特許 7065976 マルチコピー遺伝子を用いたツツガムシ病の診断方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-28

(45)【発行日】2022-05-12

(54)【発明の名称】マルチコピー遺伝子を用いたツツガムシ病の診断方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20220502BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALI20220502BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220502BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/689 Z

C12N15/11 Z ZNA

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020537467

(86)(22)【出願日】2018-10-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-07-01

(86)【国際出願番号】 KR2018012785

(87)【国際公開番号】W WO2019135477

(87)【国際公開日】2019-07-11

【審査請求日】2020-07-06

(31)【優先権主張番号】10-2018-0002282

(32)【優先日】2018-01-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】515121092

【氏名又は名称】インダストリー－アカデミック コーポレーション ファウンデイション， チョソン ユニバーシティー

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＣＨＯＳＵＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】キム ドン ミン

【審査官】佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１６６２８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００７／０１８４４６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１１／１６２４４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１１－００２８６８９（ＫＲ，Ａ）

【文献】PLOS (2014), Vol.8, No.8, e3064(p.1-15)

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者から得られた試料中のオリエンティア・ツツガムシのマルチコピー遺伝子を、前記マルチコピー遺伝子の塩基配列を増幅させることのできるプライマー対を用いて検出する、ツツガムシ病の診断のためにオリエンティア・ツツガムシのマルチコピー遺伝子を検出する方法であって、
前記プライマー対が、マルチコピー遺伝子ｔｃｈＡに関する、配列番号１～２の対、配列番号３～４の対、配列番号５～６の対、配列番号７～８の対、配列番号９～１０の対、及び配列番号１１～１２の対の塩基配列からなる群から選択されたいずれか一以上の対の塩基配列を含む、方法。

【請求項2】

前記プライマー対が、さらに、マルチコピー遺伝子ｔｒａＢ、ｔｒａＥ、及び／又はｔｒｂＣに関する、配列番号１３～１４の対、配列番号１５～１６の対、配列番号１７～１８の対、配列番号１９～２０の対、配列番号２１～２２の対、配列番号２３～２４の対、配列番号２５～２６の対、配列番号２７～２８の対、配列番号２９～３０の対、配列番号３１～３２の対、配列番号３３～３４の対、及び配列番号３５～３６の対の塩基配列からなる群から選択されたいずれか一以上の対の塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

マルチコピー遺伝子ｔｃｈＡに関する、配列番号１～２の対、配列番号３～４の対、配列番号５～６の対、配列番号７～８の対、配列番号９～１０の対、及び配列番号１１～１２の対の塩基配列を含むことを特徴とする、ツツガムシ病の診断用プライマー対。

【請求項4】

さらに、マルチコピー遺伝子ｔｒａＢ、ｔｒａＥ、及びｔｒｂＣに関する、配列番号１３～１４の対、配列番号１５～１６の対、配列番号１７～１８の対、配列番号１９～２０の対、配列番号２１～２２の対、配列番号２３～２４の対、配列番号２５～２６の対、配列番号２７～２８の対、配列番号２９～３０の対、配列番号３１～３２の対、配列番号３３～３４の対、及び配列番号３５～３６の対の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載のツツガムシ病の診断用プライマー対。

【請求項5】

（ａ）患者から得られた試料からＤＮＡを分離する段階；
（ｂ）前記分離されたＤＮＡを鋳型として、マルチコピー遺伝子ｔｃｈＡに関する、配列番号１～２の対、配列番号３～４の対、配列番号５～６の対、配列番号７～８の対、配列番号９～１０の対、及び配列番号１１～１２の対の塩基配列を含むプライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物を分離する段階を含むことを特徴とする、ツツガムシ病の診断のためにオリエンティア・ツツガムシのマルチコピー遺伝子を検出する方法。

【請求項6】

前記プライマー対が、さらに、マルチコピー遺伝子ｔｒａＢ、ｔｒａＥ、及びｔｒｂＣに関する、配列番号１３～１４の対、配列番号１５～１６の対、配列番号１７～１８の対、配列番号１９～２０の対、配列番号２１～２２の対、配列番号２３～２４の対、配列番号２５～２６の対、配列番号２７～２８の対、配列番号２９～３０の対、配列番号３１～３２の対、配列番号３３～３４の対、及び配列番号３５～３６の対の塩基配列を含む、請求項５に記載のツツガムシ病の診断のためにオリエンティア・ツツガムシのマルチコピー遺伝子を検出する方法。

