のアルゴリズムを使用して両方のアミノ酸配列間の直接的な比較によって決定することができる。配列同一性は、好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、１１のギャップ存在ペナルティ、および１のギャップ伸長ペナルティを使用してＢＬＡＳＴアラインメントによって決定される（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ ｏｌ．２１５（１９９０年）：４０３～４１０頁）。
【0060】
本発明のポリペプチド構築物は、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片を含む融合タンパク質であってもよい。少なくとも２つの断片は、好ましくは、ＡＥＤＬＱＥＩＬＰＶＮＥＴＲＲＬＴＴＳＧＡＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号２）、ＡＥＤＬＱＱＩＬＰＳＡＮＥＴＲＳＬＴＴＸ２ＧＴＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号３）、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳＶＮＥＴＲＳＬＱＡＸ２ＥＡＹＮＩＩＤＫＸ１（配列番号４）、ＡＥＤＶＥＥＦＬＰＳＡＮＥＴＲＲＳＬＫＡＸ２ＥＡＨＮＩＩＤＫＸ１（配列番号５）、Ｘ３ＲＸ４ＧＦＸ５ＱＶＶＮＮＮＹＸ６Ｘ７ＷＧＸ８ＹＡＸ９ＧＧＳＸ１０Ｘ１１ＰＴＩＬ（配列番号６）、好ましくはＸ２０ＲＨＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＫＷＧＳＹＡＩＧＧＳＡＳＰＴＩＬ（配列番号８）またはＸ２１ＲＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩＬ（配列番号９）、Ｘ１２ＤＰＶＬＴＰＸ１３ＱＸ１４ＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ１９（配列番号７）、好ましくはＶＤＰＶＬＴＰＥＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＳＡＬＳＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２２（配列番号１０）またはＳＤＰＶＬＴＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２３（配列番号１１）、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。
【0061】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、Ｘ２１ＲＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩＬ（配列番号９）、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳＶＮＥＴＲＳＬＱＡＸ２ＥＡＹＮＩＩＤＫＸ１（配列番号４）およびＳＤＰＶＬＴＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２３（配列番号１１）からなる群から選択される、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも１つの断片を含み、Ｘ１、Ｘ２１およびＸ２３は独立して、好ましくは、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ２は、好ましくは、システインまたはセリンであり、より好ましくはセリンである。
【0062】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、Ｘ２０ＲＨＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＫＷＧＳＹＡＩＧＧＳＡＳＰＴＩＬ（配列番号８）、ＡＥＤＬＱＥＩＬＰＶＮＥＴＲＲＬＴＴＳＧＡＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号２）およびＶＤＰＶＬＴＰＥＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＳＡＬＳＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２２（配列番号１０）からなる群から選択される、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも１つの断片を含み、Ｘ１、Ｘ２０およびＸ２２は独立して、好ましくは、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ２は、好ましくは、システインまたはセリンであり、より好ましくはセリンである。
【0063】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、Ｘ２０ＲＨＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＫＷＧＳＹＡＩＧＧＳＡＳＰＴＩＬ（配列番号８）、ＡＥＤＬＱＥＩＬＰＶＮＥＴＲＲＬＴＴＳＧＡＹＮＩＩＤＧＸ１（配列番号２）、ＶＤＰＶＬＴＰＥＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＳＡＬＳＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２２（配列番号１０）、Ｘ２１ＲＦＧＦＦＱＶＶＮＮＮＹＤＲＷＧＴＹＡＩＧＧＳＳＡＰＴＩＬ（配列番号９）、ＡＥＧＶＧＥＩＬＰＳＶＮＥＴＲＳＬＱＡＸ２ＥＡＹＮＩＩＤＫＸ１（配列番号４）およびＳＤＰＶＬＴＰＶＱＳＡＧＭＩＰＡＥＰＧＥＡＡＩＫＬＴＳＳＡＧＶＬＳＸ２３（配列番号１１）からなる群から選択される、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも１つの断片を含み、Ｘ１、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２およびＸ２３は独立して、好ましくは、システイン、セリンであるか、またはアミノ酸残基が存在せず、Ｘ２は、好ましくは、システインまたはセリンであり、より好ましくはセリンである。
【0064】
少なくとも２つの断片は、好ましくは、担体タンパク質と融合しているか、またはコンジュゲートしている。
【0065】
本発明の好ましい実施形態によれば、担体タンパク質は、５０から３００個、好ましくは６０から２５０個、より好ましくは８０から２００個、より好ましくは１００から２００個のアミノ酸残基からなるウイルスタンパク質またはその断片である。
【0066】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ウイルスタンパク質はカプシドタンパク質である。
【0067】
ウイルスタンパク質は、好ましくは、ヘパドナウイルス科のウイルスに由来する。
【0068】
本発明の好ましい実施形態によれば、ヘパドナウイルス科のウイルスはＢ型肝炎ウイルスである。
【0069】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Ｂ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質は、ＰｒｅＳまたはその断片、好ましくはＰｒｅＳｌまたはＰｒｅＳ２である。
【0070】
Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドの断片は、好ましくは少なくとも３０個、好ましくは少なくとも４０個、より好ましくは少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基からなり、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドのＰｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２を含んでもよい。
【0071】
担体タンパク質としてのその機能において、およびＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの少なくとも２つの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントについての融合またはコンジュゲーションパートナーとして使用されるＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（配列番号２４）：
【0072】
【化1】
を含んでもよいか、またはそれからなっていてもよい。
【0073】
Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドは、配列番号２４と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなっていてもよい。
