特許 7073256 ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-13

(45)【発行日】2022-05-23

(54)【発明の名称】ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/747 20150101AFI20220516BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20220516BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 31/575 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 31/702 20060101ALI20220516BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20220516BHJP

【ＦＩ】

A61K35/747

A61P3/06

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K47/36

A61K47/12

A61K47/04

A61K9/48

A61K9/19

A61K47/26

A61K47/46

A61K31/575

A61K31/702

A23L33/135

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2018517343

(86)(22)【出願日】2016-11-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2018-11-01

(86)【国際出願番号】 GB2016053389

(87)【国際公開番号】W WO2017077285

(87)【国際公開日】2017-05-11

【審査請求日】2019-11-05

(31)【優先権主張番号】1519326.1

(32)【優先日】2015-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

【微生物の受託番号】NCTC  ECGC13110402

(73)【特許権者】

【識別番号】516128485

【氏名又は名称】オプティバイオティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(74)【代理人】

【識別番号】100202577

【弁理士】

【氏名又は名称】林 浩

(72)【発明者】

【氏名】オハラ ステファン パトリック

【審査官】井上 能宏

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０６７９４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０６７９４８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

個体における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの低減において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物。

【請求項2】

個体における上昇した低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの処置において使用するための、または、個体における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの上昇の予防において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物。

【請求項3】

前記ラクトバチルス・プランタルムが、用量あたり１×１０^５～１×１０^１２細胞の範囲内の量で存在する、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ラクトバチルス・プランタルムが、用量あたり１×１０^８～１×１０^１０細胞の範囲内の量で存在する、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記ラクトバチルス・プランタルムが、用量あたり約１．８×１０^９細胞を与える活性株約１２０ｍｇの量で存在する、請求項３に記載の組成物。

【請求項6】

以下の物質、トウモロコシデンプン、ステアリン酸マグネシウム、および二酸化ケイ素のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

１日２回の投与のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

カプセル化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記ラクトバチルス・プランタルムが濃縮された形態および／または凍結乾燥された形態にある、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、酸化防止剤、充填剤材料、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の活性成分をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記充填剤材料が、マルトデキストリン、スクロース、またはベータグルカンのうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

以下の物質、スタチン、ステロール、および／またはスタノールのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

オリゴ糖をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記オリゴ糖が、酵素反応により、前記ラクトバチルス・プランタルムの株によって生産される、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記オリゴ糖がガラクト－オリゴ糖（ＧＯＳ）を含む、請求項１３または１４に記載の組成物。

【請求項16】

１日１回または２回、用量あたり１×１０^５～１０^１２細胞の範囲内の量で投与される、
個体における上昇した低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルを処置する方法において使用するための、または、個体における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの上昇を予防する方法において使用するための、
ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、またはその１つもしくは複数の変異株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コレステロールの処置、予防または制御において使用するためのラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

心血管疾患（ＣＶＤ：ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）は世界的に死因の第１位である。世界保健機関（ＷＨＯ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）は、２０２０年までに、すべてのヒトの死の最大４０％がＣＶＤに関係することになると予測している。上昇した血中コレステロールレベル、特に低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ：ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の増大したレベルは、ＣＶＤおよび冠動脈疾患（ＣＡＤ：ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）にとって既知の危険因子である。それゆえに、コレステロールレベル、特にＬＤＬ－Ｃレベルを低減し、制御するための治療法が、さかんに研究されている。

【0003】

現在使用されているコレステロール降下療法の大部分はスタチンである。しかし、スタチンにはコンプライアンスに影響を及ぼすさまざまな不耐性および安全性の懸念があり、またスタチンは高価である。スタチンの可能な代替物として植物ステロールおよび植物スタノールが調査されている。しかし、７％～１０．５％のＬＤＬ－Ｃの平均低減を達成するには、これらの物質を、ティースプーン３～４杯と、多量に服用する必要がある。植物ステロールおよび植物スタノールは高価なので、これは問題である。

【0004】

それゆえに、血中コレステロールプロファイルを改良するためのプロバイオティクスなどの非薬物療法への関心も高まっている。いくつかの研究が、脂質、グルコース、およびエネルギー代謝の調節におけるシグナリング分子としての胆汁酸の役割を同定している。胆汁酸は、食事性脂肪および食事性コレステロールを循環へと輸送する。胆汁酸調節因子を調節することによるコレステロールレベルの低減における微生物株の使用は公知である。胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ：Ｂｉｌｅ Ｓａｌｔ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）活性プロバイオティクスは管腔内胆汁酸脱抱合を増加させて、増加した循環脱抱合型胆汁酸塩レベルをもたらすことが、ヒトおよび動物研究において示されている。胆汁酸は腸内で脱抱合されるので、食事性および胆汁性コレステロールの吸収が低減し、胆汁の再循環が改変されて、より良好な血中（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの制御をもたらす。いくつかの研究が、市販ヨーグルト中のプロバイオティクスを試験して、その脂質降下効果を示している。