【請求項7】

マルチコピー遺伝子ｔｃｈＡに関する、配列番号１～２の対、配列番号３～４の対、配列番号５～６の対、配列番号７～８の対、配列番号９～１０の対、及び配列番号１１～１２の対の塩基配列を含むプライマー対を含むことを特徴とする、ツツガムシ病の診断用ＰＣＲキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マルチコピー遺伝子を用いたツツガムシ病の診断方法に関するものであって、好ましくはツツガムシ病の原因菌であるオリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）菌のマルチコピー遺伝子の塩基配列を増幅させることのできるプライマー及びこれを用いたツツガムシ病を診断する方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ツツガムシ病は、急性発熱性疾患としてオリエンティア・ツツガムシによって感染した毛ダニの幼虫に刺されて感染し、全身の血管炎による特徴的な臨床症状を呈する。主な宿主はげっ歯類であり、ダニは宿主であり媒介体である。主要な秋の劣性疾患として、韓国では１９５１年に初めて報告されて以来、韓国全域で９月から１１月の間に発生しており、特に、韓国の秋に発生する患者の３０％がツツガムシ病と診断されるほど一般的な病気である。

【0003】

症状は、感染した毛ダニの幼虫に刺された後、１～３週間の潜伏期間を経た後、初期症状として発熱、悪寒、頭痛、筋肉痛を伴うこともあり、紅斑性の斑点や丘疹性の発疹が胸、腹、胴或いは上下肢及び珍しい場合は顔や手のひら、足の裏に現れる。毛ダニに刺されたところには発症から数日内に黒いかさぶたで覆われる痂皮（ｅｓｃｈａｒ）が生じ、ほとんどの場合、痛みやかゆみなどの症状はなく、痂皮の確認は迅速な診断に有用である。

【0004】

だいたい症状の経過が重くなく、抗生物質の治療によく反応するが、診断が遅れる場合、肺炎、急性腎不全、髄膜炎、脳炎、上部胃腸管出血、多器官機能不全、さらには心筋梗塞や中風の形で現れることがあり、これらの合併症により一部の患者においては死に至ることがある。

【0005】

それ故、迅速且つ正確な診断が患者の予後を改善するために不可欠である。

【0006】

ツツガムシ病の診断は、患者の血液からオリエンティア・ツツガムシを培養、分離して確認する方法、患者の血清中からオリエンティア・ツツガムシに対する抗体を検出する方法がある。但し、菌体を培養して病気を診断する方法は、培養に必要な時間が数週以上要求されており、実際の患者の診断目的としてふさわしくない。

【0007】

主に診断に使用される検査方法は、間接免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）、受身赤血球凝集法（ＰＨＡ）及び免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が最も一般的に使用されている。

【0008】

これらの抗体を用いた診断法は、症状の発生１～２週間以後に検出される場合が多く、敏感度が非常に低く、偽陽性が多く、診断にあまり役立たない欠点がある。

【0009】

例えば、図１を参照すると、疾病管理本部に開示されているツツガムシ病を診断する方法のうち間接免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）を用いた診断はＩＦＡ ＩｇＧ抗体が１：２５６以上になると、ツツガムシ病確定と判定する。

【0010】

しかし、抗体が上昇して診断されるのに数週がかかることがあり敏感度も４６．７％と比較的低く、症状の発生から１週間で来院した場合、全体の患者の４２．１％だけがツツガムシ病と診断されることができ、より迅速且つ判定が容易な新たな診断法が求められている。

【0011】

代替診断法としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に基づいた検出法が提案されている。ＰＣＲは、ＤＮＡの望む部分のコピー（ｃｏｐｙ）の数を幾何級数的に増幅させることのできる分子生物学的方法である。ＤＮＡのどの部分でも、その配列さえ分かればＰＣＲにより増幅することができる。

【0012】

ＰＣＲ法は、従来の方法によって行われるコンベンショナル（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）ＰＣＲと、これを変形してコンベンショナルＰＣＲ法より１００倍さらに敏感なネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法、ＰＣＲ反応のリアルタイムモニタリング（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）が可能で、２時間以内に結果を速成で確認できるリアルタイム（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）ＰＣＲ法などがある。

