特許 7065778 炎症性障害を処置するための新規なアプローチ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-28

(45)【発行日】2022-05-12

(54)【発明の名称】炎症性障害を処置するための新規なアプローチ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220502BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220502BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20220502BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20220502BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 11/08 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220502BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220502BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/711

A61P43/00 111

A61K31/7125

A61K31/712

A61K31/7115

A61P29/00

A61P25/00

A61P35/00

A61P17/06

A61P25/28

A61P27/02

A61P1/04

A61P11/08

A61P25/04

A61P37/08

A61P17/04

A61P35/02

A61P19/02

A61P29/00 101

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2018544810

(86)(22)【出願日】2017-02-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-03-07

(86)【国際出願番号】 EP2017054374

(87)【国際公開番号】W WO2017144685

(87)【国際公開日】2017-08-31

【審査請求日】2020-02-13

(31)【優先権主張番号】16000468.5

(32)【優先日】2016-02-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】16002305.7

(32)【優先日】2016-10-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】519125450

【氏名又は名称】セカルナ・ファーマシューティカルズ・ゲーエムベーハー・ウント・コ・カーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ヤシンスキー， フランク

(72)【発明者】

【氏名】シルドゥアン，クゼニヤ

(72)【発明者】

【氏名】ミヒェル，スヴェン

【審査官】原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００６／００７４８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／１２９３９４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｑ

Ａ６１Ｋ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２～配列番号４、配列番号６～配列番号１１、配列番号２３～配列番号２６、および配列番号５３～配列番号６２からなる群から選択される、１５～２１ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列ＧＴＧＴＴＣを含み、この配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１４６～１５１位に相補的である、オリゴヌクレオチド。

【請求項2】

１５～２０ヌクレオチドからなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドは、ＨＤＬＭ２細胞においてＨＰＲＴ１の発現と比べて少なくとも８５％の、ＲＯＲＣ２の発現を阻害する、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

１つ以上のホスホロチオエートが、独立して、未修飾ホスフェート、またはホスホロチオエート以外の修飾ホスフェートと交換される、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

前記修飾ホスフェートが、メチルホスホネートである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項7】

急性炎症性疾患、慢性炎症性疾患、神経変性疾患、悪性腫瘍、および良性腫瘍のリストから選択される疾患または障害を予防するおよび／または処置するための方法において使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記炎症性疾患は、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、ベヒテレフ病、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット病、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、神経因性疼痛、アトピー性皮膚炎、およびアレルギーからなる群から選択される、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。

【請求項9】

前記腫瘍は、固形腫瘍、血行性腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星状細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、血管芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される、または胆管がん、膀胱がん、脳腫瘍、乳癌、気管支原性がん、腎臓のがん、子宮頸癌、絨毛がん、脈絡膜がん、嚢胞腺がん、胎児性がん、上皮がん、食道癌、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝臓がん、肺がん、髄様がん、頚部癌、非小細胞気管支原性／肺がん、卵巣癌、膵臓がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、前立腺癌、小腸がん、前立腺がん、直腸癌、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、皮膚癌、小細胞気管支原性／肺がん、扁平上皮がん、脂腺がん、精巣がん、および子宮癌からなる群から選択される、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＲＯＲγ（ガンマ）ｔｍＲＮＡを標的にすることをベースとする、炎症性障害および他の疾患を処置するための新規なアプローチに関するものである。本発明は、ＲＯＲγｔタンパク質をコードするＲＯＲＣ、転写変異体２ｍＲＮＡ（ＲＯＲＣ２）の特異的に選択される領域に相補的な１０～２２修飾または未修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関するものである。

【背景技術】

【0002】

Ｔｈ１７細胞は、いくつかの慢性炎症性疾患および自己免疫性疾患に関連したＴヘルパー細胞のサブセットである。極性化および活性化と同時に、Ｔｈ１７細胞は、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ならびにケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）ＣＸＣＬ８およびＣＣＬ２０のような非常に炎症誘発性の分子を産生する。さらに、Ｔｈ１７細胞は、ＧＭ－ＣＳＦのようなエフェクター分子を産生し、Ｂ細胞を助け、胚中心形成およびクラススイッチ（ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を誘発する。

【0003】

エフェクター機構および増悪性のＴｈ１７応答は、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の多様な表現型、喘息、およびアレルギーのような急性および慢性炎症性疾患の発病に関連する。

【0004】

関節リウマチでは、Ｔｈ１７の役割は、いくつかのマウスモデルおよび患者の材料において確認された。ＩＬ１７産生細胞の頻度の高まりは、病気の滑膜において発見され、コラーゲン誘発性関節炎モデルにおけるＩＬ１７の関節内投与は、ＲＡ症状の悪化を引き起こした。さらに、ＩＬ１７ＲＡ欠損マウスは、ＲＡの非常に軽度の形態しか発症しない。現在に至るまで、抗ＩＬ１７Ａおよび抗ＩＬ１７ＲＡモノクローナル抗体が、ヒトにおいて進行性のＲＡを防止することが示され、治療薬として承認されている。

【0005】

乾癬、乾癬性関節炎、および尋常性乾癬では、皮膚自己抗原および皮膚微生物叢に対するＴｈ１７細胞の慢性的な活性化および炎症誘発性の応答は、病状の主な原因である。それぞれの患者の皮膚生検材料は、高レベルのＩＬ１７、ＩＬ２３、ＩＬ６、およびＩＬ１２を示し、これは炎症誘発性の混合Ｔｈ１／Ｔｈ１７表現型を示す。そのうえ、乾癬プラーク中のＴｈ１７細胞は、ＣＣＬ２０を産生し、より多くのＴｈ１７、肥満細胞、および好中球を動員して、応答を延長し、高める。さらに、Ｔｈ１７は、にきび、皮膚筋炎、および強皮症のような他のいくつかの皮膚表現型の一部である炎症プロセスにおいて役割を果たす。

【0006】

皮膚疾患に加えて、Ｔｈ１７細胞はまた、さらに皮膚粘膜の炎症性疾患、慢性、アレルギー性、およびステロイド抵抗性の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ならびにクローン病、腸炎、および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患などにおいても重要な役割を果たす。ＩＬ１７Ａは、重度の喘息患者およびＣＯＰＤ患者の痰において高レベルで発見された。ＩＬ１７は、たばこ煙成分およびいくつかの汚染物質の標的であるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）を介して強力に誘発される。

【0007】

ＩＢＤの病状は、徹底的に研究された分野であり、有力なデータは、使用されるモデルの多様性にもかかわらず、Ｔｈ１７細胞の重要性を示す。クローン病では、患者は、Ｔｈ１７頻度の増加と共に疾患の再発期を経験する。強力なＴｈ１７促進性自己免疫性応答は、ＩＬ２３Ｒ多型に関係するかもしれず、腸微生物叢に対する行き過ぎた宿主防御は、いろいろなＴｈ１７媒介性機構をベースとする。それにもかかわらず、ＩＬ１７の阻害は、クローン病において有益と示されず、これは、患者集団におけるＩＢＤ表現型の多様性を反映する。

