特許 7073333 免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-13

(45)【発行日】2022-05-23

(54)【発明の名称】免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセス

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20220516BHJP

   C07K 1/18 20060101ALI20220516BHJP

   C07K 1/30 20060101ALI20220516BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220516BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00

C07K1/18

C07K1/30

A61K39/395 X

A61K39/395 Y

【請求項の数】 27

(21)【出願番号】P 2019504003

(86)(22)【出願日】2017-07-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-09-12

(86)【国際出願番号】 EP2017068914

(87)【国際公開番号】W WO2018019898

(87)【国際公開日】2018-02-01

【審査請求日】2020-07-14

(31)【優先権主張番号】16181493.4

(32)【優先日】2016-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】595107379

【氏名又は名称】ビオテスト・アクチエンゲゼルシャフト

【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｔｅｓｔ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100165892

【弁理士】

【氏名又は名称】坂田 啓司

(72)【発明者】

【氏名】オリヴァー・マネーク

(72)【発明者】

【氏名】アヒム・ハンナッペル

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー・メーレンカンプ－レトガー

(72)【発明者】

【氏名】ヴォルフガング・メラー

(72)【発明者】

【氏名】ディーター・ルードニック

【審査官】山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２２８４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００１－５１３５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５００２６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５１７５１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５２８１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５２７２０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５０９５０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５２５４１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３１６３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０００－５１５８６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１３６２１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２７１６６９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／００５８９６１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許第０４２９６０２７（ＵＳ，Ａ）

【文献】Tanaka et al.，Brazillian Journal of Medical and Biological research，2000年，vol. 33，p. 27-30

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分から、医薬的に許容できる免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセスであって、以下のステップを含むプロセス：
（ａ）Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分を、懸濁液の電気伝導度を少なくとも１ｍＳ／ｃｍに調整する条件下で再懸濁して、該血漿由来免疫グロブリン画分に含有される免疫グロブリンを再可溶化し、再可溶化したＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡを含有する懸濁液を得ること；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた懸濁液中の夾雑タンパク質を沈殿させ、夾雑タンパク質を除去して、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を得ること;
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、ＩｇＭおよびＩｇＡを陰イオン交換樹脂に結合させるように調整したｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陰イオン交換樹脂を用いて、イオン交換クロマトグラフィーに供し、かつ、フロースルー画分中に、および／またはＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に結合したままである条件下で陰イオン交換樹脂からＩｇＧを溶出することによって、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ること；および
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陽イオン交換材料による処理に供し、ＩｇＧを回収して、プロパージン含量が低減されたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ること。

【請求項2】

（ｃ）ステップが、ＩｇＧも陰イオン交換樹脂に結合させるように調整したｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陰イオン交換樹脂を用いること、および／または
（ｃ）ステップにおいて、フロースルー画分中に、および／またはＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に結合したままである条件下で陰イオン交換樹脂からＩｇＧを溶出することによって、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ることに続いて、陰イオン交換樹脂からＩｇＭおよび／またはＩｇＡを溶出することによって、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物を得ることを更に含む、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

（ａ）Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分を、懸濁液の電気伝導度を少なくとも１ｍＳ／ｃｍに調整する条件下で再懸濁して、該血漿由来免疫グロブリン画分に含有される免疫グロブリンを再可溶化し、再可溶化したＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡを含有する懸濁液を得ること；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた懸濁液中の夾雑タンパク質を沈殿させ、夾雑タンパク質を除去して、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を得ること、ここで、夾雑タンパク質を沈殿させることは、ステップ（ａ）で得られた懸濁液をＣ７～Ｃ９のカルボン酸で処理することを含む；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、イオン交換クロマトグラフィーに供される各免疫グロブリンの量に基づき、ＩｇＭおよびＩｇＡのそれぞれの少なくとも９０重量％を、陰イオン交換樹脂に結合させるように調整したｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陰イオン交換樹脂を用いて、イオン交換クロマトグラフィーに供し、かつ、フロースルー画分中に、および／またはＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に結合したままである条件下で陰イオン交換樹脂からＩｇＧを溶出することによって、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ること；および
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陽イオン交換材料による処理に供し、ＩｇＧを回収して、プロパージン含量が低減されたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ること、
あるいは、
（ａ）Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分を、懸濁液の電気伝導度を少なくとも１ｍＳ／ｃｍに調整する条件下で再懸濁して、該血漿由来免疫グロブリン画分に含有される免疫グロブリンを再可溶化し、再可溶化したＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡを含有する懸濁液を得ること；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた懸濁液中の夾雑タンパク質を沈殿させ、夾雑タンパク質を除去して、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を得ること、ここで、夾雑タンパク質を沈殿させることは、ステップ（ａ）で得られた懸濁液をＣ７～Ｃ９のカルボン酸で処理することを含む；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、イオン交換クロマトグラフィーに供される各免疫グロブリンの量に基づき、ＩｇＭおよびＩｇＡ並びにＩｇＧのそれぞれの少なくとも９０重量％を、陰イオン交換樹脂に結合させるように調整したｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陰イオン交換樹脂を用いて、イオン交換クロマトグラフィーに供し、かつ、フロースルー画分中に、および／またはＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に結合したままである条件下で陰イオン交換樹脂からＩｇＧを溶出することによって、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ること、続いて、陰イオン交換樹脂からＩｇＭおよび／またはＩｇＡを溶出することによって、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物を得ること；および
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陽イオン交換材料による処理に供し、ＩｇＧを回収して、プロパージン含量が低減されたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ること
のステップを含む、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