【0005】

特許文献１では、高上部胃腸生残特徴を持つＢＳＨ活性プロバイオティクスとして、ラクトバチルス・プランタルム株が提唱されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】国際公開第２０１５／０６７９４７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

高コレステロールのための改良された処置または代替的処置を提供することが、本発明の目的である。個体におけるコレステロールレベルを処置し、予防し、または他の形で制御する方法を提供することも、本発明の目的である。個体におけるコレステロールレベルを低減するために使用することができるプロバイオティック組成物を提供することは、本発明のさらなる目的である。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１態様では、個体における総コレステロール（ＴＣ：ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）レベルおよび低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの低減または調整において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物が提供される。

【0009】

本発明の第２態様では、個体における上昇した総コレステロール（ＴＣ）レベルおよび低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの管理、処置または予防において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物が提供される。

【0010】

本発明の第３態様では、個体における高コレステロール血症の管理、処置または予防において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を含む組成物が提供される。

【0011】

本発明の第４態様では、高コレステロール血症の処置または予防のための医薬品の製造において使用するためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）が提供される。

【0012】

本発明の第５態様では、高コレステロール血症の処置または予防方法におけるラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）が提供される。

【0013】

本発明の第６態様では、高コレステロール血症の管理、処置または予防のための栄養補助食品（ｆｏｏｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）または食品材料の製造において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）が提供される。

【0014】

関連する態様において、高コレステロール血症は軽度高コレステロール血症であることが好ましい。

【0015】

好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）は１０^５ｃｆｕ～１０^１２ｃｆｕの範囲内の量で個体に投与されるであろう。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）は１０^８ｃｆｕ～１０^１０ｃｆｕの範囲内の量でありうる。ただし、個体の状態に応じて異なる投与量が投与されうることは理解されるであろう。最も好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、約１．８×１０^９ｃｆｕを与える活性株約１２０ｍｇの量である。

【0016】

本組成物は、剤形の製造および摂取後のその破壊に必要な賦形剤を、さらに含みうる。本組成物は崩壊剤、結合剤、潤滑剤および流動促進剤をさらに含みうる。

【0017】

本組成物は、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、デンプングリコール酸ナトリウムおよびカルボキシメチルセルロースから選択される１つ以上の崩壊剤を、さらに含みうる。

【0018】

本組成物は、デンプン、サッカライド、セルロース、糖アルコール、ゼラチン、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールから選択される１つ以上の結合剤を、さらに含みうる。好ましくは、本組成物はトウモロコシデンプンをさらに含む。

【0019】

本組成物は、タルク、炭酸マグネシウム、ヒュームドシリカおよび二酸化ケイ素から選択される１つ以上の流動促進剤を、さらに含みうる。好ましくは、本組成物は二酸化ケイ素をさらに含む。

【0020】

本組成物は、ステアリン酸、植物性ステアリンおよびステアリン酸マグネシウムから選択される１つ以上の潤滑剤をさらに含みうる。好ましくは、本組成物はステアリン酸マグネシウムをさらに含む。

【0021】

投与頻度も個体の状態に依存するであろうが、好ましくは、本組成物は１日２回投与されるであろう。

【0022】

本組成物は１日のうちのいつ投与されてもよい。しかし好ましくは、本組成物は食前に投与される。

【0023】

本組成物が、例えば粉末、錠剤、またはカプセル剤の形態など、容易に投与される任意の形態をとりうることは、当業者には理解されるであろう。あるいは、本組成物は食品材料または食品添加物の形態をとりうる。本組成物は、固形または液状の食品材料と混合することができる飲用可能な流動体、スプレッドおよび／または粉末の形態をとりうる。本組成物は、例えば食品／飲料に配合されるまたは食品／飲料と並行して消費される、健康補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として使用することができるであろう。

【0024】

本組成物は、腸環境での、成分のうちの１つ以上の放出プロファイルを修飾するための賦形剤または担体化合物を、さらに含みうる。放出は、コレステロール吸収を低減するのに最も適当な時間に起こるべきである。典型的には、培養物は、それが小腸の腸細胞に到達するまでは、比較的完全な形で生き残らなければならない。

