特許 7072676 ２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶、その製造方法及びそれを用いたマイクロエマルション

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-12

(45)【発行日】2022-05-20

(54)【発明の名称】２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶、その製造方法及びそれを用いたマイクロエマルション

(51)【国際特許分類】

   C07C 401/00 20060101AFI20220513BHJP

   A23K 20/174 20160101ALI20220513BHJP

   A61K 31/593 20060101ALN20220513BHJP

   A61K 9/107 20060101ALN20220513BHJP

   A61P 3/02 20060101ALN20220513BHJP

【ＦＩ】

C07C401/00

A23K20/174

A61K31/593

A61K9/107

A61P3/02 102

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2020564987

(86)(22)【出願日】2018-08-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-05-27

(86)【国際出願番号】 CN2018099257

(87)【国際公開番号】W WO2019153673

(87)【国際公開日】2019-08-15

【審査請求日】2020-08-26

(31)【優先権主張番号】201810120581.0

(32)【優先日】2018-02-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】520297218

【氏名又は名称】シャントン ハイネン バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＨＡＩＮＥＮＧ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｒｏａｄ ａｎｄ ＨｕｉＹａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｇａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｒｉｚｈａｏ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ

(73)【特許権者】

【識別番号】520297229

【氏名又は名称】シャントン ハイネン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＨＡＩＮＥＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｒｏａｄ ａｎｄ ＨｕｉＹａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｇａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｒｉｚｈａｏ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】特許業務法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】タン フェイ

(72)【発明者】

【氏名】カオ ジンダン

(72)【発明者】

【氏名】リ シン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン チャオ

(72)【発明者】

【氏名】ルオ ハオ

(72)【発明者】

【氏名】リ チャンチャン

(72)【発明者】

【氏名】カオ シ

(72)【発明者】

【氏名】シュウ リャン

【審査官】武貞 亜弓

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５０４３６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７２９６１５２（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２００５－５１９８９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５２９０８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Trinh-Toan et al.，Journal of The Chemical Society，1977年，No.4，p.393-401

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｃ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶であって、そのＸ線粉末回折パターンは、下記表：

【表1】

に示すピークを含むことを特徴とする２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶。

【請求項2】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを有機溶媒に加え、加熱して還流させ、前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを溶解させて、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液を得るステップ１）と、
前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液に水を加えて固体を析出させて、前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を得るステップ２）と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法。

【請求項3】

前記有機溶媒はエーテル系溶媒、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒及び塩素化炭化水素系溶媒から選ばれる１種又は複数種であることを特徴とする請求項２に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法。

【請求項4】

前記ステップ２）は、攪拌しながら、前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液に固体が析出するまで水を加え、引き続き攪拌して室温に冷却し、濾過してケークを取得し、前記ケークをその水分含有量が２０ｗｔ％未満になるまで乾燥させて、前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を得ることを含むことを特徴とする請求項２または３に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法。

【請求項5】

前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロールと水の反応モル比は１：（０．６～２０００）であることを特徴とする請求項３に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法。

【請求項6】

前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロールと水の反応モル比は１：（０．８～１．５）であることを特徴とする請求項５に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法。

【請求項7】

請求項１に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を含むことを特徴とするマイクロエマルション。

【請求項8】

重量パーセント含有量基準で、請求項１に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶０．０５～１．２５％、ポリソルベート６０ １０～１５％、ステアロイル乳酸ナトリウム６～１２％、スパン８０ ３～５％、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール１～２．５％、ソルビン酸０．２～１％、プロピレングリコール４～７％、水５６．２５～７５．７５％を成分として含むことを特徴とする請求項７に記載のマイクロエマルション。

【請求項9】

重量パーセント含有量基準で、請求項１に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶０．１２５％、ポリソルベート６０ １２％、ステアロイル乳酸ナトリウム８％、スパン８０ ４％、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール２．５％、ソルビン酸１％、プロピレングリコール７％、水６５．３７５％を成分として含むことを特徴とする請求項８に記載のマイクロエマルション。