【0008】

Ｔｈ１７促進性であることが示された最初の疾患のうちの１つは、多発性硬化症であり、病気の複雑さは増しているが、Ｔｈ１７細胞は、今もなお中心的な役割をしている。ＭＳ患者の脳生検材料の多様な細胞型は、ＩＬ１７Ａ過剰発現およびリンパ球の広範囲な浸潤を示した。さらに、ＭＳの周辺の表現型もまた、これらの細胞がＢ細胞を助けることが示されたので、Ｔｈ１７依存性であるように思われ、自己抗体産生を誘発する可能性がある。

【0009】

ＭＳでのように、Ｔｈ１７細胞の同様の関与が、別の自己免疫性の表現型、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）において示された。この複雑で多様な疾患は、Ｔｈ１７細胞数の増加と共に悪化する。ＳＬＥにおけるＴｈ１７の主な影響は、進行性の脈管炎および内皮機能不全において観察された。この影響は、ＳＬＥだけでなく、ベーチェット病、ブドウ膜炎、およびシェーグレン（Ｓｊｕｅｇｒｅｎ）症候群にも特徴的である。ＩＬ１７産生細胞は、自己免疫性脈管炎患者の血管壁に蓄積し、好中球およびマクロファージのような他の炎症誘発性細胞を動員することが発見された。ＩＬ１７は、ヒト内皮細胞に対して血栓形成促進性のおよび凝血促進性の影響を有する。

【0010】

脈管炎でのＴｈ１７の蓄積に付きものであるが、冠動脈硬化症においてＴｈ１７の頻度および大動脈損傷の頻度の間に正の相関がある。ここで、Ｔｈ１７レベルの増加は、大動脈損傷のサイズおよび心筋梗塞の頻度の増加を引き起こす。

【0011】

関節リウマチに加えて、Ｔｈ１７は、別の慢性炎症性の関節および脊椎の疾患、ベヒテレフ（Ｂｅｃｈｔｅｒｅｗ）病において役割を果たす。ここで、進行中の腱の炎症の間に、Ｔｈ１７細胞および肥満細胞は、滑膜においてＩＬ１７を産生するのみならず、異所性骨形成および関節硬直を促進する。進行中の炎症は、抗ＴＮＦα療法によりかなり処置できるが、骨の再編成および強直は、Ｔｈ１７依存性かもしれない。

【0012】

まだ部分的にしか調査されていないＴｈ１７細胞についての１つの分野は、神経因性疼痛である。多様な神経因性で慢性の非特異的な腰痛が、Ｔｈ１７細胞および調節性Ｔ細胞の間のバランスの崩壊と相関しているというデータが蓄積している。

【0013】

総合的に考えると、Ｔｈ１７の発生および機能の阻害は、明らかに、前述の疾患の処置の有望な標的となると思われる。

【0014】

Ｔｈ１７細胞のマスター転写因子は、ＲＯＲγｔである。レチノイン酸受容体関連オーファン受容体（ＲＯＲ）は、ステロイドホルモン核内受容体ファミリーのメンバーである。ＲＯＲ転写因子サブファミリーは、３つのメンバーからなる：ＲＯＲα（ＲＯＲＡ）、ＲＯＲβ（ＲＯＲＢ）、およびＲＯＲγ（ＲＯＲＣ）。それぞれのメンバーは、独立した遺伝子として発現され、ゲノム応答エレメントに単量体として結合する。選択的スプライシングおよび特異なプロモーター使用頻度を通して、それぞれのＲＯＲメンバーは、異なる組織発現パターンを有し、かつ異なる標的を調節する変異体を生成する。ＲＯＲＣは、特異なプロモーター使用頻度から生じ、かつ第１のエクソンが異なる２つのアイソフォームを有する。これらの２つの転写変異体は、次のように注釈を付けられる：ＲＯＲγ（ＲＯＲＣ１）のＮＭ＿００５０６０およびＲＯＲγｔ（ＲＯＲＣ２）のＮＭ＿００１００１５２３。ＲＯＲγは、恒常的にまたは概日（２４時間周期）リズムの下、様々な組織で発現されるが、ＲＯＲγｔの発現は、免疫系の細胞に限られる。ＲＯＲγの最も高い発現は、骨格筋、腎臓、および肝臓で示されたが、ＲＯＲγｔの発現は、発生中のダブルポジティブ胸腺細胞、Ｔヘルパー系列１７細胞（Ｔｈ１７）、リンパ系組織インデューサー細胞（ＬＴｉ）、およびいくつかの上皮内リンパ球（ＩＬＣ）の亜集団において最高になる。ＲＯＲγｔがＦａｓ発現およびＩＬ２依存性を低下させ、胸腺選択の間に活性化誘発性の細胞死から胸腺細胞を救出するので、ＲＯＲγｔは、胸腺リンパ球新生において重要な役割を有する。さらに、ＲＯＲγｔは、ＬＴｉの機能および二次性リンパ系組織の発生にとって重要である。

【0015】

したがって、マスター分化因子、ＲＯＲγｔの阻害を通したＴｈ１７の発生および機能の阻害は、実行可能な選択肢であると思われる。

【0016】

Ｔｈ１７促進性の病状を阻害するための考え得る１つのアプローチは、既に存在しているＴｈ１７のエフェクター機能を阻害することおよびＲＯＲγｔをブロックすることによってＴｈ１７系列へのナイーブＴ細胞の新たな分化に干渉することである。しかしながら、ＲＯＲγｔは、細胞内分子であり、治療用抗体が到達することはできない。さらに、現在利用可能なＲＯＲγおよびγｔ小分子アンタゴニストは、両方の分子間で同一であるリガンドまたはＤＮＡ結合ドメインを標的にする。前に述べたように、ＲＯＲγは、至る所で発現され、多くの中心的な生理学的プロセスにおいて役割を有する。ＲＯＲγについて最も研究されている役割は、肝臓および骨格筋における脂質および糖代謝の概日性の調節である。ＲＯＲγがないと、肝臓代謝機能のアンバランス、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、および肥満が引き起こされる。そのうえ、いくつかの研究は、癌におけるＲＯＲγの重要な役割を証明した。マウスにおけるＲＯＲγ欠損は、頻繁な肝臓および脾臓転移と共に高い発生率の胸腺リンパ腫を引き起こす。したがって、ＲＯＲγｔ特異的阻害剤の必要性が高いが、未だ対処されていない。