懸濁液の電気伝導度が、少なくとも１．５ｍＳ／ｃｍである；
懸濁液の電気伝導度が、少なくとも２．０ｍＳ／ｃｍである；、または
懸濁液の電気伝導度が、少なくとも２．５ｍＳ／ｃｍである、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項5】

血漿由来免疫グロブリン画分の再懸濁が、４．２～５．５の範囲のｐＨに調整されたバッファーを用いて行われる；または
血漿由来免疫グロブリン画分の再懸濁が、４．５～５．３の範囲のｐＨに調整されたバッファーを用いて行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項6】

バッファーが、酢酸バッファーであり；
バッファーが、酢酸ナトリウムバッファーであり；
バッファーが、酢酸バッファーであり、０．０２５～０．２Ｍの範囲のモル濃度を有する；または
バッファーが、酢酸ナトリウムバッファーであり、０．０２５～０．２Ｍの範囲のモル濃度を有する、請求項５に記載のプロセス。

【請求項7】

ステップ（ｂ）において夾雑タンパク質を沈殿させることが、ステップ（ａ）で得られた懸濁液をＣ７～Ｃ９のカルボン酸で処理することを含む；または
ステップ（ｂ）において夾雑タンパク質を沈殿させることが、ステップ（ａ）で得られた懸濁液をオクタン酸で処理することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項8】

ステップ（ｂ）において夾雑タンパク質を除去することが、濾過を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項9】

ステップ（ｂ）が、夾雑タンパク質を除去した後に、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、弱酸処理に供することをさらに含み、ここで、ステップ（ｃ）において陰イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィーに供する前に、３．８～４．５の範囲のｐＨでインキュベートする、または
ステップ（ｂ）が、夾雑タンパク質を除去した後に、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、弱酸処理に供することをさらに含み、ここで、ステップ（ｃ）において陰イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィーに供する前に、３．８～４．５の範囲のｐＨで３５～４０℃の範囲の温度でインキュベートする、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項10】

ステップ（ｃ）で用いられる陰イオン交換樹脂が、マクロポーラス陰イオン交換樹脂である、請求項１～９のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項11】

ステップ（ｃ）のイオン交換クロマトグラフィーが、ＩｇＭおよびＩｇＡを陰イオン交換樹脂に結合させ、かつ、フロースルー画分中にＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得るように調整したｐＨおよび電気伝導度の条件下で行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項12】

イオン交換クロマトグラフィーが、６．７～７．５の範囲のｐＨで行われる；または
イオン交換クロマトグラフィーが、６．９～７．３の範囲のｐＨで行われる、請求項１１に記載のプロセス。

【請求項13】

イオン交換クロマトグラフィーが、４～７．５ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で行われる；または
イオン交換クロマトグラフィーが、５．５～７ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で行われる、請求項１１または１２に記載のプロセス。

【請求項14】

陰イオン交換樹脂に結合したＩｇＭおよび／またはＩｇＡが、少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの電気伝導度で該樹脂から溶出される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項15】

溶出が、６．７～７．５の範囲のｐＨで行われる；または
溶出が、６．９～７．３の範囲のｐＨで行われる、請求項１４に記載のプロセス。

【請求項16】

ステップ（ｄ）におけるＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の処理が、プロパージンが陽イオン交換材料に結合し、かつ、ＩｇＧがフロースルー画分に回収されるｐＨおよび電気伝導度の条件下で、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することにより行われる、
または
ステップ（ｄ）におけるＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の処理が、プロパージンが陽イオン膜吸着体に結合し、かつ、ＩｇＧがフロースルー画分に回収されるｐＨおよび電気伝導度の条件下で、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン膜吸着体と接触させることにより行われる、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項17】

