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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-02
(45)【発行日】2022-05-13
(54)【発明の名称】成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）のモニタリング法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20220506BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220506BHJP
C12Q 1/6862 20180101ALI20220506BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20220506BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20220506BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20220506BHJP
C12N 15/48 20060101ALN20220506BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6862 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/06
G01N33/48 M
C12N15/48
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020504761
(86)(22)【出願日】2017-04-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-08-27
(86)【国際出願番号】 EP2017058271
(87)【国際公開番号】W WO2018184683
(87)【国際公開日】2018-10-11
【審査請求日】2020-04-06
(73)【特許権者】
【識別番号】513178115
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ド リエージュ
(73)【特許権者】
【識別番号】519362103
【氏名又は名称】インスティテュート ジュール ボルデ
(73)【特許権者】
【識別番号】514084347
【氏名又は名称】ユニベルシテ リブレ デ ブリュッセル
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジョルジュ，ミヒャエル
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン デン ブロッケ，アン
(72)【発明者】
【氏名】ダーキン，キース
(72)【発明者】
【氏名】アルテッシ，マリア
(72)【発明者】
【氏名】ハホウト，ヴィンセント
(72)【発明者】
【氏名】ローズウィック，ニコラス
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００４／０９９４４６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Methods in Molecular Biology，Vol.1582, p.127-141，2017年03月30日
【文献】Genome Medicine，2014年，Vol.6, 46, Additional file 1, 2
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
レトロウイルスに感染した宿主対象または前記レトロウイルスに関連した疾患を患う対象の細胞に由来するゲノムＤＮＡから直鎖ＰＣＲ産物を作製するための方法であって、前記ＰＣＲ産物は、前記細胞の宿主ゲノムＤＮＡ内の前記レトロウイルスの組み込み部位を含む標的配列と、隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列とを含有し、前記組み込み部位は少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端を含み、
前記ＰＣＲ産物は、第一末端と、第二末端と、以下の順番の配列とを含み：
前記第一末端に特異的な配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、前記第二末端に特異的な配列；
前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）前記対象に由来する細胞からゲノムＤＮＡを単離する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた前記ゲノムＤＮＡを切断する工程；
ｃ）前記レトロウイルスの５’－ＬＴＲに結合するプライマー、前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲに結合するプライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、工程ｂ）で得られた前記切断されたＤＮＡを用いて伸長反応を行う工程であって、前記ｄＮＴＰが標識ｄＮＴＰを含み、且つ／または、前記プライマーが標識されていることにより、３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡ産物が生成され、前記標識は結合性リガンドである、前記工程；
ｄ）３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーを工程ｃ）で得られた生成物の末端にライゲーションする工程であって、前記リンカーの前記３’シングルヌクレオチドオーバーハングが前記標識ＤＮＡ鎖の前記３’シングルヌクレオチドオーバーハングと相補的であることによって、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含
む配列、それに続くリンカー配列、および前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つが導入される、前記工程、
ｅ）前記結合性リガンドに結合する受容体を用いて工程ｄ）で得られた生成物を単離する工程；
ｆ）鋳型としての工程ｅ）で得られた生成物の存在下で、工程ｅ）で得られた生成物の前記第一末端に特異的な第一プライマーおよび前記第二末端に特異的な第二プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を少なくとも１回実行する工程であって、前記第一プライマーおよび前記第二プライマーが、その５’末端に互いに異なる少なくとも１個の付加配列をそれぞれ含むことによって、前記第一末端に特異的な前記付加配列と前記第二末端に特異的な前記付加配列とを含む前記直鎖ＰＣＲ産物が生成される、前記工程。
【請求項2】
伸長工程ｃ）で用いられたＤＮＡポリメラーゼが、合成されたＤＮＡ鎖の３’末端に単一の余剰ヌクレオチドを付加する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程ｃ）において、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列、を含む二本鎖ＤＮＡ産物が得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程ｄ）において、前記リンカーが、それぞれ３’－ＬＴＲまたは５’－ＬＴＲを有する末端とは反対側の、工程ｃ）で得られた生成物の末端に付加される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
工程ｄ）において、標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡが得られ、前記二本鎖ＤＮＡ生成物は、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つ、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
工程ｄ）において、シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーが、３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する、工程ｃ）で得られた生成物の末端にライゲーションされ、リンカーのシングルヌクレオチドオーバーハングが、工程ｃ）で合成されたＤＮＡ鎖の３’シングルヌクレオチドオーバーハングにハイブリダイズされることで、標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡ生成物が生成され、前記二本鎖ＤＮＡ生成物が、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つと、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
工程ｃ）において合成ＤＮＡ鎖の３’末端に付加されたシングルヌクレオチドオーバーハングがデオキシアデノシンであり、工程ｄ）で付加されたリンカーのシングルヌクレオチドオーバーハングがデゾキシチミジンである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＰＣＲ産物が以下の順番で、Ｘ４配列、Ｘ３配列、６～３０個のヌクレオチドを含むタグ配列、宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、Ｘ１配列、Ｘ２配列を含み；工程ｆ）が以下の工程：
ｆ１）鋳型としての工程ｅ）で得られた生成物、Ｘ３配列に結合するプライマー、５’－ＬＴＲに結合するプライマー、３’－ＬＴＲに結合するプライマーの存在下で、第一ＰＣＲ反応を実行する工程であって、前記５’－ＬＴＲに結合するプライマーおよび前記
３’－ＬＴＲに結合するプライマーがそれぞれ、追加のＸ１配列をその５’末端に含むことにより、前記Ｘ１配列をも含むＰＣＲ産物が生成される、前記工程；
ｆ２）鋳型としての工程ｆ１）で得られた生成物、その５’末端に追加のＸ４配列を有するＸ３配列に結合するプライマー、その５’末端に追加のＸ２配列を有するＸ１配列に結合するプライマーの存在下で、第二ＰＣＲ反応を実行することにより、前記Ｘ２配列および前記Ｘ４配列をも含むＰＣＲ産物が生成される工程、
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記結合性リガンドおよび前記受容体が、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン；ジゴキシゲニン（digoxygenin）／抗ジゴキシゲニン（digoxygenin）抗体；ハプテン／抗ハプテン抗体；抗原／抗体からなる結合性ペアの群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記レトロウイルスがＨＴＬＶ－１であり、前記ＨＴＬＶ－１関連疾患が成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）であり、前記ゲノムＤＮＡが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）を患う対象における優勢な白血病性Ｔリンパ球クローンを測定し縦断的にモニタリングするための方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって直鎖ＰＣＲ産物が作製され、前記ＰＣＲ産物が多重シーケンスにかけられることで全ての挿入部位および全ての切断部位が決定され、前記切断部位はそれぞれの挿入部位と相関しており、
その後、特定のＴリンパ球クローンを表す各挿入部位について異なる切断部位の数を計数し、同一の挿入部位および同一のランダムタグを有するリードを排除することによりあらゆるＰＣＲデュプリケート（PCR duplicate）を考慮から排除し、それから特定のＴリンパ球クローンの各々の存在量を決定することが行われ、
特定のＴリンパ球クローンの存在量が多いことが、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性が高いこと、および／または、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療が成功していないこと、を示し；
特定のＴリンパ球クローンの存在量が少ないことが、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性が低いこと、および／または、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療が成功していること、を示す、
前記方法。
【請求項12】
特定のＴリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性を判定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
特定のＴリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療の成功を判定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記特定のＴリンパ球クローンが、診断時に優勢な白血病性クローンと同定されたものと同じである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＨＴＬＶ－１に感染した対象または成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）を患う対象に由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から直鎖ＰＣＲ産物を調製する方法、並びに、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫を患う対象において優勢な悪性／白血病性Ｔリンパ球クローンを決定し縦断的にモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【0002】