【0017】

Ｔｈ１７促進性の病状を阻害するための１つの代替アプローチは、核酸レベルでＲＯＲγｔの発現をノックダウン（Ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）することである。利用可能な小分子治療薬と比較して、核酸レベルでのターゲティングが、ＲＯＲγｔの転写のみを標的にするように調節されてもよく、したがってＲＯＲγに影響がないので、そのようなターゲティングは、いくつかの重要な利点を有する。現在開発中の小分子は、このレベルの特異性を有しておらず、これにより、これらの薬剤候補による有害な副作用が引き起こされる可能性がある。しかしながら、１０～２３モチーフをベースとするＤＮＡザイムを使用する最初のアプローチは、ＧＡＴＡ－３の阻害に利用され、既に成功しているが［ＷＯ第２００５／０３３３１４号パンフレット］（特許文献１）、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて少なくとも５０％のＲＯＲＣ２の発現の阻害をもたらさなかった（実施例２を参照）。

【0018】

ＷＯ第２００６／００７４８６号パンフレット（特許文献２）は、免疫細胞の増殖に対するＲＯＲＣ２発現の影響力についての検査をベースとし、ＲＯＲＣ２発現の阻害剤またはアンタゴニストの使用を主張する。アンチセンス構築物は、有望な阻害剤として列挙されるが、有効な例は示されていない。

【0019】

ＷＯ第２０１２／１２９３９４号パンフレット（特許文献３）は、ＩＬ－９受容体アゴニストを使用することによる癌の処置に関し、アゴニストは、受容体に対して直接またはＲＯＲＣ２発現を調節することによって間接的に作用することができる。アンチセンス構築物は、有望な阻害剤として列挙されるが、有効な例は示されていない。

【0020】

ＣＮ第１０２ ７３２ ５６２号明細書（特許文献４）は、明らかに、たとえばＲＯＲＣ１のｓｉＲＮＡベースの阻害について記載しており、配列番号７～９に記載のｓｉＲＮＡ構築物を含む。ＲＯＲＣ２に対するｓｉＲＮＡ構築物は、示されているようには思われない。

【0021】

ＷＯ第２０１１／１１３０１５号パンフレット（特許文献５）は、核内ホルモン受容体（「ＮＨＲ_ｓ」）に対するアンチセンス構築物の使用に関する。ＲＯＲＣ１は、そのようなＮＨＲ_ｓの例として列挙されるが、ＲＯＲＣ２は列挙されていない。

【0022】

Ｈａｋｅｍｉ ｅｔ ａｌ．；Ａｖｉｃｅｎｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５（２０１３）１０－１９（非特許文献１）は、ＲＯＲＣ２のｓｉＲＮＡベースの遺伝子サイレンシングに関し、全部で３つの抗ＲＯＲＣ２ ｓｉＲＮＡ構築物を示す（表３を参照）。しかしながら、これらの構築物は、ＲＯＲＣ１と共有されるＲＯＲＣ２の領域に相当するので、ＲＯＲＣ２特異的であるようには思われない（開始位置は、この文献の図１において示される配列番号１のそれぞれ８７２、１１９７、および１３０３）。

【0023】

Ｂｕｒｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４（２０１０）６１６１－６１６９（非特許文献２）は、ＦＯＸＰ３プロモーターとＲＯＲＣ２の相互作用について検査し、ＲＯＲＣ２のノックダウンにおける２つのｓｉＲＮＡ構築物の使用を含む（補足の表４を参照）。しかしながら、これらの構築物は、ＲＯＲＣ１と共有されるＲＯＲＣ２の領域に相当するので、ＲＯＲＣ２特異的であるようには思われない（開始位置は、この文献の図１において示される配列番号１のそれぞれ８７５および２４７３）。

【0024】

Ｗｅｂｅｒｉｎｇ“Ｚｕｒ Ｒｏｌｌｅ ｄｅｓ α－Ｍｅｌａｎｏｚｙｔｅｎ－ｓｔｉｍｕｌｉｅｒｅｎｄｅｎ Ｈｏｒｍｏｎｓ（α－ＭＳＨ）ｕｎｄ ｄｅｓ ｒｅｔｉｎｏｉｄ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ γｔ（ＲＯＲγｔ）ｂｅｉ ｄｅｒ Ｉｍｍｕｎｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｅ ｄｅｓ Ａｓｔｈｍａ ｂｒｏｎｃｈｉａｌｅ”，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｌｕｅｂｅｃｋ ２０１４；Ｋａｔｅｇｏｒｉｅ“Ｙ” （非特許文献３）は、気管支喘息の免疫性の発病におけるＲＯＲＣ２の役割に関し、ＲＯＲγｔの発現を阻害するためのＤＮＡザイムおよび３つの異なるｓｉＲＮＡ構築物の使用を含む。ＤＮＡザイムの使用は、ＲＯＲγｔ発現に対して影響力を有することを何ら示すことができなかったが（セクション３．２．３および図３６を参照）、ｓｉＲＮＡ構築物は、明らかに、４８時間後に６５％以下のＲＯＲγｔの発現の低下をもたらした（セクション３．２．４および図３８を参照）。しかしながら、表５に示される配列が、この文献の図１に配列番号１として示されるＲＯＲＣ２配列と一致しないので、ＲＯＲγｔのどの領域が標的にされたかは不明瞭である。

【0025】

ＷＯ第２００４／０２４８７９号パンフレット；特許文献６は、ｐ２１経路とＲＯＲの相互作用に関する。全部で、ＤＮＡ配列は、１５の異なるＲＯＲについて示され、明らかにＲＯＲＣ２（配列番号１２）を含む。ＲＯＲＣ２ではなく、それらのＲＯＲのうちの３つについて、ｓｉＲＮＡベースのノックダウン実験が示される。

【0026】

Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１５：２９０６５７ ａｎｄ Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４５２（２０１４）１０４０－１０４５（非特許文献４）は、小分子およびアプタマー－ｓｉＲＮＡキメラによるＲＯＲＣ２の阻害に関する。明らかに示される配列情報はない。

【0027】

したがって、細胞内でＲＯＲγｔの発現を特異的に阻害することができる治療剤は、Ｔｈ１７促進性の疾患、特に、様々な器官の炎症性障害の処置に不可欠である。よって、ＲＯＲＣ２の発現および／または活性を低下させるまたは阻害する治療剤について高い科学的なおよび医学的な必要性が今もなおある。特に、特異的に相互作用し、したがって、ＲＯＲＣ２の発現を低下させるまたは阻害するオリゴヌクレオチドおよびいかなる（重度の）副作用ももたらすことなくＲＯＲＣ２を特異的に阻害するオリゴヌクレオチドについて長年の必要性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0028】