ステップ（ｄ）における処理が、５．０～６．０の範囲のｐＨで、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；
ステップ（ｄ）における処理が、５．２～５．８の範囲のｐＨで、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；または
ステップ（ｄ）における処理が、５．４～５．６の範囲のｐＨで、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる、請求項１６に記載のプロセス。

【請求項18】

ステップ（ｄ）における処理が、１６～３０ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；
ステップ（ｄ）における処理が、２０～２８ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；または
ステップ（ｄ）における処理が、２２～２６ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる、請求項１７に記載のプロセス。

【請求項19】

ステップ（ｄ）で得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物、および／または、ステップ（ｃ）で得られたＩｇＭおよび／またはＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物を、さらにウイルス不活性化のための処理に供してウイルス不活性化調製物を得ることをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項20】

ステップ（ｄ）で得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物、および／または、ステップ（ｃ）で得られたＩｇＭおよび／またはＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物を、医薬用調製物に製剤化するステップをさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項21】

プロパージン含有ＩｇＧ組成物においてプロパージン含量を低減させるためのプロセスであって、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の条件下で、プロパージン含有ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料による処理に供して、プロパージン含量が低減されたＩｇＧ組成物を得ることを含む、プロセス。

【請求項22】

プロパージン含有ＩｇＧ組成物のプロパージン含量を低減させることにより、該組成物の抗補体活性（ＡＣＡ）を低減させるためのプロセスであって、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の条件下で、プロパージン含有ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料による処理に供することにより、ＡＣＡおよびプロパージン含量が低減されたＩｇＧ組成物を得ることを含む、プロセス。

【請求項23】

陽イオン交換材料による処理が、プロパージンが陽イオン交換材料に結合し、かつ、ＩｇＧがフロースルー画分に回収される条件下で、プロパージン含有ＩｇＧ組成物を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することにより行われる、請求項２１または請求項２２に記載のプロセス。

【請求項24】

ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の処理が、プロパージンが陽イオン膜吸着体に結合し、かつ、ＩｇＧがフロースルー画分に回収される条件下で、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン膜吸着体と接触させることにより行われる、請求項２１または２２に記載のプロセス。

【請求項25】

処理が、５．０～６．０の範囲のｐＨで、該ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；
処理が、５．２～５．８の範囲のｐＨで、該ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；または
処理が、５．４～５．６の範囲のｐＨで、該ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項26】

処理が、１６～３０ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で、該ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；
処理が、２０～２８ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で、該ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる；または
処理が、２２～２６ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度で、該ＩｇＧ組成物を陽イオン交換材料と接触させることにより行われる、請求項２１～２５のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項27】

プロパージン含有ＩｇＧ組成物が、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物である；
プロパージン含有ＩｇＧ組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９５重量％のＩｇＧ含量を有する、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物である；
プロパージン含有ＩｇＧ組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９８重量％のＩｇＧ含量を有する、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物である；または
プロパージン含有ＩｇＧ組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９９重量％のＩｇＧ含量を有する、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物である、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトの血漿から、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物、場合により、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセス、プロパージン含有ＩｇＧ組成物のプロパージン含量を低減するためのプロセス、およびＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの血漿から調製され、医学的使用に適する免疫グロブリン組成物は、当技術分野において知られており、数十年間に亘って広範な疾患の治療において重要な役割を果たしてきた。免疫グロブリンは、例えば、ヒトの感染症の治療に用いられ、様々な生化学的および生理学的性質に基づいて様々なクラスに分類することができる。例えば、ＩｇＧは、ウイルス抗原に対する防御に関与し、一方、ＩｇＭは、抗細菌および抗毒素免疫反応において主たる活性を有するため、細菌感染症の予防および治療に用いられている。したがって、市販の免疫グロブリン組成物は、さまざまな割合で、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを含み、異なる調製物は異なる治療用途を有する。現在のところ、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ^{（登録商標）}（Ｂｉｏｔｅｓｔ ＡＧ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が、市販されている唯一のＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物である。

【0003】

医学的使用のための免疫グロブリン組成物は、古典的なＣｏｈｎ血漿分画法またはその周知の改変法（例えば、Ｃｏｈｎ／ＯｎｃｌｅｙおよびＫｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）によって得られる、血漿または血清の画分から、通常調製される。次いで、これらの画分は、多数の精製ステップに供されて、ウイルス、変性タンパク質、プロテアーゼ、および脂質を含む夾雑物が除去される。分画するためのヒト血漿は、数千人のドナーから回収されるので、元の血漿を徹底的に試験しているにも関わらず、病原ウイルスを含有している場合がある。したがって、医学的に使用するための安全な製品を得るためには、ウイルスを不活化または除去するためのプロセスステップが重要である。ウイルスを不活化／除去するための幾つかの技術が、当技術分野において知られている。例えば、化学的処理または熱処理、ＵＶＣ光の照射、またはナノ濾過であり、これらは、全体的なウイルス安全性を保証するために実施される。