【0013】

従来はツツガムシ病のＰＣＲ診断方法において、４６ｋＤａ、５７ｋＤａ、ｇｒｏＥＬなど、多様な標的タンパク遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲが試みられており、コンベンショナルＰＣＲよりはネスティッドＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲが主に用いられていた。ツツガムシ病の診断においてコンベンショナルＰＣＲを行う場合、敏感度が１０％以内で非常に低いという欠点があり、ネスティッドＰＣＲの場合、ＰＣＲを２回行って敏感度を向上させることができるが、他のＰＣＲに比べて検査時間がさらにかかる欠点とＰＣＲを２回行うので遺伝子の汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）により偽陽性率が高くなる欠点がある。

【0014】

但し、ＰＣＲ反応のリアルタイムでモニタリングするリアルタイムＰＣＲを行って検査を速成で診断する方法があるが、検査装置が非常に高価であるため、医療機関で普遍的に使用されるには難しいのが実情である。

【0015】

したがって、高い敏感度と特異度を示しながら、一般に検査方法が簡単且つコストが低い診断方法の開発が切実である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明は、上記のような問題点を解決するために案出されたものであって、本発明は、オリエンティア・ツツガムシ菌のマルチコピー遺伝子を用いてツツガムシ病を診断する方法を提供することを主目的とする。

【0017】

好ましくは、マルチコピー遺伝子の塩基配列を増幅することのできるプライマー対を用いてツツガムシ病を診断する方法を提供することを目的とする。

【0018】

また、本発明の第二の目的は、特定の塩基配列を含むプライマー対を提供することを目的とする。

【0019】

また、本発明の第三の目的は、特定の塩基配列からなるプライマー対を含むＰＣＲ診断キットを提供することを目的とする。

【0020】

好ましくは、本発明は、敏感度と特異度が優れた特定の塩基配列からなるプライマー対を提供することにより、ツツガムシ菌を迅速に診断することのできるＰＣＴ診断キットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0021】

上述した第一の目的を達成するために、本発明は、オリエンティア・ツツガムシ菌のマルチコピー遺伝子の塩基配列を増幅することのできる特定の塩基配列を含むプライマーを開示する。本発明のプライマーは配列番号１～配列番号３６の塩基配列からなる群の中から選ばれた１種以上の塩基配列を含む。

【0022】

好ましくは、本発明のプライマー対は、配列番号１～配列番号３６の塩基配列からなる群の中から選ばれた２種以上の塩基配列を含む。

【0023】

さらに好ましくは、前記プライマー対は、配列番号１及び配列番号２の塩基配列を含むことができる。

【0024】

本発明の第二の目的を達成するために、本発明のツツガムシ病の診断方法は、マルチコピー遺伝子（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｇｅｎｅ）の塩基配列を増幅させることのできるプライマー対を用いて検出することができる。

【0025】

上記の診断方法は、（ａ）試料からＤＮＡを分離する段階、（ｂ）前記分離されたＤＮＡを鋳型として配列番号１～配列番号３６のプライマー対を用いてＰＣＲを行う段階、及び（ｃ）前記ＰＣＲ産物を分離する段階を含むことができる。

【0026】

本発明の第三の目的を達成するために、ツツガムシ診断用ＰＣＲキットは、配列番号１～配列番号３６の塩基配列からなる群から選択されたプライマー対を含むことができる。

【発明の効果】

【0027】

本発明に係る特定の塩基配列を含むプライマー対は、マルチコピー遺伝子に対する高い特異性を有する。

【0028】

また、本発明に係るツツガムシ病の診断方法は、特定の塩基配列を含むプライマー対を用いてＰＣＲ反応によって高い敏感度と特異性で検出することができるので、高い信頼性により迅速且つ容易に臨床診断することができる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、間接免疫蛍光抗体法を用いた診断方法による検出敏感度のグラフである。

【図2】図２は、本発明に係るＰＣＲ検出方法を用いたツツガムシ病の診断方法を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下では、本発明を詳細に説明する。

