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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-02
(45)【発行日】2022-05-13
(54)【発明の名称】親油性抗炎症剤を含む脂質ナノ粒子およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20220506BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20220506BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220506BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20220506BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20220506BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220506BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220506BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220506BHJP
A61K 31/58 20060101ALI20220506BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220506BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
A61K9/107
A61K9/51
A61K47/18
A61K47/22
A61K47/24
A61K47/28
A61K47/34
A61K31/58
A61P43/00 105
A61P43/00 121
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2018558293
(86)(22)【出願日】2017-05-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-06-06
(86)【国際出願番号】 EP2017060891
(87)【国際公開番号】W WO2017194454
(87)【国際公開日】2017-11-16
【審査請求日】2020-05-07
(31)【優先権主張番号】62/333,574
(32)【優先日】2016-05-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/359,429
(32)【優先日】2016-07-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/449,623
(32)【優先日】2017-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】391008951
【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】レンナルト・リンドフォーシュ
(72)【発明者】
【氏名】トマス・シェルマン
【審査官】中村 浩
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５０８７９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５０１８４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平１０－５１０８３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１７０８３３８（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５３０１４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５３００５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００６／００６２８４１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５０９９６８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）少なくとも１つのイオン化可能脂質、少なくとも１つの中性脂質、少なくとも１つのステロール、および少なくとも１つのポリマーコンジュゲート脂質を含み、少なくとも１つのイオン化可能脂質がＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｍｅｒｃｋ－３２、ＫＬ１０、Ａｃｕｉｔａｓ－５およびそれらの混合物から選択され；
少なくとも１つの中性脂質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり；
少なくとも１つのステロールがコレステロールであり；そして
少なくとも１つのポリマーコンジュゲート脂質は少なくとも１つのＰＥＧ化脂質であり；
抗炎症性脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、イオン化可能脂質は４０モル％～６０モル％の量で存在し；中性脂質は７．５モル％～１２．５モル％の量で存在し；ステロールは３５モル％～４５モル％の量で存在し；そしてポリマーコンジュゲート脂質は０．５モル％～５モル％の量で存在するものである、脂質相；
ｂ）吉草酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｖａｌｅｒａｔｅ）（Ｃ５）、カプロン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒｏａｔｅ）（Ｃ６）、カプリル酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒｙｌａｔｅ）（Ｃ８）、カプリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒａｔｅ）（Ｃ１０）、ラウリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｌａｕｒａｔｅ）（Ｃ１２）、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｃ１４）、パルミチン酸ロフレポニド（Ｃ１６）、ステアリン酸ロフレポニド（Ｃ１８）、ミリスチン酸ブデソニド（Ｃ１４）、パルミチン酸ブデソニド（Ｃ１６）、ステアリン酸ブデソニド（Ｃ１８）、ステアリン酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｓｔｅａｒａｔｅ）（Ｃ１８）、オレイン酸ブデソニド（Ｃ１８：１）およびリノール酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）（Ｃ１８：２）から選択される少なくとも１つの親油性抗炎症剤；および
ｃ）ｍＲＮＡ
を含む抗炎症性脂質ナノ粒子。
【請求項2】
前記少なくとも１つのイオン化可能脂質がＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである、請求項１に記載の抗炎症性脂質ナノ粒子。
【請求項3】
前記少なくとも１つのポリマーコンジュゲート脂質が、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＰＧ、およびそれらの混合物から選択される、請求項１に記載の抗炎症性脂質ナノ粒子。
【請求項4】
前記親油性抗炎症剤が、吉草酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｖａｌｅｒａｔｅ）（Ｃ５）、カプロン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒｏａｔｅ）（Ｃ６）、カプリル酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒｙｌａｔｅ）（Ｃ８）、カプリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒａｔｅ）（Ｃ１０）、ラウリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｌａｕｒａｔｅ）（Ｃ１２）、ミリスチン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）（Ｃ１４）、パルミチン酸ロフレポニド（Ｃ１６）、またはステアリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｓｔｅａｒａｔｅ）（Ｃ１８）から選択される、請求項１に記載の抗炎症性脂質ナノ粒子。
【請求項5】
前記親油性抗炎症剤が、ミリスチン酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）（Ｃ１４）、パルミチン酸ブデソニド（Ｃ１６）、ステアリン酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｓｔｅａｒａｔｅ）（Ｃ１８）、オレイン酸ブデソニド（Ｃ１８：１）、およびリノール酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）（Ｃ１８：２）から選択される、請求項１に記載の抗炎症性脂質ナノ粒子。
【請求項6】
脂質相対核酸セグメントの重量比が、約４０：１～１：１の範囲である、請求項１に記載の抗炎症性脂質ナノ粒子。
【請求項7】
親油性抗炎症剤対核酸セグメントの重量比が、約１０：１～約１：１００の範囲である、請求項１に記載の抗炎症性脂質ナノ粒子。
【請求項8】
複数の請求項１に記載の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項9】
それを必要とする被験者の細胞における少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の発現を対照レベルと比べて増加させるための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記被験者に対して、皮内に、筋肉内に、皮下に、腫瘍内に、心臓内に、気管内滴下、気管支滴下により、および／または吸入を介して投与される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の発現が、対照レベルと比べて、２４時間までに約２倍増加する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項12】
少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の発現が、対照レベルと比べて、７２時間までに約３倍増加する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項13】
非抗炎症性ＬＮＰの投与に関連する免疫応答を阻害するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項14】
炎症促進性マーカーの発現または活性を対照レベルと比べて阻害するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＫＣ、ＩＰ－１０、およびＭＣＰ－１の産生が、対照レベルと比べて約８０％以上の百分率分低下する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記医薬組成物の投与が、注射部位で浮腫を実質的に生じさせない、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項17】
血漿ハプトグロビンの産生を対照レベルと比べて阻害するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項18】
血漿ハプトグロビンの産生が、対照レベルと比べて約６０％以上の百分率分抑制される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
組織および細胞を標的にする薬学的活性成分の安全かつ有効な送達は、薬物担体の設計において最も重要である。既知の薬物担体、例えばリポソームおよび脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、標的化された組織および細胞への薬物の標的化された部位特異的な送達を促進することから、それらのバイオアベイラビリティを増強する。しかし、かかる担体を開発する上での主な障害は、これらの製剤の主要成分に関連した免疫原性応答である。
【0002】
ポリヌクレオチド送達に適したリポソーム担体は、標的細胞の細胞質への細胞膜を横切る送達を可能にするカチオン性脂質成分を含むことが多い。かかるカチオン性リポソームは、免疫系を活性化することが知られており、ワクチンに利用されている（非特許文献１）。それに対し、ＬＮＰは、生理学的ｐＨ７．４でゼロ正味電荷を有するように設計されることから、陽性に荷電されている粒子に関連した免疫応答が完全に除去されることはないが低減される。リポソームは、薬剤の標的組織および細胞への送達を助け得る一方で、免疫系も活性化し、急性過敏症反応をもたらし、それによりアナフィラキシーショックのリスクが増大する（非特許文献２；非特許文献３）。
【0003】
リポソームおよびＬＮＰに関連した免疫原性応答を最小化する、例えばＬＮＰにポリエチレングリコールシールドを付加し、単核食細胞系による認識を回避することや、修飾ｓｉＲＮＡを利用して免疫活性化を最小化することに注力しても、それらはやはり免疫応答を誘発し、ひいては治療選択肢としてのそれらの有効性を制限する（非特許文献２）。リポソームまたはＬＮＰの投与に先立つ抗炎症薬の同時投与についての検討もなされているが、成果は限定的である（非特許文献４；非特許文献３）。リポソーム構築物であるＬＮＰ２０１の投与前１時間のデキサメタゾンによる前治療により、炎症性ｍＲＮＡが部分的に阻害されたが、炎症効果が除去されなかった（非特許文献３）。ＬＮＰ０５－ＳＳＢ ｓｉＲＮＡまたはＬＮＰ０５－Ａｐｏ５ ｓｉＲＮＡに先立ち、様々な抗炎症薬で前治療されたラットにおいて、同様の結果が見出された（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｐｅｅｒ，Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４：１７３８－１７４８（２０１２）