【文献】ＷＯ第２００５／０３３３１４号パンフレット

【文献】ＷＯ第２００６／００７４８６号パンフレット

【文献】ＷＯ第２０１２／１２９３９４号パンフレット

【文献】ＣＮ第１０２ ７３２ ５６２号明細書

【文献】ＷＯ第２０１１／１１３０１５号パンフレット

【文献】ＷＯ第２００４／０２４８７９号パンフレット

【文献】米国特許第４，７０４，２９５号明細書

【文献】米国特許第４，５５６，５５２号明細書

【文献】米国特許第４，３０９，４０６号明細書

【文献】米国特許第４，３０９，４０４号明細書

【非特許文献】

【0029】

【文献】Ｈａｋｅｍｉ ｅｔ ａｌ．；Ａｖｉｃｅｎｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５（２０１３）１０－１９

【文献】Ｂｕｒｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４（２０１０）６１６１－６１６９

【文献】Ｗｅｂｅｒｉｎｇ“Ｚｕｒ Ｒｏｌｌｅ ｄｅｓ α－Ｍｅｌａｎｏｚｙｔｅｎ－ｓｔｉｍｕｌｉｅｒｅｎｄｅｎ Ｈｏｒｍｏｎｓ（α－ＭＳＨ）ｕｎｄ ｄｅｓ ｒｅｔｉｎｏｉｄ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ γｔ（ＲＯＲγｔ）ｂｅｉ ｄｅｒ Ｉｍｍｕｎｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｅ ｄｅｓ Ａｓｔｈｍａ ｂｒｏｎｃｈｉａｌｅ”，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｌｕｅｂｅｃｋ ２０１４；Ｋａｔｅｇｏｒｉｅ“Ｙ”

【文献】Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１５：２９０６５７ ａｎｄ Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４５２（２０１４）１０４０－１０４５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0030】

ＤＮＡザイムベースのアプローチにより得られた否定的な結果にもかかわらず、本発明者らは、驚いたことに、あるアンチセンス構築物を使用する、どちらかと言えば類似しているアプローチにより、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて少なくとも５０％のＲＯＲＣ２の発現の阻害を実現することができ、いくつかの候補は少なくとも８０％、より詳細には少なくとも９０％の阻害を実現したことを確認した。この発見は予期しなかったことであり、先行技術によって教示も示唆もされていない。

【課題を解決するための手段】

【0031】

したがって、第１の態様では、本発明は、１０～２０ヌクレオチド、特に１５～１８ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに関し、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列のアンチセンス鎖に相当し、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、任意選択で修飾され、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて少なくとも５０％の、ＲＯＲＣ２の発現を阻害する。

【0032】

代替の第１の態様では、本発明は、１０～２２ヌクレオチド、特に１４～２１ヌクレオチド、特に１５～２１ヌクレオチド、およびより詳細には１５～２０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに関し、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列のアンチセンス鎖に相当し、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、任意選択で修飾され、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて少なくとも５０％の、ＲＯＲＣ２の発現を阻害する。

【0033】

第２の態様では、本発明は、本発明に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。

【0034】

第３の態様では、本発明は、急性炎症性疾患、慢性炎症性疾患、神経変性疾患、悪性腫瘍、および良性腫瘍のリストから選択される疾患または障害を予防するおよび／または処置するための方法において使用するための、本発明に記載のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物に関する。

【0035】

第４の態様では、本発明は、急性炎症性疾患、慢性炎症性疾患、神経変性疾患、悪性腫瘍、および良性腫瘍のリストから選択される疾患または障害を予防するおよび／または処置するための方法であって、その必要がある患者に本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。

【発明の効果】

【0036】

本発明は、急性炎症性疾患および慢性炎症性疾患、神経変性疾患、悪性腫瘍、ならびに良性腫瘍のリストから選択される疾患または障害を予防するならびに／または処置するための方法において使用するための本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１は、ＲＯＲＣ、転写変異体２ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１００１５２３．１）の全体を示す図である。大文字は、ＲＯＲＣ２（ＲＯＲγｔ）に特有で、かつＲＯＲＣ１と共有していない領域を示す。ＲＯＲＣ１に対して少なくとも３つのミスマッチが必要とされると仮定して、ＲＯＲＣ２のみに対して特異的な１７アミノ酸長オリゴヌクレオチドについて使用に適した所を太字で示す。生物情報科学的スクリーニングを、ＲＯＲＣ２のみに対してオリゴヌクレオチドの特異性を保つためにこのエリア内で実行した。

【図2】図２Ａは、実施例２において記載されるように、ＨＤＬＭ２細胞におけるＲＯＲγｔの阻害についての第１のオリゴヌクレオチドスクリーニングの結果を示す図である。 図２Ｂは、２つのＲＯＲＣ２特異的オリゴヌクレオチドについてのＩＣ_５０の決定を示す図である。プロットは、ＡＳＯ濃度（ｘ軸）に依存した、残存しているＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）の減少を示す。 図２Ｃは、漸増量の２例のＲＯＲＣ２特異的オリゴヌクレオチド（ｘ軸）の存在下におけるＲＯＲＣ２タンパク質発現（ｙ軸）を示す図である。 図２Ｄは、ＲＯＲＣ２特異的およびコントロールＡＳＯの存在下における両方のＲＯＲＣアイソフォーム、ＲＯＲＣ１およびＲＯＲＣ２に対する影響を示す図である。 図２Ｅは、ヒトＴｈ１７細胞における２つの特異的なオリゴヌクレオチドのノックダウン効果ならびに主なＴｈ１７特徴的サイトカイン、ＩＬ１７Ａ／ＦおよびＩＬ２２の低下を示す図である。 図２Ｆは、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を介してのヒトＴｈ１７細胞におけるＩＬ１７Ａ産生を示す図である。 図２Ｇは、２つのＲＯＲＣ２特異的オリゴヌクレオチドおよびｎｅｇ１コントロールについてのＴＮＢＳ誘発性大腸炎モデルにおけるルミノール試験結果を示す図である。 図２Ｈは、ＴＮＢＳモデルにおけるマウス結腸のＲＯＲＣ２発現および炎症スコアの低下を示す図である。 図２Ｉは、それぞれの実験群のマウス結腸におけるミエロペルオキシダーゼ発現を示す図である（赤色のドット－ミエロペルオキシダーゼ；青色の染色－ＤＡＰＩ）。

【図3】本発明において使用されてもよい多くの様々な修飾ヌクレオチドを示す図である。

【図4】実施例３において記載されるように、ＨＤＬＭ２細胞におけるＲＯＲＣ２阻害についてのさらなるオリゴヌクレオチドスクリーニングの結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

したがって、第１の態様では、本発明は、１０～２０ヌクレオチド、特に１５～１８ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに関し、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列のアンチセンス鎖に相当し、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、任意選択で修飾され、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて少なくとも５０％の、ＲＯＲＣ２の発現を阻害する。

