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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-06
(45)【発行日】2022-05-16
(54)【発明の名称】二重特異性抗体およびその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220509BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220509BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20220509BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220509BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/46 ZNA
C07K16/30
C07K16/28
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020540284
(86)(22)【出願日】2019-01-07
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-06
(86)【国際出願番号】 CN2019070655
(87)【国際公開番号】W WO2019184549
(87)【国際公開日】2019-10-03
【審査請求日】2020-07-17
(31)【優先権主張番号】201810263832.0
(32)【優先日】2018-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520262652
【氏名又は名称】▲広▼州▲愛▼思▲邁▼生物医▲薬▼科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼文▲軍▼
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼翠娟
(72)【発明者】
【氏名】▲韋▼雪梅
(72)【発明者】
【氏名】▲羅▼▲トウ▼▲暉▼
【審査官】中山 基志
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０４８２９７２８（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１４２８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００１５６１５（ＫＲ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１７８４４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２１の重鎖可変領域（ＶＨ）配列と、配列番号２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列とを有するＣＤ３に結合する抗原結合領域を含む、抗体または抗体断片。
【請求項2】
配列番号９に示される重鎖配列と、配列番号１１に示される軽鎖配列とを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項3】
前記の抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である、請求項１または請求項２に記載の抗体または抗体断片。
【請求項4】
腫瘍抗原標的に結合する別の抗原結合領域をさらに含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項5】
前記の腫瘍抗原標的はＨＥＲ２である、請求項４に記載の抗体または抗体断片。
【請求項6】
前記の抗体は、Ｈｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）、Ｈｅｒ２－ＯＢ２（配列番号３）、Ｈｅｒ２－ＯＢ３（配列番号５）、およびＨｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）からなる群から選択される重鎖配列を含む、請求項５に記載の抗体または抗体断片。
【請求項7】
前記の抗体は、Ｈｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）の重鎖配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体断片。
【請求項8】
前記の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項9】
２つの重鎖および１つの軽鎖を有する二重特異性抗体であって、第１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へとｓｃＦｖ－ヒンジ領域－Ｆｃを有し；第２重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へとＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－Ｆｃを有し；前記の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へとＶＬ－ＣＬを有し、前記の第１重鎖のｓｃＦｖの抗原結合ドメインは腫瘍抗原標的に結合し、前記の第２重鎖のＶＨ－ＣＨ１は、前記の軽鎖のＶＬ－ＣＬと共に、免疫エフェクター細胞の表面にあるシグナル伝達経路受容体に結合する別の抗原結合領域を形成し、前記の第２重鎖のＶＨは配列番号２１の配列を有し、前記の軽鎖のＶＬは配列番号２２の配列を有する、二重特異性抗体。
【請求項10】
前記の第２重鎖は配列番号９の配列を有し、前記の軽鎖は配列番号１１の配列を有する、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
前記の第１重鎖のｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へとＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＨ領域、リンカーペプチド［（ＧＧＧＧＳ）×Ｎ、Ｎ＝３、４、５］、およびＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＬ領域を有し、または、Ｎ末端からＣ末端へとＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＬ領域、リンカーペプチド［（ＧＧＧＧＳ）×Ｎ、Ｎ＝３、４、５］、およびＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＨ領域を有する、請求項９または請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
前記の第１重鎖は、Ｈｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）、Ｈｅｒ２－ＯＢ２（配列番号３）、Ｈｅｒ２－ＯＢ３（配列番号５）、およびＨｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）からなる群から選択される配列を有する、請求項９または請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
前記の第１重鎖はＨｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）の配列を有する、請求項９または請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項14】
ＳＰ３４マウス由来モノクローナル抗体におけるＣＤ３分子結合領域と比較して、前記の二重特異性抗体におけるＣＤ３分子結合領域の熱変性温度は高い、請求項９～請求項１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項15】
前記の第１重鎖、第２重鎖および軽鎖のうち少なくとも１つは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する、請求項９～請求項１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般的に抗体および癌の治療方法に関する。具体的に、本発明は、ＣＤ３および腫瘍抗原標的（例えば、ＨＥＲ２）と標的とする二重特異性抗体、前記の抗体の調製方法およびその使用に関する。さらに、本発明は、前記の抗体を含む組成物および前記の抗体を用いて癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、世界中の悪性腫瘍の罹患率および死亡率は年々増加しており、そのうえ、若年化の傾向もある。市場には多くの抗腫瘍薬があるが、腫瘍の治癒が難しいだけでなく、多くの副作用も有するため、患者の予後および生活の質に深刻な影響を与える。したがって、腫瘍細胞に特異的な殺傷効果が強く、正常細胞に与える影響が小さい抗腫瘍薬の開発は、次世代の新薬開発のホットスポットとなった。
【0003】
抗腫瘍薬は、化学医薬品とバイオ医薬品に分けられる。化学医薬品には、アルキル化剤、代謝拮抗剤などが含まれ、バイオ医薬品には、モノクローナル抗体、抗体薬物複合体、および二重特異性抗体などが含まれる。その中で、二重特異性抗体は、人工的に設計された抗体であり、２つの異なる抗原結合部位の成分で構成され、２つの異なる抗原結合部位と同時に結合することができる。このような特別な機能によって、腫瘍の免疫療法において幅広い応用があると考えられる。
【発明の概要】
【0004】
一態様において、本発明は、ＧＸＰ２の重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号２１）およびＧＸＰ２の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号２２）を有する、ＣＤ３に結合する抗原結合領域を含む抗体または抗体断片に関する。
【0005】
一部の実施形態において、前記の抗体または抗体断片は、配列番号９に示される重鎖配列および配列番号１１に示される軽鎖配列を含む。
【0006】
一部の実施形態において、前記の抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。
【0007】
一部の実施形態において、前記の抗体または抗体断片は、腫瘍抗原標的に対する別の抗原結合領域をさらに含む。一部の実施形態において、前記の腫瘍抗原標的はＨＥＲ２である。
【0008】
一部の実施形態において、前記の抗体または抗体断片は、Ｈｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）、Ｈｅｒ２－ＯＢ２（配列番号３）、Ｈｅｒ２－ＯＢ３（配列番号５）、およびＨｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）からなる群から選択される重鎖配列を含み、好ましくは、前記の抗体または抗体断片は、Ｈｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）の重鎖配列を含む。
【0009】
一部の実施形態において、前記の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される。
【0010】
一態様において、本発明は、２つの重鎖および１つの軽鎖を有する二重特異性抗体に関する。ここで、第１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までｓｃＦｖ－ヒンジ領域－Ｆｃを有し；第２重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－Ｆｃを有し；前記の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＣＬを有する。前記の第１重鎖のｓｃＦｖの抗原結合ドメインは腫瘍抗原標的に結合する。前記の第２重鎖のＶＨ－ＣＨ１は、前記の軽鎖のＶＬ－ＣＬと共に、免疫エフェクター細胞の表面にあるシグナル伝達経路受容体に結合する別の抗原結合領域を形成する。
【0011】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の腫瘍抗原標的はＨＥＲ２であり、前記のシグナル伝達経路受容体はＣＤ３である。
【0012】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の第２重鎖のＶＨは配列番号２１の配列を有し、前記の軽鎖のＶＬは配列番号２２の配列を有する。
【0013】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の第２重鎖はＧＸＰ２－ＶＨ－ＯＡ（配列番号９）の配列を有し、前記の軽鎖はＧＸＰ２－ＶＬ（配列番号１１）の配列を有する。
【0014】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の第１重鎖のｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端までＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＨ領域、リンカーペプチド［（ＧＧＧＧＳ）×Ｎ、Ｎ＝３、４、５］、およびＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＬ領域を有し、または、Ｎ末端からＣ末端までＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＬ領域、リンカーペプチド［（ＧＧＧＧＳ）×Ｎ、Ｎ＝３、４、５］、およびＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＨ領域を有する。
【0015】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の第１重鎖は、Ｈｅｒ－ＯＢ１（配列番号１）、Ｈｅｒ－ＯＢ２（配列番号３）、Ｈｅｒ－ＯＢ３（配列番号５）およびＨｅｒ－ＯＢ４（配列番号７）からなる群から選択される配列を有する。好ましくは、前記の第１重鎖はＨｅｒ－ＯＢ４（配列番号７）の配列を有する。
【0016】
前記の二重特異性抗体の任意の実施形態において、前記の第２重鎖のＣＨ２は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を含んでも良い。一部の実施形態において、前記の第１重鎖のＣＨ２は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を含んでも良い。
【0017】
前記の二重特異性抗体の任意の実施形態において、前記の第２重鎖のＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄの変異を含んでも良く、且つ前記の第１重鎖のＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋの変異を含んでも良く；または、前記の第２重鎖のＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋの変異を含んでも良く、且つ前記の第１重鎖のＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄの変異を含んでも良い。
【0018】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性抗体の第１重鎖および第２重鎖からなるキメラＦｃ領域は、対応する抗体の野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃ受容体への結合が低下する。
【0019】
一部の実施形態において、マウス由来モノクローナル抗体と比較して、本発明の二重特異性抗体がＣＤ３分子に結合したものの熱変性温度は高くなる。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも５℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも１０℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも１２℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも５～１５℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも１０～１５℃上昇することを示す。
【0020】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は腫瘍殺傷活性を有する。一部の実施形態において、前記の腫瘍は、ＨＥＲ２陽性腫瘍である。一部の実施形態において、前記の腫瘍は、乳癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、および肺癌から選択される腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍殺傷活性は、インビトロ腫瘍殺傷試験で試験される。一部の実施形態において、腫瘍殺傷活性は、マウスにおけるインビボ腫瘍モデルで試験される。
【0021】
前記の二重特異性抗体の任意の実施形態において、前記の第１重鎖、第２重鎖および／または軽鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に由来する。一部の実施形態において、前記の第１重鎖、第２重鎖および／または軽鎖は、ＩｇＧ１に由来する。
【0022】
別の態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の第１重鎖、第２重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【0023】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターをコードすることに関する。
【0024】
一態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。一部の実施形態において、前記の宿主細胞は、２９３Ｆ細胞およびＣＨＯ細胞から選択される。
【0025】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片、或いは二重特異性抗体、および前記の抗体または抗体断片、或いは二重特異性抗体にコンジュゲートされた部分を含む抗体複合体（ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。一部の実施形態において、前記のコンジュゲートされた部分は、細胞毒素、放射性同位元素、蛍光標識物質、発光物質、発色物質、および酵素から選択される。
【0026】
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片、或いは二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、細胞毒素である。一部の実施形態において、前記の細胞毒素は、コルヒチン、エムタンシン（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）などからなる群から選択される。
【0027】
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片、或いは二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、放射性同位元素である。一部の実施形態において、前記の放射性同位元素は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２などの放射性同位体からなる群から選択される。