世界中で推定１～２千万人がヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）に感染している。感染者の約５％において、このウイルスは、予後が非常に悪い高悪性度（aggressive）のＣＤ４陽性Ｔ細胞悪性腫瘍である、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）を発症させる。発がん性レトロウイルスであるＨＴＬＶ－１は世界中に分布しているが偏在しており、流行地域は日本南西部、カリブ海沿岸、中南米、西アフリカ、並びに中東およびヨーロッパの小地域となる。ＨＴＬＶ－１感染者におけるＡＴＬの累積罹患率は５％に過ぎないが、予後が極度に悪いため、流行地域では主要な健康衛生上の問題となっている。ＡＴＬ患者は多様な臨床的特徴を示し、例えば、花のような核を有する異常リンパ球（花細胞（flower cell））の末梢血中の増加、リンパ節腫脹、高カルシウム血症、皮膚病変
、多臓器不全、および／または頻繁な日和見感染などがある。ＡＴＬは、血液合併症、循環異常リンパ球の有無、並びに高カルシウム血レベルおよび乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベルを含む生物学的パラメーターに基づいて、急性型、リンパ腫型、くすぶり型および慢性型の４種類の病型に分類されている。この病型分類に患者の治療計画および予後は大きく影響される。高悪性度の病型を患う患者の予後は非常に悪く、生存期間中央値は急性白血病性型の場合で４～６か月間、リンパ腫型の場合で９～１０か月である。低悪性度（indolent）型の予後はより有望であり、慢性型およびくすぶり型の全生存期間中央値はそれぞれ３３か月間および５１か月間である。
、多臓器不全、および／または頻繁な日和見感染などがある。ＡＴＬは、血液合併症、循環異常リンパ球の有無、並びに高カルシウム血レベルおよび乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベルを含む生物学的パラメーターに基づいて、急性型、リンパ腫型、くすぶり型および慢性型の４種類の病型に分類されている。この病型分類に患者の治療計画および予後は大きく影響される。高悪性度の病型を患う患者の予後は非常に悪く、生存期間中央値は急性白血病性型の場合で４～６か月間、リンパ腫型の場合で９～１０か月である。低悪性度（indolent）型の予後はより有望であり、慢性型およびくすぶり型の全生存期間中央値はそれぞれ３３か月間および５１か月間である。
【0003】
ＡＴＬの治療方針は、病型、予後因子、および初期治療に対する応答に大きく依存する。日本において、高悪性度形態（急性型、リンパ腫型および予後が悪い慢性型）は、同種幹細胞移植（同種ＳＣＴ）を併用した、または併用しない、従来の化学療法で治療される。一方、西洋諸国では、インターフェロン（ＩＦＮ）αとジドブジン（ＡＺＴ）との併用が、慢性型ＡＴＬおよび大半の急性型ＡＴＬに対する現在の標準的な第一選択治療である。三酸化ヒ素（Ａｓ２Ｏ３）および抗ＣＣＲ４抗体のような標的療法を含む併用療法の研究が、有望な臨床的有用性を示している。治療に対する応答および完全臨床寛解は、現在、以下の形態学的および細胞学的なコンセンサス基準、すなわち、全血球計算値（ＣＢＣ）の正常化、血液中に存在する異常リンパ球が５％未満であること、および、４週間を超えて測定可能な腫瘍が存在しないこと、に基づいて定義される。予後が非常に悪いこと、再発率が高く急速であること、さらに、血液学的な完全寛解を達成した後の生存成績のばらつきが著しいことを考慮すると、現在のコンセンサス基準には修正が必要であり、ＡＴＬ／ＨＴＬＶ－１の特定の病態生理学的側面を組み込んだ、治療に対する応答をより良好に評価する、分子ツールの改善が必要である。ＨＴＬＶ－１感染細胞の主な分子的特徴の１つとして、宿主ゲノム内のプロウイルス組み込み部位（proviral integration site）
がある。ＨＴＬＶ－１感染無症候性キャリアおよび非悪性ＨＴＬＶ－１関連疾患は、宿主ゲノム内のプロウイルス組み込み部位によってそれぞれ一意に同定される、存在量が異なる多数のクローンを特徴としているが、ＡＴＬの発症は、多クローン性の感染細胞集団を根底とした、単一の優勢クローンの出現が関連している。現在までに検査されたＡＴＬ症例の大部分で、推定悪性クローンは、単一のプロウイルス組込を保有している。
がある。ＨＴＬＶ－１感染無症候性キャリアおよび非悪性ＨＴＬＶ－１関連疾患は、宿主ゲノム内のプロウイルス組み込み部位によってそれぞれ一意に同定される、存在量が異なる多数のクローンを特徴としているが、ＡＴＬの発症は、多クローン性の感染細胞集団を根底とした、単一の優勢クローンの出現が関連している。現在までに検査されたＡＴＬ症例の大部分で、推定悪性クローンは、単一のプロウイルス組込を保有している。
【0004】
Ｇｉｌｌｅｔ等（The host genomic environment of the provirus determines the ab
undance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood 117:3113-3122, 2011）では、各ク
ローンのマッピングと存在量の定量化を同時に可能にする、ライゲーションを介したＰＣＲおよび超並列シーケンスに基づくアプローチが開発された。
undance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood 117:3113-3122, 2011）では、各ク
ローンのマッピングと存在量の定量化を同時に可能にする、ライゲーションを介したＰＣＲおよび超並列シーケンスに基づくアプローチが開発された。
【0005】
しかし、Ｇｉｌｌｅｔ等の方法では３’ＬＴＲしかアッセイされず、このことが、アッセイのダイナミックレンジを潜在的に限定し、５’ＬＴＲの欠失を伴うクローンの同定を妨げている。さらに、クローン存在量の測定が最適ではなく、この方法の実行時間は長く、且つ、コストも高い。
【発明の概要】
【0006】
治療応答をより良好に評価する改善された分子ツールが必要とされていた。従って、本発明は、腫瘍内のクローン存在量のより正確な測定、５’欠失の検出、を可能にする方法を開発し、ＡＴＬ患者における悪性クローンを縦断的にモニタリングし、分子的応答をより良好に評価すること、を目的とした。さらに、前記方法にかかる実行時間およびコストを低減することを目的とした。
【0007】
本発明の目的は以下の方法によって果たされる：レトロウイルスに感染した宿主対象または前記レトロウイルスに関連した疾患を患う対象の細胞に由来するゲノムＤＮＡから直鎖ＰＣＲ産物を作製するための方法であって、
前記ＰＣＲ産物は、前記細胞の宿主ゲノムＤＮＡ内の前記レトロウイルスの組み込み部位を含む標的配列と、隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列とを含有し、前記組み込み部位は少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端を含み、
前記ＰＣＲ産物は、第一末端と、第二末端と、以下の順番の配列とを含み：
前記第一末端に特異的な配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、前記第二末端に特異的な配列；
前記ＰＣＲ産物は、以下の工程によって作製される：
ａ）前記対象に由来する細胞からゲノムＤＮＡを単離する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた前記ゲノムＤＮＡを切断する工程；
ｃ）前記レトロウイルスの５’－ＬＴＲに結合するプライマー、前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲに結合するプライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、工程ｂ）で得られた前記切断されたＤＮＡを用いて伸長反応を行う工程であって、前記ｄＮＴＰが標識ｄＮＴＰを含み、且つ／または、前記プライマーが標識されていることにより、３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡ産物が生成され、前記標識は結合性リガンドである、前記工程；
ｄ）３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーを工程ｃ）で得られた生成物の末端にライゲーションする工程であって、前記リンカーの前記３’シングルヌクレオチドオーバーハングが前記標識ＤＮＡ鎖の前記３’シングルヌクレオチドオーバーハングと相補的であることによって、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、および前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つが導入される、前記工程、
ｅ）前記結合性リガンドに結合する受容体を用いて工程ｄ）で得られた生成物を単離する工程；
ｆ）鋳型としての工程ｅ）で得られた生成物の存在下で、工程ｅ）で得られた生成物の前記第一末端に特異的な第一プライマーおよび前記第二末端に特異的な第二プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を少なくとも１回実行する工程であって、前記第一プライマーおよび前記第二プライマーが、その５’末端に互いに異なる少なくとも１個の付加配列をそれぞれ含むことによって、前記第一末端に特異的な前記付加配列と前記第二末端に特異的な前記付加配列とを含む前記直鎖ＰＣＲ産物が生成される、前記工程。
前記ＰＣＲ産物は、前記細胞の宿主ゲノムＤＮＡ内の前記レトロウイルスの組み込み部位を含む標的配列と、隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列とを含有し、前記組み込み部位は少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端を含み、
前記ＰＣＲ産物は、第一末端と、第二末端と、以下の順番の配列とを含み：
前記第一末端に特異的な配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、前記第二末端に特異的な配列；
前記ＰＣＲ産物は、以下の工程によって作製される：
ａ）前記対象に由来する細胞からゲノムＤＮＡを単離する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた前記ゲノムＤＮＡを切断する工程；
ｃ）前記レトロウイルスの５’－ＬＴＲに結合するプライマー、前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲに結合するプライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、工程ｂ）で得られた前記切断されたＤＮＡを用いて伸長反応を行う工程であって、前記ｄＮＴＰが標識ｄＮＴＰを含み、且つ／または、前記プライマーが標識されていることにより、３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡ産物が生成され、前記標識は結合性リガンドである、前記工程；
ｄ）３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーを工程ｃ）で得られた生成物の末端にライゲーションする工程であって、前記リンカーの前記３’シングルヌクレオチドオーバーハングが前記標識ＤＮＡ鎖の前記３’シングルヌクレオチドオーバーハングと相補的であることによって、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、および前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つが導入される、前記工程、
ｅ）前記結合性リガンドに結合する受容体を用いて工程ｄ）で得られた生成物を単離する工程；
ｆ）鋳型としての工程ｅ）で得られた生成物の存在下で、工程ｅ）で得られた生成物の前記第一末端に特異的な第一プライマーおよび前記第二末端に特異的な第二プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を少なくとも１回実行する工程であって、前記第一プライマーおよび前記第二プライマーが、その５’末端に互いに異なる少なくとも１個の付加配列をそれぞれ含むことによって、前記第一末端に特異的な前記付加配列と前記第二末端に特異的な前記付加配列とを含む前記直鎖ＰＣＲ産物が生成される、前記工程。
【0008】
標識された（すなわちビオチン化された）ＤＮＡコンストラクトを作製することの利点は、標識（ビオチン化）ＤＮＡが後の精製工程で精製されることによる、ウイルス性ＬＴＲを含有する断片の選別および濃縮、並びに前記方法の感度の上昇である。
【0009】
本アプローチのさらなる利点は、３’－ＬＴＲ－宿主接合配列および５’－ＬＴＲ－宿主接合配列の両方が検出され、それにより、検出可能な組み込み部位のダイナミックレンジおよび数が増加することである。このアプローチは、従って、５’－ＬＴＲの欠失を有するＨＴＬＶ－１バリアント（２型欠損ＨＴＬＶ－１プロウイルス）の同定を可能にする。これらのバリアントは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）症例の３分の１で観察される。これらのＡＴＬの予後は完全長プロウイルスを有するＡＴＬよりも悪いことが示唆されているため、これらのバリアントの検出も重要となる。