【0074】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも２つのアレルゲン断片は、担体タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端と融合している。
【0075】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、前記少なくとも２つの断片のうちの少なくとも１つは担体タンパク質のＮ末端と融合しており、前記少なくとも２つの断片のうちの少なくとも１つは担体タンパク質のＣ末端と融合している。
【0076】
Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントの一部分を担体タンパク質のＮ末端と融合し、別の部分を担体タンパク質のＣ末端と融合すると、断片が由来するポリペプチドまたはタンパク質に対する抗体の産生が増加することが判明した。これはまた、他のアレルゲン断片について国際公開第２０１２／１６８４８７号に首尾良く示されている。
【0077】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、担体タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端と融合した、１から１０個、好ましくは２から８個、より好ましくは３から６個のアレルゲン断片を含む。
【0078】
本明細書に定義される融合タンパク質であるポリペプチド構築物の一般構造は、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－Ｚ、（Ａ）ｎ－Ｚ－（Ｂ）ｎ、Ｚ－（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－Ｚ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－Ｚ－（Ｃ）ｎ、（Ａ）ｎ－Ｚ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ、Ｚ－（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－Ｚ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－Ｚ－（Ｄ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－Ｚ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ、（Ａ）ｎ－Ｚ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ、Ｚ－（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－Ｚ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－Ｚ－（Ｅ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－Ｚ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－Ｚ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ、（Ａ）ｎ－Ｚ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ、Ｚ－（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－（Ｆ）ｎ－Ｚ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－Ｚ－（Ｆ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－Ｚ－（Ｅ）ｎ－（Ｆ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－Ｚ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－（Ｆ）ｎ、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－Ｚ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－（Ｆ）ｎ、（Ａ）ｎ－Ｚ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－（Ｆ）ｎ、Ｚ－（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－（Ｆ）ｎなどであってもよく、Ａ、Ｂ、ＣおよびＥは、独立して同一であっても、異なっていてもよい、本明細書に定義されるＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントを表し、Ｚは、担体タンパク質、好ましくはＰｒｅＳまたはその断片を表し、ｎは独立して、１から５の間、好ましくは１から４の間、より好ましくは１から３の間の整数、より好ましくは１または２、最も好ましくは２である。本発明の融合タンパク質についての最も好ましい構造は、（Ａ）ｎ－（Ｂ）ｎ－（Ｃ）ｎ－Ｚ－（Ｄ）ｎ－（Ｅ）ｎ－（Ｆ）ｎであり、断片Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、断片Ｆ、ＥおよびＤと同一である。担体タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端と融合した同じまたは異なる数の同じまたは異なる断片を含むポリペプチド構築物が特に好ましい。
【0079】
本発明の特に好ましい実施形態では、融合タンパク質は、担体タンパク質のＣ末端において、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来する成熟アレルゲンの、１から１０個、好ましくは１から８個、より好ましくは１から６個の断片を含み、Ｎ末端において同様に、１から１０個、好ましくは１から８個、より好ましくは１から６個の断片または前記少なくとも２つの断片のバリアントを含む。これらの断片は、異なっていても、同一であってもよい。さらに、本発明の融合タンパク質は、１つまたは複数、好ましくは２つ以上の同じ断片を含んでもよい。
【0080】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、およびこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0081】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５９、配列番号６２および配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0082】
本発明の好ましいポリペプチド構築物のアミノ酸配列は、実施例３（下記）に述べられており、Ｋ４、Ｋ４Ａ、Ｋ４Ｂ、Ｋ４Ｃ、Ｋ４Ｃｖａｒ、Ｋ４Ｄ、Ｋ４Ｄｖａｒ、Ｋ４ＥおよびＫ４Ｅｖａｒと指定される。本発明のさらに好ましいポリペプチド構築物は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、これらのうちのいくつかは、Ｎ末端またはＣ末端においてＨｉｓタグ（６個の連続したアミノ酸残基）を有し、これにより良好な精製を可能にすることができる。原則として、本発明のポリペプチドのいずれも、Ｈｉｓタグを有してもよいか、または有しなくてもよい：
【0083】
Ｋ４Ｈｉｓ（配列番号２５）：
【0084】
【化2】
【0085】
Ｋ４ＡＨｉｓ（配列番号２６）：
【0086】
【化3】
【0087】
Ｋ４ＢＨｉｓ（配列番号２７）：
【0088】
【化4】
【0089】
Ｋ４Ｃｖａｒ － システイン残基がセリン残基と置換されている、Ｋ４Ｃのバリアント（配列番号２８）：
【0090】
【化5】
【0091】
Ｋ４Ｄｖａｒ － システイン残基がセリン残基と置換されている、Ｋ４Ｄのバリアント（配列番号２９）：
【0092】
【化6】
【0093】
Ｋ４Ｅｖａｒ － システイン残基がセリン残基と置換されている、Ｋ４Ｄのバリアント（配列番号３０）：
【0094】
【化7】
【0095】
Ｋ４Ｆ（配列番号３１）：
【0096】
【化8】
【0097】
Ｋ４Ｇ（配列番号３２）：
【0098】
【化9】
【0099】
Ｋ４Ｈ（配列番号３３）：
【0100】
【化10】
【0101】
Ｋ４Ｉ（配列番号３４）：
【0102】
【化11】
【0103】
Ｋ４Ｊ（配列番号３５）：
【0104】
【化12】
【0105】
Ｋ４ＣＨｉｓ（配列番号３６）：
【0106】
【化13】
【0107】
Ｋ４Ｋ（配列番号３７）：
【0108】
【化14】
【0109】
Ｋ４Ｌ（配列番号３８）：