【0028】
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片、或いは二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、例えば、ＦＩＴＣ、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ＨＲＰなどのような蛍光標識物質、発光物質、および発色物質から選択される。
【0029】
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片、或いは二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒素などの酵素（その活性断片および/またはバリアントを含む）である。
【0030】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体または抗体複合体と、必要におじて薬学的に許容される担体、界面活性剤および／または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【0031】
一部の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体または抗体複合体に加えて、前記の医薬組成物は、１つまたは複数の他の治療薬をさらに含む。一部の実施形態において、前記の他の治療剤は、オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）、キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、イミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）などの他の腫瘍免疫薬からなる群から選択される。
【0032】
一態様において、本発明は、疾患の治療のための医薬品の調製における、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体、抗体複合体または医薬組成物の使用に関する。一部の実施形態において、前記の疾患は癌であり、好ましくはＨＥＲ２陽性の癌である。
【0033】
一部の実施形態において、前記の癌症は、乳癌、胃癌、卵巣癌、前列腺癌、肺癌からなる群から選択される。
【0034】
別の態様において、本発明は、ＨＥＲ２陽性の癌を治療するための本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体、抗体複合体または医薬組成物に関する。
【0035】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体、抗体複合体または医薬組成物を被験者に投与する工程を含む、疾患の治療方法に関する。
【0036】
一部の実施形態において、前記の疾患は癌であり、好ましくはＨＥＲ２陽性の癌である。一部の実施形態において、前記の癌は、乳癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌からなる群から選択される。
【0037】
一態様において、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【0038】
一態様において、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図2】図２Ａ～２Ｂは、プロテインＡで精製した二重特異性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。図２Ａは、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、図２Ｂは還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。ここで、Ｍはタンパク質分子量マーカーであり、レーン２～７は異なるコレクションチューブ内の二重特異性抗体サンプルである。
【図5】図５は、異なる温度で３０分間処理した後の、二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２、ＨＥＲ２×ＧＸＰ、およびＨＥＲ２×Ｃ３１のヒトＣＤ３抗原に対する結合活性のＥＬＩＳＡ検出結果である。これは、異なる温度での二重特異性抗体の熱安定性を反映している。
【図6A】図６Ａ～６Ｄは、３７℃および４０℃のインキュベーターに異なる日で置いて後、非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって二重特異性抗体の安定性および分解を検出した結果である。図６Ａ：３７℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｂ：３７℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｃ：４０℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｄ：４０℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。
【図6B】図６Ａ～６Ｄは、３７℃および４０℃のインキュベーターに異なる日で置いて後、非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって二重特異性抗体の安定性および分解を検出した結果である。図６Ａ：３７℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｂ：３７℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｃ：４０℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｄ：４０℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。
【図6C】図６Ａ～６Ｄは、３７℃および４０℃のインキュベーターに異なる日で置いて後、非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって二重特異性抗体の安定性および分解を検出した結果である。図６Ａ：３７℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｂ：３７℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｃ：４０℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｄ：４０℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。
【図6D】図６Ａ～６Ｄは、３７℃および４０℃のインキュベーターに異なる日で置いて後、非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって二重特異性抗体の安定性および分解を検出した結果である。図６Ａ：３７℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｂ：３７℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｃ：４０℃、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；図６Ｄ：４０℃、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。
【図7】図７Ａ～７Ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとＥＬＩＳＡによる、凍結および解凍を繰り返した二重特異性抗体の安定性実験の結果である。図７Ａ：非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果；図７Ｂ：ＣＤ３ ＥＬＩＳＡ結果；図７Ｃ：ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡ結果。
【図8】図８Ａ～８Ｄは、サイトカイン放出に対する二重特異性抗体の影響を示す。ドナー＃１およびドナー＃２由来のＰＢＭＣサンプルにおける、二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２と対照ＣＤ３モノクローナル抗体による処理後のサイトカインＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の放出に関するＥＬＩＳＡの結果を示す。図８Ａ：ドナー＃１、ＩＬ－６；図８Ｂ、ドナー＃１、ＴＮＦ－α；図８Ｃ：ドナー＃２、ＩＬ－６；図８Ｄ：ドナー＃２、ＴＮＦ－α。
【発明を実施するための形態】
【0040】
用語および略語
本明細書で特に定義されていない限り、本発明で使用される科学用語や技術用語およびそれらの略語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものである。以下、本明細書で使用される用語および略語の一部が挙げられる。
本明細書で特に定義されていない限り、本発明で使用される科学用語や技術用語およびそれらの略語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものである。以下、本明細書で使用される用語および略語の一部が挙げられる。
【0041】
抗体：ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｂ；
免疫グロブリン：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｉｇ；
重鎖：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＨＣ；
軽鎖：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ＬＣ；
重鎖可変領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ，ＶＨ；
重鎖定常領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ，ＣＨ；
軽鎖可変領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ，ＶＬ；
軽鎖定常領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ，ＣＬ；
抗原結合断片：ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆａｂ；
ヒンジ領域：ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ；
Ｆｃ断片：ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ；
モノクローナル抗体：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍＡｂｓ；
抗体依存性細胞傷害作用：ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ；
補体依存性細胞傷害作用：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ；
ナチュラルキラー細胞：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ，ＮＫ細胞；
二重特異性抗体：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＢｓＡｂ；
Ｔ細胞受容体：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ；
主要組織適合遺伝子複合体：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ；
相補性決定領域：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ，抗体の抗原相補的結合領域を指し；
免疫受容活性化チロシンモチーフ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭ；
ヒト上皮成長因子受容体２型：ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２，ＨＥＲ２；
一本鎖可変領域抗体断片（一本鎖抗体とも言う）：ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ；
養子免疫療法：ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＩ；
リンホカイン活性化キラー細胞：ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＬＡＫ細胞；
腫瘍浸潤リンパ球：Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＴＩＬ細胞；
サイトカイン誘導キラー細胞：ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＣＩＫ細胞；
キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞免疫療法：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＣＡＲ－Ｔ。
免疫グロブリン：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｉｇ；
重鎖：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＨＣ；
軽鎖：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ＬＣ；
重鎖可変領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ，ＶＨ；
重鎖定常領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ，ＣＨ；
軽鎖可変領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ，ＶＬ；
軽鎖定常領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ，ＣＬ；
抗原結合断片：ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆａｂ；
ヒンジ領域：ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ；
Ｆｃ断片：ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ；
モノクローナル抗体：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍＡｂｓ；
抗体依存性細胞傷害作用：ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ；
補体依存性細胞傷害作用：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ；
ナチュラルキラー細胞：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ，ＮＫ細胞；
二重特異性抗体：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＢｓＡｂ；
Ｔ細胞受容体：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ；
主要組織適合遺伝子複合体：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ；
相補性決定領域：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ，抗体の抗原相補的結合領域を指し；
免疫受容活性化チロシンモチーフ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭ；
ヒト上皮成長因子受容体２型：ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２，ＨＥＲ２；
一本鎖可変領域抗体断片（一本鎖抗体とも言う）：ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ；
養子免疫療法：ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＩ；
リンホカイン活性化キラー細胞：ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＬＡＫ細胞；
腫瘍浸潤リンパ球：Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＴＩＬ細胞；
サイトカイン誘導キラー細胞：ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＣＩＫ細胞；
キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞免疫療法：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＣＡＲ－Ｔ。
【0042】
本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互いに交換して使用してもよく、アミノ酸残基からなるポリマーを指す。１つのアミノ酸のカルボキシ末端ともう１つのアミノ酸のアミノ末端は、脱水縮合によって互いに結合し、ペプチド結合を形成する。ポリペプチド鎖およびタンパク質は、化学的に合成してもよく、組換えで発現させてもよく、且つその最小アミノ酸長の制限はない。
【0043】
本明細書で使用される「アミノ酸」とは、２０種類の天然に存在するアミノ酸、またはある特定の位置に現れる可能性がある任意の非天然アミノ酸類似体を指す。
【0044】
本明細書で使用される「アミノ酸変異」とは、ポリペプチド鎖におけるあるアミノ酸の付加、置換、挿入、および／または欠失を指す。
【0045】
本明細書で使用される「抗体」は、全長抗体および抗体断片を含み、生物由来の天然抗体、遺伝子工学によって得られる抗体、または組換え技術によって得られる抗体に関する。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体などを含む。また、「抗体」という用語は、マウス化抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体なども含まれる。
【0046】
「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインと、ＣＨ１ドメインのＣ末端にある１つまたは複数のシステイン残基とを有するＦｄ’断片；（ｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ断片；（ｖｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉｉ）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「抗体断片」は、上記の抗体断片だけでなく、完全抗体から改変された抗体、および組換えＤＮＡ技術によって合成された新しい抗体も含まれる。
【0047】
本明細書で使用される「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原結合部位の成分から構成され、２つの異なる抗原結合部位に同時に結合することができる人工的に設計される抗体を指す。
