特許 7066293 サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）発現増強用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-02

(45)【発行日】2022-05-13

(54)【発明の名称】サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）発現増強用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/185 20060101AFI20220506BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20220506BHJP

   A61K 31/37 20060101ALI20220506BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220506BHJP

【ＦＩ】

A61K36/185

A23L33/105

A61K31/37

A61P43/00 111

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2019204950

(22)【出願日】2019-11-12

(65)【公開番号】P2021075501

(43)【公開日】2021-05-20

【審査請求日】2021-07-01

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(74)【代理人】

【識別番号】100162396

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 泰之

(72)【発明者】

【氏名】坂井 友美

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 知倫

(72)【発明者】

【氏名】澤野 健史

【審査官】菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５０５１６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２０－１４７５１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５２４６７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Microvascular Research, 2013, Vol.90, pp.30-39

【文献】Nutrients, 2018, Vol. 10, 799, pp. 1-16

【文献】International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2011, Vol. 3, Issue 4, pp. 343-347

【文献】Archives of Pharmacy Practice, 2016, Vol. 7, Suppl. 1, pp. S39-42

【文献】Journal of Applied Pharmaceutical Science, April 2019, Vol. 9, pp. 077-081

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３６／１８５

Ａ２３Ｌ ３３／１０５

Ａ６１Ｋ ３１／３７

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現増強用組成物（但し、増殖性網膜症、視覚機能、骨粗鬆症、加齢に伴う性機能低下の改善、アルツハイマー症及び認知症の改善用組成物を除く）。

【請求項2】

トンカットアリの抽出物がトンカットアリの水及び／又は有機溶剤抽出物である請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

トンカットアリの抽出物が、ユーリコマノンを含有する抽出物である請求項１、２のいずれかに記載の組成物。

【請求項4】

ユーリコマノンを有効成分として含有する、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現増強用組成物（但し、増殖性網膜症、視覚機能、骨粗鬆症、加齢に伴う性機能低下の改善、アルツハイマー症及び認知症の改善用組成物を除く）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サーチュインの１つであるＳＩＲＴ１の発現増強作用を有する組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

サーチュイン遺伝子は、長寿遺伝子とも呼ばれ、その活性化により生物の寿命が延びるとされる。サーチュイン遺伝子の活性化により合成されるタンパク質、サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）はヒストン脱アセチル化酵素であり、ヒストンとＤＮＡの結合に作用し、遺伝的な調節を行うことで寿命を延ばすと考えられている。

【0003】

サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）は、加齢によって発現が低下する一方、カロリー制限により活性化されること、またブドウの果皮や赤ワイン、ピーナッツ等に含まれるポリフェノールであるレスベラトロールによって活性化されることが知られている（非特許文献１）。

【0004】

サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）は各組織において様々な役割を担っており、アルツハイマー型老年認知症、骨粗鬆症、動脈硬化、骨格筋減少症などの老化関連疾患との関連についての研究も行われている。

【0005】

例えば中枢神経系における作用として、アルツハイマー型認知症モデルマウスを使った研究では、レスベラトロール投与によるサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の活性化により、海馬での神経変性を抑制し、認知機能の改善が認められた報告がある（非特許文献２）。一方、末梢神経系における作用としては、ブルーベリー抽出物等がサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の活性化を通して、屈折異常等の眼疾患治療用組成物として提供されている例や（特許文献１）、糖尿病網膜症の抑制に効果をもたらすといった報告（非特許文献３）がある。
このように、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の活性化剤はその用途に期待が高く、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）のさらなる活性化剤への要望は強い。

