特許 7069135 アルブミンベースのナノ医薬品を使用するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-09

(45)【発行日】2022-05-17

(54)【発明の名称】アルブミンベースのナノ医薬品を使用するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/64 20170101AFI20220510BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20220510BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220510BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220510BHJP

   A61K 38/38 20060101ALI20220510BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220510BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220510BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220510BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220510BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220510BHJP

   C07K 14/765 20060101ALI20220510BHJP

   A61K 31/715 20060101ALN20220510BHJP

   A61K 38/00 20060101ALN20220510BHJP

   A61K 45/00 20060101ALN20220510BHJP

   A61K 47/54 20170101ALN20220510BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20220510BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALN20220510BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20220510BHJP

【ＦＩ】

A61K47/64

A61K31/7125

A61K31/7088

A61K39/395 Y

A61K39/395 L

A61K38/38

A61P35/00

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P43/00 121

C07K16/28 ZNA

C12N15/11 Z

C07K14/765

A61K31/715

A61K38/00

A61K45/00

A61K47/54

C07K14/00

C12Q1/68

C12N15/115 Z

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2019518170

(86)(22)【出願日】2017-06-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-07-11

(86)【国際出願番号】 US2017037736

(87)【国際公開番号】W WO2017218813

(87)【国際公開日】2017-12-21

【審査請求日】2020-06-15

(31)【優先権主張番号】62/350,462

(32)【優先日】2016-06-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518448231

【氏名又は名称】ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】コペチェック ジンドリック ヘンリー

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ジユアン

【審査官】長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００１５７３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Biomaterials，2013年，Vol.34，pp.7939-7949

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ２０ポジティブ細胞の集団においてアポトーシスの誘導から利益を受ける疾患の治療に使用するための第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートであって、前記治療が、
（ｉ）標的化部分及びモルフォリノを含む前記第１のコンジュゲートと、ＣＤ２０ポジティブ細胞の集団を接触させることであって、前記標的化部分が抗ＣＤ２０抗体又は抗ＣＤ２０Ｆａｂ’フラグメントであり、ならびに
（ｉｉ）アルブミン及び１つ以上のモルフォリノを含む前記第２のコンジュゲートと、前記ＣＤ２０ポジティブ細胞の集団を接触させること、を含み、
前記第１のコンジュゲートの前記モルフォリノが、５’ ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ａ ３’（配列番号２５）又は５’ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣＴ Ｃ ３’（配列番号２６）であり、
前記第２のコンジュゲートの前記１つ以上のモルフォリノが、５’ ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ａ ３’（配列番号２５）又は５’ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣＴ Ｃ ３’（配列番号２６）であり、
前記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を繰り返してもよく、
前記ＣＤ２０ポジティブ細胞の集団の、前記第１のコンジュゲート及び前記第２のコンジュゲートとの前記接触が、一以上の前記ＣＤ２０ポジティブ細胞のアポトーシスを誘導する、前記第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート。

【請求項2】

ＣＤ２０ポジティブ細胞の集団においてアポトーシスの誘導から利益を受ける疾患の治療に使用するための第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートであって、前記治療が、
標的化部分及びモルフォリノを含む前記第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のモルフォリノを含む前記第２のコンジュゲートを含む組成物と、ＣＤ２０ポジティブ細胞の集団を接触させることを含み、
前記標的化部分が抗ＣＤ２０抗体又は抗ＣＤ２０Ｆａｂ’フラグメントであり、
前記第１のコンジュゲートの前記モルフォリノが、５’ ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ａ ３’（配列番号２５）又は５’ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣＴ Ｃ ３’（配列番号２６）であり、
前記第２のコンジュゲートの前記１つ以上のモルフォリノが、５’ ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ａ ３’（配列番号２５）又は５’ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣＴ Ｃ ３’（配列番号２６）であり、
前記ＣＤ２０ポジティブ細胞の前記組成物との前記接触が、前記ＣＤ２０ポジティブ細胞のアポトーシスを誘導する、前記第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート。

【請求項3】

前記治療が、（ｉｉｉ）前記ＣＤ２０ポジティブ細胞のアポトーシスを確認することをさらに含む、請求項１又は２に記載の治療に使用するための第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート。

【請求項4】

前記ＣＤ２０ポジティブ細胞が、Ｂ細胞である、請求項１又は２に記載の治療に使用するための第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート。

【請求項5】

前記ＣＤ２０ポジティブ細胞が、対象由来であり、好ましくは、前記対象が非ホジキンリンパ腫又は関節リウマチを有する、請求項１又は２に記載の治療に使用するための第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート。

【請求項6】

前記抗ＣＤ２０抗体が１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ－０２０、ＩＢＩ－３０１、ウブリツキシマブ、又はＢＬＸ－３０１である、請求項１又は２に記載の治療に使用するための第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート。

【請求項7】

前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１又は２に記載の治療に使用するための第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート。

【請求項8】

（ｉ）標的化部分及びモルフォリノを含む第１のコンジュゲートであって、前記標的化部分が抗ＣＤ２０抗体又は抗ＣＤ２０Ｆａｂ’フラグメントである前記第１のコンジュゲート、及び
（ｉｉ）アルブミン及び１つ以上のモルフォリノを含む第２のコンジュゲート
を含むキットであって、
前記第１のコンジュゲートの前記モルフォリノが、５’ ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ａ ３’（配列番号２５）又は５’ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣＴ Ｃ ３’（配列番号２６）であり、
前記第２のコンジュゲートの前記１つ以上のモルフォリノが、５’ ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ａ ３’（配列番号２５）又は５’ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣＴ Ｃ ３’（配列番号２６）であり、
前記第１のコンジュゲートの前記モルフォリノ及び前記第２のコンジュゲートの前記１つ以上のモルフォリノが相補的である、前記キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記述
本発明は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（国立衛生研究所の総合医学科学研究所）により授与された助成金ＲＯ１ ＧＭ９５６０６の下、政府支援で行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。

【背景技術】

【0002】

薬物不含高分子治療薬プラットフォームは、いくつかの疾患及び障害の処置に対して大きな可能性を有する。例えば、本明細書に記載のＣＤ２０の架橋、続く、アポトーシスの誘導は、Ｂ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、及びＢ細胞病変を伴う自己免疫疾患を含む、いくつかの疾患及び障害を処置するために使用することができる。

【0003】

米国では２０１５年に、男女双方で、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の推定７１，８５０人の新規患者及び１９，７９０人の死亡者がいた。ＮＨＬの異種集団の大部分（８５～９０％）は、Ｂリンパ球に由来し、残りは、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞から発生する。Ｂ細胞リンパ腫（Ｂ細胞ＮＨＬ）は、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫を含む。これらの悪性腫瘍は一般に、低悪性度または中悪性度のいずれかに分類され、同時に、これらは、患者が受ける得る治療の種類を表す。現在の標準のＢ細胞ＮＨＬ処置は、化学療法と組み合わせたリツキシマブ（最も一般に使用される抗ＣＤ２０ｍＡｂ）である。しかし、これらの治療法が奏効しないか、またはこれらの治療法に対し耐性を生じる多数の患者が存在する。例えば、再発性／難治性の低悪性度または濾胞性ＮＨＬの処置の全奏効率は通常、４０～５０％（５つの異なる臨床試験において、完全奏効、６、３、１７、３、及び１４％；全奏効、４８、４６、４７、３９、及び４３％）の範囲であった。非応答性及び／または耐性は、免疫エフェクター細胞（例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞）が、ライゲーションしたｍＡｂに超架橋することができないこと、及びＣＤ２０抗原のＦｃ受容体（ＦｃＲ）介在性エンドサイトーシスまたは「トロゴサイトーシス」に起因している。これらの臨床的障壁は、新しく改良された治療方策に対するニーズを生み出している。

【0004】

ＣＤ２０は、９５％を超えるＢ細胞リンパ腫で高度に発現される３５～３７ｋＤａの内在性膜タンパク質である。遊離ＣＤ２０抗原は、血清中に存在せず、ＣＤ２０の既知の天然リガンドは存在しない。抗体に結合する時、ＣＤ２０は、非常に低い細胞内内在化率を有し、それは多くの場合、内在化しない受容体と考えられている。研究は、ＣＤ２０が、ストア作動性カルシウムチャネル及び細胞周期制御因子として機能することを示唆する。それは、Ｂリンパ球の最も信頼できるバイオマーカーの１つであり、それにより、Ｂ細胞ＮＨＬの処置のための理想的な標的を提供する。ＣＤ２０は、正常Ｂ細胞上にも発現されるが、幹細胞または前駆細胞及び成熟または活性化形質細胞上には発現されない。従って、「Ｂ細胞枯渇」治療アプローチは、安全と考えられ；正常なＢ細胞数は、処置後に回復させることができる。抗ＣＤ２０ｍＡｂの治療有効性は、３つの細胞事象：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及びＣＤ２０介在性アポトーシス、に起因する。これらの機序の全ては、機能する免疫エフェクター細胞を必要とする。対照的に、薬物不含高分子治療薬は、エフェクター細胞の助けなしに、Ｂ細胞リンパ腫の直接的且つ特異的なアポトーシスを誘発する。これは、免疫エフェクター細胞の機能を再現する合成エフェクターのデザインにより達成される。

【0005】

アポトーシスを誘導するのに有効な、且つＢ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、及びＢ細胞病変を伴う自己免疫疾患を処置するための組成物及び方法は依然として乏しい。これらのニーズ及び他のニーズは、本発明により満たされる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

アポトーシスを誘導する方法が開示され、方法は、標的化部分及び第１のオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびにアルブミン及び１つ以上の第２のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触は、細胞のアポトーシスを誘導する。一部の態様では、オリゴマー化部分は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドとすることができる。

【0007】

アポトーシスを誘導する方法も開示され、方法は、標的化部分及びモルフォリノオリゴヌクレオチド（モルフォリノ；ＭＯＲＦ）を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびにアルブミン及び１つ以上のモルフォリノを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触は、細胞のアポトーシスを誘導する。

【0008】

アポトーシスを誘導する方法も開示され、方法は、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触は、細胞のアポトーシスを誘導する。

【0009】

アポトーシスを誘導する方法も開示され、方法は、標的化部分及び第１のオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上の第２のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートを含む組成物と、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の組成物との接触は、細胞のアポトーシスを誘導する。一部の態様では、オリゴマー化部分は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドとすることができる。

【0010】

アポトーシスを誘導する方法も開示され、方法は、標的化部分及びモルフォリノを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のモルフォリノを含むコンジュゲートを含む第２のコンジュゲートを含む組成物と、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の組成物との接触は、細胞のアポトーシスを誘導する。

【0011】

アポトーシスを誘導する方法も開示され、方法は、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含むコンジュゲートを含む第２のコンジュゲートを含む組成物と、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の組成物との接触は、細胞のアポトーシスを誘導する。

【0012】

標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートを含むキットが開示される。

【0013】

標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートを含むキットが開示される。オリゴヌクレオチドは、モルフォリノとすることができる。それにより、標的化部分及びモルフォリノを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のモルフォリノを含む第２のコンジュゲートを含むキットが開示される。

【0014】

標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートを含むキットが開示される。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの態様を例示し、本明細書と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ナノコンジュゲートＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_xの合成の概略図を示す。

【図2】Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１及びＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションを示す。２つのコンジュゲートを、異なる比率で混合した時（ｐＨ７．４；ＰＢＳ）、２６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）は、減少した。最大の減色効果（最小のＵＶ吸光度）は、１：１のＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２の比で観察された。

【図3】Ｒａｊｉ Ｂ細胞におけるアポトーシス誘導を示す。アポトーシス細胞の百分率を、アネキシンＶ／ＰＩ結合により分析し、フローサイトメトリーにより定量した。インキュベーション時間は、２４時間であった。未処置：培地中の細胞；Ｆａｂ’／ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）：Ｆａｂ’（１μＭ）、続いて、（１時間後に）ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）二次Ａｂ（０．５μＭ）；Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／Ｐ－（ＭＯＲＦ２）₁₄：Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１（１μＭ）及び（１時間後に）Ｐ－（ＭＯＲＦ２）₁₄（１μＭのＭＯＲＦ２当量）；Ｆａｂ’_IF5－ＭＯＲＦ１／Ｐ－（ＭＯＲＦ２）₁₁：Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１（１μＭ）及び（１時間後に）Ｐ－（ＭＯＲＦ２）₁₁（１μＭ ＭＯＲＦ２当量）；Ｆａｂ’_IF5－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀：Ｆａｂ’_IF5ＭＯＲＦ１（１μＭ）及び（１時間後に）ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀（１μＭ、ＭＯＲＦ２当量）；Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁：Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及び（１時間後に）ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀（１μＭ、ＭＯＲＦ２当量）；１Ｆ５／ＧＡＭ：１Ｆ５ ｍＡｂ（１μＭ）、続いて、（１時間後に）ヤギ抗マウス二次Ａｂ（０．５μＭ）；凍結乾燥１Ｆ５／ＧＡＭ：凍結乾燥１Ｆ５を使用した。（Ｆａｂ’_1F5：１Ｆ５抗体のフラグメント；Ｆａｂ’_RTX：リツキシマブ抗体のフラグメント）

【図4】ＳＣＩＤマウスの全身性リンパ腫に対する治療有効性を示す。０日目に、４００万のＲａｊｉ Ｂ細胞を、尾静脈から注射した；マウスの後肢麻痺の発生または生存を、１００日目まで監視した。１、３、及び５日目の３回投与処置。ＰＢＳ：ＰＢＳが注射されたマウス（ｎ＝４）；Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7：Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及び５時間後のＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7の逐次的処置、３回投与（ｎ＝５；ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１）；Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀：Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１及び５時間後のＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀の逐次的処置、３回投与（ｎ＝５；ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１）；オビヌツズマブ：１日目の単回投与。麻痺のないマウスの生存率を、カプラン－マイヤープロットで提示される。各群の長期生存者数を示す。

【図5】ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ（Ｆａｂ１Ｆ５－ＭＯＲＦ１との同時処置）の置換の程度がＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシス誘導に及ぼす影響を示す。アポトーシス細胞の百分率を、アネキシンＶ／ＰＩ結合により分析し、フローサイトメトリーにより定量した。インキュベーション時間は、２４時間であった。培地中の未処置の細胞；１Ｆ５／ＧＡＭ、１Ｆ５ ｍＡｂ（０．５μＭ）、続いて、（１時間後）ヤギ抗マウス二次Ａｂ（０．２５μＭ）；Ｐ：Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ、Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１（１μＭ）及び置換の程度が異なるＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ（ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_6.3またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7；１μＭ、ＭＯＲＦ２当量）の予備混合物；Ｃ：Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ、逐次的な、Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１（１μＭ）、続いて、（１時間後に）置換の程度が異なるＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ（ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_6.3またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7、１μＭ、ＭＯＲＦ２当量）。アポトーシス細胞の百分率を、フローサイトメトリーにより定量した。別途指示のない限り、逐次的な各処置を、予備混合された処置と比較することにより、統計を実施した（^***Ｐ＜０．０００１、^**Ｐ＜０．００５、^*Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．：有意差なし）。全てのデータを、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として提示する。

