7069426 ユートロフィン遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-09

(45)【発行日】2022-05-17

(54)【発明の名称】ユートロフィン遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220510BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220510BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220510BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20220510BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220510BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220510BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20220510BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220510BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20220510BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

A61K31/7105

A61K35/76

A61K35/761

A61K48/00

A61P21/00

C07K14/005

C07K14/195

C12N7/01

C12N9/16 Z

C12N15/09 110

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/31

C12N15/33

C12N15/55

C12N15/63 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021551108

(86)(22)【出願日】2019-11-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-20

(86)【国際出願番号】 JP2019045716

(87)【国際公開番号】W WO2020101042

(87)【国際公開日】2020-05-22

【審査請求日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】62/768,474

(32)【優先日】2018-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/861,039

(32)【優先日】2019-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/931,925

(32)【優先日】2019-11-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000006677

【氏名又は名称】アステラス製薬株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】519187609

【氏名又は名称】株式会社モダリス

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】吉見 英治

(72)【発明者】

【氏名】吉岡 克郎

(72)【発明者】

【氏名】山形 哲也

(72)【発明者】

【氏名】シン ユアンバウ

(72)【発明者】

【氏名】トンプソン イーアン ロバート

(72)【発明者】

【氏名】カンナ ニディ

【審査官】馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１６９９８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】The American Journal of Human Genetics，2016年，Vol.98，PP.90-101

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ｃ１２Ｎ １５／３１

Ｃ１２Ｎ １５／５５

Ｃ１２Ｎ １５／３３

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｎ １５／８６４

Ｃ１２Ｎ １５／８６１

Ｃ１２Ｎ １５／８６７

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ｃ０７Ｋ １４／１９５

Ｃ０７Ｋ １４／００５

Ｃ１２Ｎ ９／１６

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｋ ３５／７６１

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

Ａ６１Ｐ ２１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、又は１７２で表される塩基配列を含む、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列。

【請求項2】

少なくとも２つの異なる、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

転写アクチベーターが、ＶＰ６４及びＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来するｄＣａｓ９である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ＥＦＳプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、Ｄｅｓプロモーター、ＣＡＧプロモーター及びＭＹＯＤプロモーターからなる群より選択される、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列を含み、
転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターであり、そして
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ＣＫ８プロモーターである、
請求項７～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号５９で表される塩基配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項13】

ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。

【請求項14】

ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１３に記載のベクター。

【請求項15】

ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ_５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ_５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶＳ１＿Ｐ１、及びＡＡＶＳ１０＿Ｐ１からなる群から選択される、請求項１４に記載のベクター。

【請求項16】

請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１２～１５のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。

【請求項17】

デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防用の、請求項１６記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６２／７６８，４７４号（２０１８年１１月１６日出願）、米国仮出願第６２／８６１，０３９号（２０１９年６月１３日出願）及び米国仮出願第６２／９３１，９２５号（２０１９年１１月７日出願）（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）の利益を請求する。
発明の背景
発明の分野
本発明は、ヒトユートロフィン（ＵＴＲＮ）遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法等に関する。より詳細には、本発明は、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ及び転写アクチベーターとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いてヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現を活性化することにより筋ジストロフィーを治療又は予防する方法、並びに筋ジストロフィーの治療又は予防剤等に関する。

【背景技術】

【0002】

背景の考察
筋ジストロフィーは進行性の筋萎縮と筋力低下を伴う遺伝性疾患の総称である。筋ジストロフィーのうち、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子の変異に起因するものとして、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＵＣＨＥＮＮＥ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＤＭＤ）およびその軽症型であるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＥＣＫＥＲ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＢＭＤ）が挙げられる。

【0003】

ＤＭＤは出生男子の約３５００人に１人が発症する最も頻度の高い遺伝性進行性筋疾患である。その臨床症状としては、２～５歳頃から筋力低下がみられ、その後筋力低下が進行し、約１０歳までに歩行不能となり、２０歳代で心不全又は呼吸不全により死に至る（ＷＯ２００９／０４４３８３を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【0004】

ＤＭＤはジストロフィン遺伝子の変異が原因であることが知られている。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体上に存在し、約２２０万塩基のＤＮＡからなる巨大な遺伝子である。ＤＮＡからｍＲＮＡ前駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれて、７９のエクソンから構成されるｍＲＮＡが生じる（約１４ｋｂ）。このｍＲＮＡから３６８５のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィンタンパク質が生成する。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与しているが、ＤＭＤ患者ではジストロフィン遺伝子中に変異が生じておりジストロフィンタンパク質がほとんど発現していないため、筋細胞の構造が維持できず、その結果、筋力低下へとつながる。

【0005】

ＢＭＤもジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、その症状は一般的にＤＭＤと比較して軽度である。ＤＭＤとＢＭＤの臨床症状の違いは、ＤＭＤでは機能を持つジストロフィンタンパク質がほとんど発現しない一方で、ＢＭＤでは不完全ながらも機能を有するジストロフィンタンパク質が産生されている点にある。

【0006】

現在でも筋ジストロフィーに対して有効な根本治療薬は存在せず、ステロイドの投与等の対処療法がおこなわれている。ＤＭＤやＢＭＤを治療するために複数の治療戦略が提案されてきたが、その戦略の一つとして遺伝子治療アプローチが注目されている。遺伝子治療においては、変異を持つ筋細胞に正常なジストロフィン遺伝子を補充し、正常ジストロフィンタンパク質を発現させることが目的となる。しかし、全長型ジストロフィンｃＤＮＡは約１４ｋｂとかなり長く、従ってアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等の特定のベクターにとっては、搭載できるＤＮＡサイズの制限等が問題となる。そこで、この問題の解決策の一つとして、最小限の機能ドメインを有する短縮型のジストロフィン遺伝子（ミニ／マイクロジストロフィン遺伝子）を用いる方法が提案されている（Sakamoto M. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2002 May 17; 293(4):1265-72を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。また、ジストロフィンを欠いているＤＭＤ患者にジストロフィンを導入することにより免疫応答が誘発される可能性があるため、この免疫応答を低減する目的でユートロフィン（本明細書において、「ユートロフィン」、「ＵＴＲＮ」等とも記載する場合がある）を用いる手段等も報告されている（Gilbert R. et al., Hum Gene Ther. 1999 May 20; 10(8):1299-310を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。ユートロフィンは、ジストロフィンに高度に相同な細胞骨格タンパク質で、低いレベルではあるが、正常及びＤＭＤの筋肉に存在する。ユートロフィンｃＤＮＡはジストロフィンと同様に非常に大きい（１０ｋｂ超）。ユートロフィンは、また、ジストロフィンの有する筋細胞の膜安定化機能を代償し得ることが知られている（Gilbert R. et al., Hum Gene Ther. 1999 May 20; 10(8):1299-310 及び Liao H. et al., Cell. 2017 Dec 14; 171(7): 1495-507を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【0007】

ユートロフィンを標的とする遺伝子治療として、例えば、ＷＯ２０１５／０１８５０３には、骨格筋組織または心筋組織で遺伝子を発現させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを対象とした発明が開示されており、筋肉特異的プロモーターと融合タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記融合タンパク質が以下の構成を有する：
ａ）転写活性化エレメント、及び
ｂ）ＤＮＡ結合エレメント、
ここで、該融合タンパク質は、該骨格筋組織または心筋組織で発現すると、ユートロフィンの発現を増加させることができる（ＷＯ２０１５／０１８５０３を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。本発明では、ＤＮＡ結合エレメントとしてジンクフィンガータンパク質が用いられる。

【0008】

一方、近年、ヌクレアーゼ活性を失活させたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）と転写活性化ドメイン又は転写抑制ドメインとを組み合わせたシステムが開発されており、該システムでは遺伝子のＤＮＡ配列を切断することなくガイドＲＮＡを用いてタンパク質を遺伝子にターゲティングすることで標的遺伝子の発現を制御する（ＷＯ２０１３／１７６７７２、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。その臨床利用が期待されている（Dominguez A. et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan; 17(1): 5-15を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。しかしながら、ｄＣａｓ９、ガイドＲＮＡ、および同時転写のアクチベーターの複合体をコードする配列は、インビボでの遺伝子導入に最も有望な方法である、最も一般的なウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）のキャパシティを超えるという課題がある（Liao H. et al., Cell. 2017 Dec 14; 171(7): 1495-507を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【0009】

２０１７年、（ａ）Ｃａｓ９遺伝子を導入したＤＭＤモデルマウス（ｍｄｘマウス）に、マウスＵＴＲＮをターゲットとしＣａｓ９のＤＮＡ切断能を阻害するガイドＲＮＡ(ｄｇＵｔｒｎ)と転写活性化ドメインを搭載したＡＡＶを投与することにより、ＵＴＲＮの発現量が増加して握力の改善も見られたこと、および（ｂ）ｍｄｘマウスに、Ｃａｓ９を搭載したＡＡＶと前記ｄｇＵｔｒｎと転写活性化ドメインを搭載したＡＡＶとを同時にインジェクションすることにより、握力の改善が見られたことが報告された（Liao H. et al., Cell. 2017 Dec 14; 171(7): 1495-507を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【発明の概要】

【0010】

発明の概要
従って、本発明の目的の１つは、筋ジストロフィー（特に、ＤＭＤおよびＢＭＤ）の新規治療手段を提供することにある。

【0011】

以下の詳細な説明の中で明らかになるであろう、この目的およびその他の目的は、本発明者らが、ヒトＵＴＲＮ遺伝子（Gene ID:7402）の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ及び転写アクチベーターとヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いることにより、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現を強力に活性化できることを見出したことによって達成された。また、本発明者らは、小型化したヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及び小型化した転写アクチベーターを用いて、該融合タンパク質をコードする塩基配列とガイドＲＮＡをコードする塩基配列とを搭載した単一のＡＡＶベクターにより、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現を強力に活性化できることを見出した。

【0012】

即ち、本発明は、以下を提供する：
（１）以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
（２）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、若しくは１７２で表される塩基配列、又は配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、若しくは１７２で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（１）記載のポリヌクレオチド。
（３）少なくとも２つの異なる、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含む、（１）又は（２）記載のポリヌクレオチド。
（４）転写アクチベーターが、ＶＰ６４及びＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである、（１）～（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（５）転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、（４）記載のポリヌクレオチド。

【0013】

（６）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、（１）～（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（７）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来するｄＣａｓ９である、（６）記載のポリヌクレオチド。
（８）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、（１）～（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（９）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、（８）記載のポリヌクレオチド。
（１０）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ＥＦＳプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、Ｄｅｓプロモーター、ＣＡＧプロモーター及びＭＹＯＤプロモーターからなる群より選択される、（８）又は（９）記載のポリヌクレオチド。

【0014】

（１１）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列、又は配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターであり、そして
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ＣＫ８プロモーターである、
（８）～（１０）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（１２）ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号５９で表される塩基配列、又は配列番号５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（１１）記載のポリヌクレオチド。
（１３）（１）～（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１４）ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、（１３）記載のベクター。
（１５）ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、（１４）に記載のベクター。

【0015】

（１６）ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ_５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ_５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶＳ１＿Ｐ１、及びＡＡＶＳ１０＿Ｐ１からなる群から選択される、（１５）記載のベクター。
（１７）ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９である、（１６）記載のベクター。
（１８）（１）～（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は（１３）～（１７）のいずれかに記載のベクターを含む、医薬組成物。
（１９）デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防用の、（１８）記載の医薬組成物。
（２０）（１）～（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は（１３）～（１７）のいずれかに記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防方法。

【0016】

（２１）デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防のための、（１）～（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は（１３）～（１７）のいずれかに記載のベクターの使用。
（２２）デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防用医薬組成物の製造における、（１）～（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は（１３）～（１７）のいずれかに記載のベクターの使用。
（２３）以下を含む、リボヌクレオプロテイン：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ。
（２４）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（２３）記載のリボヌクレオプロテイン。
（２５）転写アクチベーターが、ＶＰ６４及びＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである、（２３）又は（２４）記載のリボヌクレオプロテイン。

【0017】

（２６）転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、（２５）記載のリボヌクレオプロテイン。
（２７）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、（２３）～（２６）のいずれかに記載のリボヌクレオプロテイン。
（２８）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９である、（２７）記載のリボヌクレオプロテイン。
（２９）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そして
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９である、
（２３）～（２８）のいずれかに記載のリボヌクレオプロテイン。
（３０）ガイドＲＮＡが、配列番号１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（２９）に記載のリボヌクレオプロテイン。

【0018】

（３１）以下を含む、ヒトユートロフィン遺伝子の発現を活性化するための組成物又はキット：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、若しくは１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（３２）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（３１）記載の組成物又はキット。
（３３）少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡを含む、（３１）又は（３２）記載の組成物又はキット。
（３４）転写アクチベーターが、ＶＰ６４及びＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである、（３１）～（３３）のいずれかに記載の組成物又はキット。
（３５）転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、（３４）記載の組成物又はキット。

【0019】

（３６）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、（３１）～（３５）のいずれかに記載の組成物又はキット。
（３７）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９である、（３６）記載の組成物又はキット。
（３８）（３１）～（３７）のいずれかに記載の組成物又はキットであって、
該組成物又はキットは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み、
該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが融合タンパク質に対するプロモーター配列をさらに含み、及び／又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドがガイドＲＮＡに対するプロモーター配列をさらに含む。
（３９）ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、（３８）記載の組成物又はキット。
（４０）融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ＥＦＳプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、Ｄｅｓプロモーター、ＣＡＧプロモーター及びＭＹＯＤプロモーターからなる群より選択される、（３８）又は（３９）記載の組成物又はキット。