【請求項10】

ナノマイクロエマルションであることを特徴とする請求項７～９のいずれか１項に記載のマイクロエマルション。

【請求項11】

平均粒子径は８４～９１ｎｍであり、封入率は８５～８９％であることを特徴とする請求項１０に記載のマイクロエマルション。

【請求項12】

重量パーセント含有量基準で、０．０５～１．２５％の請求項１に記載の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶、１０～１５％のポリソルベート６０、６～１２％のステアロイル乳酸ナトリウム、３～５％のスパン８０、１～２．５％の２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノールを混合して、４５～５５℃に加熱して完全に溶解させ、ボルテックスシェーカーを用いて振盪して均一にして、第１反応液を生成するステップ１）と、
２５±５℃で、重量パーセント含有量基準で４～７％のプロピレングリコールと０．２～１％のソルビン酸を５６．２５～７５．７５％の水に溶解し攪拌して均一にして、第２反応液を生成するステップ２）と、
前記第１反応液と前記第２反応液を混合して、ボルテックスシェーカーを用いて振盪し均一にして、前記マイクロエマルションを得るステップ３）と、を含むことを特徴とする請求項７～１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションの製造方法。

【請求項13】

請求項７～１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションの飼料添加剤としての使用。

【請求項14】

請求項７～１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションを含むことを特徴とする飼料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶に関し、特に、優れた安定性を有する２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶、その製造方法及びそれを用いたマイクロエマルションに関する。

【背景技術】

【0002】

ビタミンＤ_３には生理作用がない（Ｈ．Ｆ．Ｄｅ Ｌｕｃａ ｅｔ ａｌ．，１９７１）。Ｈ^３でビタミンＤ_３を標識して研究したところ、消化管で吸収されたビタミンＤ_３は肝臓の中で２５－炭素原子のヒドロキシル化により、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールが生成され、後者は腎臓ミトコンドリアの中で１，２５－ジヒドロキシＤ_３に変換されて小腸の粘膜と腎臓に送られ、カルシウム、リンの２種のミネラルの吸収と再吸収を促すとともに、動物体の代謝に必要な他の機能が生じる。関連の研究によると、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールはエステル可溶性ビタミンと吸収原理が異なり、その利用効率がより高い。

【0003】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロールは、２５－ヒドロキシビタミンＤ_３とも呼ばれ、生体内におけるビタミンＤ_３の生理活性を有する形態であり、その構造式は式１に示すとおりである。

【0004】

【化1】

【0005】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを得る方法は多くある。例えば、ＵＳ４３１０４６７では２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの分離精製方法が報告され、ＣＮ１０３４４３０１Ｂでは光化学反応による２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの製造方法が報告され、ＣＮ１０３８９８００４Ａでは発酵による２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの製造方法が報告され、ＵＳ３５６５９２４では２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの生産方法が報告される。また関連の研究では、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールは飼料で有効成分として利用できることが報告される。しかしながら、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性試験より分かるように、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性が悪く、含有量が９９．２３％の２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを２５℃で１か月間静置した後、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの含有量は６５．０３％に低下した。したがって、関連の製剤の生産、保管及び使用を容易にし、その生物学的効果を利用するために、どのようにして２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性を高めることができるかは、本分野で早急に解決すべき課題になる。

【0006】

しかしながら、これまでに２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物に関する報告が見られず、遊離の２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを原料とする２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物の製造方法を記載する文献もない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、上記の問題に鑑みてなされるもので、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶、その製造方法及びそれを用いたマイクロエマルションが提供される。２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性を効果的に高めることができ、関連の製剤の生産、保管により有利で、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの生物学的特性を効果的に利用することに一層役立つ。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明によれば、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶が提供される。前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶のＸ線粉末回折パターンは、下記表に示すピークを含む。

【0009】

【表1】

【0010】

なお、一般的には、Ｘ線粉末回折により結晶の測定を行う場合は、測定装置、測定条件等が異なるため、パターンのピークには小さな誤差が出る可能性があり、このため、本発明の結晶のパターンは上記のピーク以外にも他のピークを含んでもよい。ここで、本発明で測定条件は、Ｃｕ Ｋα線で、管電圧が４０ｋＶ、管電流４０ｍＡである。図１は本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物のＸＲＰＤパターンである。図１でＸ線回折計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ａｄｖａｎｃｅ）の動作パラメータは次のとおりである。
Ｃｕ Ｋα線で、線管電圧は４０ｋＶであり、管電流は４０ｍＡであり、スキャン方式は固定カップリングであり、ステップ幅は０．０２°であり、スキャン範囲は３°～４０°であり、スキャン速度は１ｓ／ステップである。