【0031】

本発明のツツガムシ病の診断方法は、オリエンティア・ツツガムシ菌のマルチコピー遺伝子の塩基配列を増幅させることのできるプライマー対を用いて検出することができる。

【0032】

前記マルチコピー遺伝子（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｇｅｎｅ）は、オリエンティア・ツツガムシ遺伝子内の複数の位置に繰り返し存在する遺伝子をいい、好ましくは１４種のＴｒａ－ｌｉｎｋｅｄ遺伝子の塩基配列を含むことができ、さらに好ましくはｔｒａＢ、ｔｒａＥ、ｔｒａＣ及びＴｃｈＡ遺伝子の塩基配列を含むことができる。

【0033】

また、前記マルチコピー遺伝子は、ＰＣＲの標的遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）である。

【0034】

従来の診断方法で用いられていた４７ｋＤａ、５６ｋＤａ、ｇｒｏＥｌ－ＳＴＧなどの標的タンパク遺伝子は、全体の遺伝子の内部のある位置にのみ存在するのに比べて、マルチコピー遺伝子は、様々な位置に繰り返し存在するため、ＰＣＲを行って塩基配列を増幅時にＰＣＲ効率が高くなるので、ツツガムシ病の診断の精度を高めることができる。

【0035】

本発明のツツガムシ診断用プライマーは配列番号１～配列番号３６の塩基配列からなる群の中から選ばれた１種以上の塩基配列を含む。

【0036】

また、本発明のツツガムシ診断用のプライマー対は、配列番号１～配列番号３６の塩基配列からなる群の中から選ばれた２種以上の塩基配列を含む。

【0037】

前記プライマー対は、配列番号１及び配列番号２の塩基配列を含むことができる。

【0038】

通常、前記プライマー対は、互いに相補的な塩基配列を持たない２つのプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）をいう。

【0039】

プライマーは、特定の遺伝子配列に対して相補的な短い単線の遺伝子配列（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）でＤＮＡ合成の起点となり、ＰＣＲ検査、ＤＮＡシークエンシング（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などに用いられる。また、プライマーは、ＰＣＲ検査の最も重要な要素であり、精度を決定する。前記プライマーはオリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）保寧（Ｂｏｒｙｏｎｇ）菌株に感染した患者の血液から増幅した保寧（Ｂｏｒｙｏｎｇ）菌株のマルチコピー遺伝子の塩基配列に基づいて設計し、マルチコピー遺伝子と相補的な塩基配列を有する。

【0040】

また、前記ツツガムシ病の診断方法は、（ａ）試料からＤＮＡを分離する段階、（ｂ）前記分離されたＤＮＡを鋳型として配列番号１～配列番号３６のプライマー対を用いてＰＣＲを行う段階、及び（ｃ）前記ＰＣＲ産物を分離する段階を含むことができる。

【0041】

前記（ａ）段階でのＤＮＡ抽出は、当業界で通常使用される方法によって行われることができ、商業的に販売されているＤＮＡ抽出キットを用いて行うことができる。

【0042】

前記（ｂ）段階でＰＣＲは、分離されたＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマー対がＤＮＡ重合酵素を用いて相補的ＤＮＡ鎖（ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ）を合成してＰＣＲ反応を行うことができる。

【0043】

また、前記（ｂ）段階で一対のプライマーで増幅される産物内の塩基配列に基づいてプローブ（Ｐｒｏｂｅ）をさらに含んでリアルタイムＰＣＲ反応を行うことができる。

【0044】

前記プローブとは、塩基配列と特異的に結合することのできる数個乃至数百個の塩基からなる核酸断片を意味し、ラベリングされており、特定の核酸が存在するかどうかを確認することができる。プローブは、好ましくは、５’－末端及び３’－末端にそれぞれ蛍光物質が標識されることができる。

【0045】

また、さらに好ましくは、前記５’－末端に標識された蛍光物質は、６－カルボキシフルオレセイン（６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＡＭ）、ヘキサクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ）、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、及びＣｙａｎｉｎｅ－５（Ｃｙ５）、６－カルボキシ－４，５－ジクロロ－２，７－ジメトキシフルオレセイン（６－Ｃａｒｂｏｘｙ－４’，５’－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－２’，７’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６－ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＴＥＴ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ｔｅｒｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉａｃｙａｎａｔｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、５-カルボキシ－ｘ－ローダミン（５－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＲＯＸ）、６－カルボキシテトラメチル－ローダミン（６－ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ）からなる群から選ばれ、前記３’－末端に標識された蛍光物質は、６－カルボキシテトラメチル－ローダミン（６－ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ）またはｂｌａｃｋ ｈｏｌｅｑｕｅｎｃｈｅｒ－１，２，３（ＢＨＱ－１，２，３）であることができ、これに限定されるものではない。