【0020】

（４１）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターであり、そして
融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ＣＫ８プロモーターである、
（３８）～（４０）のいずれかに記載の組成物又はキット。
（４２）ガイドＲＮＡが、配列番号１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（４１）に記載の組成物又はキット。
（４３）以下（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防方法：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
（４４）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、（４３）記載の方法。
（４５）少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡを含む、（４３）又は（４４）記載の方法。

【0021】

（４６）転写アクチベーターが、ＶＰ６４及びＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである、（４３）～（４５）のいずれかに記載の方法。
（４７）転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、（４６）記載の方法。
（４８）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、（４３）～（４７）のいずれかに記載の方法。
（４９）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９である、（４８）記載の方法。
（５０）（４３）～（４９）のいずれかに記載の方法であって、
該方法は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、
該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが融合タンパク質に対するプロモーター配列をさらに含み、及び／又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドがガイドＲＮＡに対するプロモーター配列をさらに含む。

【0022】

（５１）ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、（５０）記載の方法。
（５２）融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ＥＦＳプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、Ｄｅｓプロモーター、ＣＡＧプロモーター及びＭＹＯＤプロモーターからなる群より選択される、（５０）又は（５１）記載の方法。
（５３）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入（ｉｎｓｅｒｔｅｄ）、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターであり、そして
融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ＣＫ８プロモーターである、
（５０）～（５２）のいずれかに記載の方法。
（５４）ガイドＲＮＡが、配列番号１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（５３）に記載の方法。
（５５）デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型（ＢＥＣＫＥＲ）筋ジストロフィーの治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下（ｅ）及び（ｆ）の使用：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。

【0023】

（５６）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（５５）記載の使用。
（５７）少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡを含む、（５５）又は（５６）記載の使用。
（５８）転写アクチベーターが、ＶＰ６４及びＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである、（５５）～（５７）のいずれかに記載の使用。
（５９）転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、（５８）記載の使用。
（６０）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、（５５）～（５９）のいずれかに記載の使用。

【0024】

（６１）ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９である、（６０）記載の使用。
（６２）（５５）～（６１）のいずれかに記載の使用であって、
該使用は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用及びガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの使用を含み、
該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが融合タンパク質に対するプロモーター配列をさらに含み、及び／又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドがガイドＲＮＡに対するプロモーター配列をさらに含む。
（６３）ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、（６２）記載の使用。
（６４）融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ＥＦＳプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、Ｄｅｓプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びＭＹＯＤプロモーターからなる群より選択される、（６２）又は（６３）記載の使用。
（６５）ガイドＲＮＡが、配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５若しくは１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み、
転写アクチベーターが、配列番号１１７で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が黄色ブドウ球菌に由来するｄＣａｓ９であり、
ガイドＲＮＡに対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターであり、そして
融合タンパク質に対するプロモーター配列が、ＣＫ８プロモーターである、
（６２）～（６４）のいずれかに記載の使用。
（６６）ガイドＲＮＡが、配列番号１９７で表される塩基配列、又は配列番号１９７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、（６５）に記載の使用。

【発明の効果】

【0025】

本発明によると、ヒトユートロフィン遺伝子の発現を活性化することができ、結果としてＤＭＤおよびＢＭＤを治療することができると期待される。

【0026】

本発明とそれに付随する多くの利点は、以下の詳細な説明を参照し、添付の図面と併せて理解することで、より完全に理解することができるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】図１において、上パネルはヒトＵＴＲＮ遺伝子のプロモーターＡの領域を、中パネルはプロモーターＢの領域を示し、各領域中に設定した、２４のターゲティング配列（ガイド＃ ｓｇＥＤ３－１～ｓｇＥＤ３－２４（配列番号１２９～１５２））の位置を表す。図１において、下パネルは、配列番号１２９～１５２で表されるターゲティング配列によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡと３種の異なるｄＳａＣａｓ９－転写アクチベーター融合タンパク質（ｄＳａＣａｓ９－ＶＰ６４（配列番号１８８）、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＨ（配列番号１８９）、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ（配列番号１９０））との組み合わせを用いてのヒトＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化を示す（Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を示す。）。コントロールｓｇＲＮＡを用いた場合と比較して、ガイド＃ ｓｇＥＤ３－６及びｓｇＥＤ３－７（配列番号１３４及び１３５）を含む領域（領域Ａ）並びにガイド＃ ｓｇＥＤ３－１３（配列番号１４１）を含む他の領域（領域Ｂ）に特異的に結合するｓｇＲＮＡをそれぞれ用いた時、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現が強く活性化された。また、活性化効果は、３種のｄＳａＣａｓ９－転写アクチベーター融合タンパク質のうちｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ融合タンパク質を用いたときが最も強かった。

【図2】図２において、上パネルはヒトＵＴＲＮ遺伝子のプロモーターＡの領域に設定した、ターゲティング配列（ガイド＃ ｓｇＥＤ３－１～ｓｇＥＤ３－２０及びｓｇＥＤ３－２５～ｓｇＥＤ３－４８（配列番号１２９～１４８及び１５３～１７６））の位置を表す。図２において、下パネルはターゲティング配列ガイド＃ ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－１３、ｓｇＥＤ３－２５～ｓｇＥＤ３－４８（配列番号１３４、１４１、１５３～１７６）によってコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡとｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲとの組み合わせを用いてのＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるヒトＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化を示す図である（Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を示す。）。ターゲティング配列ガイド＃ ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－１３、ｓｇＥＤ３－２５～ｓｇＥＤ３－３２、ｓｇＥＤ３－３９、ｓｇＥＤ３－４０、ｓｇＥＤ３－４４（配列番号１３４、１４１、１５３～１６０、１６７、１６８、及び１７２）を含む領域に特異的に結合するｓｇＲＮＡをそれぞれ用いた場合、コントロールｓｇＲＮＡを用いた場合と比較して、ヒトＵＴＲＮ遺伝子発現は２倍以上活性化された。

【図3】図３は、各ｓｇＲＮＡの機能を、プラスミドベクターを用いて検証した結果を示す図である（Ｎ＝１）。ターゲティング配列ガイド＃ ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－１３、ｓｇＥＤ３－２５、ｓｇＥＤ３－２７、ｓｇＥＤ３－３０、ｓｇＥＤ３－３１、ｓｇＥＤ３－３９、ｓｇＥＤ３－４０、又はｓｇＥＤ３－４４（配列番号１３４、１４１、１５３、１５５、１５８、１５９、１６７、１６８又は１７２）にコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを発現する、ｐＡＡＶ－ＥＦＳ－ｄＳａＣａｓ９[－２５]－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ ＡＩＯプラスミドを調製し、これらをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションして、その機能を検証した。コントロールｓｇＲＮＡと比較して、ターゲティング配列ガイド＃ ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－１３、ｓｇＥＤ３－２５、ｓｇＥＤ３－２７、ｓｇＥＤ３－３０、ｓｇＥＤ３－３１、ｓｇＥＤ３－３９、ｓｇＥＤ３－４０、又はｓｇＥＤ３－４４（配列番号１３４、１４１、１５３、１５５、１５８、１５９、１６７、１６８又は１７２）によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを用いた場合、ヒトＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化が観察された。

【図4】図４は、各ｓｇＲＮＡの機能を、ＡＡＶベクターを用いて検証した結果を示す図である（Ｎ＝１）。ターゲティング配列ガイド＃ ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－３０、又はｓｇＥＤ３－３１（配列番号１３４、１５８又は１５９）によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを発現する、ｐＡＡＶ－ＥＦＳ－ｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ ＡＩＯプラスミドを用いて作製したＡＡＶ２を用いてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に遺伝子導入した。ターゲティング配列ガイド＃ ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－３０、又はｓｇＥＤ３－３１（配列番号１３４、１５８、又は１５９）によりコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡの全てにおいて、コントロールｓｇＲＮＡと比較してヒトＵＴＲＮ遺伝子の活性化が観察された。

【図5】図５は、ｐＡＡＶ－ＥＦＳ－ｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ ＡＩＯプラスミドのコンストラクトを示す図である。

【図6】図６において、パネルＡは、ヒト骨格筋細胞のゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ２７Ａｃのパターンと、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の推定エンハンサー領域Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、推定プロモーター領域Ｐ１、Ｐ２を示す。パネルＢ～Ｆは、各ガイド＃で表されるターゲティング配列（配列番号４～１０３で表される配列）の位置を示している。

【図7】図７は、ＨＳＭＭ細胞（Ｎ＝２）において、各ガイド＃で表されたターゲティング配列（配列番号４～１０３で表された配列）でコードされたｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡと、ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲとを用いて、ヒトＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化を評価した結果を示したものである。

【図8】図８において、上パネルは、ガイド＃１４５、１４６、２０５、２０８、２１０（配列番号４５、４６、５８、５９、及び６０）の５つのターゲティング配列の、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）との相同性と位置する領域をそれぞれ示す。下パネルは、５つのターゲティング配列の組み合わせ、カニクイザルとの相同性、および位置する領域を示す。

【図9】図９は、ターゲティング配列ガイド＃１４５、１４６、２０５、２０８、２１０（配列番号４５、４６、５８、５９、及び６０）でそれぞれコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ、又はその組み合わせと、ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲとを用いた、５種類のＨＳＭＭ細胞（Ｎ＝２）におけるヒトＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化を示す。

【図10】図１０は、ｐＥＤ２６０、ｐＥＤ２６１、又はｐＥＤ２６３プラスミドバックボーンにおけるターゲティング配列ガイド＃１４５、＃１４６、又は＃２０８によってコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡが、ＵＴＲＮをアップレギュレートすることを示したものである。ガイド＃１４５、＃１４６、又は＃２０８をそれぞれｐＥＤ２６０、ｐＥＤ２６１、又はｐＥＤ２６３のバックボーンで一過性に発現させたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞から、相対的なｍＲＮＡ発現を測定した。データは、３回の繰り返しによる平均値＋標準偏差で表す（Ｎ＝３、エラーバーは標準偏差を示す）。

【図11】図１１において、左パネルに各ＡＡＶ９サンプルとマーカーをアプライしたＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーンレイアウトを、右パネルにＳＤＳ－ＰＡＧＥのイメージを示す。レーン１１の横の数値は、分子量（ｋＤａ）を意味する。各ＡＡＶサンプルから３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、それぞれ８７、７２、及び６２ｋＤａ）が検出された。これらの結果は、プラスミド（ｐＥＤ２６１－１４５、ｐＥＤ２６１－１４６、ｐＥＤ２６１－２０８、ｐＥＤ２６３－１４５、ｐＥＤ２６３－１４６、及びｐＥＤ２６３－２０８）にクローニングされた目的の遺伝子は、ＡＡＶ９に搭載できることを示している。

【図12】図１２は、ＨＳＭＭ細胞における、３種類のＡＡＶ９（ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－１４５、ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－２０８、及びＡＡＶ９－ＥＤ２６３－２０８）を用いた、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現の活性化を示す（ＡＡＶ群はＮ＝３～４、非ＡＡＶ対照はＮ＝８。エラーバーは標準誤差を示す。）。これらのＡＡＶ９によってヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現が活性化された。

【図13】図１３は、標的ガイドを非標的ガイドに対して正規化したＲＮＡ－ｓｅｑの結果を、log 2 倍率変化 vs 正規化カウントの平均値としてプロットしたものを示す（パネルＡ；ガイド＃１４５ ｖｓ ＮＴｇ１、パネルＢ；ガイド＃１４６ ｖｓ ＮＴｇ１、パネルＣ；ガイド＃２０８ ｖｓ ＮＴｇ１）。

【発明を実施するための形態】

【0028】

好ましい実施形態の詳細な説明
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。

【0029】

１．ポリヌクレオチド
本発明は、以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称することがある）を提供する：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域（即ち、１８～２４の連続したヌクレオチド）を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。

【0030】

本発明のポリヌクレオチドは、所望の細胞内に導入され、転写されることにより、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質及びヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域中の特定の領域を標的とするガイドＲＮＡを生じる。これら融合タンパク質及びガイドＲＮＡが複合体（以下、該複合体を「リボヌクレオプロテイン（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）」と称することがある）となって協同的に前記特定の領域に作用することにより、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の転写を活性化する。

【0031】

（１）定義
本明細書において「ヒトユートロフィン（ＵＴＲＮ）遺伝子の発現制御領域」とは、ＲＮＰがその領域へ結合することによりヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現が活性化され得る、あらゆる領域を意味する。即ち、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域とは、ＲＮＰの結合によりヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現が活性化される限り、ヒトＵＴＲＮ遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、エクソン等のいずれの領域に存在してもよい。本明細書中、ある特定の配列により発現制御領域を表す場合、発現制御領域とは、そのセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列の両方を含む概念である。

【0032】

本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによりヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域中の特定の領域へリクルートされる。本明細書において、「～を標的とするガイドＲＮＡ」とは、「～へ融合タンパク質をリクルートするガイドＲＮＡ」を意味する。

【0033】

本明細書において、「ガイドＲＮＡ（『ｇＲＮＡ』とも称することがある）」とは、ゲノム特異的ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」と称する）を含むＲＮＡである。ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列（後述）の相補配列に結合するＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその５’末端に付した特定の配列（例えばＦｎＣｐｆ１の場合、配列番号１０６で表されるＲＮＡ配列）からなるＲＮＡを含むＲＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその３’末端に連結されたｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称する）を含むキメラＲＮＡ（「ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と称する）を指す。（例えば、Zhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【0034】

本明細書において、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域中で、ｃｒＲＮＡが結合する配列に対する相補配列を「ターゲティング配列（targeting sequence）」と称する。すなわち、本明細書において、「ターゲティング配列」とは、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域中に存在し、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif））が隣接するＤＮＡ配列である。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合にはターゲティング配列の５’側に隣接する。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合にはターゲティング配列の３’側に隣接する。ターゲティング配列は、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域のセンス鎖配列側及びアンチセンス鎖配列側のいずれに存在してもよい（例えば、上述のZhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【0035】