【0011】

安定性試験を行ったところ、２５℃の開放状態で本発明の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を６か月間静置した後、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶における２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの質量含有量は９６．５９％であることから、本発明の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶は性質が安定しており、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性が効果的に改善されることができることが示される。

【0012】

さらに、本発明に係る２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶は、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液が水と反応して得られる。前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液は２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを有機溶媒に溶解して得られる。

【0013】

当該２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶は２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液が水和反応によって得られた生成物である。前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液は２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを有機溶媒に溶解して得られる。本発明において、原料２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの由来は限定されず、市販されるものであってもよいし、事前に調製したものであってもよい。

【0014】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液を調製するために用いる上記の有機溶媒はエーテル系溶媒、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒及び塩素化炭化水素系溶媒から選ばれる１種又は複数種であってよい。なお、エーテル系溶媒はテトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフランを含むが、これらに限定されるものではなく、アルコール系溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノールを含むが、これらに限定されるものではなく、ケトン系溶媒はアセトン、メチルエチルケトンを含むが、これらに限定されるものではなく、塩素化炭化水素系溶媒はジクロロメタン、クロロホルム等を含むが、これらに限定されるものではない。本発明において、当該有機溶媒が上記の溶媒からなる混合溶媒である場合には、各種の溶媒の比率は限定されるものではない。また、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液を調製する時は、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールと有機溶媒の質量体積比は１ｇ：１００ｍｌであり、好ましくは１ｇ：５～４０ｍｌであり、より好ましくは１ｇ：５～２０ｍｌである。

【0015】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液が水と反応することで２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を製造することについては、本発明で２５－ヒドロキシコレカルシフェロールと水の反応モル比が限定されるものではなく、１：（０．６～２０００）であってよく、好ましくは１：（０．８～１．５）であり、より好ましくは１：（１～１．２）である。２５－ヒドロキシコレカルシフェロールのモル量が水のモル量より大きい場合に、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の収率は非常に低い。２５－ヒドロキシコレカルシフェロールのモル量が水のモル量より小さい場合に、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の収率は明らかに上がる。なお、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールには水と結合する部位が１か所だけなので、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールのモル量が水のモル量より小さい場合にも、生成物は２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶で変わらず、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの多水和物にはならない。

【0016】

本発明によれば、さらに、上記の任意の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法が提供される。次のステップを含む。
１）２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを有機溶媒に加え、加熱して還流させ、前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロールが溶解すると、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液を得る。
２）前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液に水を加えて固体が析出すると、前記２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を得る。

【0017】

具体的には、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを有機溶媒に加えた後、反応系を加熱して、有機溶媒が還流して２５－ヒドロキシコレカルシフェロールが溶解する。当該有機溶媒は上記のエーテル系溶媒、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒及び塩素化炭化水素系溶媒から選ばれる１種又は複数種であってよい。２５－ヒドロキシコレカルシフェロールが溶解した後、加熱を停止した状態で引き続き攪拌し、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール溶液に白色の固体が析出するまで徐々に水を加え、水を加えるのが終わり、且つ反応系の温度が室温に下がると、引き続き２～５時間攪拌する。

【0018】

攪拌が完了した後、反応系に対し固液分離を行い、具体的には遠心分離又は濾過の方法でケークを集め、ケークを乾燥させてもよい。結晶水が２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶から離脱するのを避けるために、乾燥温度を１００℃以下に設定してよく、好ましくは２０～９０℃であり、より好ましくは３０～８０℃である。乾燥の方式は常圧乾燥であってよく、乾燥温度が低い場合には乾燥効果をよくするために減圧乾燥を行ってもよい。本発明において、乾燥される程度に関しては特に限定されるものではなく、一般に水分は２０ｗｔ％未満とし、好ましくは水分は１０ｗｔ％未満とし、より好ましくは水分は５ｗｔ％未満とする。

【0019】

本発明に係る２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法はシンプルで、操作しやすい。当該方法で製造した２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶は安定性が高く、安定性試験を行ったところ、２５℃の開放状態で、本発明の製造方法で製造した２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を６か月間静置した後、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶における２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの質量含有量は９６．５９％である。