【0110】
【化15】
【0111】
Ｋ４Ｍ（配列番号３９）：
【0112】
【化16】
【0113】
Ｋ４Ｎ（配列番号４０）：
【0114】
【化17】
【0115】
Ｋ４Ｏ（配列番号４１）：
【0116】
【化18】
【0117】
Ｋ４Ｐ（配列番号４２）：
【0118】
【化19】
【0119】
Ｋ４Ｑ（配列番号４３）：
【0120】
【化20】
【0121】
Ｋ４Ｒ（配列番号４４）：
【0122】
【化21】
【0123】
Ｋ４Ｓ（配列番号６７）：
【0124】
【化22】
【0125】
Ｋ４ＳＨｉｓ（配列番号６８）：
【0126】
【化23】
【0127】
Ｋ４Ｔ（配列番号６９）：
【0128】
【化24】
【0129】
Ｋ４ＴＨｉｓ（配列番号７０）：
【0130】
【化25】
【0131】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチド構築物は、好ましくは、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａのＡｍｂ ａ １ファミリーのアレルゲンに由来するアレルゲンによって引き起こされる、ブタクサ花粉アレルギーの予防または治療に使用される。
【0132】
本発明の別の態様は、少なくとも２つの断片が担体タンパク質と融合している、本明細書に定義されるポリペプチド構築物をコードする核酸分子に関する。
【0133】
本発明の核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡ分子であってもよい。核酸分子は、任意の種類の生体細胞においてトランスフェクトされ得るか、または導入され得るベクター（例えば、タンパク質発現ベクター、組み込みベクター、クローニングベクター）の一部であってもよい。好ましい細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞が含まれる。このような核酸分子、ベクターおよび細胞を得るための手段および方法は当業者に周知である。
【0134】
本発明のさらなる態様は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。
【0135】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記ベクターは発現またはクローニングベクターである。
【0136】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、前記ベクターは、細菌、真菌、昆虫、ウイルスまたは哺乳動物ベクターである。
【0137】
本発明のベクターは、好ましくは、細菌、酵母、糸状菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または任意の他の原核もしくは真核細胞のような種々の宿主におけるクローニングおよび発現目的のために利用することができる。したがって、前記ベクターは、本発明による低アレルギー性分子または融合タンパク質をコードする核酸の他に、宿主特異的調節配列を含む。
【0138】
本発明の別の態様は、本発明による核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【0139】
本発明のさらなる態様は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド構築物、核酸分子またはベクターを含むワクチン製剤に関する。
【0140】
本発明の好ましい実施形態によれば、ワクチン製剤および本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、ブタクサ花粉アレルギーの治療または予防に使用される。
【0141】
本明細書に使用する場合、「予防すること」および「予防」という用語は、本発明によるポリペプチド構築物または医薬品の投与に起因する対象におけるアレルギーまたはその症状の再発、発症および発生の予防または抑制を指す。一部の実施形態では、「予防すること」および「予防」とは、特定のアレルゲンに対するアレルギーを発生するリスクの低減を指す。「予防すること」という用語は、アレルギーの発生を予防するだけでなく、その進行を停止させ、一旦確立されたその結果を低減させるための手段も含む。
【0142】
本明細書に使用する場合、「治療」および「治療すること」という用語は、アレルギーの進行および持続時間の低減または抑制、アレルギーの重症度の低減または改善、ならびにその１つまたは複数の症状の改善を指す。「治療」はまた、アレルギーまたはアレルギー反応の症状の向上および／または好転も包含する。アレルギーに関連する任意のパラメーターの向上を引き起こすポリペプチド構築物は、治療用融合タンパク質またはコンジュゲートとして同定することができる。「治療」という用語は、治療的治療および予防的手段の両方を指す。例えば、本発明の組成物および方法による治療から利益を受けることができるヒトには、既にアレルギーを有するヒトおよびアレルギーを予防すべきヒトが含まれる。
【0143】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、前記製剤は、１０ｎｇから１ｇ、好ましくは１００ｎｇから１０ｍｇ、特に０．５μｇから２００μｇの前記ポリペプチド、核酸分子またはベクターを含む。
【0144】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチド構築物は、０．０１μｇ／ｋｇ体重から５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重から２ｍｇ／ｋｇ体重の量で少なくとも１回個体に投与される。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチド構築物は、体重とは関係なく（すなわち、用量は１５、２０、２５、３０または８０μｇを含んでもよい）、または体重１ｋｇ当たりのいずれかで、５から１００μｇ、好ましくは１０から８０μｇ、より好ましくは１５から３０μｇの量で患者に投与される。
【0145】
単一の剤形を生成するように賦形剤と組み合わされ得るポリペプチド構築物の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変化する。ポリペプチド構築物の用量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の抗体応答を誘発する能力などの要因に従って変化させてもよい。投薬計画は最適な治療応答を提供するように調節されてもよい。例えば、いくつかの分割用量が毎日投与されてもよいか、または用量は治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低減されてもよい。ポリペプチド構築物の用量もまた、状況に応じて最適な予防用量応答を提供するように変化されてもよい。例えば、本発明のポリペプチド構築物は、常にＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ誘導のレベルに応じて数日、１もしくは２週間またはさらに数カ月の間隔で個体に投与されてもよい。
【0146】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド構築物およびワクチン製剤は、２から１０回の間、好ましくは２から７回の間、さらにより好ましくは最大で５回まで、最も好ましくは最大で３回まで適用される。特に好ましい実施形態では、後のワクチン接種間の時間間隔は、２週から５年の間、好ましくは１カ月から最大で３年までの間、より好ましくは２カ月から１．５年の間であるように選択される。本発明の融合タンパク質の反復投与は、治療の最終効果を最大化することができる。
【0147】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、前記製剤は、少なくとも１種のアジュバント、薬学的に許容される賦形剤および／または防腐剤をさらに含む。
【0148】
本発明のポリペプチド構築物およびワクチン製剤は、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜内などに投与されてもよい。剤形および投与経路に応じて、本発明のポリペプチド構築物は、賦形剤、希釈剤、アジュバントおよび／または担体と組み合わされてもよい。好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムである。ワクチン製剤の製造のための適切なプロトコールは当業者に公知であり、例えば、「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｍ．Ｐ．Ｃｒａｎａｇｅ、Ｍ．Ｈｕｄｓｏｎ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｕ．Ｓ．；第２版、２００３年）に見出され得る。
【0149】