（２）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質
本発明では、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いて、それに融合させた転写アクチベーターをヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域にリクルートさせる。本発明に用いられるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（以下では単に「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」と称する）としては、ｇＲＮＡと複合体を形成して、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域にリクルートされる限り特に制限はないが、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（以下「ｄＣａｓ９」とも称することがある）又はヌクレアーゼ欠損Ｃｐｆ１（以下「ｄＣｐｆ１」とも称することがある）が挙げられる。

【0036】

上記ｄＣａｓ９としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＡＧＡＡＷ（ＷはＡ又はＴ。以下同じ））、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、又は黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））由来のＣａｓ９(ＳａＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ（ＲはＡ又はＧ。以下同じ））のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、これらに限定されない（例えばNishimasu et al., Cell. 2014 Feb 27; 156(5): 935-49、Esvelt KM et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21、Zhang Y. Mol Cell. 2015 Oct 15;60(2):242-55、及びFriedland AE et al., Genome Biol. 2015 Nov 24;16:257を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、且つ、８４０番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（「ｄＳｐＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる（例えば上述のNishimasu et al., Cell. 2014を参照）。或いは、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号１０７）、又は、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５５７番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号１０８）（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９」と称することがある）を使用することができる（例えば上述のFriedland AE et al., Genome Biol. 2015を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【0037】

また、本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、前記ｄＣａｓ９のアミノ酸配列の一部をさらに改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。かかる改変体としては、例えば、アミノ酸配列の一部を欠失させた短縮型の改変体が挙げられる。本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０２２７９５及びＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４１７５１（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）において開示された改変体を用いることができる。具体的には、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の７２１番目～７４５番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号１０９）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（例えば、該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカー（配列番号１１０）で置換したものを配列番号１１１で示す、該欠失部分をＳＧＧＧＳリンカー（配列番号２１３）で置換したものを配列番号２１４で示す）（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９[－２５]」と称することがある）、又は前記二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の４８２番目～６４８番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号１１２）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカーで置換したものを配列番号１１３で示す）を用いてもよい。

【0038】

また、上記ｄＣｐｆ１としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴ）、アシダミノコッカス ｓｐ．（Acidaminococcus sp.）由来のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）、又はラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71、Yamano T et al., Cell. 2016 May 5;165(4):949-62、及びYamano T et al., Mol Cell. 2017 Aug 17;67(4):633-45を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に、且つ、１００６番目のＧｌｕ残基をＡｌａ残基に変換した二重変異体を用いることができる（例えば、上述のZetsche B et al., Cell. 2015を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。本発明の一態様において、ｄＣｐｆ１として、前記ｄＣｐｆ１のアミノ酸配列の一部を改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。

【0039】

本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としては、ｄＣａｓ９が使用される。一態様において、ｄＣａｓ９はｄＳａＣａ９であり、特定の態様において、ｄＳａＣａｓ９はｄＳａＣａｓ９[－２５]である。

【0040】

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分をコードする領域をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。また、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、クローン化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に、公知の部位特異的変異誘発法を用いて、ＤＮＡ切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基、５５７番目のＨｉｓ残基、及び５８０番目のＡｓｎ残基；ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基や１００６番目のＧｌｕ残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。

【0041】

あるいはヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法との組み合わせにより取得することができ、さらに、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行った塩基配列として構築することもできる。

【0042】

（３）転写アクチベーター
本発明において、ヒトＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に融合された転写アクチベーターの作用により達成される。本明細書において、「転写アクチベーター」とは、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の転写活性化能を有するタンパク質又はその機能を保持するペプチド断片を意味する。本発明に用いられる転写アクチベーターとしては、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現を活性化し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＶＰ６４、ＶＰＨ、ＶＰＲ、ｍｉｎｉＶＲ、及びｍｉｃｒｏＶＲ、並びに転写活性化能を有するそれらの改変体等が含まれる。ＶＰ６４は、配列番号１１４で表される５０アミノ酸からなるペプチドである。ＶＰＨは、ＶＰ６４と、ｐ６５と、ＨＳＦ１との融合タンパク質であり、具体的には、配列番号１１５で表される３７６アミノ酸からなるペプチドである。ＶＰＲは、ＶＰ６４と、ｐ６５と、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスの複製転写活性化因子（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＲＴＡ））との融合タンパク質であり、例えば、配列番号１１６で表される５２３アミノ酸からなるペプチド、配列番号２１６で表される５１９アミノ酸からなるペプチド、等である。ＶＰ６４、ＶＰＨ、及びＶＰＲは公知であり、例えば、Chavez A. et al., Nat Methods. 2016 Jul;13(7):563-7やChavez A. et al., Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）に詳細に開示されている。本発明の一態様において、転写アクチベーターとしては、ＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドを用いることができる。ＲＴＡの転写活性化ドメインは公知であり、例えばJ Virol. 1992 Sep;66(9):5500-8等に開示され、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。そのようなペプチドの配列として、ｍｉｎｉＶＲとは配列番号１１７で表される１６７アミノ酸からなるペプチドであり、ｍｉｃｒｏＶＲとは配列番号１１８で表される１４０アミノ酸からなるペプチドである。配列番号１１７で表されるアミノ酸配列は、ＲＴＡの４９３～６０５位のアミノ酸残基（より短いＲＴＡの転写活性化ドメイン）とＶＰ６４とをＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（配列番号２０９）で連結したアミノ酸配列からなる。また、配列番号１１８で表されるアミノ酸配列は、ＲＴＡの５２０～６０５位のアミノ酸残基（さらにより短いＲＴＡの転写活性化ドメイン）とＶＰ６４とをＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカーで連結したアミノ酸配列からなる。ｍｉｎｉＶＲおよびｍｉｃｒｏＶＲの詳細は、ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０３０９７２に記載され、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。上述のいずれの転写アクチベーターも、その転写活性化能を維持する限り、あらゆる修飾及び／又は改変が加えられていてもよい。例えば、本発明における転写アクチベーターとしては、その転写活性化能を維持する限り、（ｉ）配列番号１１７で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｉ）配列番号１１７で表されるアミノ酸配列において1又は数個（例、２、３、４、５又はそれ以上）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｉｉ）配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に９０％以上（例、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一であるアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｖ）配列番号１１７で表されるアミノ酸配列において1又は数個（例、２、３、４、５又はそれ以上）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｖ）配列番号１１７で表されるアミノ酸配列に９０％以上（例、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一であるアミノ酸配列からなるペプチドもまた用いることができる。例えば、本発明における転写アクチベーターとしては、その転写活性化能を維持する限り、（ｉ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｉ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列において1又は数個（例、２、３、４、５又はそれ以上）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｉｉ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列に９０％以上（例、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一であるアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｖ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列において1又は数個（例、２、３、４、５又はそれ以上）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｖ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列に９０％以上（例、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一であるアミノ酸配列からなるペプチドもまた用いることができる。

【0043】

転写アクチベーターをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー法との組み合わせにより構築することができる。さらに、転写アクチベーターをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行ったＤＮＡ配列として構築することもできる。

【0044】

転写アクチベーターをコードする塩基配列に、直接又はリンカー、ＮＬＳ（核移行シグナル）、タグ、及び／若しくはその他をコードする塩基配列を付加した後に、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列をライゲーションすることで、転写アクチベーターとヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを調製することができる。本発明において、転写アクチベーターはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれに融合させてもよい。また、リンカーとしては、アミノ酸数が２から５０個程度のリンカーを用いることができ、具体的には、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）が交互に連結したＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー等が例示されるが、これらに限定されるものではない。

【0045】

（４）ガイドＲＮＡ
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質のヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域へのリクルートは、ガイドＲＮＡにより達成される。前記「（１）定義」の項に記載の通り、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、該ｃｒＲＮＡはターゲティング配列の相補配列に結合する。ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列の相補配列と完全に相補的でなくてもよく、少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたターゲティング配列の塩基配列を含んでいてもよい。

【0046】

ターゲティング配列は、例えば、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、公開されているｇＲＮＡ設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPR direct等）を用いて設定することが出来る。具体的には、目的遺伝子（即ち、ヒトＵＴＲＮ遺伝子）の配列の中から、ＰＡＭ（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、ＮＮＧＲＲＴ）が３’側に隣接している約２０ヌクレオチド長の候補ターゲティング配列をリストアップし、これらの候補ターゲティング配列の中から、ヒトのゲノム中のオフターゲットサイト数が少ないものをターゲティング配列として使用することができる。ターゲティング配列の塩基長は、１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長である。オフターゲットサイト数の予測をする一次スクリーニングとして、多数のバイオインフォマティクスツールが公知且つ公衆に利用可能であり、最もオフターゲット効果が小さいターゲティング配列を予測するために使用することができる。Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ（https://benchling.com）やＣＯＳＭＩＤ（CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions）（インターネット上のhttps://crispr.bme.gatech.eduで利用可能）等のバイオインフォマティクスツールが例示され、これらによりｇＲＮＡが標的とする塩基配列に対する類似性をまとめることができる。使用するｇＲＮＡ設計ソフトウェアに対象ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補ターゲティング配列の３’側の８～１２ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いシード（ｓｅｅｄ）配列）について、対象のゲノムに対してＢｌａｓｔ検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。

【0047】

本発明の一態様において、ヒト染色体６番（Ｃｈｒ６）のＧＲＣｈ３８．ｐ１２ポジションに存在する領域中、以下の５つの領域が、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域となり得る。これらの領域はヒストンの修飾パターンにより発現制御領域であることが強く示唆される領域である。よって、本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト染色体６番（Ｃｈｒ６）のＧＲＣｈ３８．ｐ１２ポジションに存在する領域中、以下の５つの領域の少なくとも１つの領域にある１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長の塩基配列とすることができる：
（１）１４４，２１５，５００－１４４，２１７，０００、
（２）１４４，２４８，５００－１４４，２４９，８００、
（３）１４４，２６４，０００－１４４，２６７，０００、
（４）１４４，２８３，９００－１４４，２８８，３００、
（５）１４４，２９２，５００－１４４，２９５，５００。

【0048】

本発明の一態様において、ターゲティング配列は、上記（３）の領域に存在する配列番号１０４で表される領域又は上記（４）の領域に存在する配列番号１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、若しくは１７２で表される領域中の、連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長とすることができる。

【0049】

本発明の別の態様において、ターゲティング配列は、配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、又は１７２で表される塩基配列とすることができる。配列番号４５及び４６で表される塩基配列は、前記配列番号１０４で表される領域中に含まれるターゲティング配列であり、配列番号５８、５９、６０、１５５、１５６、１５７、及び１５９で表される塩基配列は、前記配列番号１０５で表される領域中に含まれるターゲティング配列である。

【0050】

本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列は、ターゲティング配列と同じ塩基配列であり得る。例えば、配列番号４で表されるターゲティング配列（ＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＣ）をｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として細胞に導入した場合、係る配列から転写されるｃｒＲＮＡはＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＣ（配列番号１１９）となり、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域中に存在する、配列番号４で表される塩基配列の相補配列であるＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴ（配列番号１２０）に結合する。別の態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ターゲティング配列に対して少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を使用することができる。よって、本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、若しくは１７２で表される塩基配列、又は配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、若しくは１７２で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を使用し得る。

【0051】

本発明の一態様において、配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、又は１７２で表される塩基配列をｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として用い、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６又は２０７で表されるｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをそれぞれ製造することができる。本発明の別の態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列、又は配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含み得る。

【0052】

ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣｐｆ１を用いる場合、５’末端に特定のＲＮＡを付したｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として設計することができる。このようなｃｒＲＮＡの５’末端に付するＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣｐｆ１に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＦｎＣｐｆ１を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列としては、ターゲティング配列の５’側に配列番号１２１；ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴを付した塩基配列を用いることができる（ＲＮＡに転写されると、下線部の配列同士が塩基対を形成しステム－ループ構造をとる）。このような５’末端に付する配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣｐｆ１タンパク質に対して一般的に使用される配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。

【0053】

また、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端に既知のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列として設計することが出来る。このようなｔｒａｃｒＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣａｓ９に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＳａＣａｓ９を用いる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として、配列番号１２２で表される塩基配列が使用される。ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣａｓ９タンパク質に対して一般的に使用されるｔｒａｃｒＲＮＡをコードする塩基配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。

【0054】

このように設計されたｇＲＮＡをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成方法を用いて、化学的に合成することができる。

【0055】

本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる、ｇＲＮＡをコードする塩基配列を含んでもよい。例えば、該ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含み得る（ここで、少なくとも２つの異なる塩基配列は、配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７、又は１７２で表される配列を含む塩基配列から選択される）。本発明の一態様において、該ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含み得る（ここで、少なくとも２つの異なる塩基配列は、配列番号４５、４６、又は５９で表される配列を含む塩基配列から選択される）。

【0056】

（５）プロモーター配列
本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列及び／又はｇＲＮＡをコードする塩基配列のそれぞれの上流部分に、プロモーター配列が作動可能に連結されていてもよい。連結され得るプロモーターとしては、対象の細胞内においてプロモーター活性を有するものであれば特に限定されない。例えば、該融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ＥＦＳプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、ＭＬＣプロモーター、Ｄｅｓプロモーター、ｃＴｎＣプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。ｇＲＮＡをコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーターである、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、Ｈ１プロモーター、及びｔＲＮＡプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、ポリヌクレオチドが、ガイドＲＮＡをコードする２又はそれ以上の塩基配列を含む場合、１つのプロモーターが、２又はそれ以上の塩基配列の上流に作動可能に連結されていてもよい。別の態様においては、プロモーター配列が２又はそれ以上の塩基配列の各々の上流に作動可能に連結されていてもよく、ここで各塩基配列に作動可能に連結されたプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。

