ホーム > 特許ランキング > 警察庁科学警察研究所長
▶ 警察庁科学警察研究所長の特許一覧 ▶ 株式会社カネカの特許一覧
特許7068468大麻草ＤＮＡを検出するためのプライマー混合物、キット及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-06
(45)【発行日】2022-05-16
(54)【発明の名称】大麻草ＤＮＡを検出するためのプライマー混合物、キット及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220509BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20220509BHJP
C12Q 1/6895 20180101ALI20220509BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20220509BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20220509BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6895 Z
C12M1/34 B
C12N15/29
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020535895
(86)(22)【出願日】2019-08-09
(86)【国際出願番号】 JP2019031541
(87)【国際公開番号】W WO2020032222
(87)【国際公開日】2020-02-13
【審査請求日】2021-01-26
(31)【優先権主張番号】P 2018150543
(32)【優先日】2018-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】592083915
【氏名又は名称】警察庁科学警察研究所長
(73)【特許権者】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山室 匡史
(72)【発明者】
【氏名】宮本 重彦
【審査官】小金井 悟
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／０７０６１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】山室匡史ほか，核酸クロマト型チップを用いた大麻DNA検出系の開発と性能評価，日本薬学会年会要旨集，2017年，vol.137，p.217(26PB-pm101)
【文献】BLATTNER, FR.，Direct amplification of the entire ITS region from poorly preserved plant material using recombinant，BioTechniques，1999年，vol.27, no.6，p.1180-1186
【文献】室友紀ほか，葉緑体DNAのtrnL領域の解析による大麻草の識別，日本法科学技術学会誌，2010年，vol.15, no.2，p.143-149
【文献】Database GenBank [online], Accession No. KR779995, <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KR779995> 15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１Ａ）配列番号１の塩基配列、或いは配列番号１の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチド、或いは
（１Ｂ）配列番号１の塩基配列、或いは
配列番号１の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマーと、
（２Ａ）配列番号２の塩基配列、或いは
配列番号２の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチド、或いは
（２Ｂ）配列番号２の塩基配列、或いは
配列番号２の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーと
を含むＩＴＳ１領域増幅用プライマー対；
（５Ａ）配列番号５の塩基配列、或いは
配列番号５の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチド、或いは
（５Ｂ）配列番号５の塩基配列、或いは
配列番号５の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマーと、
（８Ａ）配列番号８の塩基配列、或いは
配列番号８の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチド、或いは
（８Ｂ）配列番号８の塩基配列、或いは
配列番号８の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーと
を含むｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対；
並びに、
（９Ａ）配列番号９の塩基配列、或いは
配列番号９の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチド、或いは
（９Ｂ）配列番号９の塩基配列、或いは
配列番号９の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーと、
（１０Ａ）配列番号１０の塩基配列、或いは
配列番号１０の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチド、或いは
（１０Ｂ）配列番号１０の塩基配列、或いは
配列番号１０の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列
のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーと
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対
を含むプライマー混合物。
【請求項2】
前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第１の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第１の部分と結合可能なタグである第１の結合部を更に含み、前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第２の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第２の部分と結合可能なタグである第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第３の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第３の部分と結合可能なタグである第３の結合部を更に含む、
請求項１に記載のプライマー混合物。
【請求項3】
前記（１Ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（１Ｂ）のポリヌクレオチドが、
配列番号１の塩基配列のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（２Ａ）のポリヌクレオチドが、
配列番号２の塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（２Ｂ）のポリヌクレオチドが、
配列番号２の塩基配列のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（５Ａ）のポリヌクレオチドが、
配列番号５の塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（５Ｂ）のポリヌクレオチドが、
配列番号５の塩基配列のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（８Ａ）のポリヌクレオチドが、
配列番号８の塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（８Ｂ）のポリヌクレオチドが、
配列番号８の塩基配列のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（９Ａ）のポリヌクレオチドが、
配列番号９の塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（９Ｂ）のポリヌクレオチドが、
配列番号９の塩基配列のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（１０Ａ）のポリヌクレオチドが、
配列番号１０の塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドであり、
前記（１０Ｂ）のポリヌクレオチドが、
配列番号１０の塩基配列のうち３’末端から連続した１５塩基以上の部分塩基配列
を３’末端に含むポリヌクレオチドである、
請求項１又は２に記載のプライマー混合物。
【請求項4】
検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別する方法であって、検体から分離したＤＮＡ、及び、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマー混合物を含む反応系中で核酸増幅反応を行う第１工程、並びに、
前記核酸増幅反応による増幅産物を確認する第２工程、
を含み、
前記第２工程において、前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物、前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物、及び、前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物が、全て確認された場合に、前記検体を、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であると判別する方法。
【請求項5】
前記プライマー混合物が、請求項２に記載のプライマー混合物であり、前記第２工程が、前記核酸増幅反応の生成物を、前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体に接触させ、前記固相担体の前記第１の部分において、前記第１の標識部を指標として前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認し、前記固相担体の前記第２の部分において、前記第２の標識部を指標として前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認し、前記固相担体の前記第３の部分において、前記第３の標識部を指標として前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部が、それぞれ、標識物質と結合可能なタグであり、前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部の前記タグに、前記標識物質を結合させる標識工程を更に含む
請求項５に記載の方法。
【請求項7】
検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別するためのキットであって、請求項２に記載のプライマー混合物、並びに、
前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体を備える核酸検出デバイス
を含むキット。
【請求項8】
前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部が、それぞれ、標識物質と結合可能なタグであり、前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記核酸検出デバイスが、前記標識物質を保持する標識物質保持部を更に備える、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、大麻草由来のＤＮＡを判別するために用いることができるプライマー混合物に関する。
【0002】
本発明はまた、前記プライマー混合物を用いて核酸増幅反応を行うことを含む、検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別する方法に関する。
【0003】
本発明はまた、前記プライマー混合物を含む、検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別するためのキットに関する。
【背景技術】
【0004】
大麻草（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）は、６０種類以上のカンナビノイドと総称される特有の成分を含む。カンナビノイドの１つであるテトラヒドロカンナビノールは幻覚などの薬理作用を有しており、日本では大麻取締法により大麻の所持や栽培が禁止されている。
【0005】
犯罪捜査における大麻の鑑定は、形態学的検査と含有成分検査の併用によって行われているが、近年、大麻草に特徴的なＤＮＡ配列情報を利用した分子生物学的手法による検査が注目されている。
【0006】
非特許文献１では、大麻草とその近縁種であるホップが共通して有する葉緑体ＤＮＡのｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ領域を増幅するプライマーセットを開示している。このプライマーセットによるＰＣＲ増幅産物は、鋳型として大麻草ＤＮＡが含まれる場合の断片長と、鋳型としてホップＤＮＡが含まれる場合の断片長とが異なるため、大麻草とホップとを識別することが可能である。
【0007】
非特許文献２では、大麻草の葉緑体ＤＮＡのｔｒｎＬ領域のイントロンに設計した大麻草特異的プライマーが開示されている。
【0008】
非特許文献３では、大麻草の葉緑体ＤＮＡのｔｒｎＬ領域とｔｒｎＦ領域との間の領域に大麻草に特異的な配列が存在すること、及び、この領域にプライマーを設計したことが開示されている。
【0009】
非特許文献４では、大麻草には、Δ－９－テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）含量の高い薬物種と、ＴＨＣＡ含量の低い繊維種があることが開示されている。非特許文献４では更に、薬物種の大麻草が有するＴＨＣＡ合成酵素を特定し、薬物種を特異的に検出するための、ＴＨＣＡ合成酵素のＰＣＲマーカーを特定したことが開示されている。
【0010】
非特許文献５では、大麻クッキー等の大麻加工品からＤＮＡを抽出し、大麻草特異的プライマーを用いてＰＣＲを行うことで、大麻加工品中においても大麻草の識別が可能であることが開示されている。また、非特許文献５では、小麦と大麻草との葉緑体ＤＮＡの共通領域を増幅するユニバーサルプライマーが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【文献】関税中央分析所報, 56号, 2016, p41-47
【文献】法科学技術、15(2), 2010, p143-149
【文献】Forensic Science International, 91, 1997, p71-76
【文献】Forensic Science International, 159, 2006, p132-140
【文献】関税中央分析所報, 54号, 2014, p19-24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
上記の通り、大麻草のＤＮＡに特異的な領域を増幅するための核酸増幅用プライマー対を用いて大麻草を判別する方法が従来から開発されている。しかし、大麻草のＤＮＡに特異的な１つの領域の増幅の有無を確認するだけでは、大麻草と類似したＤＮＡ配列を有する近縁種を、大麻草と判定してしまう偽陽性判定の可能性が高い。
【0013】
本発明は、大麻草由来のＤＮＡをより高い精度で判別するために用いることができるプライマー混合物、並びに、それを用いた判別方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、１つの反応系内で複数のプライマー対を用いてＤＮＡの複数の領域の増幅を行うマルチプレックス法のためのプライマー混合物の開発を試みたところ意図する核酸増幅が行われない場合があることを見出した。そこで更に検討した結果、本発明者らは、本発明の所定のプライマー混合物を用いた場合に、大麻草の近縁種であるホップとの交差がなく、大麻草由来のＤＮＡを高い精度で判別することができることを見出した。具体的には本発明は以下の発明を包含する。
【0015】
（１）（１Ａ）配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（１Ｂ）配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマーと、
（２Ａ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（２Ｂ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーと
を含むＩＴＳ１領域増幅用プライマー対；
（５Ａ）配列番号５の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（５Ｂ）配列番号５の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマーと、
（８Ａ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（８Ｂ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーと
を含むｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対；
並びに、
（９Ａ）配列番号９の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（９Ｂ）配列番号９の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーと、
（１０Ａ）配列番号１０の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（１０Ｂ）配列番号１０の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーと
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対
を含むプライマー混合物。
（１Ｂ）配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマーと、
（２Ａ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（２Ｂ）配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーと
を含むＩＴＳ１領域増幅用プライマー対；