本発明のポリペプチド構築物はまた、ワクチンに通常使用される他のアジュバントと共に製剤化されてもよい。例えば、適切なアジュバントは、ＭＦ５９、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）、ＭＤＰ誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ポリホスファゼン、エマルション（例えば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）、ＳＡＦ）、リポソーム、ビロソーム、イスコム、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ＰＬＧ微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、変異体毒素（例えば、ＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２）、微粒子および／または重合リポソームであってもよい。適切なアジュバントは、例えば、ＡＳ０１Ｂ（リポソーム製剤中のＭＰＬおよびＱＳ２１）、ＡＳ０２Ａ、ＡＳ１５、ＡＳ－２、ＡＳ－０３およびそれらの誘導体（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＵＳＡ）；ＣＷＳ（細胞壁骨格）、ＴＤＭ（トレハロース－６，６’－ジミコレート）、ＬｅＩＦ（リーシュマニア伸長開始因子）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン性またはアニオン性誘導体化多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａとして商業的に利用可能である。ＧＭ－ＣＳＦまたはインターロイキン－２、７もしくは１２などのサイトカインもまた、アジュバントとして使用することができる。主にＴｈｌ型応答を誘発する際に使用するための好ましいアジュバントには、例えば、任意選択でアルミニウム塩との、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）の組合せが含まれる。モノホスホリルリピドＡおよび界面活性剤を含む水性製剤は国際公開第９８／４３６７０号に記載されている。
【0150】
別の好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニン模倣物もしくは誘導体、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）であり、これは、単独でまたは他のアジュバントと組み合わせて使用することができる。例えば、増強系は、ＱＳ２１と３Ｄ－ＭＰＬとの組合せなどの、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組合せを含む。他の好ましい製剤は、水中油型エマルションおよびトコフェロールを含む。特に強力なアジュバント製剤は、水中油型エマルション中のＱＳ２１、３Ｄ－ＭＰＬおよびトコフェロールである。本発明に使用するためのさらなるサポニンアジュバントには、ＱＳ７（国際公開第９６／３３７３９号および国際公開第９６／１１７１１号に記載されている）およびＱＳ１７（米国特許第５，０５７，５４０号および欧州特許第０ ３６２ ２７９ Ｂ１号に記載されている）が含まれる。
【0151】
本発明のワクチン製剤は、最も好ましくはアジュバントとしてミョウバンを含む。
【0152】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに例示されるが、それらに限定されない。
【実施例】
【0153】
方法：
Ｉ）実施例１のＡｍｂ ａ １断片ならびに実施例３および４の融合タンパク質を試験し、特徴付けるために使用したＥＬＩＳＡ法
（ａ）Ａｍｂ ａ １断片および融合タンパク質のＩｇＥ反応性を試験するためのＩｇＥ ＥＬＩＳＡ：
この試験の目的は、Ａｍｂ ａ １断片または融合タンパク質が低アレルギー性であるかどうかを評価することである。この目的のために、断片または融合タンパク質とブタクサアレルギー個体の血清由来のＩｇＥとの結合を、参照として使用される野生型Ａｍｂ ａ １とこれらのＩｇＥとの結合と比較する。
Ｉ）実施例１のＡｍｂ ａ １断片ならびに実施例３および４の融合タンパク質を試験し、特徴付けるために使用したＥＬＩＳＡ法
（ａ）Ａｍｂ ａ １断片および融合タンパク質のＩｇＥ反応性を試験するためのＩｇＥ ＥＬＩＳＡ：
この試験の目的は、Ａｍｂ ａ １断片または融合タンパク質が低アレルギー性であるかどうかを評価することである。この目的のために、断片または融合タンパク質とブタクサアレルギー個体の血清由来のＩｇＥとの結合を、参照として使用される野生型Ａｍｂ ａ １とこれらのＩｇＥとの結合と比較する。
【0154】
本出願の文脈において野生型Ａｍｂ ａ １は、ＩｇＥ反応性、アレルゲン性、およびＴ細胞反応性に関して、Ａｍｂ ａ １が本質的にブタクサ花粉において発生することを意味する。「野生型Ａｍｂ ａ １」（「Ａｍｂ ａ １」とも称される）という用語は、単一のＡｍｂ ａ １アイソフォームを含有する、組換えにより産生されたＡｍｂ ａ １（ｒＡｍｂ ａ １）、またはブタクサ花粉から精製され、したがって様々なＡｍｂ ａ １アイソフォームを含む、実施例４の天然Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）を指し得る。
【0155】
以下のＥＬＩＳＡプロトコールを使用してＩｇＥ反応性を試験した：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートを、４℃にて一晩、０．５μｇ／ウェルの融合タンパク質、Ａｍｂ ａ １断片および参照アレルゲン（ｒＡｍｂ ａ １および／またはｎＡｍｂ ａ １）によりコーティングし、コーティング緩衝液（３．９ｇのＮａ２ＣＯ３＋５．３ｇのＮａＨＣＯ３の１Ｌ水溶液、脱イオン（ｄｅｉｏｎ）、ｐＨ９．６）を用いて全て希釈した。次いでプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する２５０μＬのＰＢＳＴを用いて２回洗浄し、さらに３７℃にて２時間、ブロッキング緩衝液（１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ）を用いてブロッキングした。ブタクサアレルギー患者および非ブタクサアレルギー患者のうちの少なくとも１人由来の複数の患者血清を、希釈緩衝液（０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ）を用いて希釈し（１：５）、コーティングしたプレートに加え（１００μｌ／ウェル）、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴ（２５０μｌ）を用いて５回洗浄し、検出のために、１：１００００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、カタログ番号０７４－１００４）１００μｌを３７℃にて２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴ（２５０μｌ／ウェル）を用いて５回洗浄した。最後に１００μＬのＴＭＢ（ＢＤ）をプレートに加え、呈色反応を、５０μＬの２ＮのＨ２ＳＯ４を用いて１０～２０分後に停止させ、ＴＥＣＡＮ ＥＬＩＳＡリーダーを使用してＯＤ４５０（参照６５０ｎｍ）にて測定した。参照アレルゲンに対するパーセントでのＩｇＥ反応性の計算。
ＩｇＥ反応性％＝（１００／ＯＤｒｅｆ．）＊ＯＤｐａｔ
ＩｇＥ反応性％＝（１００／ＯＤｒｅｆ．）＊ＯＤｐａｔ
【0156】
ＯＤｒｅｆは、参照アレルゲンと結合した患者のＩｇＥのＯＤ値を表し、一方で、ＯＤｐａｔ値は、試験した融合タンパク質または断片と結合した患者のＩｇＥを表す。
【0157】
（ｂ）ウサギにおけるＩｇＧ応答の誘導を評価するためのＩｇＧ ＥＬＩＳＡ：
この試験の目的は、融合タンパク質またはＡｍｂ ａ １断片によるウサギの免疫化後のｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を決定することである。
この試験の目的は、融合タンパク質またはＡｍｂ ａ １断片によるウサギの免疫化後のｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を決定することである。
【0158】