【文献】Ｋｕｍａｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，３（ｅ２１０）：１－７（２０１４）
【文献】Ａｂｒａｍｓ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（１）：１７１－１８０（２０１０）
【文献】Ｔａｏ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９（３）：５６７－５７５（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ＬＮＰの免疫刺激効果は、調合薬の安全かつ有効な送達のためのその使用を阻止し続ける。結果として、炎症応答を誘発しない治療ウインドウの増強を伴う有効なＬＮＰ送達系を開発するという需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書は、部分的には、少なくとも１つの親油性抗炎症剤を含む抗炎症性脂質ナノ粒子を開示する。一実施形態では、開示されるのは、脂質相および少なくとも１つの親油性抗炎症剤を含む抗炎症性脂質ナノ粒子である。別の実施形態では、開示されるのは、少なくとも１つの核酸セグメントをさらに含む抗炎症性脂質ナノ粒子である。
【0007】
別の実施形態では、開示されるのは、脂質相、少なくとも１つの親油性抗炎症剤、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物である。別の実施形態では、開示されるのは、脂質相、少なくとも１つの親油性抗炎症剤、および少なくとも１つの核酸セグメント、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物である。
【0008】
さらに開示されるのは、それを必要とする被験者に複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を投与するための方法である。
【0009】
別の実施形態では、開示されるのは、少なくとも１つの核酸セグメントを標的細胞に送達する方法であって、細胞を複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物と接触させることを含む、方法である。
【0010】
別の実施形態では、開示されるのは、それを必要とする被験者に少なくとも１つの核酸セグメントを送達する方法であって、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、方法である。
【0011】
さらに開示されるのは、疾患または障害を患う被験者を治療する方法であって、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、方法である。
【0012】
別の実施形態では、開示されるのは、非抗炎症性ＬＮＰの投与に関連した免疫応答を阻害する方法であって、本明細書に開示される複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、方法である。免疫応答を阻害する方法は、免疫応答の少なくとも１つのバイオマーカーまたは症状の発現または活性を阻害すること、例えば、（ａ）炎症促進性マーカーの発現または活性を阻害することと；（ｂ）炎症（例えば浮腫）を低減することと；（ｃ）炎症または免疫応答に関連した血漿ハプトグロビンの産生を低減することと、を含む。
【0013】
さらに別の実施形態では、開示されるのは、それを必要とする被験者の標的細胞におけるタンパク質またはペプチドの発現を調節するための方法であって、本明細書に開示される複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【0014】
別の実施形態では、抗炎症性脂質ナノ粒子を調製するための方法が開示される。一実施形態では、開示されるのは、抗炎症性脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、
Ａ）任意選択的に少なくとも１つの核酸セグメントを含む少なくとも１つの水溶液を提供することと；
Ｂ）少なくとも１つの親油性抗炎症剤を含む少なくとも１つの有機溶液を提供することと；
Ｃ）少なくとも１つの水溶液を少なくとも１つの有機溶液と混合し、複数の脂質ナノ粒子を含有する脂質ナノ粒子溶液を生成することと、
を含む、方法である。
Ａ）任意選択的に少なくとも１つの核酸セグメントを含む少なくとも１つの水溶液を提供することと；
Ｂ）少なくとも１つの親油性抗炎症剤を含む少なくとも１つの有機溶液を提供することと；
Ｃ）少なくとも１つの水溶液を少なくとも１つの有機溶液と混合し、複数の脂質ナノ粒子を含有する脂質ナノ粒子溶液を生成することと、
を含む、方法である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】抗炎症性脂質ナノ粒子中に存在するイオン化可能脂質成分の化学構造を図示する。
【図1B】ロフレポニドおよび代表的なロフレポニドプロドラッグの化学構造をＡＣＤ Ｃｈｅｍｓｋｅｔｃｈ ２０１４を用いて計算されたオクタノール－水ｌｏｇ（分配係数）とともに図示する。
【図1C】ブデソニドおよび代表的なブデソニドプロドラッグの化学構造をＡＣＤ Ｃｈｅｍｓｋｅｔｃｈ ２０１４を用いて計算されたオクタノール－水ｌｏｇ（分配係数）とともに図示する。
【図2A-D】（Ａ）：投与後２４時間の浮腫スコアリング；（Ｂ）：投与後２４時間の血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）：投与後８および２４時間の血漿サイトカイン／ケモカイン濃度；および（Ｄ）パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）の不在下および存在下でのＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡに基づくＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【図3A-C】（Ａ）：投与後２４時間の浮腫スコアリング；（Ｂ）：投与後２４時間の血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）：パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）／ｍＲＮＡ１：１ｗ／ｗ、１：１０ｗ／ｗ、および１：３０ｗ／ｗの不在下および存在下でのＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡに基づくＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【図4A-C】（Ａ）：投与後２４、４８および７２時間の浮腫スコアリング；（Ｂ）：時間に対する血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）：パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）またはロフレポニドを含有するＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【図6A-C】（Ａ）：浮腫スコアリング；（Ｂ）：投与後２４時間の血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）：異なる脂肪酸鎖長を有するロフレポニドプロドラッグ：吉草酸ロフレポニド（Ｃ５）、ミリスチン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）（Ｃ１４）、パルミチン酸ロフレポニド（Ｃ１６）、およびステアリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｓｔｅａｒａｔｅ）（Ｃ１８）を含有するＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【図7A-C】（Ａ）：投与後２４時間の浮腫スコアリング；（Ｂ）投与後２４時間の血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＭｅｒｃｋ－３２ ＬＮＰ対ＤＬｉｎ－ＭＣ３／パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）、およびＭｅｒｃｋ－３２／パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）ＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【図8A-C】（Ａ）：異なる用量のｍＲＮＡ１で比較する、投与後２４時間の浮腫スコアリング；（Ｂ）投与後２４時間の血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）異なる用量のｍＲＮＡ１で比較する、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＭｅｒｃｋ－３２（ミリスチン酸ロフレポニド、Ｒ－Ｃ１４を伴う）ＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【図9A-C】（Ａ）：異なる用量のｍＲＮＡ１で比較する、投与後２４時間の浮腫スコアリング；（Ｂ）投与後２４時間の血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）異なる用量のｍＲＮＡ１で比較する、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＫＬ１０（Ｒ－Ｃ１４の不在下／存在下）およびＡｃｕｉｔａｓ－５（Ｒ－Ｃ１４の不在下／存在下）ＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【図10A-G】（Ａ）：浮腫スコアリング；（Ｂ）：投与後２４時間の血漿ハプトグロビン濃度；（Ｃ）：投与後７および２４時間の血漿ＩＬ－６濃度；（Ｄ）：投与後７および２４時間の血漿ＫＣ濃度；（Ｅ）投与後７および２４時間の血漿ＩＰ－１０濃度；（Ｆ）：投与後７および２４時間の血漿ＭＣＰ－１濃度；（Ｇ）異なる脂肪酸鎖長を有するブデソニドプロドラッグ：ミリスチン酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）（Ｃ１４）、パルミチン酸ブデソニド（Ｃ１６）またはオレイン酸ブデソニド（Ｃ１８：１）を含有するＬＮＰの皮下投与後の時間に対するｍＲＮＡ１タンパク質濃度、を図示する。
【発明を実施するための形態】
【0016】
抗炎症性脂質ナノ粒子
本開示によると、抗炎症性脂質ナノ粒子は、エタノール中の脂質含有溶液と核酸セグメントを含有する水溶液とのマイクロ流体混合により生成される高電子密度のナノ構造コアを有する。本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子が５０体積％を超える連続的な水性領域を有しないことから、単層リポソームなどの通常のリポソームが除かれることは理解されるべきである。
本開示によると、抗炎症性脂質ナノ粒子は、エタノール中の脂質含有溶液と核酸セグメントを含有する水溶液とのマイクロ流体混合により生成される高電子密度のナノ構造コアを有する。本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子が５０体積％を超える連続的な水性領域を有しないことから、単層リポソームなどの通常のリポソームが除かれることは理解されるべきである。
【0017】
一態様では、抗炎症性脂質ナノ粒子は、脂質相および少なくとも１つの親油性抗炎症剤を含む。脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸セグメントをさらに含んでもよい。
【0018】
本開示の一態様は、直径が約２００ｎｍ以下、例えば約１００ｎｍ以下、または例えば約７５ｎｍ以下の平均粒子径を有する抗炎症性脂質ナノ粒子に関する。本開示の少なくとも１つの実施形態では、抗炎症性脂質ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、例えば約６０ｎｍ～約６５ｎｍの範囲、例えば約６４ｎｍの平均粒子径を有する。
【0019】
特定の実施形態では、抗炎症性脂質ナノ粒子は、約８０％以上、例えば約９０％超、例えば約９５％～１００％の範囲、例えば約９９％の核酸セグメントの封入効率（％ＥＥ）を有する。本明細書で用いられるとき、用語「封入効率」は、洗剤、例えばトリトンＸ１００を用いる脂質ナノ粒子の溶解により測定される、医薬組成物中の総核酸セグメント含量に対する抗炎症性脂質ナノ粒子中の封入核酸セグメントの比を指す（例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）上記を参照）。
【0020】
脂質相
本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子の脂質相は、ナノ粒子の正味電荷が約０である限り、通常のナノ粒子技術において用いられる任意の材料、例えば、イオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、およびポリマーコンジュゲート脂質から構築されてもよい。
本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子の脂質相は、ナノ粒子の正味電荷が約０である限り、通常のナノ粒子技術において用いられる任意の材料、例えば、イオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、およびポリマーコンジュゲート脂質から構築されてもよい。
【0021】
イオン化可能脂質の非限定例として、例えば生理学的ｐＨで正電荷を有する脂質、例えば、１，２－ジリノレイロキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（例えば、米国特許第８，１５８，６０１号明細書を参照）、２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、Ｍｅｒｃｋ－３２（例えば、国際公開第２０１２／０１８７５４号パンフレットを参照）、Ａｃｕｉｔａｓ－５（例えば、国際公開第２０１５／１９９９５２号パンフレットを参照）、ＫＬ－１０（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号明細書を参照）、Ｃ１２－２００（例えば、Ｌｏｖｅ，ＫＴ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７：１８６４（２００９）を参照）などが挙げられる。イオン化可能脂質は、抗炎症性脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約５％～約９０％、例えば約１０％～約８０％、例えば約２５％～約７５％、例えば約４０％～約６０％の範囲、例えば約５０％のモルパーセント量で存在してもよい。