【0048】
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ断片」は、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧのＣＨ２とＣＨ３ドメイン、またはＩｇＥおよびＩｇＭのＣＨ２、ＣＨ３とＣＨ４ドメインがヒンジ領域を介してからなるポリペプチドを指す。Ｆｃ断片の分解は可変であるが、通常、ヒトＩｇＧの重鎖のＦｃ断片は、Ａ２３１からそのカルボキシ末端までのポリペプチドを指す。
【0049】
本明細書で使用される「ヒンジ領域」とは、抗体のＣＨ１とＣＨ２との間に位置し、プロリンが豊富で、伸張や屈曲されやすいポリペプチド鎖を指す。周知のＩｇＧヒンジ領域は、２１６～２３０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖である。
【0050】
本明細書で使用される「ＩｇＧ」とは、確認された免疫グロブリンγ遺伝子によってコードされる抗体を指し、ヒトＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。
【0051】
本明細書で使用される「ＥＣ５０」という用語、すなわち最大５０％効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）は、最大効果の５０％に対応する抗体の濃度を指す。
【0052】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、ヒト化免疫グロブリン（アクセプター抗体）における一部またはすべてのＣＤＲ領域を非ヒト抗体（ドナー抗体）におけるＣＤＲ領域で置き換えることによって得られる抗体または抗体断片を指し、ここで、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）抗体であってもよい。また、アクセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）における一部のアミノ酸残基は、抗体の１つまたは複数の特性をさらに改善または最適化するように、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基または他の抗体のアミノ酸残基で置き換えられる。
【0053】
本明細書で使用される「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗原における免疫グロブリンまたは抗体と特異的に結合される部位を指す。抗原決定基は抗原性物質の表面に存在することが多いが、一部は抗原性物質の内部に存在し、酵素または他の方法で処理されて初めて露出される。エピトープまたは抗原決定基は、通常、例えば、アミノ酸、炭水化物または糖側鎖のような分子の化学活性を有する表面の基で構成され、一般的に、特定の３次元構造特性や特定の部位および特性を有する。エピトープは「線形的」または「構造的」であっても良い。線形エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間のすべての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線形的に存在する。構造的エピトープにおいて、相互作用部位は、互いに離れているタンパク質のアミノ酸残基にまたがって存在する。天然の抗原性物質は、複数種類および複数の決定基を有しても良い。抗原分子が大きいほど、決定基の数が多くなる。
【0054】
本明細書で使用される「特異的に結合」とは、抗体とその抗原との間の反応のような、２つの分子間のランダムでない結合反応を指す。一部の実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（または、ある抗原にする特異性を有する抗体）とは、抗体が約１０－５Ｍ未満（例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満）の親和力（ＫＤ）でこの抗原に結合することを意味する。本発明の一部の実施形態において、「標的」という用語は、特異的結合を指す。
【0055】
本明細書で使用される「ＫＤ」とは、抗体と抗原との間の結合親和性を表すために使用される特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指す。解離定数が小さいほど、抗体と抗原との結合が強くなり、抗体と抗原との間の親和性が高くなる。一般に、抗体は、約１０－５Ｍ未満（例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、または１０－１０Ｍ未満）の解離定数（ＫＤ）で抗原に結合する。
【0056】
本明細書で使用される「ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルを指す。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現できる場合、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入またはトランスフェクションなどの方法によって宿主細胞に導入され、それが運ぶ遺伝物質因子を宿主細胞で発現させる。ベクターは、当業者に対して公知であり、（１）プラスミド；（２）ファージミド；（３）コスミド；（４）例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；（５）λファージやＭ１３ファージなどのファージ、および（６）動物ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用される動物ウイルスとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択因子、およびレポーター遺伝子などの発現を制御する複数の因子を含んでもよいが、これらに限定されない。さらに、ベクターは、複製起点を含んでもよい。
【0057】
抗体は、抗原が体を刺激して免疫応答を引き起こした後、形質細胞によって分泌される、抗原に特異的に結合できる免疫グロブリンであり、自然に産生されるため、毒性や副作用が少ない。ここ１０年間で、従来のモノクローナル抗体は、腫瘍免疫療法において大きな成功を収めた。２０１６年末までに、世界で６３種の抗体系医薬品が発売され、２０１６年の世界の抗体売上高は１０００億米ドルを超えた。２０１６年に世界で販売された上位１０個の医薬品のうち、７個はバイオ医薬品であり、そのうち６個は抗体系医薬品で、世界の医薬品の売上高の２０％以上を占めている。モノクローナル抗体の作用機序には、成長シグナルの遮断、腫瘍血管新生の遮断、アポトーシスの誘導、免疫細胞の活性化による免疫効果の発生が含まれる。その中で、モノクローナル抗体は、主にＦｃが免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、単核細胞など）表面のＦｃγＲ（Ｆｃγ受容体）に結合して細胞を活性化させ、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞傷害作用）、ＡＤＣＰ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、抗体依存性細胞貪食）を増強したり、Ｆｃが補体タンパク質Ｃ１ｑに結合してＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、補体依存性細胞傷害作用）を増強したりすることで、細胞殺傷効果を発揮する。
【0058】
抗体医薬品の低い毒性および高い特異性が従来の化学療法と異なることは、その成功の優勢であるが、抗体医薬品は全体的な有効性が低いという問題に直面している。さらに、抗体医薬品の治療効果も薬剤耐性に悩まされ、腫瘍異質性および腫瘍細胞自体の複数のシグナル伝達経路による制御により、単一の標的の免疫療法が薬剤耐性になりやすくなる。これらの問題は、モノクローナル抗体の作用機序に関連する。モノクローナル抗体は、自体のＦｃ断片を介してＮＫ細胞の表面のＦｃ受容体に結合することで、ＮＫ細胞を活性化して腫瘍を殺傷する。しかしながら、ヒトＦｃ受容体には遺伝子多型があり、高親和性受容体（ＶＶ遺伝子型）を発現する人はわずか２０％程度を占めるが、低親和性受容体を発現する人は、モノクローナル抗体の効果に対する応答率が低くなる。これらは、集団におけるモノクローナル抗体の全体的な応答率が高くないことを決定する。同時に、ＮＫ細胞は全免疫細胞ＰＢＭＣの合計の５～８％程度しか占めておらず、モノクローナル抗体医薬品は、腫瘍殺傷の過程で他の免疫細胞の役割を果たすことができない。
【0059】
現在、Ｔ細胞は、腫瘍殺傷にとって最も重要な免疫細胞であると一般に考えらる。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞などを含むＴ細胞は、ＰＢＭＣの総数の２０％以上を占める。腫瘍患者の体内において特異的な抗腫瘍細胞免疫を確立するために、腫瘍関連抗原とＴ細胞活性化シグナル伝達経路受容体を同時に結合できる多数の二重特異性抗体が設計された。このクラスの二重特異性抗体の一方の端は、Ｔ細胞またはその他の免疫細胞の受容体分子（例えば、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄなど）に結合し、もう一方の端は、腫瘍細胞の標的に結合され、これより、免疫Ｔ細胞が腫瘍細胞を認識して結合することを促進し、免疫連鎖を形成して腫瘍細胞を除去する。
【0060】
本発明者らは、ＣＲＩＳ－７、ＵＣＨＴ－１、ＴＲＸ４、ＯＫＴ３、ＭＥＭ－５７、ＳＰ３４、ＨｉＴ３ａを含む複数の抗ヒトＣＤ３複合体マウス抗体について、詳細な分析および比較を行った。また、そのうちの１つのマウス抗体ＧＸＰ（ＳＰ３４）は、配列の最適化、ヒト化が行われた。
【0061】
ＧＸＰ（ＳＰ３４）は、抗ヒトＣＤ３マウスモノクローナル抗体であり、複数の特許に開示されており、一部の企業もそのヒト化を実施した（ＵＳ９５８７０２１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２１０３８２１９）。本発明者らは、ＶＨおよびＶＬフレームワーク領域の配列をヒト化し、マウス由来の重鎖および軽鎖におけるすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を変化させずに保った。もう１つの重要な原則は、抗体の構造安定性および抗原親和性への影響を減らすために、それぞれのＣＤＲ領域のＮ末端またはＣ末端付近のマウス由来の配列をできるだけ保持することである。
【0062】
本発明者らが特定した前記抗体の最終的なヒト化配列は、ＧＸＰ２と命名され、野生型抗体と比較して、本発明によって最適化されたこのＣＤ３マウス抗体のヒト化配列ＧＸＰ２は、多くの独特の特性と優位性が得られる。これらの新しい特性によって、この新しいヒト化抗体は、抗体医薬品の開発により適する。具体的には、マウス由来の抗体または他のヒト化配列と比較して、本発明の最適化された抗体配列は、抗体タンパク質の発現が著しく増加し、熱安定性も大幅に向上し、ＣＤ３抗原への親和性および結合性も向上し、二重特異性抗体の調製に用いた場合、より強力な腫瘍殺傷活性を示した。本発明に開示されたヒト化配列は、他社のヒト化配列よりも多くの利点と特徴を有し、新しい抗腫瘍医薬品の調製に用いた場合、より優れた腫瘍殺傷活性を示し、且つ物理的および化学的安定性も大幅に改善され、抗腫瘍医薬品のスクリーニングおよび開発により適する。この創造的な成果は、本発明の有益な効果および極めて高い医療応用価値を有する。
【0063】
したがって、一態様において、本発明は、ＧＸＰ２の重鎖可変領域（ＶＨ）配列（配列番号２１）およびＧＸＰ２の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列（配列番号２２）を有すＣＤ３に結合する抗原結合領域を含む、抗体または抗体断片に関する。一実施形態において、抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であっても良い。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、キメラ抗体または抗体断片、ＣＤＲ移植抗体または抗体断片、ヒト化抗体または抗体断片、または完全ヒト抗体または抗体断片であっても良い。
【0064】
一部の実施形態において、前記の抗体または抗体断片は、配列番号９に示される重鎖配列および配列番号１１に示される軽鎖配列を含む。
【0065】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、腫瘍抗原標的に対する別の抗原結合領域をさらに含む二重特異性抗体または多重特異性抗体である。一部の実施形態において、前記の腫瘍抗原標的は、ヒト上皮成長因子受容体２型（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２，ＨＥＲ２）である。
【0066】
特定の癌に関連する多くの腫瘍関連抗原がすでに確認された。本明細書で使用される「腫瘍抗原標的」という用語は、癌細胞による発現差異があるため、癌細胞を標的とするために利用することができる抗原を指す。癌抗原は、明らかな腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激できる抗原である。これらの抗原の一部は、正常細胞によってコードされるが、必ずしも正常細胞によって発現されるとは限らない。これらの抗原は、正常細胞では通常サイレントである（即ち、発現しない）もの、分化のある段階でのみ発現するもの、および胚や胎児抗原などの特定の時点に発現するものとして特徴付けられる。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、突然変異体ｐ５３）、および内部欠失または染色体転座から生じる融合タンパク質などの突然変異細胞遺伝子によってコードされる。また、他の癌抗原は、ＲＮＡ腫瘍ウイルスおよびＤＮＡ腫瘍ウイルスが持つ遺伝子などのウイルス遺伝子によってコードされても良い。多くの腫瘍抗原は、複数の固形腫瘍に基づいて定義された。例えば、免疫によって定義されたＭＡＧＥ１、２、３、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ－２、ムチン（即ち、ＭＵＣ－１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）である。さらに、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのウイルスタンパク質は、それぞれ肝細胞癌、リンパ腫および子宮頸癌の発生に重要な役割を果たすことが示された。しかし、腫瘍は、一連の異なる免疫逃避機構を利用したり、その恩恵を受けたりして、癌患者の免疫系が腫瘍抗原を認識または応答できないことがよくある。通常、精巣、胎盤、および卵巣の精母細胞または精原細胞に関連する癌抗原の例の一部としては、癌・精巣（ＣＴ）抗原ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ－１、およびＭＡＧＥ－３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸを挙げられる。これらの抗原は、黒色腫、リンパ腫、肺癌、膀胱癌、結腸癌および乳癌に存在する（例えば、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２００８；３１：２９４－３０９；Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７：１５ｓ，２００９に記載）。メラニン細胞、上皮組織、前立腺および結腸で一般的に見られる癌抗原には、分化抗原Ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ－Ａ／Ｍａｒｔ－１、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡおよびＭａｍｍａｇｌｏｂｉｎ－Ａも含まれる。これらの抗原は、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、および乳癌に存在する。一部の癌抗原は、通常低レベルで発現されるが、癌では過剰発現される共有抗原である。過剰発現される癌抗原の例としては、食道、肝臓、膵臓、結腸、乳房、卵巣、膀胱、および前立腺癌に見られるｐ５３、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ｌｉｖｉｎ、およびサバイビンが挙げられる。また、黒色腫、非小細胞肺癌、腎臓癌の１つ以上に関連するβ－カテニン－ｍ、β－アクチン／４／ｍ、ミオシン／ｍ、ＨＳＰ７０－２／ｍおよびＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７０Ｊなどの他の癌抗原は独特である。その他の癌抗原は、腎臓、腸、結腸直腸組織などの上皮組織で一般的に見られる腫瘍に関連する炭水化物抗原である。これらの癌抗原には、黒色腫、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌に見られるＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＵＣ－１、ｓＴｎ、ａｂｄ ｇｌｏｂｏ－Ｈが含まれる。他の腫瘍抗原、エピトープペプチドおよびそれらの説明は、米国特許Ｎｏ．７，９０６，６２０；７，９１０，６９２；８，０９７，２４２；７，９３５，５３１；８，０１２，４６８；８，０９７，２５６；８，００３，７７３；Ｔａｒｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２０００；７４（１）：１－３に記載した。本明細書は、その全体が参照により組み込まれる。一部の実施形態において、完全癌抗原が使用されるが、他の実施形態において、癌抗原のエピトープペプチド（タンパク質の分解消化または組換えによって調製された）が使用される。従って、本明細書に記載の組成物および方法とともに使用される腫瘍または癌抗原の非限定的な例としては、Ｈｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、β－カテニン－ｍ、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原－１２５（ＣＡ－１２５）、ＣＡ１９－９、カルレチニン（ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）、ＭＵＣ－１、上皮細胞膜抗原（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、マンマグロビンＡ（Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ Ａ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、総嚢胞性疾患流体タンパク質（ｇｒｏｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＣＤＦＰ－１５）、ＥＢＶ、ｇｐ１００、ＨＭＢ－４５抗原、タンパク質ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔリンパ球により認識された黒色腫抗原；ＭＡＲＴ－１）、ｌｉｖｉｎ、サバイビン、ｍｙｏ－Ｄ１、筋肉特異的アクチン（ＭＳＡ）、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリフォスファターゼ、シナプス小胞タンパク質、チログロブリン、甲状腺転写因子－１、ピルビン酸キナーゼアイソザイムＭ２型の二量体（腫瘍Ｍ２－ＰＫ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）ＥｐｈＡ２、ＣＳＰＧ４、ＣＤ１３８、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＤ１７１、ｋａｐｐａ、ｌａｍｂｄａ、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥｐＣＡＭ、ｆｅｔａｌ ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＡＧＥ、ＧＤ３、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ－３、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄｓ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭｓ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子変異体ＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）、ｐｒｏｓｔｅｉｎ、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体γ代替リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ－ｐ８、ＳＴＲＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原１（ｓｉｘ－ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ １））、ＨＳＰ７０－２／ｍおよびＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７０Ｊ、チロシナーゼ、異常なｒａｓタンパク質または異常なｐ５３タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0067】