以下のＥＬＩＳＡプロトコールを使用してウサギ血清中のＩｇＧレベルを測定した：ＥＬＩＳＡプレートを、１００μＬの野生型Ａｍｂ ａ １（ｒＡｍｂ ａ １および／またはｎＡｍｂ ａ １）を用いてコーティングし、これを０．１Ｍの重炭酸塩緩衝液中で２μｇ／ｍＬに希釈し、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、ＴＥＣＡＮ ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用して、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含む２５０μＬのＰＢＳを用いて５回洗浄し、ＲＴにて２時間、１％のＢＳＡを含有する２００μＬのＰＢＳＴを用いてブロッキングした。次いで、ウサギ血清の連続希釈物（０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ中で調製した希釈物）をプレートに加え（１００μＬ／ウェル）、４℃にて一晩インキュベートした。再び、プレートを、ＴＥＣＡＮ ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用して、２５０μＬのＰＢＳＴを用いて５回洗浄した。検出のために、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ中で１：２５０００希釈したＨＲＰ標識化ロバ抗ウサギＩｇＧ検出抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＮＡ９３４）１００μＬを加え、３７℃にて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、最後に１００μＬのＴＭＢをプレートに加えた。呈色反応を、５０μＬの２ＮのＨ２ＳＯ４を用いて１０～２０分後に停止させ、ＴＥＣＡＮ ＥＬＩＳＡリーダーを用いてＯＤ４５０（参照６５０ｎｍ）にて測定した。
【0159】
（ｃ）ウサギ血清中の遮断抗体を検出するためのＩｇＥ阻害ＥＬＩＳＡ
アレルギーワクチンは、免疫化の際に遮断抗体を誘導することが望ましい。この試験の目的は、異なる融合タンパク質またはＡｍｂ ａ １断片による免疫化によって誘導されるＩｇＧの、遮断抗体として機能する能力を調べ、それによってブタクサアレルギー個体の血清中に存在するＩｇＥの、野生型Ａｍｂ ａ １との相互作用を阻害することである。
アレルギーワクチンは、免疫化の際に遮断抗体を誘導することが望ましい。この試験の目的は、異なる融合タンパク質またはＡｍｂ ａ １断片による免疫化によって誘導されるＩｇＧの、遮断抗体として機能する能力を調べ、それによってブタクサアレルギー個体の血清中に存在するＩｇＥの、野生型Ａｍｂ ａ １との相互作用を阻害することである。
【0160】
以下の阻害ＥＬＩＳＡプロトコールを使用した：
【0161】
最初に、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃にて２時間、０．１Ｍの重炭酸塩緩衝液中の０．２μｇ／ウェルの野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １および／またはｒＡｍｂ ａ １）によりコーティングした。プレートを、ＴＥＣＡＮ ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用して、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含む２５０μＬのＰＢＳを用いて２回洗浄し、３７℃にて２時間、１％のＢＳＡを含有する２００μＬのＰＢＳＴを用いてブロッキングした。
【0162】
第２のステップにおいて、融合タンパク質、Ａｍｂ ａ １断片、または野生型Ａｍｂ ａ １（対照として）による免疫化によって得られた１００μｌのウサギ血清、および１００μＬの対応する免疫前血清を、４℃にて一晩、コーティングしたプレートとインキュベートした。ウサギ血清を、ＰＢＳＴ ０．５％ ＢＳＡ中の１：１０～１：１００の範囲の異なる希釈で適用した。抗ペプチド血清の混合物をさらに希釈せずに適用した。プレートを、２５０μｌのＰＢＳＴを用いて５回洗浄した。
【0163】
第３のステップにおいて、プレートを、３７℃にて２時間、ブタクサアレルギーを有する患者由来の１００μＬの血清（０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ中で１：５に希釈した）とインキュベートした。
【0164】
最後に、結合したヒトＩｇＥ抗体を、３７℃にて２時間インキュベートした、１００μＬの１：１００００希釈した（ＰＢＳＴ ０．５％ ＢＳＡ中）ＨＲＰ標識化ヤギ抗ヒトＩｇＥ検出抗体（ＫＰＬ、カタログ番号０７４－１００４）を用いて検出した。プレートを、ＰＢＳＴを用いて５回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ（ＢＤ）をプレートに加え、呈色反応を、５０μＬの２ＮのＨ２ＳＯ４を用いて１０～２０分後に停止させ、ＴＥＣＡＮ ＥＬＩＳＡリーダーを用いてＯＤ４５０（参照６５０ｎｍ）にて測定した。
【0165】
パーセンテージでのＩｇＥ結合の阻害率を以下の式に従って計算した：
ＩｇＥ阻害％＝１００－（ＯＤｓ／ＯＤｐ）×１００（Ｃｈｅｎら、Ａｌｌｅｒｇｙ Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７、６０９～６２１頁（２０１２年）に従う）。ＯＤｓおよびＯＤｐはそれぞれ、ウサギ免疫血清（ＯＤｓ）および免疫前血清（ＯＤｐ）とのプレインキュベーション後の吸光度を表す。
ＩｇＥ阻害％＝１００－（ＯＤｓ／ＯＤｐ）×１００（Ｃｈｅｎら、Ａｌｌｅｒｇｙ Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７、６０９～６２１頁（２０１２年）に従う）。ＯＤｓおよびＯＤｐはそれぞれ、ウサギ免疫血清（ＯＤｓ）および免疫前血清（ＯＤｐ）とのプレインキュベーション後の吸光度を表す。
【0166】
ＩＩ）好塩基球活性化アッセイ（ＢＡＴ）
ブタクサアレルギー個体由来の１００μｌの全血試料を、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３を含有するＨｅｐｅｓカルシウム緩衝液中で希釈した２０μｌの異なる刺激剤（陽性対照（抗ＩｇＥ）、陽性対照（ｆＭＬＰ）、Ａｍｂ ａ １および融合タンパク質）と混合し、３７℃にて１５分インキュベートした。１０μｌのＨｅｐｅｓ／ＥＤＴＡ緩衝液を加え、ＲＴにて５分のインキュベーション後、２０μｌの抗体溶液（ＦＡＣＳ緩衝液、抗ＣＤ６３－ＰＥ、抗ＣＤ１２３－ＦＩＴＣおよび抗ＣＣＲ３－ＡＰＣ）を加え、暗所で１５分間インキュベートした。赤血球を溶解し、遠心分離した後、細胞を０．５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に溶解し、遠心分離し、２％のホルムアルデヒドを含有する２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液により固定し、フローサイトメトリーを用いて測定した。ゲートをＣＤ１２３＋／ＣＣＲ３＋に設定し、１０００個の細胞を記録した。
ブタクサアレルギー個体由来の１００μｌの全血試料を、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３を含有するＨｅｐｅｓカルシウム緩衝液中で希釈した２０μｌの異なる刺激剤（陽性対照（抗ＩｇＥ）、陽性対照（ｆＭＬＰ）、Ａｍｂ ａ １および融合タンパク質）と混合し、３７℃にて１５分インキュベートした。１０μｌのＨｅｐｅｓ／ＥＤＴＡ緩衝液を加え、ＲＴにて５分のインキュベーション後、２０μｌの抗体溶液（ＦＡＣＳ緩衝液、抗ＣＤ６３－ＰＥ、抗ＣＤ１２３－ＦＩＴＣおよび抗ＣＣＲ３－ＡＰＣ）を加え、暗所で１５分間インキュベートした。赤血球を溶解し、遠心分離した後、細胞を０．５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に溶解し、遠心分離し、２％のホルムアルデヒドを含有する２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液により固定し、フローサイトメトリーを用いて測定した。ゲートをＣＤ１２３＋／ＣＣＲ３＋に設定し、１０００個の細胞を記録した。
【実施例1】
【0167】
Ａｍｂ ａ １．０３０５ペプチドの設計
以下の断片を設計した。示したアミノ酸位置は成熟Ａｍｂ ａ １．０３０５の配列を指す（図１を参照のこと）。
以下の断片を設計した。示したアミノ酸位置は成熟Ａｍｂ ａ １．０３０５の配列を指す（図１を参照のこと）。
【0168】
【表1】
【0169】
これらのペプチドを化学的に合成し、本発明のポリペプチドの構築に適したアレルゲン断片を同定するためのさらなる試験（実施例５～７）のために使用した。
【実施例2】
【0170】
実施例１の断片および／またはこれらのペプチドのバリアントを含む融合タンパク質の設計および組換え発現
これらの実施例に使用した融合タンパク質Ｋ１からＫ６ならびにＫ４Ａ、Ｋ４Ｂ、Ｋ４Ｃ、Ｋ４ＤおよびＫ４Ｅは、ペプチド担体原理に基づき、ＰｒｅＳドメインのＮ末端およびＣ末端、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原のウイルスコートタンパク質と融合したＡｍｂ ａ １ファミリーに属するアレルゲンの断片（さらに「Ａｍｂ ａ １断片」と称される）を含む。担体分子としてＰｒｅＳを含むこのようなＡｍｂ ａ １関連融合タンパク質の例を図４Ａおよび４Ｂに示す。融合タンパク質Ｋ４Ａにおいて、Ａｍｂ ａ １断片に存在する全ての末端システイン残基は欠失している。融合タンパク質Ｋ４Ｂにおいて、それぞれのＡｍｂ ａ １断片に存在する全てのシステイン残基はセリン残基と置換されている。融合タンパク質Ｋ４Ｃ、Ｋ４ＤおよびＫ４Ｅは、Ａｍｂ ａ １の異なるアイソフォームに由来する、記載したＡｍｂ ａ １断片のバリアントを含む。