【0046】

前記ＰＣＲは、重合酵素連鎖重合反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の略語であって、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定領域を試験管内で大量に増幅する技術であり、当業界で公知の複数の成分を含むＰＣＲ反応混合液を用いて行われることができる。前記ＰＣＲ反応混合液には、本発明で提供されるＰＣＲプライマー対以外に、適量のＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ緩衝溶液及び水（ｄＨ₂Ｏ）を含むことができる。

【0047】

また、ＰＣＲ緩衝溶液は、トリス－ＨＣｌ（ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ＭｇＣｌ₂、ＫＣｌ等を含むことができる。

【0048】

ＰＣＲは、通常、３つの反応段階からなっている。第一番目はＤＮＡの変性段階で、二本鎖のＤＮＡを、温度を加えて一本鎖のＤＮＡに分離させる段階であり、第二番目はプライマーの結合段階で、一本鎖に変性したＤＮＡとプライマーを共存させた後、温度を下げるとプライマー対がそれぞれ相補的な一本鎖の鋳型ＤＮＡに結合される段階であり、第三番目は伸長反応で４種類の基質（ｄＮＴＰ）が共存する状態でＤＮＡ重合酵素を作用させてプライマーを伸長させる段階からなっている。

【0049】

前記ＰＣＲは、通常のＰＣＲ反応を用いることができ、好ましくは、最も一般的なコンベンショナル（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）ＰＣＲ、２回のＰＣＲを同時にまたは連続して行うデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）ＰＣＲ及びネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ、リアルタイムで結果を確認することのできる高価なリアルタイム（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）ＰＣＲのいずれをも用いることができ、最も好ましくはコンベンショナルＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを用いることができる。

【0050】

前記リアルタイム（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングして確認することができるので、追加的な電気泳動分析方法を用いなくてもよく、エンドポイント（Ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）でＰＣＲ増幅産物を確認する既存のＰＣＲ法に比べて、迅速且つ容易にＰＣＲを解析することができ、汚染の危険性が少ない。

【0051】

リアルタイムＰＣＲ増幅産物の検出方法は、標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に特異的であり、蛍光染料（ｄｙｅ）が結合されたプローブ（Ｐｒｏｂｅ）を用い、検出特異性が高く、似た配列までも区別して検出することができる。

【0052】

また、前記（ｃ）段階では、当業界で広く公知された方法によってＰＣＲ産物を分離することができる。好ましくは、アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）またはポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）電気泳動または蛍光分析装置（ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１００ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ－ｅｌｅｃｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）によって確認することができる。電気泳動後、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）染色で電気泳動の結果を分析することができる。

【0053】

本発明のツツガムシ病の診断用ＰＣＲキットは、配列番号１～配列番号３６の塩基配列からなる群から選択されたプライマー対を含むことができる。

【0054】

また、前記検出用ＰＣＲキットには、前記マルチコピー遺伝子の塩基配列を増幅することのできるプライマー対以外にも、重合酵素連鎖重合反応に関与する酵素、ｄＮＴＰ、緩衝溶液を含むことができ、ＰＣＲ産物の増幅かどうかを確認することのできる電気泳動の実行に必要な構成成分であるミネラルオイル、標準マーカー、染色試薬であるブロモフェノールブルーまたはキシレンＦＦなどのＰＣＲ用の材料を含むことができる。

【0055】

以下、本発明を次の実施例によって菌の検出、診断方法についてより具体的に説明する。

【0056】

次の実施例は単に本発明を詳細に説明するためのもので、これらによって本発明の内容及び範囲が実施例によって限定されるものではないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。

【0057】

＜実施例＞
１．プライマーの作製
韓国で一般的なツツガムシ保寧（Ｂｏｒｙｏｎｇ）菌株に感染した患者の血液から増幅されたマルチコピー遺伝子（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｇｅｎｅ）に基づいて設計された。