ＨＥＲ２は、ヒト上皮成長因子受容体ファミリー（ＥｒｂＢファミリーとも呼ばれる）の２番目のメンバーである。このファミリーは、Ｉ型チロシンキナーゼに属し、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４の４つのメンバーがあり、正常または異常な表皮細胞の成長、分化、および転移の調節に非常に重要な役割を果たすため、複数の腫瘍の発生や発展と密接に関連する。
【0068】
ＨＥＲ２は、ヒト染色体１７ｑ２１に位置し、分子量１８５ＫＤのチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質をコードする（Ａｋｉｙａｍａ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ－ｅｒｂＢ－２ｇｅｎｅ：ａ１８５－ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８６Ｊｕｎ ２７；２３２（４７５８）：１６４４－６）。ＨＥＲ２は、通常、胎児期にのみ発現し、成人後、乳房、胃腸管、腎臓および心臓などのごく少数の正常組織に微量発現する（Ｏｌａｙｉｏｙｅ ＭＡ．Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ＨＥＲ－２ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ－２ａｎｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；３：３８５－９；Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ－ｅｒｂＢ－２ｇｅｎｅ ｔｏ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８６；３１９：２３０－４）。通常の状況において、細胞内のＨＥＲ２遺伝子は不活性状態であり、２つのコピーのみを有する。遺伝子変異が発生すると、ＨＥＲ２遺伝子は活性化され、２０倍以上増幅され、その後、転写およびタンパク質合成を増加させ、腫瘍のアポトーシスを阻害し、腫瘍細胞の増殖を促進し、さらに、腫瘍組織における血管やリンパ管の形成を促進することにより、腫瘍細胞の浸潤を促進することもできる。さらに、ＨＥＲ２タンパク質は、二量体化および自己リン酸化した後、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路およびＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化させ、細胞の無制限の増殖や分化を促進し、アポトーシスを阻害することで、細胞の発癌を促進する（Ｂｒｏｗｎｅ ＢＣ ｅｔ ａｌ．ＨＥＲ－２ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００９；９（３）：４１９－３８；Ｃａｓｔａｎｅｄａ ＣＡ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ／ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ２０１０；２９（４）：７５１－９）。また、ＨＥＲ２の過剰発現は、複数の転移関連メカニズムを開始し、それにより、細胞遊走速度、侵襲性などを含む腫瘍細胞の遊走能力を高める。一般に、ＨＥＲ２遺伝子増幅（および／またはタンパク質の過剰発現）を示す腫瘍は、悪性度が高く、転移能力が強い。ＨＥＲ２遺伝子の過剰発現は、腫瘍の発生や発展と密接に関連するだけでなく、重要な臨床治療のモニタリング指標および予後の指標でもあり、腫瘍標的治療薬の重要な標的であることが分かる（Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｐｌｕｓ ａ ｍｏｍｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＥＲ２ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈａｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＨＥＲ２．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００１Ｍａｒ １５；３４４（１１）：７８３－９２）。
【0069】
研究によると、ＨＥＲ２の過剰発現が、乳癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌などの複数の悪性腫瘍に存在することが分かった。２０％～３０％の原発性乳癌において、ＨＥＲ２遺伝子の増幅およびタンパク質の過剰発現が存在し、腫瘍細胞の悪性転移を引き起こす重要な因子である。ＨＥＲ２を過剰発現した乳癌患者は、病状が急速に進行し、化学療法の寛解期間が短く、内分泌療法の効果が悪く、無病生存率および全生存率は低いである。ＨＥＲ２陰性の転移性乳癌患者の生存率は１７～２２か月であるのに対し、ＨＥＲ２患者の生存率は８～１０か月で、前者の半分にすぎないことが研究により示された（Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７；２３５：１７７－８２）。
【0070】
胃癌は、中国の各種類の悪性腫瘍の中で第１位であり、且つ７％～３４％の胃癌においてＨＥＲ２が過剰発現する現象がある。胃癌の予後は悪く、進行胃癌の５年生存率はわずか５％～２０％であり、生存期間中央値は１年以下である。研究から、胃癌におけるＨＥＲ２陽性発現は、腫瘍の分化度、Ｌａｕｒｅｎ分類およびＷＨＯ分類に関連するが、性別、年齢、腫瘍の場所との相関関係がないことが示された。
【0071】
また、１８％～４３％の卵巣癌において、ＨＥＲ２が過剰発現する現象もある（ＧｌｅｎＭａｒｋ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。ＨＥＲ２陰性の卵巣癌患者（０／１＋）と比較して、ＨＥＲ２陽性の患者（２＋／３＋）の全生存率は著しく低下することが報告された（Ｖｅｒｒｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．ＨＥＲ２／ｎｅｕｏｎｃｏｐｐｒｏｔｅｉｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｅｃａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００５，６８：１５４－１６１）。
【0072】
さらに、前立腺癌や肺癌においても、ＨＥＲ２が過剰発現する現象がある。Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉらは、異なる臨床段階の前立腺癌サンプルにおけるＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のレベルを測定したところ、異なる治療法を受けた患者間でＨＥＲ２過剰発現の比率が異なり、前立腺癌の手術切除のみを受けた患者の２５％、手術前に抗アンドロゲン療法を受けた患者の５９％、アンドロゲン療法が失敗して骨転移（アンドロゲン依存性ＡＩ）を起こした患者の最大７８％は、ＨＥＲ２が過剰発現したことを見出した。肺癌におけるＨＥＲ２の過剰発現は、遺伝子の転写および転写後修飾と密接に関連する。
【0073】
現在臨床で使用されているＨＥＲ２標的薬としては、上記のようなトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））、およびアドトラスツズマブエムタンシン（Ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂｅｍｔａｎｓｉｎｅ、Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））が挙げられる。これらの薬物は、一定の治療効果はあるが、依然として多くの制限がある。（１）約６０～７０％の患者がＨｅｒｃｅｐｔｉｎに対する初期耐性（ｐｒｉｍａｒｙ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示し；（２）約７０％の患者がＨｅｒｃｅｐｔｉｎによる治療の１年後に獲得耐性を獲得し；（３）Ｋａｄｃｙｌａの第一選択薬としての効果はＨｅｒｃｅｐｔｉｎに及ばず、しかも非常に高価で、患者に大きな経済的負担を与える（ＧｌｅｎＭａｒｋ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。
【0074】
本発明は、モノクローナル抗体Ｃｈ４Ｄ５のアミノ酸配列（ＰＤＢ Ｄａｔａｂａｓｅ＃１Ｎ８Ｅ）を参照して、腫瘍標的Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合するＳｃＦｖ構造を設計、構築し、さらにＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ、およびＶＨ－リンカー－ＶＬにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を加えたものなどのいくつかの形式を設計した。具体的な設計は次のとおりである。
【0075】
第１実施形態において、腫瘍標的Ｈｅｒ２に結合するｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、抗Ｈｅｒ２抗体Ｃｈ４Ｄ５のＶＨが１５アミノ酸の短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３に連結し、さらにＣｈ４Ｄ５のＶＬと連結する。得られたｓｃＦｖは、ヒンジ領域、およびＯＢ変異配列（Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ）を持つＦｃに連結し、Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖、即ちＨｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）を形成する。
【0076】
第２実施形態において、腫瘍標的Ｈｅｒ２に結合するｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｃｈ４Ｄ５のＶＬが１５アミノ酸の短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３に連結し、さらにＣｈ４Ｄ５のＶＨに連結する。得られたｓｃＦｖは、ヒンジ領域、およびＯＢ配列を持つＦｃに連結し、Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖、即ちＨｅｒ２－ＯＢ２（配列番号３）を形成する。
【0077】
第３実施形態において、腫瘍標的Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖の構造は、第１実施形態と同様であり、即ち、抗Ｈｅｒ２抗体Ｃｈ４Ｄ５のＶＨが、１５アミノ酸の短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３に連結し、さらにＣｈ４Ｄ５のＶＬに連結する。得られたｓｃＦｖは、ヒンジ領域、およびＯＢ配列を持つＦｃに連結する。Ｈｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）は、ＶＬ領域とヒンジ領域との間にＮｃｏＩおよびＢｇ１ＩＩマルチクローニングサイトが含まれるため、他の非ヒト由来アミノ酸ＴＶＡＭＶＲが含まれる。この実施形態において、該配列は、ヒト抗体配列ＧＥＰＫで置き換えられて、Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖Ｈｅｒ２－ＯＢ３（配列番号５）を形成する。
【0078】
第４実施形態は、第３実施形態に基づき、モノクローナル抗体Ｃｈ４Ｄ５重鎖のＣＨ２領域にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を導入して、抗体のＡＤＣＣ機能およびＣＤＣ機能を低下させ、Ｔ細胞への損傷を回避する。得られた配列は、Ｈｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）である。
【0079】
なお、以上の４種類のコンストラクトは、いずれもＨｅｒ２／ｎｅｕに対する高い親和力を示し、その中に、ＶＨ－リンカー－ＶＬ構造を有するＯＢ１、ＯＢ３、ＯＢ４は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ構造を有するＯＢ２よりも高い親和力を示す。
【0080】
従って、一部の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、Ｈｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）、Ｈｅｒ２－ＯＢ２（配列番号３）、Ｈｅｒ２－ＯＢ３（配列番号５）、およびＨｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）から選択される重鎖配列を含み、好ましくは、上記の抗体はＨｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）の重鎖配列を含む。上記の重鎖配列は、高親和性でＨＥＲ２に結合して、上記のＧＸＰ２のＶＨ配列（配列番号２１）およびＧＸＰ２のＶＬ配列（配列番号２２）（ＣＤ３に結合する抗原結合領域）と二重特異性抗体または多重特異性抗体を形成し、ＨＥＲ２陽性の乳癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌および肺癌などのＨＥＲ２陽性癌の治療に用いられる。
【0081】
一部の実施形態において、前記の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびｓｃＦｖ断片から選択される。
【0082】
一態様において、本発明は、２つの重鎖および１つの軽鎖を有する二重特異性抗体に関し、ここで、第１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までｓｃＦｖ－ヒンジ領域－Ｆｃを有し；第２重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－Ｆｃを有し；前記の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＣＬを有し、前記の第１重鎖のｓｃＦｖの抗原結合ドメインは腫瘍抗原標的に結合し、前記の第２重鎖のＶＨ－ＣＨ１は、前記の軽鎖のＶＬ－ＣＬと共に、免疫エフェクター細胞の表面にあるシグナル伝達経路受容体に結合する別の抗原結合領域を形成する。
【0083】
図１は、本発明の二重特異性抗体の分子構造の模式図を示す。
【0084】
本発明において開示される二重特異性抗体は、構造について以下の特徴を有する。
【0085】
１．該二重特異性抗体分子は、２つの異なる抗原結合領域が含まれるため、一方は腫瘍関連抗原を特異的に認識でき、もう一方は免疫エフェクター細胞のシグナル経路標的を特異的に認識して結合できる。それは、人体の免疫細胞を特異的に捕捉し、腫瘍細胞の付近に連れて行くことができ、また、免疫細胞と腫瘍細胞との間に免疫効果の連鎖の形成を促進することで、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなどの免疫細胞を活性化させ、腫瘍細胞を殺傷して除去する。
【0086】
２．該分子構造の１つの抗原結合領域はｓｃＦｖ構造で、もう１つの抗原結合領域はＦａｂ構造であるため、分子全体は２つの異なる重鎖および１つの軽鎖からなる。ここで、Ｆａｂ結合領域を形成する１つの軽鎖は、この領域の重鎖可変領域としか結合できないので、軽鎖と対応する重鎖とのミスマッチは起こらない。
【0087】
３．該二重特異性抗体分子は非対称構造であるため、製造プロセスに生成される大量の目的生成物（ヘテロダイマー）と少量の非目的生成物（ホモダイマー）の分子量や電荷分布などは、いずれも大きな差異があり、下流の精製、分離に役立つ。
【0088】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の腫瘍抗原標的はＨＥＲ２であり、前記のシグナル伝達経路受容体はＣＤ３である。一部の実施形態において、前記の第２重鎖のＶＨはＧＸＰ２のＶＨ配列（配列番号２１）を有し、前記の軽鎖のＶＬはＧＸＰ２のＶＬ配列（配列番号２２）を有する。
【0089】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の第２重鎖はＧＸＰ２－ＶＨ－ＯＡの配列（配列番号９）を有し、前記の軽鎖はＧＸＰ２－ＶＬの配列（配列番号１１）を有する。
【0090】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の第１重鎖のｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端までＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＨ領域、リンカーペプチド［（ＧＧＧＧＳ）×Ｎ、Ｎ＝３、４、５］、およびＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＬ領域を有するか、または、Ｎ末端からＣ末端までＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＬ領域、リンカーペプチド［（ＧＧＧＧＳ）×Ｎ、Ｎ＝３、４、５］、およびＣｈ４Ｄ５モノクローナル抗体のＶＨ領域を有する。
【0091】
前記の二重特異性抗体の一部の実施形態において、前記の第１重鎖は、Ｈｅｒ－ＯＢ１（配列番号１）、Ｈｅｒ－ＯＢ２（配列番号３）、Ｈｅｒ－ＯＢ３（配列番号５）およびＨｅｒ－ＯＢ４（配列番号７）からなる群から選択される配列を有する。ここで、好ましくは、前記の第１重鎖はＨｅｒ－ＯＢ４（配列番号７）の配列を有する。
【0092】
前記の二重特異性抗体の任意の実施形態において、抗体のＡＤＣＣ機能およびＣＤＣ機能を低下させ、Ｔ細胞への損傷を回避するために、前記の第２重鎖のＣＨ２および／または第１重鎖のＣＨ２は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含んでも良い。