【0004】

十分な忍容性を有する製品を得るためには、潜在的に存在するウイルスに加えて、タンパク質分解酵素、プレカリクレインアクチベーターなどの血管作動性物質、タンパク質凝集体、および変性免疫グロブリンなどの他の夾雑物を除去することもまた重要である。変性免疫グロブリンおよび免疫グロブリン凝集体は、補体を非特異的に活性化させる能力が高く、変性免疫グロブリンを投与されている患者に重篤な副作用をもたらすので、患者にとって潜在的なリスクである。補体系の非特異的活性化に対する免疫グロブリン組成物の能力は、その抗補体活性（ＡＣＡ）に関連しており、ＡＣＡはタンパク質組成物が補体アッセイにおいて補体を消費する能力であり、標準化された試験方法、例えば、ヨーロッパ薬局方８．０（２．６．１７－免疫グロブリンの抗補体活性の試験）に記載されている方法で測定することができ、それによると、ＡＣＡの許容限界値は、１ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満である。

【0005】

これらのあらゆる夾雑物を除去することは、（１）製品が、静脈内投与後患者にとって忍容性を有するようにするため、（２）製品が、ウイルスの混入に関する生物学的安全性の指針に準拠することを保証するため、（３）製品が、長期保存中に安定であるようにするため、および（４）望ましい化合物混合物／医薬組成物を生成するために、重要である。

【0006】

ＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物を生産するためのプロセスは、先行技術で開示されている。

【0007】

ＥＰ０４４７５８５Ａ１は、凝集体、血管作動性物質およびタンパク質分解活性を含まないであろう、静脈内忍容性のポリクローナルＩｇＧ溶液の生産について記載している。Ｃｏｈｎ画分ＩＩまたはＩＩ／ＩＩＩから開始して、オクタン酸で処理して夾雑タンパク質を沈殿させた後、得られた溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーに供して、Ｃｏｈｎ画分ＩＩまたはＩＩ／ＩＩＩに最大５％の量で存在し得るＩｇＧ凝集体を除去する。陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＩｇＧが陽イオン交換材料に結合する条件下、またはフロースルーモードで行うことができる。

【0008】

ＥＰ０８２５９９８Ａは、Ｃｏｈｎ画分ＩＩまたは上清画分ＩＩＩから開始した、医薬的に許容できるＩｇＧ調製物の生産について記載している。抗補体活性を排除し、かつウイルスを不活性化するために、該画分をペプシンで処理して、溶剤／界面活性剤処理に供する。ウイルス不活性化のために用いた化学物質およびペプシンを、陽イオン交換体で処理することにより除去する。

【0009】

ＵＳ２０１３／００５８９６１Ａ１は、ＩｇＧを含む血漿由来免疫グロブリン組成物における抗補体活性を低減させるための方法について記載しており、Ｃｏｈｎ画分沈殿物およびＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物を、６．０以下のｐＨおよび１１ｍＳ／ｃｍ以下の電気伝導度を含む第一の溶液条件下で、陽イオン交換樹脂と接触させて、ＩｇＧ免疫グロブリンと第一の量のＡＣＡとを、陽イオン交換樹脂に結合させ、かつ、該陽イオン交換樹脂を、少なくとも７．５のｐＨおよび少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を含む溶出バッファーと接触させて、ＡＣＡが低減され、かつＩｇＧを含有する溶出物のうち最大８０％を含む先頭部分（ｌｅａｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）を含む溶出物を形成することにより、ＩｇＧ免疫グロブリンを陽イオン交換樹脂から溶出させる。記載された方法は、ＩｇＭおよびＩｇＡを含む免疫グロブリン組成物の回収を包含しない。

【0010】

ＷＯ９８／０５６８６Ａは、血漿材料からＩｇＧを精製または回収するための方法を開示しており、血漿材料を、マクロポーラス陰イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー分画に供して、夾雑タンパク質、特にトランスフェリンと、ＩｇＭとを除去する。所望のＩｇＧを、陰イオン交換樹脂からのフロースルー画分中に得る。微細に分割された二酸化ケイ素への吸着によって脱脂したＣｏｈｎ上清Ｉ、または可溶化されたＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩを出発物質として用いて、精製されたＩｇＧを得る。