【0039】

代替の第１の態様では、本発明は、１０～２２ヌクレオチド、特に１５～２１ヌクレオチド、より詳細には１５～２０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドに関し、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列のアンチセンス鎖に相当し、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、任意選択で修飾され、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて少なくとも５０％の、ＲＯＲＣ２の発現を阻害する。

【0040】

特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の５’末端部分に含まれる配列に相補的であり、前記５’末端部分は、ヌクレオチド１～１６６、特にヌクレオチド１～１６３、より詳細にはヌクレオチド１～１６２からなる。ただし、それぞれの場合に、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも３つのヌクレオチドが、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１～１４８位に含まれるヌクレオチドに相補的であることを条件とする。

【0041】

より詳細な実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の５’末端部分に含まれる配列に相補的であり、前記５’末端部分は、ヌクレオチド１３１～１６６、特にヌクレオチド１３１～１６３、より詳細にはヌクレオチド１３１～１６２からなる。ただし、それぞれの場合に、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも３つのヌクレオチドが、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１３１～１４８位に含まれるヌクレオチドに相補的であることを条件とする。

【0042】

特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列ＧＴＧＴＴを含み、この配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１４７～１５１位に相補的である。より詳細な実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列ＧＴＧＴＴＣを含み、この配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１４６～１５１位に相補的である。より詳細な実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列ＧＴＧＴＴＣＴを含み、この配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１４５～１５１位に相補的である。特定の他の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列ＴＧＴＧＴＴＣＴを含み、この配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１４５～１５２位に相補的である。特定の他の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列ＴＴＧＴＧＴＴＣＴを含み、この配列は、配列番号１のＲＯＲＣ２核酸コード配列の１４５～１５３位に相補的である。

【0043】

本発明の特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、より詳細には少なくとも８５％、より詳細には少なくとも９０％の、ＲＯＲＣ２の発現を阻害する。

【0044】

ある実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ＨＤＬＭ２細胞において未処置コントロールと比べて約９５％の、ＲＯＲＣ２の発現を阻害する。

【0045】

本発明において、ＲＯＲＣ２の発現の阻害は、下記の実施例２または実施例３において示される方法に従って決定される。

【0046】

本発明の特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオチドは、修飾されている。

【0047】

ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの基本単位を形成し、たとえば、核酸塩基（窒素塩基、たとえばプリンまたはピリミジン）、５炭素糖（たとえばリボース、２－デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、またはそれらの糖の安定化修飾体）、および１つ以上のリン酸基から構成される。修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートである。ヌクレオチドのそれぞれの化合物は、修飾可能であり、天然に存在するまたは天然に存在しない。後者の例は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’，４’拘束エチル核酸（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ｃ－ＥＴ）、２’－０，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ポリアルキレンオキシド－（トリエチレングリコール（ＴＥＧ）など）、２’－フルオロ－、２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’－０－メトキシ－、および２’－Ｏ－メチル－修飾ヌクレオチドである。図３は、本発明において使用されてもよい多くの様々な修飾ヌクレオチドの例を示す。

【0048】

「ＬＮＡ」は、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、リボース成分は、２’酸素および４’炭素をつなぐ追加のブリッジにより修飾されている（２’－４’リボヌクレオシド）。ブリッジは、３’－ｅｎｄｏ（Ｎｏｒｔｈ）コンホメーションでリボースをロックし、これは、Ａ型二重鎖で見出されることが多い。ＬＮＡヌクレオシドおよびヌクレオチドは、それぞれ、たとえば、α－Ｄまたはβ－Ｌ立体配置をしたチオ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、またはアミノ－ＬＮＡの形態を含み、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡの残基と、それぞれ混合するまたは組み合わせることができる。

【0049】

「架橋核酸」は、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、時に拘束または隔絶（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）ＲＮＡ分子とも呼ばれ、これは、「固定」Ｃ３’－ｅｎｄｏ糖パッカリングを有する５員、６員、またはさらには７員架橋構造を含有してもよい。ブリッジは、リボースの２’，４’位に合成により組み込まれ、２’，４’－ＢＮＡ単量体がもたらされる。詳細な例は、「ＥＮＡ」ヌクレオチドであり、ブリッジは、エチレンブリッジである。図３は、本発明において使用されてもよい多くのＢＮＡヌクレオチドを示す。

【0050】

特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオチドは、修飾されており、修飾ヌクレオチドは、特にホスホロチオエートおよびメチルホスホネート、特にホスホロチオエートから選択される修飾リン酸基を含有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのリン酸基はすべて、特にホスホロチオエートおよびメチルホスホネートから独立して選択される修飾リン酸基であり、特に、リン酸基はすべて、ホスホロチオエートである。

【0051】

特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドはすべて、ホスホロチオエート基によって連結される。

【0052】

特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオチドは、修飾されており、修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ｃ－ＥＴ、ＥＮＡ、ポリアルキレンオキシド、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシ、ＦＡＮＡ、および／または２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。

【0053】

特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’端の５ヌクレオチドのストレッチ内にある、特に、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’端にある。

【0054】

特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’端に少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、特に、少なくとも１つのＬＮＡ、ｃ－ＥＴ、および／またはＥＮＡを含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’端の５つ以下のヌクレオチドのストレッチ内に１、２、３、または４つのＬＮＡまたはｃ－ＥＴまたはＥＮＡおよび３’端の５つ以下のヌクレオチドのストレッチ内に１、２、３、または４つのＬＮＡまたはｃ－ＥＴまたはＥＮＡを含む。別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’端または３’端の５ヌクレオチドのストレッチ内に１、２、３、または４つのＬＮＡ、ｃ－ＥＴ、またはＥＮＡおよび３’端または５’端の５ヌクレオチドのストレッチ内にＴＥＧなどのようなポリアルキレンオキシドを含む。

【0055】

特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの５’端の５ヌクレオチドのストレッチ内に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドの３’端の５ヌクレオチドのストレッチ内に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むＧａｐｍｅｒである。特定の実施形態では、前記Ｇａｐｍｅｒは、前記オリゴヌクレオチドの５’端の５ヌクレオチドのストレッチ内に２または３つのＬＮＡヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドの３’端の５ヌクレオチドのストレッチ内に２または３つのＬＮＡヌクレオチドを含む。