【0093】
ＷＯ２０１７０３４７７０Ａ１において、１つの重鎖にＰ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋの変異（ＯＡと呼ばれる）を導入すること；もう１つの重鎖にＴ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ（ＯＢと呼ばれる）を導入することを含む、抗体の重鎖部分を修飾して２つの重鎖間の結合活性および特異性を高める方法が開示された。
【0094】
したがって、前記の二重特異性抗体の任意の実施形態において、前記の第２重鎖のＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋの変異を含んでも良く、第１重鎖のＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄの変異を含んでも良い。
【0095】
或いは、重鎖間の結合親和性および特異性を高めるために、前記の第２重鎖のＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄの変異を含んでも良く、前記の第１重鎖のＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋの変異を含んでも良い。
【0096】
本明細書および特許請求の範囲において、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載したＥＵインデックスの番号付けである。これは、インタネットから入手可能であり、参照により本明細書に完全に組み込まれる。例えば、「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ配列番号付け」または「Ｋａｂａｔマーク」とは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で可変領域をコードする配列を指す。重鎖可変領域について、Ｋａｂａｔ番号として、超可変領域の範囲は、ＣＤＲ１のアミノ酸位置３１～３５、ＣＤＲ２のアミノ酸位置５０～６５、およびＣＤＲ３のアミノ酸位置９５～１０２である。軽鎖可変領域について、Ｋａｂａｔ番号として、超可変領域の範囲は、ＣＤＲ１のアミノ酸位置２４～３４、ＣＤＲ２のアミノ酸位置５０～５６、ＣＤＲ３のアミノ酸位置８９～９７である。
【0097】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性抗体の第１重鎖および第２重鎖からなるキメラＦｃ領域は、対応する抗体の野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃ受容体への結合が低下する。例えば、一部の実施形態において、そのＦｃ受容体への結合が低下する。抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合が低下すると、抗体のＡＤＣＣ機能およびＣＤＣ機能が低下し、Ｔ細胞への損傷を回避できる。
【0098】
一部の実施形態において、マウスモノクローナル抗体と比較して、本発明の二重特異性抗体がＣＤ３分子に結合したものの熱変性温度は高くなる。例えば、一部の実施形態において、それがＣＤ３分子に結合したものの熱変性温度が上昇する。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも５℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも１０℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも１２℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも５～１５℃上昇することを示す。一部の実施形態において、そのＣＤ３に結合したものの熱変性温度の上昇は、ΔＴが少なくとも１０～１５℃上昇することを示す。
【0099】
一部の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は腫瘍殺傷活性を有する。一部の実施形態において、前記の腫瘍は、ＨＥＲ２陽性腫瘍である。一部の実施形態において、前記の腫瘍は、乳癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、および肺癌から選択される腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍殺傷活性は、インビトロ腫瘍殺傷試験で試験される。一部の実施形態において、腫瘍殺傷活性は、マウスにおけるインビボ腫瘍モデルで試験される。
【0100】
前記の二重特異性抗体の任意の実施形態において、前記の第１重鎖、第２重鎖および／または軽鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に由来する。一部の実施形態において、前記の第１重鎖、第２重鎖および／または軽鎖は、ＩｇＧ１に由来する。
【0101】
さらに、一態様において、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【0102】
一態様において、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【0103】
核酸、ベクター、および宿主細胞
一態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の第１重鎖、第２重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
一態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の第１重鎖、第２重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【0104】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）をコードすることに関する。
【0105】
本発明の発現ベクターの例としては、ｐＦＵＳＥｓｓ ＣＨＩｇ－ｈＧ１ベクターまたはその他のベクターに基づいて構築された発現ベクターが挙げられる。ここで、ＰＣＲにより抗ＨＥＲ２のｓｃＦｖドメインを増幅させ、酵素切断部位（ＥｃｏＲ ＩおよびＸｈｏ Ｉ）をｓｃＦｖに導入し；増幅された遺伝子断片は、酵素で切断されたベクターｐＦＵＳＥｓｓ ＣＨＩｇ－ｈＧ１と連結され、抗ＨＥＲ２のｓｃＦｖ－Ｆｃを搭載した発現ベクター（ｐＦｕｓｅ ＨＥＲ２－ＯＢと呼ばれる）が得られた。
【0106】
また、本発明のベクターの例としては、ＰＣＲにより抗ＣＤ３の重鎖ＶＨ断片を増幅させ、酵素切断部位（ＥｃｏＲ ＩおよびＸｈｏ Ｉ）を重鎖に導入し、酵素で切断されたベクターｐＦＵＳＥｓｓ ＣＨＩｇ－ｈＧ１と連結され、抗ＣＤ３の重鎖を搭載した発現ベクター（ｐＦＵＳＥ ＧＸＰ２－ＯＡ－ＶＨと呼ばれる）が得られたことが挙げられる。
【0107】
本発明のベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ ３．１（＋）または他のベクターに基づいて構築された発現ベクターが挙げられる。ここで、ＰＣＲにより抗ＣＤ３の軽鎖ＶＬ断片を増幅させ、酵素切断部位（Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｈｏ Ｉ）を軽鎖に導入し、酵素で切断されたベクターｐｃＤＮＡ ３．１（＋）と連結され、抗ＣＤ３軽鎖を挿入した発現ベクター（ｐＣＫ ＧＸＰ２－ＶＬと呼ばれる）が得られた。
【0108】
一態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。一部の実施形態において、前記の宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞およびＣＨＯ細胞から選択される。
【0109】
また、本発明は、二重特異性抗体の調製方法に関する。この方法は以下を含む。
【0110】
１．ｓｃＦｖを含む結合領域の第１重鎖を、第１発現ベクターに構築し、Ｆａｂ構造を含む結合領域の第２重鎖を、第２発現ベクターに構築し；Ｆａｂ構造を含む結合領域の軽鎖を、第２ベクターまたは必要に応じて第３発現ベクターに構築し；
【0111】
２．第１発現ベクター、第２発現ベクター、および必要に応じて第３発現ベクターを共に哺乳動物宿主細胞にコトランスフェクトし、好ましくは、前記の細胞は２９３Ｆ細胞またはＣＨＯ細胞であり；
【0112】
３．トランスフェクトした２９３Ｆ細胞またはＣＨＯ細胞を培養し、培養上清を回収し；
【0113】
４．培養上清から目的の二重特異性抗体を精製し；分離工程には、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにより、発現上清からＦｃ断片付き抗体分子を捕捉した後、陽イオン交換クロマトグラフィーによって目的の二重特異性抗体と副産物との分離を行い、最後に濃縮して緩衝液を交換することが含まれる。
【0114】
一部の実施形態において、前記の第１発現ベクターはｐＦｕｓｅ ＨＥＲ２－ＯＢである。一部の実施形態において、前記の第２発現ベクターはｐＦＵＳＥ ＧＸＰ２－ＯＡ－ＶＨである。一部の実施形態において、前記の第３発現ベクターはｐＣＫ ＧＸＰ２－ＶＬである。
【0115】
抗体複合体
近年、抗体複合体は、その優れた標的指向性と抗癌活性によって、ますます注目を集めている。抗体複合体は、抗体、リンカー短鎖、および以下のコンジュゲート物質からなる。上記のコンジュゲート物質は、細胞毒素、放射性同位元素、蛍光標識物質、発光物質、発色物質、または酵素からなる群から選択される。抗体複合体は、抗体の標的指向性と上記のコンジュゲート物質を組み合わせるものである。抗体複合体が血液循環に入ると、抗体部分は、標的細胞の表面上の標的を認識し；標的を認識した後、抗体は、標的複合体としてエンドサイトーシスによって細胞に入り、次にリソソーム内の酵素によって徐々に分解され、抗体が持つ有毒物質を細胞質に放出させ、標的細胞を殺傷する。抗体複合体は、化学療法薬系抗腫瘍薬の副作用を軽減し、腫瘍治療の選択性を高めることができる。
近年、抗体複合体は、その優れた標的指向性と抗癌活性によって、ますます注目を集めている。抗体複合体は、抗体、リンカー短鎖、および以下のコンジュゲート物質からなる。上記のコンジュゲート物質は、細胞毒素、放射性同位元素、蛍光標識物質、発光物質、発色物質、または酵素からなる群から選択される。抗体複合体は、抗体の標的指向性と上記のコンジュゲート物質を組み合わせるものである。抗体複合体が血液循環に入ると、抗体部分は、標的細胞の表面上の標的を認識し；標的を認識した後、抗体は、標的複合体としてエンドサイトーシスによって細胞に入り、次にリソソーム内の酵素によって徐々に分解され、抗体が持つ有毒物質を細胞質に放出させ、標的細胞を殺傷する。抗体複合体は、化学療法薬系抗腫瘍薬の副作用を軽減し、腫瘍治療の選択性を高めることができる。
【0116】
したがって、本発明は、本発明の抗体または二重特異性抗体と別の部分とをコンジュゲートすることによって形成される抗体複合体に関する。一部の実施形態において、前記の別の部分は、細胞毒素、放射性同位元素、蛍光標識物質、発光物質、発色物質、または酵素からなる群から選択される。
【0117】
一部の実施形態において、本発明の抗体または二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、細胞毒素である。一部の実施形態において、前記の細胞毒素は、細胞機能を阻害または遮断する物質および／または細胞破壊を引き起こす物質を指し、小分子細胞毒素が含まれる。一部の実施形態において、前記の細胞毒素は、コルヒチン、エンタンシン（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）などからなる群から選択される。
【0118】
一部の実施形態において、本発明の抗体または二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、放射性同位元素である。一部の実施形態において、前記の放射性同位元素は、例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位元素を含む。
【0119】
一部の実施形態において、本発明の抗体または二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、例えば、ＦＩＴＣ、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ＨＲＰなどの蛍光標識物質、発光物質および発色物質から選択される。
【0120】
一部の実施形態において、本発明の抗体または二重特異性抗体にコンジュゲートして抗体複合体を形成する部分は、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の酵素活性毒素などの酵素であり、その活性断片および／またはバリアントを含む。
【0121】
医薬組成物および疾患の治療方法
一態様では、本発明は、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体または抗体複合体、および必要に応じて薬学的に許容される担体、界面活性剤および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
一態様では、本発明は、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体または抗体複合体、および必要に応じて薬学的に許容される担体、界面活性剤および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【0122】
「薬学的に許容される担体」とは、ＬＡＰバインダーの安定性、溶解性または活性の維持に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体、封入材料、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物または媒介物を指す。製剤の他の成分と適合し、且つ患者に有害ではないという点から、それぞれの担体は、「許容される」ことが必要である。薬学的に許容される担体として用いられる材料の例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；（８）落花生油、綿実油、紅花、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；（９）プロピレングリコールなどのグリコール；（１０）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１１）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１２）寒天；（１３）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１４）アルギン酸；（１５）発熱物質を含まない水；（１６）等張食塩水；（１７）リンガー液；（１９）ｐＨ緩衝液；（２０）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２１）ポリペプチドおよびアミノ酸などの充填剤；（２２）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；（２３）エタノールなどのＣ２～Ｃ１２アルコール；および（２４）医薬品製剤で用いられる他の非毒の相溶性物質が挙げられる。さらに、放出剤、コーティング剤、防腐剤および抗酸化剤も、医薬品製剤中に存在してもよい。なお、本明細書において、「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は、互いに交換して使用してもよい。
【0123】
一部の実施形態において、前記の医薬組成物は、本発明の抗体、二重特異性抗体、または抗体複合体に加えて、１つまたは複数の他の治療剤を含む。
【0124】
一部の実施形態において、前記の他の治療剤としては、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法用薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）拮抗薬（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）））、血小板由来成長因子阻害剤（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）（イマチニブメシレート（Ｉｍａｔｉｎｉｂ Ｍｅｓｙｌａｔｅ）））、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ））などの他の癌治療薬、インターフェロン、サイトカイン、アンタゴニスト（例えば、中和抗体、これは以下の１つまたは複数の標的に結合する：ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２（例えば、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）；ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）；ＭＫ－３４７５；ＡＭＰ－２２４；ＭＰＤＬ３２８０Ａ；ＭＥＤＩ０６８０；ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；および／またはＭＥＤＩ４７３６）；ＣＴＬＡ－４（例えば、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＰＦＩＺＥＲ）およびイピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ））；ＬＡＧ－３（例えば、ＢＭＳ－９８６０１６）；ＣＤ１０３；ＴＩＭ－３および／または他のＴＩＭファミリーのメンバー；ＣＥＡＣＡＭ－１および／またはその他のＣＥＡＣＡＭファミリーのメンバー、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ－β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦ受容体ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２）、およびその他の生物活性薬剤および有機化学薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。また、本明細書に記載される方法は、特にそれらの組み合わせが考えられる。
【0125】