【0011】

ＵＳ４，１３６，０９４Ａは、静脈内投与用の（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）ＩｇＧ含有免疫グロブリン組成物の調製を開示しており、ヒトの血漿をヒュームドシリカと混合させて、夾雑タンパク質を吸着させて血漿製剤を安定化させ、その後、安定化した血漿製剤を陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、精製されたＩｇＧを分離させる。ＷＯ９８／０５６８６に開示されるように、シリカ処理は、ＩｇＧ_３の低減をもたらす。しかしながら、天然のＩｇＧサブクラスの分布は、最先端の、市販のＩｇＧ調製物には必須である。

【0012】

関連するＵＳ４，２９６，０２７Ａは、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン系などの、線溶系、凝固系およびキニノーゲン系の前駆体および補体成分を、二酸化ケイ素処理によって血漿から除去することを開示している。プロパージンは除去されたタンパク質の一部であることが見出され、処理された未精製（ｃｒｕｄｅ）血漿中に検出されなかったが、最終ＩｇＧ組成物はそのプロパージン含量について試験されず、静脈内投与用の免疫グロブリン調製物の有用性に対するこの分子の役割は論じられなかった。

【0013】

ＷＯ２０１１／０８０６９８Ａは、ＩｇＧが富化されたヒトの血漿または血漿製剤を、ＩｇＧの結合が可能になるように設計された条件下で陽イオン交換クロマトグラフィーに供することにより、静脈内投与用のＩｇＧ組成物を調製するためのプロセスについて記載している。溶出後に、ＩｇＧ溶液をさらに精製するために、陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。

【0014】

ＥＰ０４１３１８７Ａ１は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＧを濃縮形態で含有し、通常のプールされた血漿に近いＩｇＧサブクラスの分布を有する、静脈内投与用の免疫グロブリン溶液を調製するためのプロセスについて記載している。Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩから開始して、オクタン酸処理の上清を、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０吸着に供することにより、これらの免疫グロブリン溶液を得る。

【0015】

ＥＰ００１３９０１Ａ１は、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩから開始し、オクタン酸、βプロピオラクトンを用いるステップと陰イオン交換樹脂を用いる吸着ステップとを含む、ＩｇＭ富化免疫グロブリン組成物を調製するための方法について記載している。本方法は、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ^{（登録商標）}（現在までに市販されている唯一の静脈内投与用ＩｇＭ製剤）を生産するために用いられる。βプロピオラクトンは、潜在的に存在するウイルスを不活性化するために滅菌ステップで使用される周知の化学物質である。βプロピオラクトンは、タンパク質の化学修飾を引き起こす非常に反応性の高い物質である。

【0016】

ＥＰ０３５２５００Ａ２は、陰イオン交換クロマトグラフィー、βプロピオラクトン、ＵＶＣ光照射および昇温しながらのインキュベーションステップ（４０℃～６０℃）を使用することによる、抗補体活性を低減させた静脈内投与用のＩｇＭ濃縮物の調製について、記載している。本方法によって生産された調製物は、その化学修飾のために、限られた時間の間、液体溶液中で安定であった。

【0017】

ＥＰ０３４５５４３Ａ２は、治療的使用のための、少なくとも３３％のＩｇＭを有する高濃縮ＩｇＭ調製物について開示しており、該調製物は実質的に同種凝集素価を有さない。本特許出願では、オクタン酸を添加することによりオクタン酸沈殿を行い、Ｓｙｎｓｏｒｂアフィニティークロマトグラフィーにより同種凝集素を除去する。最終調製物は、凍結乾燥されなければならないものであった。

【0018】

ＥＰ０４１３１８８Ａ１は、ＩｇＭおよびＩｇＧが富化されたタンパク質溶液の調製について記載している。これらの方法は、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩまたはＩＩ／ＩＩＩから開始して、タンパク質溶液をオクタン酸処理および陰イオン交換クロマトグラフィーに供することを包含し、ＩｇＭおよびＩｇＡは陰イオン交換樹脂に結合して、ＩｇＧ富化画分がフロースルー画分として得られ得る。

【0019】

ＥＰ０４５０４１２Ａは、非特異的補体活性を低減させるために、ＩｇＭ調製物に対し、ｐＨ４．０～５．０で、４０～６２℃、好ましくは４５～５５℃で、穏やかな熱処理を使用することについて記載している。本特許出願において、遠心分離によりプレカリクレインアクチベーターおよびリポタンパク質を除去するために、オクタン酸をＣｏｈｎ画分ＩＩＩ懸濁液に添加する。熱処理により、ＩｇＭの抗原決定基が部分的に失われる。これは、ネオ抗原を生成するリスクを増大させ、ヒトにおける免疫原性の増大または活性の喪失をもたらし得る。