【図6】ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ（Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１と同時処置）の置換の程度が、Ｒａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシス誘導に及ぼす影響を示す。アポトーシス細胞の百分率を、アネキシンＶ／ＰＩ結合により分析し、フローサイトメトリーにより定量した。インキュベーション時間は、２４時間であった。未処置、培地中の細胞；ＲＴＸ／ＧＡＭ、ＲＴＸ ｍＡｂ（０．５μＭ）、続いて、（１時間後）ヤギ抗マウス二次Ａｂ（０．２５μＭ）；Ｐ：Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ、Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１（１μＭ）及び置換の程度の異なるＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ（ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_6.3またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7；１μＭ、ＭＯＲＦ２当量）の予混合物。Ｃ：Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ、逐次的な、Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１（１μＭ）、続いて、（１時間後に）置換の程度が異なるＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ（ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_6.3またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀またはＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7、１μＭ、ＭＯＲＦ２当量）。アポトーシス細胞の百分率を、フローサイトメトリーにより定量した。別途指示のない限り、逐次的な各処置を、予備混合された処置と比較することにより、統計を実施した（^***Ｐ＜０．０００１、^**Ｐ＜０．００５、^*Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．：有意差なし）。全てのデータを、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として提示する。

【図7】図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、Ｒａｊｉ細胞表面上のＣｙ５－のＦａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及びＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２の間の共局在化の可視化を示す。図Ａは、Ｃｙ５－Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及びＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２で処置されたＲａｊｉ細胞の代表的な共焦点画像。Ｒａｊｉリンパ腫Ｂ細胞を、２つのコンジュゲートの予備混合物と共にインキュベートし、または逐次的にＣｙ５－Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１、次に、ＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２に曝露した。逐次的処置では、ブロッキング目的のために、過剰（１００倍）のＲＴＸ抗体（Ａｂ）を、Ｃｙ５－Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１の前に添加し、または過剰（１００倍）のＭＯＲＦ２を、ＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２前に添加した。（Ｃｙ５－Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１なしに）ＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２のみで処置された細胞は、対照として機能した。Ｃｙ５；ＦＩＴＣ。スケールバー、２０μｍ。図７Ｂ及び図７Ｃは、Ｒａｊｉ細胞表面上のＣｙ５－Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及びＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２の分布パターンのＺスタック共焦点画像。図Ｂでは、Ｒａｊｉ細胞を、２つのコンジュゲートの予備混合物と共にインキュベートした。図７Ｃでは、Ｒａｊｉ細胞を、逐次的に２つのコンジュゲートと共に処置した。グラチクルサイズ、１０μｍ。

【0016】

本発明のさらなる利点は、部分的には、続く説明に記載されるか、部分的には、説明から明らかとなるか、または本発明の実施により習得することができる。上述の一般的な説明及び次の詳細な説明はともに、例示的なものであり、且つ特許請求の範囲に記載の本発明を限定するものではないことを理解すべきである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、本発明の次の詳細な説明及びそれに含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。

【0018】

本化合物、組成物、物品、システム、デバイス、及び／または方法が開示及び記載される前に、それらが、別途明記のない限り、具体的な合成方法、または、別途明記のない限り、特定の試薬、に限定されず、そのようなものであるから、当然変動し得ることを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、且つ限定するものではないことも理解すべきである。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法及び材料をここに記載する。

【0019】

本明細書で言及された全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連した方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提示される。本明細書には、本発明が先行発明により、このような刊行物に先立つ権利が与えられないことを容認するものと解釈されるべきものはない。

【0020】

Ａ．定義
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。

【0021】

本明細書では、範囲は、「約」１つの特定値から、及び／または「約」別の特定値まで、として表現することができる。このような範囲が表現される時、さらなる態様は、１つの特定値から、及び／またはもう１つの特定値まで、を含む。同様に、値が、先行する「約」を使用して近似値として表される場合、その特定値がさらなる態様を形成すると理解されるであろう。さらに、各範囲の端点は、他の端点に関連しても、他の端点と無関係でも、重要であることが理解されるであろう。本明細書に開示の多数の値があり、各値もまた、その値自体に加えて、「約」その特定値として、本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。２つの特定単位間の各単位もまた開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

【0022】

本明細書及び最後の特許請求の範囲における、組成物中の特定の要素または構成成分の重量部への言及は、重量部が表す組成物または物品中の、要素または構成成分と他の任意の要素または構成成分との間の重量関係を示す。従って、２重量部の構成成分Ｘ及び５重量部の構成成分Ｙを含有する化合物では、Ｘ及びＹは、２：５の重量比で存在し、さらなる構成成分が化合物中に含有されるかどうかに関わらず、このような比で存在する。

【0023】

本明細書で使用される場合、「任意の」または「任意に」という用語は、続いて記載される事象または状況が起こり得るか、または起こり得ないこと、ならびにその記載が該事象または状況が起こる場合及びそれが起こらない場合を含むこと、を意味する。例えば、一態様では、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートは、検出可能な標識を任意に含むことができる。一態様では、開示される方法は、開示される組成物及び／またはコンジュゲートの投与を繰り返すことを任意に含むことができる。

【0024】

本明細書で使用される場合、「アナログ」という用語は、親化合物（例えば、本明細書に開示の化合物）の構造に由来する構造を有する化合物を指し、その構造は、本明細書に開示されるものと十分に類似しており、その類似性に基づいて、特許請求される化合物と同じもしくは類似の活性及び有用性を示すこと、または前駆体として、特許請求される化合物と同じもしくは類似の活性及び有用性を誘導することが、当業者により予想されるであろう。

【0025】

本明細書で使用される場合、「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」または「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」は、特定の既知の配列と相同性を有するポリペプチドまたは核酸を指す。記載されたまたは既知の配列と、少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、またはそれ以上のパーセント相同性を有する本明細書に開示の核酸及びポリペプチドの多様体が、具体的に開示される。２つ以上のタンパク質または２つ以上の核酸の相同性をどのように決定するかを、当業者らは容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最高レベルになるように、２つ以上の配列をアラインした後に、計算することができる。本明細書に開示される遺伝子及びタンパク質の任意の多様体、改変体、または誘導体を定義する１つの手段は、具体的な既知の配列との相同性に関して、多様体、改変体、及び誘導体を定義することによると理解されている。

【0026】

本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、好ましくは、具体的な手段で、標的分子と相互作用する分子を指す。通常、アプタマーは、ステムループまたはＧカルテットなどの規定の二次構造及び三次構造に折りたたまれる長さが１５～５０塩基の範囲の小さい核酸である。アプタマーは、小分子及び大分子を結合することができる。アプタマーは、１０^-12Ｍ未満の標的分子のＫｄで、非常に強く結合することができる。アプタマーは、非常に高い特異度で、標的分子に結合することができる。アプタマーは、当該技術分野で既知であり、様々な異なる標的分子を結合するためのアプタマーの作製及び使用方法の代表例は、次の非限定的な米国特許のリスト：５，４７６，７６６、５，５０３，９７８、５，６３１，１４６、５，７３１，４２４、５，７８０，２２８、５，７９２，６１３、５，７９５，７２１、５，８４６，７１３、５，８５８，６６０、５，８６１，２５４、５，８６４，０２６、５，８６９，６４１、５，９５８，６９１、６，００１，９８８、６，０１１，０２０、６，０１３，４４３、６，０２０，１３０、６，０２８，１８６、６，０３０，７７６、及び６，０５１，６９８、に見出すことができる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「標的化部分」は、例えば、Ｂ細胞などの細胞または細胞の集団の表面上の認識分子に特異的である可能性がある。開示される組成物及び方法の一態様では、標的化部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、全長抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、ハイブリッドフラグメント、ファージディスプレイ抗体、リボソームディスプレイ抗体、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチドリガンド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、糖類、または多糖、及びアプタマーを含むことができるが、これらに限定されない。

【0028】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、動物、を指す。「対象」という用語は、家庭動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含む。従って、本明細書に開示の方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類、とすることができる。あるいは、本明細書に開示の方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモット、または齧歯動物とすることができる。この用語は、特定の年齢または性別を表すものではない。従って、男女関わらず、成人対象及び新生児対象、ならびに胎児が網羅されるものとする。一態様では、対象は、ヒト患者とすることができる。

【0029】

患者は、１つ以上の疾患または障害、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、及びＢ細胞が関与する自己免疫疾患など、に罹患している対象を指す。一態様では、疾患及び障害は、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症を含むが、これらに限定されない。一態様では、対象は、次のうちの１つ以上を有することができる：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症。一態様では、患者は、ＪＣウイルスを有する。一態様では、患者は、臓器移植を受けている。開示される方法の一態様では、患者は、投与ステップの前に、上述の疾患または障害のうちの１つ以上の処置の必要があると診断されている。開示される方法の一態様では、患者は、例えば、悪性Ｂ細胞などの悪性細胞のアポトーシスを誘導する必要があると診断されている。

【0030】

本明細書で使用される場合、「非ホジキンリンパ腫」または「ＮＨＬ」は、リンパ組織の癌を指す。異質な状態として、ＮＨＬは、リンパ節及び全身の系の肥大を引き起こす可能性がある。

【0031】

本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、疾患、病的状態、または障害（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、及びＢ細胞が関与する自己免疫疾患など）を治癒させ、改善し、安定化させ、または予防する意向の患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的処置、つまり、疾患、病的状態、または障害の改善に具体的に向けられた処置を含み、原因処置、つまり、関連疾患、病的状態、または障害の原因の除去に直接向けられた処置も含む。加えて、この用語は、緩和療法、つまり、疾患、病的状態、または障害の治癒よりも症状の軽減のためにデザインされた処置；予防的処置、つまり、関連する疾患、病的状態、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的もしくは完全に抑制することに関連する処置；及び支持的処置、つまり、関連疾患、病的状態、または障害の改善に向けられた別の具体的な治療を補完するために用いられる処置を含む。種々の態様では、この用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含む対象の任意の処置を網羅し、（ｉ）疾患に罹患しやすい可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患が生じることを予防すること；（ｉｉ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること；または（ｉｉｉ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと、を含む。

【0032】

本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防すること」という用語は、特に、事前の作用により、何かが起こるのを妨げ、回避し、未然に防ぎ、予め妨げ、停止させ、または妨害することを指す。低減させる、抑制する、または予防するが、本明細書で使用される場合、特に別途指示のない限り、他の２つの単語の使用もまた、明示的に開示されると理解されている。一態様では、悪性細胞成長を防止することが意図される。

【0033】

本明細書で使用される場合、「診断される」という用語は、熟練者、例えば、内科医、による診察を受けており、且つ本明細書に開示の化合物、組成物、または方法により診断または処置することができる状態を有することが判明していることを意味する。例えば、「ＮＨＬと診断される」は、熟練者、例えば、内科医、による診察を受けており、且つＢ細胞などの細胞の集団において、悪性細胞成長を予防もしくは抑制し、及び／またはアポトーシスを誘導することができる化合物または組成物により診断することができるか、または処置することができる状態を有することが判明していることを意味する。さらなる例として、「アポトーシスを誘導する必要があると診断される」は、熟練者、例えば、内科医、による診察を受けており、且つ悪性細胞成長、または細胞の集団のアポトーシスを誘導することが対象に有益である他の疾患を特徴とする状態を有することが判明していることを指す。このような診断は、本明細書で考察されるような、障害、例えば、ＮＨＬなどに関するものとすることができる。

【0034】

本明細書で使用される場合、「１つ以上のオリゴヌクレオチド」は、「１つ以上のモルフォリノ」を指すことができる。例えば、一態様では、アルブミンを含む開示されるコンジュゲートは、１つ以上のグラフトされたオリゴヌクレオチドを含むことができるか、または１つ以上のグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、「１つ以上のオリゴヌクレオチド」または「１つ以上のモルフォリノ」は、１つのモルフォリノ、または２つのモルフォリノ、または３つのモルフォリノ、または４つのモルフォリノ、または５つのモルフォリノ、または６つのモルフォリノ、または７つのモルフォリノ、または８つのモルフォリノ、または９つのモルフォリノ、または１０のモルフォリノを含むことができる。例えば、一態様では、アルブミンを含む開示されるコンジュゲートは、１つのモルフォリノを含むことができる。一態様では、アルブミンを含む開示されるコンジュゲートは、３つのモルフォリノを含むことができる。一態様では、アルブミンを含む開示されるコンジュゲートは、１０のモルフォリノを含むことができる。一態様では、アルブミンを含む開示されるコンジュゲートは、１０を超えるグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、１つ以上のモルフォリノは、１つ以上のグラフトされたＭＯＲＦ２モルフォリノを含むことができる。例えば、開示されるアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートは、１つのグラフトされたモルフォリノ、または３つのグラフトされたモルフォリノ、または１０のグラフトされたモルフォリノ、または１０のグラフトされたモルフォリノ、または１０を超えるグラフトされたモルフォリノを含むことができる。例えば、開示されるアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートは、１つのグラフトされたＭＯＲＦ２、または３つのグラフトされたＭＯＲＦ２、または１０のグラフトされたＭＯＲＦ２、または１５のグラフトされたＭＯＲＦ２、または１５を超えるグラフトされたＭＯＲＦ２を含むことができる。

【0035】

本明細書で使用される場合、「障害の処置の必要があると同定される」などの語句は、障害の処置の必要性に基づく対象の選択を指す。例えば、対象は、当業者による早期の診断に基づいて、障害（例えば、ＮＨＬまたは悪性細胞成長に関連する一部の他の障害または細胞の集団のアポトーシスを必要とする障害）の処置の必要があると同定し、その後、障害に対する処置を受けることができる。一態様では、同定は、診断を行う者とは異なる者により実施することができると考えられる。さらなる態様では、投与は、診断を実施した者が実施することができるとも考えられる。

【0036】

本明細書で使用される場合、「投与すること」及び「投与」という用語は、開示される組成物、コンジュゲート、または医薬調製物を対象に提供する任意の方法を指す。このような方法は、当業者らに周知であり、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼内投与、耳内投与、脳内投与、直腸内投与、舌下投与、口腔投与、ならびに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与などの注射用を含む非経口投与を含むが、これらに限定されない。投与は、連続的または断続的であり得る。種々の態様では、調製物は、治療的に投与することができ；つまり、既存の疾患または状態を処置するために投与することができる。さらに種々の態様では、調製物は、予防的に投与することができ；つまり、疾患または状態の予防のために投与することができる。一態様では、当業者は、対象を処置するか、またはアポトーシスを誘導するために、開示される組成物または開示されるコンジュゲートに対する有効な用量、有効なスケジュール、または有効な投与経路を決定することができる。一態様では、当業者は、開示されるコンジュゲートまたは開示される組成物の有効性を改善するために、投与ステップの一態様を変更または修正することもできる。