【0020】

本発明によれば、さらに、マイクロエマルションが提供される。当該マイクロエマルションは上記の任意の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を含む。２５－ヒドロキシコレカルシフェロールはメタノール、エタノール、ジメチルスルホキシドに易溶であり、ジエチルエーテルに微溶であり、水には実質的に不溶であるため、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを含むマイクロエマルションの水中の溶解度は非常に低く、このため、体内で効果的に吸収されるためにその溶解性を改善する必要がある。したがって、本発明において、安定性が高く水溶性に優れている２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を含むマイクロエマルションが提供される。

【0021】

さらに、重量パーセント含有量基準で、マイクロエマルションは成分として、上記の任意の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶０．０５～１．２５％、ポリソルベート６０ １０～１５％、ステアロイル乳酸ナトリウム６～１２％、スパン８０ ３～５％、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール１～２．５％、ソルビン酸０．２～１％、プロピレングリコール４～７％、水５６．２５～７５．７５％を含む。

【0022】

さらに、重量パーセント含有量基準で、マイクロエマルションは成分として、上記の任意の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶０．１２５％、ポリソルベート６０ １２％、ステアロイル乳酸ナトリウム８％、スパン８０ ４％、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール２．５％、ソルビン酸１％、プロピレングリコール７％、水６５．３７５％を含む。

【0023】

本発明に係るマイクロエマルションはナノオーダーのものであり得る。具体的には、その平均粒子径は８４～９１ｎｍであり、封入率は８５～８９％であり得る。封入率とは、リポソーム懸濁液における被封入物質（例えば、特定の遊離薬物）の薬物総量に占めるパーセンテージである。それはリポソーム及びナノ粒子の品質管理における一つの重要な指標であり、薬物が担体によって封入される度合いを反映している。封入率にはパーセント封入率と被覆容積の測定が含まれる。一般に封入率（ＥＮ％）の計算式は次の数式１に示すとおりである。
ＥＮ％＝（１－Ｃｆ／Ｃｔ）×１００％
式１中、Ｃｆは被封入物質（遊離薬物）の量であり、Ｃｔはナノ粒子、又はリポソーム懸濁液における薬物の総量である。

【0024】

本発明によれば、さらに、上記の任意のマイクロエマルションの製造方法が提供される。次のステップを含む。
１）重量パーセント含有量基準で、０．０５～１．２５％の上記の任意の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶、１０～１５％のポリソルベート６０、６～１２％のステアロイル乳酸ナトリウム、３～５％のスパン８０、１～２．５％の２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノールを混合して、４５～５５℃に加熱して完全に溶解させ、ボルテックスシェーカーを用いて振盪して均一になると、第１反応液を生成する。
２）室温において、重量パーセント含有量基準で、４～７％のプロピレングリコールと０．２～１％のソルビン酸を５６．２５～７５．７５％の水に溶解し攪拌して均一になると、第２反応液を生成する。
３）前記第１反応液と前記第２反応液を混合して、ボルテックスシェーカーを用いて振盪し均一になると、前記マイクロエマルションを得る。

【0025】

一般には、ボルテックスシェーカーで１０～１５分間振盪すれば、各成分が均一に混合されることを確保することができる。

【0026】

本発明によれば、さらに、飼料添加剤における上記の任意のマイクロエマルションの用途が提供される。当該マイクロエマルションを飼料添加剤として用いる場合に、家畜と家禽の体内におけるビタミンＤ_３の代謝時間が短縮され、カルシウム・リン元素の吸収と再吸収が促されることができ、我が国で２５－ヒドロキシコレカルシフェロールは飼料添加剤として利用されていないという現状を変える。

【0027】

本発明によれば、さらに、上記の任意のマイクロエマルションを含む飼料が提供される。当該飼料は家畜と家禽の体内におけるカルシウム・リン元素の吸収を効果的に促すことができ、家畜と家禽の健やかな成長に役立つものである。

【発明の効果】

【0028】

本発明の実施により、少なくとも以下の利点が得られる。
１．本発明の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶は２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物の新たな結晶形である。

【0029】

２．本発明の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶は安定性に優れており、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性がある程度改善されており、関連の製剤の生産、保管及び使用に役立つものであり、優れる包括的な使いやすさを有しており、幅広い利用が見込まれる。

【0030】

３．本発明に係る２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造方法は操作しやすく、コントロールも容易であり、反応条件が温和で、プロセスは安定的であり、再現性に優れており、製品の品質が安定しているため、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の産業的な大量生産に適する。