【0010】
少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列は、６～３０個のランダムな連続ヌクレオチド（本明細書では「ランダムタグ」または「ランダムタグ配列」とも称され得る）を含むことが好ましい。ランダムタグ配列は、好ましくは６～２０個、さらに好ましくは６～１０個のランダムな連続ヌクレオチドを含む。しかし、前記方法の特に好ましい実施形態では、８個のランダムな連続ヌクレオチドが使用される。ランダムタグを用いて、ＰＣＲデュプリケート、すなわち、同一の切断部位および同一のランダムタグを有するリード、が検出される。このアプローチにより、クローン存在量のより正確な測定が可能となる。
【0011】
ランダムタグの後には、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１２個のヌクレオチド、より好ましくは１０～６０個、さらに好ましくは１２～２５個のヌクレオチドを有するリンカー配列が続く。
【0012】
本発明に係る方法は、腫瘍におけるクローン存在量のより正確な測定、５’欠失の検出、を可能にし、ＡＴＬ患者における悪性クローンを縦断的にモニタリングし分子応答評価を改善するためのツールを提供する。さらに、前記方法の実行時間およびコストが低減された。
【0013】
本発明によれば、伸長工程ｃ）で用いられたＤＮＡポリメラーゼは、合成されたＤＮＡ鎖の３’末端に単一の余剰ヌクレオチドを付加する。
【0014】
好ましい実施形態では、工程ｃ）において、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡ産物が得られる。
【0015】
さらに好ましくは、工程ｄ）において、前記リンカーは、それぞれ３’－ＬＴＲまたは５’－ＬＴＲを有する末端とは反対側の、工程ｃ）で得られた生成物の末端に付加される。
【0016】
さらに好ましい方法では、工程ｄ）において、標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡが得られ、前記二本鎖ＤＮＡ生成物は、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つ、を含む。
【0017】
さらに好ましい実施形態では、工程ｄ）において、シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーが、３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する、工程ｃ）で得られた生成物の末端にライゲーションされ、リンカーのシングルヌクレオチドオーバー
ハングが、工程ｃ）で合成されたＤＮＡ鎖の３’シングルヌクレオチドオーバーハングにハイブリダイズされることで、標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡ生成物が生成され、前記二本鎖ＤＮＡ生成物が、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つ、を含む。
ハングが、工程ｃ）で合成されたＤＮＡ鎖の３’シングルヌクレオチドオーバーハングにハイブリダイズされることで、標識ＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡ生成物が生成され、前記二本鎖ＤＮＡ生成物が、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つ、を含む。
【0018】
本方法の別の好ましい実施形態では、工程ｃ）において合成ＤＮＡ鎖の３’末端に付加されるシングルヌクレオチドオーバーハングはデオキシアデノシンであり、工程ｄ）で付加されるリンカーのシングルヌクレオチドオーバーハングはデゾキシチミジンである。
【0019】
本方法のまたさらに好ましい実施形態では、前記ＰＣＲ産物は、以下の順番で、Ｘ４配列、Ｘ３配列、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、宿主ゲノムＤＮＡ配列、少なくとも前記レトロウイルスの３’－ＬＴＲ配列末端または５’－ＬＴＲ配列末端、Ｘ１配列、Ｘ２配列を含み；
工程ｆ）は以下の工程を含む：
ｆ１）鋳型としての工程ｅ）で得られた生成物、Ｘ３配列に結合するプライマー、５’－ＬＴＲに結合するプライマー、３’－ＬＴＲに結合するプライマーの存在下で、第一ＰＣＲ反応を実行する工程であって、前記５’－ＬＴＲに結合するプライマーおよび前記３’－ＬＴＲに結合するプライマーがそれぞれ、追加のＸ１配列をその５’末端に含むことにより、前記Ｘ１配列をも含むＰＣＲ産物が生成される、前記工程；
ｆ２）鋳型としての工程ｆ１）で得られた生成物、その５’末端に追加のＸ４配列を有するＸ３配列に結合するプライマー、その５’末端に追加のＸ２配列を有するＸ１配列に結合するプライマーの存在下で、第二ＰＣＲ反応を実行することにより、前記Ｘ２配列および前記Ｘ４配列をも含むＰＣＲ産物が生成される工程。
工程ｆ）は以下の工程を含む：
ｆ１）鋳型としての工程ｅ）で得られた生成物、Ｘ３配列に結合するプライマー、５’－ＬＴＲに結合するプライマー、３’－ＬＴＲに結合するプライマーの存在下で、第一ＰＣＲ反応を実行する工程であって、前記５’－ＬＴＲに結合するプライマーおよび前記３’－ＬＴＲに結合するプライマーがそれぞれ、追加のＸ１配列をその５’末端に含むことにより、前記Ｘ１配列をも含むＰＣＲ産物が生成される、前記工程；
ｆ２）鋳型としての工程ｆ１）で得られた生成物、その５’末端に追加のＸ４配列を有するＸ３配列に結合するプライマー、その５’末端に追加のＸ２配列を有するＸ１配列に結合するプライマーの存在下で、第二ＰＣＲ反応を実行することにより、前記Ｘ２配列および前記Ｘ４配列をも含むＰＣＲ産物が生成される工程。
【0020】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記Ｘ３配列はＮｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅ配列を含み、該Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅ配列にＮｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーが結合する。前記Ｘ３配列はライゲーション工程で導入されたリンカーに含まれる。イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにも存在するＮｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅトランスポゾン型配列として、最終産物であるライブラリーのシーケンス工程に市販キットを用いることができる。
【0021】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、前記Ｘ１配列はＮｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄプライマーが結合するＮｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄ配列を含み、前記Ｘ４配列はＰ７配列およびインデックス配列を含み、前記Ｘ２配列はＰ５配列－インデックス配列を含む。
【0022】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態では、前記結合性リガンドおよび前記受容体は、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン；ジゴキシゲニン（digoxygenin）／抗ジゴキシゲニン（digoxygenin）抗体；ハプテン／抗ハプテン抗体；抗原／抗体からなる結合性ペアの群から選択される。
【0023】
本発明に係る方法の特に好ましい実施形態では、前記レトロウイルスはＨＴＬＶ－１であり、前記ＨＴＬＶ－１関連疾患は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）であり、前記ゲノムＤＮＡは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来するおよび／または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から精製される。
【0024】
本発明はまた、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）を患う対象における優勢な白血病性Ｔリンパ球クローンを測定し縦断的にモニタリングするための方法であって、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって直鎖ＰＣＲ産物が作製され、前記ＰＣＲ産物が多重シーケンスにかけられることで全ての挿入部位および全ての切断部位が決定され、前記切断部位はそれぞれの挿入部位と相関しており、
その後、特定のＴリンパ球クローンを表す各挿入部位について異なる切断部位の数を計数し、同一の挿入部位および同一のランダムタグを有するリードを排除することによりあらゆるＰＣＲデュプリケート（PCR duplicate）を考慮から排除し、それから特定のＴリ
ンパ球クローンの各々の存在量を決定することが行われる、
前記方法を提供する。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって直鎖ＰＣＲ産物が作製され、前記ＰＣＲ産物が多重シーケンスにかけられることで全ての挿入部位および全ての切断部位が決定され、前記切断部位はそれぞれの挿入部位と相関しており、
その後、特定のＴリンパ球クローンを表す各挿入部位について異なる切断部位の数を計数し、同一の挿入部位および同一のランダムタグを有するリードを排除することによりあらゆるＰＣＲデュプリケート（PCR duplicate）を考慮から排除し、それから特定のＴリ
ンパ球クローンの各々の存在量を決定することが行われる、
前記方法を提供する。
【0025】
ランダムタグを用いて、ＰＣＲデュプリケート、すなわち、同一の切断部位および同一のランダムタグを有するリード、が検出される。このアプローチにより、クローン存在量のより正確な測定が可能となる。
【0026】
多重シーケンスは、ハイスループット装置での多数の試料の処理を可能にする。各試料には「バーコード」配列が個々に付加されるため、データ解析の際に識別と選別が可能である。プーリング試料は、シングルランで解析される試料の数を指数関数的に増加させるが、コストや時間は大きくは増加しない。
【0027】
上記の通り、多重シーケンスは、全ての挿入部位および全ての切断部位の決定を可能にする。これが意味することは、それぞれの直鎖ＰＣＲ産物の挿入部位および切断部位が決定されるということである。
【0028】
前記方法は、以下をさらに含むことが好ましい：
特定のＴリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性を判定すること；および／または
特定のＴリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療の成功を判定すること。
特定のＴリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性を判定すること；および／または
特定のＴリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療の成功を判定すること。
【0029】
本発明のさらに好ましい方法によれば、
特定のＴリンパ球クローンの存在量が多いことは、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性が高いこと、および／または、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療が成功していないこと、を示し；
特定のＴリンパ球クローンの存在量が少ないことは、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性が低いこと、および／または、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療が成功していること、を示す。
特定のＴリンパ球クローンの存在量が多いことは、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性が高いこと、および／または、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療が成功していないこと、を示し；
特定のＴリンパ球クローンの存在量が少ないことは、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の再発の可能性が低いこと、および／または、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の治療が成功していること、を示す。
【0030】
本発明のさらに好ましい方法によれば、前記特定のＴリンパ球クローンは、診断時に優勢な白血病性クローンと同定されたものと同じである。しかし、治療中または治療後に対象をモニタリングすると、優勢な特定のＴリンパ球クローンが、診断時に同定された優勢な特定のＴリンパ球クローンとは異なることが判明し得る。
【0031】
本発明者らは、ＨＴＬＶ－１挿入部位のマッピングと対応するクローンの存在量の測定とを同時に行うための、改善されたハイスループットシーケンス（ＨＴＳ）法を開発した。このことは、現在では、診断時に同定された優勢悪性クローンの発展（evolution）に
基づいて、治療を受けているＡＴＬ患者および治療を受けていないＡＴＬ患者の両方を、モニタリングできることを意味している。