【0037】

本明細書で使用される場合、「１つ以上の投与ステップを変更すること」は、１つ以上の開示される組成物または開示されるコンジュゲートの投与を変更または修正することを含むことができる。一態様では、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを投与することは、例えば、投与経路を変えること、または組成物の用量を変えること、または投与のタイミングを変えること、または投与の頻度を変えること、またはそれらの組み合わせにより、変更することができる。一態様では、共重合体担体及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを投与することは、例えば、投与経路を変えること、または組成物の用量を変えること、または投与のタイミングを変えること、または投与の頻度を変えること、またはそれらの組み合わせにより、変更することができる。一態様では、１つ以上の投与ステップを変更することは、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートの投与を変更すること、ならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートの投与を変更することを含むことができる。

【0038】

本明細書で使用される「接触させる」という用語は、直接的（すなわち、標的自体と相互作用することにより）または間接的（すなわち、標的の活性が依存する別の分子、補因子、因子、もしくはタンパク質と相互作用することにより）のいずれかで、開示される組成物、化合物、またはコンジュゲートが、目的の標的（例えば、受容体、転写因子、細胞、細胞の集団など）の活性に影響を及ぼし得るように、開示される組成物、化合物、またはコンジュゲートを、目的の標的（例えば、細胞もしくは細胞の集団、受容体、抗原、または他の生物学的エンティティ）と一緒にすることを指す。一態様では、開示される組成物またはコンジュゲートは、例えば、Ｂ細胞などの細胞または細胞の集団と接触させることができる。

【0039】

本明細書で使用される場合、「決定すること」という用語は、発現及び／または活性レベルまたは有病率及び／または発病率における活性もしくは事象または数量もしくは量または変化を測定または確認することを指すことができる。例えば、決定することは、アポトーシス誘導の数量または量を測定または確認することを指すことができる。決定することは、カスパーゼ活性または発現の数量または量を測定または確認することを指すこともできる。本明細書で使用されるような発現及び／または活性レベルまたは罹患率及び／または発病率における活性もしくは事象または数量もしくは量または変化を測定するために使用される方法及び技術は、当業者が一部の定量化可能な値を測定または確認するために必要とするステップを指すことができる。当該分野は、発現及び／または活性レベルまたは有病率及び／または発病率における活性もしくは事象または数量もしくは量または変化を測定する手段に精通している。

【0040】

本明細書で使用される場合、「有効量」及び「有効な量」という用語は、所望の結果を達成するか、または望ましくない状態に影響を与えるのに十分である量を指す。例えば、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するか、または望ましくない症状に影響を与えるのに十分であるが、一般に有害な副作用を引き起こすのに不十分な量を指す。例えば、一態様では、開示される組成物またはコンジュゲートの有効量は、所望の細胞または細胞の集団においてアポトーシスを誘導するのに有効な量である。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効な用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；用いられる具体的な化合物の投与時期；投与経路；排泄率；処置の期間；用いられる具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医療技術分野で周知の類似の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで、開示される組成物またはコンジュゲートの投与を開始すること、及び所望の効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させることは、十分に当該技術分野の技量の範囲内である。必要に応じて、有効な１日用量は、投与のために複数回用量に分割することができる。従って、単回投与組成物は、１日用量を構成する、このような量またはその約数を含有することができる。禁忌の場合には、投薬量は、個々の医師が調整することができる。投薬量は変動することができ、１日または数日間、１日１回以上の用量で投与することができる。一態様では、調製物は、「予防的有効量」で投与することができ、つまり、疾患または状態の予防に有効な量である。

【0041】

「薬学的に許容される」という用語は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではなく、すなわち、許容できないレベルの望ましくない生物学的効果を引き起こすことのない、または有害な仕方で相互作用することのない、材料を表す。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、滅菌水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、ならびに使用直前に滅菌注射用溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末を指す。好適な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロース及びそれらの好適な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、ならびにエチルオレアートなどの注射用有機エステルが挙げられる。これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントも含有することができる。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含むことにより確保することができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい可能性もある。モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの、吸収を遅らせる薬剤を含むことにより、注射用医薬形態の持続的吸収をもたらすことができる。注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、及びポリ（無水物）などの生分解性ポリマー中に、薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマーの比及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。デポー注射製剤は、体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を封入することによっても調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過により、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。好適な不活性担体は、ラクトースなどの糖を含むことができる。

【0042】

「オリゴマー化部分（oligomerization moiety）」という用語は、第１のオリゴマー化部分の、１つ以上の第２のオリゴマー化部分へのオリゴマー化を促進または可能にする部分を指す。例えば、「オリゴマー化部分」は、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチドまたはオリゴ糖とすることができる。

【0043】

Ｂ．組成物
開示されるコンジュゲートは、アポトーシスを誘導する開示される方法及び本明細書に開示の処置方法に使用することができる。

【0044】

ｉ）標的化部分及びオリゴマー化部分を含むコンジュゲート
標的化部分及びオリゴマー化部分を含むコンジュゲートが本明細書に開示される。例えば、オリゴマー化部分は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドとすることができる。

【0045】

一態様では、開示されるコンジュゲートは、検出可能な標識をさらに含むことができる。検出可能な標識は、当業者に既知であり、ローダミン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０を含むが、これらに限定されない。

【0046】

（ａ）標的化部分
限定されないが、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドなどのオリゴマー化部分に結合、連結、または付着することができる標的化部分が開示される。

【0047】

開示されるコンジュゲートの一態様では、標的化部分は、内在化しない細胞表面分子（non-internalizing cell surface molecule）または徐々に内在化する細胞表面分子（slowly internalizing cell surface molecule）に特異的であり得る。内在化しない細胞表面分子または徐々に内在化する細胞表面分子の例は、当業者に既知である。一態様では、内在化しない細胞表面分子または徐々に内在化する細胞表面分子は、細胞または細胞の集団上にあり得る。一態様では、細胞または細胞の集団は、Ｂ細胞とすることができる。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞とすることができる。一態様では、Ｂ細胞は、悪性Ｂ細胞とすることができる。

【0048】

開示されるコンジュゲートの一態様では、内在化しない細胞表面分子は、受容体とすることができる。一態様では、徐々に内在化する細胞表面分子は、受容体とすることができる。例えば、内在化しない細胞表面分子または徐々に内在化する細胞表面分子は、ＣＤ２０受容体、Ｃ型タンパク質チロシンホスファターゼ受容体（ＰＴＰＲＣ）、細胞表面デス受容体、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体を含むが、これらに限定されない。腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、デス受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びアポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）を含む。一態様では、受容体は、ＣＤ２０受容体とすることができる。一態様では、受容体は、Ｃ型タンパク質チロシンホスファターゼ受容体（ＰＴＰＲＣ）とすることができる。一態様では、受容体は、細胞表面デス受容体とすることができる。一態様では、受容体は、デス受容体４（ＤＲ４）とすることができる。一態様では、受容体は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体とすることができる。一態様では、受容体は、デス受容体５（ＤＲ５）である。一態様では、受容体は、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）とすることができる。一態様では、受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）とすることができる。一態様では、受容体は、アポトーシス受容体のＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）とすることができる。

【0049】

開示されるコンジュゲートの一態様では、標的化部分は、多糖、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’フラグメント、または単鎖可変フラグメントとすることができる。一態様では、標的化部分は、多糖とすることができる。一態様では、標的化部分は、ペプチドリガンドとすることができる。一態様では、標的化部分は、アプタマーとすることができる。一態様では、標的化部分は、一本鎖可変フラグメントとすることができる。一態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’フラグメントとすることができる。一態様では、Ｆａｂ’フラグメントは、ヒト化することができる。一態様では、Ｆａｂ’フラグメントは、抗ＣＤ２０受容体抗体に由来することができる。抗ＣＤ２０受容体抗体の例は、当該技術分野で既知であり、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ－０２０、ＩＢＩ－３０１、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、及びＢＬＸ－３０１を含むが、これらに限定されない。一態様では、抗ＣＤ２０受容体抗体は、１Ｆ５とすることができる。

【0050】

（ｂ）オリゴマー化部分
オリゴマー化部分は、複合体を形成するために、少なくとも１つの他のオリゴマー化部分に結合するか、またはこれと相互作用することができる任意の化合物（例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴ糖）とすることができる。

【0051】

標的化部分またはアルブミンに結合、連結、または付着することができるオリゴマー化部分が開示される。

【0052】

（ｉ）オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知である。開示されるコンジュゲートの一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性及び非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性及び電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、次の：生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性のうちの１つ以上とすることができる。例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性とすることができる。

【0053】

開示されるコンジュゲートの一態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸とすることができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルとすることができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートとすることができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸とすることができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルホスホジエステルとすることができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ロックオリゴヌクレオチドとすることができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノとすることができる。

【0054】

（ａ）モルフォリノ
本明細書に開示の組成物及び方法は、化学的に修飾された骨格を有する、生体適合性合成オリゴヌクレオチドアナログを利用することができる。以下に示す概略図は、いくつかのアナログを示し、これらのアナログの特性を天然のＤＮＡと比較する。

【0055】

好ましくは、アナログは、生体適合性且つ非分解性であり得、開示される組成物及び方法は、ホスホロジアミダートモルフォリノオリゴヌクレオチド（モルフォリノまたはＭＯＲＦとしても知られる）を利用することができる。本明細書で使用される場合、「ＭＯＲＦ」という用語は、モルフォリノを指す。例えば、「ＭＯＲＦ１」は、第１のモルフォリノを指すことができ、「ＭＯＲＦ２」は、第２のモルフォリノを指すことができる。一部の態様では、ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２は、オリゴマー化する可能性がある。モルフォリノは、化学的に修飾された非荷電骨格を有し、４つの異なるサブユニットが集合し、これらのそれぞれは、６員モルフォリン環に連結される４つの核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）のうちの１つを含有する。サブユニットは、モルフォリノオリゴヌクレオチドを生成するために、非イオン性ホスホルアミダート連結により結合される。モルフォリノは、強い結合親和性（すなわち、低ｎＭからｐＭレベルまでのＫｄ）、高い配列特異性、及び十分に実証された安全性プロファイルも有する。さらに、モルフォリノの免疫原性は、高度に配列依存性であり、従って、対処することができる。モルフォリノの合成、構造、及び結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、及び同第５，５０６，３３７号に詳細に記載されており、これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0056】

長さがより長い開示されるモルフォリノは、より高い特異性及びより強い結合親和性を提供するが、このようなモルフォリノは、不十分な水溶性も有する。当該技術分野では、１４ｂｐ～１５ｂｐのモルフォリノは、理想的な標的化効果を維持するのに必要な最小長と考えられている。２５ｂｐのモルフォリノは、強い結合親和性及び良好な水溶性（約５～３０ｍＭ）を確保することができる。例えば、開示される組成物及び方法において２５ｂｐのモルフォリノを使用することは、第１及び第２のモルフォリノ（例えば、ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２）のハイブリダイゼーションに対する立体障害の影響を回避することができる。より長い配列は、ハイブリダイゼーションに関し、より良い「立体的柔軟性」を提供することができる。従って、本明細書に開示の組成物及び方法では、モルフォリノは、１０ｂｐ～４０ｂｐを含むことができる。一態様では、例えば、モルフォリノは、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ｂｐであり得る。

【0057】

開示されるモルフォリノのＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇの含量は、３つの要因：（１）Ｇ＋Ｃ含量（Ｇ及びＣの＃または％）、（２）Ｇ含量（Ｇの＃または％）、及び（３）Ｃ含量（Ｃの＃または％）に基づいて決定することができる。

【0058】

Ｇ＋Ｃ含量に関しては、開示されるモルフォリノは、約３５％～約６５％のＧ＋Ｃ含量を含むことができる。この範囲は、最適な結合効力及び特異性を提供することができる。Ｇ含量に関しては、開示されるモルフォリノは、約３６％未満のＧ含量を含むことができる。このレベルのＧ含量は、良好な水溶性を提供することができるが、４つ以上のＧの繰り返しは、避けるべきである。Ｃ含量に関しては、開示されるモルフォリノは、７つ未満のＣ含量を含むことができる。このレベルのＣ含量は、モルフォリノの腎臓蓄積を増強するという好ましくない効果を回避することができることを確実にできる。さらに、アルブミンを有する１つ以上のモルフォリノのコンジュゲーションは、モルフォリノの薬物動態プロファイルを変更することができ、腎臓蓄積を（モルフォリノ及びＦａｂ’フラグメントのコンジュゲーションと比較して）低減させることができる。表１は、様々なレベルのＣ含量を含むモルフォリノの腎臓蓄積を示す。２５Ｃを有するモルフォリノは、注射のちょうど３時間後に、正常マウスの腎臓において最も高いパーセント蓄積を示した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、２００４）。
表１

【0059】

開示される組成物及び方法では、Ｆａｂ’フラグメントにコンジュゲートされるモルフォリノは、より多くのＡ及びより少ないＣを含むことができるが、アルブミン担体にコンジュゲートされる１つ以上のモルフォリノは、より多くのＣ及びより少ないＡを含むことができる。従って、一態様では、２５ｂｐのモルフォリノは、３Ｃ、６Ｇ、１２Ａ、４Ｔを含むことができる（Ｇ＋Ｃ＝３６％、Ｇ＝２４％）。相補的２５ｂｐのモルフォリノは、６つのＣ、３つのＧ、４つのＡ、１２のＴを含むことができる（Ｇ＋Ｃ＝３６％、Ｇ＝１２％）。

【0060】

各モルフォリノの核酸塩基組成を決定した後、公にアクセス可能なオンライン配列「スクランブラ」を使用して、ヒトｍＲＮＡを用いる最小の標的外結合を確保することができる。さらに、公にアクセス可能なオンライン配列解析ソフトウエアを使用して、最小の自己相補性を確保することができる。本明細書に開示の実験では、自己相補性を回避するために配列解析を実施する時、「自己二量化に必要な最小の塩基対」及び「ヘアピンに必要な最小塩基対」を、「２」及び「２」（１０ｂｐ及び１２ｂｐの場合）；「３」及び「３」（１５ｂｐ、１８ｂｐ、２０ｂｐ、２３ｂｐ、及び２５ｂｐの場合）；「４」及び「４」（２８ｂｐ、３０ｂｐ、３２ｂｐ、及び３５ｂｐの場合）；ならびに「５」及び「４」（３８ｂｐ及び４０ｂｐの場合）に設定した。表２は、開示される組成物及び方法に使用される例示的モルフォリノのリストを提供する。
表２－例示的モルフォリノのリスト

【0061】

一態様では、一対の開示されるモルフォリノ間のハイブリダイゼーションは、塩基対形成（すなわち、特異的水素結合パターン）により達成することができる。ハイブリダイゼーションは、塩基スタッキング（すなわち、π相互作用）により維持することができる。