【0006】

一方、ニガキ科に属する植物の一種であるトンカットアリ（和名：ニガキ科ナガエカサ、学名：Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）の抽出物は、マレーシアなどの東南アジアでは古来より解熱剤、マラリア治療および胃病等の民間薬として用いられてきた。近年この抽出物に男性更年期障害の改善作用が見いだされた（特許文献２）。また、特許文献３には、トンカットアリの男性機能に対する活性は、クアシノイド類、クマリン類などの配糖体にあり、極性有機溶媒で抽出できることが記載されている。また、トンカットアリに含まれるユーリペプチドがコレステロールを出発点とする男性ホルモンの生合成に関与していることがわかり、生合成されたテストステロンが男性生殖器や脳、皮膚、筋肉、骨、腎臓、肝臓などの様々な標的部位で活性を示すことが報告されている。さらに、特許文献４には、トンカットアリの根から水抽出した後、ゲル濾過法によって分画することによってテストステロン作用を有する物質を単離できることが記載されている。また、男女問わずトンカットアリ抽出物の摂取により、免疫力が向上したことを示す報告がある。このように、トンカットアリはヒトへの様々な生理作用が報告されている摂取経験の多い植物であるが、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現増強作用は、これまで知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特開２００６－２９８８７６公報

【文献】特開２００９－０５１７６５号公報

【文献】特表２０１０－５００３４２号公報

【文献】米国特許第７１３２１１７号公報

【非特許文献】

【0008】

【文献】Nature. 2003 Sep 11;425(6954):191-6.

【文献】EMBO J 2007; 26: 3169―3179

【文献】Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Nov 25;52(12):9142-8.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、トンカットアリ抽出物を有効成分として含有する、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現増強用組成物を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、多数の天然物や化合物の網膜由来ミュラー細胞に対する作用を研究する過程で、ミュラー細胞に作用してサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現を増強する効果を有する物質を見出し、本発明をなした。

【0011】

すなわち、
本発明は、以下の構成からなる。
（１）トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現増強用組成物。
（２）トンカットアリの抽出物がトンカットアリの水及び／又は有機溶剤抽出物である（１）に記載の組成物。
（３）トンカットアリの抽出物が、ユーリコマノンを含有する抽出物である（１）（２）のいずれかに記載の組成物。
（４）ユーリコマノンを有効成分として含有する、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現増強用組成物。

【発明の効果】

【0012】

本発明により、トンカットアリの抽出物を有効成分とする、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現を増強する組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】トンカットアリの抽出物がサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現を増強することを示すグラフである。

【図2】トンカットアリの抽出物中に含まれるユーリコマノンがサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の発現を増強することを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明について具体的に説明する。
なお、本発明でいう「組成物」とは、トンカットアリの抽出物を含有し、サーチュイン１（以下「ＳＩＲＴ１」）の発現を増強するものをいう。「組成物」には飲食品、医薬品、健康食品を包含する。

【0015】

本発明に用いられるトンカットアリの抽出物としては、特に限定されるものではないが、東南アジアに生育する樹木の幹または根の抽出物が好ましく用いられる。中でも、トンカットアリの根の水性溶媒抽出物が好ましく用いられる。

【0016】

トンカットアリの抽出物は、特許文献４に開示されている還流冷却器を付した熱水抽出法によって抽出することが好ましい。またアルコール或いは水とアルコールの混合溶液による抽出でも良い。抽出液は、凍結乾燥等の乾燥手段によって溶媒を除去し、抽出エキスとしても良い。なお、このような抽出エキスは、トンカットアリ乾燥エキスとして市販されており、これを本発明に用いても良い。市販されているものとして「トンカットアリ（Ｐｈｙｓｔａ：登録商標）フィスタ：アスク薬品株式会社」を例示できる。

【0017】

さらに抽出物は、公知の分離精製方法を適宜組み合わせて活性を高めることもできる。
トンカットアリの抽出物をヒトに投与する場合は、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、医薬品、サプリメント等の健康食品として使用可能である。

【0018】

トンカットアリの抽出物を食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。

【0019】

また、トンカットアリの抽出物を含有する組成物をサプリメントや医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。

【0020】

トンカットアリの抽出物を医薬品やサプリメントの製剤とする場合は、トンカットアリの抽出物を一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって、容易に得ることができる。この場合、本発明に用いられる抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性基剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。