【0056】

本発明では、用語「Ｇａｐｍｅｒ」は、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘発するのに十分に長いデオキシヌクレオチド単量体の中央にあるブロックを含有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。Ｇａｐｍｅｒの中央にあるブロックは、内側のブロックをヌクレアーゼ分解から保護する２’－Ｏ修飾リボヌクレオチドまたは架橋核酸（ＢＮＡ）などのような他の人工的に修飾されたリボヌクレオチド単量体のブロックが側面に位置する。多くの以前の研究において、修飾ＤＮＡアナログは、体液中でのそれらの安定性について調査された。これらの実験の大多数において、ホスホロチオエートＤＮＡアナログが、使用された。より最近では、ＢＮＡ単量体を含むいくつかのタイプの人工ヌクレオチド単量体が、Ｇａｐｍｅｒの設計におけるそれらの有用性について調査された。Ｇａｐｍｅｒは、ホスホロチオエート連結の数を低下させると同時に、標的ＲＮＡのＲＮアーゼ－Ｈ媒介性の切断を達成するために使用された。ホスホロチオエートは、未修飾ＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増加している。しかしながら、それらにはいくつかの不都合がある。これらには、相補的な核酸に対する結合能力が低いことおよび毒性の副作用を引き起こしてそれらの利用を制限する、タンパク質への非特異的な結合が含まれる。オフターゲットの影響を引き起こす非特異的な結合に加えて毒性の副作用が発生したことにより、毒性の副作用を示すことなく、インビボにおいて効率的で特異的なアンチセンス活性をもたらす修飾オリゴヌクレオチドの開発のための新たな人工核酸の設計が促された。

【0057】

ＬＮＡ Ｇａｐｍｅｒは、タンパク質、ｍＲＮＡ、およびｌｎｃＲＮＡの機能喪失型の研究についての強力なツールである。これらの単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ Ｈ依存性の分解を触媒する。ＬＮＡ Ｇａｐｍｅｒは、典型的に１２～２０ヌクレオチド長で、フランキング領域にはＬＮＡが、ＬＮＡがない中央にあるギャップにはＤＮＡが豊富で、よってＧａｐｍｅｒと名付けられた。ＬＮＡ含有フランキング領域は、アンチセンスオリゴに対するヌクレアーゼ抵抗性を与え、同時に、ＧＣ含有量にかかわらず標的結合親和性を増加させる。中央にあるＤＮＡ「ギャップ」は、結合と同時に標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ切断を活性化する。

【0058】

本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２～配列番号３４および配列番号５３～配列番号７４からなる群から；特に、配列番号２～配列番号４、配列番号６～配列番号２７、配列番号３１～配列番号３４、および配列番号５３～配列番号７４からなる群から；特に、配列番号２～配列番号４、配列番号６～配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３～配列番号２７、および配列番号５３～配列番号６４からなる群から；より詳細には、配列番号２～配列番号４、配列番号６～配列番号１１、配列番号２３～配列番号２６、および配列番号５３～配列番号６２からなる群から；より詳細には、配列番号２～配列番号４、配列番号６～配列番号９、配列番号２３、および配列番号５３～配列番号５９からなる群から；より詳細には、配列番号２～配列番号４、配列番号６、配列番号７、および配列番号５３～配列番号５５からなる群から選択される配列を含む。

【0059】

本発明のある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を含む。

【0060】

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２～配列番号３４および配列番号５３～配列番号７４からなる群から選択される配列の変異体であり、そのような変異体において、１つ以上のホスホロチオエートは、独立して、未修飾ホスフェート、または、ホスホロチオエート以外の修飾ホスフェート、特にメチルホスホネートと交換される。

【0061】

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２～配列番号３４および配列番号５３～配列番号７４からなる群から選択される配列の変異体であり、そのような変異体は、１つ以上のヌクレオチドミスマッチ、特に、１つまたは２つのミスマッチ、より詳細には、１つのミスマッチを含む、ただし、ミスマッチを含むいずれのそのような変異体も、実施例１において記載される生物情報科学的ツールにより分析した場合、適した種に対して相同性を維持しながら、ヒト全ゲノムスクリーニングと比べて少なくとも１つのミスマッチを含有することを条件とする。

【0062】

第２の態様では、本発明は、本発明に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。

【0063】

特定の実施形態では、医薬組成物は、医薬として許容されるキャリヤをさらに含む。

【0064】

特定の実施形態では、医薬組成物は、さらなるアンチセンス化合物、抗体、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、免疫調整化合物、医薬として許容される結合剤、および補助剤から選択される少なくとも１つの追加の構成成分をさらに含む。

【0065】

一実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび医薬組成物は、それぞれカプセル、錠剤、および丸剤などの形態をした投薬単位としてそれぞれ製剤され、たとえば以下の化合物を含有する：バインダーとしての結晶セルロース、ガム、またはゼラチン；賦形剤としてのデンプンまたはラクトース；潤滑剤としてのステアリン酸、様々な甘味料または香味料。カプセルについては、投薬単位は、脂肪油のような液体キャリヤを含有してもよい。同様に、糖または腸溶剤のコーティングは、投薬単位の一部であってもよい。

【0066】

オリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、様々なルートを介して投与できる。これらの投与ルートは、エレクトロポレーション、上皮、皮膚の中への陥入、動脈内、関節内、頭蓋内、皮内、病巣内、筋肉内、鼻内、眼内、髄腔内、前房内、腹腔内、前立腺内、肺内、脊髄内、気管内、腫瘍内、静脈内、膀胱内、身体の腔内への配置、経鼻吸入、経口、肺吸入（たとえば、ネブライザーによるものを含む、粉剤もしくはエアロゾルの吸入もしくはガス注入によるもの）、皮下、皮膚下、局所（眼ならびに膣および直腸送達を含む粘膜を含む）、または経皮投与を含むが、これらに限定されない。

【0067】

非経口、皮下、皮内、または局所投与については、オリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、たとえば滅菌希釈剤、バッファー、毒性の調節剤、および抗菌薬を含む。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、放出制御特性を有する移植片またはマイクロカプセルを含む、分解または身体からの即座の排出を防ぐキャリヤにより調製される。静脈内投与については、好ましいキャリヤは、たとえば生理的食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。経口投与のためのそのようなオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、たとえば粉剤もしくは顆粒剤、微小粒子、ナノ粒子、水もしくは非水溶媒中の懸濁剤もしくは水剤、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ、錠剤、または小型の錠剤を含む。非経口、髄腔内、前房内、または脳室内投与のためのものを含むオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、たとえば、バッファー、希釈剤、ならびに／または透過促進剤、キャリヤ化合物、および／または他の医薬として許容されるキャリヤもしくは賦形剤などのような他の適した添加剤を任意選択で含有する滅菌水溶液を含む。

【0068】

医薬として許容されるキャリヤは、たとえば液体または固体であり、ある特定の医薬組成物の核酸およびその他の構成成分と組み合わせられた場合に、所望の容積、濃度などを提供するために、考えられた投与計画方法により選択される。典型的な医薬として許容されるキャリヤは、結合剤（たとえばα化とうもろこしデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（たとえばラクトースおよび他の糖、結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、もしくはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅ）（たとえばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；または湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウムなど）を含むが、これらに限定されない。経口的に投与される投薬形態のための徐放性経口送達系および／または腸溶コーティングは、米国特許第４，７０４，２９５号明細書；米国特許第４，５５６，５５２号明細書；米国特許第４，３０９，４０６号明細書；および米国特許第４，３０９，４０４号明細書において記載される。補助剤はこれらの語句に含まれる。