一部の実施形態において、前記の他の治療剤は化学療法剤である。化学療法剤の例としては、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）およびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）などのアルキル化剤類（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）；ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、インプロスルファン（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ）、およびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）などのアルキルスルホン酸塩類（ａｌｋｙｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレデパ（Ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）およびウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）などのアジリジン類（ａｚｉｒｉｄｉｎｅｓ）；アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）などを含むエチレンイミン類（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅｓ）およびメチルメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎ）（特にブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）およびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）（合成類似体であるトポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）を含む）；ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ）；ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ；ＣＣ－１０６５（アドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）、ビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）などの合成類似体を含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｓ）（特にクリプトフィリン１およびクリプトフィリン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１などの合成類似体を含む）；エロイテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、塩酸ナイトロジェンマスタード－Ｎ－オキシド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード（ｕｒａｃｉｌ ｍｕｓｔａｒｄ）などのナイトロジェンマスタード類（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄｓ）；カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア類（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａｓ）；エンジイン系抗生物質（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）（例えば、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特にカリケアミシンγ１ＩおよびカリケアミシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４））などの抗生物質類；ジネマイシンＡ（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ Ａ）などのアントラサイクリン系抗生物質（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）発色団および関連する色素タンパク質エンジイン系抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ｃａｒａｂｉｃｉｎ、カルミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ，ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ，ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロロドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ，ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤類；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）などの葉酸類似体；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）などのプリン類似体；アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アズリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ジデオキシウリジン（ｄｉｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）などのピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）などのアンドロゲン類；アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、トリロスタン（ｔｒｉｌｏｓｔａｎｅ）などの抗アドレナリン薬類；フォリン酸（ｆｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸サプリメント；アセグラトン（ａｃｅｇｌａｔｏｎｅ）；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホスファミド（ｄｅｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）； ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）などのメイタンシノイド類（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジド（ｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ）；プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）；多糖類複合体（ＰＳＫ（登録商標））（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ，ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（特にＴ－２毒素、ベルカリン（ｖｅｒｒｕｃａｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアンギジン（ａｎｇｕｉｄｉｎ））；ウレタン（ｕｒｅｔｈａｎ）；ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）；ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（“Ａｒａ－Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）；パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ） （Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、クレモホールフリー（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ－ｆｒｅｅ）のアルブミン修飾ナノ粒子剤形のパクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）などのタキソイド（ｔａｘｏｉｄｓ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６－チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）；メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）；メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）；シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）およびカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）などのプラチナアナログ；ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）；プラチナ；エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ－１６）；イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ビンクリスチン；ナベルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；エダ
トレキサート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）；ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ－１１）（イリノテカン、５－ＦＵおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）を含む治療レジメン）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）などのレチノイド（ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ）；コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）；ホルミルテトラヒドロ葉酸（ＬＶ）；オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）やオキサリプラチンを含む治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）；ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）（ＴＹＫＥＲＢ．）；ＰＫＣ－ａｌｐｈａ、Ｒａｆ、Ｈ－ＲａｓＶＥＧＦ－Ａの阻害剤；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
トレキサート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）；ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ－１１）（イリノテカン、５－ＦＵおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）を含む治療レジメン）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）などのレチノイド（ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ）；コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）；ホルミルテトラヒドロ葉酸（ＬＶ）；オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）やオキサリプラチンを含む治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）；ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）（ＴＹＫＥＲＢ．）；ＰＫＣ－ａｌｐｈａ、Ｒａｆ、Ｈ－ＲａｓＶＥＧＦ－Ａの阻害剤；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0126】
本明細書に記載の医薬組成物は、特に、以下に適したものを含む、固体、液体またはゲルの形態で被験者に化合物を投与するための化合物を調製することができる。（１）例えば無菌溶液や懸濁液または徐放性製剤としての、例えば皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外での注射などの非経口投与；（２）例えば、皮膚に適用するクリーム剤、軟膏剤や制御放出パッチ剤またはスプレー剤としての表面適用；（３）例えばペッサリー、クリームまたはフォーム戸としての膣内または直腸内投与；（４）眼；（５）経皮；（６）経粘膜；または（７）鼻内の投与に適したものが含まれる。
【0127】
一態様では、本発明は、癌を治療するための医薬品の調製における、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体、抗体複合体または医薬組成物の使用に関する。一部の実施形態において、前記の癌は、ＨＥＲ２陽性の癌である。
【0128】
別の態様において、本発明は、癌の治療のために使用する本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体、抗体複合体または医薬組成物に関する。一部の実施形態において、前記の癌は、ＨＥＲ２陽性の癌である。
【0129】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片、二重特異性抗体、抗体複合体または医薬組成物を被験者に投与する工程を含む、癌の治療方法に関する。一部の実施形態において、前記の癌は、ＨＥＲ２陽性の癌である。
【0130】
癌の例としては、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳およびＣＮＳ癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；胆管癌；絨毛癌；結腸直腸癌；結合組織癌；消化器癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（胃腸癌を含む）；膠芽腫；肝癌；肝癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；白血病；肝癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；奇形癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器癌；外陰癌；およびその他の癌や肉腫；ならびに移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、および母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連する浮腫）、原始起源腫瘍、Ｍｅｉｇｓ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
一部の実施形態において、前記の癌は、乳癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、および肺癌からなる群から選択される。
【実施例】
【0132】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【0133】
実施例１：二重特異性抗体の構築
１．腫瘍抗原に結合する第１重鎖の構築
本発明者らは、モノクローナル抗体Ｃｈ４Ｄ５のアミノ酸配列を参照して、二重特異性抗体の第１結合ドメインとして腫瘍標的Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合するＳｃＦｖ構造を設計、構築し、さらにＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ、およびＶＨ－リンカー－ＶＬにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を加えたものなどのいくつかの形式を設計した。具体的な設計は次のとおりである。
１．腫瘍抗原に結合する第１重鎖の構築
本発明者らは、モノクローナル抗体Ｃｈ４Ｄ５のアミノ酸配列を参照して、二重特異性抗体の第１結合ドメインとして腫瘍標的Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合するＳｃＦｖ構造を設計、構築し、さらにＶＨ－リンカー－ＶＬ、ＶＬ－リンカー－ＶＨ、およびＶＨ－リンカー－ＶＬにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を加えたものなどのいくつかの形式を設計した。具体的な設計は次のとおりである。
【0134】
第１実施形態において、腫瘍標的Ｈｅｒ２に結合するｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、抗Ｈｅｒ２抗体Ｃｈ４Ｄ５のＶＨが１５アミノ酸の短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３に連結し、さらにＣｈ４Ｄ５のＶＬと連結する。得られたｓｃＦｖは、ヒンジ領域、およびＯＢ変異を持つＦｃに連結し、Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖、即ちＨｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）を形成する。
【0135】
第２実施形態において、腫瘍標的Ｈｅｒ２に結合するｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｃｈ４Ｄ５のＶＬが１５アミノ酸の短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３に連結し、さらにＣｈ４Ｄ５のＶＨに連結する。得られたｓｃＦｖは、ヒンジ領域、およびＯＢ配列を持つＦｃに連結し、Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖、即ちＨｅｒ２－ＯＢ２（配列番号３）を形成する。
【0136】
第３実施形態において、腫瘍標的Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖の構造は、第１実施形態と同様であり、即ち、抗Ｈｅｒ２抗体Ｃｈ４Ｄ５のＶＨが、１５アミノ酸の短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）×３に連結し、さらにＣｈ４Ｄ５のＶＬに連結する。得られたｓｃＦｖは、ヒンジ領域、およびＯＢ配列を持つＦｃに連結する。Ｈｅｒ２－ＯＢ１（配列番号１）は、ＶＬ領域とヒンジ領域との間にＮｃｏＩおよびＢｇ１ＩＩマルチクローニングサイトが含まれるため、他のアミノ酸ＴＶＡＭＶＲが含まれる。この実施形態において、該配列は、ヒト抗体配列ＧＥＰＫで置き換えられて、Ｈｅｒ２に結合するＳｃＦｖ－Ｆｃ重鎖Ｈｅｒ２－ＯＢ３（配列番号５）を形成する。
【0137】
第４実施形態は、第３実施形態に基づき、モノクローナル抗体Ｃｈ４Ｄ５重鎖のＣＨ２領域にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を導入して、抗体のＡＤＣＣ機能およびＣＤＣ機能を低下させ、Ｔ細胞への損傷を回避する。得られた配列は、Ｈｅｒ２－ＯＢ４（配列番号７）である。
【0138】
ＥＬＩＳＡの結果から、上記の４つのコンストラクトは、いずれもＨｅｒ２／ｎｅｕに対して高い親和性を示し、その中に、ＶＨ－リンカー－ＶＬ構造を有するＯＢ１、ＯＢ３、ＯＢ４は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ構造を有するＯＢ２よりも高い親和力を示す。
【0139】
２．Ｔ細胞表面抗原であるＣＤ３に結合する重鎖および軽鎖可変領域の構築
本発明者らは、複数の抗ヒトＣＤ３複合体のマウス由来抗体について、詳細な分析および比較を行い、マウス由来抗体ＧＸＰ（ＳＰ３４）の可変領域に対して配列最適化およびヒト化を行った。