（５Ａ）配列番号５の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（５Ｂ）配列番号５の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマーと、
（８Ａ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（８Ｂ）配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーと
を含むｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対；
並びに、
（９Ａ）配列番号９の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（９Ｂ）配列番号９の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーと、
（１０Ａ）配列番号１０の塩基配列と相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド、又は
（１０Ｂ）配列番号１０の塩基配列と相同な塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上の部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチド
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーと
を含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対
を含むプライマー混合物。
【0016】
（２）前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第１の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第１の部分と結合可能なタグである第１の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第２の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第２の部分と結合可能なタグである第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第３の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第３の部分と結合可能なタグである第３の結合部を更に含む、
（１）に記載のプライマー混合物。
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第２の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第２の部分と結合可能なタグである第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第３の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第３の部分と結合可能なタグである第３の結合部を更に含む、
（１）に記載のプライマー混合物。
【0017】
（３）検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別する方法であって、
検体から分離したＤＮＡ、及び、（１）又は（２）に記載のプライマー混合物を含む反応系中で核酸増幅反応を行う第１工程、並びに、
前記核酸増幅反応による増幅産物を確認する第２工程、
を含み、
前記第２工程において、前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物、前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物、及び、前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物が、全て確認された場合に、前記検体を、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であると判別する方法。
検体から分離したＤＮＡ、及び、（１）又は（２）に記載のプライマー混合物を含む反応系中で核酸増幅反応を行う第１工程、並びに、
前記核酸増幅反応による増幅産物を確認する第２工程、
を含み、
前記第２工程において、前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物、前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物、及び、前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物が、全て確認された場合に、前記検体を、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であると判別する方法。
【0018】
（４）前記プライマー混合物が、（２）に記載のプライマー混合物であり、
前記第２工程が、前記核酸増幅反応の生成物を、前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体に接触させ、前記固相担体の前記第１の部分において、前記第１の標識部を指標として前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認し、前記固相担体の前記第２の部分において、前記第２の標識部を指標として前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認し、前記固相担体の前記第３の部分において、前記第３の標識部を指標として前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認することを含む、（３）に記載の方法。
前記第２工程が、前記核酸増幅反応の生成物を、前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体に接触させ、前記固相担体の前記第１の部分において、前記第１の標識部を指標として前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認し、前記固相担体の前記第２の部分において、前記第２の標識部を指標として前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認し、前記固相担体の前記第３の部分において、前記第３の標識部を指標として前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物を確認することを含む、（３）に記載の方法。
【0019】
（５）前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部が、それぞれ、標識物質と結合可能なタグであり、
前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部の前記タグに、前記標識物質を結合させる標識工程を更に含む
（４）に記載の方法。
前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部の前記タグに、前記標識物質を結合させる標識工程を更に含む
（４）に記載の方法。
【0020】
（６）検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別するためのキットであって、
（２）に記載のプライマー混合物、並びに、
前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体を備える核酸検出デバイス
を含むキット。
（７）前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部が、それぞれ、標識物質と結合可能なタグであり、
前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、（６）に記載のキット。
（８）前記核酸検出デバイスが、前記標識物質を保持する標識物質保持部を更に備える、（７）に記載のキット。
（２）に記載のプライマー混合物、並びに、
前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体を備える核酸検出デバイス
を含むキット。
（７）前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部が、それぞれ、標識物質と結合可能なタグであり、
前記第１の標識部、前記第２の標識部、及び、前記第３の標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、（６）に記載のキット。
（８）前記核酸検出デバイスが、前記標識物質を保持する標識物質保持部を更に備える、（７）に記載のキット。
【0021】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－１５０５４３号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【0022】
本発明は、近縁種の偽陽性判定リスクが低減された、大麻草由来のＤＮＡを判別するために用いることができるプライマー混合物、並びに、それを用いた判別方法及びキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図3A】図３Ａは、第１の増幅産物に含まれるＤＮＡタグと相補的な第１のＤＮＡ断片が固定された第１の部分６－１と、第２の増幅産物に含まれるＤＮＡタグと相補的な第２のＤＮＡ断片が固定された第２の部分６－２とを備えるメンブレン１（固相担体）の平面図である。
【図3B】図３Ｂは、第１の増幅産物に含まれるＤＮＡタグと相補的な第１のＤＮＡ断片が固定された第１の部分６－１と、第２の増幅産物に含まれるＤＮＡタグと相補的な第２のＤＮＡ断片が固定された第２の部分６－２と、第３の増幅産物に含まれるＤＮＡタグと相補的な第３のＤＮＡ断片が固定された第３の部分６－３とを備えるメンブレン１（固相担体）の平面図である。
【図4】図４はクロマト型核酸検出デバイス１０の模式図を示す。図４（Ａ）はクロマト型核酸検出デバイス１０の平面図であり、図４（Ｂ）はクロマト型核酸検出デバイス１０の断面図である。１：メンブレン（固相担体）、２：コンジュゲートパッド（標識物質保持部）、３：サンプルパッド（反応系受容部）、４：吸収パッド、５：基材。
【図5】図５は、大麻草のｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ遺伝子の塩基配列（配列番号１５）における、フォワードプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｆ（配列番号９）とリバースプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｒｖ（配列番号１０）の設計位置を示す。
【図7】図７は、実施例２において、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）を用いたシングルＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果、並びに、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いたマルチプレックスＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
＜用語＞
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドとしては、任意の位置のＴをＵに置換して合成したＵを含むＤＮＡや、任意の位置のＵをＴに置換して合成したＴを含むＲＮＡも使用することができる。ポリヌクレオチドはイノシン（Ｉ）等の修飾ヌクレオチドを一部に含んでいてもよい。ＲＮＡにおいては、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と読み替えることができる。
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドとしては、任意の位置のＴをＵに置換して合成したＵを含むＤＮＡや、任意の位置のＵをＴに置換して合成したＴを含むＲＮＡも使用することができる。ポリヌクレオチドはイノシン（Ｉ）等の修飾ヌクレオチドを一部に含んでいてもよい。ＲＮＡにおいては、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と読み替えることができる。
【0025】
ポリヌクレオチドは一本鎖として存在していてもよいし、二本鎖として存在していてもよい。ポリヌクレオチドが二本鎖として存在する場合は、少なくとも一方の鎖が、以下に規定する所定の特徴を備えるポリヌクレオチドであればよい。
【0026】
ポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造してもよいし、受託合成サービスを利用して製造してもよい。
【0027】
本発明において「塩基配列Ｘと相同な塩基配列Ｙ」、或いは、「塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが相同である」、というとき、塩基配列Ｘの相補配列からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドとが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせである限り、塩基配列ＸとＹとが同一であってもよいし、塩基配列ＸとＹとが部分的に異なっていてもよい。例えば、塩基配列Ｘの相補配列からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドとが、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、または３０ヌクレオチド中に１ミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。典型的には、塩基配列Ｘと「相同な」塩基配列Ｙというとき、塩基配列ＸとＹとが以下の関係のいずれかを満たすことを指す。
【0028】
（Ａ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと同一の塩基配列である、或いは、塩基配列Ｘにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと７０％以上の同一性を有する塩基配列である。
（Ｃ）塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドが、配列番号Ｘと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。
（Ｄ）塩基配列Ｘと塩基配列Ｙの一方における任意の位置のチミン（Ｔ）が、他方におけるウラシル（Ｕ）に置換されている。
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと７０％以上の同一性を有する塩基配列である。
（Ｃ）塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドが、配列番号Ｘと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。
（Ｄ）塩基配列Ｘと塩基配列Ｙの一方における任意の位置のチミン（Ｔ）が、他方におけるウラシル（Ｕ）に置換されている。
【0029】
前記（Ａ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。前記（Ａ）において、好ましくは、塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと同一の塩基配列である。
【0030】
前記（Ｂ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ、及びＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５，３３８９－３４０２，１９７７及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，１９９０を参照されたい。
【0031】
前記（Ｂ）において、同一性はより好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
【0032】
前記（Ｃ）において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，４ｔｈ Ｅｄ（２０１２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５～５００ｍＭ、好ましくは２５～３００ｍＭであり、温度が４０～６８℃、好ましくは４０～６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１～７×ＳＳＣ、０．０２～３％ ＳＤＳ、温度４０～６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１～２×ＳＳＣ、０．１～０．３％ ＳＤＳ、温度５０～６５℃で行うことができる。
【0033】
＜プライマー混合物＞
本発明に係るプライマー混合物は、ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対と、ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対とを含むことを特徴とする。
本発明に係るプライマー混合物は、ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対と、ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対とを含むことを特徴とする。
【0034】
ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対は、緑色植物ＤＮＡに共通するＩＴＳ１領域を増幅するユニバーサルプライマーである。
【0035】
ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対は、大麻草の葉緑体ＤＮＡに特異的なｔｒｎＬ領域を増幅するためのプライマーである。
【0036】
ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対は、大麻草の葉緑体ＤＮＡに特異的なｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域を増幅するためのプライマーである。
【0037】