【0022】
中性脂質は、生理学的ｐＨで０正味電荷を有する。中性脂質の非限定例として、生理学的ｐＨで非荷電形態または中性双性イオン形態で存在する脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）などが挙げられる。中性脂質は、抗炎症性脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約１％～約５０％、例えば約５％～約２０％、例えば７．５％～約１２．５％の範囲、例えば約１０％のモルパーセント量で存在してもよい。
【0023】
ステロールの非限定例として、コレステロールなどが挙げられる。ステロールは、抗炎症性脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約１０％～約９０％、例えば約２０％～約５０％、例えば約３５％～４５％の範囲、例えば約３８．５％のモルパーセント量で存在してもよい。
【0024】
ポリマーコンジュゲート脂質は、脂質部分およびポリマー部分を含み、例えばＰＥＧ化脂質は、脂質部分およびポリエチレングリコール部分の双方を含む。非限定例として、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）２０００（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００）、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＰＧなどが挙げられる。使用可能なポリ（エチレングリコール）の分子量は、約５００～約１０，０００Ｄａ、または約１，０００～約５，０００Ｄａの範囲であってもよい。
【0025】
ポリマーコンジュゲート脂質は、抗炎症性脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約０％～約２０％、例えば約０．５％～約５％、例えば約１％～約２％の範囲、例えば、約１．５％のモルパーセント量で存在してもよい。
【0026】
本開示の少なくとも１つの実施形態では、抗炎症性脂質ナノ粒子は、複数の脂質成分を組み合わせることにより調製されてもよい。例えば、抗炎症性脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質、ステロール、中性脂質、およびポリマーコンジュゲート脂質を、存在する総脂質に対する５０：４０－ＸＰＥＧ脂質：１０：ＸＰＥＧ脂質のモル比で組み合わせることにより調製されてもよい。例えば、抗炎症性脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質、ステロール、中性脂質、およびポリマーコンジュゲート脂質を、５０：３７：１０：３（モル／モル）のモル比、または例えば５０：３８．５：１０：１．５（モル／モル）のモル比、または例えば５０：３９．５：１０：０．５（モル／モル）、または５０：３９．７５：１０：０．２５（モル／モル）で組み合わせることにより調製されてもよい。
【0027】
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｍｅｒｃｋ－３２、ＫＬ１０、またはＡｃｕｉｔａｓ－５など）、ステロール（コレステロールなど）、中性脂質（ＤＳＰＣなど）、およびポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００など）を、存在する総脂質に対する約５０：３８．５：１０：１．５（モル／モル）のモル比で用いて調製されてもよい。さらに別の非限定例が、イオン化可能脂質（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｍｅｒｃｋ－３２、ＫＬ１０、またはＡｃｕｉｔａｓ－５など）、ステロール（コレステロールなど）、中性脂質（ＤＳＰＣなど）、およびポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００など）を、存在する総脂質に対する約４７．７：３６．８：１２．５：３（モル／モル）のモル比で含む抗炎症性脂質ナノ粒子である。別の非限定例が、イオン化可能脂質（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｍｅｒｃｋ－３２、ＫＬ１０、またはＡｃｕｉｔａｓ－５など）、ステロール（コレステロールなど）、中性脂質（ＤＳＰＣなど）、およびポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００など）を、存在する総脂質に対する約５２．４：４０．４：６．４：０．８（モル／モル）のモル比で含む抗炎症性脂質ナノ粒子である。別の実施形態では、非限定例が、イオン化可能脂質（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｍｅｒｃｋ－３２、ＫＬ１０、またはＡｃｕｉｔａｓ－５など）、ステロール（コレステロールなど）、中性脂質（ＤＳＰＣなど）、およびポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００など）を、存在する総脂質に対する約５３．５：４１．２：４．６：０．７（モル／モル）のモル比で含む抗炎症性脂質ナノ粒子である。別の非限定例が、イオン化可能脂質（Ｃ１２－２００など）、ステロール（コレステロールなど）、中性脂質（ＤＳＰＣなど）、およびポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００など）を、存在する総脂質に対する約３０：５０：１９：１（モル／モル）のモル比で含む抗炎症性脂質ナノ粒子である。
【0028】
抗炎症性脂質ナノ粒子を含むイオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、および／またはポリマーコンジュゲート脂質の選択、ならびにかかる脂質の互いに対する相対モル比は、選択される脂質の特徴、意図される標的細胞の性質や、送達されるべき例えばｍＲＮＡなどの核酸の特徴により決定されてもよい。例えば、特定の実施形態では、抗炎症性脂質ナノ粒子中のイオン化可能脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、または約７０％超であってもよい。抗炎症性脂質ナノ粒子中の中性脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して約５％超、約１０％超、約２０％超、約３０％超、または約４０％超であってもよい。抗炎症性脂質ナノ粒子中のステロールのモルパーセントは、存在する総脂質に対して約１０％超、約２０％超、約３０％超、または約４０％超であってもよい。抗炎症性脂質ナノ粒子中のポリマーコンジュゲート脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して約０．２５％超、例えば約１％超、約１．５％超、約２％超、約５％超、または約１０％超であってもよい。
【0029】
本開示によると、抗炎症性脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、および／またはポリマーコンジュゲート脂質の各々を所望される任意の有用な配向性で含んでもよい。例えば、ナノ粒子のコアは、イオン化可能脂質およびステロールを含んでもよく、結果として、中性脂質および／またはポリマーコンジュゲート脂質を含む１つ以上の層がコアを包囲してもよい。例えば、一実施形態によると、抗炎症性脂質ナノ粒子のコアは、任意の特定の厚みの中性脂質単層（例えばＤＳＰＣ）に覆われ、任意の特定の厚みの外側のポリマーコンジュゲート脂質単層にさらに覆われた、イオン化可能脂質（例えばＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、およびステロール（例えばコレステロール）を任意の特定比で含むコアを含んでもよい。かかる例では、親油性抗炎症剤および核酸セグメントは、意図される標的細胞の性質や、送達されるべき例えばｍＲＮＡなどの核酸の特徴に応じて、コアまたはそれに続く層のいずれか１つの中に組み込まれてもよい。コアおよび外層は、典型的には当該技術分野で公知の脂質ナノ粒子中に組み込まれる他の成分をさらに含んでもよい。
【0030】
さらに、抗炎症性脂質ナノ粒子を含むイオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、および／またはポリマーコンジュゲート脂質のモルパーセントは、総脂質ナノ粒子の特定の物理パラメータ、例えば脂質の１つ以上の表面積を提供するように選択されてもよい。例えば、抗炎症性脂質ナノ粒子を含むイオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、および／またはポリマーコンジュゲート脂質のモルパーセントは、中性脂質、例えばＤＳＰＣあたりの表面積が得られるように選択されてもよい。非限定例として、イオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、および／またはポリマーコンジュゲート脂質のモルパーセントは、約１．０ｎｍ２～約２．０ｎｍ２、例えば約１．２ｎｍ２のＤＳＰＣあたりの表面積が得られるように決定されてもよい。
【0031】
親油性抗炎症剤
本開示によると、抗炎症性脂質ナノ粒子は、治療有効量の少なくとも１つの親油性抗炎症剤をさらに含む。
本開示によると、抗炎症性脂質ナノ粒子は、治療有効量の少なくとも１つの親油性抗炎症剤をさらに含む。
【0032】
用語「炎症」および「炎症性」は、免疫系の上方制御を含む生物学的応答を指し、それは炎症または免疫応答に関するタンパク質活性（例えば、ケモカインおよびサイトカインなどの炎症促進性マーカー、血漿ハプトグロビンの産生）の増強および炎症の症状（例えば、疼痛、熱、発赤および／または浮腫）を含んでもよい。一部の実施形態では、炎症は急性である。一部の実施形態では、炎症は慢性である。
【0033】
用語「抗炎症剤」は、例えば、炎症または免疫応答に関する酵素またはタンパク質活性の低減または阻害（例えば、炎症促進性マーカーの阻害または血漿ハプトグロビンの産生における低下）により；炎症または免疫応答の１つ以上の症状（例えば、疼痛、発赤、熱または浮腫）の寛解により；または炎症性プロセスもしくは免疫応答の緩徐化もしくは遅延により、炎症（急性または慢性のいずれか）を低減するかまたは免疫応答を下方制御するように、被験者における生物学的または医学的応答を誘発する薬剤を含む。
【0034】
用語「親油性抗炎症剤」は、約５．０以上のｌｏｇＰ値を示す抗炎症剤を指す。用語「ｌｏｇＰ」は、分配係数Ｐ（Ｐは、有機相中の化合物の濃度の、水相中の同じ化合物の濃度に対する相対比である）の対数の底が１０の関数の定量を指す。抗炎症剤の親油性は、抗炎症剤の親水性部分を親油性部分に変換することにより、例えば、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、または他の親水性基を、アルキルおよびアルキルエステル、酸エステル、アリールおよびアリールエステル、ヘテロアリールエステル、アミド基、または他の親油性基に変換することによって得てもよい。本明細書中の親油性抗炎症剤は、約５以上のｌｏｇＰ値を示す。親油性抗炎症剤は、上記の通り、抗炎症剤を修飾し、親油性を高めることによって、そのｌｏｇＰ値を増加させるように合成されてもよい。抗炎症剤は、親薬剤分子上に存在する任意の親水性基の１つ以上のエステル化またはアルキル化などの公知の技術を通じて調製されてもよい（例えば、Ｗａｒｉｎｇ，ＭＪ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，５（３）：２３５－２４８（２０１０）を参照。
【0035】
少なくとも１つの親油性抗炎症剤に先行する用語「治療有効量」は、非抗炎症性ＬＮＰの投与に関連した炎症応答のバイオマーカーまたは症状のいずれかまたはすべてを阻害および／または寛解する抗炎症剤の量を指す。
【0036】
用語「非抗炎症性ＬＮＰ」は、抗炎症剤を含まない脂質ナノ粒子を指す。
【0037】
公知の抗炎症剤は、限定はされないが、コルチコステロイド（例えば、ロフレポニド、ブデソニドなど）、およびサイトカイン阻害剤（例えば、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＲＬ１－９、ＮＦ－κｂ、ＩＲＡＫ－１、ＩＲＡＫ－２、ＩＲＡＫ－４、ＩＲＦ－３、ＴＢＫ－１、ＴＲＡＦ－３、ｐ３８、ＩＫＫεなど）などを含む。
【0038】
本開示の少なくとも１つの実施形態では、親油性抗炎症剤は、ロフレポニドプロドラッグである。ロフレポニドプロドラッグの例として、限定はされないが、吉草酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｖａｌｅｒａｔｅ）（Ｃ５）、カプロン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒｏａｔｅ）（Ｃ６）、カプリル酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒｙｌａｔｅ）（Ｃ８）、カプリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｃａｐｒａｔｅ）（Ｃ１０）、ラウリン酸ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ ｌａｕｒａｔｅ）（Ｃ１２）、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｃ１４）、パルミチン酸ロフレポニド（Ｃ１６）、またはステアリン酸ロフレポニド（Ｃ１８）が挙げられる。
【0039】
別の実施形態では、親油性抗炎症剤は、ブデソニドプロドラッグである。非限定例として、ミリスチン酸ブデソニド（Ｃ１４）、パルミチン酸ブデソニド（Ｃ１６）、ステアリン酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｓｔｅａｒａｔｅ）（Ｃ１８）、オレイン酸ブデソニド（Ｃ１８：１）、およびリノール酸ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）（Ｃ１８：２）が挙げられる。
【0040】