【0025】

本組成物はカプセル化することができる。数多くのカプセル化技法が当業者には明らかであるだろう。そして使用されるカプセル化技法は、消化管通過時に要求されるラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）の安定性に適合しているであろう。

【0026】

ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）は濃縮および／または凍結乾燥されうる。好都合なことに、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）は、パイロット規模の試験製造において優れた凍結乾燥生残性を示している。

【0027】

本組成物は、ビタミン、ミネラル、植物性化学物質、酸化防止剤、およびそれらの組合せから選択される１つ以上の活性成分を、さらに含みうる。

【0028】

ビタミンは、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンなどの脂溶性ビタミン、ならびにそれらの組合せを包含しうる。いくつかの実施形態において、ビタミンは、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ群（チアミン、すなわちＢ１、リボフラビン（ｒｉｂｏｆｌａｖｏｉｎ）、すなわちＢ２５、ナイアシン、すなわちＢ３、ピリドキシン、すなわちＢ６、葉酸、すなわちＢ９、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌｉｍｉｎ）、すなわちＢ１２、パントテン酸、ビオチン）などの水溶性ビタミン、ならびにそれらの組合せを包含しうる。

【0029】

ミネラルは、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組合せを包含しうるが、これらに限定されるわけではない。

【0030】

酸化防止剤は、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リン酸ビタミンＥ、トコフェロール、リン酸ジ－アルファ－トコフェリル、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ－カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド（ｆｉａｖｏｎｏｉｄ）、およびそれらの混合物を包含しうるが、これらに限定されるわけではない。

【0031】

植物性化学物質は、カロテノイド（ｃａｒｔｏｔｅｎｏｉｄ）、クロロフィル、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン（ａｎｔｈｏｃｙａｍｎ）、シアン化物（ｃｙａｎｉｄｉｎｇ）、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｉｌｏｃａｔｅｃｈｉｎｇａｌｌａｔｅ）、テアフラビン、テアルビジン、プロアントシアニン、フラボノール、ケルセチン、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラボノンヘスペレチン（ｆｌａｖｏｎｏｎｅｓｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、フィトエストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、大豆イソフラボン、およびそれらの混合物を包含しうるが、これらに限定されるわけではない。

【0032】

本組成物は、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）に特に適合しているプレバイオティクスを含みうる。本プレバイオティクスは、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）の成長および生残性を選択的に高めうる。

【0033】

本組成物は１つ以上の充填剤をさらに含みうる。本組成物は、以下から選択される１つ以上の充填剤を、さらに含みうる：マルトデキストリン、スクロース、またはコレステロール低減能を持つ充填剤。好ましくは、本組成物は、コレステロールを低減することで本組成物中の他の賦形剤のコレステロール低減／制御機能を協同的に強化することができるベータグルカンを、さらに含む。

【0034】

本組成物は、１つ以上のスタチン、ステロールおよび／またはスタノールと共に投与されうる。好都合なことに、公知のコレステロール降下治療薬との共投与は、強化されたコレステロールの低減および／または制御をもたらすことができる。植物ステロールは、アテローム性プラークの一部ならびに植物ステロールおよび植物スタノールの長期使用者の網膜に見いだされている血清中植物ステロールのレベルを増加させることが示されている。ＢＳＨ活性プロバイオティック細菌は、循環コレステロールおよび循環植物ステロールを低減することが示されている。それゆえに、植物ステロールとＢＳＨ活性プロバイオティクスとの組合せは、コレステロールレベルを低減／制御し、植物ステロールの血清中レベルを低減して、ステロール製品の安全性プロファイルを有利に改良することができる。機構上、ＢＳＨ活性細菌は、胆汁酸塩脱抱合を増加させステロール吸収を低減するので、スタチンと補完的に働いて、ＬＤＬ受容体活性および血清コレステロールのクリアランスを増幅するはずである。それゆえに、ＢＳＨ活性プロバイオティクスとスタチンの共投与は、より大きな血清中ＬＤＬ－Ｃの低減をもたらすことで、スタチン投与量の低減を可能にし、よってコストおよび副作用を低減し、患者コンプライアンスを改善できる可能性がある。

【0035】

好ましくは、本組成物は４℃以下で保存される。この温度範囲では細菌の成長が安定化するので、組成物の安定性が保証される。

【0036】

本組成物は、ラクトバチルス・プランタルムの株の成長に特異的なプレバイオティック成長培地を、さらに含みうる。プレバイオティック成長培地は、好ましくは、逆酵素反応により、ラクトバチルス・プランタルムの株によって生産されうるであろう。この酵素は、糖分解酵素またはグリコシダーゼ酵素を含みうる。これらの糖分解酵素またはグリコシダーゼ酵素は細菌または真菌に由来しうる。