検体から分離したＤＮＡ、及び、本発明に係るプライマー混合物を含む反応系中でマルチプレックス核酸増幅反応を行う。前記核酸増幅反応により、ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物が確認された場合、前記検体が緑色植物に由来するＤＮＡを含んでおり、且つ、核酸増幅反応が正常に行われたと判断することができる。更に、前記核酸増幅反応により、ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物とが両方とも確認された場合、前記検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であると判別することができる。緑色植物のＤＮＡに共通した領域の増幅と、大麻草のＤＮＡに特異的な２つの領域の増幅を確認することで、偽陽性判定のリスクを低減することができ、大麻草と、大麻草の近縁種であるホップとを交差することなく判別することができる。以下に、各プライマー対の具体的な実施形態について説明する。
【0038】
＜ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対＞
本発明で用いるＩＴＳ１領域増幅用プライマー対は、
前記（１Ａ）又は（１Ｂ）のポリヌクレオチドを含むＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマーと、
前記（２Ａ）又は（２Ｂ）のポリヌクレオチドを含むＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーとを含む。
本発明で用いるＩＴＳ１領域増幅用プライマー対は、
前記（１Ａ）又は（１Ｂ）のポリヌクレオチドを含むＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマーと、
前記（２Ａ）又は（２Ｂ）のポリヌクレオチドを含むＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーとを含む。
【0039】
前記（１Ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列１Ａとする。この塩基配列１Ａは、配列番号１の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号１の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列１Ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【0040】
塩基配列１Ａが配列番号１の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列１Ａは、配列番号１の塩基配列、或いは、配列番号１の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号１の塩基配列、或いは、配列番号１の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列１Ａが配列番号１の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列１Ａは、配列番号１の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号１の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１３の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号１の塩基配列と、配列番号１の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【0041】
前記（１Ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１Ａを含んでいればよく、塩基配列１Ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１Ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（１Ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１３に示す大麻草のＤＮＡのＩＴＳ１領域の塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列１Ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（１Ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列１Ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0042】
前記（１Ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列１Ａ）のうち３’末端から連続した５塩基以上の塩基からなる部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドである。前記（１Ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列１Ａのうち３’末端から連続した１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【0043】
前記（１Ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１Ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１Ｂ）のポリヌクレオチドは、好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（１Ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列１Ａの前記部分塩基配列からなり、より好ましくは配列番号１に示す塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0044】
前記（２Ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列２Ａとする。この塩基配列２Ａは、配列番号２の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号２の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列２Ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【0045】
塩基配列２Ａが配列番号２の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列２Ａは、配列番号２の塩基配列、或いは、配列番号２の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号２の塩基配列、或いは、配列番号２の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列２Ａが配列番号２の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列２Ａは、配列番号２の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号２の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１３に示す大麻草のＤＮＡのＩＴＳ１領域の塩基配列に対する相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号２の塩基配列と、配列番号２の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【0046】
前記（２Ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列２Ａを含んでいればよく、塩基配列２Ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（２Ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（２Ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１３に示す大麻草のＤＮＡのＩＴＳ１領域の塩基配列に対する相補塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列２Ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（２Ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列２Ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0047】
前記（２Ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列２Ａ）のうち３’末端から連続した５塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含むポリヌクレオチドである。前記（２Ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列２Ａのうち３’末端から連続した１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【0048】
前記（２Ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列２Ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（２Ｂ）のポリヌクレオチドは好ましくは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（２Ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列２Ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号２に示す塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0049】
ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマーは、前記（１Ａ）又は（１Ｂ）のポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する第１の標識部又は第１の結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと第１の標識部又は第１の結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマーにおいて、第１の標識部及び第１の結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【0050】
ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーは、前記（２Ａ）又は（２Ｂ）のポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する第１の標識部又は第１の結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと第１の標識部又は第１の結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーにおいて、第１の標識部及び第１の結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【0051】
ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及びＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの少なくとも一方が、第１の標識部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、第１の標識部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物の検出が容易である。
【0052】
ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及びＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの少なくとも一方が、第１の結合部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、第１の結合部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物を固相担体に固定することが可能であり、増幅産物の検出が容易である。
【0053】
＜ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対＞
本発明で用いるｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対は、
前記（５Ａ）又は（５Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマーと、
前記（８Ａ）又は（８Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーとを含む。
本発明で用いるｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対は、
前記（５Ａ）又は（５Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマーと、
前記（８Ａ）又は（８Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーとを含む。
【0054】
前記（５Ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号５の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列５Ａとする。この塩基配列５Ａは、配列番号５の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号５の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列５Ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【0055】
塩基配列５Ａが配列番号５の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列５Ａは、配列番号５の塩基配列、或いは、配列番号５の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号５の塩基配列、或いは、配列番号５の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列５Ａが配列番号５の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列５Ａは、配列番号５の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号５の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１４の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号５の塩基配列と、配列番号５の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【0056】
前記（５Ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列５Ａを含んでいればよく、塩基配列５Ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（５Ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（５Ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１４に示す大麻草のＤＮＡのｔｒｎＬ領域の塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列５Ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（５Ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列５Ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0057】
前記（５Ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号５の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列５Ａ）のうち３’末端から連続した５塩基以上の塩基からなる部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドである。前記（５Ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列５Ａのうち３’末端から連続した１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【0058】
前記（５Ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列５Ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（５Ｂ）のポリヌクレオチドは、好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（５Ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列５Ａの前記部分塩基配列からなり、より好ましくは配列番号５に示す塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0059】
前記（８Ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列８Ａとする。この塩基配列８Ａは、配列番号８の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号８の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列８Ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【0060】