【0057】

本発明の一態様において、前記融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、筋肉特異的なプロモーターを使用することができる。かかる筋肉特異的なプロモーターとしては、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、心筋トロポニンＣプロモーター、αアクチンプロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ(ＭＨＣＫ)プロモーター、ミオシン軽鎖２Ａプロモーター、ジストロフィンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３４８ＭＣＫプロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、Ｍｙｆ５プロモーター、ＭＬＣ１／３ｆプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、Ｍｙｏｇプロモーター、Ｐａｘ７プロモーター、Ｄｅｓプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない（筋肉特異的プロモーターの詳細は、例えばＵＳ２０１１／０２１２５２９Ａ、McCarthy JJ et al., Skeletal Muscle.2012 May;2(1):8、およびWang B.et al., Gene Ther.2008 Nov;15(22):1489-99等を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。

【0058】

本発明の一態様において、ｇＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列としてＵ６プロモーターを用いることができ、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列としてＣＫ８プロモーターを用いることができる。具体的には、Ｕ６プロモーターについては、以下の塩基配列を用いることができる；（ｉ）配列番号１２８で表される塩基配列、（ｉｉ）配列番号１２８で表される塩基配列において１又は数個（例、２、３、４、５又はそれ以上）の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された、標的となる細胞中でのプロモーター活性を有する塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１２８で表される塩基配列に９０％以上（例、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、標的となる細胞中でのプロモーター活性を示す塩基配列。ＣＫ８プロモーターについては、以下の塩基配列を用いることができる；（ｉ）配列番号１９１で表される塩基配列、（ｉｉ）配列番号１９１で表される塩基配列において１又は数個（例、２、３、４、５又はそれ以上）の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された、標的となる細胞中でのプロモーター活性を有する塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１９１で表される塩基配列に９０％以上（例、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）同一である、標的となる細胞中でのプロモーター活性を示す塩基配列。

【0059】

（６）その他の塩基配列
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、上記以外にも、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列が転写されて生じるｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる目的で、ポリアデニル化（ポリＡ（ｐｏｌｙＡ））シグナル、コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列等の公知の配列をさらに含んでもよい。例えば、本発明においてポリアデニル化シグナルとしては、ｈＧＨ ｐｏｌｙＡ、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ、２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ（ＵＳ７５５７１９７Ｂ２を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等を挙げることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードする塩基配列、ＮＬＳをコードする塩基配列、及び／又はタグをコードする塩基配列を含んでもよい。

【0060】

（７）本発明の例示的な態様
本発明の一態様では以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列、
１又は２の、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列、又は配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９又はｄＳａＣａｓ９［－２５］であり、
ここで、転写アクチベーターは、ＶＰ６４、ＶＰＨ、ＶＰＲ、ｍｉｎｉＶＲ、及びｍｉｃｒｏＶＲからなる群より選択され、及び
ここで、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列は、ＥＦ－１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター、及びＣＫ８プロモーターからなる群より選択される。
該ポリヌクレオチドは、さらにｈＧＨ ｐｏｌｙＡ、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ、又は２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡを含んでもよい。

【0061】

本発明の一態様では以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＫ８プロモーター、
１又は２の、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列、又は配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９又はｄＳａＣａｓ９［－２５］であり、及び
ここで、転写アクチベーターは、ｍｉｎｉＶＲ又はｍｉｃｒｏＶＲである。
該ポリヌクレオチドは、さらにｂＧＨ ｐｏｌｙＡ又は２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡを含んでもよい。

【0062】

本発明の一態様では以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＫ８プロモーター、
１又は２の、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列、又は配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、及び
ここで、転写アクチベーターは、ｍｉｎｉＶＲである。
該ポリヌクレオチドは、さらにｂＧＨ ｐｏｌｙＡ又は２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡを含んでもよい。

【0063】

本発明の一態様では以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＫ８プロモーター、
１又は２の、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列、又は配列番号４５、４６、若しくは５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、及び
ここで、転写アクチベーターは、ｍｉｃｒｏＶＲである。
該ポリヌクレオチドは、さらにｂＧＨ ｐｏｌｙＡ又は２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡを含んでもよい。

【0064】

本発明の一態様では以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＫ８プロモーター、
配列番号５９で表される塩基配列、又は配列番号５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含むガイドＲＮＡをコードする塩基配列、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、及び
ここで、転写アクチベーターは、ｍｉｎｉＶＲである。
該ポリヌクレオチドは、さらに２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡを含んでもよい。

【0065】

本発明の一態様では以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＫ８プロモーター、
配列番号５９で表される塩基配列、又は配列番号５９で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含むガイドＲＮＡをコードする塩基配列、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、及び
ここで、転写アクチベーターは、ｍｉｃｒｏＶＲである。
該ポリヌクレオチドは、さらに２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡを含んでもよい。

【0066】

本発明のポリヌクレオチドの一態様では、ポリヌクレオチドは、５’末端から順に、（ｉ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び（ｉｉ）ｇＲＮＡをコードする塩基配列を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは、５’末端から順に、（ｉｉ）ｇＲＮＡをコードする塩基配列、及び（ｉ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターの融合タンパク質をコードする塩基配列を含む。

【0067】

２．ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下、「本発明のベクター」と称することがある）を提供する。本発明のベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。

【0068】

本発明のベクターがプラスミドベクターである場合、使用されるプラスミドベクターとしては、特に限定されず、クローニングプラスミドベクターや発現プラスミドベクター等のあらゆるプラスミドベクターであってよい。当該プラスミドベクターは、公知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドをプラスミドベクターに挿入することにより調製される。

【0069】

また、本発明のベクターがウイルスベクターである場合、使用されるウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない。尚、本明細書において「ウイルスベクター（virus vector）」又は「ウイルスベクター（viral vector）」には、その派生物も含まれる。遺伝子治療における利用を考慮すれば、導入遺伝子を長期にわたり発現させられる点や非病原性ウイルス由来で安全性が高い等の理由から、ＡＡＶベクターが好適に用いられる。

【0070】

本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、公知の方法により調製することができる。簡潔には、本発明のポリヌクレオチドを挿入したウイルス発現用プラスミドベクターを調製し、これを適切な宿主細胞にトランスフェクトし、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを一過性に産生させ、該ウイルスベクターを回収する。

【0071】

本発明の一態様において、ＡＡＶベクターを用いる場合、ＡＡＶベクターの血清型としては、対象においてヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現を活性化できる限り特に限定されず、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ．１０等のいずれを用いてもよい（ＡＡＶの多様な血清型に関してはＷＯ２００５／０３３３２１及びＥＰ２３４１０６８（Ａ１）を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。尚、ＡＡＶの派生物としては、例えば、キャプシド改変した新規血清型（例えば、ＷＯ２０１２／０５７３６３、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等が挙げられるが、これに限定されない。例えば、本発明の一態様では、AAV₅₈₇MTP, AAV₅₈₈MTP, AAV-B1, AAVM41, AAVS1_P1,及びAAVS10_P1等、筋肉細胞への感染性が向上しているキャプシド改変された新規血清型を用いることができる（Yu et al., Gene Ther. 2009 Aug;16(8):953-62, Choudhury et al., Mol Ther. 2016 Aug;24(7):1247-57, Yang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 10;106(10):3946-51及びＷＯ２０１９／２０７１３２を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる)。

【0072】

ＡＡＶベクターを調製する場合、（１）プラスミドを用いる方法、（２）バキュロウイルスを用いる方法、（３）単純ヘルペスウイルスを用いる方法、（４）アデノウイルスを用いる方法、（５）酵母を用いる方法など、公知の方法を用いることができる（例えば、Appl Microbiol Biotechnol. 2018; 102(3): 1045-1054等、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、プラスミドを用いてＡＡＶベクターを調製する場合、まず、野生型のＡＡＶのゲノム配列のうち両端の末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ(ＩＴＲ)）と、Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡの代わりに挿入された、本発明のポリヌクレオチドとを含むベクタープラスミドを作製する。一方で、ウイルス粒子の形成に必要とされるＲｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡは、別のプラスミドに挿入する。さらに、ＡＡＶの増殖に必要なアデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ、及びＥ４ｏｒｆ６）を含むプラスミドを、アデノウイルスヘルパープラスミドとして作製する。これら３種のプラスミドを、宿主細胞にコトランスフェクションすることにより、該細胞内において組換えＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生されるようになる。宿主細胞としては、前記ヘルパー作用を担う遺伝子の遺伝子産物（タンパク質）のうちの一部を供給し得る細胞（例えば、２９３細胞等）を用いることが好ましく、そのような細胞を用いる場合には、該宿主細胞より供給され得るタンパク質をコードする遺伝子を、前記アデノウイルスヘルパープラスミドに搭載する必要がない。産生されたＡＡＶベクターは核内に存在するため、宿主細胞を凍結融解して細胞を破壊することでウイルスを回収し、塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法やカラム法等により、ウイルス画分の分離及び精製を行うことにより、所望のＡＡＶベクターが調製される。

【0073】

ＡＡＶベクターは、安全性や遺伝子導入効率等の点から大きな利点があり、遺伝子治療に利用されている。しかしながら、ＡＡＶベクターに搭載可能なポリヌクレオチドのサイズに制限があることが知られている。例えば、本発明の一態様である、ｄＳａＣａｓ９とｍｉｎｉＶＲまたはｍｉｃｒｏＶＲとの融合タンパク質をコードする塩基配列、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域を標的とするｇＲＮＡをコードする塩基配列、並びにプロモーター配列としてＥＦＳプロモーター配列又はＣＫ８プロモーター及びＵ６プロモーター配列を含むポリヌクレオチドの塩基長と、ＩＴＲ部とを含む全長は、約４.８５ｋｂであるので、単一のＡＡＶベクターに搭載することが出来る。

【0074】

３．医薬組成物
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む、医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称することがある）を提供する。本発明の医薬組成物は、ＤＭＤやＢＭＤの治療や予防に用いることができる。

【0075】

本発明の医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを有効成分として含み、かかる有効成分（即ち、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクター）と、通常、医薬的に許容される担体を含む製剤として調製され得る。

【0076】

本発明の医薬組成物は、非経口に投与され、また局所的又は全身的に投与され得る。本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与することができる。

【0077】

本発明の医薬組成物の対象への投与量は、治療及び／又は予防有効量である限り特に限定されない。有効成分、剤形、対象の年齢及び体重、投与スケジュール、並びに投与方法等に応じて適宜最適化すればよい。

【0078】

本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、ＤＭＤ又はＢＭＤに罹患している対象だけでなく、遺伝的バックグラウンド解析等に基づき、将来的にＤＭＤ又はＢＭＤを発症する可能性のある対象に対して予防的に投与することもできる。また、本明細書における「治療」との用語には、疾患の治癒に加えて、疾患の寛解も含まれ得る。また、「予防」との用語には、疾患の発症を防ぐことに加えて、疾患の発症を遅らせることも含まれ得る。また、本発明の医薬組成物は、「本発明の剤」等とも言い換えることができる。

【0079】

４．ＤＭＤ又はＢＭＤの治療又は予防方法
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＤＭＤ又はＢＭＤの治療又は予防方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。また、本発明には、ＤＭＤ又はＢＭＤの治療又は予防に使用するための、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターが含まれる。さらに、本発明には、ＤＭＤ又はＢＭＤの治療又は予防用医薬組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターの使用が含まれる。

【0080】

本発明の方法は、上述した本発明の医薬組成物をＤＭＤ又はＢＭＤを罹患する対象に投与することにより実施することができ、その投与量、投与経路、対象等は上記したものと同一である。

【0081】

症状の測定は本発明の方法を用いた治療の開始前に行ってよく、また、治療に対する対象の応答を判定するための治療後の任意のタイミングでおこなってよい。

【0082】

本発明の方法により、対象の骨格筋及び／又は心筋の機能が改善され得る。機能が改善される筋肉としては、特に限定はなく、あらゆる筋肉又は筋肉群が例示される。

【0083】

５．リボヌクレオプロテイン
本発明は、以下を含む、リボヌクレオプロテイン（以下、「本発明のＲＮＰ」と称することがある。）を提供する：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ。

【0084】

本発明のＲＮＰに含まれるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、およびガイドＲＮＡとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」の項目において詳細に説明される、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、およびガイドＲＮＡを使用することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞や細菌、その他の生物体に導入して発現させることにより、あるいは該ポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムにより作製することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、例えば、化学的に合成するか、あるいはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムを用いて作製することができる。このようにして作製された融合タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合することで、本発明のＲＮＰを調製することができる。必要に応じて、金粒子などの他の物質を混合してもよい。本発明のＲＮＰを標的細胞や組織等に直接送達するために、公知の方法により、該ＲＮＰは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化してもよい。本発明のＲＮＰは、公知の方法により、標的細胞や組織等に導入することができる。ＬＮＰへのカプセル化や導入方法については、例えばLee K., et al., Nat Biomed Eng. 2017; 1:889-901, ＷＯ ２０１６／１５３０１２（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等を参酌することができる。

【0085】

本発明の一態様において、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、ヒト染色体６番（Ｃｈｒ６）のＧＲＣｈ３８．ｐ１２ポジションに存在する領域中、以下の５つの領域の少なくとも１つの領域にある連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長を標的とする：
（１）１４４，２１５，５００－１４４，２１７，０００、
（２）１４４，２４８，５００－１４４，２４９，８００、
（３）１４４，２６４，０００－１４４，２６７，０００、
（４）１４４，２８３，９００－１４４，２８８，３００、
（５）１４４，２９２，５００－１４４，２９５，５００。