【0058】

さらに好ましくは、前記プライマーはＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＭ４９４４７５．１：Ｏ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ Ｂｏｒｙｏｕｎｇ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｔｈｃＡ ｇｅｎｅ（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して正方向のプライマー（ｐｏｓｉｔｉｏｎ１４－３４）と逆方向のプライマー（ｐｏｓｉｔｉｏｎ１７１－１５１）で作製し、それぞれ配列番号１～配列番号３６で表記した。

【0059】

また、プローブ（ｐｒｏｂｅ）は、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ５８－７８）で作製し、配列番号３７と３８で表記した。

【0060】

本発明の実施例によって作製されたプライマー及びプローブを下記の表１に示した。

【0061】

【表1】

【0062】

前記プライマーはマルチコピー遺伝子であるｔｃｈＡ、ｔｒａＢ、ｔｒａＥ、ｔｒｂＣと相補的な塩基配列を有することができる。

【0063】

また、前記プライマーの配列の長さはそれぞれ１９ｎｔ～３０ｎｔ、ＧＣ含量は２０～６０％であり、Ｔｍ値は５０～７０℃となるように作製した。

【0064】

２．検体の準備
２００７年から２００８年の間に、朝鮮大学校病院に来院した患者を対象に、当時痂皮または半球真性発疹などがあり、頭痛、全身脆弱感、筋肉痛、咳、吐き気、腹痛などの２種類以上の臨床症状を持っている患者の血液サンプルを採取し、遺伝子を抽出して検査に用いた。

【0065】

血液検体において間接免疫蛍光検査法（ＩＦＡ）でオリエンティア・ツツガムシに対するｌｇＧ抗体が４倍以上上昇した場合をツツガムシ病の確定診断と定義し、ツツガムシ病と確定診断された患者５２人の血液を陽性対照群とし、ツツガムシではない他の疾患と診断された患者２０人の血液を陰性対照群として使用した。

【0066】

３．オリエンティア・ツツガムシの検出
作製したプライマー及び診断方法の有効性を確認するために準備した陽性対照群と陰性対照群の検体を対象としてＤＮＡを検出して、図２に示すようにＰＣＲを行った。

【0067】

患者から全血を採取し、白血球軟層を分離した後、ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＤＮＡを分離した。分離方法は、キットに同梱されたマニュアル（ｍａｎｕａｌ）により実施し、分離したＤＮＡはオリエンティア・ツツガムシ菌の検出のための鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用した。

【0068】

抽出されたＤＮＡを鋳型としてコンベンショナルＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲを行った。

【0069】

このとき、実験に使用したプライマーとしては、本発明の配列番号１～配列番号３６の塩基配列を持つプライマーと配列番号３７及び３８の塩基配列を持つプローブを用いた。

【0070】

コンベンショナルＰＣＲ及びネスティッドＰＣＲはＡｃｃｕＰｏｗｅｒ^TM ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（１Ｕ Ｔｏｐ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５０μｍ ｄＮＴＰ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０；Ｂｉｏｎｅｅｒ）に２μｌ鋳型ＤＮＡ、それぞれ１μｌずつ１０ｐｍｏｌｅ／μｌ正方向プライマー及び逆方向プライマー、１６μｌの滅菌３次蒸留水を添加して総２０μｌの反応液を調製した後、チューブをよく混合してＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｅｒｉｔｉ^TM ９６－ｗｅｌｌ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にセットした後、ＰＣＲを行った。

【0071】

また、リアルタイムＰＣＲは、１μｌの２ｐｍｏｌｅ／μｌプローブを含んで上記と同様の方法で反応液を調製した後、チューブをよく混合してＢＩＯＮＥＥＲ Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ^TM ９６Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢＩＯＮＮＥＲ）にセットした後、ＰＣＲを行い、プローブの５’と３’－末端にＦＡＭ（６－ｃａｒｂｏｘｙＦｌｕｏ－ｒｅｓｃｅｉｎ）とＢＨＱ－１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－１）で標識して使用した。