【0037】

プレバイオティック成長培地は、ガラクト－オリゴ糖（ｇａｌａｃｔｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｈａｒｉｄｅ）（ＧＯＳ）、グルコ－オリゴ糖（ｇｌｕｃｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｈａｒｉｄｅ）、またはフルクト－オリゴ糖（ＦＯＳ）などのオリゴ糖を、さまざまな濃度で含みうる。オリゴ糖の形態は、本株のβ－ガラクトシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－およびβ－グルコシダーゼ、α－マンノシダーゼ、ならびにβ－キシロシダーゼの逆反応によって生産される形態と実質的に同じであることが好ましい。

【0038】

プレバイオティック成長培地は、安全性、耐性、および貯蔵寿命に悪影響を及ぼすことなく腸内で本株の最適な成長および生残をもたらす量で存在しうる。

【0039】

本発明のさらなる一態様によれば、１日２回、１×１０^５～１０^１２細胞の範囲内の量で投与される、高コレステロール血症を予防し、処置し、または調整する方法において使用するための、ラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、またはその１つもしくは複数の変異株が提供される。

【0040】

より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、１×１０^８～１×１０^１０細胞の範囲内の量で投与されうる。最も好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは約１．８×１０^９細胞の量で投与される。ラクトバチルス・プランタルムが活性株約１２０ｍｇの量で投与されることも好ましい。

【0041】

ラクトバチルス・プランタルムは、朝食および夕食の直前、食中、または食後に投与されうる。好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、朝食および夕食の直前に投与される。

【0042】

ラクトバチルス・プランタルムは、薬として、または健康補助食品として、投与されうる。

【0043】

ラクトバチルス・プランタルムは凍結乾燥された形態をとりうる。

【0044】

ラクトバチルス・プランタルムは、１つ以上の追加コレステロール降下成分と共に投与されうる。そのような成分はスタチン、ステロールおよび／またはスタノールを含みうる。さらにまた、ラクトバチルス・プランタルムは、１つ以上のプロバイオティクスおよび／またはプレバイオティクスと共に投与されうる。ラクトバチルス・プランタルムは、ラクトバチルス・プランタルムの株の成長に特異的なプレバイオティック成長培地と組み合わせて投与されうる。プレバイオティック成長培地は、好ましくは、逆酵素反応により、ラクトバチルス・プランタルムの株によって生産されうるであろう。プレバイオティック成長培地はオリゴ糖を含むことができ、そのオリゴ糖は好ましくはガラクト－オリゴ糖（ＧＯＳ）を含むであろう。

【0045】

好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムは、投与前は４℃以下で保存される。

【0046】

本発明のさらなる一態様によれば、医薬品または栄養補助食品の調製において使用するためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を生産する方法であって、
ａ）培養ブロスを生産するのに十分な条件下でラクトバチルス・プランタルムを発酵させる工程、
ｂ）ラクトバチルス・プランタルム細胞の濃縮物が形成されるように培養ブロスからラクトバチルス・プランタルムを濃縮する工程、
ｃ）混合物が形成されるように濃縮物を凍結保護物質にさらす工程、および
ｄ）混合物を凍結乾燥する工程
を含む方法が提供される。

【0047】

上述の方法によるラクトバチルス・プランタルム細胞の凍結乾燥に関する生残率は７０％超である。さらにまた、好都合なことに、本方法はラクトバチルス・プランタルム細胞を最大８×１０^１１ｃｆｕ／ｇの量で生産することが見いだされている。

【0048】

本方法は、当然、上述の組成物のためのラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）またはその１つもしくは複数の変異株を、さらに言えば上述のラクトバチルス・プランタルム２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）を、生産するのに適しているであろう。

【0049】

本発明のいくつかの態様に関して列挙した本組成物の特徴のうちのいくつかが、本方法において投与される組成物と交換可能であるだろうことは、当業者には明らかであるだろう。

【発明を実施するための形態】

【0050】

本発明の実施形態を、単なる例として、以下に説明する。

【0051】

ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２を含む製剤を４９人の軽度高コレステロール血症成人に投与することにより、安全性、コンプライアンスならびにコレステロールの低減および制御の程度を確立するために、ヒトボランティア試験を行った。この試験は、英国レディング大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｅａｄｉｎｇ）の食品栄養科学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、独立して実行された。この試験はヘルシンキ宣言に従って実行され、すべてのボランティアから文書によるインフォームドコンセントを得た。試験プロトコールはレディング大学の研究倫理委員会によって承認された。