【0086】

１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表されるＤＮＡ配列中の連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長の塩基配列を標的とする。１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号４５、４６、５８、５９、６０、１３５、１４１、１５３、１５５、１５６、１５７、１５９、１６７又は１７２で表される配列の全部又は一部を含む領域を標的とする。本発明の一態様において、配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される、又は配列番号１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６若しくは２０７で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、ｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡを用いることができる。

【0087】

６．その他
本発明はまた、以下を含む、ヒトユートロフィン遺伝子の発現を活性化するための組成物又はキットを提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。

【0088】

本発明はまた、以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防方法を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。

【0089】

本発明はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下（ｅ）及び（ｆ）の使用を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトユートロフィン遺伝子の発現制御領域における、配列番号１０４、１０５、１３５、１４１、１５３、１６７、又は１７２で表される領域中の連続する１８～２４ヌクレオチド長の領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。

【0090】

これらの発明で使用されるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、ガイドＲＮＡ、並びにこれらをコードするポリヌクレオチド及びそれらが搭載されるベクターとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」、「２．ベクター」や「５．リボヌクレオプロテイン」の項目において詳細に説明されるものが使用できる。上記（ｅ）及び（ｆ）の投与量、投与経路、対象、製剤等は「３．ＤＭＤ又はＢＭＤの治療又は予防剤」の項目において説明したものと同様である。
本発明の他の特徴は、本発明の説明のために与えられた以下の例示的な態様の記載によって明らかになるであろうが、それらに限定されることを意図するものではない。

【実施例】

【0091】

本実施例では、ヒトＵＴＲＮ遺伝子発現の選択的な活性化をもたらすヒトＵＴＲＮ遺伝子の定められた発現制御領域における、遺伝子発現を増強するための転写アクチベーターとｄＣａｓ９の融合タンパク質の使用について述べる。遺伝子発現の修飾の目的は、欠陥のあるジストロフィン遺伝子産物の機能を補完する野生型のヒトＵＴＲＮ遺伝子産物の発現を増強することである。また、本実施例では、他の遺伝子の発現への影響を最小限に抑えた、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の選択的な活性化を付与する特定のゲノム領域の決定について述べる。ヒトＵＴＲＮ遺伝子の発現を増強する本発明の方法は、本明細書に記載および例示されているように、欠陥のあるジストロフィンに起因する欠陥のある筋機能を改善するための新規の治療または予防戦略を表している。

【0092】

実施例１ ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を用いたヒトユートロフィン遺伝子に対するｇＲＮＡのスクリーニング
本実施例では、ＵＴＲＮ遺伝子の定められた発現制御領域を標的にしてＵＴＲＮ遺伝子の活性化を達成するために、本明細書に記載された方法を使用することを説明している。この方法では、適切なｓｇＲＮＡ配列を設計することで、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの複合体がゲノムの所望の遺伝子座にリクルートされるという特性を利用する。また、本方法は、Gilbert LA et al, Cell 2013 Jul; 154(2):442-51、およびGilbert LA et al., Cell 2014 Oct; 159(3):647-61（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）に記載されるように、ＳａＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ欠損型（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体（配列番号１０７）、またはＤ１０ＡおよびＨ５５７Ａ変異体（配列番号１０８）；ｄＳａＣａｓ９）を活用して、ゲノム配列をそのまま残すが、様々な転写／エピジェネティック機能ドメインまたはモチーフをｄＳａＣａｓ９につないで（tether）、ｓｇＲＮＡ配列が標的とする意図した遺伝子座の所望の修飾を達成する。

【0093】

本実施例では、本明細書に記載の方法を使用して、野生型ＵＴＲＮの発現を活性化できることを説明する。選択的かつ効果的な遺伝子活性化を与えるＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域を標的としてｓｇＲＮＡを設計した。図１に、ヒトのＵＴＲＮ遺伝子座と、予測される２つの転写開始点（ＴＳＳ）を示す（上段と中段）。ＵＴＲＮ遺伝子のＴＳＳは、FANTOM5 human promoteromeデータベースを照会して同定した（www.fantom.gsc.riken.jp, Nature 2014 Mar; 507(7493):462-70、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。ＵＴＲＮ遺伝子には２つのプロモーター領域が報告されており（プロモーターＡ及びＢ）、我々は活性化について両方のプロモーターを検証した。これらの領域内で効果的かつ選択的な治療配列を決定するため、ガイドＲＮＡ配列は上記の領域をカバーするように設計した。

【0094】

（１）実験方法
ｓｇＲＮＡ配列の選択
ＵＴＲＮ遺伝子のプロモーター領域周辺の配列（プロモーターＡ（Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；１４４，２８３，９００－１４４，２８８，３００）の約４．４ｋｂ、プロモーターＢ（Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；１４４，３４２，６８３－１４４，３４５，３１１）の約２．６ｋｂ）をスキャンし、ｄＳａＣａｓ９とｓｇＲＮＡの複合体が結合する認識配列の候補を探した。配列ＮＮＧＲＲＴを持つプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について該領域をスキャンした。ＰＡＭに隣接するターゲティング配列が同定された。ターゲティング配列（標的ＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡの部分）の長さは２１ヌクレオチドとした。ターゲティング配列は、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇソフトウェア（https://benchling.com）で生成された予測される特異性と効率性に基づいて選択し、選択された領域に均等に分布するようにした。ＥＮＣＯＤＥ研究によるＵＴＲＮ発現制御領域周辺のエピジェネティック情報（The ENCODE Project Consortium, Nature. 2012 Sep; 489: 57-74、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）をもまた参考にして、遺伝子の機能的要素に結合する可能性の高いｇＲＮＡを選択した。

【0095】

表１に記載の２４のターゲティング配列（ガイド＃ｓｇＥＤ３－１～ｓｇＥＤ３－２４（配列番号１２９～１５２））について、ＵＴＲＮ遺伝子発現のモジュレーション機能を検証した（以下、表１に記載のターゲティング配列を「ｓｇＥＤ３シリーズ」と称することがある）。

【0096】

ＵＴＲＮ遺伝子におけるターゲティング配列の位置も図１に示した（上段と中段）。

【0097】

選択した２４個のターゲティング配列とコントロールのノンターゲティング配列（配列番号１７７）を、それぞれｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１２２）をコードするＤＮＡ配列と融合させてｓｇＲＮＡ配列を形成し、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ社のｐＣＲＩＳＰＲ－ＬｖＳＧ０３ベクター（＃ｐＣＲＩＳＰＲ－ＬｖＳＧ０３）にクローニングした。得られたベクターは、本明細書ではｐＣＲＩＳＰＲ－ＬｖＳＧ０３ ｓｇＲＮＡ発現ベクターと表記する。ｓｇＲＮＡの発現はＵ６プロモーターで駆動し、また該ベクターはＳＶ４０プロモーター下でｍＣｈｅｒｒｙ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ遺伝子を発現させ、ｓｇＲＮＡ発現細胞の追跡と選択を容易にした。

【0098】

エフェクター分子のクローニング
ヌクレアーゼ欠損ＳａＣａｓ９タンパク質（Ｄ１０ＡとＮ５８０Ａ、またはＤ１０ＡとＨ５５７Ａ、ｄＳａＣａｓ９）は、直接融合タンパク質の形をとり、機能的ドメイン／モチーフを結びつけるための主要な足場として機能する。ｄＳａＣａｓ９には、エフェクター分子の核への効率的な局在化を可能にするために、Ｎ末端（配列番号１７８に示すアミノ酸配列、配列番号１７９に示すＤＮＡ配列）とＣ末端（配列番号１８０に示すアミノ酸配列、配列番号１８１に示すＤＮＡ配列）に２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を付加した。

【0099】

一例において、Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異を有するｄＳａＣａｓ９をコードするＤＮＡ配列を、合成アミノ酸の転写活性化部分であるＶＰ６４、ＶＰＨまたはＶＰＲをコードするＤＮＡ配列とそのＣ末端で融合させた（配列番号１８２，１８３又は１８４）（Chavez A et al., Nat Methods. 2016 Jul; 13(7):563-67 and Chavez A et al., Nat Methods. 2015 Apr; 12(4):326-8を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。得られた融合タンパク質は、本明細書ではそれぞれｄＳａＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＨ、又はｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ融合タンパク質と称する。

【0100】

この融合タンパク質は、ＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域にリクルートされることで、転写活性化作用を発揮する。その結果、ＵＴＲＮ遺伝子の発現が増強される。

【0101】

一例において、アミノ酸７２１－７４５を欠くｄＳａＣａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ｄＳａＣａｓ９［－２５］、（配列番号２１４））を、合成アミノ酸転写アクチベーター、ｍｉｎｉＶＲ（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０３０９７２を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）をコードするＤＮＡ配列と、そのＣ末端に融合させた（配列番号１８５）。得られた融合タンパク質は、本明細書ではｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ融合タンパク質（配列番号１８６）と称する。

【0102】

ｄＳａＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＨ、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ、及びｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲの融合タンパク質を発現させるために、融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ社のＣＰ－ＬｖＣ９ＮＵ－０９レンチウイルス発現ベクター（Ｃａｔ．＃ ＣＰ－ＬｖＣ９ＮＵ－０９）にクローニングした。オリジナルベクターのＣａｓ９コーディング配列を、融合タンパク質のコーディング配列に置き換えて、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＨ、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ、又はｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲの４つの融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ断片を含むＣＰ－ＬｖＣ９ＮＵ－０９レンチウイルス発現ベクターを調製した。本明細書では、得られたベクターは，それぞれＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９－ＶＰ６４－０９、ＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９－ＶＰＨ－０９、ＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ－０９、又はＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－０９プラスミドと表記する。該ベクターは、エフェクター分子の発現の為にＥＦ１αプロモーターを、ｅＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏｍｙｃｉｎ遺伝子の発現の為にＳＶ４０プロモーターを使用する。

【0103】

アデノ随伴ウイルスベクターでの発現の為に、ｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片、Ｕ６プロモーター、及びｓｇＲＮＡをタカラから入手したｐＡＡＶ－ＣＭＶベクター（＃６２３４）にクローニングした。ＣＭＶプロモーターをＥＦＳプロモーター（配列番号１８７）に置き換えた。元のベクターからβグロビンイントロンを取り除き、ｈＧＨポリＡをウシＧＨポリＡ（ｂＧＨポリＡ）に置き換えた。得られたベクターは、その５’端から３’端の順に、ＩＴＲ、ＥＦＳプロモーター、ｄＣａｓ９、ｍｉｎｉＶＲ、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡ、及びＩＴＲから構成されており（図５）、本明細書ではｐＡＡＶ－ＥＦＳ－ｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ ＡＩＯプラスミドと表記する。

【0104】

細胞培養とトランスフェクション
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Thermo Fisher # R70007）は、トランスフェクションの２４時間前に２４ウェルプレート（CORNING # 351147）に１ウェルあたり７５，０００細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher # 11140050）で培養した。レンチウイルス発現ベクターでの発現には、製造元の指示に従い、１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Life technologies # 11668019）を用いて、５００ｎｇのＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９－ＶＰ６４－０９、ＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９－ＶＰＨ－０９、ＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ－０９、又はＣＰ－ＬｖｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－０９プラスミド、及び５００ｎｇのｐＣＲＩＳＰＲ－ＬｖＳＧ０３ ｓｇＲＮＡ発現ベクターを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクトされた細胞を、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で選択した。アデノ随伴ウイルスベクターでの発現には、製造元の指示に従い、１．５μｌのLipofectamine 2000（Life technologies # 11668019）を用いて、５００ｎｇのｐＡＡＶ－ＥＦＳ－ｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ ＡＩＯプラスミドを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクトした細胞はピューロマイシンで選択しなかった。

【0105】

遺伝子発現解析のために、トランスフェクトした細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で培養し、トランスフェクション後７２時間で回収し、ＲＬＴバッファー（Qiagen # 74104）で溶解し、ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen # 74104）を用いて全ＲＮＡを抽出した。

【0106】

遺伝子発現解析
Ｔａｑｍａｎ解析には、１．５μｇの全ＲＮＡを用い、２０μｌの容量でTaqMan^TM High-Capacity RNA-to-cDNA Kit（Applied Biosystems # 4387406）を用いてｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡを水で２０倍に希釈し、Ｔａｑｍａｎ反応１回につき６．３３μｌを使用した。ＵＴＲＮ遺伝子とＨＰＲＴ遺伝子のＴａｑｍａｎプライマーとプローブはApplied Biosystems社から入手した。Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現マスターミックス（Thermo Fisher # 4369016）を用いてＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０でＴａｑｍａｎ反応を行い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６解析ソフトウェアを用いて解析した。ＵＴＲＮ遺伝子の発現レベルは、ＨＰＲＴ遺伝子の発現レベルで正規化した。

【0107】

Ｔａｑｍａｎプローブ製品ＩＤ：
ＵＴＲＮ：Ｈｓ０１１２５９９４＿ｍ１（ＦＡＭ）
ＨＰＲＴ：Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１（ＦＡＭ， ＶＩＣ）
Ｔａｑｍａｎ ＱＰＣＲ 条件：
ステップ１；９５℃ １０分間
ステップ２；９５℃ １５秒間
ステップ３；６０℃ ３０秒間
ステップ２及び３の繰り返し；４０回