親油性抗炎症剤は、抗炎症性脂質ナノ粒子の総重量に対して約０．００１重量％～約５０重量％の範囲の量で存在してもよい。一部の実施形態では、親油性抗炎症剤は、抗炎症性脂質ナノ粒子の総重量に対して約０．５重量％～約２０重量％、例えば約１重量％～約１０重量％、例えば約８重量％の範囲の量で存在してもよい。
【0041】
核酸セグメント
本開示によると、抗炎症性脂質ナノ粒子は、抗炎症性脂質ナノ粒子の表面上で会合され得る、かつ／または同じ抗炎症性脂質ナノ粒子内部に封入され得る核酸セグメントを治療有効量でさらに含んでもよい。
本開示によると、抗炎症性脂質ナノ粒子は、抗炎症性脂質ナノ粒子の表面上で会合され得る、かつ／または同じ抗炎症性脂質ナノ粒子内部に封入され得る核酸セグメントを治療有効量でさらに含んでもよい。
【0042】
用語「核酸セグメント」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体、またはそれらの組み合わせから選択される任意の１つ以上の核酸セグメントを意味するように理解される。本明細書中の核酸セグメントは、野生型または修飾型であってもよい。少なくとも１つの実施形態では、抗炎症性脂質ナノ粒子は、複数の異なる核酸セグメントを含んでもよい。さらに別の実施形態では、野生型または修飾型の核酸セグメントの少なくとも１つは、目的のポリペプチドをコードする。
【0043】
少なくとも１つの核酸セグメントに先行する用語「治療有効量」は、標的組織および／または細胞型におけるタンパク質の発現を調節するのに十分な核酸の量を指す。一部の実施形態では、少なくとも１つの核酸セグメントの治療有効量は、少なくとも１つの核酸セグメントによって発現されるタンパク質に関連した疾患または障害を治療するのに十分な量である。
【0044】
少なくとも１つの実施形態では、総脂質相の核酸セグメントに対する重量比は、約４０：１～約１：１の範囲、例えば約１０：１である。これは、核酸単量体に対するイオン化可能脂質のおよそのモル比が約３：１であることに対応する。さらに別の例では、核酸セグメントに対する総脂質相の重量比は、約３０：１～約１：１の範囲、例えば約１７：１であり、これは、核酸単量体に対するイオン化可能脂質のおよそのモル比が約６：１であることに対応する。しかし、核酸単量体に対する脂質相および／または脂質相成分の相対モル比は、意図される標的細胞の性質および核酸セグメントの特性により判定されてもよく、それ故、上で同定された実施形態の範囲内に限定されない。
【0045】
別の実施形態では、抗炎症性脂質ナノ粒子は、親油性抗炎症剤および核酸セグメントを、重量比が約１０：１（親油性抗炎症剤対核酸セグメント）～約１：１００の範囲で含む。さらに別の実施形態では、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対する核酸セグメントの重量比は、約２：１～約１：５０、例えば約１：１～約１：１０の範囲である。
【0046】
組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子、治療有効量の少なくとも１つの抗炎症剤および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメント、および／または１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む。本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤」は、合理的なリスク／ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の課題もしくは合併症を伴わない、健全な医学的判断の範囲内での、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの組織標的化剤、例えばＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＣＲＰＰＲまたはＤＳＰＥ－ＣＲＰＰＲなどのペプチドコンジュゲートをさらに含んでもよい。
本開示の医薬組成物は、本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子、治療有効量の少なくとも１つの抗炎症剤および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメント、および／または１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、担体もしくは希釈剤を含む。本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤」は、合理的なリスク／ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の課題もしくは合併症を伴わない、健全な医学的判断の範囲内での、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの組織標的化剤、例えばＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－ＣＲＰＰＲまたはＤＳＰＥ－ＣＲＰＰＲなどのペプチドコンジュゲートをさらに含んでもよい。
【0047】
医薬組成物は、非経口投与に適した形態であってもよい。本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子を含む組成物は、インビボ投与においては、治療的適用に応じて、それを必要とする被験者に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、皮下に、舌下に、腫瘍内に、心臓内に、気管内滴下、気管支滴下、および／または吸入により、投与されてもよい。
【0048】
医薬組成物は、滅菌注射用水性または懸濁液の形態であってもよく、それは公知の方法に従って配合されてもよい。滅菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容できる緩衝液中の滅菌注射用懸濁液であってもよい。他の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥されて、乾燥粉末の形態を生じてもよく、ここで乾燥粉末は、投与のため、必要に応じて後に再構成され得る。乾燥粉末組成物は、増量剤、例えばスクロースまたはトレハロースをさらに含んでもよい。
【0049】
医薬液体組成物は、不活性気体の使用により霧化され得る。霧化された懸濁液は、霧化装置から直接的に吸い込まれてもよい、または霧化装置は、フェイステントマスク、または間欠的陽圧呼吸装置に取り付けられ得る。さらに、固体剤形はまた、乾燥粉末吸入器を用いた吸入を介して投与されてもよい。懸濁液または乾燥粉末医薬組成物は、医薬組成物を適切な様式で送達する装置から経口的または経鼻的に投与され得る。
【0050】
単一剤形を作製するための１つ以上の賦形剤と組み合わされる核酸セグメントの量は、治療される被験者および特定の投与経路に応じて異なることが必要となる。投与経路および投与計画に関するさらなる情報については、読者は、Ｃｈａｐｔｅｒ ２５．３ ｉｎ Ｖｏｌｕｍｅ ５ ｏｆ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；Ｃｈａｉｒｍａｎ ｏｆ Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｂｏａｒｄ）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０を参照のこと。
【0051】
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される、治療有効量の少なくとも１つの抗炎症剤および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物を含む医薬キットである。かかるキットは、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体を含む容器、および当業者にとって容易に理解できる追加的容器などの様々な通常の医薬キット成分をさらに含んでもよい。投与されるべき成分の量、投与のためのガイドライン、および／または成分を混合するためのガイドラインをインサートまたはラベルのいずれかとして示す使用説明書もまた、キットに含めることができる。
【0052】
方法
一実施形態では、本開示は、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与するための方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与するための方法を提供する。
【0053】
用語「被験者」は、温血哺乳類、例えば、霊長類、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、およびマウスを含む。一部の実施形態では、被験者は、霊長類、例えばヒトである。一部の実施形態では、被験者は、治療を必要とする（例えば、被験者は、治療から生物学的または医学的に恩恵を得ることになる）。
【0054】
本明細書に開示される抗炎症性脂質ナノ粒子はさらに、例えば核酸セグメント、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体の標的細胞および組織への選択的送達のためのプラットフォームとして役立ててもよい。したがって、一実施形態は、少なくとも１つの核酸セグメントを細胞に送達する方法であって、細胞を、インビトロまたはインビボで、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物と接触させることを含む、方法である。一部の実施形態では、核酸セグメントは、ポリペプチドの発現を、例えば発現を増強または低減することにより、またはその発現を上方制御または下方制御することにより調節する。
【0055】
別の実施形態は、治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントをそれを必要とする被験者に送達するための方法であって、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、方法を提供する。
【0056】
複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および本明細書に開示される少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物は、被験者におけるポリペプチドの過小発現、被験者におけるポリペプチドの過剰発現、および／または被験者におけるポリペプチドの不在／存在によって特徴づけられる多種多様な障害および疾患を治療するために用いられてもよい。したがって、開示されるのは、疾患または障害を患う被験者を治療する方法であって、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、方法である。
【0057】
さらに開示されるのは、非抗炎症性ＬＮＰの投与に関連した免疫応答を阻害する方法であって、治療有効量の少なくとも１つの親油性抗炎症剤を含む複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む、方法である。例えば、本開示に従う抗炎症性脂質ナノ粒子は、免疫応答の少なくとも１つのバイオマーカーまたは症状の発現または活性を阻害および／または寛解し得る。少なくとも１つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、（浮腫スコアリングによる判定として）注射部位での炎症を低減および／または阻害し、血漿ハプトグロビンの産生を低減および／または阻害し、また炎症促進性マーカー（例えば、サイトカイン、ケモカイン）の量を低減および／または阻害する。したがって、本開示は、炎症促進性マーカーの発現または活性を阻害し、炎症（例えば浮腫）を低減し、かつ血漿ハプトグロビンの産生を低減するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの親油性抗炎症剤および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を含む。
【0058】
少なくとも１つの実施形態では、浮腫の低減または阻害が認められる。別の実施形態では、血漿ハプトグロビンレベルにおける低減または阻害が認められる。さらに別の実施形態では、血漿炎症性マーカーの低減または阻害が認められる。開示される方法のいずれか１つでは、封入される核酸セグメントの標的活性が阻害されない。例えば、細胞におけるタンパク質発現を増加させるための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの抗炎症剤および治療有効量の少なくとも１つの核酸セグメントを含む、本明細書に開示される複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を投与することを含む、方法が開示される。
【0059】
炎症促進性マーカーの非限定例として、サイトカインおよびケモカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＰ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、エオタキシン、ＦＧＦ－ベーシック、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１、ＭＩＰ－２、ＭＣＰ－１、ＩＮＦ－γ、ＩＮＦα２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、およびＩＬ－１βが挙げられる。例えば、本明細書に開示される方法は、浮腫を低減および／もしくは阻害し、また血漿ハプトグロビンの産生を低減および／もしくは阻害し、かつ／または非抗炎症性ＬＮＰの投与に関連した炎症促進性マーカーの産生を、対照レベルを超える百分率にかけて低減および／もしくは阻害する。
【0060】
本明細書で用いられるとき、用語「低減および／または阻害する」は、対照レベルと比べて、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント以上の変化（陽性または陰性）を指す。本明細書で用いられるとき、用語「対照レベル」は、未処理の試料もしくは被験者、または開示される親油性抗炎症剤を伴わずに脂質ナノ粒子で処理された試料もしくは被験者を示す。例として、対照レベルは、親油性抗炎症剤の不在下、対照試料中での発現または活性のレベルである。
【0061】