【0062】

一態様では、開示される組成物及び方法に利用されるモルフォリノは、完全に相補的（１００％）であり得るか、または完全に相補的以外であり得る。従って、一態様では、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１コンジュゲートのモルフォリノ及びアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートの１つ以上のモルフォリノのパーセント相補性は、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～１００％相補的であり得る。一態様では、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１コンジュゲートのモルフォリノ及びアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートの１つ以上のモルフォリノは、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的であり得る。一態様では、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１コンジュゲートのモルフォリノ及びアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートの１つ以上のモルフォリノは、少なくとも９３％相補的であり得る。

【0063】

一態様では、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１コンジュゲートのモルフォリノ及びアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートの１つ以上のモルフォリノは、１５ｎＭ以下の平衡解離定数Ｋｄを有することができる。一態様では、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１コンジュゲートのモルフォリノ及びアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートの１つ以上のモルフォリノは、１０^-7Ｍ未満の結合定数（Ｋｄ）を有することができる。一態様では、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１コンジュゲートのモルフォリノ及びアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートの１つ以上のモルフォリノは、１０^-9Ｍ未満の結合定数（Ｋｄ）を有することができる。

【0064】

一態様では、開示されるモルフォリノは、例えば、ヒトゲノムなどのゲノムの任意のｍＲＮＡ標的に結合しない。一態様では、開示されるモルフォリノは、自己相補的ではない。一態様では、モルフォリノは、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）修飾することができる。

【0065】

開示されるコンジュゲートの一態様では、モルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得、３つのシチジン、６つのグアノシン、１２のアデノシン、及び４つのチミジンを含むことができる。例えば、一態様では、３つのシチジン、６つのグアノシン、１２のアデノシン、及び４つのチミジンを含むモルフォリノは、５’ ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ ３’（配列番号２５）とすることができる。一態様では、開示されるコンジュゲートのモルフォリノは、約３５％～約６５％のＧＣ含量を含むことができる。一態様では、モルフォリノは、３６％未満のＧ含量を含むことができる。一態様では、モルフォリノは、７つ以下のＣを含むことができる。

【0066】

開示されるコンジュゲートの一態様では、標的化部分は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションの種類及びコンジュゲートするための方法は、当該技術分野に既知である。一態様では、開示されるコンジュゲートの標的化部分は、例えば、共有結合を介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。一態様では、標的化部分は、チオール基を介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。チオール基は、当該技術分野で既知である。開示されるコンジュゲートの一態様では、標的化部分は、チオエーテル結合、チオール－マレイミド結合、チオール－ビニルスルホン結合、チオール－ハロゲン結合、チオール－ペンタフルオロフェニルエステル結合、チオール－エン結合、またはチオール－イン結合を介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。

【0067】

標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートが本明細書に開示され、標的化部分は、Ｆａｂ’フラグメントであり、Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＤ２０受容体に特異的であり、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり、Ｆａｂ’フラグメントは、チオエーテル結合を介してモルフォリノにコンジュゲートされる。

【0068】

（ｉｉ）オリゴペプチド
オリゴペプチドは、当該技術分野で既知である。開示されるコンジュゲートの一態様では、オリゴペプチドは、生体適合性であり得る。一態様では、オリゴペプチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴペプチドは、水溶性であり得る。

【0069】

（ａ）コイルドコイル形成ペプチド
開示されるコンジュゲートの一態様では、１つ以上のコイルドコイル形成ペプチドは、（例えば、それぞれ第１または第２のコンジュゲート中で）標的化部分またはアルブミンに結合させることができる。

【0070】

コイルドコイルは、天然タンパク質の基本的な折りたたみパターンの１つである。それは、わずかに左巻きのαヘリックスを形成するために、一緒に巻かれている２つ以上の右巻きのαヘリックスからなる。コイルドコイルモチーフの一次構造は、［ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ］_xとして示される繰り返しのヘプタドの配列を特徴とし、式中、ａ及びｄは通常、疎水性アミノ酸残基であるが、他のものは、極性アミノ酸残基である。２つのヘリックスは、ａ及びｄの間の疎水性界面を介して会合し、ｂ、ｃ、及びｆを外側に向ける。残基ｅとｇの間のヘリックス間静電相互作用は、コイルドコイルの安定性に寄与する。それらの詳細な構造に応じて、αヘリックスは、平行または逆平行のアラインメントで、ホモ二量体、ヘテロ二量体として会合するか、またはより高次の（例えば、四量体）凝集体を形成し得る。疎水性アミノ酸の例は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐである。

【0071】

２つ以上のコイルドコイル形成ペプチドは、互いにヘリックスを形成することにより相互作用することができる。コイルドコイル形成ペプチドは、コイルドコイル構造を形成する任意のアミノ酸配列とすることができる。本明細書に例示されるコイルドコイルドメインは、様々なタンパク質からクローニングされたものであるが、得られるコイルドコイルドメインが、コイルドコイル構造と当業者により認識される限り、種々の変異及び誘導体化が本発明に包含され、コイルドコイルドメイン含有キメラは、多量体を形成する可能性があり、容易に可溶性であり、天然のリガンドまたは受容体に関して同様のまたはより高い効力を提供することができることが理解される。

【0072】

コイルドコイル形成ペプチドは、それらの天然に存在するペプチドまたはキメラコイルドコイル形成ペプチドとすることができる。キメラコイルドコイル形成ペプチドは、天然に存在するコイルドコイル形成ペプチドフラグメントの組み合わせとすることができる。

【0073】

本明細書に開示される方法及び組成物に使用されるペプチドの例を表３に示す。
表３：オリゴペプチド（^*ペプチドは、Ｄ－アミノ酸残基からなる）

【0074】

ｉｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含むコンジュゲート
アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含むコンジュゲートは、本明細書に開示される。

【0075】

一態様では、開示されるコンジュゲートは、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、当該技術分野で既知であり、ローダミン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０を含むが、これらに限定されない。

【0076】

（ａ）アルブミン
アルブミンを含むコンジュゲートが開示される。一部の態様では、アルブミンは、天然または合成のものとすることができる。一部の態様では、アルブミンは、野生型アルブミン、アルブミン多様体、またはアルブミンの誘導体とすることができる。アルブミンは、その教示に関して本明細書をもって参照により本明細書に組み込まれる欧州公開第ＥＰ２５５６０８７号に開示されるアルブミンのいずれかとすることができる。

【0077】

一部の態様では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とすることができる。ＨＳＡは、不活性であり、生分解性であり、容易に入手可能であり、腫瘍及び炎症組織により有意に取り込まれるので、多数の薬物送達システムにおいて担体として使用されている。アルブミンを含むコンジュゲートは、アルブミンとの化学的コンジュゲーション、直接遺伝子融合、ナノ粒子封入、及び非共有結合性の会合により調製することができる。ＨＳＡは、（グリコシル化されていない）可溶性タンパク質（分子量６６，５００）であり；それは、血清タンパク質の約半分（３５～５０ｇ／Ｌのヒト血清）を構成している。それは、前駆体タンパク質（６０９アミノ酸残基）として肝細胞により合成することができ；最初の２４の残基は、翻訳後に切断され、ＨＳＡは、循環中に分泌される。ＨＳＡは、１７のジスルフィド架橋及び３４位に１つの遊離システインを有する５８５のアミノ酸残基からなる。これは、６７％のαヘリックスを有し、βシートを有さない熱成形分子であり、ハート型の分子であり；それは、長い柔軟なループを介して接続された３つのドメインに折りたたむ。ＨＳＡは、４～９の範囲のｐＨで安定であり、４０％のエタノールに可溶性であり、変性に対して耐性を示す（１０時間まで６０℃で安定した）。ＨＳＡは、２１日の血清半減期を有する。ＦｃＲｎ受容体は、循環中の高レベルのＨＳＡを維持するのに重要な役割を果たす。ＦｃＲｎは、エンドソームから細胞表面へ、ＦｃＲｎ－ＨＳＡコンジュゲートを循環させることにより、ＨＳＡの分解を防止する。酸性から中性へのｐＨ変化は、ＨＳＡリガンドの放出を引き起こす。

【0078】

（ｂ）オリゴマー化部分
オリゴマー化部分は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含むコンジュゲートに関して、本明細書に開示されるもののいずれかとすることができる。従って、オリゴマー化部分は、複合体を形成するために、少なくとも１つの他のオリゴマー化部分と結合または相互作用することができる任意の化合物（例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴ糖）とすることができる。

【0079】

例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノとすることができる。従って、１つ以上のグラフトされたモルフォリノを含むアルブミンが開示される。一態様では、１つ以上のモルフォリノは、１つのモルフォリノ、または２つのモルフォリノ、または３つのモルフォリノ、または４つのモルフォリノ、または５つのモルフォリノ、または６つのモルフォリノ、または７つのモルフォリノ、または８つのモルフォリノ、または９つのモルフォリノ、または１０のモルフォリノを含むことができる。例えば、一態様では、開示されるアルブミンは、１つのモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミンは、３つのモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミンは、１０のモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミンは、１５のモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミンは、１０を超えるグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミンは、１５を超えるグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、１つ以上のモルフォリノは、１つ以上のグラフトされたＭＯＲＦ２モルフォリノを含むことができる。例えば、開示されるアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートは、１つのグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートは、３つのグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートは、１０のグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートは、１５のグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、開示されるアルブミン－ＭＯＲＦ２コンジュゲートは、１５を超えるグラフトされたモルフォリノを含むことができる。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、同じオリゴヌクレオチドを含むことができるか、または異なるオリゴヌクレオチドを含むことができる。一態様では、１つ以上のモルフォリノは、同じモルフォリノを含むことができるか、または異なるモルフォリノを含むことができる。一態様では、１つ以上のモルフォリノまたはグラフトされたモルフォリノは、同じ配列を有することができる。一態様では、１つ以上のモルフォリノは、異なる配列を有することができる。例えば、複数のモルフォリノが存在することができる一態様では、１つ以上のモルフォリノが異なる配列を含むか、または１つ以上のモルフォリノが同じ配列もしくはそれらの組み合わせを含む。

【0080】

ｉｉｉ）キット
標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲート、ならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートを含むキットが本明細書に開示される。一態様では、開示されるキットは、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートを投与するための使用説明書を含むことができる。

【0081】

標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートを含むキットが本明細書に開示される。一態様では、開示されるキットは、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートを投与するための使用説明書を含むことができる。

【0082】

標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートを含むキットが、本明細書に開示される。一態様では、開示されるキットは、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートを投与するための使用説明書を含むことができる。

【0083】

標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲート、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲート、ならびに第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートを投与するための使用説明書を含むキットが本明細書に開示される。

【0084】

標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲート、ならびに第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートを投与するための使用説明書を含むキットが本明細書に開示される。

【0085】

標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲート、アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲート、ならびに第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートを投与するための使用説明書を含むキットが本明細書に開示される。

【0086】

一態様では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート、合剤化（co-formulated）される。一態様では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートは、同梱される。

【0087】

本明細書に開示の標的化部分、本明細書に開示のオリゴマー化部分、本明細書に開示のアルブミン、及び／または本明細書に開示の標的化部分、オリゴマー化部分、もしくはアルブミンを含むコンジュゲート、を含むキットが開示される。

【0088】

ｉｖ）医薬組成物
本明細書に開示される１つ以上のコンジュゲートを含む開示される組成物を含む医薬組成物が、本明細書に開示される。例えば、一態様では、開示される医薬組成物は、（ｉ）標的化部分及びオリゴマー化部分を含むコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む。一態様では、開示される医薬組成物は、（ｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含むコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む。一態様では、開示される医薬組成物は、（ｉ）標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲート、（ｉｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲート、ならびに（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む。（ｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物も開示される。一態様では、開示される医薬組成物は、（ｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む。一態様では、開示される医薬組成物は、（ｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、（ｉｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲート、ならびに（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む。一部の態様では、キットは、個々のコンジュゲートまたは１つ以上のコンジュゲートの混合物を含むことができる。

【0089】

（ｉ）標的化部分及びオリゴペプチドを含むコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物も開示される。一態様では、開示される医薬組成物は、（ｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含むコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む。一態様では、開示される医薬組成物は、（ｉ）標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲート、（ｉｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲート、ならびに（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む。一部の態様では、キットは、個々のコンジュゲートまたは１つ以上のコンジュゲートの混合物を含むことができる。

【0090】

一態様では、開示される医薬組成物は、Ｂ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、またはＢ細胞病変を伴う自己免疫疾患の処置を必要とする対象に投与することができる。例えば、一態様では、開示される医薬組成物は、ＮＨＬの処置を必要とする対象に投与することができる。一態様では、開示される医薬組成物は、次のうちの１つ以上の処置を必要とする対象に投与することができる：関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症。一態様では、対象は、次のうちの１つ以上を有することができる：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症。一態様では、開示される医薬組成物は、移植臓器を受けた後に、処置を必要とする対象に投与することができる。一態様では、開示される医薬組成物は、処置を必要とする対象に投与することができ、対象は、ＪＣウイルスを有する。

【0091】

用いられる薬学的担体は、例えば、固体、液体、または気体とすることができる。固体担体の例としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、アガー、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸が挙げられる。液体担体の例は、糖シロップ、落花生油、オリーブ油、及び水である。気体担体の例としては、二酸化炭素及び窒素が挙げられる。

【0092】

経口剤形用の組成物を調製する際、都合のよい任意の薬学的媒体を用いることができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、着香料、保存料、着色料などを使用して、懸濁液、エリキシル剤、及び溶液などの経口液体調製物を形成することができるが、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体を使用して、散剤、カプセル剤、及び錠剤などの経口固形調製物を形成することができる。錠剤及びカプセル剤は、固体の医薬担体が用いられる、好ましい経口投薬単位である。任意に、錠剤は、標準的な水性または非水性技術によりコーティングすることができる。本明細書に開示の組成物またはコンジュゲートを含有する錠剤は、任意に、１つ以上の補助成分またはアジュバントと共に、圧縮または成形することにより調製することができる。圧縮錠剤は、任意に、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または分散剤と混合された、粉末または顆粒などの流動性のある形態の組成物の開示されるコンジュゲートを、好適な機械で圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することにより作製することができる。

【0093】

開示される組成物は、開示される化合物から調製することができることが理解される。開示される組成物は、開示される使用方法に用いることができることも理解される。

【0094】

Ｃ．方法
ｉ）アポトーシスを誘導する方法
標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること；アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法が本明細書に開示される。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができ、第１及び第２のコンジュゲートは、細胞の集団に接触させる前に、予備混合される。

【0095】

標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること；アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法が本明細書に開示される。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができ、第１及び第２のコンジュゲートは、細胞の集団に接触させる前に、予備混合される。