本発明者らは、複数の抗ヒトＣＤ３複合体のマウス由来抗体について、詳細な分析および比較を行い、マウス由来抗体ＧＸＰ（ＳＰ３４）の可変領域に対して配列最適化およびヒト化を行った。
【0140】
ＧＸＰ（ＳＰ３４）は、抗ヒトＣＤ３のマウス由来モノクローナル抗体であり、そのヒト化を実施したこと（ＵＳ９５８７０２１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２１０３８２１９を参照）が報告された。本発明者らは、そのＶＨおよびＶＬのフレームワーク配列をヒト化し、マウス由来の重鎖および軽鎖におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を変化させずに保った。もう１つの重要な原則は、抗体の構造安定性および抗原親和性への影響を減らすために、それぞれのＣＤＲ領域付近のマウス由来の配列をできるだけ保持することである。
【0141】
本発明者らが特定した最終的な配列は、表１Ａおよび表１Ｂに示すように、ＧＸＰ２と命名された。
【0142】
【表1A】
【0143】
【表1B】
【0144】
本発明者らは、ＧＸＰ（ＳＰ３４）のマウス由来配列、ヒト化ＧＸＰ２配列、およびＵＳ９５８７０２１に開示されたヒト化配列（Ｃ３１と命名）を使用して、二重特異性抗体Ｈｅｒ２×ＧＸＰ、Ｈｅｒ２×ＧＸＰ２およびＨｅｒ２ｘＣ３１を構築し、それらの熱安定性および生物活性を比較した結果、ＧＸＰ２のヒト由来ＣＤ３に対する親和性がマウス由来ＧＸＰおよびヒト化配列Ｃ３１よりも高く、熱安定性も大幅に向上する（△Ｔは１２℃超）こと；３７℃および４０℃で２７日間保管した条件、または凍結融解を繰り返した条件下で分解せずに安定に保つことが意外に判明した。
【0145】
さらに、二重特異性抗体の腫瘍殺傷効果およびサイトカインストーム誘発活性を評価した結果、ＧＸＰ２は、Ｈｅｒ２陽性の腫瘍細胞を殺傷する能力が大幅に向上するが、サイトカインストームを誘発する活性は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体よりも著しく低下することが分かった。そして、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの移植腫瘍モデルにおいて優れた抗腫瘍活性を示した。上記の結果は、ＧＸＰ２が潜在的な抗腫瘍薬の候補であることを示す。
【0146】
実施例２：二重特異性抗体の発現および精製
本実験に含まれるすべての二重特異性抗体は、一過性トランスフェクションまたは安定トランスフェクションによって発現された。まず、ＯＭＥＧＡキットを利用してプラスミドを抽出した。調製の具体的な操作は、通常の分子生物学の方法に従って行われた。ＯＰＭ－ＣＤ０３２９３培地を利用して３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養用シェーカーで２９３Ｆ細胞を１３０ｒｐｍで振盪培養した。細胞が対数増殖期に成長した後、トランスフェクション試薬ＰＥＩを使用して、異なる組み合わせのプラスミドを２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトし、ＨＥＲ２×ＣＤ３に対する一連の二重特異性抗体を発現した。トランスフェクトした２４時間および９６時間に、それぞれ細胞培養サプリメントを添加し、トランスフェクトした７日目に３５００ｒｐｍで細胞培養上清を遠心分離して回収した。
本実験に含まれるすべての二重特異性抗体は、一過性トランスフェクションまたは安定トランスフェクションによって発現された。まず、ＯＭＥＧＡキットを利用してプラスミドを抽出した。調製の具体的な操作は、通常の分子生物学の方法に従って行われた。ＯＰＭ－ＣＤ０３２９３培地を利用して３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養用シェーカーで２９３Ｆ細胞を１３０ｒｐｍで振盪培養した。細胞が対数増殖期に成長した後、トランスフェクション試薬ＰＥＩを使用して、異なる組み合わせのプラスミドを２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトし、ＨＥＲ２×ＣＤ３に対する一連の二重特異性抗体を発現した。トランスフェクトした２４時間および９６時間に、それぞれ細胞培養サプリメントを添加し、トランスフェクトした７日目に３５００ｒｐｍで細胞培養上清を遠心分離して回収した。
【0147】
本発明は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ）を利用して、細胞培養上清から二重抗体を捕捉する。まず、カラム容量の１０倍量の平衡化緩衝液（ＰＢＳ、ＰＨ７．４）でカラムを平衡化し、次にサンプルをアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードし、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ３．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む）で溶出する。その後、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用してＨｉｔｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ）を通過して、副産物から目的の二重特異性抗体を分離させ、平衡化緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）でカラムを平衡化した後、溶出緩衝液である５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、溶液Ａ）と１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、溶液Ｂ）とを混合して２５倍のカラム容量でグラジエント溶出を行い；最後に、濃縮し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と交換して保管する。
【0148】
続いて、精製された生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出および同定に供し、その結果を図２Ａ～２Ｂに示す。その中で、図２Ａは非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果であり、図２Ｂは還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。ここで、Ｍはタンパク質分子量マーカーであり、ウェル２～７はプロテインＡによる精製後に溶出された二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２のサンプルである。図２Ａ～２Ｂの結果から、プロテインＡによる一段階精製を行った後、非常に高い純度の目的の二重特異性抗体が得られることが分かった。これは、軽鎖がミスマッチせずに相同な重鎖に特異的に結合することでき、それにより発現生成物に高純度の目的の二重特異性抗体を含むことを保証することを示しす。本発明で開示される二重特異性抗体は非対称構造であるため、目的抗体と対応するホモ二量体の分子量は一致しなくて、下流の精製に有利である。
【0149】
実施例３：標的抗原ＣＤ３およびＨＥＲ２に対する二重特異性抗体の結合活性の分析
本研究ではＥＬＩＳＡ分析法を使用した。具体的な実験手順は次のとおりである。抗原ＣＤ３または抗原ＨＥＲ２をＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）にコートし、４℃で一晩コートし、プレートを洗浄した後、スキムミルクでブロッキングし、プレートを洗浄し、その後、二重特異性抗体および対照サンプルを加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１：２０００で希釈された二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（商標））を加え、室温で１時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、発光基質Ａ＋Ｂ（Ａ：Ｂ＝１：１）を加え、３分後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｃｋ）で吸光度を測定した。
本研究ではＥＬＩＳＡ分析法を使用した。具体的な実験手順は次のとおりである。抗原ＣＤ３または抗原ＨＥＲ２をＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）にコートし、４℃で一晩コートし、プレートを洗浄した後、スキムミルクでブロッキングし、プレートを洗浄し、その後、二重特異性抗体および対照サンプルを加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１：２０００で希釈された二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（商標））を加え、室温で１時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、発光基質Ａ＋Ｂ（Ａ：Ｂ＝１：１）を加え、３分後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｃｋ）で吸光度を測定した。
【0150】
ＥＬＩＳＡの結果から、二重特異性抗体がＣＤ３抗原に対して陽性の結合を示し、且つその結合率が用量依存的な関係を示したことが明らかとなった。本発明で開示されるヒト化抗体ＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰ２のＣＤ３抗原に対する結合活性は、ヒト化抗体ＨＥＲ２－ＯＢ１×Ｃ３１およびマウス由来抗体ＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰよりも高い。それらとＣＤ３抗原との結合のＥＣ５０は、それぞれ１．４０２μｇ／ｍＬ、３．５２２μｇ／ｍＬおよび３．１５３μｇ／ｍＬであった（図３）。
【0151】
さらに、二重特異性抗体は、腫瘍細胞の表面抗原ＨＥＲ２を特異的に認識して結合することもでき、且つその結合率は用量依存的な関係を示した。二重特異性抗体ＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰ２、ＨＥＲ２－ＯＢ１×Ｃ３１、およびＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰのＨＥＲ２抗原に対する結合活性はそれほど変わらないため、ＨＥＲ２配列と異なるＣＤ３抗体配列との組み合わせが、ＨＥＲ２抗原への結合に影響しないことを示す（図４を参照）。
【0152】
実施例４：二重特異性抗体の熱安定性分析
１．熱処理した二重特異性抗体の安定性および親和性の試験
適量の二重特異性抗体サンプルを、サンプルごとに１０本ずつＰＣＲチューブに分注し、ＰＣＲ機器（Ｍｙｇｅｎｅ（商標））に温度勾配を設定し、恒温で３０分間加熱した。温度は、３５℃、４０．６℃、４５℃、５０℃、５５．６℃、６０℃、６５℃、７０．６℃、７５℃に設定され、残った１チューブの元の抗体は、コントロールとして－２０℃で保存された。処理終了後、サンプルを室温まで冷却し、－２０℃で保管した。
１．熱処理した二重特異性抗体の安定性および親和性の試験
適量の二重特異性抗体サンプルを、サンプルごとに１０本ずつＰＣＲチューブに分注し、ＰＣＲ機器（Ｍｙｇｅｎｅ（商標））に温度勾配を設定し、恒温で３０分間加熱した。温度は、３５℃、４０．６℃、４５℃、５０℃、５５．６℃、６０℃、６５℃、７０．６℃、７５℃に設定され、残った１チューブの元の抗体は、コントロールとして－２０℃で保存された。処理終了後、サンプルを室温まで冷却し、－２０℃で保管した。
【0153】
ＥＬＩＳＡプレートをＣＤ３抗原またはＨＥＲ２抗原でコートし、プレートを洗浄した後、牛乳でブロッキングし、プレートを洗浄し、元の二重特異性抗体コントロールおよび熱処理された二重特異性抗体を加え、１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、酵素標識抗体を加え、インキュベートし、プレートを洗浄し、酵素標識抗体と反応する発光基質を添加した後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）で吸光度を測定した。ここで、この吸光度は、特異的に結合した抗体の量に比例した。結果から、ＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰ２二重特異性抗体の熱変性曲線の中点値Ｔ５０が５８．２８℃に達したことを示した。
【0154】
ＥＬＩＳＡアッセによって、上記の処理をした二重特異性抗体がＣＤ３抗原に結合する能力を測定し、その熱安定性を決定した。その結果、本発明のヒト化抗体ＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰ２の熱安定性は大幅に改善され、その熱変性曲線の中間値Ｔ５０は５８．２８℃に達し、マウス由来抗体ＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰ（Ｔ５０は４５．７１℃）より約１２℃向上しただけでなく、他のヒト化二重特異性抗体ＨＥＲ２－ＯＢ１×Ｃ３１（Ｔ５０は４９．５５℃）よりもほぼ１０℃向上したことが判明した（図５を参照）。これらの結果は、本発明の最適化を実施した後、ＨＥＲ２－ＯＢ１×ＧＸＰ２の熱安定性が著しく向上し、癌を治療するための抗体医薬品としてより適していることが示された。
【0155】
２．二重特異性抗体の長期熱安定性の試験
適量の二重特異性抗体を２０本の１．５ｍＬＥＰチューブに分注し、そのうちの１０本を３７℃で保管し、残りの１０本を４０℃で保管した。２つのグループの実験において、０日目、１日目、３日目、６日目、１０日目、１３日目、１７日目、２０日目、２４日目、２７日目に、それぞれ順次に１つチューブにＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーを追加し、－２０℃で冷凍した。最後に、すべてのサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した。
適量の二重特異性抗体を２０本の１．５ｍＬＥＰチューブに分注し、そのうちの１０本を３７℃で保管し、残りの１０本を４０℃で保管した。２つのグループの実験において、０日目、１日目、３日目、６日目、１０日目、１３日目、１７日目、２０日目、２４日目、２７日目に、それぞれ順次に１つチューブにＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーを追加し、－２０℃で冷凍した。最後に、すべてのサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した。
【0156】
電気泳動の結果は、３７℃または４０℃で２７日間保存した場合でも、いずれの二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２は明らかに分解しなかったことを示した（図６Ａ～６Ｄを参照）。上記の結果は、ＨＥＲ２×ＧＸＰ２二重特異性抗体が優れた長期安定性を有することを示した。
【0157】
３．凍結解凍を繰り返した二重特異性抗体の安定性の試験
適量の二重特異性抗体を４本の１．５ｍＬＥＰチューブに分注し、Ｆ－Ｔ０－３でマークを付け、Ｆ－Ｔ０を４℃で保管し、Ｆ－Ｔ１－３を－２０℃で保管した。Ｆ－Ｔ１－３が固体に凍結した後、Ｆ－Ｔ１－３を急速に解凍させ、Ｆ－Ｔ１を４℃で保管し、Ｆ－Ｔ２－３を－２０℃で保管した。Ｆ－Ｔ２－３が固体に凍結した後、Ｆ－Ｔ２－３を急速に解凍させ、凍結解凍を２回繰り返したＦ－Ｔ２を４℃で保管し、Ｆ－Ｔ３を－２０℃で保管した。Ｆ－Ｔ３を固体に凍結した後、Ｆ－Ｔ３を急速に解凍させ、Ｆ－Ｔ３は凍結解凍を３回繰り返した。最後に、すべてのサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡで分析した。
適量の二重特異性抗体を４本の１．５ｍＬＥＰチューブに分注し、Ｆ－Ｔ０－３でマークを付け、Ｆ－Ｔ０を４℃で保管し、Ｆ－Ｔ１－３を－２０℃で保管した。Ｆ－Ｔ１－３が固体に凍結した後、Ｆ－Ｔ１－３を急速に解凍させ、Ｆ－Ｔ１を４℃で保管し、Ｆ－Ｔ２－３を－２０℃で保管した。Ｆ－Ｔ２－３が固体に凍結した後、Ｆ－Ｔ２－３を急速に解凍させ、凍結解凍を２回繰り返したＦ－Ｔ２を４℃で保管し、Ｆ－Ｔ３を－２０℃で保管した。Ｆ－Ｔ３を固体に凍結した後、Ｆ－Ｔ３を急速に解凍させ、Ｆ－Ｔ３は凍結解凍を３回繰り返した。最後に、すべてのサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡで分析した。
【0158】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、凍結解凍を３回繰り返しても、二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２は明らかな分解が現れず、そのバンドは凍結解凍をしながったサンプルと一致したままであり（図７Ａを参照）、凍結解凍を繰り返した場合の安定性を示した。これと一致して、ＣＤ３およびＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡアッセでは、凍結融解したサンプルおよび凍結融解しながったサンプルの対応する抗原に結合した吸光度はほぼ同じである（図７Ｂおよび７Ｃを参照）。これは、凍結融解を繰り返した場合、二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２は、ＣＤ３抗原およびＨＥＲ２抗原に対する高い結合活性を保持していることを示した。
【0159】
実施例５：サイトカイン放出に対する二重特異性抗体の影響
本発明において、ＰＢＭＣ細胞を使用して、サイトカイン放出に対する二重特異性抗体の影響を測定した。ＰＢＭＣ細胞をＰＢＳで洗浄した後、１６４０培地で細胞密度を２×１０６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、即ち２×１０５細胞／ウェルに加えた。１６４０培地で抗体を２μｇ／ｍＬに希釈した後、１００μＬの抗体希釈液を各ウェルに添加し、即ち、最終的な抗体濃度は１μｇ／ｍＬとなった。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。本実験では、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、サンプル中のサイトカインの濃度を検出した。サイトカインに特異的に結合するモノクローナル捕捉抗体は、ＥＬＩＳＡプレートにコートし、サンプル中のサイトカインが捕捉抗体に結合した。その後、ビオチン化した抗サイトカイン抗体はサイトカインに結合して、捕捉抗体、サイトカインおよびビオチン化した抗体の免疫複合体を形成した。具体的な実験手順は次のとおりである。ＰＢＭＣ細胞を含む上記の９６ウェルプレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を１００μＬ／ウェルで対応するウェルに加え、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温で１２０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルでビオチン化抗体を添加し、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温で６０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルでＨＲＰ－ストレプトアビジンを添加し、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温、遮光下で１０～２０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルで発色剤であるＴＭＢ溶液を添加し、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温、遮光下で２０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルで停止液を加え、均一に混合した後、すぐにマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。実験結果を図８Ａ～８Ｄに示す。