塩基配列８Ａが配列番号８の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列８Ａは、配列番号８の塩基配列、或いは、配列番号８の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号８の塩基配列、或いは、配列番号８の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列８Ａが配列番号８の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列８Ａは、配列番号８の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号８の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１４に示す大麻草のＤＮＡのｔｒｎＬ領域の塩基配列に対する相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号８の塩基配列と、配列番号８の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【0061】
前記（８Ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列８Ａを含んでいればよく、塩基配列８Ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（８Ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（８Ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１４に示す大麻草のＤＮＡのｔｒｎＬ領域の塩基配列に対する相補塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列８Ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（８Ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列８Ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0062】
前記（８Ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号８の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列８Ａ）のうち３’末端から連続した５塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含むポリヌクレオチドである。前記（８Ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列８Ａのうち３’末端から連続した１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【0063】
前記（８Ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列８Ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（８Ｂ）のポリヌクレオチドは好ましくは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（８Ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列８Ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号８に示す塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0064】
ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマーは、前記（５Ａ）又は（５Ｂ）のポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する第２の標識部又は第２の結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと第２の標識部又は第２の結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマーにおいて、第２の標識部及び第２の結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【0065】
ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーは、前記（８Ａ）又は（８Ｂ）のポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する第２の標識部又は第２の結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと第２の標識部又は第２の結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーにおいて、第２の標識部及び第２の結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【0066】
ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及びｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの少なくとも一方が、第２の標識部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、第２の標識部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物の検出が容易である。
【0067】
ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及びｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの少なくとも一方が、第２の結合部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、第２の結合部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物を固相担体に固定することが可能であり、増幅産物の検出が容易である。
【0068】
＜ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対＞
本発明で用いるｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対は、
前記（９Ａ）又は（９Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーと、
前記（１０Ａ）又は（１０Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーとを含む。
本発明で用いるｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対は、
前記（９Ａ）又は（９Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーと、
前記（１０Ａ）又は（１０Ｂ）のポリヌクレオチドを含むｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーとを含む。
【0069】
前記（９Ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号９の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列９Ａとする。この塩基配列９Ａは、配列番号９の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号９の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列９Ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【0070】
塩基配列９Ａが配列番号９の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列９Ａは、配列番号９の塩基配列、或いは、配列番号９の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号９の塩基配列、或いは、配列番号９の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列９Ａが配列番号９の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合、より好ましくは、塩基配列９Ａは、配列番号９の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号９の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１５の塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号９の塩基配列と、配列番号９の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【0071】
前記（９Ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列９Ａを含んでいればよく、塩基配列９Ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（９Ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（９Ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１５に示す大麻草のＤＮＡのｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域の塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列９Ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（９Ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列９Ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0072】
前記（９Ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号９の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列９Ａ）のうち３’末端から連続した５塩基以上の塩基からなる部分塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドである。前記（９Ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列９Ａのうち３’末端から連続した１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【0073】
前記（９Ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列９Ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（９Ｂ）のポリヌクレオチドは、好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（９Ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列９Ａの前記部分塩基配列からなり、より好ましくは配列番号９に示す塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0074】
前記（１０Ａ）のポリヌクレオチドにおける、配列番号１０の塩基配列と相同な塩基配列を塩基配列１０Ａとする。この塩基配列１０Ａは、配列番号１０の塩基配列と、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）の関係を満たす（配列番号１０の塩基配列が塩基配列Ｘ、塩基配列１０Ａが塩基配列Ｙに相当する）。
【0075】
塩基配列１０Ａが配列番号１０の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列１０Ａは、配列番号１０の塩基配列、或いは、配列番号１０の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方から合計で１若しくは数個の塩基が欠失した配列、特に好ましくは配列番号１０の塩基配列、或いは、配列番号１０の塩基配列において５’末端のみから１若しくは数個の塩基が欠失した配列である。また、塩基配列１０Ａが配列番号１０の塩基配列と前記（Ａ）の関係を満たす場合は、より好ましくは、塩基配列１０Ａは、配列番号１０の塩基配列において５’末端及び３’末端の一方又は両方に合計で１若しくは数個の塩基が付加した配列、特に好ましくは配列番号１０の塩基配列において５’末端のみに１若しくは数個の塩基が付加した配列であり、特に好ましくは、配列番号１５に示す大麻草のＤＮＡのｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域の塩基配列に対する相補塩基配列の部分塩基配列であって、配列番号１０の塩基配列と、配列番号１０の塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方に付加した合計１若しくは数個の塩基とからなる前記部分塩基配列である。
【0076】
前記（１０Ａ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１０Ａを含んでいればよく、塩基配列１０Ａの５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１０Ａ）のポリヌクレオチドは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下のポリヌクレオチドである。前記（１０Ａ）のポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、配列番号１５に示す大麻草のＤＮＡのｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領の塩基配列に対する相補塩基配列のうち連続した４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下の部分塩基配列であって、塩基配列１０Ａを３’末端に含む部分塩基配列が挙げられる。より好ましくは前記（１０Ａ）のポリヌクレオチドは塩基配列１０Ａの塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0077】
前記（１０Ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号１０の塩基配列と相同な塩基配列（すなわち前記の塩基配列１０Ａ）のうち３’末端から連続した５塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含むポリヌクレオチドである。前記（１０Ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、より好ましくは、塩基配列１０Ａのうち３’末端から連続した１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分の配列を３’末端に含む。
【0078】
前記（１０Ｂ）のポリヌクレオチドは３’末端に塩基配列１０Ａの前記の部分配列を含んでいればよく、該部分配列の５’末端側には更に他の塩基配列が付加されていてもよい。前記（１０Ｂ）のポリヌクレオチドは好ましくは４０塩基以下、好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下のポリヌクレオチドである。より好ましくは前記（１０Ｂ）のポリヌクレオチドは塩基配列１０Ａの前記部分塩基配列からなり、最も好ましくは配列番号１０に示す塩基配列のうち３’末端から連続した５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上の塩基からなる部分塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【0079】
ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーは、前記（９Ａ）又は（９Ｂ）のポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する第３の標識部又は第３の結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと第３の標識部又は第３の結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーにおいて、第３の標識部及び第３の結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【0080】
ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーは、前記（１０Ａ）又は（１０Ｂ）のポリヌクレオチドのみからなっていてもよいし、後述する第３の標識部又は第３の結合部を更に含んでもよい。前記ポリヌクレオチドと第３の標識部又は第３の結合部とは、後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結することができる。ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーにおいて、第３の標識部及び第３の結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的領域を含むポリヌクレオチド又はその相補鎖とのアニーリング及び核酸増幅反応における伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。
【0081】
ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及びｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの少なくとも一方が、第３の標識部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、第３の標識部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物の検出が容易である。
【0082】
ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及びｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの少なくとも一方が、第３の結合部を含む場合、これを用いた核酸増幅反応では、第３の結合部を含む増幅産物が得られるため、増幅産物を固相担体に固定することが可能であり、増幅産物の検出が容易である。
【0083】
＜プライマー混合物の特に好ましい実施形態＞
本発明のプライマー混合物の特に好ましい実施形態では、