これらの実施例に使用した融合タンパク質Ｋ１からＫ６ならびにＫ４Ａ、Ｋ４Ｂ、Ｋ４Ｃ、Ｋ４ＤおよびＫ４Ｅは、ペプチド担体原理に基づき、ＰｒｅＳドメインのＮ末端およびＣ末端、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原のウイルスコートタンパク質と融合したＡｍｂ ａ １ファミリーに属するアレルゲンの断片（さらに「Ａｍｂ ａ １断片」と称される）を含む。担体分子としてＰｒｅＳを含むこのようなＡｍｂ ａ １関連融合タンパク質の例を図４Ａおよび４Ｂに示す。融合タンパク質Ｋ４Ａにおいて、Ａｍｂ ａ １断片に存在する全ての末端システイン残基は欠失している。融合タンパク質Ｋ４Ｂにおいて、それぞれのＡｍｂ ａ １断片に存在する全てのシステイン残基はセリン残基と置換されている。融合タンパク質Ｋ４Ｃ、Ｋ４ＤおよびＫ４Ｅは、Ａｍｂ ａ １の異なるアイソフォームに由来する、記載したＡｍｂ ａ １断片のバリアントを含む。
【0171】
Ｋ１からＫ６ならびにＫ４Ａ、Ｋ４Ｂ、Ｋ４Ｃ、Ｋ４ＤおよびＫ４Ｅのアミノ酸配列は以下の通りであった：
【0172】
Ｋ１（配列番号５６）：
【0173】
【化26】
【0174】
Ｋ２（配列番号５７）：
【0175】
【化27】
【0176】
Ｋ３（配列番号５８）：
【0177】
【化28】
【0178】
Ｋ４（配列番号５９）：
【0179】
【化29】
【0180】
Ｋ５（配列番号６０）：
【0181】
【化30】
【0182】
Ｋ６（配列番号６１）：
【0183】
【化31】
【0184】
Ｋ４Ａ － 断片の末端システイン残基を有しないＫ４のバリアント（配列番号６２）：
【0185】
【化32】
【0186】
Ｋ４Ｂ － システイン残基がセリン残基と置換されている、Ｋ４のバリアント（配列番号６３）：
【0187】
【化33】
【0188】
Ｋ４Ｃ（配列番号６４）：
【0189】
【化34】
【0190】
Ｋ４Ｄ（配列番号６５）：
【0191】
【化35】
【0192】
Ｋ４Ｅ（配列番号６６）：
【0193】
【化36】
【0194】
前記融合タンパク質をコードする核酸分子は、熱ショック形質転換を使用して発現ベクターｐＥＴ－２７ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ／Ｎｏｖａｇｅｎ）を介して化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）に導入されている。組換えにより発現した融合タンパク質の精製を容易にするために、６個の連続するヒスチジン残基を含むＨｉｓタグを融合タンパク質のＣ末端に導入した。
【0195】
融合タンパク質の組換え発現のために、１．２５ｍＬの一晩培養物を、光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して６００ｎｍの波長にて測定して０．６のＯＤ（光学密度）として表した細胞密度に到達するようにカナマイシンを含有する２５０ｍＬのＬＢ培地に接種した。融合タンパク質の発現を誘導するために、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を細胞培養物に加えた。３から４時間後、細胞を、７０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離によって回収した。上清を廃棄し、ペレットを－２０℃にて凍結した。
【実施例3】
【0196】
融合タンパク質の単離および精製
融合タンパク質を含む実施例２のＥ．ｃｏｌｉペレットを、１５ｍＬの溶解緩衝液（２５ｍＭのイミダゾール；０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００；ｐＨ７．４）に溶解した。得られた懸濁液を室温にて２０分間撹拌した。細胞を破壊し、分散装置（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ；ＩＫＡ）を使用することによって均質化した。ＤＮＡを、４μＬのＤＮＡｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０分間撹拌することによって除去した。１０ｍＭのＮａＣｌの添加によってＤＮＡｓｅ活性は減少した。融合タンパク質を含むペレットを遠心分離によって回収した。
融合タンパク質を含む実施例２のＥ．ｃｏｌｉペレットを、１５ｍＬの溶解緩衝液（２５ｍＭのイミダゾール；０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００；ｐＨ７．４）に溶解した。得られた懸濁液を室温にて２０分間撹拌した。細胞を破壊し、分散装置（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ；ＩＫＡ）を使用することによって均質化した。ＤＮＡを、４μＬのＤＮＡｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、１０分間撹拌することによって除去した。１０ｍＭのＮａＣｌの添加によってＤＮＡｓｅ活性は減少した。融合タンパク質を含むペレットを遠心分離によって回収した。
【0197】
ペレットから融合タンパク質を単離するために、ペレットを、６ＭのＧＨＣｌ（塩酸グアニジン）または８Ｍの尿素のいずれかを含む変性緩衝液（ｐＨ８）を使用することによって溶解した。これらの緩衝液のうちの１つを用いてペレットを溶解した後、溶液を遠心分離し、透明な上清をＮｉ－ＮＴＡマトリクス（Ｑｕｉａｇｅｎ）と接触させた。このマトリクスをポリプロピレンカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）に移し、カラムを６ＭのＧＨＣｌまたは８Ｍの尿素を含む緩衝液（ｐＨ６．３）を用いて２回洗浄した。最後に、融合タンパク質を、６ＭのＧＨＣｌまたは８Ｍの尿素を含む緩衝液（ｐＨ４．５）を適用することによってカラムから溶出した。精製手順を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて種々のステップからの試料を分析することによってモニターした。
【0198】
単離および精製ステップの後、６ＭのＧＨＣｌまたは８Ｍの尿素を含む緩衝液に溶解した融合タンパク質を透析して、ＧＨＣｌまたは尿素を除去した。
【実施例4】
【0199】
ブタクサ花粉抽出物からの天然Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）の単離および精製
ブタクサ花粉粗抽出物（ＣＥ）の調製およびそれに続く硫酸アンモニウムによる沈殿のために、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｙａｓｕｅｄａら、１９８３年（Ｊ ＡＬＬＥＲＧＹ ＣＬＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬ ７１：７７、１９８３年）の改変プロトコールを使用した。
ブタクサ花粉粗抽出物（ＣＥ）の調製およびそれに続く硫酸アンモニウムによる沈殿のために、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｙａｓｕｅｄａら、１９８３年（Ｊ ＡＬＬＥＲＧＹ ＣＬＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬ ７１：７７、１９８３年）の改変プロトコールを使用した。
【0200】
簡潔に述べると、花粉をＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａから得、１０ｇをエーテルにより脱脂し、２０℃にて４８時間、２００ｍｌの０．１２５Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ＝８．０）中で抽出した。抽出後、花粉を遠心分離（１０，０００×ｇ）によって上清から分離し、２４時間にわたって１２０ｍｌの０．１２５Ｍの重炭酸アンモニウム中で抽出した。合わせた上清を５ｍＭの重炭酸アンモニウムに対して透析し、凍結乾燥した。
【0201】
１０ｇの乾燥花粉から得た抽出物を３０ｍｌの０．０５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に溶解し、固体硫酸アンモニウムを撹拌しながら８０％飽和まで加えた。４℃にて一晩撹拌した後、沈殿物を遠心分離によって回収した。得られた黄色の沈殿物を１０ｍｌの０．０２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に溶解し、同じＴｒｉｓ緩衝液に対して透析した。