【0021】

本発明のトンカットアリの抽出物を含有する組成物は、特に限定されるものではないが、好ましくは抽出物の乾燥物として通常全組成の０．００００１～９９．５質量％の範囲で含有される組成物とする。

【実施例】

【0022】

実施例、試験例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜実施例１．ＳＩＲＴ１発現増強作用＞
（１）初代ミュラー細胞の調製
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。
７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（－）で５倍希釈したトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｔ３９２４）にＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した溶液１０ｍｌ中で、３７℃で３０分間静置した。ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を吸引除去した後、１０％ＦＢＳ（ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍｌに懸濁した。懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう希釈した。Ｔ－７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社）に１０ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した（培養０日目）。培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍｌに交換し、再び３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。培養７日目に、Ｗｅｉ－Ｔａｏ Ｓｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；６（６）：７７８－７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、４ｘ１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるよう懸濁し、９６ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ （ＦＡＬＣＯＮ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。

【0023】

（２）トンカットアリ抽出物のＳＩＲＴ１発現増強作用の確認
トンカットアリ抽出物のＳＩＲＴ１発現増強作用について、以下の方法で試験した。
１）試験試料
トンカットアリ抽出物は、アスク薬品株式会社より入手した（製品番号０１２．１０５「トンカットアリ乾燥エキス Ｐｈｙｓｔａ」）を試験に用いた。このエキスは、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ Ｊａｃｋの乾燥根から水抽出されたものであって、規格成分として、ユーリコマノンを０．８～１．５質量％、グリコサポニンを３５質量％以上、総多糖類を３０質量％以上、総蛋白を２２質量％以上含有する粉末である。以下の試験においては、ＤＭＳＯで溶解して使用した。

【0024】

２）ＳＩＲＴ１発現増強
実施例１に記載の方法で調製した培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ_２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。
上記のトンカットアリ根抽出物を、０、５０、１００μｇ／ｍｌに濃度になるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅＩＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。約４０ｎｇの調製したＲＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
ＳＩＲＴ１の発現量はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用い、内在性コントロールにはラットＧａｐｄｈ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いて、次の方法で定量した。１μＬのｃＤＮＡとラットＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、ラットＳＩＲＴ１ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｔａｑｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］ｘ４５サイクルの反応条件で測定を行った。
測定により得られたＣｔ値からＧａｐｄｈを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
使用したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。
Ｇａｐｄｈ：Ａｐｐｉｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１（Ｄｙｅ：ＶＩＣ，Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）
ＳＩＲＴ１：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ０１４２８０９６＿ｍ１（Ｄｙｅ：ＦＡＭ，Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）
３）結果
測定結果を図１に示した。図１から、ラット初代ミュラー細胞において、トンカットアリ根抽出物は、添加濃度依存的にＳＩＲＴ１の発現を増強した。

【0025】

＜実施例２．ユーリコマノンによるＳＩＲＴ１の発現増強作用＞
トンカットアリ根抽出物中に含有されるユーリコマノンのＳＩＲＴ１発現増強作用について、以下の方法で試験した。
（１）試験方法
１）試験試料
ユーリコマノンは富士フイルム和光純薬株式会社より購入し、試験に用いた。試験にあたってＤＭＳＯで溶解し使用した。

【0026】

２）ＳＩＲＴ１発現増強
実施例１に記載の方法で調製した培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ_２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。
上記のユーリコマノンを、０、１０、３０μＭの濃度になるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。次いで、実施例１に記載の方法で、ＳＩＲＴ１の相対的遺伝子発現量を定量した。

【0027】

（２）結果
測定結果を図２に示した。
図２に示すように、ラット初代ミュラー細胞において、ユーリコマノンは、添加濃度依存的にＳＩＲＴ１の発現を増強した。したがって、ユーリコマノンは、トンカットアリの示すＳＩＲＴ１発現増強作用の有効成分の１つであることが明らかになった。

【0028】

以上の試験結果から、トンカットアリ抽出物は、ＳＩＲＴ１の発現を増強する。

【図1】

【図2】