【0031】

４．本発明に係るマイクロエマルションは安定性に優れている２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を含み、水溶性に優れており、適用範囲が広い。

【0032】

５．本発明は革新的に２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を含むマイクロエマルションを飼料生産分野に利用し、これにより家畜と家禽の体内におけるカルシウム・リン元素の吸収を促すことができ、家畜と家禽の健やかな成長に役立つものである。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１は、本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶のＸＲＰＤパターンである。

【図2】図２は、本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の原子構造図である。

【図3】図３は、本発明の実施例２で製造されたマイクロエマルションと対照例のマイクロエマルションの安定性試験の曲線図である。

【図4】図４は、本発明の実施例３で製造されたマイクロエマルションと対照例のマイクロエマルションの安定性試験の曲線図である。

【図5】図５は、本発明の実施例４で製造されたマイクロエマルションと対照例のマイクロエマルションの安定性試験の曲線図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

次に、本発明の目的、技術的解決手段及び利点を一層明瞭なものにすべく、本発明の図面と実施例を用いて、本発明の実施例に係る技術的解決手段を分かりやすく完全に説明する。言うまでもないが、説明される実施例は本発明の実施例の一部に過ぎず、全ての実施例ではない。当業者が本発明の実施例に基づいて進歩性のある作業をすることなく他の実施例を得る場合は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。

【0035】

（実施例１）
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の製造：
製造方法は具体的に次のステップを含む。
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール１ｋｇをアセトン２００ｍＬに加え、攪拌しながら加熱して還流させ、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールが完全に溶解したら、徐々に水２００ｍＬを滴加し、白色の固体が析出したら、加熱を停止して引き続き３時間攪拌し、常圧で濾過してケークを集め、ケークを６０℃で１０時間乾燥させることにより、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を得る。発明者は当該実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶に対して次の測定を行った。

【0036】

１．カールフィッシャー滴定法で測定して、本実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶で水分は４．５％である。
２．Ｘ線回折計Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ Ａｄｖａｎｃｅを利用して、本実施例の２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶に対して通常のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）を行う。測定条件は、Ｃｕ Ｋα線で、管電圧４０ｋＶ、管電流４０ｍＡである。図１は、本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶のＸＲＰＤパターンで、表１は本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶のＸＲＰＤパターンに関連するデータである。

【0037】

【表2】

【0038】

図１と表１では、本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の組成が検証され、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの結晶形を特定するデータが記載されている。

【0039】

３．また、本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の原子構造分析も行われており、結果を図２に示す。図２は、本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の原子構造図である。図２から分かるように、本発明の実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶において、３－ヒドロキシ基に接続された６員環はいす形配座で、しかも３－ヒドロキシ基と６員環をつなげた結合はエクアトリアル結合である。

【0040】

４．元素分析装置を利用して本実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶に対して元素分析を行う。Ｃ元素の含有量は７７．２２％で、水素元素の含有量は１１．１０％である。２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶の分子式から算出されたＣ元素の含有量は７７．４６％で、水素元素の含有量は１１．０８％である。

【0041】

したがって、元素分析の結果から、本実施例で得た生成物は２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶であることが示される。

【0042】

５．本実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶に対し、それぞれ水素核ＮＭＲ、炭素核ＮＭＲ、エレクトロスプレー質量分析を行う。結果データは以下のとおりである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：６．２２（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ，６－ＣＨ），６．０５（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ，７－ＣＨ），５．０８（ｓ，１Ｈ，１９－ＣＨ），４．８１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ，１９－ＣＨ），３．９６（ｍ，１Ｈ，３－ＣＨ），２．８０－２．８５（ｍ，１Ｈ），２．５５－２．５８（ｍ，１Ｈ），２．３９－２．４３（ｍ，１Ｈ），２．２９（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１３．０Ｈｚ，１Ｈ），２．１５－２．２３（ｍ，１Ｈ），１．２２－２．０２（ｍ，２２Ｈ），１．２３（ｓ，６Ｈ），０．９４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ，２１－ＣＨ_３），０．５５（ｓ，３Ｈ，１８－ＣＨ_３）。
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１４４．９５，１４２．３９，１３４．９９，１２２．４０，１１７．４０，１１２．５１，７１．１８，６９．１５，５６．３３，５６．２３，４５．８１，４５．７８，４４．３０，４０．４０，３６．２８，３６．０９，３５．０５，３１．８８，２９．３１，２９．１４，２８．９５，２７．６６，２３．５２，２２．１９，２０．７１，１８．７６，１１．９６。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２３．３７［Ｍ＋Ｎａ］^＋，８２３．７８［２Ｍ＋Ｎａ］^＋。