基づいて、治療を受けているＡＴＬ患者および治療を受けていないＡＴＬ患者の両方を、モニタリングできることを意味している。
【0032】
本発明に係る本方法を用いることで、全員が血液学的な完全寛解を達成したが、様々な経過／期間の臨床応答の後に再発を起こした、５人のＡＴＬ患者の後向き縦断的試料における、ＨＴＬＶ－１クローナリティーを解析することができた。
【0033】
以下の図面によって本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【発明を実施するための形態】
【0035】
図１は、宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルス、および、ＤＮＡ切断後に得られ得る断片、の模式図を示している。ＨＴＬＶ－１ウイルスゲノムが、ウイルス性の５’－ＬＴＲ配列および３’－ＬＴＲ配列に挟まれている。５’－ＬＴＲおよび隣接ウイルス配列が欠失した組み込みプロウイルスも存在する（図示せず）。ゲノムＤＮＡの切断後、様々な断片が得られ得る。宿主ゲノム配列のみを含有するＤＮＡ断片、プロウイルス配列のみを含有するＤＮＡ断片、宿主ゲノム配列とウイルス配列の一部とを含有するＤＮＡ断片。
【0036】
図２は、プロウイルス配列の一部を含有するＤＮＡ断片の例によって、ＤＮＡ伸長工程を示している。伸長工程では、５’－ＬＴＲに特異的に結合するプライマーおよび３’－ＬＴＲに特異的に結合するプライマーの両方を利用する。伸長反応では、前記特異的プライマーから開始されて合成されるＤＮＡ鎖を標識するために、ビオチン化されたｄＮＴＰが使用される。あるいは、ビオチン標識を前記プライマーに組み込んでもよい。ＤＮＡ合成では、ＤＮＡポリメラーゼが用いられ、新たに合成された（ビオチン化）ＤＮＡ鎖の３’末端、すなわちＡ（アデノシンデゾキシリボヌクレオチド）、に１つの追加ヌクレオチドが付加される。この工程では、５’－ＬＴＲ配列を含有するＤＮＡ断片および３’－ＬＴＲ配列を含有するＤＮＡ断片のみが、前記反応の対象となってビオチン化される。このアプローチの利点は、ウイルス性ＬＴＲ含有断片の選別および濃縮、並びに感度の増加にある。ストレプトアビジンに基づいた選別を利用する後の精製工程では、これらのビオチン化されたコンストラクトを精製できる。伸長反応はまた、プライマーが結合したＬＴＲ配列の反対側の末端に粘着末端を与える。後の工程で、その１つの末端にのみリンカーを付加するために、この粘着末端が利用される（図３参照）。
【0037】
本アプローチのさらなる利点は、３’－ＬＴＲ－宿主接合配列および５’－ＬＴＲ－宿主接合配列の両方が検出され、それにより、検出可能な組み込み部位のダイナミックレンジおよび数が増加することである。このアプローチは、従って、５’－ＬＴＲの欠失を有するＨＴＬＶ－１バリアント（２型欠損ＨＴＬＶ－１プロウイルス）の同定を可能にする。これらのバリアントは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）症例の３分の１で観察される。これらのＡＴＬの予後は完全長プロウイルスを有するＡＴＬよりも悪いことが示唆されているため、これらのバリアントの検出も重要となる。
【0038】
図３はライゲーション工程を示しており、ＬＴＲ配列の反対側の末端にある粘着末端に
、リンカーが付加される。このために、３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する部分二本鎖ＤＮＡを与えるオリゴヌクレオチドが用いられ、ここで、前記リンカーのこのシングルヌクレオチドは、伸長工程時にポリメラーゼによって新規合成された標識（ビオチン化）ＤＮＡ鎖に付加されたシングルヌクレオチドに相補的である。伸長工程時にポリメラーゼによって新規合成された標識（ビオチン化）ＤＮＡ鎖に付加されたシングルヌクレオチドはＡであるため、リンカーの３’シングルヌクレオチドオーバーハングはＴ（チミジンデゾキシリボヌクレオチド）となる。この伸長工程と後のライゲーション工程により、所定の構造を有する目的のＤＮＡコンストラクトが得られる。宿主ゲノムＤＮＡを含む末端が特定の配列を伴って得られ、一方、反対側の末端は３’－ＬＴＲ末端または５’－ＬＴＲ末端を含む。このＤＮＡコンストラクトは、さらに、宿主ゲノムＤＮＡ配列とプロウイルス配列との間の元の接合部（挿入部位）も含んでいる。この特定の挿入部位が、特定のＴ細胞クローンの指標となる。このＤＮＡコンストラクトはまた、ゲノムＤＮＡの切断部位（切断工程時に生成された）と、それに付加されたリンカーも含む。この切断部位は、特定のクローンの存在量を推定するための評価の際に用いられ、上記のように、特定のクローンは特定またはユニークな挿入部位によって示される。
、リンカーが付加される。このために、３’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する部分二本鎖ＤＮＡを与えるオリゴヌクレオチドが用いられ、ここで、前記リンカーのこのシングルヌクレオチドは、伸長工程時にポリメラーゼによって新規合成された標識（ビオチン化）ＤＮＡ鎖に付加されたシングルヌクレオチドに相補的である。伸長工程時にポリメラーゼによって新規合成された標識（ビオチン化）ＤＮＡ鎖に付加されたシングルヌクレオチドはＡであるため、リンカーの３’シングルヌクレオチドオーバーハングはＴ（チミジンデゾキシリボヌクレオチド）となる。この伸長工程と後のライゲーション工程により、所定の構造を有する目的のＤＮＡコンストラクトが得られる。宿主ゲノムＤＮＡを含む末端が特定の配列を伴って得られ、一方、反対側の末端は３’－ＬＴＲ末端または５’－ＬＴＲ末端を含む。このＤＮＡコンストラクトは、さらに、宿主ゲノムＤＮＡ配列とプロウイルス配列との間の元の接合部（挿入部位）も含んでいる。この特定の挿入部位が、特定のＴ細胞クローンの指標となる。このＤＮＡコンストラクトはまた、ゲノムＤＮＡの切断部位（切断工程時に生成された）と、それに付加されたリンカーも含む。この切断部位は、特定のクローンの存在量を推定するための評価の際に用いられ、上記のように、特定のクローンは特定またはユニークな挿入部位によって示される。
【0039】
ライゲーション工程では、少なくとも６個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、および前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも１つが導入される。この例に記載される前記方法の実施形態では、前記ライゲーション工程は、第一末端に特異的な配列（本明細書では「Ｘ３」配列とも称する）として、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅトランスポゾン型配列を導入し、該Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅトランスポゾン型配列は、イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにも存在しており、そのため、最終産物であるライブラリーのシーケンス工程に市販キットを用いることを可能にする。さらに、クローンの存在量を測定するように改善された、リンカーを有する、ランダムタグが導入される。
【0040】
図４は、第一ＰＣＲ工程（ＰＣＲ１）を示している。本発明の１つの実施形態に係るこの第一ＰＣＲ工程では、イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにも存在するトランスポゾン型配列が導入されるため、最終産物ライブラリーのシーケンス工程に市販キットを用いることが可能である。ここで、第一ＰＣＲ反応は、伸長およびライゲーション後に得られた鋳型としての精製産物、リンカー配列に結合するプライマー、５’－ＬＴＲに結合するプライマー、および３’－ＬＴＲに結合するプライマーの存在下で行われる。これらの、５’－ＬＴＲに結合するプライマーおよび３’－ＬＴＲに結合するプライマーは、それぞれ、５’末端に、追加のイルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄ配列、および追加のランダムヌクレオチド配列、を含む。ＰＣＲ産物は故に、前記追加配列を含む。
【0041】
図５は、第二ＰＣＲ工程（ＰＣＲ２）を示している。本発明の１つの実施形態に係るこの第二ＰＣＲ工程では、後の多重シーケンスのために、市販のインデックスプライマー（イルミナ社製）が導入される。ここで、第二ＰＣＲ反応は、第一ＰＣＲ工程後に得られた鋳型としての精製ＰＣＲ産物、リンカー配列に結合するプライマー、およびイルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄ配列（ＬＴＲ配列より遠位）に結合するプライマー、の存在下で行われる。ここで、前記リンカー配列に結合するプライマーは、その５’末端に、Ｐ７配列およびインデックス配列をさらに含み、前記ＬＴＲ末端に結合するプライマーは、その５’末端に、Ｐ５配列およびインデックス配列をさらに含む。この第二ＰＣＲによって、リンカーおよび宿主ゲノム配列を含む末端にＰ７およびＩｎｄｅｘを含み、且つ、プロウイルスのＬＴＲを含む末端にＰ５およびＩｎｄｅｘを含む、ＰＣＲ産物が得られる。従って、この反応では、Ｐ５配列およびインデックスを有する配列、並びにＰ７配列およびインデックスを有する配列（すなわち、Ｐ５＋インデックスおよびＰ７＋インデックス）が付加される。Ｐ５およびＰ７はフローセルとの結合のために用いられ、一方、イ
ンデックスは多重シーケンスのために用いられる。
ンデックスは多重シーケンスのために用いられる。
【0042】
多重シーケンスは、ハイスループット装置での多数の試料の処理を可能にする。各試料には「バーコード」配列が個々に付加されるため、データ解析の際に識別と選別が可能である。プーリング試料は、シングルランで解析される試料の数を指数関数的に増加させるが、コストや時間は大きくは増加せず、すなわち、試料あたりのコストが減少する。
【0043】
図６は、プロウイルスゲノム配列と宿主ゲノム配列との間の接合部（星印）を指し示している。元の挿入部位を表すこの接合部はハイスループットペアエンドシーケンスによって同定される。イルミナ社製リード１は、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｏｒｗａｒｄから生じて、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲの一部、および宿主ゲノム内のプロウイルス挿入部位をシーケンスする。リード２配列はＮｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅで生じて、ランダムタグをシーケンスし、ＰＣＲデュプリケートの同定および切断部位の再利用を可能にする。ランダムタグのあとで、宿主ＤＮＡはＤＮＡ切断点を示す。リード１からの宿主配列とリード２からの宿主配列との組み合わせにより、プロウイルス組み込み部位の正確な同定が促されることで、クローンが同定され、その存在量が測定される。
【0044】
図７は、５人のＡＴＬ患者における、ＨＴＬＶ－１優勢悪性クローンおよび関連クローンの頻度分布の縦断的モニタリングを示している。パネルａ～ｅは、他の全感染細胞に対しての優勢クローンの存在量の発展（evolution）を示しており、縦断的なチャートによ
って示され、各種形状は異なる時点に対応している（丸（dot）：診断、四角：血液の再
発（relapse blood）、三角：リンパ腫の再発（relapse lymphoma）、菱形：完全寛解（complete remission）ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３）。灰色の領域は完全臨床寛解の期間
を示している（表１）。クローン性再構成が生じたＴ細胞受容体－γ（ＴＣＲ－γ）遺伝子の検出が行われた試料は、黒色の輪郭でマークされた形を有する（ＴＣＲ＋）。クローン頻度分布は円グラフで表されており、各スライスは独立した組み込み部位およびその対応するクローンの存在量を表している。単一の優勢クローン（１００プロウイルスコピーあたりの存在量、円グラフの下に表示）が黒色で示されている。ＡＴＬ６０は、単一悪性クローンにおいて、４種類の等頻度のプロウイルスのエビデンスを示している（単一ＴＣＲ－γ再構成、ＡＴＬ６０、表２）。残りの潜在的なクローンは灰色で示されている。ＰＶＬ：ＰＢＭＣ内のプロウイルス量（１００細胞あたりのｔａｘコピー）。悪性クローンの絶対存在量（ＰＢＭＣ内の優勢ＨＴＬＶ－１挿入部位の割合）は、ＰＶＬおよび白血病性クローンの相対的存在量から定量化できる。完全寛解時の悪性組み込み部位の絶対存在量、ＡＴＬ１４－ＣＲ１＜０．００７％（スキームｄ、０．０１６％のＰＶＬ、４３％の相対的存在量）。
って示され、各種形状は異なる時点に対応している（丸（dot）：診断、四角：血液の再
発（relapse blood）、三角：リンパ腫の再発（relapse lymphoma）、菱形：完全寛解（complete remission）ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３）。灰色の領域は完全臨床寛解の期間
を示している（表１）。クローン性再構成が生じたＴ細胞受容体－γ（ＴＣＲ－γ）遺伝子の検出が行われた試料は、黒色の輪郭でマークされた形を有する（ＴＣＲ＋）。クローン頻度分布は円グラフで表されており、各スライスは独立した組み込み部位およびその対応するクローンの存在量を表している。単一の優勢クローン（１００プロウイルスコピーあたりの存在量、円グラフの下に表示）が黒色で示されている。ＡＴＬ６０は、単一悪性クローンにおいて、４種類の等頻度のプロウイルスのエビデンスを示している（単一ＴＣＲ－γ再構成、ＡＴＬ６０、表２）。残りの潜在的なクローンは灰色で示されている。ＰＶＬ：ＰＢＭＣ内のプロウイルス量（１００細胞あたりのｔａｘコピー）。悪性クローンの絶対存在量（ＰＢＭＣ内の優勢ＨＴＬＶ－１挿入部位の割合）は、ＰＶＬおよび白血病性クローンの相対的存在量から定量化できる。完全寛解時の悪性組み込み部位の絶対存在量、ＡＴＬ１４－ＣＲ１＜０．００７％（スキームｄ、０．０１６％のＰＶＬ、４３％の相対的存在量）。