【0096】

標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること；アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法が本明細書に開示される。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができ、第１及び第２のコンジュゲートは、細胞の集団に接触させる前に、予備混合される。

【0097】

一態様では、当業者は、アポトーシスを誘導するために、開示される組成物または開示されるコンジュゲートに対する有効な用量、有効なスケジュール、または有効な投与経路を決定することができる。

【0098】

一態様では、アポトーシスを誘導する開示される方法は、細胞のアポトーシスを確認することを含むことができる。アポトーシスを確認する方法は、当該技術分野で既知であり、これらに限定されないが、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定することが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、アポトーシスを確認することは、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定すること、のうちの１つを含むことができる。一態様では、アポトーシスを確認することは、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定すること、のうちの２つを含むことができる。一態様では、アポトーシスを確認することは、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定すること、のうちの全てを含むことができる。

【0099】

アポトーシスを誘導する開示される方法の一態様では、細胞の集団は、Ｂ細胞とすることができる。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞とすることができる。一態様では、細胞は、悪性Ｂ細胞とすることができる。一態様では、細胞の集団は、対象に存在し得る。一態様では、Ｂ細胞は、対象に存在し得る。一態様では、対象は、非ホジキンリンパ腫を有し得る。一態様では、対象は、臓器移植を受けている可能性がある。一態様では、対象は、ＪＣウイルスを有し得る。一態様では、対象は、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症を有することができる。一態様では、対象は、次のうちの１つ以上を有することができる：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症。

【0100】

アポトーシスを誘導する開示される方法の一態様では、標的化部分は、内在化しない細胞表面分子または徐々に内在化する細胞表面分子に特異的であり得る。内在化しない細胞表面分子または徐々に内在化する細胞表面分子の例は、当該技術分野で既知である。一態様では、内在化しない細胞表面分子または徐々に内在化する細胞表面分子は、細胞または細胞の集団上にあり得る。一態様では、細胞または細胞の集団は、Ｂ細胞とすることができる。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞とすることができる。一態様では、Ｂ細胞は、悪性Ｂ細胞とすることができる。

【0101】

アポトーシスを誘導する開示される方法の一態様では、内在化しない細胞表面分子は、受容体とすることができる。一態様では、徐々に内在化する細胞表面分子は、受容体とすることができる。例えば、内在化しない細胞表面分子または徐々に内在化する細胞表面分子は、ＣＤ２０受容体、Ｃ型タンパク質チロシンホスファターゼ受容体（ＰＴＰＲＣ）、細胞表面デス受容体、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体を含むが、これらに限定されない。腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、デス受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びアポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）を含む。一態様では、受容体は、ＣＤ２０受容体とすることができる。一態様では、受容体は、Ｃ型タンパク質チロシンホスファターゼ受容体（ＰＴＰＲＣ）とすることができる。一態様では、受容体は、細胞表面デス受容体とすることができる。一態様では、受容体は、デス受容体４（ＤＲ４）とすることができる。一態様では、受容体は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体とすることができる。一態様では、受容体は、デス受容体５（ＤＲ５）である。一態様では、受容体は、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）とすることができる。一態様では、受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）とすることができる。一態様では、受容体は、アポトーシス受容体のＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）とすることができる。

【0102】

開示される方法の一態様では、標的化部分は、多糖、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’フラグメント、または単鎖可変フラグメントとすることができる。一態様では、標的化部分は、多糖とすることができる。一態様では、標的化部分は、ペプチドリガンドとすることができる。一態様では、標的化部分は、アプタマーとすることができる。一態様では、標的化部分は、一本鎖可変フラグメントとすることができる。一態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’フラグメントとすることができる。一態様では、Ｆａｂ’フラグメントは、ヒト化することができる。一態様では、Ｆａｂ’フラグメントは、抗ＣＤ２０受容体抗体に由来することができる。抗ＣＤ２０受容体抗体の例は、当該技術分野で既知であり、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ－０２０、ＩＢＩ－３０１、ウブリツキシマブ、及びＢＬＸ－３０１を含むが、これらに限定されない。一態様では、抗ＣＤ２０受容体抗体は、１Ｆ５とすることができる。

【0103】

アポトーシスを誘導する開示される方法の一態様では、アルブミンは、天然または合成のものとすることができる。一部の態様では、アルブミンは、野生型アルブミン、アルブミン多様体、またはアルブミンの誘導体とすることができる。アルブミンは、本明細書をもって参照により本明細書に組み込まれる欧州公開第ＥＰ２５５６０８７号に開示されるアルブミンのいずれかとすることができる。一部の態様では、アルブミンは、ＨＳＡまたはその多様体もしくは誘導体とすることができる。

【0104】

本明細書に開示のコンジュゲートのいずれかは、アポトーシスを誘導する方法において使用することができる。例えば、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること；アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法が本明細書に開示される。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができる。標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む開示されるコンジュゲートならびにアルブミン及び本明細書に開示の１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを使用することができる。
標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること；アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートとの接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法もまた本明細書に開示される。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を繰り返し接触させることを含むことができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができる。標的化部分及びオリゴペプチドを含む開示されるコンジュゲートならびにアルブミン及び本明細書に開示の１つ以上のオリゴペプチドを含むコンジュゲートを使用することができる。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができ、第１及び第２のコンジュゲートは、細胞の集団に接触させる前に、予備混合される。

【0105】

ｉｉ）アポトーシスを誘導する方法
標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含むコンジュゲートを含む第２のコンジュゲートを含む組成物と、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の組成物との接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法が本明細書に開示される。一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができ、第１及び第２のコンジュゲートは、細胞の集団に接触させる前に、予備混合される。

【0106】

標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを含む第２のコンジュゲートを含む組成物と、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の組成物との接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法が本明細書に開示される。標的化部分及びオリゴヌクレオチド及び／またはアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む開示されるコンジュゲートのいずれかは、開示される方法に使用することができる。

【0107】

標的化部分及びオリゴペプチド化部分を含む第１のコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含むコンジュゲートを含む第２のコンジュゲートを含む組成物と、細胞の集団を接触させることを含み、細胞の組成物との接触が、細胞のアポトーシスを誘導する、アポトーシスを誘導する方法が本明細書に開示される。標的化部分及びオリゴペプチド及び／またはアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む開示されるコンジュゲートのいずれかは、開示される方法に使用することができる。

【0108】

アポトーシスを誘導する開示される方法の一態様では、方法は、細胞の組成物との接触を繰り返すことを含むことができる。開示される方法は、細胞のアポトーシスを確認することを含むことができる。アポトーシスを確認する方法は、当該技術分野で既知であり、これらに限定されないが、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定することが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、アポトーシスを確認することは、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定すること、のうちの１つを含むことができる。一態様では、アポトーシスを確認することは、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定すること、のうちの２つを含むことができる。一態様では、アポトーシスを確認することは、カスパーゼ－３活性を測定すること、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合を測定すること、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識を測定すること、のうちの全てを含むことができる。一態様では、当業者は、アポトーシスを誘導するために、開示される組成物または開示されるコンジュゲートに対する有効な用量、有効なスケジュール、または有効な投与経路を決定することができる。

【0109】

アポトーシスを誘導する開示される方法の一態様では、細胞の集団は、Ｂ細胞とすることができる。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞とすることができる。一態様では、細胞は、悪性Ｂ細胞とすることができる。一態様では、細胞の集団は、対象に存在し得る。一態様では、Ｂ細胞は、対象に存在し得る。一態様では、対象は、非ホジキンリンパ腫を有し得る。一態様では、対象は、臓器移植を受けている可能性がある。一態様では、対象は、ＪＣウイルスを有し得る。一態様では、対象は、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症を有することができる。一態様では、対象は、次のうちの１つ以上を有することができる：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、Ｅｖａｎｓ症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、Ｄｅｖｉｃ病、またはＧｒａｖｅｓ病眼症。

【0110】

一態様では、開示される方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、ならびに、アルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートと、細胞の集団を接触させること、を含むことができ、第１及び第２のコンジュゲートは、細胞の集団に接触させる前に、予備混合される。

【0111】

ｉｉｉ）処置方法
それを必要とする対象の処置方法が本明細書に開示され、方法は、標的化部分及びオリゴマー化部分を含む第１のコンジュゲートを含む第１の組成物を対象に投与すること、ならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴマー化部分を含む第２のコンジュゲートを含む第２の組成物を対象に投与することを含み、第１の組成物及び第２の組成物の投与は、対象において細胞の標的の集団のアポトーシスを誘導する。

【0112】

それを必要とする対象の処置方法が本明細書に開示され、方法は、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートを含む第１の組成物を対象に投与すること、ならびにコポリマー担体及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートを含む第２の組成物を対象に投与することを含み、第１の組成物及び第２の組成物の投与は、対象において細胞の標的集団のアポトーシスを誘導する。標的化部分及びオリゴヌクレオチド及び／またはアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む開示されるコンジュゲートのいずれかは、開示される方法に使用することができる。

【0113】

それを必要とする対象の処置方法が本明細書に開示され、方法は、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートを含む第１の組成物を対象に投与すること、ならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む第２のコンジュゲートを含む第２の組成物を対象に投与することを含み、第１の組成物及び第２の組成物の投与は、対象において細胞の標的集団のアポトーシスを誘導する。標的化部分及びオリゴペプチド及び／またはアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む開示されるコンジュゲートのいずれかは、開示される方法に使用することができる。

【0114】

一態様では、投与は、静脈内投与を含む。一態様では、開示される方法は、第１の組成物の投与を繰り返すことを含むことができる。一態様では、開示される方法は、第２の組成物の投与を繰り返すことを含むことができる。一態様では、開示される方法は、第１の組成物の投与を繰り返すこと及び第２の組成物の投与を繰り返すことを含むことができる。一態様では、開示される方法は、細胞の標的集団のアポトーシスを確認することを含むことができる。一態様では、当業者は、それを必要とする対象を処置するために、開示される組成物または開示されるコンジュゲートに対する有効な用量、有効なスケジュール、または有効な投与経路を決定することができる。

【0115】

開示される処置方法の一態様では、アポトーシスの誘導は、当該技術分野で既知であり、さらに本明細書に開示される方法により検出することができる。一態様では、アポトーシスを受けているか、または処置方法により標的とされている細胞は、本明細書に開示される細胞とすることができる。一態様では、対象は、本明細書に開示の対象とすることができる。

【0116】

一態様では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートは、逐次的に投与することができる。例えば、第１のコンジュゲートの投与及び第２のコンジュゲートの投与の間に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間の遅延時間が存在し得る。一部の態様では、第１のコンジュゲートの投与及び第２のコンジュゲートの投与の間に、１、２、３、４、５、６、または７日の遅延時間が存在し得る。一態様では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートは、同時に投与することができる。同時投与は、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートを別々の組成物として同時に投与すること、または第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートを１つの単一の組成物として予備混合することを含むことができる。

【0117】

Ｄ．合成
ｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートの合成
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを合成するプロセスが本明細書に開示され、プロセスは、標的化部分を得ること、オリゴヌクレオチドを修飾すること、及び標的化部分をオリゴヌクレオチドとコンジュゲートすることを含む。一態様では、標的化部分は、チオエーテル結合を介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせることができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ＳＭＣＣ修飾することができる。一態様では、オリゴヌクレオチドは、３’－マレイミド基を含有することができる。一態様では、コンジュゲートを合成する開示されるプロセスは、検出可能な標識を導入することを含むことができる。コンジュゲートを合成する開示されるプロセスの一態様では、標的化部分は、開示される標的化部分とすることができる。例えば、標的化部分は、ＣＤ２０に特異的なＦａｂ’フラグメントとすることができる。コンジュゲートを合成する開示されるプロセスの一態様では、オリゴヌクレオチドは、開示されるオリゴヌクレオチドとすることができる。例えば、開示されるオリゴヌクレオチドは、１０ｂｐ～４０ｂｐを含むモルフォリノとすることができる。

【0118】

ｉｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートの合成
標的化部分及びオリゴペプチドを含むコンジュゲートを合成するプロセスが本明細書に開示され、プロセスは、標的化部分を得ること、オリゴペプチドを修飾すること、及び標的化部分をオリゴペプチドとコンジュゲートすることを含む。一部の態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’フラグメントとすることができる。

【0119】

Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）₂への酵素消化及びＦａｂ’への還元及びクロマトグラフィーカラムでの精製により、全抗体から調製することができる。あるいは、Ｆａｂ’フラグメントは、関連プラスミドを細菌に挿入することによる遺伝子操作により合成することができる。オリゴペプチドは、好ましくは、固相ペプチド合成により合成することができる。オリゴペプチドのアミノ末端に、システインで始まる短いスペーサー（例えば、ＣＹＧＧ）を導入することができる。Ｆａｂ’の修飾オリゴペプチドとのインキュベーションは、構成成分がチオエーテル結合を介して結合するＦａｂ’－オリゴペプチドコンジュゲートをもたらす。

【0120】

ｉｉｉ）アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートの合成
アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを合成するプロセスが、本明細書に開示され、プロセスは、アルブミンを得ること、１つ以上のオリゴヌクレオチドを修飾すること、及びアルブミンを１つ以上のオリゴヌクレオチドとコンジュゲートすることを含む。一態様では、コンジュゲートを合成する開示されるプロセスは、検出可能な標識を導入することを含むことができる。コンジュゲートを合成する開示されるプロセスの一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の開示されるオリゴヌクレオチドとすることができる。例えば、１つ以上の開示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ１０ｂｐ～４０ｂｐを含むモルフォリノとすることができる。

【0121】

ｉｖ）アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含むコンジュゲートの合成
アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含むコンジュゲートを合成するプロセスが本明細書に開示され、プロセスは、アルブミンを得ること、１つ以上のオリゴペプチドを修飾すること、及びアルブミンを１つ以上のオリゴペプチドとコンジュゲートすることを含む。一態様では、コンジュゲートを合成する開示されるプロセスは、検出可能な標識を導入することを含むことができる。コンジュゲートを合成する開示されるプロセスの一態様では、１つ以上のオリゴペプチドは、１つ以上の開示されるオリゴペプチドとすることができる。例えば、１つ以上の開示されるオリゴヌクレオチドは、コイルドコイル形成ペプチドとすることができる。