例えば、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む、本明細書に開示される方法は、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＫＣ、ＩＰ－１０、およびＭＣＰ－１の産生を約８０％以上の百分率にかけて、例えば約８５％以上、低減および／または阻害する。
【0062】
さらに本明細書に開示されるのは、非抗炎症性ＬＮＰの投与に関連した注射部位で浮腫を阻害するための方法であって、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む、方法である。例えば、本明細書に開示される方法は、注射部位で実質的に浮腫をもたらさない。本明細書で用いられるとき、用語「実質的に存在しない浮腫」は、肉眼にとって明白な目に見える腫脹および／または発赤が存在しないことを意味するように理解される。
【0063】
さらに開示されるのは、非抗炎症性ＬＮＰの投与に関連した血漿ハプトグロビンの産生を阻害するための方法であって、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む、方法である。少なくとも１つの実施形態によると、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む、本明細書における方法は、血漿ハプトグロビンの産生を約６０％以上の百分率にかけて、例えば約８０％以上、阻害する。別の実施形態では、本明細書における方法は、複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む一方で、正常な血漿ハプトグロビンレベルを維持する。本明細書で用いられるとき、用語「正常な血漿ハプトグロビンレベル」は、３２００ｎｇ／ｍＬ～６５０００ｎｇ／ｍＬの範囲内の血漿ハプトグロビンレベルを含む。
【0064】
さらに開示されるのは、細胞におけるタンパク質の発現を増加させるための方法であって、本明細書に開示される複数の抗炎症性脂質ナノ粒子を含む医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む、方法である。少なくとも１つの実施形態では、タンパク質の発現は、約２時間から最大で２４時間にわたり増加してもよい。別の実施形態では、タンパク質の発現は、約３時間から最大で７２時間にわたり増加してもよい。
【実施例】
【0065】
本開示の態様は、本開示の脂質ナノ粒子および組成物の調製ならびに本開示の脂質ナノ粒子を用いるための方法について詳述する以下の非限定例を参照することにより、さらに規定され得る。材料および方法の双方に対する多くの修飾が、本開示の範囲から逸脱することなく実施され得ることは当業者に明らかになるであろう。
【0066】
ｍＲＮＡを含有するＬＮＰの調製
クエン酸塩緩衝液中のｍＲＮＡ１の溶液は、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解したｍＲＮＡ１、１００ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３）およびＭｉｌｌｉＱ水を混合することによって調製し、５０ｍＭクエン酸塩の溶液を得た。エタノール（９９．５％）中の脂質溶液は、４つの異なる脂質成分：イオン化可能脂質（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｍｅｒｃｋ－３２、ＫＬ１０またはＡｃｕｉｔａｓ－５）；コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ）；およびＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）２０００、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて調製した。イオン化可能脂質の化学構造を図１Ａに示す。すべての実験における脂質の総濃度は１２．５ｍＭであった。親油性抗炎症剤プロドラッグを含有する脂質ナノ粒子は、プロドラッグを脂質エタノール溶液に添加することにより調製した。ロフレポニドの化学構造、ならびに脂肪酸鎖の長さに基づいてＲ－Ｃ５、Ｒ－Ｃ１４．Ｒ－Ｃ１６およびＲ－Ｃ１８のように略される異なるプロドラッグを図１Ｂに示す。ブデソニドの化学構造、ならびに脂肪酸鎖の長さに基づいてＢ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６およびＢ－Ｃ１８：１のように略される異なるプロドラッグを図１Ｃに示す。
クエン酸塩緩衝液中のｍＲＮＡ１の溶液は、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解したｍＲＮＡ１、１００ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３）およびＭｉｌｌｉＱ水を混合することによって調製し、５０ｍＭクエン酸塩の溶液を得た。エタノール（９９．５％）中の脂質溶液は、４つの異なる脂質成分：イオン化可能脂質（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｍｅｒｃｋ－３２、ＫＬ１０またはＡｃｕｉｔａｓ－５）；コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ）；およびＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）２０００、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて調製した。イオン化可能脂質の化学構造を図１Ａに示す。すべての実験における脂質の総濃度は１２．５ｍＭであった。親油性抗炎症剤プロドラッグを含有する脂質ナノ粒子は、プロドラッグを脂質エタノール溶液に添加することにより調製した。ロフレポニドの化学構造、ならびに脂肪酸鎖の長さに基づいてＲ－Ｃ５、Ｒ－Ｃ１４．Ｒ－Ｃ１６およびＲ－Ｃ１８のように略される異なるプロドラッグを図１Ｂに示す。ブデソニドの化学構造、ならびに脂肪酸鎖の長さに基づいてＢ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６およびＢ－Ｃ１８：１のように略される異なるプロドラッグを図１Ｃに示す。
【0067】
ｍＲＮＡおよび脂質溶液は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）のマイクロ流体混合システムで、水溶液：ＥｔＯＨ＝３：１の混合比および１２ｍＬ／分の一定流速で混合した。混合時、イオン化可能脂質上の窒素原子とｍＲＮＡ鎖上のリン原子との間の比は３．１に相当した。
【0068】
調製したＬＮＰ懸濁液の最初の０．２～０．３５ｍＬおよび最終の０．０５～０．１ｍＬを廃棄した一方で、体積の残りを試料画分として収集した。試料の試料画分２５μＬは、１０ｍＭリン酸緩衝液９７５μＬ（ｐＨ７．４）に注射し、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）での強度平均粒子径（「透析前粒子径」）および多分散指数（ＰＤＩ）を測定するために用いた。残存試料体積分を、Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析カセット（１００００ＭＷＣＯ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に直ちに移し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。ＰＢＳ緩衝液の体積は、試料画分体積の５００～１０００倍であった。次に、試料画分を収集し、この体積から２５μＬを１０ｍＭリン酸緩衝液９７５μＬ（ｐＨ７．４）に注射し、粒子径（透析後粒子径）およびＰＤＩを再度測定した。
【0069】
最終のｍＲＮＡ濃度および封入効率百分率（％ＥＥ）を、ＬＮＰを破壊するためのトリトンＸ１００を用いて、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）により測定した。
【0070】
インビボマウス実験
マウス５匹（雌、約１２週齢、Ｃｒｌ：Ｃｄ１（ＩＣＲ）、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の異なる群に、ＰＢＳ（陰性対照）または脂質ナノ粒子中に配合したｍＲＮＡ１を投与した。投与前、マウスをイソフルラン５％で軽く麻酔し、注射領域を剪毛した。次に、配合物を異なるマウス群の嚢内領域内に皮下注射した（５ｍｌ／ｋｇまたは０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇ）。投与後の血液試料を収集し、血漿を遠心分離により調製した。血漿の一定分量をクライオチューブ（０．５ｍｌのＵ形状のポリプロピレンクライオチューブ（ｃａｐ Ｒｅｆ＃７２．７３０のＳａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）内に移し、ハプトグロビン、サイトカイン／ケモカインおよびｍＲＮＡ１タンパク質濃度の定量化まで凍結貯蔵した。一部の試験では、血漿試料中の親油性抗炎症剤についても定量化を実施した。投与後２４時間、炎症応答の臨床徴候は、注射領域にわたり指で緩やかに押して浮腫を測定することによって評価し、異なるマウスにおいて浮腫があるかまたは浮腫がないかを外観検査により判断した。群（各群はマウス５匹を有する）あたりの浮腫の可視的徴候を呈するマウスの数を合計し、０～５の浮腫スコアを得た。
マウス５匹（雌、約１２週齢、Ｃｒｌ：Ｃｄ１（ＩＣＲ）、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の異なる群に、ＰＢＳ（陰性対照）または脂質ナノ粒子中に配合したｍＲＮＡ１を投与した。投与前、マウスをイソフルラン５％で軽く麻酔し、注射領域を剪毛した。次に、配合物を異なるマウス群の嚢内領域内に皮下注射した（５ｍｌ／ｋｇまたは０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇ）。投与後の血液試料を収集し、血漿を遠心分離により調製した。血漿の一定分量をクライオチューブ（０．５ｍｌのＵ形状のポリプロピレンクライオチューブ（ｃａｐ Ｒｅｆ＃７２．７３０のＳａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）内に移し、ハプトグロビン、サイトカイン／ケモカインおよびｍＲＮＡ１タンパク質濃度の定量化まで凍結貯蔵した。一部の試験では、血漿試料中の親油性抗炎症剤についても定量化を実施した。投与後２４時間、炎症応答の臨床徴候は、注射領域にわたり指で緩やかに押して浮腫を測定することによって評価し、異なるマウスにおいて浮腫があるかまたは浮腫がないかを外観検査により判断した。群（各群はマウス５匹を有する）あたりの浮腫の可視的徴候を呈するマウスの数を合計し、０～５の浮腫スコアを得た。
【0071】
血漿中のハプトグロビンの定量化
ハプトグロビンの血漿濃度は、ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ Ｍｏｕｓｅ Ａｃｕｔｅ Ｐｈａｓｅ ｐａｎｅｌ２キット（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。試料は、まずアッセイ緩衝液で１：２００００に希釈し、次に標準およびＱＣと一緒に９６ウェルプレート内に配置した。次に、ビーズを含有する溶液を添加した。ビーズは磁気マイクロスフェアであり、それらの各々は特異抗体でコーティングした。混合物を４℃で一晩インキュベートし、次に反応混合物をストレプトアビジン－ＰＥコンジュゲートとともにインキュベートし、各マイクロスフェアの表面上で反応を完了させた。プレートは、アナライザーのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００で読み取った。各個別のマイクロスフェアを同定し、そのバイオアッセイの結果を蛍光レポーターシグナルに基づいて定量化した。濃度は、５パラメータロジスティック曲線フィッティング法を用いる中央値蛍光強度（ＭＦＩ）データを用いて評価した。
ハプトグロビンの血漿濃度は、ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ Ｍｏｕｓｅ Ａｃｕｔｅ Ｐｈａｓｅ ｐａｎｅｌ２キット（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。試料は、まずアッセイ緩衝液で１：２００００に希釈し、次に標準およびＱＣと一緒に９６ウェルプレート内に配置した。次に、ビーズを含有する溶液を添加した。ビーズは磁気マイクロスフェアであり、それらの各々は特異抗体でコーティングした。混合物を４℃で一晩インキュベートし、次に反応混合物をストレプトアビジン－ＰＥコンジュゲートとともにインキュベートし、各マイクロスフェアの表面上で反応を完了させた。プレートは、アナライザーのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００で読み取った。各個別のマイクロスフェアを同定し、そのバイオアッセイの結果を蛍光レポーターシグナルに基づいて定量化した。濃度は、５パラメータロジスティック曲線フィッティング法を用いる中央値蛍光強度（ＭＦＩ）データを用いて評価した。
【0072】
血漿中のサイトカイン／ケモカインの定量化
マウスサイトカイン／ケモカインの血漿濃度は、サイトカイン；ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＣＰ－１およびＩＰ－１０の同時定量化のため、ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ磁気ビーズキット（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。試料は、まずアッセイ緩衝液で１：２に希釈し、次に標準およびＱＣと一緒に９６ウェルプレート内に配置した。ビーズを含有する溶液を添加した。ビーズは磁気マイクロスフェアであり、それらの各々は特異抗体でコーティングした。混合物を４℃で一晩インキュベートし、次に反応混合物をストレプトアビジン－ＰＥコンジュゲートとともにインキュベートし、各マイクロスフェアの表面上で反応を完了させた。プレートは、アナライザーのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００で読み取った。各個別のマイクロスフェアを同定し、そのバイオアッセイの結果を蛍光レポーターシグナルに基づいて定量化した。濃度は、５パラメータロジスティック曲線フィッティング法を用いる中央値蛍光強度（ＭＦＩ）データを用いて評価した。