【0052】

被験者は３０～６５歳の男女であった。被験者が直近６ヶ月以内の心血管イベントの既往を有している場合、甲状腺機能障害に関係する続発性異常脂質血症が存在する場合、被験者が過去３ヶ月間に脂質代謝に影響を及ぼす何らかの薬物を使用していた場合、被験者にアルコール乱用の経歴がある場合、被験者が過去６ヶ月間に抗生物質の投薬を受けていた場合、または被験者が直近の１ヶ月間にプレバイオティクス／プロバイオティック調製物を摂取していた場合、その被験者は除外した。

【0053】

本試験の開始に先だって、組み入れ基準を満たす被験者をスクリーニングした。ベースライン血液サンプルを採取し、被験者のＢＭＩおよび血圧を測定した。総合的健康状態を決定するために、スクリーニング血液サンプルを全血球数（ＦＢＣ：ｆｕｌｌ ｂｌｏｏｄ ｃｏｕｎｔ）および肝機能検査（ＬＦＴ：ｌｉｖｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ）について分析した。総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ：ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、空腹時トリアシルグリセロール（ＴＡＧ：ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）およびビタミンＤも測定した。胆汁酸ならびにメタゲノム研究およびメタボロミクス研究のために、尿、血液および糞便を収集した。

【0054】

この試験は単一施設前向き無作為化二重盲プラセボ対照並行群間治験であった。被験者を、プラセボまたはラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２による処置の２群に、ランダムに分配した。プラセボ群および処置群に、ブリスター包装されたＤＲ１カプセル剤を与えた。処置群には、１カプセルあたり１．８×１０^９細胞の用量をもたらす１２０ｍｇの活性ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２を与え、これを、１日１回、または１日２回、朝食時に１回および夜に１回、健康補助食品として投与した。参加者には、治験期間を通して日常の食事または身体活動を変えないように勧告した。習慣的食事を事前検証済みの５日間食事日記（週末２日および平日３日）によって評価した。

【0055】

活性製剤およびプラセボ製剤に関する製剤の詳細をそれぞれ下記表１および表２に示す。

【0056】

【表1】

【0057】

【表2】

【0058】

ボランティアを試験開始の２週間前に事前スクリーニングし、あらゆるプレ／プロバイオティクス摂取を差し控えるように勧告した。試験は処置期間（１２週）およびウォッシュアウト期間（４週）の二相からなった。この試験は、選抜時のベースライン来院、中間時点での来院、および処置期間の終了時点での来院（それぞれ０週目、６週目および１２週目）、ならびにウォッシュアウト期間後の４回目の来院（１６週目）を含んだ。

【0059】

初期分析セットでは、２つの群が十分に対応していることを保証するために、ベースラインでの人口統計的変数およびアウトカム変数を調べた。連続変数は対応のないｔ検定を使って分析し、一方、カテゴリー変数にはカイ二乗検定を使用した。

【0060】

２つの試験群間の試験アウトカムを、時点間の変化に関して分析した。ベースライン～中間点（０～６週）、中間点～終了点（６～１２週）、ベースライン～終了点（０～１２週）、および終了点～ウォッシュアウト（１２～１６週）の４つの試験期間を、アウトカムの変化について調べた。各分析のためのデータはその分析における２つの特定時点に限定した。分析は共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を使って行った。後者の時点をアウトカム変数として使用し、先の時点を共変量とみなした。このアプローチは、テスト群および対照群の可変的出発値を考慮するので、群間で経時的変化を単純に比較するより、数学的に好ましい。

【0061】

最初の分析セットでは、すべての試験参加者およびさまざまな患者サブグループを考慮した。これらのサブグループは、ベースライン総コレステロール（＜５ｍｍｏｌ／ｌ、５～５．９ｍｍｏｌ／ｌおよび≧６．０ｍｍｏｌ／ｌ）、性別ならびに年齢（＜５０歳、５０～５９歳、≧６０歳）に基づいた。

【0062】

この試験を通してボランティアによって報告された安全性、コンプライアンス、または耐性の問題はなかった。３人のボランティアは、無関係な病気のために抗生物質処置を受け、そのため以後の試験への参加から除外されることになったため、試験から離脱した。