【0020】

ＷＯ２０１１／１３１７８６およびＷＯ２０１１／１３１７８７は、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分ＢまたはＢ＋Ｉから開始されるＩｇＭ免疫グロブリン組成物の調製について記載している。血漿画分を、該免疫グロブリンを含む溶液として提供し、オクタン酸と混合して、振動攪拌機（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ａｇｉｔａｔｏｒ）で処理して、夾雑タンパク質を沈殿させる。沈殿したタンパク質を溶液から除去して、ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を産生する。免疫グロブリン溶液をオクタン酸と混合するステップの間に振動攪拌機を使用すると、プロセスの過程で、ウイルス粒子、特に非エンベロープウイルスの、高度な不活性化および除去をもたらす。さらに、従来の攪拌と比較して、タンパク質分解活性の除去の改善が達成される。Ｃｏｈｎ画分ＩＩに含有されるＩｇＧは、出発物質の沈殿の前に除去される。

【0021】

先行技術に開示されるように、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセスは、通常、大部分のＩｇＧを含むＣｏｈｎ画分ＩＩまたはＣｏｈｎ画分ＩＩ／ＩＩＩから開始される。少量の免疫グロブリンしか含有しないが、大量のフィブリノーゲンや他の望ましくない夾雑タンパク質を含有するＣｏｈｎ画分Ｉは、通常除去される。その一方で、ＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物は、通常、大部分のＩｇＧを含有するＣｏｈｎ画分ＩＩから分離後の、大部分のＩｇＭおよびＩｇＡを含有する、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩから開始して調製される。従って、製造段階初期で、Ｃｏｈｎ画分Ｉにおける望ましくないタンパク質（例えばフィブリノーゲン）を除去することは、一方で、ＩｇＧ含有組成物の調製を、他方で、ＩｇＭおよびＩｇＡ含有組成物の調製を容易にする。しかしながら、Ｃｏｈｎ画分Ｉの沈殿には、いくつかの欠点がある。具体的には、Ｃｏｈｎ画分Ｉの沈殿は、沈殿画分Ｉ中の上清のキャリーオーバー、および濾過または遠心分離中の技術的損失のために、免疫グロブリンの損失をもたらし、特にＩｇＡおよびＩｇＭはこれらの濾過または遠心分離ステップによってさらなる剪断応力にさらされる。さらに、分離濾過または遠心分離は、より高い人件費ならびに機器および消耗品の費用のために、より高い生産コストをもたらす。

【0022】

しかしながら、免疫グロブリンの損失を避けるため、および、所望の免疫グロブリンの収量を改善するために、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ富化免疫グロブリン組成物を同時調製するための出発物質として、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩの組み合わせを使用することは、望ましくない免疫グロブリンおよび夾雑物の除去という問題をもたらし、従って、容認出来ないＡＣＡをもたらし得る。特に、本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィー後に、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉから得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物が、依然として許容できないほど高いＡＣＡを有することを見出した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0023】

本発明の目的は、血漿から、医薬的に許容できる免疫グロブリン組成物、特に、ヨーロッパ薬局方による抗補体活性の許容限界を満たす免疫グロブリン組成物を調製するための経済的なプロセスを提供することであり、このプロセスは、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物の同時調製（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を可能にして、血漿からの免疫グロブリンの損失をできるだけ低く保つ。

【0024】

本発明のさらなる目的は、プロパージン含有ＩｇＧ組成物におけるプロパージン含量を低減するためのプロセスを提供することである。

【0025】

本発明のよりさらなる目的は、ヨーロッパ薬局方による抗補体活性の許容限界を満たす医薬的に許容できるＩｇＧ組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0026】

本発明は、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分から、医薬的に許容できる免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセスを提供し、該プロセスは、以下のステップを含む：
（ａ）Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分を、懸濁液の電気伝導度を少なくとも１ｍＳ／ｃｍに調整する条件下で再懸濁して、該血漿由来免疫グロブリン画分に含有される免疫グロブリンを再可溶化し、再可溶化したＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡを含有する懸濁液を得ること；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた懸濁液中の夾雑タンパク質を沈殿、および、場合により吸着させ、夾雑タンパク質を除去して、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を得ること；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、IｇＭおよびＩｇＡ、並びに場合によりＩｇＧを陰イオン交換樹脂に実質的に結合させるように調整したｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陰イオン交換樹脂を用いて、イオン交換クロマトグラフィーに供し、かつ、フロースルー画分中に、および／またはＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に結合したままである条件下で陰イオン交換樹脂からＩｇＧを溶出することによって、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ることであって、場合により、続いて、陰イオン交換樹脂からＩｇＭおよび／またはＩｇＡを溶出することによって、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物を得ること；および
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陽イオン交換材料による処理に供し、ＩｇＧを回収して、プロパージン含量が低減されたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ること。