【0069】

ヒト疾患予防および／または処置の方法における使用に加えて、本発明に記載のオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物はまた、家畜動物、爬虫類動物、鳥、外来の動物、および哺乳動物、げっ歯動物などを含む飼育動物を含む他の対象の予防および／または処置のための方法においても使用される。哺乳動物は、たとえばウマ、イヌ、ブタ、ネコ、または霊長動物（たとえばサル、チンパンジー、もしくはキツネザル）を含む。げっ歯動物は、たとえばラット、ウサギ、マウス、リス、またはモルモットを含む。

【0070】

第３の態様では、本発明は、急性炎症性疾患および慢性炎症性疾患、神経変性疾患、悪性腫瘍、ならびに良性腫瘍のリストから選択される疾患または障害を予防するならびに／または処置するための方法において使用するための本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。

【0071】

第４の態様では、本発明は、急性炎症性疾患、慢性炎症性疾患、神経変性疾患、悪性腫瘍、および良性腫瘍のリストから選択される疾患または障害を予防するおよび／または処置するための方法であって、その必要がある患者に本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。

【0072】

本発明の特定の実施形態では、炎症性疾患は、乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、ベヒテレフ病、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット病、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、神経因性疼痛、アトピー性皮膚炎、およびアレルギーからなる群から選択される。

【0073】

本発明の特定の他の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、血行性腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、乾癬、星状細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、血管芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、セミノーマ、トラコーマ、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択されるまたは胆管がん、膀胱がん、脳腫瘍、乳癌、気管支原性がん、腎臓のがん、子宮頸癌、絨毛がん、脈絡膜がん、嚢胞腺がん、胎児性がん、上皮がん、食道癌、子宮頸部のがん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭部癌、肝臓がん、肺がん、髄様がん、頚部癌、非小細胞気管支原性／肺がん、卵巣癌、膵臓がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、前立腺癌、小腸がん、前立腺がん、直腸癌、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、皮膚癌、小細胞気管支原性／肺がん、扁平上皮がん、脂腺がん、精巣がん、および子宮癌の群から選択される。

【0074】

理解しやすくするためおよび簡潔に説明するために、特徴について同じまたは別々の実施形態の一部として本明細書において記載するが、本発明の範囲は、記載される特徴のすべてまたはいくつかの組み合わせを有する実施形態を含んでいてもよいことが十分に理解されるであろう。

【0075】

以下の実施例は、本発明をさらに例証する役目を果たすであろうが、同時に、本発明を限定するものとみなされることは決してない。それどころか、本発明の範囲は、本明細書の説明を読み終えた後に本発明の精神から逸脱することなく当業者らに示唆されるかもしれない様々な他の実施形態、その変形、および等価物に言及することがはっきり理解されなければならない。

【実施例】

【0076】

実施例１：配列の選択およびオリゴヌクレオチド修飾プロセス
初めに、可能性のある標的部位に相当する適した配列を専用の生物情報科学ツールを使用して同定した。第２のステップで、これらの配列に対する化学修飾の影響について、修飾パターンを最適化するためにインシリコで予測した。

【0077】

１．段階的な配列選別プロセス
ＲＯＲＣについては、特異なプロモーター使用頻度から生じ、したがって第１のエクソンが異なる２つのアイソフォームが、知られている。これらの２つの転写変異体は、次のように注釈を付けられる：ＲＯＲγ（ＲＯＲＣ１）のＮＭ＿００５０６０およびＲＯＲγｔ（ＲＯＲＣ２）のＮＭ＿００１００１５２３。変異体ＲＯＲＣ２は、変異体ＲＯＲＣ１と比較して５’ＵＴＲおよびコード領域が異なる。そのため、アイソフォームＲＯＲＣ２は、アイソフォームＲＯＲＣ１と比較して短く、かつ異なるＮ末端を有する。ＲＯＲＣ２（ＮＭ＿００１００１５２３）およびＲＯＲＣ１（ＮＭ＿００５０６０）のｍＲＮＡは、それぞれ、３０５４ヌクレオチドおよび３０８４ヌクレオチドからなる。両方の配列のアライメントは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内にほとんど位置する最初の１４８ヌクレオチドのみが、ＲＯＲＣ２に特有であり、残りのヌクレオチドは共有されることを示す。

【0078】

この領域における１３アミノ酸長の長さ～１７アミノ酸長の長さの範囲にわたる配列長について、専用の生物情報科学的ツールを使用して分析した（合計８００配列）。

【0079】

以下の因子について、ＲＯＲＣ２特異的アンチセンス配列の選択のために考慮に入れた：
・ＲＯＲＣ１ ｍＲＮＡに対する少なくとも３つのミスマッチ
・部分的に相同な、可能性として考えられるオフターゲットｍＲＮＡが少ない
・マウスＲＯＲＣ２に対する交差反応性

【0080】

２．化学修飾の影響についての分析
融解温度およびヘアピンまたは二量体を形成する傾向などのような物理化学的特性に対する化学修飾の影響について、利用可能な予測ツールを使用して評価した。最も好都合な、予測された物理化学的特性を有するオリゴヌクレオチドを合成およびスクリーニングのために選択した。

【0081】

実施例２：アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡザイムによるＲＯＲＣ２の阻害
材料：
ＨＤＬＭ２細胞株－ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｌｉｎｉｅｎ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ／ＡＣＣ－１７）

【0082】

【表1】

【0083】

【表2】

【0084】

【表3】

【0085】

プロトコール：
ＨＤＬＭ２細胞株をＤＳＭＺから購入し、マスターセルバンクおよびワーキングセルバンク用に増やし、すべてのさらなる実験のために補足ＲＰＭＩ １６４０培地（５％ＣＯ_２および３７℃）において培養した。ワーキングセルバンクからのすべての解凍細胞バッチの培養期間を２～３週間とした。

【0086】

オリゴヌクレオチドはすべて、Ｅｘｉｑｏｎ（Ｖｅｄｂａｅｋ／Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＢｉｏｓｐｒｉｎｇ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。凍結乾燥オリゴヌクレオチドを、ＤＥＰＣ処置水により１ｍＭの濃度まで還元した。

【0087】

最初のスクリーニングは、それぞれのＲＯＲＣ２特異的オリゴヌクレオチドおよびネガティブコントロール（ｎｅｇ１；ＷＯ第２０１４１５４８４３Ａ１号パンフレットにおいて記載される）について１０μＭの単一の濃度でＨＤＬＭ２細胞株において実行した。細胞は、トランスフェクション試薬を用いないでオリゴヌクレオチドにより処置し（ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達）、ＲＯＲＣ２のノックダウンを決定するために３日後に溶解した。