【0063】

ボランティアには、試験の継続期間を通して毎日、胃腸症状日記に記入し、経験した有害作用があれば報告するように依頼した。腹痛、腹部膨満および鼓腸に関するＧＩ症状は、ボランティアにより、なし（０）、軽度（１）、中等度（２）、または重度（３）として記録された。ベースラインから１２週までの自己申告された胃腸（ＧＩ）症状の平均スコア（表３）は、１日あたりの便通または便硬度（ブリストル便性状チャート）において群間に有意差がないことを示した。活性剤群ではボランティアの１人が中等度の腹痛、腹部膨満および鼓腸を報告し、一方、プラセボ群では、２人のボランティアが中等度の鼓腸を報告した。ベースラインから１２週までの処置期間中に重度のＧＩ副作用を報告した試験参加者はなく、処置群間で便の形態および頻度に有意差は観察されなかった。他のボランティアは全員、症状なしと報告した。

【0064】

【表3】

【0065】

ベースライン特徴（総コレステロール、身体測定値、収縮期圧および拡張期圧）をプラセボ群（ｎ＝２３）と活性剤群（ｎ＝２３）との間で比較した。それらを下記表４に示す。これらの結果は、それらの人口統計（年齢、性別）に関して、またはベースラインでの脂質測定値もしくは身体測定値のいずれについても、２つの試験群間に有意差がないことを示唆した。

【0066】

【表4】

【0067】

試験中の脂質測定値の変化が、２つの試験群間でどのように異なるかを調べるために、独立した統計分析を行った。４対の時点間（０～６週、０～１２週、６～１２週、１２～１６週）の変化を調べた。別段の表示がある場合を除き、ベースラインと処置の終了時との間（０～１２週）のデータの分析だけを示す。他の時点間での臨床的または統計的に有意な差異は強調する。これらを表３～５に要約する。

【0068】

表５～７は、ベースラインおよび１２週における処置終了時での平均および標準偏差を示している。表５は、全被験者（ｎ＝４６）について、ベースラインから１２週までの脂質測定値の変化を示している。表６は、＜５ｍｍｏｌ／ｌのＴＣを持つ被験者（ｎ＝２３）について、ベースラインから１２週までの脂質測定値の変化を示している。表７は、５～５．９ｍｍｏｌ／ｌのＴＣを持つ被験者（ｎ＝１７）について、ベースラインから１２週までの脂質測定値の変化を示している。６．０＋ｍｍｏｌ／ｌについても分析を実行したが、この群には６人の被験者（活性３人、プラセボ３人）しか含まれていなかったので、適当な但し書きを付して、統計的有意差だけを報告する。

【0069】

ＡＮＣＯＶＡ分析による群差を平均差および対応する信頼区間で報告する。これらは、ベースライン値について調整して、活性剤群のアウトカムからプラセボ群のアウトカムを差し引いた値として報告されている結果の有意性を示すＰ値を報告する。

【0070】

ＴＣ濃度、ＬＤＬ－Ｃ濃度、ＨＤＬ－Ｃ濃度およびＴＡＧ濃度を、ｍｍｏｌ／ｌの単位で表す。

【0071】

群を、表５～７に示すようにベースラインコレステロールレベルに従って、また年齢（＜５０歳 ｎ＝１６；５０～５９歳 ｎ＝１８；≧６０歳，ｎ＝１２）および性別（女性＝３２、男性ｎ＝１４）に従って、層別化した。

【0072】

【表5】

【0073】

【表6】

【0074】

【表7】

【0075】

総コレステロール（ＴＣ）は、ベースラインから１２週までに、プラセボ群と比較して、すべての群において低減した（表５～７）。全被験者におけるＴＣレベルのベースライン調整値は、活性剤群ではプラセボ群と比較して０．１２ｍｍｏｌ／ｌ低く、２．３％の減少であった。ベースラインＴＣ濃度による層別化では、高ＴＣサブグループと中～低サブグループとの間の差異が明らかになった。ＴＣ＜５．０ｍｍｏｌ／ｌサブグループでは、ベースラインと処置終了時との間の変化が、活性剤群ではプラセボ群と比較して４．２％低かった（０．１９ｍｍｏｌ／ｌ低かった）。同様に、ＴＣ ５～５．９ｍｍｏｌ／ｌ群では、ベースライン調整処置終了時ＴＣ濃度が活性剤群では０．２３ｍｍｏｌ／ｌ低く、これは４．１７％の低減に相当した。ＴＣ≧６．０ｍｍｏｌ／ｌ（０～６週）群では、３６．７％の低減に相当する２．４４ｍｍｏｌ／ｌの統計的に有意な低減が、ＴＣに観察された（Ｐ＝０．０４５）（表５～７ではデータ省略）。しかし、この群のサイズは極めて小さいので（ｎ＝３プラセボ／３活性）、その統計的有意性にもかかわらず、群関連性（ｇｒｏｕｐ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）はこの効果に寄与しないはずである。ＴＣに対する性別の有意な効果は同定されなかった。大半の結果は統計的に有意でなかったが、プラセボと比較した場合に、活性剤処置群ではＴＣが減少するという、共通の群傾向があった。これらの結果は、ＴＣの初期レベルが高い患者は、他の患者よりも大きなＴＣの低減による恩恵を受けうることも示唆した。