前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第１の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第１の部分と結合可能なタグである第１の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第２の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第２の部分と結合可能なタグである第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第３の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第３の部分と結合可能なタグである第３の結合部を更に含む。
本発明のプライマー混合物の特に好ましい実施形態では、
前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第１の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第１の部分と結合可能なタグである第１の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第２の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第２の部分と結合可能なタグである第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第３の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第３の部分と結合可能なタグである第３の結合部を更に含む。
【0084】
この実施形態のプライマー混合物に含まれる各プライマー対による増幅産物は、標識部と結合部とを含む二本鎖の増幅産物であるため、核酸クロマトグラフィーによる検出が容易である。以下に、この実施形態について説明する。
【0085】
本実施形態において、第１の標識部、第２の標識部及び第３の標識部は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。以下の説明では、第１の標識部、第２の標識部及び第３の標識部を総称して「標識部」と表示する場合がある。
【0086】
本実施形態において、第１の結合部、第２の結合部及び第３の結合部は、互いに異なるものであることが好ましい。以下の説明では、第１の結合部、第２の結合部及び第３の結合部を総称して「結合部」と表示する場合がある。
【0087】
（標識部）
標識部は、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質のいずれかであり、好ましくは標識物質と結合可能なタグである。本明細書では、標識物質と結合可能なタグを標識用タグと呼ぶ場合がある。標識部が標識用タグである場合、核酸増幅反応の増幅産物と標識物質とを接触させることにより増幅産物の一端に含まれるタグを標識することができる。標識部が標識物質である場合、核酸増幅反応の増幅産物として標識物質を一端に含む増幅産物を得ることができる。
標識部は、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質のいずれかであり、好ましくは標識物質と結合可能なタグである。本明細書では、標識物質と結合可能なタグを標識用タグと呼ぶ場合がある。標識部が標識用タグである場合、核酸増幅反応の増幅産物と標識物質とを接触させることにより増幅産物の一端に含まれるタグを標識することができる。標識部が標識物質である場合、核酸増幅反応の増幅産物として標識物質を一端に含む増幅産物を得ることができる。
【0088】
標識物質は増幅産物の検出を可能とするものであればよく特に限定はされないが、好ましくは増幅産物の目視検出を可能とするものである。このような標識物質としては、着色粒子、色素、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等が挙げられるが、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、金属ロッド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定はされない。標識物質の大きさは増幅産物を後述する固相担体に捕捉するのを妨げるものでなければよい。標識物質は検出の際に発色の良いものであることが好ましく、後述する固相担体や、固相担体を備える核酸検出デバイスの各種多孔質部材の孔径よりも小さなサイズとなるように、適宜選択することができる。例えば、標識物質の大きさはおよそ５００ｎｍ以下、好ましくはおよそ０．１ｎｍ～２５０ｎｍ、より好ましくはおよそ１ｎｍ～１００ｎｍの粒径とすることができる。色素として、蛍光色素（フルオロセイン、シアニン等）等も使用可能であるが、その場合は各蛍光色素の励起波長光を照射し、検出することが好ましい。
【0089】
標識部として利用可能な標識用タグは、標識物質と結合可能なものであればよく、標識物質の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。標識用タグの一つの好ましい形態としては、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。標識用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマー混合物による核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号２５又は２６に示す塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドを用いることができる。標識用タグのもう一つの好ましい形態としては、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ等の低分子化合物からなるものである。
【0090】
標識部が上記の標識用タグである場合、標識物質と標識用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する標識物質と標識用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、標識用タグがポリヌクレオチドを含む場合、標識物質を当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）に結合させ、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、標識物質と標識用タグとを間接的に結合することができる。標識物質とポリヌクレオチドとの結合はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば２０～４０℃にて、１０ｍＭ～５０ｍＭのリン酸を含む緩衝液（ｐＨ６～７）中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。
【0091】
また、標識用タグが低分子化合物の場合、それと特異的に結合するタンパク質（例えばビオチンに結合するアビジン、ＦＩＴＣに結合するタンパク質）、抗体（例えば抗ＤＩＧ抗体）、アプタマー等の結合性物質と連結した標識物質により標識することができる。この場合、標識用タグと結合性物質とは、各種中性付近の緩衝液を用いて結合させることができる。
【0092】
標識部（標識用タグ又は標識物質）と、ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー、ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及びｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーから選択されるフォワードプライマーに含まれるポリヌクレオチド、又は、ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマー、ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマー及びｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーから選択されるリバースプライマーに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、標識部のうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分がポリヌクレオチドよりなる場合、核酸増幅反応により当該部分が前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと標識部とが結合される。このような「スペーサー」としては、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、標識部の二本鎖化を防ぐものであればよく、例えば、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）もしくはＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、下記式Ｉで表されるアゾベンゼン構造を含む二価基、脂肪鎖（アルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖）、５’－５’結合、３’－３’結合のような逆位配列構造を含む二価基等が挙げられるがこれらに限定はされない。
【0093】
【化1】
【0094】
式Ｉで表される二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、該二価基の一方の３’末端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の５’末端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
【0095】
脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－Ｏ－ＣｍＨ２ｍ－Ｏ－３’ 式（ＩＩ）
（式中、５’は、５’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
５’－Ｏ－ＣｍＨ２ｍ－Ｏ－３’ 式（ＩＩ）
（式中、５’は、５’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
【0096】
また、他のスペーサーとしては、以下の式（ＩＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－（ＯＣｎＨ２ｎ）Ｌ－Ｏ－３’ 式（ＩＩＩ）
（式中、５’は、５’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌが４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩＩ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩＩ）中のＨの置換基は、式（ＩＩ）中の置換基と同様の態様が適用される。
他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。
５’－（ＯＣｎＨ２ｎ）Ｌ－Ｏ－３’ 式（ＩＩＩ）
（式中、５’は、５’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’末端側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌが４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩＩ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩＩ）中のＨの置換基は、式（ＩＩ）中の置換基と同様の態様が適用される。
他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。
【0097】
【化2】
【0098】
これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドにリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端又は３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
【0099】
（結合部及び固相担体）
第１の結合部、第２の結合部及び第３の結合部は、それぞれ、後述する固相担体の第１の部分、第２の部分及び第３の部分と結合可能なタグである。固相担体の第１の部分、第２の部分及び第３の部分は、固相担体上の異なる位置に位置する。本明細書では、固相担体と結合可能なタグを固定化用タグと呼ぶ場合がある。
第１の結合部、第２の結合部及び第３の結合部は、それぞれ、後述する固相担体の第１の部分、第２の部分及び第３の部分と結合可能なタグである。固相担体の第１の部分、第２の部分及び第３の部分は、固相担体上の異なる位置に位置する。本明細書では、固相担体と結合可能なタグを固定化用タグと呼ぶ場合がある。
【0100】
結合部として利用可能な固定化用タグは、固相担体と結合可能なものであればよく、固相担体の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えばポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。固定化用タグは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。固定化用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマー混合物による核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号１７～２４のいずれかの塩基配列又はその部分塩基配列或いはそれらの相補塩基配列を含む（又はからなる）ポリヌクレオチドを用いることができる。
【0101】
固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは、固相担体は、溶液中の増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。本発明において利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレン、乾燥させた各種ゲル（シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル）、シリコン、ガラス、プラスチック等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。
【0102】
固相担体は、第１の部分、第２の部分及び第３の部分がそれぞれ固定化用タグと結合可能なように構成されていればよく、より好ましくはこれらの部分のみが固定化用タグと結合可能なように構成されている。固相担体の特定の部分のみを固定化用タグと結合可能なように構成することによって、固相担体に捕捉された増幅産物は前記部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
【0103】
固相担体と固定化用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する固相担体と固定化用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、第１の結合部（固定化用タグ）、第２の結合部（固定化用タグ）、第３の結合部（固定化用タグ）が、それぞれ、互いに異なる第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドを含む場合、固相担体の第１の部分、第２の部分、第３の部分に、それぞれ、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）を固定化してタグ捕捉手段とし、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、固相担体と固定化用タグとを間接的に結合することができる。固相担体へのポリヌクレオチドの固定化はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、標識用タグと標識物質との結合に関して上記した条件により行うことができる。第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチドを固相担体の第１の部分、第２の部分、第３の部分に固定化する場合、特定の部分に限局して固定化することによって、捕捉された増幅産物は所定の部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。
【0104】
結合部（固定化用タグ）と、ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー、ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及びｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマーから選択されるフォワードプライマーに含まれるポリヌクレオチド、又は、ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマー、ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマー及びｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーから選択されるリバースプライマーに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、固定化用タグのうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分が核酸よりなる場合、核酸増幅反応により当該部分が前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと固定化用タグとが結合される。結合部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーの具体例は、標識部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーに関して上述したものと同様である。
【0105】
＜大麻草由来のＤＮＡを含む検体の判別方法＞
本発明はまた、
検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別する方法であって、
検体から分離したＤＮＡ、及び、本発明の前記プライマー混合物を含む反応系中で核酸増幅反応を行う第１工程、並びに、
前記核酸増幅反応による増幅産物を確認する第２工程、
を含み、
前記第２工程において、前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物、前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物、及び、前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物が、全て確認された場合に、前記検体を、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であると判別する方法に関する。