【0045】
図８は、ＨＴＬＶ－１ ２型欠損プロウイルスを明らかにする際の、長期のＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンスによる、５’／３’デュアルＨＴＳクローナリティー法の検証を示している。ＡＴＬ１１－再発－ＬＮ（上）またはＡＴＬ１４ 診断（下）における、優勢ＨＴＬＶ－１組み込み部位の上流（ＦＰ）および下流（ＲＰ）に位置するプライマーペアを用いて得られたＰＣＲ産物のＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンスによって生じた、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）で可視化され、ヒトゲノムの第１番染色体：２０，５１６，８０５（ＡＴＬ１１－再発－ＬＮ）または第１８番染色体：４５，０１１，５７２（ＡＴＬ１４ Ｄ）にプロウイルスが組み込まれたカスタムゲノムにマップされた、カバレッジおよび個々のリード。組み込み部位はＨＴＳクローナリティーマッピングによって同定された。ヒトとプロウイルスゲノムの両方に跨るリードは、平均の長さが、ＡＴＬ１１－Ｒ－ＬＮで２，１４３ｂｐ（４１ｂｐ～９，１５５ｂｐの範囲）、ＡＴＬ１４で３，２５５ｂｐ（７３ｂｐ～９，５６２ｂｐの範囲）であった。ＡＴＬ１１－再発－ＬＮカバレッジにより、プロウイルスゲノム内の６，５２９ｂｐ（５’ＬＴＲを含む）の巨大な５’欠失が明らかとなり、これは、３’ＬＴ
Ｒ－宿主接合部が検出された一方での、ＨＴＳクローナリティー法で確認された５’ＬＴＲ－宿主リードの非存在と一致している。長いリードは、ＡＴＬにおける２型欠損ＨＴＬＶ－１プロウイルスの同定について、５’／３’デュアルＨＴＳ法を検証している。ＨＴＬＶ－１プロウイルスゲノムおよび転写物が上段に示される。ＰＦ：フォワードプライマー、ＰＲ：リバースプライマー、ｃｏｖ：カバレッジ。
Ｒ－宿主接合部が検出された一方での、ＨＴＳクローナリティー法で確認された５’ＬＴＲ－宿主リードの非存在と一致している。長いリードは、ＡＴＬにおける２型欠損ＨＴＬＶ－１プロウイルスの同定について、５’／３’デュアルＨＴＳ法を検証している。ＨＴＬＶ－１プロウイルスゲノムおよび転写物が上段に示される。ＰＦ：フォワードプライマー、ＰＲ：リバースプライマー、ｃｏｖ：カバレッジ。
【0046】
リガンド受容体ペア
本明細書で使用される場合、「リガンド－受容体ペア」または「結合ペア」という表現は、互いを認識し互いに結合することが可能な化学部分である、リガンドおよび受容体を指す。リガンドおよび受容体は、互いを認識し互いに結合して複合体を形成できるものであれば、いかなる部分であってもよい。さらに、リガンドおよび受容体は、第三の媒介物質の結合を介して相互作用してもよい。通常、リガンド－受容体ペアを構成するリガンドおよび受容体は、特異的な非共有結合性相互作用により互いに結合する結合分子である。リガンドおよび受容体は、天然のものでも人工のものでもよく、他の化学種と集合体を形成してもよい。
本明細書で使用される場合、「リガンド－受容体ペア」または「結合ペア」という表現は、互いを認識し互いに結合することが可能な化学部分である、リガンドおよび受容体を指す。リガンドおよび受容体は、互いを認識し互いに結合して複合体を形成できるものであれば、いかなる部分であってもよい。さらに、リガンドおよび受容体は、第三の媒介物質の結合を介して相互作用してもよい。通常、リガンド－受容体ペアを構成するリガンドおよび受容体は、特異的な非共有結合性相互作用により互いに結合する結合分子である。リガンドおよび受容体は、天然のものでも人工のものでもよく、他の化学種と集合体を形成してもよい。
【0047】
リガンドおよび／または受容体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：細胞膜受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ステロイドなどのホルモン、ホルモン受容体、ペプチド、酵素および他の触媒性ポリペプチド、酵素基質、補助因子、有機小分子薬を含む薬剤、オピエート、オピエート受容体、レクチン、糖、ポリサッカライドを含むサッカライド、タンパク質、並びに、モノクローナル抗体および合成抗体断片を含む抗体、細胞、細胞膜および細胞膜受容体を含むその部分、並びに細胞小器官。リガンド－受容体ペアの例としては、以下が挙げられる：抗体－抗原；レクチン－炭水化物；ペプチド－細胞膜受容体；プロテインＡ－抗体；ハプテン－抗ハプテン抗体；ジゴキシゲニン－抗ジゴキシゲニン抗体；酵素－補助因子、および酵素－基質。
【0048】
１つの好ましい実施形態において、リガンド－受容体ペアは、ビオチン－アビジンまたはビオチン－ストレプトアビジンである。ビタミンであるビオチンは、卵白から単離されるアビジン、または、ストレプトマイセス・アビジニ細菌から単離されるストレプトアビジンという、指示タンパク質の結合によって検出される。アビジンおよびストレプトアビジンは、ビオチンに対して、４つの高親和性結合部位を有し、結合定数はおよそＫ＝１０１５ｍｏｌ－１である。
【0049】
ＨＴＬＶ－１組み込み部位のＨＴＳマッピングおよびクローン存在量の測定
本発明が提供する改善されたＨＴＳに基づく方法を利用することで、患者の縦断的ＰＢＭＣ試料から単離されたゲノムＤＮＡにおける、ＨＴＬＶ－１組み込み部位の、マッピングおよび存在量の定量化が同時に行われた。これまでに開発されたＴａｇ－ＮＧＳプロトコルに記載されるランダムタグに加えて、本発明の最適化された方法は、ライブラリー調製およびデータ解析にいくつかの重要な改変を含み、これまでに確立されたプロトコルの制限のいくつかが克服されている。簡潔には、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの両方をアッセイすることにより、前記技術のダイナミックレンジが増加したことで、クローン存在量のより良好な測定が可能となり、プロウイルスにおける５’－欠失の発生に関する重要な情報が得られるようになった。Ｂｉｏｔｉｎ－１１－ｄＵＴＰを用いた伸長工程により、末端修復と、ストレプトアビジンを用いたＬＴＲ陽性断片の濃縮促進とが同時に行われ、その後、限定的なＰＣＲが行われて、ＰＣＲデュプリケートが回避される。従って、個別の末端修復工程を省略できる。アダプターおよびインデックスを追加するための特注のシーケンスプライマーの代わりに、市販のイルミナ社製プライマーを用いたことで、ライブラリーの多重化が単純化され、プロトコルを臨床環境に適用可能となる程度までコストおよび実行時間の両方が低減された。イルミナ社製ＭｉＳｅｑ装置により、ライブラリーが
アセンブルされ、１５０ｂｐのペアエンドシーケンスリードが得られた（平均生リード数：３７３，４００、範囲：２８，９３０～９７７，０００）。５’ＬＴＲ－宿主接合部または３’ＬＴＲ－宿主接合部のいずれかを支持するリードが保持された。
本発明が提供する改善されたＨＴＳに基づく方法を利用することで、患者の縦断的ＰＢＭＣ試料から単離されたゲノムＤＮＡにおける、ＨＴＬＶ－１組み込み部位の、マッピングおよび存在量の定量化が同時に行われた。これまでに開発されたＴａｇ－ＮＧＳプロトコルに記載されるランダムタグに加えて、本発明の最適化された方法は、ライブラリー調製およびデータ解析にいくつかの重要な改変を含み、これまでに確立されたプロトコルの制限のいくつかが克服されている。簡潔には、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの両方をアッセイすることにより、前記技術のダイナミックレンジが増加したことで、クローン存在量のより良好な測定が可能となり、プロウイルスにおける５’－欠失の発生に関する重要な情報が得られるようになった。Ｂｉｏｔｉｎ－１１－ｄＵＴＰを用いた伸長工程により、末端修復と、ストレプトアビジンを用いたＬＴＲ陽性断片の濃縮促進とが同時に行われ、その後、限定的なＰＣＲが行われて、ＰＣＲデュプリケートが回避される。従って、個別の末端修復工程を省略できる。アダプターおよびインデックスを追加するための特注のシーケンスプライマーの代わりに、市販のイルミナ社製プライマーを用いたことで、ライブラリーの多重化が単純化され、プロトコルを臨床環境に適用可能となる程度までコストおよび実行時間の両方が低減された。イルミナ社製ＭｉＳｅｑ装置により、ライブラリーが
アセンブルされ、１５０ｂｐのペアエンドシーケンスリードが得られた（平均生リード数：３７３，４００、範囲：２８，９３０～９７７，０００）。５’ＬＴＲ－宿主接合部または３’ＬＴＲ－宿主接合部のいずれかを支持するリードが保持された。
【0050】
ユニークなＨＴＬＶ－１組み込み部位の数および対応するクローンの存在量は以下のように測定した：ペアエンドリードを、ＢＷＡを用いて、宿主－プロウイルスハイブリッドゲノムにアライメントした。クオリティートリミング（平均塩基クオリティー≧３０）の後、以下の条件を満たすペアエンドリード（ＬＴＲ－宿主接合部に跨る）のみを保持した：リード１：関連ＬＴＲ末端にマッピングされたリードのＨＴＬＶ－１ ５’ＬＴＲ：２９ｎｔ、ＨＴＬＶ－１ ３’ＬＴＲ：４５ｎｔ。リード２：ミスマッチが３以下である宿主ゲノムにマッピングされたリード。同一のゲノム挿入部位および同一の８ランダムヌクレオチド（ｎｔ）タグを示したリードに基づいて、重複を除去した。各プロウイルス組み込み部位についてリード数をカウントし、記録した。腫瘍（ＡＴＬ）試料中のクローン存在量を以下の通りに決定した：５’ＬＴＲ隣接部位および３’ＬＴＲ隣接部位の両方が同定された場合、％＝平均３’ＬＴＲ－５’ＬＴＲ、一方のＬＴＲ隣接部位のみが検出された場合、％＝検出されたＬＴＲ隣接部位により定められる％。３’ＬＴＲ隣接部位のみが優勢な挿入部位として同定された場合に、そのクローンを５‘ＬＴＲ欠失２型欠損プロウイルスと定義した。
【0051】
本発明の方法を適用することにより、ＨＴＳ－クローナリティーは、コンセンサス応答基準が完全血液学的寛解を示した時点において、第一選択治療に対する不応例を明らかにした。分子的寛解を達成した患者において、従来法による検出を逃れる白血病性クローンの早期再発の状態を検出することができ、より良好な再発予測が可能となる。予後的重要性を有するＨＴＳで同定されたＨＴＬＶ－１バリアントは、進行後にクローンスイッチを示し、他の現在利用可能な分子的方法よりも優れていた。
【0052】
本発明の研究により、ＡＴＬ患者におけるＨＴＬＶ－１クローン構造に関する分子的知識が、完全寛解のより良好な定義を可能にし、従って治療介入を導き得ることが示された。第一に、ＨＴＳクローナリティー解析により、他の点では完全血液学的寛解のコンセンサス基準を満たしている、患者における第一選択治療に対して不応性のＡＴＬを明らかにできることが示された。優勢な悪性クローンの残留性と一致して、これらの患者は極めて短い期間内に再発をおこした。結果として、この最適化されたＨＴＳ法の開発によって、臨床医は、標準的治療の恩恵を受けない（難治性疾患）、別のまたは新規の最前線戦略に登録されるべき患者を迅速に同定するためのツールを与えられる。第二に、ある時点で分子的寛解を達成したＡＴＬ患者において、縦断的分子モニタリングは、従来法による検出を逃れる白血病性クローンの早期再発を検出することができ、より良好な再発予測が可能となることが示された。最後に、ＨＴＳマッピングは治療を継続するかの決定に影響し得る。ＡＺＴ／ＩＦＮ－α治療後に完全血液学的寛解を達成し、さらに、持続的な分子的応答を示す（ＨＴＬＶ－１ポリクローナル構造を特徴とする）患者において、毒性低減という潜在的利益のために、維持療法の期間が再評価され得る。さらに、ＨＴＳクローナリティーは、同種幹細胞移植に適した患者の成功率の予測に有用であり、また、同種幹細胞移植後の免疫抑制剤の調整に有用であり得る。
【0053】
ＡＴＬの高い再発率は、優勢な白血病性クローンの残留性または再発に寄与してきた。しかし、一部の患者は異なるクローンで再発を起こす。ＡＴＬ１１リンパ腫再発のＨＴＳマッピングにより、そのようなクローンスイッチの直接的な分子的エビデンスが得られた。治療の再施行が新規の別の悪性クローンの存在量を減少させるのに現在有効であり得ることを考慮すると、再発時のクローン遷移の同定は重要な治療的意味を持ち得る。５’／３’デュアルＨＴＳ法によって５’ＬＴＲ欠失プロウイルスを保有する悪性クローンの忠実な同定が可能であることが、同一の患者において実証され、長期ナノポアシーケンスに
より確認された。５’ＬＴＲ欠失２型欠損プロウイルスのＡＴＬ細胞への組み込みは、およそ１／３の症例で観察され、予後と関連している。
より確認された。５’ＬＴＲ欠失２型欠損プロウイルスのＡＴＬ細胞への組み込みは、およそ１／３の症例で観察され、予後と関連している。
【0054】
最後に、ＡＴＬ１４（ＣＲ１～ＣＲ３、花細胞が存在せず、ＡＬＣは０．２～１．２Ｇ／Ｌの範囲）において、ＡＬＣおよび血液スメアは完全寛解の期間を通じて平凡なままであったが、この患者の縦断的ＨＴＳ追跡によって、これらの時点での悪性クローンの分子的再発（ＣＲ１およびＣＲ３それぞれにおいて４３．２４％～７０．８４％の存在量）が明らかとなった。興味深いことに、この患者は、再発時の血液パラメーターは正常範囲内（ＡＬＣ：１．９Ｇ／Ｌ）（表２）のまま、強いリンパ節転移（ＬＮ＋＋）を伴う再発を起こした。このことは、完全血液学的寛解時の患者の血液のＨＴＳ解析が、遠位部位での再発を予測できることを示している。
【0055】
この５人の患者の研究は、ＡＴＬ管理のための応答評価基準にＨＴＬＶ－１クローンの分子サインを組み入れることの実証実験となる。本発明のＨＴＳに基づく方法は、これまでに報告された方法の制限のいくつかを克服し、臨床試験環境に適用可能となる程度までコストおよび実行時間の両方を減少させる、いくつかの基準変更を含む。
【0056】