マウスサイトカイン／ケモカインの血漿濃度は、サイトカイン；ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＣＰ－１およびＩＰ－１０の同時定量化のため、ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ磁気ビーズキット（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。試料は、まずアッセイ緩衝液で１：２に希釈し、次に標準およびＱＣと一緒に９６ウェルプレート内に配置した。ビーズを含有する溶液を添加した。ビーズは磁気マイクロスフェアであり、それらの各々は特異抗体でコーティングした。混合物を４℃で一晩インキュベートし、次に反応混合物をストレプトアビジン－ＰＥコンジュゲートとともにインキュベートし、各マイクロスフェアの表面上で反応を完了させた。プレートは、アナライザーのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００で読み取った。各個別のマイクロスフェアを同定し、そのバイオアッセイの結果を蛍光レポーターシグナルに基づいて定量化した。濃度は、５パラメータロジスティック曲線フィッティング法を用いる中央値蛍光強度（ＭＦＩ）データを用いて評価した。
【0073】
血漿中のｍＲＮＡ１タンパク質の定量化
ｍＲＮＡ１タンパク質は、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ磁気ビーズ［Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ］を用いて単一分析物として測定した。アッセイは、Ｂｉｏｐｌｅｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｕｍｉｎｅｘ １００ＴＭ］およびＢｉｏｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ６．１ソフトウェアのカーブフィッティングソフトウェア［Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ］を用いて実施した。簡潔に述べると、アッセイは、検量線の低領域側を延長するための追加的な較正点を伴う、製造業者の使用説明書に基づく改良されたプロトコルに従って実施した。試料データは、検量線から逆算した（５ＰＬカーブフィッティング）。
ｍＲＮＡ１タンパク質は、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ磁気ビーズ［Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ］を用いて単一分析物として測定した。アッセイは、Ｂｉｏｐｌｅｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｕｍｉｎｅｘ １００ＴＭ］およびＢｉｏｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ６．１ソフトウェアのカーブフィッティングソフトウェア［Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ］を用いて実施した。簡潔に述べると、アッセイは、検量線の低領域側を延長するための追加的な較正点を伴う、製造業者の使用説明書に基づく改良されたプロトコルに従って実施した。試料データは、検量線から逆算した（５ＰＬカーブフィッティング）。
【0074】
血漿中の親油性抗炎症剤の定量化
血漿中の親油性抗炎症剤の濃度は、タンパク質沈殿とその後の質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィーにより測定した。血漿試料５０μＬを、体積マーカーとして１０ナノモル／Ｌの５，５－ジエチル－１，３－ジフェニル－２－イミノバルビツール酸を含有するアセトニトリル中の０．２％ギ酸１８０μＬで沈殿させた。３分間のボルテックスおよび遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、２０分）の後、上清を採取し、分析した。上清の分析は、短い逆相ＨＰＬＣカラムで、迅速な勾配溶出ならびにエレクトロスプレーイオン化および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）獲得を伴う三重四重極装置を用いたＭＳ／ＭＳ検出とともに実施した。
血漿中の親油性抗炎症剤の濃度は、タンパク質沈殿とその後の質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィーにより測定した。血漿試料５０μＬを、体積マーカーとして１０ナノモル／Ｌの５，５－ジエチル－１，３－ジフェニル－２－イミノバルビツール酸を含有するアセトニトリル中の０．２％ギ酸１８０μＬで沈殿させた。３分間のボルテックスおよび遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、２０分）の後、上清を採取し、分析した。上清の分析は、短い逆相ＨＰＬＣカラムで、迅速な勾配溶出ならびにエレクトロスプレーイオン化および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）獲得を伴う三重四重極装置を用いたＭＳ／ＭＳ検出とともに実施した。
【0075】
実施例１：パルミチン酸ロフレポニド／ｍＲＮＡ（１：１ ｗ／ｗ）を含有するＬＮＰ
脂質溶液を調製するのに用いられる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５（モル／モル）である。さらに、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中のＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表１に記載する。
脂質溶液を調製するのに用いられる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５（モル／モル）である。さらに、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中のＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表１に記載する。
【0076】
ｍＲＮＡ１溶液の一定分量１．０５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．３５ｍＬとを、上記のプロセスに従って混合した。さらに、Ｒ－Ｃ１６およびＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００（「Ｒ－Ｃ１６対照」）のみを含有する非晶質Ｒ－Ｃ１６ナノ粒子を、上記と同じ混合条件下で調製した。ＬＮＰについて記述されたプロトコルを用いての調製の直後、粒子径を測定し、その後、これらの粒子を同様に透析した。測定した透析前および透析後の粒子径および％ＥＥを下の表１ａに示す。
【0077】
【表1】
【0078】
ＬＮＰ中に組み込まれたパルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）の量を測定するため、試料９００μＬを５０００００ｇで６０分間超遠心し、下層画分３００μＬおよび元の試料（遠心分離していない）を、シグナルがＰＤＡ－ＣＡＤ検出器を用いて検出されるＨＰＬＣを用いて、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよびＲ－Ｃ１６の含量について分析した。ＣＡＤシグナルは、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡのために用い、Ｒ－Ｃ１６については、２３５ｎｍでのＵＶ吸光度最大値を用い、濃度を外部検量線を用いて測定した。２成分間で分析した比を、元の試料における比と比較した。さらに、ＬＮＰ試料からの異なる画分中のＲ－Ｃ１６の濃度を、Ｒ－Ｃ１６およびＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００（「Ｒ－Ｃ１６対照」）のみのナノ粒子を含有する試料中のＲ－Ｃ１６の濃度と比較した。「Ｒ－Ｃ１６対照」試料の分析によると、超遠心分離後、パルミチン酸ロフレポニドが、Ｒ－Ｃ１６を含有するＬＮＰ試料と異なり、底部相に完全に局在することが示された。これは、完全に非水溶性であるパルミチン酸ロフレポニドが、混合物中に分離した薬剤粒子を形成しないばかりか、ＬＮＰ中に組み込まれることを示す。
【0079】
Ｒ－Ｃ１６ ＬＮＰに対するＨＰＬＣの結果を表１ｂに示す。ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡとＲ－Ｃ１６との間の比は、全画分において類似し、元の試料中で見られる場合に密接に関連し、これはＬＮＰ中へのパルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）の組み込みを示す。
【0080】
【表2】
【0081】
実施例２：非抗炎症性ＬＮＰ対パルミチン酸ロフレポニド／ｍＲＮＡ（１：１ ｗ／ｗ）ＬＮＰ
脂質溶液を調製するのに用いられる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、試料Ｓ４については、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表２に記載する。ｍＲＮＡ１溶液１．０５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．３５ｍＬとを、一般的説明に従って混合した。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表２に提示する。
脂質溶液を調製するのに用いられる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、試料Ｓ４については、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表２に記載する。ｍＲＮＡ１溶液１．０５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．３５ｍＬとを、一般的説明に従って混合した。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表２に提示する。
【0082】
【表3】
【0083】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ならびに試料Ｓ３およびＳ４を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で異なるマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビン、血漿サイトカイン／ケモカインおよび血漿ｍＲＮＡ１タンパク質濃度について得られた結果を図２Ａ～Ｄに示す。サイトカイン／ケモカインにおけるデータは、８および２４時間後の双方で示す。結果は、本開示に従うＬＮＰを用いることにより、免疫応答のバイオマーカーまたは症状、例えば（浮腫スコアリングとして測定された）炎症、血漿中のハプトグロビンおよびサイトカイン／ケモカインが有意に低下することを示す。さらに、本開示に従うＬＮＰは、タンパク質発現の増加をもたらす。
【0084】
実施例３：非抗炎症性ＬＮＰ対パルミチン酸ロフレポニド／ｍＲＮＡ（１：１、１：１０および１：３０ ｗ／ｗ）ＬＮＰ
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、試料Ｓ５、Ｓ６およびＳ７については、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭ（Ｓ５）、０．０２５ｍＭ（Ｓ６）または８．３μＭ（Ｓ７）をもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表３に記載する。ｍＲＮＡ１溶液１．２９ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．４３ｍＬとを、上記に従って混合した。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表３に提示する。
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、試料Ｓ５、Ｓ６およびＳ７については、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭ（Ｓ５）、０．０２５ｍＭ（Ｓ６）または８．３μＭ（Ｓ７）をもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表３に記載する。ｍＲＮＡ１溶液１．２９ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．４３ｍＬとを、上記に従って混合した。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表３に提示する。
【0085】
【表4】
【0086】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）および試料Ｓ５～Ｓ８を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で異なるマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビン、および血漿タンパク質濃度について得られた結果を図３Ａ～Ｃに示す。結果は、（すべての比での）Ｒ－Ｃ１６ ＬＮＰを用いることにより、浮腫スコアリングとして測定された炎症およびハプトグロビンが有意に低下することを示す。さらに、（すべての比での）Ｒ－Ｃ１６ ＬＮＰは、非抗炎症性ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ ＬＮＰに対するタンパク質発現の増加をもたらす。
【0087】
実施例４：パルミチン酸ロフレポニド対ロフレポニドＬＮＰ