本発明はまた、
検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別する方法であって、
検体から分離したＤＮＡ、及び、本発明の前記プライマー混合物を含む反応系中で核酸増幅反応を行う第１工程、並びに、
前記核酸増幅反応による増幅産物を確認する第２工程、
を含み、
前記第２工程において、前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物、前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物、及び、前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物が、全て確認された場合に、前記検体を、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であると判別する方法に関する。
【0106】
本発明の判別方法では、緑色植物のＤＮＡに共通した領域の増幅と、大麻草のＤＮＡに特異的な２つの領域の増幅を確認するため、偽陽性判定のリスクを低減することができる。
【0107】
本発明において対象となる検体は、大麻草由来のＤＮＡを含む可能性のある検体であればよく、例えば、大麻草を含む可能性のある植物体又はその処理物が例示できる。大麻草が他の植物体（例えばタバコ葉）と混合された検体に対しても、本発明の判別方法は有効である。
【0108】
前記第１工程で鋳型として用いるＤＮＡは、検体から抽出され精製された形態であってもよいし、検体から抽出され粗精製された形態であってもよい。あるいは、細胞や組織の一部等の比較的高濃度でＤＮＡを含む検体であれば、検体自体をそのまま核酸増幅反応に含めることもできる。
【0109】
前記第１工程における核酸増幅反応は、一般的なＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法に従って行うことができる。すなわちＤＮＡ中に存在する所定の標的領域の断片が増幅されるＰＣＲ条件にて行うことができる。
【0110】
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。
【0111】
ホットスタートＰＣＲ法は、プライマーダイマーの形成を抑制する効果が期待できることから有用である。ホットスタートＰＣＲ法は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）等の市販のホットスタートＰＣＲ用試薬を用いて行うことができる。また、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ ＨＳ ＰＣＲ Ｋｉｔ，ＵＮＧ ｐｌｕｓ（登録商標）を使用することもでき、このキットを用いることで核酸増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションを抑制する効果も期待できる。
【0112】
ＰＣＲ法でのサイクル数は２５サイクル以上が好ましく、３０サイクル以上がより好ましい。サイクル数の上限は特に限定されないが通常は６０サイクル以下、好ましくは５０サイクル以下である。
【0113】
ＰＣＲ法での反応系中の開始時のプライマー濃度は特に限定されず、鋳型となるＤＮＡ等に応じて適宜調整することができる。反応系中の反応開始時の好ましい各プライマーの濃度としては、各々０．０５μＭ以上、１．０μＭ以下という濃度が挙げられる。０．０５μＭ未満の場合、検出感度が低下して基準となる検出感度の低下が生じる可能性がある。また、プライマー濃度の上限は特に限定されないが、好ましくは１.０μＭである。
【0114】
前記第１工程では、検体から分離したＤＮＡ中に標的領域が含まれている場合、増幅産物として所定の標的領域を含むＤＮＡ断片が生じる。
【0115】
前記第２工程では、前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物、前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物、及び、前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物の有無を確認する。前記第２工程における増幅産物の確認方法は特に限定されず、例えば、前記第１工程終了後に、核酸増幅反応の反応液をゲル電気泳動により分画し、各プライマー対による所定の標的領域を含むＤＮＡ断片に相当するサイズのバンドの有無を確認する方法や、核酸増幅反応の反応液又はその精製物に、各プライマー対による所定の標的領域を含むＤＮＡ断片に特異的な、標識化されたポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、複合体を検出する方法が例示できる。
【0116】
また、前記第１工程の核酸増幅反応を、５’末端にレポーター蛍光物質が連結され、３’末端にクエンチャー色素を連結されたポリヌクレオチドプローブの存在下で行い、各プライマー対による所定の標的領域を含むＤＮＡ断片が増幅した場合に生じる蛍光を指標として、ＤＮＡ断片を検出することも前記第２工程の一態様である。
【0117】
また、本発明のプライマー混合物において、
前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第１の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第１の部分と結合可能なタグである第１の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第２の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第２の部分と結合可能なタグである第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第３の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第３の部分と結合可能なタグである第３の結合部を更に含む
場合には、前記第２工程は、固相担体を用いた以下の工程であることが好ましい。
前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第１の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第１の部分と結合可能なタグである第１の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第２の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第２の部分と結合可能なタグである第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、標識物質と結合可能なタグである又は標識物質である第３の標識部を更に含み、他方が、固相担体の第３の部分と結合可能なタグである第３の結合部を更に含む
場合には、前記第２工程は、固相担体を用いた以下の工程であることが好ましい。
【0118】
（固相担体を用いた第２工程）
この実施形態に係る前記第２工程は、前記第１工程における核酸増幅反応の生成物を、前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体に接触させ、前記固相担体の前記第１の部分において、前記第１の標識部を指標として前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物（第１の増幅産物）を確認し、前記固相担体の前記第２の部分において、前記第２の標識部を指標として前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物（第２の増幅産物）を確認し、前記固相担体の前記第３の部分において、前記第３の標識部を指標として前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物（第３の増幅産物）を確認することを含む。
この実施形態に係る前記第２工程は、前記第１工程における核酸増幅反応の生成物を、前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体に接触させ、前記固相担体の前記第１の部分において、前記第１の標識部を指標として前記ＩＴＳ１領域増幅用プライマー対による増幅産物（第１の増幅産物）を確認し、前記固相担体の前記第２の部分において、前記第２の標識部を指標として前記ｔｒｎＬ領域増幅用プライマー対による増幅産物（第２の増幅産物）を確認し、前記固相担体の前記第３の部分において、前記第３の標識部を指標として前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用プライマー対による増幅産物（第３の増幅産物）を確認することを含む。
【0119】
第１～第３の標識部が上述の標識用タグである場合には、標識物質を標識用タグに結合させる標識工程を更に行えばよい。標識工程の詳細は後述する。標識部が上述の標識物質である場合には標識工程は不要である。前記第２工程において「前記第１の標識部を指標として」、「前記第２の標識部を指標として」又は「前記第３の標識部を指標として」とは、第１～第３の標識部が標識用タグである場合には標識工程を経て結合した標識物質を指標として第１～第３の増幅産物を検出し確認することを指し、第１～第３の標識部が標識物質である場合には該標識物質を指標として第１～第３の増幅産物を検出し確認することを指す。
【0120】
核酸増幅反応の生成物とは、第１～第３の増幅産物を含んでいる可能性のある核酸増幅反応の反応液や、該反応液から第１～第３の増幅産物を更に高濃度化した試料等を指す。
【0121】
固相担体の詳細は既述の通りである。
固相担体の第１～第３の部分への、前記生成物の接触は、固相担体の第１～第３の部分と第１～第３の結合部との組合せに応じて、前記生成物中に第１～第３の増幅産物が含まれていた場合に前記部分に第１～第３の増幅産物の結合部が結合するように適宜調節された条件（例えば、ハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
固相担体の第１～第３の部分への、前記生成物の接触は、固相担体の第１～第３の部分と第１～第３の結合部との組合せに応じて、前記生成物中に第１～第３の増幅産物が含まれていた場合に前記部分に第１～第３の増幅産物の結合部が結合するように適宜調節された条件（例えば、ハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
【0122】
例えば、前記核酸増幅反応の生成物である液体、或いは、前記核酸増幅反応の生成物に展開液又は希釈液を混合した液体を、前記第１～第３の部分を備えた多孔質の固相担体の一部に接触させることで、毛管現象により前記液体を前記固相担体内で移動させて展開し、前記液体中の第１～第３の増幅産物を、前記第１～第３の部分に到達させる方法が例示できる。前記核酸増幅反応の生成物である液体と、展開液は、前記固相担体の一部に同時に接触させる必要はなく、順に接触させてもよい。前記液体には必要に応じて標識物質を添加してもよい。このようなクロマトグラフィーを利用した核酸検出方法のための固相担体を備えた核酸検出デバイスをクロマト型核酸検出デバイスという。
【0123】
第１～第３の増幅産物の確認は、固相担体の第１～第３の部分に捕捉された第１～第３の増幅産物に結合した前記標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。第１～第３の増幅産物が存在する場合には、固相担体の第１～第３の部分に捕捉・結合された第１～第３の増幅産物の標識物質が検出される。
【0124】
（標識工程）
標識工程は、本発明のプライマー混合物に含まれる前記第１～第３の標識部が上述の標識用タグである場合に行う工程であり、核酸増幅反応の生成物と標識物質とを接触させ、標識用タグに標識物質に結合させることにより行う。標識工程は、核酸増幅反応の生成物を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。
標識工程は、本発明のプライマー混合物に含まれる前記第１～第３の標識部が上述の標識用タグである場合に行う工程であり、核酸増幅反応の生成物と標識物質とを接触させ、標識用タグに標識物質に結合させることにより行う。標識工程は、核酸増幅反応の生成物を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。
【0125】
標識物質と前記生成物との接触は、標識物質と標識用タグとの組合せに応じて、前記生成物中に第１～第３の増幅産物が含まれていた場合に標識物質と第１～第３の増幅産物の標識用タグとが結合するように適宜調節された条件（例えば既述のハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
【0126】
（検出デバイス）
上述の第２工程及び標識工程は、核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、核酸増幅反応の反応系中の第１～第３の増幅産物（標的領域を含むポリヌクレオチド断片）の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。
上述の第２工程及び標識工程は、核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、核酸増幅反応の反応系中の第１～第３の増幅産物（標的領域を含むポリヌクレオチド断片）の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。
【0127】
核酸検出デバイスは、核酸クロマトグラフィー法により標識された核酸増幅産物を検出するために利用される公知の核酸検出デバイス（ＷＯ２０１２／０７０６１８）を利用することができる。
【0128】
本発明にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図４に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図４中に示される符号に対応する。
【0129】
図４のクロマト型核酸検出デバイス１０は、基材５の上に、核酸増幅反応の反応系を受容するための反応系受容部であるサンプルパッド３、標識物質を保持するコンジュゲートパッド（標識物質保持部）２、固相担体１及び吸収パッド４を互いがこの順に接触するように配置して形成される。固相担体１は、図３Ｂに示すように、互いに異なる位置に、第１の部分６－１、第２の部分６－２及び第３の部分６－３を含む。固相担体１の第１の部分６－１は、第１の増幅産物に含まれる第１の結合部と結合可能な部分であり、第１の増幅産物を捕捉するための手段（捕捉手段）（例えば、第１の結合部がポリヌクレオチドである場合に、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド等）が限局して配置・固定化された部分である。固相担体１の第２の部分６－２は、第２の増幅産物に含まれる第２の結合部と結合可能な部分であり、第２の増幅産物を捕捉するための手段（捕捉手段）（例えば、第２の結合部がポリヌクレオチドである場合に、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド等）が限局して配置・固定化された部分である。固相担体１の第３の部分６－３は、第３の増幅産物に含まれる第３の結合部と結合可能な部分であり、第３の増幅産物を捕捉するための手段（捕捉手段）（例えば、第３の結合部がポリヌクレオチドである場合に、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド等）が限局して配置・固定化された部分である。図示しないが、固相担体１の表面はフィルムにより覆われていてもよい。サンプルパッド３、コンジュゲートパッド２、固相担体１及び吸収パッド４は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材により構成することができる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材５はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイスの操作を容易にするものであればよく、例えば樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合や、標識部が標識物質である場合には、コンジュゲートパッド２は省略することができる。
【0130】
前記第１工程により得られた核酸増幅反応の生成物をサンプルパッド３に添加する。前記核酸増幅反応の反応液をそのまま添加してもよいし、適当な展開溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液）と共に添加してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド３に添加された前記反応液は、図４中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。
【0131】
また別の態様としては、核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液を保持した容器（例えば、ＰＣＲチューブ、エッペンチューブ、９６穴プレート等）に前記クロマト型核酸検出デバイスを入れ、サンプルパッド３を核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液に浸漬させる方法で展開することもできる。その場合、核酸増幅反応の生成物及び／又は展開溶液を保持した容器にサンプルパッド３が入るように、サンプルパッド３の幅は２.０～１０．０ｍｍにすることが好ましく、２.０～５．０ｍｍにすることがより好ましい。
【0132】
前記第１～第３の標識部が標識用タグである実施形態では、反応系中の第１～第３の増幅産物は標識物質が保持されたコンジュゲートパッド２を通過する際に、標識物質と接触し、標識用タグを介して標識物質により標識される。
【0133】
次いで、反応系中の第１の増幅産物は、固相担体１を通過する際に、第１の部分６－１に固定された捕捉手段と接触し、固定化用タグを介して固相担体１の第１の部分６－１に捕捉・結合される。反応系中の第２の増幅産物は、固相担体１を通過する際に、第２の部分６－２に固定された捕捉手段と接触し、固定化用タグを介して固相担体１の第２の部分６－２に捕捉・結合される。反応系中の第３の増幅産物は、固相担体１を通過する際に、第３の部分６－３に固定された捕捉手段と接触し、固定化用タグを介して固相担体１の第３の部分６－３に捕捉・結合される。
【0134】
検体から分離したＤＮＡ中に標的領域が存在する場合には、捕捉手段を含む固相担体１の第１の部分６－１、第２の部分６－２、第３の部分６－３に捕捉・結合された第１～第３の増幅産物に結合した標識物質が検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して第１の部分６－１、第２の部分６－２、第３の部分６－３が呈色する。当該標識物質の検出（呈色）の有無を指標にして、第１～第３の増幅産物の有無を検出することができる。
【0135】