【0043】

６．安定性試験
２５℃の開放状態で、本実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶を静置し、１か月、３か月、６か月後にそれぞれ２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの含有量を測定し、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールを対照例として、結果を表２に示す。

【0044】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの含有量の検出方法は以下のとおりである。サンプルを採取して約１０μｇ／ｍＬの溶液を調製し、２０μＬを使用してＨＰＬＣにより分析し、外部標準法により含有量を算出する。

【0045】

ＨＰＬＣ検出の条件は以下のとおりである。
クロマトグラフィーカラムにＣ１８カラムを使用し、内径は４．６ｍｍであり、長さは１５０ｍｍであり、粒度は５μｍである。
検出波長は２６５ｎｍである。
カラム温度は３０℃である。
流速は１．５ｍＬ／ｍｉｎである（理想的な保持時間及び２５－ヒドロキシコレカルシフェロールと２５－ヒドロキシコレカルシフェロール前駆体の分離度を得るように、調整することができる）。
サンプル量は２０μＬである。
記録時間はメインピーク保持時間の２倍である。

【0046】

【表3】

【0047】

表２から分かるように、本実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶は安定性に優れており、２５℃の開放状態で６か月間静置した後、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールはほぼ損失されていない。

【0048】

（実施例２）
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションの製造：
製造方法は具体的に次のステップを含む。
１）原料用意
実施例１で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶０．０５５ｋｇ、ポリソルベート６０ １０ｋｇ、ステアロイル乳酸ナトリウム１０ｋｇ、スパン８０ ５ｋｇ、ＢＨＴ １ｋｇ、プロピレングリコール４ｋｇ、ソルビン酸０．２ｋｇ、水６９．７５ｋｇ。

【0049】

２）第１反応液の調製
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶をポリソルベート６０、ステアロイル乳酸ナトリウム、スパン８０、ＢＨＴと混合し、５０℃に加熱して完全に溶解させて、ボルテックスシェーカーで１０分間ボルテックス振盪して、第１反応液を生成する。

【0050】

３）第２反応液の調製
室温において、プロピレングリコールとソルビン酸を水に溶解し、均一に攪拌して、第２反応液を生成する。

【0051】

４）混合
第１反応液と第２反応液を混合し、ボルテックスシェーカーで１０分間ボルテックス振盪して、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションを得る。当該マイクロエマルションにおける２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物の質量パーセント含有量は０．０５５％である。

【0052】

検出した結果、当該実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションは粒径が８４ｎｍであり、封入率が８９％である。

【0053】

２５℃で、本実施例で製造されたマイクロエマルションを密封して保存し、１か月、２か月、３か月、６か月後に、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの含有量を測定し、実施例と同じ手順で無水２５－ヒドロキシコレカルシフェロールから調製されたマイクロエマルションを対照例として、結果を図３に詳細に示す。図３は本発明の実施例２で製造されたマイクロエマルションと対照例のマイクロエマルションの安定性試験の曲線図である。図３に示す結果から、本実施例で製造されたマイクロエマルションは従来の技術で製造されたマイクロエマルションよりも明らかに安定性が優れることが示されている。

【0054】

２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの含有量の検出方法は以下のとおりである。安定性試験の最終日に、サンプルを採取して約１０μｇ／ｍＬ溶液を調製し、２０μＬを使用してＨＰＬＣにより分析し、外部標準法により含有量を算出する。

【0055】

ＨＰＬＣ検出の条件は以下のとおりである。
クロマトグラフィーカラムにＣ１８カラムを使用し、内径は４．６ｍｍであり、長さは１５０ｍｍであり、粒度は５μｍである。
検出波長は２６５ｎｍである。
カラム温度は３０℃である。
流速は１．５ｍＬ／ｍｉｎである（理想的な保持時間及び２５－ヒドロキシコレカルシフェロールと２５－ヒドロキシコレカルシフェロール前駆体の分離度を得るように、調整することができる）。
サンプル量は２０μＬである。
記録時間はメインピーク保持時間の２倍である。