【0108】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）製造
アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）粒子は、１５０ｍｍディッシュ（Corning）に１ディッシュあたり９，０００，０００細胞の密度で播種したＡＡＶｐｒｏ ２９３Ｔ細胞（Takara # 632273）を用い、１０％ＦＢＳ、２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher # 11140050）で培養して調製した。１４．８５μｇのｐＲＣ２－ｍｉ３４２および１４．８５μｇのｐＨｅｌｐｅｒベクター（Takara # 6234）と１４．８５μｇのｐＡＡＶ－ＥＦＳ－ｄｓａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ ＡＩＯプラスミドを、８１μｌのTransIT-VirusGen（Mirus Bio # MIR6703）を用いて細胞にトランスフェクションした。７２時間後、細胞を回収し、ＡＡＶ２ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍプロトコール（Takara # 6230）の製造元の指示に従って、１５０ｍｍディッシュあたり５５０μｌで粗ＡＡＶ２を抽出した。

【0109】

ＡＡＶ２の細胞へのトランスダクション
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Thermo Fisher # R70007）に形質導入するために、２４ウェルプレート（CORNING # 351147）に１ウェルあたり７５，０００個の細胞を播種し、１０％ ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher # 11140050）で１６時間培養した。培地を、粗ＡＡＶ２を１０または１μｌ（それぞれ１：１００または１：１０００希釈）含む１０００μｌの新鮮な培地と交換した。続いて７２時間培養した後、細胞を溶解し、製造元の指示に従って全ＲＮＡを抽出し（RNeasy Plus 96 kit）（Qiagen # 74192）、「遺伝子発現解析」に記載されているようにして、Ｔａｑｍａｎによりユートロフィンの過剰発現を測定した。

【0110】

表１ ＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域のスクリーニングに使用したターゲティング配列

【0111】

【表1-1】

【0112】

【表1-2】

【0113】

【表1-3】

【0114】

表１において、「位置」は、ＳａＣａｓ９を使用した場合の、ターゲティング配列が存在する鎖のヌクレオチドの切断位置を示す。

【0115】

表１の「鎖」の項目では、１がセンス鎖、－１がアンチセンス鎖を示している。

【0116】

（２）結果
図１は、３種類の異なるｄＳａＣａｓ９－アクチベーター融合タンパク質（ｄＳａＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＨ、及びｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ）によるＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化を、コントロールｓｇＲＮＡと比較して示したものである。コントロールｓｇＲＮＡは、ＡＣＧＧＡＧＧＣＵＡＡＧＣＧＵＣＧＣＡＡＧ（配列番号２１５）とｔｒａｃｒＲＮＡの配列を含み、ヒトゲノム上のどの配列にもターゲットを持たないように設計されている。ガイド＃ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－７、又はｓｇＥＤ３－１３（配列番号１３４、１３５又は１４１）でコードされる、ｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、それぞれ、ｄＳａＣａｓ９－アクチベーター融合タンパク質をＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域にリクルートすることでＵＴＲＮ遺伝子の発現を活性化した。活性化効果は、ｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲ融合タンパク質で最も強かった。

【0117】

以上の結果から、Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；１４４，２８５，０００－１４４，２８６，０００（図１）に対応するガイド＃ｓｇＥＤ３－６～ｓｇＥＤ３－７（配列番号１３４～１３５）（表１）がカバーする約１．０ｋｂの領域（領域Ａ）と、Ｃｈｒ６： ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；１４４，２８７，０００－１４４，２８７，３００に対応するガイド＃ｓｇＥＤ３－１３（配列番号１４１）周辺の約０．３ｋｂの領域（領域Ｂ）は、ＵＴＲＮ遺伝子の発現を効率的に活性化させる。プロモーターＢは、ガイド＃ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－７、及びｓｇＥＤ３－１３（配列番号１３４、１３５、及び１４１）でコードされるｃｒＲＮＡと比較して、比較的弱くＵＴＲＮ遺伝子を活性化させる。

【0118】

図２では、ＵＴＲＮ遺伝子をより強力に活性化させる為に、Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；１４４，２８４，７５０－１４４，２８７，３００に相当する領域Ａ＋Ｂにまたがる領域を、さらに２４種類のｓｇＲＮＡ（表１、ガイド＃ｓｇＥＤ３－２５～ｓｇＥＤ３－４８（配列番号１５３～１７６））とｄＳａＣａｓ９－ＶＰＲを用いてスクリーニングした。ガイド＃ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－１３、ｓｇＥＤ３－２５～ｓｇＥＤ３－３２、ｓｇＥＤ３－３９、ｓｇＥＤ３－４０、及びｓｇＥＤ３－４４（配列番号１３４、１４１、１５３～１６０、１６７、１６８、及び１７２）にそれぞれコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、前述のコントロールｓｇＲＮＡと比較して、ＵＴＲＮ遺伝子の発現を２倍以上活性化した。

【0119】

図３では、ガイド＃ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－１３、ｓｇＥＤ３－２５、ｓｇＥＤ３－２７、ｓｇＥＤ３－３０、ｓｇＥＤ３－３１、ｓｇＥＤ３－３９、ｓｇＥＤ３－４０、及びｓｇＥＤ３－４４（配列番号１３４、１４１、１５３、１５５、１５８、１５９、１６７、１６８、及び１７２）でコードされるｃｒＲＮＡを含む強力なｓｇＲＮＡの一部に関して、それぞれ、ｐＡＡＶ－ＥＦＳ－ｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ ＡＩＯプラスミドを調製し、機能検証のためにＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にそれぞれトランスフェクションした。ＵＴＲＮ遺伝子の誘導は、前述のコントロールｓｇＲＮＡと比較して、種々のｓｇＲＮＡで種々の程度で観察された。

【0120】

図４では、ＥＦＳ－ｄＳａＣａｓ９［－２５］－ｍｉｎｉＶＲ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡを搭載したＡＡＶ２を作製し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスダクションした。ｓｇＲＮＡとしては、それぞれガイド＃ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－３０、又はｓｇＥＤ３－３１（配列番号１３４、１５８、又は１５９）にコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを用いた。３つのｓｇＲＮＡのいずれについても、前述のコントロールｓｇＲＮＡと比較してＵＴＲＮ遺伝子の誘導が認められた。

【0121】

実施例２ ＨＳＭＭ細胞を用いたヒトユートロフィン遺伝子に対するｇＲＮＡのスクリーニング
（１）実験方法
ＵＴＲＮターゲティング配列の選択
ヒト骨格筋細胞におけるゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃパターンに基づき、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の推定エンハンサー（Ｅと表記）およびプロモーター（Ｐと表記）領域周辺の約１３．２ｋｂの配列をスキャンし、本明細書でターゲティング配列として定義されているｇＲＮＡと複合化したヌクレアーゼ欠損ＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９［配列番号１２３（タンパク質）］）によって標的化される配列を探した。ＵＴＲＮ遺伝子に対する標的ゲノム領域の位置を図６に示し、その座標を以下に示す：
１．Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；１４４２１５５００－１４４２１７０００－＞約１．５ｋｂ（Ｐ２と表記）
２．Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；１４４２４８５００－１４４２４９８００－＞約１．３ｋｂ（Ｅ１と表記）
３．Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；１４４２６４０００－１４４２６７０００－＞約３．０ｋｂ（Ｅ２と表記）
４．Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；１４４２８３９００－１４４２８８３００－＞約４．４ｋｂ（Ｐ１と表記）
Ｃｈｒ６：ＧＲＣｈ３８．ｐ１２；１４４２９２５００－１４４２９５５００－＞約３．０ｋｂ（Ｅ３と表記）

【0122】

ターゲティング配列は，配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する２１ヌクレオチドセグメント（５’－２１ヌクレオチドターゲティング配列－ＮＮＧＲＲＴ－３’）で特定し、カニクイザル（Macaca fascicularis）ゲノムの対応する領域と完全に一致するもの（ターゲティング配列とＰＡＭ配列）を主に含むようにフィルタリングした（表３に「ＴＲＵＥ」と記載）。

【0123】

レンチウイルス導入プラスミド（ｐＥＤ１７６）の構築
ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（https://www.genscript.com）から購入し、以下の変更を加えた：ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列をＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列（配列番号１２４）に置き換え、ＳｐＣａｓ９をコドン最適化ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（ｍｉｎｉＶＲとも称される）に融合したｄＳａＣａｓ９に置き換えた［配列番号１２５（ＤＮＡ）及び１２６（タンパク質）］。ＭｉｎｉＶＲの転写活性化ドメインは、転写を活性化することで遺伝子発現を活性化することができる。ＭｉｎｉＶＲはｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体）のＣ末端に結合され（以下、ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲと称する（配列番号１９２（ＤＮＡ）及び１９３（タンパク質）））、そして、各ターゲティング配列にコードされたｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡによって導かれ（directed）、ヒトＵＴＲＮ遺伝子の推定エンハンサー領域またはプロモーター領域にターゲティングされる（図６）。調製したバックボーンプラスミドはｐＥＤ１７６と名付けた。

【0124】

ｇＲＮＡクローニング
３つのコントロールノンターゲティング配列（表３、配列番号１～３）と１００のターゲティング配列（表３、配列番号４～１０３）をｐＥＤ１７６にクローニングした。フォワードおよびリバースオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により以下のフォーマットで合成された；フォワード；５’ＣＡＣＣ（Ｇ）－２０～２１塩基対ターゲティング配列－３’、及びリバース；５’ＡＡＡＣ－２０～２１塩基対の逆相補ターゲティング配列－（Ｃ）－３’。ターゲットがＧで始まらない場合は括弧内の塩基が追加された。オリゴはトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に１００μＭで再懸濁した。各相補オリゴ１μｌをＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（New England Biolabs (NEB) # B7203S）で１０μｌの反応液（reaction）に添加した（combined）。この反応液を９５℃まで加熱し、サーモサイクラーで２５℃まで冷却することで、ｐＥＤ１７６へのクローニングに適合する粘着末端オーバーハングを持つオリゴをアニーリングした。アニーリングしたオリゴを、ＢｓｍＢＩで消化してゲル精製したレンチウイルストランスファープラスミドｐＥＤ１７６とあわせ、製造元のプロトコールに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（NEB # M0202S）でライゲーションした。２μｌのライゲーション反応液で、製造元のプロトコールに従って、１０μｌのＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（NEB # C3040I）を形質転換した。このようにして得られたコンストラクトは、Ｕ６プロモーター（配列番号１２８）によって、ｓｇＲＮＡの発現を駆動する。ここで、ｓｇＲＮＡは、個々のターゲティング配列がコードするｃｒＲＮＡを含み、その３’末端にＵ６ポリメラーゼの終止シグナルＴＴＴＴＴＴが付加されたＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列からコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（ｇｕｕｕｕａｇｕａｃｕｃｕｇｇａａａｃａｇａａｕｃｕａｃｕａａａａｃａａｇｇｃａａａａｕｇｃｃｇｕｇｕｕｕａｕｃｕｃｇｕｃａａｃｕｕｇｕｕｇｇｃｇａｇａｕｕｕｕｕｕ（配列番号１２７））が融合している。

【0125】

レンチウイルス調製
ＨＥＫ２９３ＴＡ細胞（Genecopoeia # LT008）を６ウェル細胞培養皿（VWR # 10062-892）に０．７５ｘ１０^６細胞／ウェルで播種し、２ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher # 11140050)）中で、３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間培養した。翌日、１．５μｇのパッケージングプラスミドミックス［１μｇのパッケージングプラスミド（pCMV delta R8.2; addgene # 12263を参照）と０．５μｇのエンベロープ発現プラスミド（pCMV-VSV-G; addgene # 8454を参照）］、およびｄｓａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲと示されたｓｇＲＮＡをコードする配列を含む１μｇのトランスファープラスミドを用いて、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮトランスフェクション反応（Mirus Bio # MIR6700）を製造元のプロトコールに従ってセットアップした。トランスフェクションから４８時間後に、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（VWR # 10218-488）に培地の上清を通すことにより、レンチウイルスを回収した。精製して分注したレンチウイルスは、使用するまで－８０℃の冷凍庫で保存した。

【0126】

ＨＳＭＭ細胞のトランスダクション
表２に示すように、０～３５歳の５つの異なるヒトドナーから採取した初代骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）をＬｏｎｚａ Ｉｎｃ．から入手した。

【0127】

【表2】

【0128】

細胞は、Ｌｏｎｚａから入手した、初代骨格筋細胞増殖用培地［SkBM^TM-2 Basal Medium (# CC-3246)及び骨格筋細胞の増殖に要求されるSkGM^TM-2 SingleQuots^TM supplements (# CC-3244)を含有する培養システムを含む、SkGM^TM-2 Skeletal Muscle Growth Bullet Kit medium (# CC-3245)］中で培養した。ＣＣ－３２４６は1 x SkBM^TM-2 Basal Medium, 500 mLを含む。1 x SkGM^TM-2 SingleQuots^TM Supplement Pack (#CC-3244)は以下を含む：
1 x GA-1000, 0.50 mLが入った赤色キャップのバイアル
1 x hEGF, 0.50 mLが入った緑色キャップのバイアル
1 x デキサメサゾン, 0.50 mLが入ったナチュラルキャップのバイアル
1 x FBS, 50.00 mLのボトル
1 x L-Glutamine, 10.00 mLのボトル

【0129】

ＣＣ－３２４４の成分を、製造元の指示に従って５００ｍｌの培養液（# CC-3246）に添加した。トランスダクションにあたっては、増殖培地を入れた６ウェルの細胞培養皿（VWR # 10062-894）に０．１２５～０．３３×１０^６細胞／ウェルで細胞を播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間培養した。翌日、８μｇ／ｍｌポリブレン（Sigma # TR-1003-G）を添加した１．５ｍｌの増殖培地と、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合した個々のターゲティング配列（表３）にコードされたｃｒＲＮＡを含む各ｓｇＲＮＡに対応する１．０ｍｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェルに添加した。レンチウイルスの力価は、Lenti-X^TM qRT-PCR Titration Kit（Clontech # 631235）を用いて、１０^８から１０^９粒子／ｍｌの範囲で測定した。細胞をレンチウイルスと６時間インキュベートした後、ウイルス培地を除去し、新鮮な増殖培地と交換した。トランスダクションから７２時間後、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Sigma # P8833-100MG）を添加した増殖培地］を与えた。細胞には２－３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから７－１０日後、細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Qiagen # 74182）でＲＮＡを抽出した。