【0088】

結果：
ＨＤＬＭ２細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの最初のスクリーニングにより、いくつかの非常に活性な分子がもたらされた。ＲＯＲＣ２およびＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルは、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ ｂＤＮＡアッセイによって決定した。ＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡレベルをＨＰＲＴ１レベル（ハウスキーピング遺伝子）に対して正規化（標準化）し、未処置コントロールとの関係について示した（図２Ａ）。正規化後のＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡ発現の平均値をそれぞれのオリゴヌクレオチドについて表３に列挙する。最高のノックダウン効率は、２つのオリゴヌクレオチド－Ａ０１０１８ＨＭ（９４．８％）およびＡ０１０１０ＨＭ（９４．２％）により実現された。

【0089】

これらの２つのオリゴヌクレオチドのさらなる特徴付けのために、発明者らは、用量－応答（dose-response）実験を実行した。発明者らは、３日間、段階希釈オリゴヌクレオチドによりＨＤＬＭ２細胞を処置し、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ ｂＤＮＡアッセイを介して、残存しているＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡを決定した（図２Ｂ）。Ａ０１０１０ＨＭについてのＩＣ_５０値は、２９０．５ｎＭ（相対的）および２３７．２ｎＭ（絶対的；１０μＭの最も高い濃度で９９．７％のノックダウン）である。Ａ０１０１８ＨＭについては、相対的ＩＣ_５０は、２７７．５ｎＭであり、絶対的ＩＣ_５０は、２００．１ｎＭ（９６．２％の最大のノックダウン）である。

【0090】

ＲＯＲＣ２タンパク質の用量（dose）依存性のノックダウン
タンパク質レベルに対するノックダウン効果を決定するために、発明者らは、Ｎ末端ｈｉｓタグつきＲＯＲＣ２タンパク質をコードするプラスミド構築物によりヒト癌細胞株、Ｈｅｌａをトランスフェクトし、漸増量のそれぞれのオリゴヌクレオチドによりそれらを処置した。ノックダウン効果は、ＲＯＲＣ２およびｈｉｓタグのＦＡＣＳ共染色によって決定した（図２Ｃ）。

【0091】

ＲＯＲＣアイソフォーム１および２に対する影響
２つのＲＯＲＣアイソフォームは、それらの５’領域、発現パターン、および生物学的機能が異なる。Ｔｈ１７促進性の、したがってＲＯＲＣ２促進性の自己免疫性の表現型に干渉するよう、発明者らは、ＲＯＲＣ２を特異的に標的にすることを目的とする。発明者らは、３日間の処置と同時にＨＤＬＭ２細胞におけるＲＯＲＣ１およびＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡの両方に対するＡＳＯの影響を分析し、ＲＯＲＣ１ ｍＲＮＡ発現にはほとんど影響しないことを観察したが、ＲＯＲＣ２は、用量依存的にノックダウンされた（図２Ｄ）。

【0092】

初代ヒトＴｈ１７細胞におけるＡＳＯの影響
ノックダウン効果の次のステップは、極性化ヒトＴｈ１７細胞において実行した。Ｔｈ１７細胞は、Ａｃｏｓｔａ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７）に従って、ヒトドナーの血液から生成した。極性化プロセスの間に、ヒトＴ細胞をオリゴヌクレオチドにより処置した。初めにＲＯＲＣ２のノックダウンが示され、その下流への影響－ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２２サイトカインの産生が続いた。

【0093】

極性化の間のＡＳＯの存在は、ＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡの発現を少なくとも５０％低下させた。さらに、ＩＬ１７Ａ／ＦおよびＩＬ２２サイトカイン分泌の低下は、ＲＯＲＣ２特異的ＡＳＯ処置群において観察された（図２Ｅ／Ｆ）。

【0094】

ＴＮＢＳ誘発性大腸炎マウスモデルにおけるＲＯＲＣ２特異的ＡＳＯ
Ｔｈ１７に関係のある疾患モデルにおけるＲＯＲＣ２ノックダウンの影響を検証するために、発明者らは、１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｒ．）のＲＯＲＣ２特異的ＡＳＯ（Ａ０１０１０ＨＭ、Ａ０１０１８ＨＭ）またはネガティブコントロール（ｎｅｇ１）によりマウスを処置した。マウスは、大腸炎誘発性のチャレンジおよび疾患増悪の前に２回およびその間に２回、処置した。１０日間の実験のエンドポイントで、発明者らは、結腸におけるＲＯＲＣ２ノックダウン、炎症スコア、およびミエロペルオキシダーゼ発現を測定した。Ａ０１０１０ＨＭおよびＡ０１０１８ＨＭは両方とも、結腸におけるＲＯＲＣ２の発現および全体的な炎症を低下させる（ルミノール試験）（図２Ｇ／Ｈ）。炎症スコアは、皮膚粘膜腸パラメーターにおける全体的な変化を示し、ＲＯＲＣ２特異的ＡＳＯの存在下において低下する（図２Ｈ）。さらに、結腸の至る所での炎症誘発性のミエロペルオキシダーゼの発現は、ＲＯＲＣ２ノックダウンにより低下する（図２Ｉ）。総合的に考えると、示されるＡＳＯは、インビボにおいて強力なノックダウン効果を有し、ＴＮＢＳ誘発性大腸炎モデルにおいて炎症を抑える。

【0095】

実施例３：ＲＯＲＣ２特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのｈｉｔ－ｔｏ－ｌｅａｄ最適化
最も高いノックダウン効果を有する最初に同定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＯＲＣ２スプライスｍＲＮＡ配列のみで生成される特有のエクソン－エクソンジャンクション部位に結合する。新たに設計し、かつスクリーニングしたＡＳＯも、特有のＲＯＲＣ２配列に結合する。この特有のＲＯＲＣ２配列は、次のとおりである（５’－３’、ｍＲＮＡ）：
ＡＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣ

【0096】

ＨＤＬＭ２細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの一用量スクリーニングにより、いくつかの非常に活性な分子がもたらされた。ＲＯＲＣ２およびＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルは、ｂＤＮＡアッセイによって決定した。ＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡレベルをＨＰＲＴ１レベル（ハウスキーピング遺伝子）に対して正規化（標準化）し、未処置コントロールとの関係について示した（図４）。正規化後のＲＯＲＣ２ ｍＲＮＡ発現の平均値をそれぞれのオリゴヌクレオチドについて表４に列挙する。Ａ０１０１８ＨＭ（最初のスクリーニングからの最も効率的なアンチセンスオリゴヌクレオチド）を内部標準として使用した。

【0097】

【表4】

【0098】

【表5】

【産業上の利用可能性】

【0099】

本発明は、炎症性障害を処置するための新規なアプローチを提供するものとして有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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