【0122】

ｖ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートならびにアルブミン担体及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを含む組成物の合成
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを合成するプロセスが本明細書に開示され、プロセスは、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートを、アルブミンを含む第２のコンジュゲートと、１つ以上のオリゴヌクレオチドで接触させることを含む。一態様では、第１のコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、第２のコンジュゲートの１つ以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする。一態様では、開示されるプロセスは、第１のコンジュゲートを生成することを含むことができる。一態様では、開示されるプロセスは、第２のコンジュゲートを生成することを含むことができる。一態様では、開示されるプロセスは、第１のコンジュゲートを生成すること及び第２のコンジュゲートを生成することを含むことができる。一態様では、第１のコンジュゲートは、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む開示される任意のコンジュゲートとすることができる。一態様では、第２のコンジュゲートは、アルブミン及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む開示される任意のコンジュゲートとすることができる。例えば、開示されるプロセスの一態様では、標的化部分は、ＣＤ２０に特異的なＦａｂ’フラグメントとすることができ、アルブミンは、天然アルブミン、合成アルブミン、またはアルブミン誘導体とすることができ、オリゴヌクレオチドのそれぞれは、１０ｂｐ～４０ｂｐを含むモルフォリノとすることができ、第１のコンジュゲートのモルフォリノは、第２のコンジュゲートの１つ以上のモルフォリノと相補的である。

【0123】

ｖｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートならびにアルブミン担体及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを含む組成物の合成
標的化部分及びオリゴペプチドを含むコンジュゲートならびにアルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含むコンジュゲートを合成するプロセスが本明細書に開示され、プロセスは、標的化部分及びオリゴペプチドを含む第１のコンジュゲートを、アルブミンを含む第２のコンジュゲートと、１つ以上のオリゴペプチドで接触させることを含む。一態様では、第１のコンジュゲートのオリゴペプチドは、第２のコンジュゲートの１つ以上のオリゴペプチドとハイブリダイゼーションする。一態様では、開示されるプロセスは、第１のコンジュゲートを生成することを含むことができる。一態様では、開示されるプロセスは、第２のコンジュゲートを生成することを含むことができる。一態様では、開示されるプロセスは、第１のコンジュゲートを生成すること及び第２のコンジュゲートを生成することを含むことができる。一態様では、第１のコンジュゲートは、標的化部分及びオリゴペプチドを含む開示される任意のコンジュゲートとすることができる。一態様では、第２のコンジュゲートは、アルブミン及び１つ以上のオリゴペプチドを含む開示される任意のコンジュゲートとすることができる。例えば、開示されるプロセスの一態様では、標的化部分は、ＣＤ２０に特異的なＦａｂ’フラグメントとすることができ、アルブミンは、天然アルブミン、合成アルブミン、またはアルブミン誘導体とすることができ、オリゴペプチドのそれぞれは、コイルドコイル形成ペプチドとすることができ、第１のコンジュゲートのコイルドコイル形成ペプチドは、第２のコンジュゲートの１つ以上のコイルドコイル形成ペプチドに相補的である。

【0124】

開示される方法は、追加のステップ、操作、及び／または構成要素をさらに含むことができると考えられる。１つ以上の任意のステップ、操作、及び／または構成要素は、任意に省略することができると考えられる。開示される方法は、開示される化合物を提供するために使用することができることが理解される。開示される方法の生成物は、開示される使用方法に用いることができることも理解される。

【0125】

Ｅ．実施例
次の実施例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、及び／または方法がどのように作製され、評価されるかの説明を、当業者らに提示するために記載され、単に本発明の例示とするものであり、発明者らが自らの発明とみなすものの範囲を制限するものではない。しかし、当業者らは、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく同様または類似した結果をさらに得ることを理解すべきである。数（例えば、量、温度など）に関して精度を確保するための取り組みがなされているが、いくらかの誤差及び偏差が考慮されるべきである。

【0126】

（１）ナノコンジュゲートの骨格としてのＨＳＡ
ＨＳＡは、不活性であり、生分解性であり、容易に入手可能であり、腫瘍及び炎症組織により有意に取り込まれるので、多数の薬物送達システムにおいて担体として使用されている。アルブミン含有薬物送達系は、化学的コンジュゲーション、直接遺伝子融合、ナノ粒子封入、及びアルブミンとの非共有結合により調製することができる。ＦＤＡが承認したアルブミン製品は、抗糖尿病性融合製品Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標）及びＶｉｃｔｏｚａ（登録商標）、パクリタキセルＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）のナノ粒子製剤、ならびに診断用製品Ｎａｎｏｃｏｌｌ（登録商標）及びＡｌｂｕｒｅｓ（登録商標）を含む。他の実験的用途は、ＨＳＡのシステイン－３４の－ＳＨ基を標的とした。ＨＳＡは、変性することなく化学的に修飾することができる強力なタンパク質である。

【0127】

いくつかの研究により、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の作用機序が実証されている。それは、静脈内注入後に急速に溶解して、アルブミンとサイズが類似したパクリタキセル複合体または水溶性ポリマー－薬物コンジュゲートをもたらす。固形腫瘍では、コンジュゲートは、ＥＰＲ（増強された透過性及び保持力）効果のために浸出し、複合体のさらなる取り込みは、ｇｐ６０トランスサイトーシス経路及びその後のＳＰＡＲＣ（分泌されたタンパク質、酸性、及びシステインに富む）への結合により媒介される。

【0128】

アルブミンは、開示されるナノコンジュゲートに、以下のようないくつかの利点を提供する：ｉ）有効性を改善して必要な用量の数を減少させることができる生体適合性ナノコンジュゲートの血管内半減期が長い；ｉｉ）アルブミンは、入手が容易な天然ポリマーである；ｉｉｉ）それは、ＧＭＰ環境において、アルブミンベースのコンジュゲートの計測可能な合成を有する；ｉｖ）処置プロトコールは、効率的なプレターゲティング方策の開発に適した二構成成分系である；及びｖ）それは、低分子量の細胞傷害性薬物が欠如している。

【0129】

２つの相補的モルフォリノオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたはＢ細胞表面での相補的コイルドコイル形成ペプチドの会合は、ＣＤ２０受容体の架橋を媒介し、アポトーシスを開始する。１つのオリゴヌクレオチド（ＭＯＲＦ１）またはコイルドコイル形成ペプチド（ＣＣＥ）は、ＣＤ２０受容体により認識される抗体フラグメント（ナノコンジュゲート１；Ｆａｂ’－モチーフ１）に結合し；相補的オリゴヌクレオチド（ＭＯＲＦ２）またはオリゴペプチド（ＣＣＫ）は、複数コピー中でヒト血清アルブミンに結合する（ナノコンジュゲート２；ＨＳＡモチーフ２）。従って、高分子治療薬における新しいパラダイムは、例えば、２つのナノコンジュゲート、ａ）Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１＋ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ；ｂ）Ｆａｂ’－ＣＣＥ＋ＨＳＡ－（ＣＣＫ）ｘからなる。コンジュゲートの好ましい投与は、逐次的である。第１のコンジュゲート（例えば、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１）を、静脈内投与する。５時間の時間差の後（これは、ＳＣＩＤマウスに最適である）、第２のナノコンジュゲートを（静脈内にも）投与することができる。あるいは、ナノコンジュゲートを投与前に予備混合し、１回用量で適用することができる。

【0130】

しかし、提案された２つのステップアプローチ、すなわち、Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１（またはＦａｂ’－ＣＣＥ）、続く、ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_x（またはＨＳＡ－（ＣＣＫ）_y）の逐次的投与は、プレターゲティング［１～４］の機会を提供する。癌の放射免疫療法では、プレターゲティング方策を一般に使用する。目的は、治療モダリティ（例えば、放射性核種）を標的化官能基（例えば、抗体）から分離すること［５］により、望ましい薬物動態学目標を達成することである。長年にわたり、プレターゲティングの概念は、治療送達の拡大［６］及び異なる腫瘍リガンドの全般的な標的化［７］のような方策に拡大及び適用されていている。これらのアプローチは、治療効力を改善すること及び有害な副反応を低減すること［８］を目指す。同様に、薬物不含高分子治療薬の場合、Ｆａｂ’コンジュゲートは、プレターゲティング薬として使用することができ、次に、多価アルブミンコンジュゲートは、治療的に活性な用量として送達される。プレターゲティング効率を最適化し、個々の患者における最大の腫瘍対組織の蓄積を達成するために、Ｆａｂ’コンジュゲートの薬物動態及び生体内分布に基づいて、２つの投与間の時間差を調整することができる。本発明者らは近年、マウスにおいてこの概念を証明している。

【0131】

（ａ）ナノコンジュゲートの合成及び特性決定
（ｉ）１Ｆ５抗体由来のＦＡＢ’を使用するナノコンジュゲート１Ａ－（ＦＡＢ’－ＭＯＲＦ１）
１Ｆ５ Ａｂ由来のＦａｂ’フラグメントを使用して、ナノコンジュゲート１Ａを調製する：最初に、２００ｎｍｏｌのＭＯＲＦ１－ＮＨ２（３’－一級アミンを含有する）（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ、オレゴン州フィロマス）を、１７０μＬのＤＭＳＯ中の０．６７ｍｇ（２μｍｏｌ）のスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、マサチューセッツ州ビバリー）と反応させて、ＭＯＲＦ１－ｍａｌ（３’－マレイミドを含有する）を生成した。反応を、ＲＴ（室温）で２４時間実施した。生成物を、１．５ｍＬのアセトン中に沈殿させることにより単離し、脱イオン水－アセトン中で２回溶解沈殿させることにより精製し、真空下で乾燥させた。次に、２００ｎｍｏｌのＭＯＲＦ１－ｍａｌを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ６．５）２００μＬに溶解させ、次に、溶液を、２ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で新たに還元したＦａｂ’－ＳＨ ２００ｎｍｏｌ（約１０ｍｇ）と混合した。反応を、４℃で２４時間実施した。最後に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１コンジュゲートを精製して、遊離したコンジュゲートされていないＦａｂ’_1F5及びＭＯＲＦ１を除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ＨＲ１６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用した。任意に、Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１は、イメージング研究のために、５～１０モル過剰のＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）－Ｘスクシンイミジルエステル（Ｒ６０１０）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で標識した。ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、生成物を精製した。Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１コンジュゲートのＦａｂ’_1F5当量濃度を決定するために、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用した。得られた値を、紫外可視分光法（２７８，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1のモル吸光係数を使用する）から得られたＭＯＲＦ１当量濃度と比較した。このような比較により、１：１化学量論のカップリング反応が確認された。

【0132】

（ｉｉ）リツキシマブ由来のＦＡＢ’を使用するナノコンジュゲート１Ｂ－（ＦＡＢ’－ＭＯＲＦ１）
ナノコンジュゲート１Ｂを、１Ａと同様に調製した。２１ｍｇのリツキシマブ溶液に、２．１ｍｇのペプシンを添加した。混合物を、３７℃で８５分間インキュベートした。Ｆ（ａｂ’）₂を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ １００ ６０／１００カラム（Ｓ－１００）で分離した後、１２ｍｇのＦ（ａｂ’）₂を単離した。ＭＯＲＦ１と反応させる直前に、ＴＣＥＰを用いて、Ｆ（ａｂ’）₂をＦａｂ’に還元した。

【0133】

上記のように、新たに調製されたＦａｂ’_RTX－ＳＨの３’－マレイミドＭＯＲＦ１との反応により、Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１コンジュゲートを合成した。簡単に言うと、ＭＯＲＦ１－ｍａｌ（１６２ｎｍｏｌ；１．４ｍｇ）を、ｐＨ６．５のＰＢＳ中のＦａｂ’_RTX－ＳＨ（８０ｎｍｏｌ；４ｍｇ）と４℃で２０時間反応させた。生成物を、ＰＢＳを用いる限外濾過（３０ｋＤａ）により５回精製した（あるいは、それは、Ｓ－１００カラムを使用して精製することができる）。標準検量線を使用するＢＣＡアッセイにより、Ｆａｂ’_RTX濃度を決定した。Ｆａｂ’_RTX／ＭＯＲＦ１の比は、約１／１である。

【0134】

（ｉｉｉ）１Ｆ５抗体由来のＦＡＢ’を使用するナノコンジュゲート１Ｃ－（ＦＡＢ’－ＣＣＥ）
既知の技術を使用して、ナノコンジュゲート１Ｃ（Ｆａｂ’－ＣＣＥ）コンジュゲートを調製した。１Ｆ５のＦａｂ’フラグメントを、上記のように調製した。マレイミド－チオール化学を使用するＦａｂ’のＣＣＥとのコンジュゲーションにより、Ｆａｂ’－（ＣＣＥ）₁を得た。使用直前に、Ｆ（ａｂ’）₂を、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を用いて、Ｆａｂ’に、３７℃、暗所で１時間還元した。ＣＣＥ（Ｆａｂ’に対して１．５倍過剰）を添加し、カップリング反応を、４℃の暗所で一晩進行させた。次に、ＰＤ１０カラムを使用して、粗生成物を２回精製した。このカップリング反応は、１：１の化学量論に従う。従って、得られたコンジュゲートを、Ｆａｂ’－（ＣＣＥ）₁と呼んだ。

【0135】

消化及びコンジュゲーションを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びＲＰ－ＨＰＬＣにより確認した。１Ｆ５ Ａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦａｂ’－（ＣＣＥ）_lは、それぞれＳＥＣカラムに注入され、異なる特性溶出時間を示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、１Ｆ５抗体の良好な消化及びＦａｂ’フラグメントのＣＣＥとのコンジュゲーションを実証した。

【0136】

１Ｆ５ Ａｂ由来またはリツキシマブ由来のＦａｂ’フラグメントを、例として使用した。これは、適用範囲をこれらのＡｂのみに限定するものではなく；このようオファツムマブ、オビヌツズマブ、及びトシツムマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｕｍａｂ）などの多数のＡｂを使用することができる。

【0137】

（ｉｖ）複数コピーのＭＯＲＦ２－ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）Ｘでグラフトされたナノコンジュゲート２Ａ－ＨＳＡ
ナノコンジュゲート２Ａ（ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ）を、２ステップで合成した（図１）。最初に、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＭ－（ＰＥＧ）_XのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（スクシンイミジル－［（Ｎ－マレイミドプロピオンアミド）－ジエチレングリコール］エステル）との反応により、ＨＳＡアミノ基の画分を、マレイミド基に変換した。第２のステップでは、新たに調製したＭＯＲＦ２－ＳＨを、チオエーテル結合を介してＨＳＡに付着させた。例えば、５ｍｇのＨＳＡ（［ＮＨ₂］：７７８ｎｍｏｌ／ｍｇのＨＳＡ、１当量）を、４００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に溶解させ、１５０μＬのＤＭＳＯ中の１８．３ｍｇのＳＭ－（ＰＥＧ）_X（４３μｍｏｌ、１１当量）と混合した。混合物を、室温で６時間及び４℃で一晩、撹拌した。過剰のＳＭ－（ＰＥＧ）_Xを、限外濾過により除去した（修正エルマンアッセイにより決定された３０，０００ｃｕ群は、３１８ｎｍｏｌ／ｍｇのＨＳＡであった（４１％の変換））。５．７ｍｇのＭＯＲＦ２－ＳＳ－Ｒを、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解させ、９００μＬのＴＣＥＰ溶液（１０ｍＭ、ＰＢＳ中ｐＨ７．０）に添加し、次に、室温で２．５時間インキュベートした。完成後、過剰のＴＣＥＰを限外濾過（３，０００カットオフ）で４回除去して、ＭＯＲＦ２－ＳＨを得、最終容量は、５００μＬであった。