【0056】

（実施例３）
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションの製造：
製造方法は具体的に次のステップを含む。
１）原料用意
実施例１で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶０．１３５ｋｇ（有効質量は０．１２５ｋｇ）、ポリソルベート６０ １２ｋｇ、ステアロイル乳酸ナトリウム８ｋｇ、スパン８０ ４ｋｇ、ＢＨＴ ２．５ｋｇ、プロピレングリコール７ｋｇ、ソルビン酸１ｋｇ、水６５．３７５ｋｇ。

【0057】

２）第１反応液の調製
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶をポリソルベート６０、ステアロイル乳酸ナトリウム、スパン８０、ＢＨＴと混合し、４５℃に加熱して完全に溶解させて、ボルテックスシェーカーで１５分間ボルテックス振盪して、第１反応液を生成する。

【0058】

３）第２反応液の調製
室温において、プロピレングリコールとソルビン酸を水に溶解し、均一に攪拌して、第２反応液を生成する。

【0059】

４）混合
第１反応液と第２反応液を混合し、ボルテックスシェーカーで１０分間ボルテックス振盪して、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションを得る。当該マイクロエマルションにおける２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物の質量パーセント含有量は０．１２５％である。

【0060】

検出した結果、当該実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションは粒径が８６ｎｍであり、封入率が８８％である。

【0061】

２５℃で、本実施例で製造されたマイクロエマルションを密封して保存し、１か月、２か月、３か月、６か月後に、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの含有量を測定し、実施例と同じ手順で無水２５－ヒドロキシコレカルシフェロールから調製されたマイクロエマルションを対照例として、結果を図４に詳細に示す。図４は本発明の実施例３で製造されたマイクロエマルションと対照例のマイクロエマルションの安定性試験の曲線図である。図４に示す結果から、本実施例で製造されたマイクロエマルションは従来の技術で製造されたマイクロエマルションよりも明らかに安定性が優れることが示されている。

【0062】

（実施例４）
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションの製造：
製造方法は具体的に次のステップを含む。
１）原料用意
実施例１で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶１．３０ｋｇ（有効質量は１．２５ｋｇ）、ポリソルベート６０ １５ｋｇ、ステアロイル乳酸ナトリウム１２ｋｇ、スパン８０ ５ｋｇ、ＢＨＴ ２．５ｋｇ、プロピレングリコール７ｋｇ、ソルビン酸１ｋｇ、水５６．２５ｋｇ。

【0063】

２）第１反応液の調製
２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物結晶をポリソルベート６０、ステアロイル乳酸ナトリウム、スパン８０、ＢＨＴと混合し、５５℃に加熱して完全に溶解させて、ボルテックスシェーカーで１０分間ボルテックス振盪して、第１反応液を生成する。

【0064】

３）第２反応液の調製
室温において、プロピレングリコールとソルビン酸を水に溶解し、均一に攪拌して、第２反応液を生成する。

【0065】

４）混合
第１反応液と第２反応液を混合し、ボルテックスシェーカーで１５分間ボルテックス振盪して、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションを得る。当該マイクロエマルションにおける２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物の質量パーセント含有量は１．２５％である。

【0066】

検出した結果、当該実施例で製造された２５－ヒドロキシコレカルシフェロール一水和物マイクロエマルションは粒径が９１ｎｍであり、封入率が８５％である。

【0067】

２５℃で、本実施例で製造されたマイクロエマルションを密封して保存し、１か月、２か月、３か月、６か月後に、２５－ヒドロキシコレカルシフェロールの含有量を測定し、実施例と同じ手順で無水２５－ヒドロキシコレカルシフェロールから調製されたマイクロエマルションを対照例として、結果を図５に詳細に示す。図５は本発明の実施例４で製造されたマイクロエマルションと対照例のマイクロエマルションの安定性試験の曲線図である。図５に示す結果から、本実施例で製造されたマイクロエマルションは従来の技術で製造されたマイクロエマルションよりも明らかに安定性が優れることが示されている。

【0068】

なお、上記の各実施例は本発明の技術的解決手段を説明するためのものに過ぎず、限定するものではない。上記の各実施例を参照して本発明を詳細に説明しているが、当業者であれば、なおも上記の各実施例に記載の技術的解決手段を修正し、又はその技術的特徴の一部又は全部に同等な差し替えを行うことができる。かかる修正又は差し替えにより、その対象になる技術的解決手段の本質が本発明の各実施例の技術的解決手段の範囲から逸脱することはない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】