【0202】
ｎＡｍｂ ａ １の精製のために、２つのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ ＩおよびＡＣＥ ＩＩ）および１つの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ステップを含む、３つのクロマトグラフィーステップを実施した。
【0203】
１０ｍｌの０．０２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中に硫酸アンモニウム沈殿物を含有する上清を、カチオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を使用して捕捉した。高分子量不純物は、これらの不純物が結合せずにカラムを通過したためになくなった。ｎＡｍｂ ａ １タンパク質の溶出を勾配溶出によって実施し、生成物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）および緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）を使用することによって溶出した。ｎＡｍｂ ａ １を含有する画分を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に従ってプールし、２つのプール（Ｐ１およびＰ２）を得た。捕捉プール２を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）によってさらに処理した。
【0204】
カラムからのプール２を２．５Ｍの塩化ナトリウムと混合し、ｐＨ１０に調整し、ＨＩＣカラムに充填した（結合モード）。低塩緩衝液を使用する勾配溶出によって溶出を実施した。生成物は、溶出緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ＭのＮａＣＬ、ｐＨ１０）および緩衝液Ｂ（５ｍＭのＴｒｉＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４％のイソプロパノール（ｐＨ８．０）が３０％から６０％の間にあるときに溶出された。
【0205】
画分を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に従ってプールし、得られたＨＩＣプールを濃縮し、透析濾過した。最後に、高度に精製したｎＡｍｂ ａ １タンパク質を滅菌濾過し（０．２２μｍ］、タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを使用することによって測定し、ウェスタンブロット（ＷＢ）によって確認し、アリコートし、２０℃にて凍結した。
【0206】
精製したｎＡｍｂ ａ １は、特異的Ａｍｂ ａ １反応性抗体を用いた免疫ブロットにおいて陽性と判定した。
【実施例5】
【0207】
Ａｍｂ ａ １断片のＩｇＥ反応性は野生型Ａｍｂ ａ １と比較して大幅に低減する
実施例１の１１個のＡｍｂ ａ １ペプチドのＩｇＥ結合能を、方法Ｉ（ａ）に記載されるＩｇＥ ＥＬＩＳＡの使用によって野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １および／またはｒＡｍｂ ａ １）のものと比較した。このＥＬＩＳＡにおいて得られたＯＤレベルはＩｇＥレベルに対応し、ＯＤ値が高いほど、より多くのＩｇＥに、コーティングされた抗原が結合していた。これは、より高いＩｇＥ反応性を示す。全体で、２３人の高度のブタクサアレルギー患者および１人の非アレルギー患者（陰性対照として）由来の血清を選択し、Ａｍｂ ａ １断片を試験するために使用した。ペプチドのＩｇＥ反応性を、各患者についての参照として使用し１００％のＩｇＥ反応性と設定した野生型Ａｍｂ ａ １のものと比較した。次いで断片のＩｇＥ反応性のパーセンテージを、各患者について、野生型Ａｍｂ ａ １についてのそれらの１００％に対して計算した。結果を図２にまとめる。
実施例１の１１個のＡｍｂ ａ １ペプチドのＩｇＥ結合能を、方法Ｉ（ａ）に記載されるＩｇＥ ＥＬＩＳＡの使用によって野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １および／またはｒＡｍｂ ａ １）のものと比較した。このＥＬＩＳＡにおいて得られたＯＤレベルはＩｇＥレベルに対応し、ＯＤ値が高いほど、より多くのＩｇＥに、コーティングされた抗原が結合していた。これは、より高いＩｇＥ反応性を示す。全体で、２３人の高度のブタクサアレルギー患者および１人の非アレルギー患者（陰性対照として）由来の血清を選択し、Ａｍｂ ａ １断片を試験するために使用した。ペプチドのＩｇＥ反応性を、各患者についての参照として使用し１００％のＩｇＥ反応性と設定した野生型Ａｍｂ ａ １のものと比較した。次いで断片のＩｇＥ反応性のパーセンテージを、各患者について、野生型Ａｍｂ ａ １についてのそれらの１００％に対して計算した。結果を図２にまとめる。
【実施例6】
【0208】
ＫＬＨ結合Ａｍｂ ａ １断片および融合タンパク質による免疫化はＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ抗体を誘導する
Ａｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ抗体の量ならびに実施例１のＡｍｂ ａ １断片または実施例２および３の融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を評価し、それを野生型Ａｍｂ ａ １（精製した天然または組換えＡｍｂ ａ １）の免疫原性と比較するために、免疫化研究をウサギにおいて実施した。この目的のために、ＫＬＨ結合断片、野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １）または融合タンパク質を水酸化アルミニウム（ミョウバン）に吸着させ、ウサギに皮下投与した。３匹のウサギを各抗原により免疫化した。血液試料を免疫化の前および後に得た。
Ａｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ抗体の量ならびに実施例１のＡｍｂ ａ １断片または実施例２および３の融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を評価し、それを野生型Ａｍｂ ａ １（精製した天然または組換えＡｍｂ ａ １）の免疫原性と比較するために、免疫化研究をウサギにおいて実施した。この目的のために、ＫＬＨ結合断片、野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １）または融合タンパク質を水酸化アルミニウム（ミョウバン）に吸着させ、ウサギに皮下投与した。３匹のウサギを各抗原により免疫化した。血液試料を免疫化の前および後に得た。
【0209】
Ａｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ力価の誘導を評価するために、免疫化後に得たウサギ血清の連続希釈物（１／１０～１／１２８０）を、方法５（ｂ）に記載されるＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して試験した。野生型Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １）による免疫化に起因するアレルゲン特異的ＩｇＧのレベルは、一方では陽性対照として、他方では最適な免疫原性のための参照として役立った。このように、野生型Ａｍｂ ａ １アレルゲンによって誘導されたＩｇＧレベルは、ペプチドによって誘導されたものと比較して高かった。図３Ａおよび３Ｂに示すように、ペプチド１１は、はるかに多くの量のＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ抗体を誘導し、したがって最も高い免疫原性を示し、他のペプチドはより低いＩｇＧ力価を誘導した。図３Ａおよび３Ｂに示した抗体レベルはこれらの３匹のウサギの平均を表す。
【0210】
融合タンパク質をウサギの免疫化のために使用し、得られた抗血清を同様に試験した。
【実施例7】
【0211】
実施例１のペプチド／Ａｍｂ ａ １断片１から５および７から１１によるウサギの免疫化は、アレルギー患者のＩｇＥと野生型Ａｍｂ ａ １との結合を阻害する遮断抗体を誘導する
上記の方法Ｉｃ）を使用して、ペプチド／Ａｍｂ ａ １断片１から５および７から１１（実施例１を参照のこと）ならびに前記ペプチド／断片の混合物による免疫化によって誘導された抗体のＩｇＥ阻害可能性を評価した。
上記の方法Ｉｃ）を使用して、ペプチド／Ａｍｂ ａ １断片１から５および７から１１（実施例１を参照のこと）ならびに前記ペプチド／断片の混合物による免疫化によって誘導された抗体のＩｇＥ阻害可能性を評価した。
【0212】