【0072】

ＰＣＲ実行条件は、表２に示した。

【0073】

ＰＣＲ終了後、０．５ｎｇ／ｍｌ ＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｂｉｏｎｅｅｒ）を入れた１．５％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ（Ｓｅａｋｅｍ ＬＥ ａｇａｒｏｓｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をバイオニア電気泳動装置（Ｂｉｏｎｅｅｒ）にロードし、１００Ｖ（１Ｘ ＴＥＡ、Ｂｉｏｎｅｅｒ）の条件で４０分間ＰＣＲ増幅産物を電気泳動を行い、その結果を観察した。

【0074】

ＰＣＲ検査の結果、陰性対照群に対するＰＣＲ増幅産物は、電気泳動させた時にどこにもバンドが観察されなかった。また、本発明のプライマー対によるＰＣＲ増幅産物の大きさは表３に示されており、その大きさのバンドを確認することにより、オリエンティア・ツツガムシが検出されるかどうかを確認することとし、ＰＣＲ増幅産物は、間接免疫蛍光検査法と一致する結果が導出されることが確認できた。

【0075】

【表2】

【0076】

【表3】

【0077】

＜比較例＞
１．従来の方法によるオリエンティア・ツツガムシの検出
本発明のプライマー及び診断方法の有効性を比較するために下記のように比較実験を行った。

【0078】

鋳型ＤＮＡは、前記血液検体から分離したものを同様に使用し、それぞれの実験は、ツツガムシ菌の検出に一般的に使用される標的タンパク遺伝子である５６ｋＤａ、４７ｋＤａに対するコンベンショナルＰＣＲとネスティッドＰＣＲを行っており、その結果を表４に示す。

【0079】

それぞれのＰＣＲに使用したプライマー対は、参考文献に基づいて作製するか、直接デザインして使用し、実施例３と同様の方法でＰＣＲを実施した。

【0080】

４７ｋＤａ遺伝子を増幅させるためのプライマー対は、参考文献（Ｊｉａｎｇ Ｊ、Ｃｈａｎ ＴＣ、Ｔｅｍｅｎａｋ ＪＪ、Ｄａｓｃｈ ＧＡ、Ｃｈｉｎｇ ＷＭ、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＡＬ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．２００４ Ａｐｒ；７０（４）：３５１－６．）を参照して作製した。

【0081】

また、５６ｋＤａ遺伝子を増幅させるためのプライマー対は、参考文献（Ｋｉｍ ＤＭ、Ｙｕｎ ＮＲ、Ｙａｎｇ ＴＹ、Ｌｅｅ ＪＨ、Ｙａｎｇ ＪＴ、Ｓｈｉｍ ＳＫ、ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．２００６ Ｓｅｐ；７５（３）：５４２－５．）を参照して作製した。

【0082】

【表4】

【0083】

＜結果＞ツツガムシ病の診断方法の有効性確認
本発明のプライマーを用いた実施例３と比較例のオリエンティア・ツツガムシの検出方法において、オリエンティア・ツツガムシの検出敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び検出時間を測定した結果を表５に示す。

【0084】

表５から分かるように、実施例３のＴｒａＢ遺伝子を標的としてコンベンショナル（Ｃ）－ＰＣＲを行った場合、比較例１の５６ｋＤａ、４７ｋＤａ遺伝子を標的としたネスティッド（Ｎ）－ＰＣＲに比べて少ない時間が所要された。

【0085】

また、実施例３のＴｒａＢ１、ＴｒａＢ２遺伝子を標的としてコンベンショナル（Ｃ）－ＰＣＲを行った場合、それぞれ８２．７％と８８．５％の敏感度を示した。

【0086】

特に、Ｔｃｈ遺伝子を標的として用いる場合には、コンベンショナルＰＣＲ（Ｃ－ＰＣＲ）を行った場合、９０．４％の敏感度を示し、リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）を行った場合、検出時間が１～２時間に過ぎないにも関わらず敏感度が９８．１％を示した。

【0087】

よって、下記表５に示すように、本発明のプライマー対は、本発明が達成しようとした目的及び効果を達成した。

【0088】

上記の結果によれば、本発明に係るプライマー対を用いたＰＣＲ検出方法は、オリエンティア・ツツガムシの感染の有無を確認するのに十分な敏感度を提供できることが確認できる。

【0089】

【表5】

【0090】

以上により、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述しており、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は、単に正確な実施の例示であるだけで、これにより本発明の範囲が制限されるものではなく、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項によって定義されるといえる。

【図1】

【図2】

【配列表】

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