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、試料Ｓ９については、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭをもたらす量で含有した。この試料においては、ｍＲＮＡ１溶液１．０５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．３５ｍＬとを、上記に従って混合した。試料Ｓ１０は、２１ｍＭロフレポニドのエタノール溶液１６μＬをＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００ ＬＮＰに添加することにより調製し、透析ステップ後、所望される組成物を得て、その後の２日間平衡化した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６またはロフレポニドの最終モル組成を下の表４に記載する。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表４に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、試料Ｓ９については、溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．２５ｍＭをもたらす量で含有した。この試料においては、ｍＲＮＡ１溶液１．０５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．３５ｍＬとを、上記に従って混合した。試料Ｓ１０は、２１ｍＭロフレポニドのエタノール溶液１６μＬをＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００ ＬＮＰに添加することにより調製し、透析ステップ後、所望される組成物を得て、その後の２日間平衡化した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６またはロフレポニドの最終モル組成を下の表４に記載する。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表４に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
【0088】
【表5】
【0089】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）試料Ｓ９およびＳ１０を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で２つのマウス群（Ｎ＝１５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビン、および血漿タンパク質濃度について得られた結果を図４Ａ～Ｃに示す。結果は、本開示に従うＲ－Ｃ１６ ＬＮＰを用いることにより、ロフレポニドを同じモル用量で含有するＬＮＰに対して、浮腫スコアリングとして測定された炎症およびハプトグロビンが有意に低下することを示す。さらに、Ｒ－Ｃ１６ ＬＮＰは、ロフレポニドを含有するＬＮＰに対してタンパク質発現タンパク質の増加および延長をもたらす。
【0090】
実施例５：プロドラッグのパルミチン酸ロフレポニドのロフレポニドへの変換
試料Ｓ９およびＳ１０（上記参照）を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量でマウス（Ｎ＝１６）に皮下投与した。ロフレポニド血漿濃度対時間について得られた結果を図５に示す。結果は、パルミチン酸ロフレポニドＬＮＰのマウスへの皮下投与後の、パルミチン酸ロフレポニドのロフレポニドへの変換を示す。さらに、結果はまた、ロフレポニドＬＮＰが、パルミチン酸ロフレポニドＬＮＰの使用時に対して有意により高い初期血漿濃度をもたらすことを明示する。これは、パルミチン酸ロフレポニドを含むＬＮＰの投与の場合、相当量のロフレポニドが投与部位から血漿中に漏れる場合のロフレポニド母化合物を有するＬＮＰの場合と比べて、ロフレポニドのかなりの部分が血漿ではなく細胞内に位置することを示す。したがって、本開示に従うＬＮＰは、治療ウインドウの全体的増加をもたらし、需要のある被験者に投与されるべき用量の有意な減少を可能にする。
試料Ｓ９およびＳ１０（上記参照）を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量でマウス（Ｎ＝１６）に皮下投与した。ロフレポニド血漿濃度対時間について得られた結果を図５に示す。結果は、パルミチン酸ロフレポニドＬＮＰのマウスへの皮下投与後の、パルミチン酸ロフレポニドのロフレポニドへの変換を示す。さらに、結果はまた、ロフレポニドＬＮＰが、パルミチン酸ロフレポニドＬＮＰの使用時に対して有意により高い初期血漿濃度をもたらすことを明示する。これは、パルミチン酸ロフレポニドを含むＬＮＰの投与の場合、相当量のロフレポニドが投与部位から血漿中に漏れる場合のロフレポニド母化合物を有するＬＮＰの場合と比べて、ロフレポニドのかなりの部分が血漿ではなく細胞内に位置することを示す。したがって、本開示に従うＬＮＰは、治療ウインドウの全体的増加をもたらし、需要のある被験者に投与されるべき用量の有意な減少を可能にする。
【0091】
実施例６：吉草酸ロフレポニド、ミリスチン酸ロフレポニド、パルミチン酸ロフレポニドまたはステアリン酸ロフレポニドを有するＬＮＰ
脂質溶液を調製するのに用いられる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに溶液はまた、吉草酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ５、試料Ｓ１２）、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４、試料Ｓ１３）、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６、試料Ｓ１４）またはステアリン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１８、試料Ｓ１５）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－ＣＸの総濃度＝０．２５ｍＭ（Ｘ＝鎖内の炭素の数）をもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－ＣＸの最終モル組成を下の表６に示す。ｍＲＮＡ１溶液２．４７５ｍＬと脂質およびＲ－ＣＸ溶液０．８２５ｍＬとを、一般的説明に従って混合した。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表６に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
脂質溶液を調製するのに用いられる脂質のモル組成は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに溶液はまた、吉草酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ５、試料Ｓ１２）、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４、試料Ｓ１３）、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６、試料Ｓ１４）またはステアリン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１８、試料Ｓ１５）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－ＣＸの総濃度＝０．２５ｍＭ（Ｘ＝鎖内の炭素の数）をもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－ＣＸの最終モル組成を下の表６に示す。ｍＲＮＡ１溶液２．４７５ｍＬと脂質およびＲ－ＣＸ溶液０．８２５ｍＬとを、一般的説明に従って混合した。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表６に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
【0092】
【表6】
【0093】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）および試料Ｓ１１～Ｓ１５を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で異なるマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビン、および血漿タンパク質濃度について得られた結果を図６Ａ～Ｃに示す。結果は、本開示に従うＲ－Ｃ１４、Ｒ－Ｃ１６またはＲ－Ｃ１８ ＬＮＰを用いることにより、非抗炎症性ＬＮＰに対して、浮腫スコアリングとして測定された炎症およびハプトグロビンが有意に低下するが、吉草酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ５）を用いても炎症が有意に影響されなかったことを示す。さらに、Ｒ－Ｃ１４、Ｒ－Ｃ１６またはＲ－Ｃ１８ ＬＮＰは、非抗炎症性ＬＮＰに対してタンパク質発現の増加および延長をもたらすが、Ｒ－Ｃ５ ＬＮＰは、有意に増加した総タンパク質の発現をもたらさなかった（０～２４時間）。
【0094】
実施例７：パルミチン酸ロフレポニドの存在下および不在下でのＭｅｒｃｋ－３２を有するＬＮＰ
２つの試料を調製し（Ｓ１６およびＳ１７）、両試料において、脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、Ｍｅｒｃｋ－３２：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、Ｓ１６に対して用いた溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．１４ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表７に記載する。Ｓ１６については、ｍＲＮＡ１溶液２．９２５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．９７５ｍＬとを上記に従って混合し、またＳ１７については、ｍＲＮＡ１溶液０．７５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．２５ｍＬとを上記に従って混合した。Ｓ１６およびＳ１７双方において、イオン化可能脂質（Ｍｅｒｃｋ－３２）とｍＲＮＡヌクレオチドのモル比は６．０であった。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表７に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
２つの試料を調製し（Ｓ１６およびＳ１７）、両試料において、脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、Ｍｅｒｃｋ－３２：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５であった。さらに、Ｓ１６に対して用いた溶液はまた、パルミチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１６）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１６の総濃度＝０．１４ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１６の最終モル組成を下の表７に記載する。Ｓ１６については、ｍＲＮＡ１溶液２．９２５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．９７５ｍＬとを上記に従って混合し、またＳ１７については、ｍＲＮＡ１溶液０．７５ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１６溶液０．２５ｍＬとを上記に従って混合した。Ｓ１６およびＳ１７双方において、イオン化可能脂質（Ｍｅｒｃｋ－３２）とｍＲＮＡヌクレオチドのモル比は６．０であった。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表７に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
【0095】
【表7】
【0096】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含有する試料Ｓ１１およびＳ１４（表６参照）ならびにＭｅｒｃｋ－３２を含有する試料Ｓ１６～Ｓ１７を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で異なるマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビン、および血漿タンパク質濃度について得られた結果を図７Ａ～Ｃに示す。結果は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭｅｒｃｋ－３２に基づくＬＮＰ双方においてパルミチン酸ロフレポニドを用いることにより、浮腫スコアリングとして測定された炎症およびハプトグロビンが有意に低下することを示す。さらに、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭｅｒｃｋ－３２に基づくＬＮＰ双方におけるパルミチン酸ロフレポニドの存在は、ｍＲＮＡ１タンパク質発現の増加をもたらす。
【0097】
実施例８：より高いｍＲＮＡ用量でミリスチン酸ロフレポニドを有し（ミリスチン酸ロフレポニド／ｍＲＮＡ比が１：１および０．３：１ ｗ／ｗの時）、Ｍｅｒｃｋ－３２を有するＬＮＰ
３つの試料を調製したが（Ｓ１８～Ｓ２０）、脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成を下の表８に記載する。試料Ｓ１９およびＳ２０については、脂質混合物は、ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質、およびミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１４の総濃度＝０．０８３ｍＭ（Ｓ１９）または０．２５ｍＭ（ＳＣ２０）をもたらす量で含んだ。すべての試料は、上の一般的説明に従って混合した。試料Ｓ１８については、ｍＲＮＡ１溶液の体積は２．１３ｍＬであり、脂質溶液の体積は０．７１ｍＬであった。試料Ｓ１９については、ｍＲＮＡ１溶液の体積は３．１２ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は１．０４ｍＬであった。試料Ｓ２０は、２つのバッチと同一のバッチからなった（各バッチにおいて、ｍＲＮＡ１溶液の体積は３．２１ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は１．０７ｍＬであった）。両試料Ｓ１９およびＳ２０は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルターを用いて濃縮し、インビボ投与にとって所望される濃度にした。濃縮ステップ前に、試料Ｓ２０を構成する２つのバッチを一緒に混合させた。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表８に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