Ａｍｂ ａ １ペプチド／断片１から５および７から１１による免疫化によって得られた血清は、ペプチド／断片９、１０および１１が少なくとも５０％のＩｇＥ結合阻害のレベルに達したことを示したが、ペプチド１から５、７および８により得られた阻害レベルは５０％未満であった（図１１Ａを参照のこと）。驚くべきことに、３つまたは４つのペプチド／断片に対する抗体を含む前記血清の混合物（すなわち、ペプチド１＋９＋１１、２＋９＋１１、８＋９＋１１、３＋４＋５、５＋７＋８、１＋９＋１０＋１１を含有する混合物）は、成熟アレルゲンのＮ末端に由来する少なくとも１つの断片（すなわち、成熟アレルゲンのアミノ酸残基１から５０）に対する抗体および成熟アレルゲンのＣ末端に由来する少なくとも１つの断片（すなわち、成熟アレルゲンのアミノ酸残基２４０からＣ末端）に対する抗体を含有する混合物が、最も高いＩｇＥ阻害反応性を示すことを明らかにした（図１１Ｂを参照のこと）。Ａｍｂ ａ １の２つの断片（ペプチド／断片２＋１１、１＋２、１＋８および１＋１１）に対する抗体を含む血清の混合物は、ＩｇＥ阻害アッセイにおいて、成熟アレルゲンのＮ末端に由来する少なくとも１つの断片に対する抗体と、成熟アレルゲンのＣ末端に由来する少なくとも１つの断片に対する抗体との組合せが、高い阻害率をもたらすことも示した（図１１Ｃを参照のこと）。
【実施例8】
【0213】
融合タンパク質のＩｇＥ反応性は野生型Ａｍｂ ａ １と比較して大幅に低減する
Ａｍｂ ａ １特異的融合タンパク質のＩｇＥ結合能（実施例２；図４Ａおよび４Ｂを参照のこと）を、方法Ｉ（ａ）に記載されるＩｇＥ ＥＬＩＳＡの使用によって、天然Ａｍｂ ａ １のものと比較した。やはり、高いＯＤ値は、より多くのＩｇＥが、コーティングした融合タンパク質または野生型Ａｍｂ ａ １によって結合され得ることを意味し、高いＩｇＥ反応性を示す。合計で１９人のブタクサアレルギー患者の血清を使用し、陰性対照について１人の非アレルギー患者を試験した。
Ａｍｂ ａ １特異的融合タンパク質のＩｇＥ結合能（実施例２；図４Ａおよび４Ｂを参照のこと）を、方法Ｉ（ａ）に記載されるＩｇＥ ＥＬＩＳＡの使用によって、天然Ａｍｂ ａ １のものと比較した。やはり、高いＯＤ値は、より多くのＩｇＥが、コーティングした融合タンパク質または野生型Ａｍｂ ａ １によって結合され得ることを意味し、高いＩｇＥ反応性を示す。合計で１９人のブタクサアレルギー患者の血清を使用し、陰性対照について１人の非アレルギー患者を試験した。
【0214】
天然Ａｍｂ ａ １のＩｇＥ反応性を参照として使用した。それを最大ＩｇＥ反応性と定義し、したがって個々の患者についての１００％のＩｇＥ反応性と設定し、融合タンパク質のＩｇＥ反応性を各患者についてＡｍｂ ａ １のものとの相関において計算した。図５および８に示したＥＬＩＳＡ結果により、野生型Ａｍｂ ａ １と比較して、いずれの融合タンパク質も、関連するＩｇＥ反応性を示さなかったことが示された。
【0215】
ブタクサアレルギー個体においてアレルギー反応を誘発するＩｇＥ反応性および可能性を、好塩基球活性化試験（ＢＡＴアッセイ）を用いてさらに測定した。ブタクサアレルギー患者由来の新鮮な血液を使用した。融合タンパク質のＩｇＥ反応性は、陽性対照および野生型Ａｍｂ ａ １と比較して非常に低かった（図１０を参照のこと）。ＢＡＴアッセイについての実験プロトコールの詳細な説明は方法ＩＩに提供される。
【実施例9】
【0216】
融合タンパク質Ｋ１からＫ６によるウサギの免疫化は、アレルギー患者のＩｇＥと野生型Ａｍｂ ａ １との結合を阻害する遮断抗体を誘導する
Ａｍｂ ａ １融合タンパク質Ｋ１からＫ６による免疫化によって誘導された抗体のＩｇＥ阻害可能性を評価するために、野生型Ａｍｂ ａ １によりコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを融合タンパク質Ｋ１からＫ６により免疫化したウサギから得られた血清、続いて、異なるブタクサアレルギー患者由来の２６の血清とインキュベートした。阻害ＥＬＩＳＡの詳細なプロトコールは方法Ｉ（ｃ）に記載される。結果を図６に示す。Ａｍｂ ａ １特異的融合タンパク質Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４およびＫ６による免疫化によって得られた血清は、参照として使用した野生型Ａｍｂ ａ １および陽性対照（ｎＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １）について決定したものと同じ範囲（９０～９２％）であった８０～９０％の阻害レベルに達した。対照的に、Ａｍｂ ａ １融合タンパク質Ｋ１およびＫ５によって誘導されたＩｇＧ抗体は、より低い阻害レベルを示した（６０％および２３％）。
Ａｍｂ ａ １融合タンパク質Ｋ１からＫ６による免疫化によって誘導された抗体のＩｇＥ阻害可能性を評価するために、野生型Ａｍｂ ａ １によりコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを融合タンパク質Ｋ１からＫ６により免疫化したウサギから得られた血清、続いて、異なるブタクサアレルギー患者由来の２６の血清とインキュベートした。阻害ＥＬＩＳＡの詳細なプロトコールは方法Ｉ（ｃ）に記載される。結果を図６に示す。Ａｍｂ ａ １特異的融合タンパク質Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４およびＫ６による免疫化によって得られた血清は、参照として使用した野生型Ａｍｂ ａ １および陽性対照（ｎＡｍｂ ａ １およびｒＡｍｂ ａ １）について決定したものと同じ範囲（９０～９２％）であった８０～９０％の阻害レベルに達した。対照的に、Ａｍｂ ａ １融合タンパク質Ｋ１およびＫ５によって誘導されたＩｇＧ抗体は、より低い阻害レベルを示した（６０％および２３％）。
【0217】
さらに、ウサギ血清を、ＰＢＳを用いて１：１０、１：２５、１：５０および１：１００に希釈し、ＩｇＥ阻害を上記のように再び試験した。融合タンパク質Ｋ４により免疫化したウサギから得られた血清は、最も高い阻害率を示したことが判明した（図７を参照のこと）。融合タンパク質Ｋ５により免疫化したウサギ由来の血清は、以前の実験において低いＩｇＥ阻害反応性を示したので、それを異なる希釈においてさらに試験しなかった。
【実施例10】
【0218】
融合タンパク質によるウサギの免疫化は、アレルギー患者のＩｇＥの、Ａｍｂ ａ １の臨床的に関連するアイソフォームとの結合を阻害する遮断抗体を誘導する
Ａｍｂ ａ １の異なるアイソフォームに対するＡｍｂ ａ １融合タンパク質による免疫化によって誘導された抗体のＩｇＥ阻害可能性を評価するために、実施例９の阻害ＥＬＩＳＡを、それぞれ、ｒＡｍｂ ａ １（単一アイソフォームＡｍｂ ａ １．０３０５）およびｎＡｍｂ ａ １（質量分析によって確認して、大部分はアイソフォームＡｍｂ ａ １．０１０１およびＡｍｂ ａ １．０４０１）によりコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて実施した。コーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、融合タンパク質Ｋ４ＡおよびＫ４Ｂにより免疫化したウサギから得られた血清、続いて、異なるブタクサアレルギー患者由来の２６の血清とインキュベートした。結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。Ｋ４ＡおよびＫ４Ｂによって誘導された抗体は、Ａｍｂ ａ １アイソフォーム１．０３０５、ならびにアイソフォーム１．０１０１および１．０４０１の混合物とのＩｇＥ結合を阻害することができた。
Ａｍｂ ａ １の異なるアイソフォームに対するＡｍｂ ａ １融合タンパク質による免疫化によって誘導された抗体のＩｇＥ阻害可能性を評価するために、実施例９の阻害ＥＬＩＳＡを、それぞれ、ｒＡｍｂ ａ １（単一アイソフォームＡｍｂ ａ １．０３０５）およびｎＡｍｂ ａ １（質量分析によって確認して、大部分はアイソフォームＡｍｂ ａ １．０１０１およびＡｍｂ ａ １．０４０１）によりコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて実施した。コーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、融合タンパク質Ｋ４ＡおよびＫ４Ｂにより免疫化したウサギから得られた血清、続いて、異なるブタクサアレルギー患者由来の２６の血清とインキュベートした。結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。Ｋ４ＡおよびＫ４Ｂによって誘導された抗体は、Ａｍｂ ａ １アイソフォーム１．０３０５、ならびにアイソフォーム１．０１０１および１．０４０１の混合物とのＩｇＥ結合を阻害することができた。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10-1】
【図10-2】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【配列表】