【0138】

ＨＳＡ－ｍａｌ（２ｍｇ；６７０ｎｍｏｌのｍａｌ群、３３０μＬのＰＢＳ中、１当量）を、ＭＯＲＦ２－ＳＨ溶液（６７０ｎｍｏｌ、１当量）と混合させ、室温で２．５時間インキュベートした。完成後、遊離ＭＯＲＦ２－ＳＨを、限外濾過（３，０００Ｄａカットオフ）で４回除去して、ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_xを得、最終容量は、８５０μＬであった。ＦＰＬＣ分析は、遊離ＨＳＡがないことを示した。ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２（５μＬ）を、１ｍＬのＨＣｌ（０．１Ｍ）に溶解させ、２６４ｎｍでのＯＤは、０．３５１であった（ε＝２５２，０００）。［ＭＯＲＦ２］は、２７８ｕＭであった。ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘのＨＳＡ濃度を、ＨＳＡ標準検量線を用いるＢＣＡアッセイで決定した、［ＨＳＡ］：２７．６ｕＭ。コンジュゲートの組成は、ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀であった（図１の合成を参照のこと）。

【0139】

（ｖ）複数コピーのＣＣＫ－ＨＳＡ－（ＣＣＫ）Ｘでグラフトされたナノコンジュゲート２Ｂ－ＨＳＡ
ナノコンジュゲート２Ｂ（ＨＳＡ－（ＣＣＫ）ｘ）は、ナノコンジュゲート２Ａと同様に合成することができる。ＳＭ－（ＰＥＧ）₂で修飾されたＨＳＡは、ＨＳＡ上のマレイミド基のＣＣＫペプチドのＳＨ基との反応により、チオエーテル結合を介して、ＣＣＫペプチド（ＣＹＧＧ Ｋ ＶＳＡＬＫＥＫ ＶＳＡＬＫＥＥ ＶＳＡＮＫＥＫ ＶＳＡＬＫＥＫ ＶＳＡＬＫＥ）と反応させることができる。

【0140】

（ｖｉ）紫外可視分光法によるハイブリダイゼーションＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２の検出
Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ４００ ＢｉｏＵＶ－可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して、ＭＯＲＦ１－ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションへの減色効果の分析を実施した。最初に、ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２（またはＦａｂ’－ＭＯＲＦ１及びＨＳＡ－ＭＯＲＦ２）を、１ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ＝７．４に、２．５μＭ（ＭＯＲＦ当量）の濃度で溶解させ、次に、室温で異なる比で混合した。各溶液混合物中のＭＯＲＦオリゴ（ＭＯＲＦ１＋ＭＯＲＦ２）の最終濃度は、一定（２．５μＭ）に保たれた。例えば、２．５μＭのＭＯＲＦ１溶液０．７５ｍＬを、２．５μＭのＭＯＲＦ２溶液０．２５ｍＬと混合することにより、７５％のＭＯＲＦ１（または２５％のＭＯＲＦ２）を含有する混合物を作成した。測定のために、試料を１ｃｍ石英キュベットに入れた。（塩基が寄与する）２６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を記録した。全ての測定を、３連で実施した。Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１及びＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションを、ＵＶ－Ｖｉｓで分析した（図２）。

【0141】

（ｂ）アポトーシスアッセイ
Ｆａｂ’－ＭＯＲＦ１及びＨＳＡ－ＭＯＲＦ２との同時処置による、ヒトバーキットＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）Ｒａｊｉ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシス誘導を、２つのアッセイ：アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）結合アッセイ、及びカスパーゼ－３活性化アッセイにより評価した。全ての実験では、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）二次抗体（２°Ａｂ）（ＫＰＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）と超架橋した１Ｆ５ ｍＡｂを、陽性対照として使用した（モル比１Ｆ５：ＧＡＭ＝２：１）。未処置細胞（培地中）を、陰性対照として使用した。

【0142】

Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１（またはＦａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１）及びＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘとの同時処置による、ヒトバーキットＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）Ｒａｊｉ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシス誘導を、２つのアッセイ：アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）結合アッセイ、及びＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチド媒介ｄＵＴＰニック端標識）アッセイにより評価した。２つの細胞曝露プロトコールを使用した。逐次的曝露：最初に、細胞を、Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１（またはＦａｂ’_1F5の－ＭＯＲＦ１）コンジュゲートと共にインキュベートした。１時間後、ＭＯＲＦ１で装飾した細胞を、ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘに２４時間曝露した。予備混合された曝露：ナノコンジュゲートＦａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１（またはＦａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１）及びＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘを、３７℃で混合し、１時間後、Ｒａｊｉ細胞を、予め形成された自己集合多価コンジュゲートに２４時間曝露した。全ての実験では、リツキシマブ（ＲＴＸ）またはヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ、メリーランド州）またはヤギ抗マウス（ＧＡＭ）二次抗体（２°Ａｂ）（ＫＰＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）と超架橋された１Ｆ５ ｍＡｂを、陽性対照として使用した（モル比 ＲＴＸ：ＧＡＨ＝２：１、１Ｆ５：ＧＡＭ＝２：１）。未処置細胞（培地中）を、陰性対照として使用した。各アッセイの手順を、以下に記載する。

【0143】

（ｉ）アネキシンＶ／ＰＩアッセイ
図３の結果は、ＨＰＭＡコポリマーコンジュゲート（Ｐ－コンジュゲート）と比較した場合、ＨＳＡコンジュゲートの高い活性を明らかに示している。ＨＳＡコンジュゲート双方の組み合わせ、ａ）Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀（１Ｆ５抗体由来のＦａｂ’）；ｂ）Ｆａｂ’_rtx－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀（リツキシマブ抗体由来のＦａｂ’）は、ＨＰＭＡコポリマーベースの組み合わせ、Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／Ｐ－（ＭＯＲＦ２）₁₄及びＦａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／Ｐ－（ＭＯＲＦ２）_11.4（Ｐは、ＨＰＭＡコポリマー骨格である）よりも高いアポトーシスレベルを有していた。

【0144】

製造者（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ボストン）により提供されるＲＡＰＩＤ（商標）プロトコールに従って、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ及びＰＩ染色を実施した。逐次的処置の場合、２×１０⁵のＲａｊｉ細胞を、１μＭのＦａｂ^’ _RTX－ＭＯＲＦ１（またはＦａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１）を含む０．４ｍＬの新鮮な成長培地に懸濁した。細胞を、３７℃の５％ＣＯ₂を有する加湿雰囲気中で、１時間インキュベートし、次に、ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２回洗浄し、続いて、１μＭ（ＭＯＲＦ２当量）のＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘを含有する培地０．４ｍＬ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、２４時間インキュベートした。予備混合された処置の場合、最初に、１μＭのＦａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１（またはＦａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１）を、培地中１μＭ（ＭＯＲＦ２－当量）のＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）Ｘと１時間３７℃で混合させ、次に、２×１０⁵のＲａｊｉ細胞を、予備混合溶液０．４ｍＬ中で懸濁させた。細胞懸濁液を、２４時間インキュベートした。陽性対照の場合、細胞を、最初に１時間、培地中１μＭの１Ｆ５またはＲＴＸ ｍＡｂと共にインキュベートし、次に、ＰＢＳ＋１％のＢＳＡで２回洗浄し、０．５μＭのＧＡＭまたはＧＡＨを含有する新しい成長培地０．４ｍＬに再懸濁させた。細胞を、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。染色前に、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。全ての実験を、３連で実施した。

【0145】

アポトーシス誘導におけるＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘの異なる置換度を評価するために、ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘコンジュゲートの３つの置換体を、様々な量のＭＯＲＦ２－ＳＨを有する異なるＨＳＡ－ｍａｌ前駆体（ｍａｌ対ＨＳＡの比は、それぞれ２０または３０である）から合成して、ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_6.3、ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀、及びＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7を生成した。

【0146】

以前の薬物不含高分子治療系は、２つのハイブリッドコンジュゲートから構成されていた：（１）ＭＯＲＦ１に連結された抗ＣＤ２０のＦａｂ’（Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１、Ｆａｂ’フラグメントを１Ｆ５マウスｍＡｂから得た）、及び、（２）複数コピーのＭＯＲＦ２でグラフトされたＨＰＭＡ共重合体（Ｐ－（ＭＯＲＦ２）ｘ）。Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／Ｐ－（ＭＯＲＦ２）ｘは、良好に機能した。ＨＰＭＡコポリマー骨格の動的且つ柔軟な性質は、ＣＤ２０架橋に対する立体配座応答を可能にした。アルブミンは、分子量が６６．５ｋＤａである最も豊富な血漿タンパク質である。ヒト血清アルブミンは、薬物標的化のための、且つペプチドまたはタンパク質ベースの薬物の薬物動態プロファイルを改善するための多機能タンパク質担体として増加させる役割を果たしている。ポリマー骨格の柔軟性とは異なり、ＨＳＡは、タンパク質折りたたみに起因して、ほぼ３次元形状を有する。ＣＤ２０架橋及びアポトーシス誘導を、ＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションにより媒介した。ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘ及びＦａｂ’－ＭＯＲＦ１の間のＭＯＲＦ１－ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーション効率は、ＨＳＡの固有構造により影響を受け得る。重要なことに、Ｒａｊｉ細胞をＨＳＡベースの系及びＨＰＭＡコポリマーベースの系と共にインキュベートすることにより、達成されたアポトーシスレベルを比較した時、ＨＳＡベースの系のアポトーシスレベル（アネキシンＶ／ＰＩアッセイを使用して決定される）は、かなり高かった（図３に示す）。

【0147】

アポトーシス誘導におけるＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘの有効性を評価するために、Ｒａｊｉ細胞のＦａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１及びＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘでの同時処置が最初に該当した。アネキシンＶ／ＰＩアッセイにより決定されるアポトーシス誘導の結果を図５に示す。Ｒａｊｉ細胞を、ナノコンジュゲートＦａｂ’１Ｆ５－ＭＯＲＦ１及びＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘで、予備混合物としてまたは逐次的に同時処置した後に得られたアポトーシス研究により、ＨＳＡが、モルフォリノオリゴヌクレオチドのための有効なタンパク質担体として役立つことが示された。ＭＯＲＦ２の複数の置換基でグラフトするためにＨＳＡを使用している、得られたＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘは、Ｐ－ＭＯＲＦ２の機能に類似するいくつかの生物学的認識挙動を有する。ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘは、同時に起こるＣＤ２０架橋を有する細胞表面でＭＯＲＦ１－ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションを介してＦａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１をライゲーションし、アポトーシスを誘発することができる。置換度反応性傾向は、逐次的処置レジメン及び予備混合処置レジメンの双方で観察された。ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘの置換度の影響を、明らかに実証した。ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）ｘの置換度の増加は、より高いレベルのアポトーシスをもたらした。全てのコンジュゲートは、陽性対照－１Ｆ５／ＧＡＭよりも有効であった。

【0148】

（ｃ）ヒトＮＨＬのマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価
ハイブリダイゼーション媒介薬物不含高分子治療薬のｉｎ ｖｉｖｏ治療有効性を、全身に播種されたＲａｊｉ Ｂ細胞を有するＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ－１７）マウスにおいて評価した。この動物モデルは、１００％に近い腫瘍の生着率を有し、処置後の後肢麻痺のない生存期間は、抗癌有効性を正確に反映している。

【0149】

約７週齢の雌Ｃ．Ｂ－１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）に、尾静脈から２００μＬの生理食塩水中の４×１０⁶のＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞を静脈内注射した（０日目）。この動物モデルは、後肢麻痺及びそれに続く動物の死亡をもたらす、脊髄を含む種々の器官におけるリンパ腫細胞の播種、浸潤、及び成長を表す。後肢麻痺の発症は、実験的なエンドポイントであった；加えて、体重減少が２０％を超えた時、マウスを死亡させた。麻痺／病気の徴候のない動物は、１００日まで飼育し、長期間の生存者とみなした。４群の動物を評価した：ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水を用いる、１、３、及び５日目の３回投与処置（対照；ｎ＝４）；Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7：Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１（５８μｇ／２０ｇマウス；マウス１匹当たり１ｎｍｏｌのＦａｂ’当量）及び５時間後のＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）_14.7を用いた逐次的処置、１、３、及び５日目の３投与（１２．８μｇ／２０ｇマウス；マウス１匹当たり１ｎｍｏｌのＭＯＲＦ２；ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１）（ｎ＝５）；Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１／ＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀：Ｆａｂ’_1F5－ＭＯＲＦ１及び５時間後のＨＳＡ－（ＭＯＲＦ２）₁₀を用いた逐次的処置、１、３、及び５日目の３投与（マウス１匹当たり１ｎＭのＦａｂ’当量；ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１）（ｎ＝５）；オビヌツズマブ：１日目のオビヌツズマブ（７５μｇ／２０ｇマウス）の単回投与。麻痺のないマウスの生存率を、カプラン－マイヤープロットで提示される。各群の長期生存者数を示す。

【0150】

生物発光イメージング
ｉｎ ｖｉｖｏイメージングを、所定の時間間隔で実施した。マウスを、精密噴霧器からの酸素中２％（ｖ／ｖ）のイソフルランガス（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で麻酔し、３ｍｇのホタルＤ－ルシフェリン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を腹腔内注射した。ルシフェリンの注射の１５分後、（最大ルシフェラーゼシグナル強度を有する所定の時間間隔）に、マウスを腹臥位でスキャンした。Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、露光時間１分、ビニング中、及びｆストップ値１で使用した。画像を取得し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ソフトウエア環境下で解析した。マウス全体を含むように輪郭を描くことにより、目的の領域（ＲＯＩ）を選択した。ルシフェラーゼ発光単位を、平均放射輝度（光子／秒／ｃｍ²／ｓｒ）で定量した。ｅｘ ｖｉｖｏ分析のために、死亡させる１２分前に、マウスに３ｍｇのルシフェリンを注射した。画像化のために、種々の臓器及び組織（心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、胃、筋肉、脳、脊髄、大腿骨、脛骨、ならびに腸間膜及び鼠径リンパ節）を採取した。取得パラメータは、次の通りであった：露光時間１分、ビニング小、及びｆ／ｓｔｏｐ １。