【0130】

２つのウイルスの共トランスダクション実験も同様に、ウイルスの総量が1つのウイルスのトランスダクションと同じになるように行った。

【0131】

遺伝子発現解析
遺伝子発現解析のために、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit （Applied Biosystems; Thermo Fisher # 4368813）のプロトコールに従って、約０．０５～０．８μｇの全ＲＮＡから１０μｌの容量でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、Taqman Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher # 4444557）を用いて製造元のプロトコールに従って解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（UTRN: Assay Id Hs01125994_m1 FAM; HPRT: Assay Id Hs99999909_m1 VIC_PL）は、Life Technologies社から入手した。Taqman Fast Advanced Master Mixのプロトコールに従って、QuantStudio 5 Real-Time PCRシステムでTaqman probe-based real-time PCR反応を進め解析した。

【0132】

データ解析
各サンプルと３つのコントロールについて、３回の技術的反復実験から得られたＵＴＲＮプローブのＣｔ値の平均値からＨＰＲＴプローブの平均値を差し引くことにより、ｄｅｌｔａＣｔ値を算出した（平均Ct UTRN －平均Ct HPRT）。発現値（expression value）は、各サンプルについて、２^{－（ｄｅｌｔａＣｔ）}の式を用いて求めた。次に、サンプルの発現値（表３；配列番号４～１０３）を、各実験について３つのコントロールの発現値（表３；配列番号１～３）の平均値で正規化し、各サンプルの相対的なＵＴＲＮ発現量を求めた。各スクリーンから２つの生物学的反復実験を分析し、すべての実験の平均値を算出した（表３）。

【0133】

（２）結果
ＲＮＰによるＵＴＲＮ遺伝子発現の活性化
ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲの発現カセットと各ターゲティング配列のｓｇＲＮＡを、５人の異なるドナー由来の初代ＨＳＭＭ細胞に送達させるレンチウイルスを作製した（表２）。アッセイの大部分は、細胞の増殖速度の点から、ドナー＃３（表２）のＨＳＭＭ細胞で行った。トランスダクションされた細胞は、ピューロマイシンに対する耐性で選択され、Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙを用いてＵＴＲＮの発現量を定量した（表３）。各サンプルの発現値を、コントロールのｓｇＲＮＡを導入した細胞のＵＴＲＮ発現量の平均値で正規化した（表３、配列番号１～３）。ドナー＃３の２回の実験で平均発現値を測定した（表３；図７）。

【0134】

表３ ＵＴＲＮ遺伝子の発現制御領域のスクリーニングに使用されたターゲティング配列

【0135】

【表3-1】

【0136】

【表3-2】

【0137】

【表3-3】

【0138】

【表3-4】

【0139】

表３において、「座標」は、ＳａＣａｓ９を使用した場合に、示されたすべてのｇＲＮＡのＳａＣａｓ９切断部位の候補を示している。

【0140】

図７に示すように、調べた１００個のターゲティング配列のうち、５個のターゲティング配列がＨＳＭＭ ドナー＃３細胞におけるＵＴＲＮ ｍＲＮＡ発現の一貫したアップレギュレーションを示した（ガイド＃１４５、１４６、２０５、２０８、及び２１０（配列番号：４５、４６、５８、５９、及び６０））。これらのうち２つの配列、すなわち＃１４５（配列番号４５）と＃１４６（配列番号４６）はエンハンサーＥ２領域に、残りの３つの配列、すなわち＃２０５（配列番号５８）、＃２０８（配列番号５９）、＃２１０（配列番号６０）はプロモーターＰ１領域に集積していた。ガイド＃２０５、２０８、及び２１０は、それぞれ実施例１の＃ｓｇＥＤ３－６、ｓｇＥＤ３－３０、ｓｇＥＤ３－３２と同一である。

【0141】

これら５つのターゲティング配列のうち、３配列、即ち、＃１４５、＃１４６、＃２０８は、カニクイザルのゲノムの対応する領域と１００％一致した。一方、これらの配列のうち２つ、即ち＃２０５と＃２１０は、カニクイザルゲノムの対応する領域とは一致しなかった（図８）。

【0142】

これらの５つのターゲティング配列を個別に調べると、５つの異なるドナー由来のＨＳＭＭ（the 5 different HSMM donors）においてＵＴＲＮ ｍＲＮＡの発現が一貫して約２～４倍増加していた（図９）。プロモーター領域のガイド＃２０５、＃２０８、又は＃２１０とエンハンサー領域のガイド＃１４５、＃１４６の組み合わせ（図８の模式図）では、ガイド＃２０５と＃１４５（＃２０５＋１４５）、ガイド＃２０８と＃１４５（＃２０８＋１４５）の２つの組み合わせで、５つの異なるドナー由来のＨＳＭＭにおいてＵＴＲＮの発現が約３～７倍に増加した（図９）。

【0143】

実施例３ ＡＡＶシス－プラスミドの調製と評価
（１）実験方法
ＡＡＶ ＡＩＯ シス－プラスミドの構築
表４に示すように、試験したすべてのプラスミドバックボーンｐＥＤ２６０（配列番号２１０）、ｐＥＤ２６１（配列番号２１１）、ｐＥＤ２６３（配列番号２１２）は、完全長のｄＳａＣａｓ９、ＣＫ８プロモーター、Ｕ６プロモーターの塩基配列が同じで、ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクター（Takara # 6234）のＩＴＲ間の配列を置き換えている。
それらは、アクチベーター部分、ｐｏｌｙＡで異なっており、ｐＥＤ２６０、ｐＥＤ２６１はアクチベーター部分としてｍｉｎｉＶＲを含み、一方ｐＥＤ２６３はｍｉｃｒｏＶＲを含む。ｐＥＤ２６０はｂＧＨ ｐｏｌｙＡを有しているのに対し、ｐＥＤ２６１、ｐＥＤ２６３は２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ配列を有している（配列番号２０８）。

【0144】

【表4】

【0145】

ターゲティング配列 ガイド＃１４５、＃１４６、又は＃２０８でコードされるｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ用の各オリゴを、これらの各バックボーンにクローニングし、オールインワン（ＡＩＯ）プラスミドを作製して試験をした。得られた各ＡＩＯプラスミドは、表４で示されるように、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲ－ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃１４５（pED260-145）、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲ－ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃１４６（pED260-146）、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲ－ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃２０８（pED260-208）、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲ－２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃１４５（pED261-145）、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲ－２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃１４６（pED261-146）、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲ－２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃２０８（pED261-208）、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｃｒｏＶＲ－２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃１４５（pED263-145）、ｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｃｒｏＶＲ－２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃１４６（pED263-146）、又はｐＡＡＶ－ＣＫ８－ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｃｒｏＶＲ－２ｘ ｓＮＲＰ－１ ｐｏｌｙＡ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＃２０８（pED263-208）と表記した。

【0146】

ヒトゲノムのどの部分とも相同性がないことが知られている２つの異なる配列をネガティブコントロールとして使用し、ノンターゲティングガイド（ＮＴｇ１（配列番号１）、ＮＴｇ２（配列番号２））と称した。又、ＮＴｇ１又はＮＴｇ２の各オリゴをそれぞれのバックボーンにクローニングし、コントロールプラスミドとして使用した。

【0147】

ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Thermo Fisher # R70007）を２４ウェルの細胞培養皿（CORNING # 351147）に５×１０^４細胞／ウェルで播種し、０．５ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher # 11140050））中、３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間培養した。翌日、ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲ又はｄＳａＣａｓ９－ｍｉｃｒｏＶＲをコードする配列および実施例２で選択したターゲティング配列（すなわちガイド＃１４５（配列番号４５）、＃１４６（配列番号４６）、又は＃２０８（配列番号５９））を含むｓｇＲＮＡをコードする配列を含む０．５μｇのプラスミドを用いて、製造元のプロトコールに従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－２０００トランスフェクション反応（Thermo Fisher # 11668019）をセットアップした（表４）。

【0148】

トランスフェクションから４８時間後に細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Qiagen # 74182）を用いてＲＮＡを抽出した。

【0149】

遺伝子発現解析
遺伝子発現解析のために、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit （Applied Biosystems; Thermo Fisher # 4368813）のプロトコールに従って、約０．５μｇの全ＲＮＡから１０μｌの容量でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、Taqman Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher # 4444557）を用いて製造元のプロトコールに従って解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（UTRN: Assay Id Hs01125994_m1 FAM; HPRT: Assay Id Hs99999909_m1 VIC_PL）は、Thermo Fisherから入手した。Taqman Fast Advanced Master Mixのプロトコールに指示される通り、QuantStudio 5 Real-Time PCRシステムでTaqman probe-based real-time PCR反応を進め解析した。

【0150】

データ解析
ＮＴｇ１又はＮＴｇ２を含むプラスミドについては、結果の平均値をＣｔｒｌＸ２として示した。

【0151】

各サンプルについて、各プローブのデルタＣｔ値は、ノンターゲティングガイドコントロールの３回の技術的反復実験の平均Ｃｔ値から、各サンプルの３回の技術的反復実験の平均Ｃｔ値を差し引くことにより算出した。
デルタＣｔ ＵＴＲＮ＝平均値 コントロールＣｔ ＵＴＲＮ － 平均値 サンプルＣｔ ＵＴＲＮ。
デルタＣｔ ＨＰＲＴ＝平均値 コントロールＣｔ ＨＰＲＴ － 平均値 サンプルＣｔ ＨＰＲＴ。
次に、各サンプルのＵＴＲＮのデルタＣｔ値からＨＰＲＴのデルタＣｔ値を差し引くことにより、デルタデルタＣｔ値を算出した。
デルタデルタＣｔ＝デルタ Ｃｔ ＵＴＲＮ － デルタ Ｃｔ ＨＰＲＴ。
発現値は、各サンプルについて、２^{（ｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣｔ）}の式で求めた。

【0152】

（２）結果
ターゲティング配列ガイド＃１４５（配列番号４５）、＃１４６（配列番号４６）、＃２０８（配列番号５９）でコードされたｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡの存在下では、３つのテストしたバックボーン（ｐＥＤ２６０、２６１、及び２６３）はすべて、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞においてＵＴＲＮをアップレギュレートすることができた（図１０）。

【0153】

実施例４ ｄＳａＣａｓ９、転写アクチベーター、及びｓｇＲＮＡを搭載した組換えＡＡＶ９の調製
（１）実験方法
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生
アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）粒子は、Ｔ２２５フラスコ（Corning）あたり０．９６×１０^７～１．８×１０^７細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher # 11995-065）で培養した２９３Ｔ細胞（ATCC CRL-3216）を用いて調製した。ｐＲＣ９プラスミドは以下のように構築した：ＡＡＶ９のキャプシド配列（ＪＰ５０５４９７５Ｂを参照）を、ＡＡＶ２のキャプシド配列に置き換えてｐＲＣ２－ｍｉ３４２プラスミド（Takara # 6230）にサブクローニングした。２０μｇのｐＲＣ９プラスミドと２０μｇのｐＨｅｌｐｅｒベクター（Takara # 6230）を、実施例３で使用したＡＩＯプラスミド、ｐＥＤ２６１－１４５、ｐＥＤ２６１－１４６、ｐＥＤ２６１－２０８、ｐＥＤ２６３－１４５、ｐＥＤ２６３－１４６、又はｐＥＤ２６３－２０８の６種類のうち１つを２０μｇ、Ｔ２２５フラスコあたり１８０μｌのＴｒａｎｓＩＴ－２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Mirus Bio # MIR2700）を用いて、細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後、培養液を２％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に変更した。７２時間後に細胞を回収し、製造元の指示に従ってＡＡＶｐｒｏ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(All Serotypes) (Takara # 6666)を用いてＡＡＶを抽出・精製した。精製したＡＡＶの力価は、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(for Real Time PCR)(Takara # 6233)を用いて測定した。得られた各ＡＡＶを、ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－１４５、ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－１４６、ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－２０８、ＡＡＶ９－ＥＤ２６３－１４５、ＡＡＶ９－ＥＤ２６３－１４６、又はＡＡＶ９－ＥＤ２６３－２０８と表記する。

【0154】

ＡＡＶの確認
ＮｕＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、抗酸化剤及びバッファー（Thermo Fisher # NP0009, # NP0005, # NP0007）を用いてＡＡＶサンプルを調製した後、NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels 1.0 mm x 12-well （Thermo Fisher # NP0322BOX）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥでＡＡＶキャプシドタンパク質を確認した。各ＡＡＶのアプライ量は１．０ｘ１０^１０ｖｇ／レーンであった。オリオール蛍光ゲル染色液（BioRad # 161-0495）でゲルを染色した後、ＵＶ励起と５８０ｎｍフィルターを用いてChemiDoc^TM Touch（BioRad）で画像を撮影した。

【0155】

（２）結果
Ｔ２２５フラスコで製造されたＡＡＶ９の力価は、以下のように算出された。

【0156】

【表5】

【0157】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、各ＡＡＶサンプルから３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、それぞれ８７ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６２ｋＤａ）が検出された（図１１）。これらの結果から、ＡＡＶ ＡＩＯシスプラスミドにクローニングされたｄＳａＣａｓ９や転写アクチベーター等の目的の遺伝子が、ＡＡＶ９に搭載できることが示された。