これらの研究で為された観察により、臨床的且つ血液学的な完全寛解を達成する患者間の分子不均一性が大きいことが明らかとなり、ＡＴＬの応答基準を再考する必要性が明確となった。これまで試験されたあらゆる他の方法に対する優位性を考慮すると、本ＨＴＳアプローチは、コンセンサス基準に組み込まれるべきであり、より良好な、治療に対する応答の評価、再発の予測、および治療中の治療介入の導入のためのツールとして評価されるべきである。本発明者らは、微小残存病変の検出、同種幹細胞移植後の移植片対ＡＴＬ効果の評価、および成績向上に未だ不可欠である臨床試験の評価のための方法として、本ＨＴＳアプローチを提唱する。
【0057】
以下の実施例で本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定はされない。
【実施例】
【0058】
患者
本発明者らは、白血病性の病型と診断された、５例のＡＴＬの後向き試料の縦断的解析を行った。これらのＡＴＬは全て、導入療法後に臨床的寛解を達成したが、様々な期間の血液学的応答の後に再発したものである。系統的試料を改良型ＨＴＳ法で検査してプロウイルス組み込み部位をマッピングし、診断時に同定された優勢な白血病性クローンの分子的な追跡を可能とした。
本発明者らは、白血病性の病型と診断された、５例のＡＴＬの後向き試料の縦断的解析を行った。これらのＡＴＬは全て、導入療法後に臨床的寛解を達成したが、様々な期間の血液学的応答の後に再発したものである。系統的試料を改良型ＨＴＳ法で検査してプロウイルス組み込み部位をマッピングし、診断時に同定された優勢な白血病性クローンの分子的な追跡を可能とした。
【0059】
詳細には、本発明に係る研究は、高悪性度の白血病性型と診断され、２００８年と２０１６年の間にネッカー病院（パリ）で治療され、臨床的寛解中および再発時の系統的試料が記録されていた、５人のＡＴＬ患者の後向き縦断的試料に対して行われた（表１）。本研究は倫理委員会ＣＰＰイル・ド・フランスＩＩに承認されたものであり、死亡でない場合、全ての患者から書面によるインフォームドコンセントが得られた。ＡＴＬの診断は、臨床的パラメーター、血液スメア中の異型リンパ球の存在および血清中のＨＴＬＶ－１特異的抗体存在、に基づいて行われた。患者は下山分類に従って分類された。導入療法は、ＣＨＯＰに基づく投与計画またはＡＺＴ＋ＩＦＮ－α併用療法からなるものであった。２症例で、強化療法としてＡｓ２Ｏ３を用いた。患者の特徴を表１にまとめる。完全血液学的寛解は、２００９年に発表された推奨に従った、形態学的および細胞学的な基準（Tsukasaki K et al.: Definition, prognostic factors, treatment, and response criteria
of adult T-cell leukemia-lymphoma: a proposal from an international consensus meeting. J Clin Oncol 27:453-9, 2009）によって、すなわち、ＣＢＣの正常化、血液中
に存在する異常リンパ球が５％未満であること、および、４週間を超えて測定可能な腫瘍が存在しないこと、によって、定義された。腫瘍血液学の公認診断研究所において欧州標準プロトコルにより測定された、患者のＣＢＣ、リンパ球絶対数（ＡＬＣ）、血液スメア、臨床データ、および生物学的パラメーターが、ネカー病院の電子医療記録から後向きに得られた（表２）。
of adult T-cell leukemia-lymphoma: a proposal from an international consensus meeting. J Clin Oncol 27:453-9, 2009）によって、すなわち、ＣＢＣの正常化、血液中
に存在する異常リンパ球が５％未満であること、および、４週間を超えて測定可能な腫瘍が存在しないこと、によって、定義された。腫瘍血液学の公認診断研究所において欧州標準プロトコルにより測定された、患者のＣＢＣ、リンパ球絶対数（ＡＬＣ）、血液スメア、臨床データ、および生物学的パラメーターが、ネカー病院の電子医療記録から後向きに得られた（表２）。
【0060】
【表1】
Ｆ：女性、Ｍ：男性、病型は下山分類に従い定義されたもの、ＣＨＯＰ：シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、ＬＳＧ１５：ＶＣＡＰ－ＡＭＰ－ＶＥＰＣ、ＩＦＮα：インターフェロンα、ＡＳ２Ｏ３：三酸化ヒ素、ＣＲ：完全寛解（単位は月）、＊ＡＴＬ１１診断は、この患者から最初期に入手可能な試料に相当（化学療法後に非応答者臨床状態、ＡＺＴ－ＩＦＮα－ＡＳ２Ｏ３治療前）。
【0061】
【表2】
【0062】
実施例１：血液試料およびＤＮＡ調製
ＨＴＬＶ－１患者由来の試料は、ヘルシンキ宣言に従いインフォームドコンセントが得られた後、治験審査委員会に承認されたプロトコルの後に、フランス、パリ大学のネカー病院で、「イル・ド・フランスＩＩ倫理委員会（Comite d’ethique Ile de France II）
」に従って、採取された。試料は、治療を行ったが再発した、５人のＡＴＬ患者（４例の急性型および１例の予後不良慢性型）由来のＰＢＭＣから構成される試料であった。ＰＢＭＣはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（シグマ社）を用いて血液から分離された。本研究で用いられたＤＮＡは、キアゲン社製ＡｌｌＰｒｅｐ－ＤＮＡキットを用いて単離された。
ＨＴＬＶ－１患者由来の試料は、ヘルシンキ宣言に従いインフォームドコンセントが得られた後、治験審査委員会に承認されたプロトコルの後に、フランス、パリ大学のネカー病院で、「イル・ド・フランスＩＩ倫理委員会（Comite d’ethique Ile de France II）
」に従って、採取された。試料は、治療を行ったが再発した、５人のＡＴＬ患者（４例の急性型および１例の予後不良慢性型）由来のＰＢＭＣから構成される試料であった。ＰＢＭＣはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（シグマ社）を用いて血液から分離された。本研究で用いられたＤＮＡは、キアゲン社製ＡｌｌＰｒｅｐ－ＤＮＡキットを用いて単離された。
【0063】
実施例２：ＤＮＡ切断
合計５μｇのＤＮＡを、超音波処理により、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）装置（ダイアジェノード社（Diagenode）、ベルギー）を用いて切断した。切断の設定は、０５秒
間のＯＮ-９０秒間のＯＦＦを合計８サイクル、であった。最適な切断のために、４サイ
クルの後にチューブをスピンダウンした。また、この手順を、ＤＮＡ量を５μｇ未満（２００ｎｇまで）にして行った。
合計５μｇのＤＮＡを、超音波処理により、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）装置（ダイアジェノード社（Diagenode）、ベルギー）を用いて切断した。切断の設定は、０５秒
間のＯＮ-９０秒間のＯＦＦを合計８サイクル、であった。最適な切断のために、４サイ
クルの後にチューブをスピンダウンした。また、この手順を、ＤＮＡ量を５μｇ未満（２００ｎｇまで）にして行った。
【0064】
実施例３：ＤＮＡ伸長
実施例２で得られたＤＮＡに、以下のＤＮＡ伸長工程を行った：ＨＴＬＶ－１ ５’－ＬＴＲプライマーおよびＨＴＬＶ－１ ３’－ＬＴＲプライマー（５’－ＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＴＣＡＧＡＣ－３’：配列番号１；５’－ＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＡＴＴ－３’：配列番号２）を用いる、ビオチン化ｄＵＴＰ（０．２５ｍＭ）（サーモサイエンティフィック社）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、各１ｍＭ、ｄＴＴＰ、０．７５ｍＭ）および２．５ユニットのＨｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（プロメガ社）の存在下での、ＤＮＡ伸長工程。以下の伸長プログラムを実行した：ステップ１：９５℃、２．５分間、ステップ２：９５℃、０．５分間、ステップ３：５８℃、０．５分間、ステップ４：７２℃、１．０分間、ステップ５：７２℃、５分間、ステップ６：１２℃、反応終了。ステップ３～４を３０サイクル繰り返した。Ｔａｑポリメラーゼによって、プロウイルスのＬＴＲ領域（プライマーが結合する）から開始されて、宿主ゲノム配列の方向に、ビオチン化ＤＮＡ鎖が合成され、この新たな鎖の３’末端に追加の１個のアデノシンヌクレオチドが付加される。
実施例２で得られたＤＮＡに、以下のＤＮＡ伸長工程を行った：ＨＴＬＶ－１ ５’－ＬＴＲプライマーおよびＨＴＬＶ－１ ３’－ＬＴＲプライマー（５’－ＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＴＣＡＧＡＣ－３’：配列番号１；５’－ＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＡＴＴ－３’：配列番号２）を用いる、ビオチン化ｄＵＴＰ（０．２５ｍＭ）（サーモサイエンティフィック社）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、各１ｍＭ、ｄＴＴＰ、０．７５ｍＭ）および２．５ユニットのＨｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（プロメガ社）の存在下での、ＤＮＡ伸長工程。以下の伸長プログラムを実行した：ステップ１：９５℃、２．５分間、ステップ２：９５℃、０．５分間、ステップ３：５８℃、０．５分間、ステップ４：７２℃、１．０分間、ステップ５：７２℃、５分間、ステップ６：１２℃、反応終了。ステップ３～４を３０サイクル繰り返した。Ｔａｑポリメラーゼによって、プロウイルスのＬＴＲ領域（プライマーが結合する）から開始されて、宿主ゲノム配列の方向に、ビオチン化ＤＮＡ鎖が合成され、この新たな鎖の３’末端に追加の１個のアデノシンヌクレオチドが付加される。
【0065】
実施例４：精製
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ベックマン・コールター社）を用いて、実施例３で得られたＤＮＡを精製した。再懸濁されたＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズに、１：１の割合で、前記伸長産物を加えた。
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ベックマン・コールター社）を用いて、実施例３で得られたＤＮＡを精製した。再懸濁されたＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズに、１：１の割合で、前記伸長産物を加えた。
【0066】
実施例５：リンカーのライゲーション
実施例４で得られたＤＮＡをライゲーション工程にかけ、ライゲーション工程では、配列番号３（５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４（５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’）のオリゴヌクレオチドから構成されるリンカーを、前記ＤＮＡに加えてライゲーションし、それにより、イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーにも存在する配列と８ｎｔのランダムタグとを導入した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いて反応を実行した。反応は、室温で３時間実行することもできるし、１６℃で一晩実行することもできる。
実施例４で得られたＤＮＡをライゲーション工程にかけ、ライゲーション工程では、配列番号３（５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’）のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４（５’－／５Ｐｈｏｓ／ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’）のオリゴヌクレオチドから構成されるリンカーを、前記ＤＮＡに加えてライゲーションし、それにより、イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーにも存在する配列と８ｎｔのランダムタグとを導入した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いて反応を実行した。反応は、室温で３時間実行することもできるし、１６℃で一晩実行することもできる。
【0067】
実施例６：ストレプトアビジンに基づく選択
ライゲーション工程の最終産物は、ＤＮＡ伸長工程の際に組み込まれたビオチンを含有する。ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０、インビトロジェン／ライフテクノロジーズ社）を用いることにより、実施例５で得られた生成物を選択および精製した。
ライゲーション工程の最終産物は、ＤＮＡ伸長工程の際に組み込まれたビオチンを含有する。ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０、インビトロジェン／ライフテクノロジーズ社）を用いることにより、実施例５で得られた生成物を選択および精製した。
【0068】
実施例７：ＰＣＲ１反応