【0076】

ＨＤＬ－Ｃは、プラセボ群でも活性剤群でも、ベースラインと１２週との間でわずかに増加した。可変的ベースラインについて調整すると、全被験者群およびＴＣ＜５ｍｍｏｌ／ｌ群ではＨＤＬ－Ｃ濃度が、プラセボと比較した場合に、活性剤群では０．０６ｍｍｏｌ／ｌ（４．５％）および０．０９ｍｍｏｌ／ｌ（７．４％）高かった。この差の大半は６～１２週期間に起こり、この期間では、全被験者群（ｐ＝０．０６）でもＴＣ＜５ｍｍｏｌ／ｌ群（ｐ＝０．０９）でも、統計的有意に近い差が見られた。この期間において、全被験者群およびＴＣ＜５ｍｍｏｌ／ｌ群は、プラセボ群と比較した場合に、それぞれ０．０９ｍｍｏｌ／ｌ（６．５％）および０．１０ｍｍｏｌ／ｌ（７．８％）のＨＤＬコレステロールレベルの平均増加を示した。

【0077】

年齢層別化では、６０＋群（ｎ＝１２）における統計的に有意な群差（ｐ＝０．０３）が明らかになり、この６０＋群では、プラセボ群と比較した場合に、ＨＤＬコレステロールが平均で０．２３ｍｍｏｌ／ｌ（＋１４．７％）増加した。ベースラインＴＣ濃度および性別による層別化では、ＨＤＬレベルに対する有意な処置効果は明らかにならなかった。

【0078】

ＬＤＬ－Ｃコレステロールは、すべての活性剤処置群において、ベースラインと１２週との間で低減した。この効果はプラセボ群では観察されなかった。

【0079】

可変的ベースラインについて調整すると、全被験者群ではＬＤＬ－Ｃ濃度が、プラセボと比較した場合に、平均で０．２４ｍｍｏｌ／ｌ（７．２％）低かった。ＴＣ＜５．０ｍｍｏｌ／ｌ群におけるＬＤＬ－Ｃ濃度は、活性剤群ではプラセボ群と比較して、０．３９ｍｍｏｌ／ｌ（１３．９％）有意に低かった（Ｐ＝０．０３）。これらの低減には臨床的意義および商業的意義がある。ＴＣ ５．０～５．９ｍｍｏｌ／ｌ群では、ＬＤＬ－Ｃが平均０．４７ｍｍｏｌ／ｌの減少（１３．１％）を示したが、これは統計的有意性に到達しなかった。ＬＤＬ低減効果は、０～６週期間と６～１２週期間の両方にわたって一貫して生じるようであった。これらの結果は、ＬＤＬコレステロールの初期レベルが高い患者は、他の患者よりも大きなＬＤＬ－Ｃの低減による恩恵を受けうることを示唆している。

【0080】

性別による層別化では、女性ボランティアにおいて、男性と比べてより顕著なＬＤＬ－Ｃ低減効果が明らかになった（ｐ＝０．０６）。活性剤群濃度は、女性の場合、プラセボと比較して０．４１ｍｍｏｌ／ｌ（１２．４％）低く、一方、活性剤男性群ではプラセボと比較して０．０６ｍｍｏｌ／ｌ（１．８％、Ｐ＝０．０６）の増加が観察された（Ｐ＝０．８３）。

【0081】

年齢による層別化は、年齢の増加に伴って増えるＬＤＬ－Ｃ濃度の減少を示した。＜５０歳群ではベースライン調整ＬＤＬ－Ｃ濃度にわずかな変化しか観察されなかった（０．０８ｍｍｏｌ／ｌの増加）。ＬＤＬ－Ｃの減少は、５０～５９群（０．４９ｍｍｏｌ／ｌ）および≧６０歳群（０．３１ｍｍｏｌ／ｌ）では、より顕著であり、プラセボと比較して活性剤群ではそれぞれ１５％および９．１４％の減少に相当した。