【0151】

（ｄ）共焦点
紫外可視分光法によるハイブリダイゼーション及び動的光散乱による流体力学的有効径の以前の分析は、Ｆａｂ－ＭＯＲＦ１及びＰ－ＭＯＲＦ２コンジュゲートが、溶液中で混合される時、ＭＯＲＦ１－ＭＯＲＦ２生物学的認識を介して自己集合したことを示した。Ｃｙ５－Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及びＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２が、細胞表面上のＣＤ２０抗原で、特異的に集合することを実証することが必要である。従って、本発明者らは、ＣＤ２０発現ヒトＮＨＬ Ｒａｊｉ Ｂ細胞株を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで共焦点顕微鏡試験を行った（図７）。Ｒａｊｉ細胞を、蛍光標識されたコンジュゲート（Ｃｙ５－Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及びＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２）の双方の予備混合物に曝露すると、Ｂ細胞の表面でのＣｙ５及びＦＩＴＣシグナルのウェル共局在化がもたらされた。逐次的処置では、Ｒａｊｉ細胞を、最初に１時間、Ｃｙ５－Ｆａｂ－ＭＯＲＦ１に曝露し、次に、ＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２で処置した場合、蛍光画像もまた２つのシグナルの共局在化を示した。細胞を蛍光標識コンジュゲートの前に、過剰量のリツキシマブで予めブロックした場合、これら２つのシグナルのいずれも、見出すことができない。細胞表面上に装飾されたＣｙ５－Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１コンジュゲートを、前もって、ＦＩＴＣシグナルが存在しない正常なＭＯＲＦ２モチーフとハイブリダイゼーションさせた時に、ブロッキング効果も実施した。ＦＩＴＣ－ＨＳＡ－ＭＯＲＦ２のみに曝露された細胞は、いかなる蛍光シグナルも示さなかった。これらの顕微鏡の結果は、Ｆａｂ’_RTX－ＭＯＲＦ１及びＨＳＡ－ＭＯＲＦ２コンジュゲートが、有効なＭＯＲＦ１－ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションを介して、細胞表面上で集合することができることができることを確認した。

参考文献
１． Ｔ．－Ｗ．Ｃｈｕ，Ｒ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｐ．Ｃｈａｏ，Ｐ．Ｓｈａｍｉ，Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ａ ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＣＤ２０ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍａｙ ａｃｈｉｅｖｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉ－ｌｙｍｐｈｏｍａ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ５，８３４－８４６（２０１５）．
２． Ｋ．Ｗｕ，Ｊ．Ｌｉｕ，Ｒ．Ｎ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｄｒｕｇ－ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４９，１４５１－１４５５（２０１０）．
３． Ｔ．－Ｗ．Ｃｈｕ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｓｉｍａ，Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｖｉａ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ８，７１９－７３０（２０１４）．
４． Ｔ．－Ｗ．Ｃｈｕ，Ｋ．Ｍ．Ｋｏｓａｋ，Ｐ．Ｊ．Ｓｈａｍｉ，Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｄｒｕｇ－ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓ．４，３８９－３９４（２０１４）．
５． Ｇ．Ｌｉｕ，Ｇ．Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎ，Ｊ．Ｈｅ，Ｓ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｌｉｕ，Ｍ．Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎ ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｉｃｅ ｂｙ １８８Ｒｅ－ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒ，ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２，４９５８－４９６４（２００６）．
６． Ｊ．Ｊ．Ｍｕｌｖｅｙ，Ｃ．Ｈ．Ｖｉｌｌａ，Ｍ．Ｒ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｆ．Ｅ．Ｅｓｃｏｒｃｉａ，Ｅ．Ｃａｓｅｙ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｔｕｍｏｕｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ，ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，７６３－７７１（２０１３）．
７． Ｊ．Ｇｕｎｎ，Ｓ．Ｉ．Ｐａｒｋ，Ｏ．Ｖｅｉｓｅｈ，Ｏ．Ｗ．Ｐｒｅｓｓ，Ｍ．Ｚｈａｎｇ，Ａ ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．７，７４２－７４８（２０１１）．
８． Ｔ．－Ｗ．Ｃｈｕ，Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｄｒｕｇ－ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉ．３，９０８－９２２（２０１５）．
９． Ｒ．Ｌ．Ｓｉｅｇｅｌ，Ｋ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｊｅｍａｌ，Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１５．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６５，５－２９（２０１５）．
１０． Ｋ．Ｒ．Ｓｈａｎｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｏ．Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｂ．Ｗ．Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｌａｎｃｅｔ ３８０，８４８－８５７（２０１２）．
１１． Ｊ．Ｏ．Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｄ．Ｄ．Ｗｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１６，２７８０－２７９５（１９９８）．
１２． Ａ．Ｄ．Ｚｅｌｅｎｅｔｚ，Ｌ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｇ．Ｗｉｅｒｄａ，Ｊ．Ｓ．Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．Ａｄｖａｎ，Ｃ．Ｂ．Ａｎｄｒｅａｄｉｓ，Ｎ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．Ｂｙｒｄ，Ｍ．Ｓ．Ｃｚｕｃｚｍａｎ，Ｌ．Ｅ．Ｆａｙａｄ，Ｒ．Ｉ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎ，Ｎ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｔ．Ｈｏｐｐｅ，Ｓ．Ｍ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｃ．Ｒ．Ｋｅｌｓｅｙ，Ｙ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋｒｉｖａｃｉｃ，Ａ．Ｓ．ＬａＣａｓｃｅ，Ａ．Ｎａｄｅｍａｎｅｅ，Ｐ．Ｐｏｒｃｕ，Ｏ．Ｐｒｅｓｓ，Ｒ．Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，Ｎ．Ｒｅｄｄｙ，Ｅ．Ｒｅｉｄ，Ａ．Ａ．Ｓａａｄ，Ｌ．Ｓｏｋｏｌ，Ｌ．Ｊ．Ｓｗｉｎｎｅｎ，Ｃ．Ｔｓｉｅｎ，Ｊ．Ｍ．Ｖｏｓｅ，Ｊ．Ｙａｈａｌｏｍ，Ｎ．Ｚａｆａｒ，Ｍ．Ｄｗｙｅｒ，Ｈ．Ｓｕｎｄａｒ，Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ ４．２０１４．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃｏｍｐｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗ．１２，１２８２－１３０３（２０１４）．
１３． Ｄ．Ｇ．Ｍａｌｏｎｅｙ，Ａ．Ｊ．Ｇｒｉｌｌｏ－Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｂｏｄｋｉｎ，Ｒ．Ｊ．Ｓｃｈｉｌｄｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｎｅｉｄｈａｒｔ，Ｎ．Ｊａｎａｋｉｒａｍａｎ，Ｋ．Ａ．Ｆｏｏｎ，Ｔ．Ｍ．Ｌｉｌｅｓ，Ｂ．Ｋ．Ｄａｌｌａｉｒｅ，Ｋ．Ｗｅｙ，Ｉ．Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｔ．Ｄａｖｉｓ，Ｒ，Ｌｅｖｙ，ＩＤＥＣ－Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｌｏｗ－ｇｒａｄｅ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ ９０，２１８８－２１９５（１９９７）．
１４． Ｄ．Ｇ．Ｍａｌｏｎｅｙ，Ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６，２００８－２０１６（２０１２）．
１５． Ａ．Ｍｏｌｉｎａ，Ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５９，２３７－２５０（２００８）．
１６． Ｇ．Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｌ．Ｄａｃｈｅｕｘ，Ｇ．Ｓａｌｌｅｓ，Ｐ．Ｓｏｌａｌ－Ｃｅｌｉｇｎｙ，Ｐ．Ｂａｒｄｏｓ，Ｐ．Ｃｏｌｏｍｂａｔ，Ｈ．Ｗａｔｉｅｒ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃｙＲＩＩＩａ ｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ ９９，７５４－７５８（２００２）．
１７． Ｍ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ）：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２，７３５９（２００３）．
１８． Ｉ．Ｄｒａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＦｃｙＲＩＩｂ ａｎｄ ＣＤ２０ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １２３，６０６－６０７（２０１４）．
１９． Ｔ．Ｐｈａｍ，Ｐ．Ｍｅｒｏ，Ｊ．Ｗ．Ｂｏｏｔｈ，Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ－ｃｏａｔｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅｌ４４９８（２０１１）．
２０． Ｐ．Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ，Ｌ．Ｍ．Ｎａｄｌｅｒ，Ｒ．Ｈａｒｄｙ，Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５，１６７８－１６８５（１９８０）．
２１． Ｋ．Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ｂａｔｅｓ，Ｂ．Ｌ．Ｓｌａｕｇｈｅｎｈｏｕｐｔ，Ｇ．Ｓ．Ｐｉｎｋｕｓ，Ｓ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｌ．Ｍ．Ｎａｄｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ ６３，１４２４－１４３３（１９８４）．
２２． Ｏ．Ｗ．Ｐｒｅｓｓ，Ａ．Ｇ．Ｆａｒｒ，Ｋ．Ｉ．Ｂｏｒｒｏｚ，Ｓ．Ｋ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９，４９０６－４９１２（１９８９）．
２３． Ｒ．Ｂ．Ｍｉｃｈｅｌ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｔｔｅｓ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ １Ｆ５ ｉｎ Ｂ－ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８，２７０１－２７１３（２００２）．
２４． Ｊ．Ｋ．Ｂｕｂｉｅｎ，Ｌ．Ｊ．Ｚｈｏｕ，Ｐ．Ｄ．Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ａ．Ｆｒｉｚｚｅｌｌ，Ｔ．Ｆ．Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２０ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ａ Ｃａ２＋ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｆｏｕｎｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ｉｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１，１１２１－１１３２（１９９３）．
２５． Ｔ．Ｆ．Ｔｅｄｄｅｒ，Ｐ．Ｅｎｇｅｌ，ＣＤ２０：ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １５，４５０－４５４（１９９４）．
２６． Ｅ．Ｊａｎａｓ，Ｒ．Ｐｒｉｅｓｔ，Ｒ．Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ＣＤ２０ ａｃｔｉｖｉｔｙ？Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，２００５，１６５－１７５．
２７． Ｂ．Ｄ．Ｃｈｅｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｂ－ｃｅｌｌ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９，６１３－６２６（２００８）．
２８． Ｐ．Ｂｏｒｏｓｓ，Ｊ．Ｈ．Ｗ．Ｌｅｕｓｅｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２，２，６７６－６９０（２０１２）．
２９． Ｍ．Ｏｋｒｏｊ，Ａ．Ｏｓｔｅｒｂｏｒｇ，Ａ．Ｍ．Ｂｌｏｍ，Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３９，６３２－６３９（２０１３）．
３０． Ｄ．Ｓｈａｎ，Ｊ．Ａ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｏ．Ｗ．Ｐｒｅｓｓ，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２０ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ ９１，１６４４－１６５２（１９９８）．
３１． Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｔ．－Ｗ．Ｃｈｕ，Ｅ．Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １６，１７２５－１７２９（２０１５）．
３２． Ｒ Ｚｈａｎｇ，Ｊ Ｙａｎｇ，Ｔ－Ｗ Ｃｈｕ，Ｊ Ｍ Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ａ“ｄｒｕｇ－ｆｒｅｅ”ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ．Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．４，１０５４－１０６５（２０１５）．
３３． Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｔ．－Ｗ．Ｃｈｕ Ｔ－Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２３７８４，ｆｉｌｅｄ：Ｍａｒｃｈ １１，２０１４．
３４． Ｍ．Ｂｅｒｎ，Ｋ．Ｍ．Ｋｎｕｔｓｅｎ Ｓａｎｄ，Ｊ．Ｎｉｌｓｅｎ，Ｉ．Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｊ．Ｔ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２１１，１４４－１５２（２０１５）．
３５． Ｆ．Ｋｒａｔｚ，Ａｌｂｕｍｉｎ ａｓ ａ ｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒ：Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３２，１７１－１８３（２００８）．
３６． Ｊ．Ｔ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｂ．Ｄａｌｈｕｓ，Ｄ．Ｖｉｕｆｆ，Ｂ．Ｔ．Ｒａｖｎ，Ｋ．Ｓ．Ｇｕｎｎａｒｓｅｎ，Ａ．Ｐｌｕｍｒｉｄｇｅ，Ｋ．Ｂｕｎｔｉｎｇ，Ｆ．Ａｎｔｕｎｅｓ，Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｓ．Ａｔｈｗａｌｌ，Ｅ．Ａｌｌａｎ，Ｌ．Ｅｖａｎｓ，Ｍ Ｂｊｏｒａｓ，Ｓ．Ｋｊａｅｒｕｌｆｆ，Ｄ．Ｓｌｅｅｐ．Ｉ．Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｊ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９，１３４９３－１３５０２（２０１４）．
３７． Ａ．Ｓｅｔｈｉ，Ｍ．Ｓｈｅｒ，Ｍ．Ｒ．Ａｋｒａｍ，Ｓ．Ｋａｒｉｍ，Ｓ．Ｋｈｉｌｊｅｅ，Ａ．Ｓａｊｊａｄ，Ｎ．Ｈ．Ｓｈａｈ，Ｇ．Ｍｕｒｔａｚａ，Ａｌｂｕｍｉｎ ａｓ ａ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｏｏｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｒｋｅｔ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ａｃｔａ Ｐｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ－Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．７０，５９７－６００（２０１３）．
３８． Ｂ．Ｅｌｓａｄｅｋ，Ｆ．Ｋａｔｚ，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｏｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ－Ｎｅｗ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｈｏｒｉｚｏｎ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５７，４－２８（２０１２）．
３９． Ｎ．Ｄｅｓａｉ，Ｖ．Ｔｒｉｅｕ，Ｂ．Ｄａｍａｓｃｅｌｌｉ，Ｐ．Ｓｏｏｎ－Ｓｈｉｏｎｇ，ＳＰＡＲＣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｌｂｕｍｉｎ－ｂｏｕｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．２，５９－６４（２００９）．
４０． Ｇ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｈｅ，Ｓ．Ｄｏｕ，Ｓ．Ｇｕｐｔａ，Ｊ．Ｌ．Ｖａｎｄｅｒｈｅｙｄｅｎ，Ｍ．Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｕｍｏｒｅｄ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ｓｈｏｗｉｎｇ ｌｏｗ ｋｉｄｎｅｙ ｕｐｔａｋｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ ３１，４１７－４２４（２００４）．
４１． Ａ．Ｍ．Ｇｈｅｔｉｅ，Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｔ．Ｔｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｗ．Ｕｈｒ，Ｅ．Ｓ．Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｏｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ Ｂ－ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ（Ｄａｕｄｉ） ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４５，４８１－４８５（１９９０）．
４２． Ａ．Ｍ．Ｇｈｅｔｉｅ，Ｋ．Ｔｕｃｋｅｒ，Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｕｈｒ，Ｅ．Ｓ．Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｔｈｅ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ２２ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｄａｕｄｉ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｅｉｔｈｅｒ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ １９ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｒ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ １９ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ｂｌｏｏｄ ８０，２３１５－２３２０（１９９２）．
４３． Ｇ．Ｌ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｔｔｅｓ，Ｒ．Ｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｖ．Ｇｏｖｉｎｄａｎ，Ｉ．Ｄ．Ｈｏｒａｋ，Ｈ．Ｊ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｅ ｏｆ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ ｂｅａｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｂ－ｌｙｍｐｈｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｂｙ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ７４ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９，６５６７－６５７１（２００３）．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【配列表】

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