実施例６で得られた生成物に、以下のＰＣＲ工程を行った：ＨＴＬＶ－１特異的プライマー（ＨＴＬＶ－５’末端－ＰＣＲプライマー：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＧＧ－３’：配列番号５；およびＨＴＬＶ－３’末端－ＰＣＲプライマー：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＡＴＡＧＣＡＣＴＣ－３’：配列番号６）、およびリンカー特異的プライマー（５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴ－３’、配列番号７）を用いる、ｄＮＴＰおよびＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）の存在下での、以下のＰＣＲ１プログラム（１５サイクル）を用いる、ＰＣＲ工程：ステップ１：９８℃、３０秒間、ステップ２：９８℃、８秒間、ステップ３：６６℃、２０秒間、ステップ４：７２℃、３０秒間、ステップ５：７２℃、６０秒間、ステップ６：１２℃、反応終了。ステップ２～４を１５サイクル繰り返す。この工程により、イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにも存在する配列が導入される。
実施例６で得られた生成物に、以下のＰＣＲ工程を行った：ＨＴＬＶ－１特異的プライマー（ＨＴＬＶ－５’末端－ＰＣＲプライマー：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＧＧ－３’：配列番号５；およびＨＴＬＶ－３’末端－ＰＣＲプライマー：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＡＴＡＧＣＡＣＴＣ－３’：配列番号６）、およびリンカー特異的プライマー（５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴ－３’、配列番号７）を用いる、ｄＮＴＰおよびＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）の存在下での、以下のＰＣＲ１プログラム（１５サイクル）を用いる、ＰＣＲ工程：ステップ１：９８℃、３０秒間、ステップ２：９８℃、８秒間、ステップ３：６６℃、２０秒間、ステップ４：７２℃、３０秒間、ステップ５：７２℃、６０秒間、ステップ６：１２℃、反応終了。ステップ２～４を１５サイクル繰り返す。この工程により、イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａ
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにも存在する配列が導入される。
【0069】
実施例８：精製
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ベックマン・コールター社）を用いて、実施例7で得られたＤＮＡを精製した。再懸濁されたＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕ
ｒｅ ＸＰビーズに、１：１の割合で、前記ＰＲＣ１産物を加えた。
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ベックマン・コールター社）を用いて、実施例7で得られたＤＮＡを精製した。再懸濁されたＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕ
ｒｅ ＸＰビーズに、１：１の割合で、前記ＰＲＣ１産物を加えた。
【0070】
実施例９：ＰＣＲ２反応
実施例８で得られた生成物に、以下の第二ＰＣＲ工程を行った：Ｎｅｘｔｅｒａプライマー配列とマッチするプライマー（イルミナ社製）を用いる、ｄＮＴＰおよびＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）の存在下での、以下のＰＣＲ１プログラム（１２サイクル）を用いる、ＰＣＲ工程：ステップ１：９８℃、３０秒間、ステップ２：９８℃、８秒間、ステップ３：６２℃、２０秒間、ステップ４：７２℃、３０秒間、ステップ５：７２℃、６０秒間、ステップ６：１２℃、反応終了。ステップ２～４を１２サイクル繰り返す。この工程により、Ｐ５配列およびインデックス配列、並びにＰ７配列およびインデックス配列が導入される。
実施例８で得られた生成物に、以下の第二ＰＣＲ工程を行った：Ｎｅｘｔｅｒａプライマー配列とマッチするプライマー（イルミナ社製）を用いる、ｄＮＴＰおよびＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）の存在下での、以下のＰＣＲ１プログラム（１２サイクル）を用いる、ＰＣＲ工程：ステップ１：９８℃、３０秒間、ステップ２：９８℃、８秒間、ステップ３：６２℃、２０秒間、ステップ４：７２℃、３０秒間、ステップ５：７２℃、６０秒間、ステップ６：１２℃、反応終了。ステップ２～４を１２サイクル繰り返す。この工程により、Ｐ５配列およびインデックス配列、並びにＰ７配列およびインデックス配列が導入される。
【0071】
実施例１０：精製
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ベックマン・コールター社）を用いて、実施例８で得られたＤＮＡを精製した。再懸濁されたＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズに、１：０．８の割合で、前記ＰＲＣ２産物を加えた。
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（ベックマン・コールター社）を用いて、実施例８で得られたＤＮＡを精製した。再懸濁されたＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズに、１：０．８の割合で、前記ＰＲＣ２産物を加えた。
【0072】
実施例１１：ライブラリー構築
種々のＰＣＲ２産物（それぞれユニークなインデックスセットを有する）をプールすることによりライブラリーを構築した。
種々のＰＣＲ２産物（それぞれユニークなインデックスセットを有する）をプールすることによりライブラリーを構築した。
【0073】
実施例１２：ＨＴＬＶ－１プロウイルス量の定量化
キアゲン社製ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡキットを用いてＤＮＡを単離し、ＨＴＬＶ－１ ３’領域を標的とするプライマーおよび正規化用のそれぞれアクチンのＲＰＳ９を標的とするプライマー（インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ社製のプライマー）を用いるリアルタイムＰＣＲによってプロウイルスＤＮＡを定量化した。１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧ）中、１μｇのトータルＤＮＡ、プライマーおよびプローブ（それぞれ２００ｎＭの濃度）を含有する５０μＬ体積（ＨＴＬＶ－１）の中で、または、５０ｎｇのＤＮＡおよび１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， Ｎｏ Ａｍ
ｐＥｒａｓｅ ＵＮＧａ（サーモサイエンティフィック社）を含有する１０μＬの中で、ランを実行した（ＢＬＶ）。温度サイクル条件は、９５℃、１０分間、その後、９５℃、１５秒間および６０℃、１分間を５０サイクル、であった。Ｔａｒｌ２細胞株（ＨＴＬＶ－１、単一プロウイルスコピー）由来ＤＮＡの連続希釈により検量線を作成した。プロウイルス量（単位は％ＰＢＭＣ）＝（試料平均量）×２／（試料ＲＰＳ９量またはアクチン量）＊１００。
キアゲン社製ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡキットを用いてＤＮＡを単離し、ＨＴＬＶ－１ ３’領域を標的とするプライマーおよび正規化用のそれぞれアクチンのＲＰＳ９を標的とするプライマー（インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ社製のプライマー）を用いるリアルタイムＰＣＲによってプロウイルスＤＮＡを定量化した。１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧ）中、１μｇのトータルＤＮＡ、プライマーおよびプローブ（それぞれ２００ｎＭの濃度）を含有する５０μＬ体積（ＨＴＬＶ－１）の中で、または、５０ｎｇのＤＮＡおよび１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， Ｎｏ Ａｍ
ｐＥｒａｓｅ ＵＮＧａ（サーモサイエンティフィック社）を含有する１０μＬの中で、ランを実行した（ＢＬＶ）。温度サイクル条件は、９５℃、１０分間、その後、９５℃、１５秒間および６０℃、１分間を５０サイクル、であった。Ｔａｒｌ２細胞株（ＨＴＬＶ－１、単一プロウイルスコピー）由来ＤＮＡの連続希釈により検量線を作成した。プロウイルス量（単位は％ＰＢＭＣ）＝（試料平均量）×２／（試料ＲＰＳ９量またはアクチン量）＊１００。
【0074】
実施例１３：臨床試料の長期Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンス
ＨＴＬＶ－１プロウイルス、並びにその５’側および３’側に隣接するゲノム配列を、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いて、ＰＣＲ増幅した。ＡＴＬ１４（推定完全長プロウイルス、５’ＬＴＲ－宿主接合部および３’ＬＴＲ－宿主接合部、ＨＴＳクローナリティーによって検出）：フォワードプライマー（５’－ＴＧＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡ－３’：配列番号８）、およびリバースプライマー（５’－ＴＧＣＡＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴＣＡＧＡ－３’：配列番号９）は、７５０ｂｐ（野生型染色体）、およびプロウイルスを含む約９０００ｂｐのバンドを生成した。ＡＴＬ１１－Ｒ－ＬＮ（リンパ節、再発）：フォワードプライマー（５’－ＣＣＴＴＡＡＴＣＡＣＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣ－３’：配列番号１０）およびリバースプライマー（５’－ＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＴＴＡＴＣＡＴ－３’：配列番号１１）は、４６０ｂｐのバンド（野生型染色体）、および推定５’ＬＴＲ欠失２型欠損プロウイルスを含む約４０００ｂｐのバンドを生成した。ゲル精製ＰＣＲ産物から調製されたライブラリー（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ２Ｄ－Ｒ９．４）を、ＳｐｏｔＯＮ Ｆｌｏｗ Ｃｅｌｌ Ｍｋ－Ｉ－Ｒ９．４（オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社）でシーケンスした。Ｐｏｒｅｔｏｏｌｓを用いてＦＡＳＴＱ配列を抽出し、適切な部位にプロウイルスが組み込まれたカスタムゲノムに、ＢＷＡ－ＭＥＭを介して、マッピングした。
ＨＴＬＶ－１プロウイルス、並びにその５’側および３’側に隣接するゲノム配列を、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いて、ＰＣＲ増幅した。ＡＴＬ１４（推定完全長プロウイルス、５’ＬＴＲ－宿主接合部および３’ＬＴＲ－宿主接合部、ＨＴＳクローナリティーによって検出）：フォワードプライマー（５’－ＴＧＧＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡ－３’：配列番号８）、およびリバースプライマー（５’－ＴＧＣＡＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴＣＡＧＡ－３’：配列番号９）は、７５０ｂｐ（野生型染色体）、およびプロウイルスを含む約９０００ｂｐのバンドを生成した。ＡＴＬ１１－Ｒ－ＬＮ（リンパ節、再発）：フォワードプライマー（５’－ＣＣＴＴＡＡＴＣＡＣＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣ－３’：配列番号１０）およびリバースプライマー（５’－ＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＴＴＡＴＣＡＴ－３’：配列番号１１）は、４６０ｂｐのバンド（野生型染色体）、および推定５’ＬＴＲ欠失２型欠損プロウイルスを含む約４０００ｂｐのバンドを生成した。ゲル精製ＰＣＲ産物から調製されたライブラリー（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ２Ｄ－Ｒ９．４）を、ＳｐｏｔＯＮ Ｆｌｏｗ Ｃｅｌｌ Ｍｋ－Ｉ－Ｒ９．４（オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社）でシーケンスした。Ｐｏｒｅｔｏｏｌｓを用いてＦＡＳＴＱ配列を抽出し、適切な部位にプロウイルスが組み込まれたカスタムゲノムに、ＢＷＡ－ＭＥＭを介して、マッピングした。
【0075】
実施例１４：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再構成
ＴＣＲ－γ遺伝子再構成を、確立されたＥｕｒｏＣｌｏｎａｌｉｔｙ（Ｂｉｏｍｅｄ－２）プロトコル（Van Dongen JJM et al.: Design and standardization of PCR primers
and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17:2257-2317, 2003）を用いて評価した。
ＴＣＲ－γ遺伝子再構成を、確立されたＥｕｒｏＣｌｏｎａｌｉｔｙ（Ｂｉｏｍｅｄ－２）プロトコル（Van Dongen JJM et al.: Design and standardization of PCR primers