【発明を実施するための形態】

【0027】

ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡなどの特定の免疫グロブリンと組み合わせて用いられる「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」という用語は、免疫グロブリン組成物におけるそれぞれの免疫グロブリンの比率が、通常の血漿のこれらの免疫グロブリンの相対量、従って、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分から得られた懸濁液における再可溶化された免疫グロブリンの相対量と比較すると、少なくとも１つの他の免疫グロブリンに対して富化されていることを意味する。

【0028】

本発明の方法によると、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン組成物から得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物におけるＡＣＡは、陰イオン交換クロマトグラフィー後に得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、さらに陽イオン交換材料による処理に供する場合に、低減される。本発明者らは、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物における望ましくないＡＣＡが、Ｃｏｈｎ画分Ｉ、および他の分画プロセスの対応する画分における高いプロパージン含量に起因し、プロパージンは、工業的調製プロセスに必要な量のＩｇＭおよびＩｇＡを再可溶化するのに必要な電気伝導度の条件下で溶解することを見出した。プロパージンは、補体副経路における重要な調節タンパク質である。これは、約２５μｇ／ｍｌの濃度で血漿中に見出される可溶性糖タンパク質であり、ヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）様式で互いに結合して環状ポリマーを形成している、いくつかの同一の５３ｋＤのサブユニットからなる（概説については、L. Kouser et al, Frontiers in Immunology, Vol. 4, Article 93, April 2013を参照されたい）。このプロパージンは、ＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物の生産のための既知のプロセスにおいて用いられている、オクタン酸処理および陰イオン交換クロマトグラフィーなどの従来の精製ステップでは除去されない。

【0029】

本発明のプロセスのステップ（ａ）において出発物質として用いられる血漿由来免疫グロブリン画分は、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉ、すなわち、血漿中の本質的に全てのＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ免疫グロブリンと、不純物として、寒冷沈降により分離されないフィブリノーゲンの一部とを含有する従来の血漿分画プロセスの画分を含むか、またはこれから成る。本明細書で用いられる「Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ」という用語は、古典的Ｃｏｈｎ分画プロセスにより得られるＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩと、Ｃｏｈｎ分画プロセスの改変法により得られる免疫グロブリン組成物中のこれらと同等の画分とを含むことを意味する。

【0030】

用途に応じて、血漿由来免疫グロブリン画分は、ヒトまたは動物の血漿から得ることができるが、一般的には、該免疫グロブリン画分はヒトの血漿に由来する。該免疫グロブリン画分は、固体または半固体の形態で存在し、かなりの量の夾雑タンパク質を含有し得る。

【0031】

ステップ（ａ）では、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉを含むか、またはこれから成る血漿由来免疫グロブリン画分を、懸濁液の電気伝導度を少なくとも１ｍＳ／ｃｍに調整する条件下で再懸濁することにより、該血漿由来免疫グロブリン画分に含有される免疫グロブリンを再可溶化する。これにより、本質的にＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡで構成される、再可溶化された免疫グロブリンを含有する懸濁液を得る。血漿由来免疫グロブリン画分中に存在するＩｇＧの大部分を再可溶化するにはより低い電気伝導度で十分であろうが、十分な量の免疫グロブリンＩｇＭおよびＩｇＡを再可溶化するには少なくとも１ｍＳ／ｃｍの電気伝導度が必要である。一般的には、再可溶化された免疫グロブリン、具体的にはＩｇＡおよびＩｇＭの量は、懸濁液の電気伝導度が増加するにつれて増加し、懸濁液の電気伝導度は、血漿由来出発物質中に含有される免疫グロブリンを、できるだけ多く再可溶化するように調整される。好ましくは、血漿由来免疫グロブリン画分は、懸濁液の電気伝導度を、少なくとも１．５ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは少なくとも２．０ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは少なくとも２．５ｍＳ／ｃｍに調整する条件下で、再懸濁される。懸濁液中の電気伝導度の上限は、重要ではない。しかしながら、タンパク質分解活性は非常に高い電気伝導度で増加する傾向があるため、懸濁液の電気伝導度は一般的には、１．０ｍＳ／ｃｍ～１６．０ｍＳ／ｃｍの範囲に調整される。