＜キット＞
本発明はまた、検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別するためのキットであって、
前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、前記第１の標識部を更に含み、他方が、前記第１の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、前記第２の標識部を更に含み、他方が、前記第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、前記第３の標識部を更に含み、他方が、前記第３の結合部を更に含む
実施形態に係るプライマー混合物、並びに、
前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体を備える核酸検出デバイス
を含むキットに関する。
本発明はまた、検体が、大麻草由来のＤＮＡを含む検体であることを判別するためのキットであって、
前記ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー及び前記ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマーの一方が、前記第１の標識部を更に含み、他方が、前記第１の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＬ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＬ領域増幅用リバースプライマーの一方が、前記第２の標識部を更に含み、他方が、前記第２の結合部を更に含み、
前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用フォワードプライマー及び前記ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅用リバースプライマーの一方が、前記第３の標識部を更に含み、他方が、前記第３の結合部を更に含む
実施形態に係るプライマー混合物、並びに、
前記第１の部分、前記第２の部分、及び、前記第３の部分を含む固相担体を備える核酸検出デバイス
を含むキットに関する。
【0136】
本発明のキットには、更に、核酸増幅反応のための各種試薬（例えばＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅反応用緩衝液、ｄＮＴＰｓ等）、インキュベーションのための各種試薬（インキュベーション用緩衝液）等を含めることができる。
【0137】
本発明のキットは、前記プライマー混合物における前記第１～第３の標識部が、標識物質と結合可能な標識用タグである場合には、標識用タグと結合可能な標識物質を更に含むことが好ましい。この実施形態では、前記核酸検出デバイスが、前記標識物質を保持する標識物質保持部を更に備えることが好ましい。
【実施例】
【0138】
＜実施例１＞大麻草ＤＮＡ検出用プライマーの設計
（１）プライマーの設計
大麻草を検出するためのプライマー対として、非特許文献１に記載されている大麻草特異的なフォワードプライマーｃｐＣａｎ（配列番号５）と、ｔｒｎＬ遺伝子のイントロン領域に設計したリバースプライマーＣａｎＲｖ（配列番号８）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の大麻草（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）に特異的な領域を増幅するプライマー対を用いた。大麻草のｔｒｎＬ遺伝子の塩基配列（配列番号１４）における、前記プライマー対（配列番号５、配列番号８）の設計位置を図２に示す。
（１）プライマーの設計
大麻草を検出するためのプライマー対として、非特許文献１に記載されている大麻草特異的なフォワードプライマーｃｐＣａｎ（配列番号５）と、ｔｒｎＬ遺伝子のイントロン領域に設計したリバースプライマーＣａｎＲｖ（配列番号８）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の大麻草（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）に特異的な領域を増幅するプライマー対を用いた。大麻草のｔｒｎＬ遺伝子の塩基配列（配列番号１４）における、前記プライマー対（配列番号５、配列番号８）の設計位置を図２に示す。
【0139】
フォワードプライマーｃｐＣａｎ（配列番号５）の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列Ａｕ（配列番号２５）を連結した。リバースプライマーＣａｎＲｖ（配列番号８）の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、核酸クロマトグラフィーのメンブレン捕捉用のＤＮＡタグ配列Ｔ１（配列番号１７）を連結した。
【0140】
緑色植物を検出するためのプライマー対として、ＩＴＳ１領域内に設計された非特許文献５に記載のフォワードプライマーＩＴＳ－Ａ（配列番号１）と、リバースプライマーＩＴＳ－Ｃ（配列番号２）とからなる、緑色植物に共通するＩＴＳ１領域を増幅するプライマー対を用いた。大麻草のＩＴＳ１領域の塩基配列（配列番号１３）における、前記プライマー対（配列番号１、配列番号２）の設計位置を図１に示す。
【0141】
フォワードプライマーＩＴＳ－Ａ（配列番号１）の５’末端側に、上記二価基を介してメンブレン捕捉用のＤＮＡタグ配列Ｔ２（配列番号１８）を連結した。リバースプライマーＩＴＳ－Ｃ（配列番号２）の５’末端側に、金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列Ａｕ（配列番号２５）を連結した。
【0142】
（２）ポリヌクレオチド結合金コロイドの作製
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ、９．０×１０１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と、３’末端にＳＨ基を付加した上記金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列Ａｕの相補鎖Ａｕ－ｃｏｍｐ（配列番号２６）とを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。
調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ、９．０×１０１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と、３’末端にＳＨ基を付加した上記金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列Ａｕの相補鎖Ａｕ－ｃｏｍｐ（配列番号２６）とを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。
調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
【0143】
（３）タグ捕捉手段を固定化したメンブレンの作製
タグ捕捉手段として、上記のＤＮＡタグ配列Ｔ１の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２１）を含む溶液及び上記のＤＮＡタグ配列Ｔ２の相補塩基配列からなる（配列番号２２）ＤＮＡを含む溶液を、それぞれ、１つのメルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ１８０）上の位置の異なる２つの部分（図３Ａの第２の部分６－２及び第１の部分６－１）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることで、タグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。
タグ捕捉手段として、上記のＤＮＡタグ配列Ｔ１の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２１）を含む溶液及び上記のＤＮＡタグ配列Ｔ２の相補塩基配列からなる（配列番号２２）ＤＮＡを含む溶液を、それぞれ、１つのメルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ１８０）上の位置の異なる２つの部分（図３Ａの第２の部分６－２及び第１の部分６－１）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることで、タグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。
【0144】
（４）クロマト型核酸検出デバイスの作製
作製したクロマト型核酸検出デバイスは、図４の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。
すなわち、基材５としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド２として上記（２）で作製したコンジュゲートパッド、メンブレン（固相担体）１として、上記（３）で作製した、第２の部分６－２及び第１の部分６－１に、それぞれ、タグ配列Ｔ１の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２１）及びタグ配列Ｔ２の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２２）を備えた図３Ａに示すメンブレン、サンプルパッド３としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド４としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図４に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、クロマト型核酸検出デバイス１０を作製した。図３Ａに示すメンブレン１の第１の部分６－１が、緑色植物に共通するＩＴＳ１領域の増幅産物の検出ラインである。図３Ａに示すメンブレン１の第２の部分６－２が、大麻草に特異的なｔｒｎＬ領域の増幅産物の検出ラインである。
作製したクロマト型核酸検出デバイスは、図４の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。
すなわち、基材５としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド２として上記（２）で作製したコンジュゲートパッド、メンブレン（固相担体）１として、上記（３）で作製した、第２の部分６－２及び第１の部分６－１に、それぞれ、タグ配列Ｔ１の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２１）及びタグ配列Ｔ２の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２２）を備えた図３Ａに示すメンブレン、サンプルパッド３としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド４としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図４に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、クロマト型核酸検出デバイス１０を作製した。図３Ａに示すメンブレン１の第１の部分６－１が、緑色植物に共通するＩＴＳ１領域の増幅産物の検出ラインである。図３Ａに示すメンブレン１の第２の部分６－２が、大麻草に特異的なｔｒｎＬ領域の増幅産物の検出ラインである。
【0145】
（５）ＰＣＲ
上記（１）に記載の、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）とを含む、下記のマルチプレックスＰＣＲ反応液を調製した。
大麻草ＤＮＡの鋳型として、鳥の餌用に販売されているあさの実から抽出したＤＮＡを使用した。大麻草の近縁種のＤＮＡの鋳型として、ホップから抽出したＤＮＡを使用した。
上記（１）に記載の、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）とを含む、下記のマルチプレックスＰＣＲ反応液を調製した。
大麻草ＤＮＡの鋳型として、鳥の餌用に販売されているあさの実から抽出したＤＮＡを使用した。大麻草の近縁種のＤＮＡの鋳型として、ホップから抽出したＤＮＡを使用した。
【0146】
【表1】
【0147】
ＰＣＲ反応液を、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒ社、ＬｉｆｅＥｃｏ）にセットし、９５℃で３分間反応後、９４℃－１０秒／５９℃－１０秒／７２℃－４０秒のサイクルを４０回行なった。
【0148】
（６）核酸クロマトグラフィー検出系を用いた検出
上記条件でのＰＣＲ後の反応液を、ラテラルフロー型核酸検出デバイス１０に適用して、増幅産物の検出を試みた。具体的には、前記デバイス１０上のサンプルパッド３にＰＣＲ後の反応液５μＬを添加し、さらに８０μＬの展開溶液（界面活性剤を配合したクエン酸緩衝液）を添加することで、反応液を展開した。室温で１０分後、メンブレン１上の第１の部分６－１（緑色植物検出ライン）と第２の部分６－２（大麻草検出ライン）の着色の有無を目視で確認した。着色が確認できた場合に「＋」、確認できなかった場合に「－」とした。
結果を下記表に示す。表中の比較例１～３で用いたプライマー対は後述する。
上記条件でのＰＣＲ後の反応液を、ラテラルフロー型核酸検出デバイス１０に適用して、増幅産物の検出を試みた。具体的には、前記デバイス１０上のサンプルパッド３にＰＣＲ後の反応液５μＬを添加し、さらに８０μＬの展開溶液（界面活性剤を配合したクエン酸緩衝液）を添加することで、反応液を展開した。室温で１０分後、メンブレン１上の第１の部分６－１（緑色植物検出ライン）と第２の部分６－２（大麻草検出ライン）の着色の有無を目視で確認した。着色が確認できた場合に「＋」、確認できなかった場合に「－」とした。
結果を下記表に示す。表中の比較例１～３で用いたプライマー対は後述する。
【0149】
【表2】
【0150】
緑色植物検出用に配列番号１のフォワードプライマー及び配列番号２のリバースプライマーからなるＩＴＳ１検出用プライマー対、大麻草検出用に配列番号５のフォワードプライマー及び配列番号８のリバースプライマーからなるｔｒｎＬ領域検出用プライマー対を組み合わせて用いると、大麻草及びホップを適切なライン着色パターンで検出することができた。
【0151】
＜比較例１＞
緑色植物を検出するためのプライマー対として、実施例１のＩＴＳ１検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）に代えて、ｔｒｎＬ遺伝子のエクソン領域に設計したフォワードプライマーＣ－ｕｎｉ（配列番号６）とリバースプライマーＤ－ｕｎｉ（配列番号７）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の緑色植物に共通する領域を増幅するプライマー対を使用し、大麻草を検出するためのプライマー対として、実施例１のｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）に代えて、ｔｒｎＬ遺伝子のイントロン領域に設計したフォワードプライマーｃｐＣａｎ（配列番号５）とｔｒｎＬ遺伝子のエクソン領域に設計したリバースプライマーＤ－ｕｎｉ（配列番号７）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の大麻草に特異的な領域を増幅するプライマー対を使用した以外は、実施例１と同様に評価を実施した。
緑色植物を検出するためのプライマー対として、実施例１のＩＴＳ１検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）に代えて、ｔｒｎＬ遺伝子のエクソン領域に設計したフォワードプライマーＣ－ｕｎｉ（配列番号６）とリバースプライマーＤ－ｕｎｉ（配列番号７）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の緑色植物に共通する領域を増幅するプライマー対を使用し、大麻草を検出するためのプライマー対として、実施例１のｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）に代えて、ｔｒｎＬ遺伝子のイントロン領域に設計したフォワードプライマーｃｐＣａｎ（配列番号５）とｔｒｎＬ遺伝子のエクソン領域に設計したリバースプライマーＤ－ｕｎｉ（配列番号７）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の大麻草に特異的な領域を増幅するプライマー対を使用した以外は、実施例１と同様に評価を実施した。
【0152】
＜比較例２＞
緑色植物を検出するためのプライマー対として、実施例１のＩＴＳ１検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）に代えて、ｒｂｃＬａ領域に設計したフォワードプライマーｒｂｃＬａ－Ｆ（配列番号３）とリバースプライマーｒｂｃＬａ－Ｒ（配列番号４）とからなる、ｒｂｃＬａ遺伝子の緑色植物に共通する領域を増幅するプライマー対を使用した以外は、実施例１と同様に評価を実施した。
緑色植物を検出するためのプライマー対として、実施例１のＩＴＳ１検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）に代えて、ｒｂｃＬａ領域に設計したフォワードプライマーｒｂｃＬａ－Ｆ（配列番号３）とリバースプライマーｒｂｃＬａ－Ｒ（配列番号４）とからなる、ｒｂｃＬａ遺伝子の緑色植物に共通する領域を増幅するプライマー対を使用した以外は、実施例１と同様に評価を実施した。
【0153】
＜比較例３＞
大麻草を検出するためのプライマー対として、実施例１のｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）に代えて、フォワードプライマーｃｐＣａｎ（配列番号５）とリバースプライマーＤ－ｕｎｉ（配列番号７）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の大麻草に特異的な領域を増幅するプライマー対を使用した以外は、実施例１と同様に評価を実施した。
大麻草を検出するためのプライマー対として、実施例１のｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）に代えて、フォワードプライマーｃｐＣａｎ（配列番号５）とリバースプライマーＤ－ｕｎｉ（配列番号７）とからなる、ｔｒｎＬ遺伝子の大麻草に特異的な領域を増幅するプライマー対を使用した以外は、実施例１と同様に評価を実施した。
【0154】
＜比較例１～３の結果＞
緑色植物検出用プライマー対及び大麻草検出用プライマー対をいずれもｔｒｎＬ遺伝子に設計した比較例１では、大麻草を検体に用いた場合に大麻草検出ラインのみが着色し、緑色植物検出ラインが着色しなかった。
緑色植物検出用プライマー対及び大麻草検出用プライマー対をいずれもｔｒｎＬ遺伝子に設計した比較例１では、大麻草を検体に用いた場合に大麻草検出ラインのみが着色し、緑色植物検出ラインが着色しなかった。
【0155】