【0082】

全被験者群、ＴＣ≦５ｍｍｏｌ／ｌ群、またはＴＣ ５～５．９ｍｍｏｌ／ｌ群において、活性剤またはプラセボの摂取処置後に、トリアシルグリセリド（ｔｒｉａｃｙｌｇｙｃｅｒｉｄｅ）濃度に対する有意な効果は観察されなかった。年齢層別化は、６０＋群に、プラセボ群と活性剤群との間で、０．４８ｍｍｏｌ／ｌ（５３．９％）の統計的に有意な（ｐ＝０．００２）トリグリセリドの低減を示した。このトリグリセリドの大きな低減は、全テスト期間にわたって一貫しており、６～１２週期間では０．２６ｍｍｏｌ／ｌ（３２．９％）の統計的に有意な低減（ｐ＝０．０３）およびベースライン～６週期間では０．２８ｍｍｏｌ／ｌ（３１．４％、ｐ＝０．０７）の低減であった。

【0083】

ベースラインから１２週後の処置終了時までの身体測定値の変化を、プラセボ処置群および活性剤処置群の全被験者（ｎ＝４６）について、以下の表８に示す。表８には、ベースラインおよび１２週後に測定された各アウトカムについて、平均値および標準偏差が示されている。ＡＮＣＯＶＡ分析による群差も平均差および対応する信頼区間で示す。これらは、ベースライン値について調整して、活性剤群のアウトカムからプラセボ群のアウトカムを差し引いた値として報告されている。結果の有意性を示すＰ値を報告する。体重はｋｇ、ＢＭＩはｋｇ／ｍ^２、胴囲はｃｍの単位で表されている。

【0084】

【表8】

【0085】

ベースラインと１２週における処置終了時点との間で、体重、ＢＭＩおよび胴囲に関連する身体測定パラメータに、有意な変化は認められなかった。

【0086】

これらの結果は、ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２が、高コレステロール血症被験者および軽度高コレステロール血症被験者において、血中のＴＣおよびＬＤＬ－Ｃを低下させる可能性を有することを示している。

【0087】

活性ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２カプセル剤およびプラセボカプセル剤は、試験の継続期間を通して、４℃で保存した。試験のベースライン時、６週時および１２週時（処置の終了時）に製品安定性をチェックしたが、細菌数に有意な変化は観察されなかった。プラセボカプセル剤において細菌成長は検出されなかった。

【0088】

安全性パラメータの分析は、ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２消費の有害な作用を示さなかった。ラクトバチルス・プランタルムは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ：Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によってＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ：一般に安全と認められる）とみなされている広く使用されるプロバイオティクスであり、欧州食品基準庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｇｅｎｃｙ）による特定微生物の安全性推定（ＱＰＳ：Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ）指定を有する。これは、ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２が高コレステロール血症を処置するための安全で有効な処置である可能性を有することを示唆するものであるだろう。

【0089】

ラクトバチルス・プランタルムＥＣＧＣ１３１１０４０２に関して工業的スケールアップ実験も行った。以下の作業を行った：ａ）さまざまな低アレルギー性培地をチェックするために行われたフラスコテスト、ｂ）試験を行うための、１～５Ｌの発酵、少量の濃縮および凍結乾燥、ｃ）さまざまな凍結保護物質のテスト、ｄ）さまざまな凍結乾燥曲線のテスト、ｅ）８０Ｌでの発酵、濃縮および凍結乾燥。最終工程は８０Ｌ発酵槽での生産であり、これは、（ｉ）細胞数＞８×１０^１１ｃｆｕ／ｇ、（ｉｉ）Ａｗ：０．１１、（ｉｉｉ）いかなる賦形剤でも希釈／規格化されていない、凍結乾燥された、濃縮バイオマス量７００ｇをもたらした。それゆえにこの特定株は、製造上の観点から、極めて有望であると思われる。細胞の生残率は７０％超であることが見いだされ、収率は極めて高い１．２５％であった。

【0090】

上記の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定しようとするものではなく、むしろ本発明をどのように実施しうるかの例を記載するためのものである。

【0091】

生物の寄託
本願は、寄託された生物学的材料の以下の表示に関係する。
名称：欧州細胞カルチャーコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）
所在地：英国ＳＰ４ ０ＪＧソールズベリー、ポートンダウン、イングランド公衆衛生局ポートンダウン（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ＰＨＥカルチャー・コレクションズ（ＰＨＥ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）、微生物部門（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）
日付：２０１３年１１月４日
受託番号：１３１１０４０２