３つの試料を調製したが（Ｓ１８～Ｓ２０）、脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成を下の表８に記載する。試料Ｓ１９およびＳ２０については、脂質混合物は、ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質、およびミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１４の総濃度＝０．０８３ｍＭ（Ｓ１９）または０．２５ｍＭ（ＳＣ２０）をもたらす量で含んだ。すべての試料は、上の一般的説明に従って混合した。試料Ｓ１８については、ｍＲＮＡ１溶液の体積は２．１３ｍＬであり、脂質溶液の体積は０．７１ｍＬであった。試料Ｓ１９については、ｍＲＮＡ１溶液の体積は３．１２ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は１．０４ｍＬであった。試料Ｓ２０は、２つのバッチと同一のバッチからなった（各バッチにおいて、ｍＲＮＡ１溶液の体積は３．２１ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は１．０７ｍＬであった）。両試料Ｓ１９およびＳ２０は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルターを用いて濃縮し、インビボ投与にとって所望される濃度にした。濃縮ステップ前に、試料Ｓ２０を構成する２つのバッチを一緒に混合させた。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表８に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
【0098】
【表8】
【0099】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含有する試料Ｓ１８ならびにＭｅｒｃｋ－３２およびミリスチン酸ロフレポニドを含有する試料Ｓ２０を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で異なるマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。さらに、試料Ｓ１９～Ｓ２０はまた、１ｍｇ／ｋｇのより高いｍＲＮＡ用量でマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビン、および血漿ｍＲＮＡ１タンパク質濃度について得られた結果を図８Ａ～Ｃに示す。結果は、Ｍｅｒｃｋ－３２に基づくＬＮＰ中にミリスチン酸ロフレポニドをＲ－Ｃ１４／ｍＲＮＡ比が１：１で用いることにより、０．３および１ｍｇ／ｋｇ双方で、浮腫スコアリングとして測定された炎症が低下することを示す。さらに、タンパク質発現が、０．３および１ｍｇ／ｋｇ用量を比較するとき、（時間間隔０～２４時間にわたり）概ね用量比例的な増加を示す。
【0100】
実施例９：ミリスチン酸ロフレポニドの存在下および不在下でのＫＬ１０およびＡｃｕｉｔａｓ－５を有するＬＮＰ（ミリスチン酸ロフレポニド／ｍＲＮＡ比が１：１ ｗ／ｗ）
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成を下の表９に記載する。試料Ｓ２３およびＳ２５については、脂質混合物は、イオン化可能脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質に加えて、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）を、透析前ＬＮＰ溶液中でのＲ－Ｃ１４の総濃度＝０．２８ｍＭ（Ｓ２３）または０．１７ｍＭ（Ｓ２５）をもたらす量で含有した。すべての試料は、試料Ｓ２２およびＳ２３においてＮ：Ｐ＝３であり、かつ試料Ｓ２４およびＳ２５においてＮ：Ｐ＝４．９である以外では、一般的説明に従って混合した。試料Ｓ２１については、ｍＲＮＡ１溶液の体積は２．１６ｍＬであり、脂質溶液の体積は０．７２ｍＬであった。試料Ｓ２２およびＳ２３については、ｍＲＮＡ１タンパク質溶液の体積は１．４１ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は０．４７ｍＬであり、また試料Ｓ２４およびＳ２５については、ｍＲＮＡ１タンパク質溶液の体積は１．７７ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は０．５９ｍＬであった。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表８に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成を下の表９に記載する。試料Ｓ２３およびＳ２５については、脂質混合物は、イオン化可能脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質に加えて、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）を、透析前ＬＮＰ溶液中でのＲ－Ｃ１４の総濃度＝０．２８ｍＭ（Ｓ２３）または０．１７ｍＭ（Ｓ２５）をもたらす量で含有した。すべての試料は、試料Ｓ２２およびＳ２３においてＮ：Ｐ＝３であり、かつ試料Ｓ２４およびＳ２５においてＮ：Ｐ＝４．９である以外では、一般的説明に従って混合した。試料Ｓ２１については、ｍＲＮＡ１溶液の体積は２．１６ｍＬであり、脂質溶液の体積は０．７２ｍＬであった。試料Ｓ２２およびＳ２３については、ｍＲＮＡ１タンパク質溶液の体積は１．４１ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は０．４７ｍＬであり、また試料Ｓ２４およびＳ２５については、ｍＲＮＡ１タンパク質溶液の体積は１．７７ｍＬであり、脂質およびＲ－Ｃ１４溶液の体積は０．５９ｍＬであった。測定した透析前および透析後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表８に提示する（サイズ測定においては、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いた）。
【0101】
【表9】
【0102】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含有する試料Ｓ２１、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）の不在下および存在下でＡｃｕｉｔａｓ－５を含有する試料Ｓ２２～２３、ならびにミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）の不在下および存在下でＫＬ１０を含有する試料Ｓ２４～２５を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で異なるマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビンおよび血漿ｍＲＮＡ１タンパク質濃度について得られた結果を図９Ａ～Ｃに示す。結果は、Ａｃｕｉｔａｓ－５およびＫＬ１０に基づくＬＮＰ双方においてミリスチン酸ロフレポニドを用いることにより、浮腫スコアリングとして測定された炎症および血漿ハプトグロビンが、（０．３ｍｇ／ｋｇ時の）ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡに基づくＬＮＰと比べて低下することを示す。さらに、（時間間隔０～２４時間にわたる）ｍＲＮＡ１タンパク質発現が、ミリスチン酸ロフレポニドがＬＮＰ中に組み込まれるとき、増加する。
【0103】
実施例１０：Ｍｅｒｃｋ－３２単独を有するＬＮＰおよびミリスチン酸ロフレポニド、ミリスチン酸ブデソニド、パルミチン酸ブデソニドまたはオレイン酸ブデソニドを有するＬＮＰ
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、Ｌ６０８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５（試料Ｓ２６）であった。試料Ｓ２７はまた、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）を含有し、試料Ｓ２９、Ｓ３０、およびＳ３１については、溶液はまた、ミリスチン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１４）、パルミチン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１６）およびオレイン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１８：１）の各々を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６およびＢ－Ｃ１８：１の総濃度＝０．１５４ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６またはＢ－Ｃ１８：１の最終モル組成を下の表１０に記載する。ｍＲＮＡ１タンパク質溶液の一定分量３．３６ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６またはＢ－Ｃ１８：１溶液１．１２ｍＬとを、上記の「ｍＲＮＡを含有するＬＮＰの調製」セクションの下の上記の一般的説明に従って混合した。すべての試料は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心分離フィルターを用いて濃縮し、次に配合物が０．２ｍｇ／ｍＬより有意に高い推定上のｍＲＮＡ濃度を有するまで、３０００ｒｐｍおよび８℃で回転した。残存する配合物の塊を収集し、遠心分離フィルターを少ない一定分量のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、主な試料画分に添加し、約０．２ｍｇ／ｍＬの推定上のｍＲＮＡ濃度を得た。その後、粒子径を再び測定した。測定した透析前および濃縮後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表１０に提示する。
脂質溶液を調製するのに用いる脂質のモル組成は、Ｌ６０８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５（試料Ｓ２６）であった。試料Ｓ２７はまた、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）を含有し、試料Ｓ２９、Ｓ３０、およびＳ３１については、溶液はまた、ミリスチン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１４）、パルミチン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１６）およびオレイン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１８：１）の各々を、透析前ＬＮＰ溶液中でＲ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６およびＢ－Ｃ１８：１の総濃度＝０．１５４ｍＭをもたらす量で含有した。ＬＮＰ中の４つの脂質およびＲ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６またはＢ－Ｃ１８：１の最終モル組成を下の表１０に記載する。ｍＲＮＡ１タンパク質溶液の一定分量３．３６ｍＬと脂質およびＲ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６またはＢ－Ｃ１８：１溶液１．１２ｍＬとを、上記の「ｍＲＮＡを含有するＬＮＰの調製」セクションの下の上記の一般的説明に従って混合した。すべての試料は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心分離フィルターを用いて濃縮し、次に配合物が０．２ｍｇ／ｍＬより有意に高い推定上のｍＲＮＡ濃度を有するまで、３０００ｒｐｍおよび８℃で回転した。残存する配合物の塊を収集し、遠心分離フィルターを少ない一定分量のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、主な試料画分に添加し、約０．２ｍｇ／ｍＬの推定上のｍＲＮＡ濃度を得た。その後、粒子径を再び測定した。測定した透析前および濃縮後の粒子径を、％ＥＥとともに、下の表１０に提示する。
【0104】
【表10】
【0105】
試料Ｓ２６～Ｓ３１を、上記のように、０．３ｍｇのｍＲＮＡ／ｋｇの用量で異なるマウス群（Ｎ＝５）に皮下投与した。浮腫スコアリング、血漿ハプトグロビン、血漿サイトカイン／ケモカインおよび血漿ｍＲＮＡ１濃度について得られた結果を図１０Ａ～Ｇに示す。結果は、ミリスチン酸ロフレポニド（Ｒ－Ｃ１４）、パルミチン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１６）またはオレイン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１８：１）ＬＮＰが、通常のＬＮＰ（試料Ｓ２６）に対して、浮腫スコアリングとして測定された炎症、ハプトグロビンならびにサイトカインＩＬ－６およびＫＣを有意に低減することを示す。さらに、炎症は、ミリスチン酸ブデソニド（Ｂ－Ｃ１４）を用いる場合と同程度に影響されなかった。さらに、Ｒ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６またはＢ－Ｃ１８：１ ＬＮＰは、通常のＬＮＰ（試料Ｓ２６）に対して、ｍＲＮＡ１発現の増加および延長をもたらした。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A-D】
【図3A-C】
【図4A-C】
【図5A-B】
【図6A-C】
【図7A-C】
【図8A-C】
【図9A-C】
【図10A-B】
【図10C-D】
【図10E-F】
【図10G】