本発明において、ＰＢＭＣ細胞を使用して、サイトカイン放出に対する二重特異性抗体の影響を測定した。ＰＢＭＣ細胞をＰＢＳで洗浄した後、１６４０培地で細胞密度を２×１０６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、即ち２×１０５細胞／ウェルに加えた。１６４０培地で抗体を２μｇ／ｍＬに希釈した後、１００μＬの抗体希釈液を各ウェルに添加し、即ち、最終的な抗体濃度は１μｇ／ｍＬとなった。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。本実験では、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、サンプル中のサイトカインの濃度を検出した。サイトカインに特異的に結合するモノクローナル捕捉抗体は、ＥＬＩＳＡプレートにコートし、サンプル中のサイトカインが捕捉抗体に結合した。その後、ビオチン化した抗サイトカイン抗体はサイトカインに結合して、捕捉抗体、サイトカインおよびビオチン化した抗体の免疫複合体を形成した。具体的な実験手順は次のとおりである。ＰＢＭＣ細胞を含む上記の９６ウェルプレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を１００μＬ／ウェルで対応するウェルに加え、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温で１２０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルでビオチン化抗体を添加し、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温で６０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルでＨＲＰ－ストレプトアビジンを添加し、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温、遮光下で１０～２０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルで発色剤であるＴＭＢ溶液を添加し、パラフィルムで反応ウェルを密封し、室温、遮光下で２０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルで停止液を加え、均一に混合した後、すぐにマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。実験結果を図８Ａ～８Ｄに示す。
【0160】
同量のＨＥＲ２×ＧＸＰ２抗体またはＣＤ３モノクローナル抗体を使用して、異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣと共に一晩インキュベートした。その上清を取って上記のＥＬＩＳＡサンドイッチ法実験を行い、サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－αの放出量を測定することにより、Ｔ細胞が非特異的に活性化され、サイトカインストームが発生するかどうかを確認した。実験結果から、ＨＥＲ２陽性細胞が存在しない場合では、高用量（１μｇ／ｍＬ）のＨＥＲ２×ＧＸＰ２抗体を異なるドナーのＰＢＭＣと共にインキュベートしても、Ｔ細胞が非特異的に活性化する現象は見られなかった。ＣＤ３モノクローナル抗体がＩＬ－６およびＴＮＦ－αを含むサイトカインの高いレベルの放出を引き起こしたことは、本実験で使用されたＴ細胞の機能が正常で、ＣＤ３モノクローナル抗体によって活性化されることを証明した。これに対して、本発明の二重特異性抗モノクローナル抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２では、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αのレベルは、陰性対照群（ＲＰＭＩ１６４０培地）に近い、いずれもＣＤ３モノクローナル抗体群より明らかに低下し；また、異なるドナーのＰＢＭＣを使用しても、同様の結果を得た（図８Ａおよび８Ｂは、それぞれドナー＃１のＩＬ－６およびＴＮＦ－αの結果を示し；図８Ｃおよび８Ｄは、それぞれドナー＃２のＩＬ－６およびＴＮＦ－αの結果を示す）。上記の結果は、本発明のＨＥＲ２×ＧＸＰ２二重抗体を使用してＨＥＲ２陽性腫瘍を臨床的に治療する場合、サイトカインストームの発生を低減でき、その安全性が大幅に改善されることを示す。
【0161】
実施例６：二重特異性抗体が媒介したＰＢＭＣ細胞のＨＥＲ２陽性腫瘍細胞に対する殺傷の測定
１．標的細胞の培養
ＳＫＢＲ細胞（ＨＥＲ２＋＋＋）、Ｎ８７細胞（ＨＥＲ２＋＋）、ＭＣＦ－７細胞（ＨＥＲ２＋）をＴ７５フラスコに置いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。上記の細胞に対応する培地は、ＳＫＢＲ－３：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ８７：１６４０（Ｇｉｂｃｏ）、ＭＣＦ－７：ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）であり、すべての培地は、１０％ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ－Ｉおよび１００Ｕ／ｍＬの２つの抗生物質を含有した。対照である２９３Ｆ細胞（ＨＥＲ２陰性）を、ＯＰＭ ＣＤ０３ ２９３培地で３７℃、５％ＣＯ２細胞培養用シェーカーで培養した。
１．標的細胞の培養
ＳＫＢＲ細胞（ＨＥＲ２＋＋＋）、Ｎ８７細胞（ＨＥＲ２＋＋）、ＭＣＦ－７細胞（ＨＥＲ２＋）をＴ７５フラスコに置いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。上記の細胞に対応する培地は、ＳＫＢＲ－３：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ８７：１６４０（Ｇｉｂｃｏ）、ＭＣＦ－７：ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）であり、すべての培地は、１０％ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ－Ｉおよび１００Ｕ／ｍＬの２つの抗生物質を含有した。対照である２９３Ｆ細胞（ＨＥＲ２陰性）を、ＯＰＭ ＣＤ０３ ２９３培地で３７℃、５％ＣＯ２細胞培養用シェーカーで培養した。
【0162】
２．ＰＢＭＣの分離
静脈から新鮮な全血を採血した後、生理食塩水で２倍に希釈し、リンパ球層の液体を目盛り付き遠心チューブに転移し、スポイトでチューブ壁に沿って希釈した全血を分離液にゆっくりと加え、両者の間の界面をきれいに保持した。水平遠心機を利用して７６０ｇで３０分間遠心した。白い膜の層の位置を観察しながら、キャピラリーピペットで混濁した部分に穏やかに挿入し、スポイトでこの層の細胞を穏やかに吸引して、他の遠心分離管に移した（他の細胞成分との混合を避けるために、余分な層状の液体または血漿吸い取らないようにする）。ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、室温で水平遠心分離した。１回目は４２７ｇで１５分間遠心し、２回目は２７３ｇで１０分間遠心し、３回目は２２９ｇで１０分間遠心することにより、ほとんどの混合した血小板を除去できる。細胞を１６４０培地（１０％ＦＢＳおよび二重抗体を含む）に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
静脈から新鮮な全血を採血した後、生理食塩水で２倍に希釈し、リンパ球層の液体を目盛り付き遠心チューブに転移し、スポイトでチューブ壁に沿って希釈した全血を分離液にゆっくりと加え、両者の間の界面をきれいに保持した。水平遠心機を利用して７６０ｇで３０分間遠心した。白い膜の層の位置を観察しながら、キャピラリーピペットで混濁した部分に穏やかに挿入し、スポイトでこの層の細胞を穏やかに吸引して、他の遠心分離管に移した（他の細胞成分との混合を避けるために、余分な層状の液体または血漿吸い取らないようにする）。ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、室温で水平遠心分離した。１回目は４２７ｇで１５分間遠心し、２回目は２７３ｇで１０分間遠心し、３回目は２２９ｇで１０分間遠心することにより、ほとんどの混合した血小板を除去できる。細胞を１６４０培地（１０％ＦＢＳおよび二重抗体を含む）に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0163】
３．ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害作用）
本研究は、以下の原理に基づいた。即ち、二重特異性抗体は、標的細胞とＴ細胞に結合して、ＨＥＲ２陽性の標的細胞とＴ細胞におけるＣＤ３複合体を同時に認識することにより、腫瘍細胞とＴ細胞を互いに接近させ、Ｔ細胞を活性化して腫瘍細胞を殺傷する。本発明において、ＬＤＨ放出実験で二重特異性抗体の殺傷活性を検出する。即ち、細胞内の乳酸脱水素酵素が上清に放出され、一定量の上清を採取し、反応基質である乳酸および適量の酵素溶液を添加し、乳酸脱水素酵素と乳酸と反応させて、吸光度の値を測定することにより、腫瘍細胞から放出された乳酸脱水素酵素の量を決定できるため、抗体の刺激によるＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷活性を間接的に測定することができる。
本研究は、以下の原理に基づいた。即ち、二重特異性抗体は、標的細胞とＴ細胞に結合して、ＨＥＲ２陽性の標的細胞とＴ細胞におけるＣＤ３複合体を同時に認識することにより、腫瘍細胞とＴ細胞を互いに接近させ、Ｔ細胞を活性化して腫瘍細胞を殺傷する。本発明において、ＬＤＨ放出実験で二重特異性抗体の殺傷活性を検出する。即ち、細胞内の乳酸脱水素酵素が上清に放出され、一定量の上清を採取し、反応基質である乳酸および適量の酵素溶液を添加し、乳酸脱水素酵素と乳酸と反応させて、吸光度の値を測定することにより、腫瘍細胞から放出された乳酸脱水素酵素の量を決定できるため、抗体の刺激によるＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷活性を間接的に測定することができる。
【0164】
トリプシンで標的細胞（ＳＫＢＲ－３細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＭＣＦ－７細胞を含む）を消化して、単一細胞懸濁液を調製し、ここで、２９３Ｆ細胞を培養した際にすでに単一細胞懸濁液であった。５％ＦＢＳ－１６４０培地で細胞濃度を０．２０×１０６／ｍＬに調整し、各ウェルに１．０×１０４細胞を含むように、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。本実験で使用されたエフェクター細胞と標的細胞の比率は１５：１である。実験において、同量の５％ＦＢＳ－１６４０培地を満たした対照ウェルを設置した。
【0165】
５％ＦＢＳ－１６４０培地で抗体を４μｇ／ｍＬに希釈した後、１：４の比率で希釈して、１０個の濃度がそれぞれ４０００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、１５６．２５ｎｇ／ｍＬ、３９．０６ｎｇ／ｍＬ、９．７７ｎｇ／ｍＬ、２．４４ｎｇ／ｍＬ、０．６１ｎｇ／ｍＬ、０．１５ｎｇ／ｍＬである抗体を得た。実験計画に従って、５０μＬ／ウェルで対応する抗体を加え、等量の５％ＦＢＳ－１６４０培地で対照ウェルを満たした。細胞と抗体を均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。１８～２０時間後、乳酸脱水素酵素細胞毒性試験用キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を使用して細胞の殺傷毒性を検出し、二重抗体の殺傷活性を算出した。計算式は次の通りである。
殺傷率％＝（実験値－Ｓ自発）／（Ｍａｘ－Ｓ自発）×１００％
ただし、Ｓ自発＝ＯＤ自発放出孔（標的細胞＋エフェクター細胞）、Ｍａｘ＝ＯＤ最大放出孔（標的細胞）
殺傷率％＝（実験値－Ｓ自発）／（Ｍａｘ－Ｓ自発）×１００％
ただし、Ｓ自発＝ＯＤ自発放出孔（標的細胞＋エフェクター細胞）、Ｍａｘ＝ＯＤ最大放出孔（標的細胞）
【0166】
異なるＨＥＲ２発現レベルの腫瘍細胞株を、健常者由来ＰＢＭＣおよび勾配希釈されたＨＥＲ２×ＧＸＰ２とコインキュベートし、上清の乳酸脱水素酵素の含有量を測定することで、腫瘍細胞の殺傷状況を判断した。結果から、本発明の二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２が、ＨＥＲ２の発現が高い腫瘍細胞に対して非常に優れた殺傷効果を示し、ＨＥＲ２の発現が低い腫瘍細胞に対しても殺傷効果を有するが、ＨＥＲ２陰性細胞に対しては殺傷活性を持たないことが分かった。二重特異性抗体は、インビトロ細胞毒性実験でＨＥＲ２陽性腫瘍細胞に対して優れた殺傷効果を示すが、ＨＥＲ２陰性細胞に対しては殺傷効果がないことを示した。
【0167】
具体的には、ヒト乳癌細胞ＳＫＢＲ－３は、ＨＥＲ２抗原の発現が高い細胞株（ＨＥＲ２＋＋＋）に属する。ＨＥＲ２×ＧＸＰ２は、免疫細胞によるＳＫＢＲ－３の殺傷を効果的に媒介できる。そのＥＣ５０は、他のヒト化抗体ＨＥＲ２×Ｃ３１より５倍低く、従来に臨床的に使用されている乳癌治療薬であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）よりも１００倍以上低いである（図９Ａを参照）。
【0168】
ヒト胃癌細胞ＮＣＩ－Ｎ８７（ＨＥＲ２＋＋）のＨＥＲ２の発現量は、ＳＫＢＲ－３細胞よりもわずかに低いである。ここで、ＨＥＲ２×ＧＸＰ２のＥＣ５０は３．９５２×１０－４μｇ／ｍＬで、対照群であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）およびＨＥＲ２×Ｃ３１（それぞれ２．１８２×１０－２μｇ／ｍＬおよび３．６４７×１０－３μｇ／ｍＬ）（図９Ｂを参照）よりも明らかに低下し、その傾向はＳＫＢＲ－３細胞における結果と一致した。
【0169】
ＭＣＦ－７細胞および２９３Ｆ細胞（ＨＥＲ２＋／－、正常細胞に相当する）などのＨＥＲ２抗原の発現が低い細胞株またはＨＥＲ２陰性の細胞株は、二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２による殺傷に対して敏感ではなく、明らかな殺傷効果はない（図９Ｃおよび図９Ｄを参照）。
【0170】
以上のことから、ＳＫＢＲ－３やＮＣＩ－Ｎ８７細胞などのＨＥＲ２が高発現する腫瘍細胞は、抗ＨＥＲ２×ＣＤ３の二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２に非常に敏感であり、低濃度のＨＥＲ２×ＧＸＰ２を使用すると、非常に良好な殺傷効果が得られ；さらに、本明細書で開示される二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２のＳＫＢＲ－３やＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対するＥＣ５０は、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）およびＨＥＲ２×Ｃ３１に比べて明らかに低く、より低濃度のＨＥＲ２×ＧＸＰ２を使用することで、高濃度のハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）と類似した殺害効果が得られる。
【0171】
さらに、二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２は、ＭＣＦ－７や２９３Ｆ細胞などのＨＥＲ２が低い発現する細胞またはＨＥＲ２陰性細胞に対して明きらかな殺傷効果を示さない。ＨＥＲ２×ＧＸＰ２によるＳＫＢＲ－３やＮＣＩ－Ｎ８７細胞の殺傷効果を総合すると、ＨＥＲ２×ＧＸＰ２は、正常細胞に損傷を与えることなく、免疫細胞を刺激してＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を特異的に殺傷できることが示される。
【0172】
実施例７：動物腫瘍モデルにおける腫瘍に対する二重特異性抗体のインビボでの殺傷効果の分析
２４匹のマウスをランダムで４つの群に分け、各群に６匹ずつであった。その後、対数増殖期にあるＳＫＯＶ－３細胞（ＨＥＲ２陽性の卵巣癌細胞、Ｈｅｒ２発現量はＨｅｒ２＋＋とＨｅｒ２＋＋＋の間）を収集し、遠心分離してＳＫＯＶ－３細胞の細胞濃度を５×１０７細胞／ｍＬに調整し、ＰＢＭＣ細胞濃度を５×１０７細胞／ｍＬに調整した。ＳＫＯＶ－３細胞を等量のＰＢＭＣと混合した後、マウスの右腋窩に０．２ｍＬ／匹で皮下接種した。腫瘍細胞を接種した後、１日目、３日目、５日目および８日目に、低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）、中用量（１ｍｇ／ｋｇ）、高用量（５ｍｇ／ｋｇ）で本発明の二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２をそれぞれ１回投与した。なお、陰性対照群に等量の滅菌生理食塩水を与えた。群分けの際（即ち、最初の投与前）に１回、投与した後、毎週に２回、安楽死の前に１回、腫瘍の長径と短径を測定して記録し、腫瘍体積を計算し、腫瘍体積によって腫瘍成長曲線を作成し、各群の間の腫瘍成長曲線の違いを比較した。腫瘍体積は、次の式に従って計算した。Ｖ＝１／２×長径×短径２。図１０は、腫瘍体積の時間に対する変化の曲線を示す。
２４匹のマウスをランダムで４つの群に分け、各群に６匹ずつであった。その後、対数増殖期にあるＳＫＯＶ－３細胞（ＨＥＲ２陽性の卵巣癌細胞、Ｈｅｒ２発現量はＨｅｒ２＋＋とＨｅｒ２＋＋＋の間）を収集し、遠心分離してＳＫＯＶ－３細胞の細胞濃度を５×１０７細胞／ｍＬに調整し、ＰＢＭＣ細胞濃度を５×１０７細胞／ｍＬに調整した。ＳＫＯＶ－３細胞を等量のＰＢＭＣと混合した後、マウスの右腋窩に０．２ｍＬ／匹で皮下接種した。腫瘍細胞を接種した後、１日目、３日目、５日目および８日目に、低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）、中用量（１ｍｇ／ｋｇ）、高用量（５ｍｇ／ｋｇ）で本発明の二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２をそれぞれ１回投与した。なお、陰性対照群に等量の滅菌生理食塩水を与えた。群分けの際（即ち、最初の投与前）に１回、投与した後、毎週に２回、安楽死の前に１回、腫瘍の長径と短径を測定して記録し、腫瘍体積を計算し、腫瘍体積によって腫瘍成長曲線を作成し、各群の間の腫瘍成長曲線の違いを比較した。腫瘍体積は、次の式に従って計算した。Ｖ＝１／２×長径×短径２。図１０は、腫瘍体積の時間に対する変化の曲線を示す。
【0173】
上記の結果は、低用量、中用量および高用量で投与された本発明の二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２がいずれもマウス体内の腫瘍増殖を効果的に阻害したことを示す。上記の結果は、本発明の二重特異性抗体ＨＥＲ２×ＧＸＰ２が、インビトロで免疫細胞を媒介してＨＥＲ２陽性腫瘍細胞を標的として効果的に殺傷するだけでなく、インビボでもＨＥＲ２陽性腫瘍の成長を効果的に阻害できることを証明する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】