大麻草検出用プライマー対としてｔｒｎＬ遺伝子に設計した配列番号５、８を使用し、緑色植物検出用プライマー対としてｒｂｃＬａ領域に設計した配列番号３、４を使用した比較例２ではホップを検体とした場合に大麻草検出ラインの非特異的な着色を認めた。
【0156】
同様に、大麻草検出用プライマー対としてｔｒｎＬ遺伝子に設計した配列番号５、７を使用し、緑色植物検出用プライマー対としてＩＴＳ１領域に設計した配列番号１、２を使用した比較例３でも、ホップを検体とした場合に大麻草検出ラインの非特異的な着色を認めた。
【0157】
＜実施例２＞
（１）プライマーの設計
大麻草を検出するための追加のプライマー対として、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ遺伝子の大麻草特異的領域に設計したフォワードプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｆ（配列番号９）とリバースプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｒｖ（配列番号１０）とからなる、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対を用いた。大麻草のｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ遺伝子の塩基配列（配列番号１５）における、前記プライマー対（配列番号９、配列番号１０）の設計位置を図５に示す。
（１）プライマーの設計
大麻草を検出するための追加のプライマー対として、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ遺伝子の大麻草特異的領域に設計したフォワードプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｆ（配列番号９）とリバースプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｒｖ（配列番号１０）とからなる、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対を用いた。大麻草のｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ遺伝子の塩基配列（配列番号１５）における、前記プライマー対（配列番号９、配列番号１０）の設計位置を図５に示す。
【0158】
フォワードプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｆ（配列番号９）の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列Ａｕ（配列番号２５）を連結した。
【0159】
リバースプライマーｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ－Ｒｖ（配列番号１０）の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、核酸クロマトグラフィーのメンブレン捕捉用のＤＮＡタグ配列Ｔ３（配列番号１９）を連結した。
【0160】
（２）クロマト型核酸検出デバイスの作製
実施例１の（３）で作製したメンブレンにおいて、更に、第１の部分６－１及び第２の部分６－２とは異なる第３の部分６－３に、タグ配列Ｔ３の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２３）を固定化した、図３Ｂに示すメンブレンを作製した。第３の部分６－３にタグ配列Ｔ３の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２３）を固定化する手順は、実施例１の（３）に記載の手順と同様である。こうして作製した図３Ｂに示すメンブレン１を備える、図４に示すクロマト型核酸検出デバイス１０を、実施例１の（４）と同様の手順で作製した。図３Ｂに示すメンブレン１の第１の部分６－１が、緑色植物に共通するＩＴＳ１領域の増幅産物の検出ラインである。図３Ｂに示すメンブレン１の第２の部分６－２が、大麻草に特異的なｔｒｎＬ領域の増幅産物の検出ラインである。図３Ｂに示すメンブレン１の第３の部分６－３が、大麻草に特異的なｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域の増幅産物の検出ラインである。
実施例１の（３）で作製したメンブレンにおいて、更に、第１の部分６－１及び第２の部分６－２とは異なる第３の部分６－３に、タグ配列Ｔ３の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２３）を固定化した、図３Ｂに示すメンブレンを作製した。第３の部分６－３にタグ配列Ｔ３の相補塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号２３）を固定化する手順は、実施例１の（３）に記載の手順と同様である。こうして作製した図３Ｂに示すメンブレン１を備える、図４に示すクロマト型核酸検出デバイス１０を、実施例１の（４）と同様の手順で作製した。図３Ｂに示すメンブレン１の第１の部分６－１が、緑色植物に共通するＩＴＳ１領域の増幅産物の検出ラインである。図３Ｂに示すメンブレン１の第２の部分６－２が、大麻草に特異的なｔｒｎＬ領域の増幅産物の検出ラインである。図３Ｂに示すメンブレン１の第３の部分６－３が、大麻草に特異的なｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域の増幅産物の検出ラインである。
【0161】
（３）ＰＣＲ及び検出
上記のｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）を用いて、実施例１と同様の方法でシングルＰＣＲを実施した。また、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）と、実施例１に記載のＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、実施例１に記載のｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）とを含むプライマー混合物を用いたマルチプレックスＰＣＲを実施した。ＰＣＲによる核酸増幅は実施例１と同様に行った。核酸増幅反応後の容器に１６０μLの展開液を添加して混合し、この容器中に、実施例１の（６）に記載のクロマト型核酸検出デバイス１０のサンプルパッド３側の端部を挿入して反応液に浸すことで、反応液を展開した。室温で１０分後のライン着色を確認した。
上記のｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）を用いて、実施例１と同様の方法でシングルＰＣＲを実施した。また、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）と、実施例１に記載のＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、実施例１に記載のｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）とを含むプライマー混合物を用いたマルチプレックスＰＣＲを実施した。ＰＣＲによる核酸増幅は実施例１と同様に行った。核酸増幅反応後の容器に１６０μLの展開液を添加して混合し、この容器中に、実施例１の（６）に記載のクロマト型核酸検出デバイス１０のサンプルパッド３側の端部を挿入して反応液に浸すことで、反応液を展開した。室温で１０分後のライン着色を確認した。
【0162】
＜比較例４＞
大麻草を検出するための別の追加のプライマー対として、実施例２に記載のｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）に代えて、ｃｌｐＰ領域に設計したフォワードプライマーｃｌｐＰ－２Ｆ（配列番号１１）とリバースプライマーｃｌｐＰ－２Ｒ（配列番号１２）とからなるｃｌｐＰ領域検出用プライマー対を使用した以外は、実施例２と同様の検討を行った。大麻草のｃｌｐＰ遺伝子の塩基配列（配列番号１６）における、前記プライマー対（配列番号１１、配列番号１２）の設計位置を図６に示す。この場合、図３Ｂに示すメンブレン１の第３の部分６－３が、大麻草に特異的なｃｌｐＰ領域の増幅産物の検出ラインである。
大麻草を検出するための別の追加のプライマー対として、実施例２に記載のｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）に代えて、ｃｌｐＰ領域に設計したフォワードプライマーｃｌｐＰ－２Ｆ（配列番号１１）とリバースプライマーｃｌｐＰ－２Ｒ（配列番号１２）とからなるｃｌｐＰ領域検出用プライマー対を使用した以外は、実施例２と同様の検討を行った。大麻草のｃｌｐＰ遺伝子の塩基配列（配列番号１６）における、前記プライマー対（配列番号１１、配列番号１２）の設計位置を図６に示す。この場合、図３Ｂに示すメンブレン１の第３の部分６－３が、大麻草に特異的なｃｌｐＰ領域の増幅産物の検出ラインである。
【0163】
＜実施例２、比較例４の結果＞
実施例２において、追加の大麻草ＤＮＡ検出用プライマー対としてｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）を用いたシングルＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果、並びに、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いたマルチプレックスＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果を図７に示す。
実施例２において、追加の大麻草ＤＮＡ検出用プライマー対としてｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）を用いたシングルＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果、並びに、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いたマルチプレックスＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果を図７に示す。
【0164】
図７及び後述する図８において、「ＮＣ」とは、鋳型を含まない条件でＰＣＲ増幅を行って得たサンプルの検出結果を示し、「Ｈｏｐ」とは、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を行って得たサンプルの検出結果を示し、「大麻」とは、鳥の餌用に販売されているあさの実から抽出したＤＮＡ（大麻草ＤＮＡ）を鋳型としてＰＣＲ増幅を行って得たサンプルの検出結果を示す。ＰＣＲの条件は実施例１の（５）に記載の通りである。
【0165】
実施例２では、大麻草ＤＮＡを鋳型とした場合に、シングルＰＣＲでｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域の増幅産物の検出ラインの着色が確認され、マルチプレックスＰＣＲで、緑色植物ＤＮＡに共通するＩＴＳ１領域の増幅産物の検出ラインに加えて、大麻草ＤＮＡに特異的な、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域の増幅産物の検出ラインと、ｔｒｎＬ領域の増幅産物の検出ラインの着色が確認された。一方、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型とした場合には、シングルＰＣＲではｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域の増幅産物の検出ラインの着色は確認されず、マルチプレックスＰＣＲでは、緑色植物ＤＮＡに共通するＩＴＳ１領域の増幅産物の検出ラインのみの着色が確認され、大麻草ＤＮＡに特異的な増幅産物の検出ラインの着色は確認されなかった。
【0166】
比較例４において、追加の大麻草検出用プライマー対としてｃｌｐＰ領域検出用プライマー対（配列番号１１、配列番号１２）を用いたシングルＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果、並びに、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｃｌｐＰ領域検出用プライマー対（配列番号１１、配列番号１２）とを含むプライマー混合物を用いたマルチプレックスＰＣＲ後に検出デバイスで検出した結果を図８に示す。
【0167】
比較例４においてｃｌｐＰ領域検出用プライマー対（配列番号１１、配列番号１２）を用いたシングルＰＣＲでは、大麻草ＤＮＡを鋳型とした場合（大麻）にｃｌｐＰ領域の増幅産物の検出ラインの着色が確認され、鋳型を用いない場合（ＮＣ）及びホップから抽出したＤＮＡを鋳型とした場合（Ｈｏｐ）にはｃｌｐＰ領域の増幅産物の検出ラインの着色は確認されなかった。しかし、マルチプレックスＰＣＲでは、鋳型を用いない場合（ＮＣ）及びホップから抽出したＤＮＡを鋳型とした場合（Ｈｏｐ）だけでなく大麻草ＤＮＡを鋳型とした場合（大麻）においても、ｃｌｐＰ領域の増幅産物の検出ラインの着色は確認されず、鋳型を用いない場合（ＮＣ）、ホップから抽出したＤＮＡを鋳型とした場合（Ｈｏｐ）及び大麻草ＤＮＡを鋳型とした場合（大麻）のいずれにおいても、ｔｒｎＬ領域の増幅産物の検出ラインが着色されてしまい、適切な着色パターンとはならなかった。
【0168】
＜実施例３＞
薬物種大麻及び繊維種大麻の各部位（葉、花穂、根、茎、種子）から抽出したＤＮＡを鋳型として用い、緑色植物検出のためのＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、大麻草検出のためのｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、大麻草検出のためのｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いて、実施例２と同様の条件でマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応液を核酸検出デバイスでの検出を行った。結果を下記表に示す。
薬物種大麻及び繊維種大麻の各部位（葉、花穂、根、茎、種子）から抽出したＤＮＡを鋳型として用い、緑色植物検出のためのＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、大麻草検出のためのｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、大麻草検出のためのｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いて、実施例２と同様の条件でマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応液を核酸検出デバイスでの検出を行った。結果を下記表に示す。
【0169】
【表3】
【0170】
前記プライマー混合物を用いたマルチプレックスＰＣＲでは、大麻草のいずれの部位を用いても適切なライン着色パターンでの検出が可能であった。また、薬物種大麻と繊維種大麻で同様の結果が得られた。このことから、本方法は大麻草ＤＮＡの特異的な検出に有効であることが示された。
【0171】
＜実施例４＞
大麻草とタバコを重量比で１：１～１：９９の割合で混合した試料（１０ｍｇ）から抽出したＤＮＡを鋳型として用い、実施例３と同様に、緑色植物検出のためのＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、大麻草検出のためのｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、大麻草検出のためのｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。増幅産物の評価は実施例２及び３と同様に実施した。結果を下記表に示す。
大麻草とタバコを重量比で１：１～１：９９の割合で混合した試料（１０ｍｇ）から抽出したＤＮＡを鋳型として用い、実施例３と同様に、緑色植物検出のためのＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、大麻草検出のためのｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、大麻草検出のためのｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。増幅産物の評価は実施例２及び３と同様に実施した。結果を下記表に示す。
【0172】
【表4】
【0173】
大麻草とタバコの混合比率が重量比で１：９９の検体から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合でも、緑色植物に共通するＩＴＳ１領域の増幅産物の検出ラインに加えて、大麻草に特異的な、ｔｒｎＬ領域の増幅産物の検出ライン及びｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域増幅産物の検出ラインが着色することが確認できた。このことから、本方法は大麻草と他の植物との混合試料中での大麻草ＤＮＡの検出にも有効であることが示された。
【0174】
＜実施例５＞
薬物種大麻から抽出したＤＮＡを１０ｎｇ～１ｆｇまで段階希釈したものを鋳型とし、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いて、実施例２～４と同様の手順によりマルチプレックスＰＣＲ及び検出を行った。結果を図９に示す。
本方法による大麻草ＤＮＡの検出下限は１０ｆｇであり、非常に優れた検出性能を有することが示された。
薬物種大麻から抽出したＤＮＡを１０ｎｇ～１ｆｇまで段階希釈したものを鋳型とし、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いて、実施例２～４と同様の手順によりマルチプレックスＰＣＲ及び検出を行った。結果を図９に示す。
本方法による大麻草ＤＮＡの検出下限は１０ｆｇであり、非常に優れた検出性能を有することが示された。
【0175】
＜実施例６＞
大麻草以外の植物、危険ドラッグ、指定薬物の植物から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いて、実施例２～５と同様の手順によりマルチプレックスＰＣＲ及び検出を行った。結果を下記表に示す。
大麻草以外の植物、危険ドラッグ、指定薬物の植物から抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＩＴＳ１領域検出用プライマー対（配列番号１、配列番号２）と、ｔｒｎＬ領域検出用プライマー対（配列番号５、配列番号８）と、ｔｒｎＧ－ｐｓｂＩ領域検出用プライマー対（配列番号９、配列番号１０）とを含むプライマー混合物を用いて、実施例２～５と同様の手順によりマルチプレックスＰＣＲ及び検出を行った。結果を下記表に示す。
【0176】
【表5】
【0177】
大麻以外の植物、危険ドラッグ及び指定薬物の植物を大麻と誤認することはなかった。
【0178】
【表6】
【0179】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】