【0158】

実施例５ ｄＳａＣａｓ９、転写アクチベーター、及びｓｇＲＮＡを搭載した組換えＡＡＶ９のユートロフィン アップレギュレーションに対するインビトロ薬理学的評価
（１）実験方法
ＡＡＶ９産生
アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）粒子は、４．７７ｘ１０^７細胞／７００ｍＬ／Cell Stack 5 flask（Corning）の密度で播種し、１０％ ＦＢＳ（Hyclone # SH30070.03）、１％ＭＥＭ（Sigma # M7145）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher # 15070-063）、及び２．５％ ＨＥＰＥＳ（Sigma # H0887）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した２９３Ｔ細胞（ATCC # CRL-3216）を用いて調製した。その３日後、実施例４で構築したｐＲＣ９プラスミド２２７．９μｇ、ｐＨｅｌｐｅｒベクター（Takara # 6230）、実施例３で使用した３つのＡＩＯプラスミドｐＥＤ２６１－１４５、ｐＥＤ２６１－２０８、又はｐＥＤ２６３－２０８のいずれか１つを用いて、フラスコあたり６８３．７μｌのポリエチレンイミンＭａｘ（2mg/mL）（Polysciences # 24765-2）で細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に、細胞をTriton X-100（最終濃度 0.2%）（Roche # 10789704001）を用いて回収した。ＡＡＶサンプルに対し、遠心分離、ろ過、濃縮、クロマトグラフィー（AKTA avant 25, GE Healthcare, POROS CaptureSelect AAV Resins column, Thermo Fisher）及びＣｓＣｌを用いた超遠心分離（Optima XE-90, Beckman Coulter）による精製を行った。目的とする分画を透析した後、ＡＡＶの力価をAAVpro Titration Kit （for Real Time PCR）（Takara # 6233）を用いて測定した。ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－１４５、ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－２０８、及びＡＡＶ９－ＥＤ２６３－２０８が得られた。

【0159】

細胞培養とＡＡＶ感染
ヒト骨格筋筋芽細胞（HSMM, Lonza # CC-2580, lot# 18TL211617）をコラーゲンＩコートした２４ウェルプレート（IWAKI # 4820-010）に１ウェルあたり１００，０００個の密度で播種し、５００ Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher # 15070063）を添加したSkGM^TM-2 Skeletal Muscle Cell Growth Medium-2 BulletKit^TM（Lonza # CC-3245）中で、３７℃、５％ ＣＯ_２で２日間培養した。培地を分化培地（２％ＦＢＳ（GE Healthcare # SH30070.03）と５００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Sigma # D6429））に交換し、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間培養した。ＡＡＶ感染のため、培地は、０．２、１．０、又は５．０×１０^１１ ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ９－ＥＤ２６１－１４５、ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－２０８、又はＡＡＶ９－ＥＤ２６３－２０８を含む５００μＬの新鮮な分化培地に交換した。感染後、感染した細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で３～４日間培養し、製造元の指示に従い、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen # 74134）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＡＡＶを感染させていない細胞からのＲＮＡをコントロールとし、ＡＡＶ（－）として示した。

【0160】

遺伝子発現解析
Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲでは、SuperScript^TM VILO^TM cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher # 11754250）を用いて、２５０ｎｇの全ＲＮＡを２０μＬの反応容量でｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡは水で５倍希釈し、２μＬをｑＰＣＲに使用した。ＵＴＲＮ用のＴａｑｍａｎプローブ（Thermo Fisher # Hs01125994_m1, FAM）、ＨＰＲＴ１用のＴａｑｍａｎプローブ（Thermo Fisher # Hs02800695_m1, FAM）、およびTaqMan^TM Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher # 4324018）を含む１０μＬの最終容量で、QuantStudio^TM 12K Flex Real-Time PCR System（Thermo Fisher）を用いてｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲのサイクル条件は以下の通り：９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４５サイクル。データは、QuantStudio^TM 12K Flex software （Thermo Fisher）で解析した。発現値は、各遺伝子の標準曲線を用いて解析し、ＵＴＲＮ遺伝子の発現レベルをＨＰＲＴ１遺伝子の発現レベルで正規化した。

【0161】

（２）結果
ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－１４５、ＡＡＶ９－ＥＤ２６１－２０８、又はＡＡＶ９－ＥＤ２６３－２０８をＨＳＭＭ細胞に感染させたところ、ユートロフィンｍＲＮＡのアップレギュレーションが見られたことから、ｄＳａＣａｓ９、ｍｉｎｉＶＲ又はｍｉｃｒｏＶＲ、及びガイド＃１４５又は＃２０８を含むｓｇＲＮＡの導入遺伝子を搭載したＡＡＶ９が、ヒト筋細胞におけるユートロフィンのアップレギュレーションに対して薬理作用を持つことが示唆された（図１２）。

【0162】

実施例６ ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を用いたオフターゲット解析
（１）実験方法
レンチウイルス調製
ＨＥＫ２９３ＴＡ細胞（Genecopoeia # LT008）を６ウェル細胞培養皿（VWR # 10062-892）に０．７５ｘ１０^６細胞／ウェルで播種し、２ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher # 11140050））中、３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間培養した。翌日、１．５μｇのパッケージングプラスミドミックス［１μｇのパッケージングプラスミド（pCMV delta R8.2;addgene # 12263を参照）と０．５μｇエンベロープ発現プラスミド（pCMV-VSV-G;addgene #8454を参照）］と、ｄＳａＣａｓ９－ｍｉｎｉＶＲと、実施例２で選択したターゲティング配列、すなわちガイド＃１４５（配列番号４５）、＃１４６（配列番号４６）、＃２０８（配列番号５９））、またはＮＴｇ１（ノンターゲティングガイド－１）（配列番号１）を含むｓｇＲＮＡをコードする塩基配列を含むトランスファープラスミド１μｇとを用いて、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮトランスフェクション反応を製造元のプロトコールに従ってセットアップした。トランスフェクションから４８－７２時間後に、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（VWR # 10218-488）に培地の上清を通すことにより、レンチウイルスを回収した。精製して分注したレンチウイルスは、使用するまで－８０℃の冷凍庫で保存した。

【0163】

ＨＳＭＭ ｃｅｌｌｓ細胞のトランスダクション及びＲＮＡサンプル調製
０歳のヒトドナー由来の初代骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）（Lot # 542368）をＬｏｎｚａ Ｉｎｃ．より入手した。細胞は、Ｌｏｎｚａ社製の初代骨格筋細胞増殖用培地［SkGM^TM-2 Skeletal Muscle Growth Bullet Kit培地（# CC-3245）：骨格筋筋芽細胞の増殖に必要なSkBM^TM-2 Basal Medium（# CC-3246）とSkGM^TM-2 SingleQuots^TMサプリメント（# CC-3244）を含む培養システムを含む）］で培養した。トランスダクションにあたっては、増殖培地を入れた６ウェルの細胞培養皿（VWR # 10062-894）に０．１２５×１０^６細胞／ウェルで細胞を播種し、３７℃／５％ ＣＯ_２で２４時間培養した。翌日、８μｇ／ｍｌポリブレン（Sigma # TR-1003-G）を添加した増殖培地１．５ｍｌと、個々のターゲティング配列（ガイド＃１４５（配列番号４５）、＃１４６（配列番号４６）、又は＃２０８（配列番号５９））にコードされたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む各ｓｇＲＮＡに対応するレンチウイルス上清（力価は０．２－２ｘ１０^９コピー／ｍｌ、Lenti-X^TM qRT-PCR Titration Kit（Clontech # 631235）を用いて測定）１．０ｍｌを各ウェルに加えた。細胞をレンチウイルスと６時間インキュベートした後、ウイルス培地を除去し、新鮮な増殖用培地と交換した。トランスダクション後７２時間で、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Sigma # P8833-100MG）を添加した増殖用培地］を与えた。細胞には２～３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから７－１０日後、細胞を回収し、製造元の指示の通りにＲＮｅａｓｙ ９６キット（Qiagen # 74182）でＲＮＡを抽出した。コントロールとして使用したＮＴｇ１（ノンターゲティングガイド－１）の配列は、ＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＣＧＴＣＧＣＡＡ（配列番号１）である。

【0164】

オフターゲット解析
イルミナシーケンシングはＧｅｎｅＷｉｚ，ＬＬＣ社が行い、ＲＮＡライブラリーは製造元のプロトコールに従ってNEBNext Ultra RNA Library Prep Kit（Ipswich, MA, USA, NEB # E7530L）を用いて調製した。シークエンシングライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｆｌｏｗ ｃｅｌｌの３つのレーンにクラスタリングし、２Ｘ１５０ Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄコンフィギュレーションを用いてシークエンシングした。結果として得られた生の配列データ（．ｂｃｌファイル）をｆａｓｔｑファイルに変換し、イルミナ社のｂｃｌ２ｆａｓｔｑ ２．１７ソフトウェアを用いて、インデックス配列の同定に１ミスマッチを許容する条件でデマルチプレックスを行った。Ｆａｓｔｑファイルは、ＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒを用いて、ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１２にアラインした。差分解析はＤＥＳｅｑ２を用いて行い、プロットはカスタムＲスクリプトを用いてｐｌｏｔｌｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｌｏｔ．ｌｙ）で作成した。

【0165】

（２）結果
各ガイドによるｍＲＮＡレベルのゲノムワイドな倍率変化を、ノンターゲティングガイド１（ＮＴｇ１）の値を用いて正規化した。各ドットは１つの遺伝子を表す。Ｘ軸は遺伝子の平均発現量を示す。Ｙ軸はＮＴｇ１サンプルに対する遺伝子発現のｌｏｇ－２倍率変化を示す。水平方向のＬｏｇ２＝０より上の遺伝子は、ＮＴｇ１サンプルよりも実験サンプル（例：ガイド＃１４５）における方が遺伝子の発現が高いことを示し、水平方向のＬｏｇ２＝０より下の遺伝子は、ＮＴｇ１サンプルよりも実験サンプルにおける方が遺伝子の発現が低いことを示す。また、ＮＴｇ１サンプルよりも実験サンプルにおける方が高度にアップレギュレートされている又はダウンレギュレートされている遺伝子については、遺伝子ＩＤを示している。ｇＲＮＡが異なると、異なる遺伝子の発現変化が誘導される（図１３Ａ：ガイド＃１４５、１３Ｂ：ガイド＃１４６、１３Ｃ：ガイド＃２０８）。ガイド＃２０８は、ＵＴＲＮ遺伝子のアップレギュレーションが良好な一方で、他の遺伝子の発現変化をあまり引き起こさないように思われる。

【0166】

実施例７ ユートロフィン アップレギュレーションに対する薬理作用のインビボ評価
（１）実験方法
動物及び免疫抑制のレジメン
本研究では、ＡＡＶ９－血清型陰性のカニクイザル（雄）を使用する。馴化１週間後、０．７５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロンリン酸ナトリウム（Abcam # ab142456）を、カニクイザルに経口投与する。投薬は、ＡＡＶ投与の１４日前から開始し、屠殺するまで続ける。

【0167】

ＡＡＶ９処置及び筋肉組織サンプリング
１．０または６．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＥＤ２６１－２０８（SignaGen社製）を橈側皮静脈経由でカニクイザルに静脈内投与する。大腿四頭筋生検では、サルに塩酸ケタミン１０ｍｇ／ｋｇと塩酸メデトミジン０．０８ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与して麻酔をかけ、ＡＡＶ投与前１９日目と投与後２８日目に５０～２００ｍｇのサンプルを採取する。ＡＡＶ９投与後５６日目にサルを屠殺し、各筋肉と心臓のサンプルを採取する。サンプルは液体窒素中で凍結され、遺伝子及びタンパク質の発現解析に用いる。

【0168】

筋肉組織サンプルの、遺伝子及びタンパク質発現解析
Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲのために、筋肉サンプルからRNeasy Fibrous Tissue Mini Kit （Qiagen # 74704）を用いて全ＲＮＡを抽出し、SuperScript^TM VILO^TM cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher # 11754250）を用いてｃＤＮＡに変換する。ＵＴＲＮ用のＴａｑｍａｎプローブ（Thermo Fisher, # Mf01126001_m1, FAM）とＨＰＲＴ１用のＴａｑｍａｎプローブ（Thermo Fisher, # Hs02800695_m1, FAM）、及びTaqMan^TM Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher, # 4324018）を用いて、QuantStudio^TM 12K Flex Real-Time PCR System（Thermo Fisher）でｑＰＣＲを実施する。ＵＴＲＮ遺伝子の発現レベルをＨＰＲＴ１遺伝子の発現レベルで正規化する。

【0169】

タンパク質の発現解析には、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターカクテル（Thermo Fisher # 78441）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Millipore # 20-188）を用いて全筋ライセートを調製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに供する。ユートロフィンタンパク質は、ユートロフィンの一次抗体（SantaCruz # SC-33700）と西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した二次抗体（Cell Signaling # 7076）を用いて検出する。

【産業上の利用可能性】

【0170】

本発明によれば、ヒト細胞においてＵＴＲＮ遺伝子の発現を活性化することができる。すなわち、本発明はＤＭＤおよびＢＭＤの治療及び／又は予防に極めて有用であると期待される。
数字的な限界または範囲が記載されている場合には、その両端も含まれる。さらに、数字的な限界または範囲の中にあるすべての数値およびサブレンジもまた、あたかも明示的に記述されたかのように、明確に含まれる。
本明細書では、「a」や「an」等の単語は、「１以上」という意味を有する。
明らかに、上記の教示に照らして、本発明の多くの改変と変更が可能である。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施することができることが理解される
上述のすべての特許およびその他の文献は、この参照により、詳細に記載されている場合と同じように、ここに完全に組み入れられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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