and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17:2257-2317, 2003）を用いて評価した。
【0076】
実施例１５：血液細胞の免疫表現型検査
ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４クローン）、ＣＤ２５（２Ａ３）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｌ２４３）、ＣＤ３ｄｉｍ（ＵＣＨＴ１）およびＣＤ７ａｂｓｅｎｔ（１２４－１Ｄ１）を発現する異常リンパ球集団の存在を、ＥｕｒｏＦｌｏｗの標準プロトコルに従って、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）により検査した。
ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４クローン）、ＣＤ２５（２Ａ３）、ＨＬＡ－ＤＲ（Ｌ２４３）、ＣＤ３ｄｉｍ（ＵＣＨＴ１）およびＣＤ７ａｂｓｅｎｔ（１２４－１Ｄ１）を発現する異常リンパ球集団の存在を、ＥｕｒｏＦｌｏｗの標準プロトコルに従って、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）により検査した。
【0077】
実施例１６：
クローナリティーは、細胞または物質が、１つの供給源に由来している状態であること、または、他の供給源に由来している状態であること、を暗示する。従って、ポリクローナル（多くのクローンに由来）；オリゴクローナル（少数のクローンに由来）；およびモノクローナル（１つのクローンに由来）、というような用語がある。これらの用語は抗体または免疫細胞に関連して最も多く使用される。ＨＴＬＶ－１プロウイルスが細胞ゲノム内の同一部位に挿入された細胞は全て、「姉妹細胞（Sister cell）」とされる。「クロ
ーン」は姉妹細胞の集団である。超音波処理によるランダムなＤＮＡ断片化は、ユニークな挿入部位の存在量の定量化を可能にする、重要な特徴となる。ユニークな挿入部位のそれぞれについて、長さの異なるアンプリコンの数がカウントされる。「アンプリコン」は、ＰＣＲの際に生成される分子である。
クローナリティーは、細胞または物質が、１つの供給源に由来している状態であること、または、他の供給源に由来している状態であること、を暗示する。従って、ポリクローナル（多くのクローンに由来）；オリゴクローナル（少数のクローンに由来）；およびモノクローナル（１つのクローンに由来）、というような用語がある。これらの用語は抗体または免疫細胞に関連して最も多く使用される。ＨＴＬＶ－１プロウイルスが細胞ゲノム内の同一部位に挿入された細胞は全て、「姉妹細胞（Sister cell）」とされる。「クロ
ーン」は姉妹細胞の集団である。超音波処理によるランダムなＤＮＡ断片化は、ユニークな挿入部位の存在量の定量化を可能にする、重要な特徴となる。ユニークな挿入部位のそれぞれについて、長さの異なるアンプリコンの数がカウントされる。「アンプリコン」は、ＰＣＲの際に生成される分子である。
【0078】
さらに、シークエンス時のタグインデックスの読み間違いは、特定の挿入部位が違う試料に帰属されることを引き起こし得る。この問題を回避するため、所与の挿入部位について、６ｂｐのタグ情報を考慮するだけでなく、相異する切断部位の総数およびリードの総数も考慮することによって、挿入部位が正しい試料に帰属される。
【0079】
実施例１７：プロウイルス組み込み部位のＨＴＳマッピングの結果は分子的反応の定量的測定を可能にする
白血病型（４人は急性型、１人は予後不良の慢性型）と診断され、全員が導入療法後に臨床的寛解を達成した、５人のＡＴＬ患者の後向きＰＢＭＣ試料の、縦断的なクローナリティー解析を実施した。これは、最適化されたＨＴＳに基づく方法を適用して、ＨＴＬＶ－１組み込み部位のマッピングおよび対応するクローンの存在量の定量化を行うことで、優勢な推定腫瘍クローンの分子的追跡を可能にすることにより、実現された。患者の特徴および試料の特徴を表１にまとめる。５人の患者全員が最終的には再発したが、血液学的寛解の持続期間、臨床経過、および生存成績は患者間で様々であった。２人の患者が５．８年と２．４年という長期に及ぶ臨床的寛解（それぞれ、ＡＴＬ１１およびＡＴＬ６０；図１ａ、図１ｂ）を達成したが、一方で、３人の患者が急速な再発を示し、寛解は、ＡＴＬ７は４．３か月、ＡＴＬ１４は５．３か月、ＡＴＬ１００は３．７か月という、著しくより短いものであった（表１、図１ｃ～ｅ）。
白血病型（４人は急性型、１人は予後不良の慢性型）と診断され、全員が導入療法後に臨床的寛解を達成した、５人のＡＴＬ患者の後向きＰＢＭＣ試料の、縦断的なクローナリティー解析を実施した。これは、最適化されたＨＴＳに基づく方法を適用して、ＨＴＬＶ－１組み込み部位のマッピングおよび対応するクローンの存在量の定量化を行うことで、優勢な推定腫瘍クローンの分子的追跡を可能にすることにより、実現された。患者の特徴および試料の特徴を表１にまとめる。５人の患者全員が最終的には再発したが、血液学的寛解の持続期間、臨床経過、および生存成績は患者間で様々であった。２人の患者が５．８年と２．４年という長期に及ぶ臨床的寛解（それぞれ、ＡＴＬ１１およびＡＴＬ６０；図１ａ、図１ｂ）を達成したが、一方で、３人の患者が急速な再発を示し、寛解は、ＡＴＬ７は４．３か月、ＡＴＬ１４は５．３か月、ＡＴＬ１００は３．７か月という、著しくより短いものであった（表１、図１ｃ～ｅ）。
【0080】
各ＡＴＬについて、血液学的寛解の期間中に採取された、単一（ＣＲ１；ＡＴＬ７およびＡＴＬ１００）または複数（ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３；ＡＴＬ１１、ＡＴＬ１４およびＡＴＬ６０）の縦断的試料から構成される、（ｉ）診断時、（ｉｉ）再発時、および（ｉｉｉ）中間時点における、クローン構造を解析した。ＰＶＬ（１００個のＰＢＭＣあたりのプロウイルスコピーの数）、ＴＣＲ－γ再構成プロファイル、および血液細胞免疫表現型も、全ての試料について、記録した。追跡中の患者の臨床的データおよび生物学的データを表２に記載する。診断時のＨＴＬＶ－１組み込み部位のＨＴＳマッピングによって、５つのＡＴＬ症例のうち４症例（ＡＴＬ７、ＡＴＬ１１、ＡＴＬ１４およびＡＴＬ１００）において、プロウイルスゲノムの９２．７５％～９９．８６％（平均９５．９％）を構成していた単一の優勢な組み込み部位が明らかとなった。残りの腫瘍（ＡＴＬ６０）においては、４種の優勢プロウイルスが同一悪性クローンに同一頻度で存在することが証明され、単一ＴＣＲ－γ再構成の知見と一致した（総相対存在量９９．０５％）。全ての患者が治療を受け、ＣＢＣの正常化、異常リンパ球が５％未満であること、および４週間を超えて測定可能腫瘍が存在しないことを特徴とする、完全臨床寛解を達成した。２／５の患者において、治療後に、推定悪性クローンの優勢ＨＴＬＶ－１挿入部位が、９７．３２％から１．８７％に（ＡＴＬ１１）減少し、また、９９．０５％から２．１５％に（ＡＴＬ６０）減少したことが、分子解析により明らかとなった。両方の患者で、臨床的寛解時のＨＴＬＶ－１感染細胞のクローン頻度分布は複数の低存在量クローンから構成されており、そのユニークな推定悪性組み込み部位がプロウイルスゲノムの３％未満に寄与した（図１、ａ～ｂ、ＣＲ１）。患者の１人（ＡＴＬ１１）は、５年１１か月間臨床的且つ分子的な寛解を維持し、クローン頻度に有意な変化はなく、ＰＶＬはわずかに変動した（ＣＲ２およびＣＲ３；図１ａ）。一方、２番目の患者（ＡＴＬ６０）は、２年４か月間の完全血液学的寛解の期間をかけて、悪性クローンのゆっくりとした中程度の再発を示したが、ＰＶＬの増加はなかった（ＣＲ２およびＣＲ３でそれぞれ９．２５％および３６．９５％、図１ｂ）。再発時のＡＴＬ６０のクローナリティー解析によって、診断時に検出された優勢組み込み部位の完全再発が明らかとなり、全体のクローン存在量は９９．４６％であった。ＡＴＬ１１は、リンパ腫型で、異なるクローンで、再発した。この新たなクローンはプロウイルスゲノムの８９．３％を構成した。クローン変化の知見は、ＡＴＬの臨床経過時の異なるクローンの出現を示した以前の報告と一致している。優勢組み込み部位は３’ＬＴＲ－宿主接合部によって支持されたが、５’ＬＴＲ依存性リードはシーケンス結果に
回収されず、このことは、再発時に出現した新たな悪性クローンが５’ＬＴＲ欠失プロウイルスであったことを強く示唆している。本発明者らは、長期Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンス技術を適用して、再発時に発生したリンパ腫におけるプロウイルスおよびそのゲノムバウンダリ（genomic boundary）を特徴づけることにより、これが実際に事実であることを確認した。これにより、５’／３’デュアルＨＴＳアプローチが５’ＬＴＲ欠失２型欠損プロウイルスを正確に検出できることが示された（図２）。
回収されず、このことは、再発時に出現した新たな悪性クローンが５’ＬＴＲ欠失プロウイルスであったことを強く示唆している。本発明者らは、長期Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンス技術を適用して、再発時に発生したリンパ腫におけるプロウイルスおよびそのゲノムバウンダリ（genomic boundary）を特徴づけることにより、これが実際に事実であることを確認した。これにより、５’／３’デュアルＨＴＳアプローチが５’ＬＴＲ欠失２型欠損プロウイルスを正確に検出できることが示された（図２）。
【0081】
残りの３／５人の患者の導入療法後のクローナリティー解析によって、ＡＴＬ１１およびＡＴＬ６０とは対照的に、診断時に同定された悪性クローンの相対的存在量が臨床的寛解時に優勢なままであったが（ＡＴＬ７、ＡＴＬ１４およびＡＴＬ１００それぞれについて、ＣＲ１時は７３．４％、４３．２４％および５５．４３％；診断時は９２．７５％、９９．８６％および９４．９５％）、臨床応答基準は完全血液学的寛解と一致し、ＰＶＬは１．７倍～１０００倍超減少したことが明らかとなった（表２および図１、ｃ～ｅ）。これらの患者はそれぞれ４．３か月後、５．３か月後および３．７か月後に再発を起こし、優勢悪性クローンは８６％超（それぞれ、８６．２０％、８８．１％、および９９．１２％）となった。すなわち、これら３人の患者の分子的追跡により、臨床応答基準が完全血液学的寛解を示した時点においての第一選択治療に対する不応性が明らかとなった。
【0082】
実施例１８：ＨＴＳによるクローン頻度分布評価は他の現在利用可能な分子的手法よりも優れている
ＴＣＲ－γ再構成データが記録され、さらに、血液細胞の免疫表現型プロファイルがＦＣＭにより測定された（図１および表２）。これらのアッセイはネカー病院における通例の造血器腫瘍評価に組み込まれている。ある特定の時点において、クローン性再構成を示したＴＣＲ－γおよび／またはＦＣＭは、標準的な血液学的応答基準よりも良好な再発の指標であったが、これらのアッセイは両方とも制限があった。ＴＣＲ－γに関しては、ＨＴＳクローナリティーが、導入療法に対する不応性の優れた予測者であった（図１、ＡＴＬ１００ ＣＲ１、ＡＴＬ１４ ＣＲ１およびＣＲ２）。ＨＴＳアプローチの別の利点は、ＴＣＲ－γアッセイとは対照的に、それが、短期間の分子的寛解後の再発の定量的測定を可能としたこと（図１、ＡＴＬ６０）と、より高い感度を示したこと（図１ｄ、ＣＲ１、０．００７％の絶対存在量、それに対して、ＴＣＲ－γアッセイは約１％という感度）である。ＦＣＭの場合、５人中４人のＡＴＬにおいて、発現がＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ７－、およびＣＤ３ｄｉｍの異常リンパ球集団が明らかとなったが、健常人において観察される分布とのＣＤ３発現レベルの重複を考慮すると、ＣＤ３ｄｉｍステータスを用いた残存病変の正確な検出のためのＦＣＭデータの忠実な解釈には、依然として問題があった。さらに、全てのＡＴＬ症例がＣＤ３ｄｉｍ表現型を示すわけでもなく（表２、ＡＴＬ１００：ＣＤ３ｈｉｇｈ）、このことは、分子応答のマーカーとしてのＦＣＭの限界を示している。結論として、ＨＴＳクローナリティーを含む本発明の方法は、現在、試験された他のどのアッセイよりも優れている。
ＴＣＲ－γ再構成データが記録され、さらに、血液細胞の免疫表現型プロファイルがＦＣＭにより測定された（図１および表２）。これらのアッセイはネカー病院における通例の造血器腫瘍評価に組み込まれている。ある特定の時点において、クローン性再構成を示したＴＣＲ－γおよび／またはＦＣＭは、標準的な血液学的応答基準よりも良好な再発の指標であったが、これらのアッセイは両方とも制限があった。ＴＣＲ－γに関しては、ＨＴＳクローナリティーが、導入療法に対する不応性の優れた予測者であった（図１、ＡＴＬ１００ ＣＲ１、ＡＴＬ１４ ＣＲ１およびＣＲ２）。ＨＴＳアプローチの別の利点は、ＴＣＲ－γアッセイとは対照的に、それが、短期間の分子的寛解後の再発の定量的測定を可能としたこと（図１、ＡＴＬ６０）と、より高い感度を示したこと（図１ｄ、ＣＲ１、０．００７％の絶対存在量、それに対して、ＴＣＲ－γアッセイは約１％という感度）である。ＦＣＭの場合、５人中４人のＡＴＬにおいて、発現がＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ７－、およびＣＤ３ｄｉｍの異常リンパ球集団が明らかとなったが、健常人において観察される分布とのＣＤ３発現レベルの重複を考慮すると、ＣＤ３ｄｉｍステータスを用いた残存病変の正確な検出のためのＦＣＭデータの忠実な解釈には、依然として問題があった。さらに、全てのＡＴＬ症例がＣＤ３ｄｉｍ表現型を示すわけでもなく（表２、ＡＴＬ１００：ＣＤ３ｈｉｇｈ）、このことは、分子応答のマーカーとしてのＦＣＭの限界を示している。結論として、ＨＴＳクローナリティーを含む本発明の方法は、現在、試験された他のどのアッセイよりも優れている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】