【0032】

上述の少なくとも１．０ｍＳ／ｃｍの電気伝導度は、出発物質として用いられる血漿由来免疫グロブリン画分に含有される免疫グロブリンの、少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、最も好ましくは少なくとも９０重量％を再可溶化するのに十分である。それぞれ、懸濁液中の再可溶化された免疫グロブリンの総重量に基づき、これらの条件下で得られる懸濁液中のＩｇＭの比率は、一般的には、５～１１重量％の範囲内であり、好ましくは少なくとも６重量％、より好ましくは少なくとも７重量％であり、再可溶化された免疫グロブリンにおけるＩｇＡの比率は、一般的には、１０～１４重量％の範囲内であり、好ましくは少なくとも１０．５重量％、より好ましくは少なくとも１１重量％である。再可溶化された免疫グロブリンにおけるＩｇＧの比率は、一般的には、７５～８５重量％の範囲内である。上述のような電気伝導度で、血漿由来免疫グロブリン画分を再懸濁することにより、一般的には、懸濁液中のＩｇＭの収量が、少なくとも５ｇＩｇＭ／ｋｇ画分、好ましくは少なくとも７ｇＩｇＭ／ｋｇ画分、より好ましくは少なくとも９ｇＩｇＭ／ｋｇ画分となり、かつ、懸濁液中のＩｇＡの収量が、一般的には、少なくとも１１ｇＩｇＡ／ｋｇ画分、好ましくは少なくとも１２ｇＩｇＡ／ｋｇ画分、より好ましくは少なくとも１３ｇＩｇＡ／ｋｇ画分となる。懸濁液中のＩｇＧの収量は、一般的には、少なくとも９０ｇＩｇＧ／ｋｇ画分、好ましくは少なくとも９５ｇＩｇＧ/kg画分である。一般的には、再可溶化された免疫グロブリンにおける、ＩｇＭとＩｇＡの重量比は、約２：３である。本明細書で示される免疫グロブリンの重量は、当技術分野で既知の方法に従い容易に決定することができ、例えば、ヨーロッパ薬局方８．０，２．２．１に従い比濁法（Ｓｉｅｍｅｎｓ ＢＮ Ｐｒｏｓｐｅｃ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定することができる。

【0033】

一般的には、電気伝導度を調整する条件下で血漿由来免疫グロブリン画分を再懸濁することは、好適なｐＨおよびモル濃度を有するバッファーを用いて血漿由来免疫グロブリン画分を再懸濁することによって、行われる。一般的には、バッファーは、４．２～５．５、好ましくは４．５～５．３の範囲のｐＨを有し、かつ、０．０２５～０．２Ｍ、好ましくは０．０５～０．１５Ｍの範囲のモル濃度、通常は約０．１Ｍのモル濃度を有する。使用されるバッファーの最適モル濃度は、再懸濁される血漿由来免疫グロブリン画分中に既に存在する塩の量に依存し得るが、モル濃度が有意に０．０２５Ｍを下回ると、ＩｇＭおよびＩｇＡの再可溶化が減少し得、一方でモル濃度が有意に０．２Ｍを上回ると、電気伝導度が非常に高まり、従って、タンパク質分解活性のより顕著な再可溶化をもたらし得る。免疫グロブリンに悪影響を及ぼさない限り、バッファーの種類は重要ではない。しかしながら、一般的には、再可溶化は、酢酸バッファー、特に酢酸ナトリウムバッファーを用いて行われる。再懸濁に際し、バッファーと血漿由来免疫グロブリン画分との重量比は、一般的には、３：１から７：１、好ましくは４：１から６：１、最も好ましくは４．５：１から５．５：１の範囲である。

【0034】

本発明のプロセスで必要な電気伝導度では、出発物質に含有される夾雑タンパク質の一部は溶解しないままであり、免疫グロブリン含有懸濁液から分離することができる。しかしながら、出発物質に含有されるプロパージンは、再可溶化物質中に見出される。その上、電気伝導度が増加すると、懸濁液中の再可溶化ＩｇＭおよびＩｇＡの比率が増加する一方で、電気伝導度が増加すると、再可溶化物質中に見出されるプロパージンの量も増加し、それによって、後続のプロセスステップでプロパージンを除去するという課題を増大させる。

【0035】

ステップ（ａ）で得られた再可溶化された免疫グロブリンを含有する懸濁液を、沈殿、および場合により吸着のステップ（ｂ）に供し、ここで、懸濁液中の夾雑タンパク質は沈殿および吸着し、よって、他の非可溶化タンパク質と共に再可溶化された免疫グロブリンから除去されて、不純物が除去された免疫グロブリン組成物、すなわち、夾雑タンパク質含量が低減した、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡを含有する免疫グロブリン組成物を得ることができる。本ステップにおいて、驚くべきことに免疫グロブリンと共に溶解したままであるプロパージンを除いて、大部分の夾雑タンパク質が除去される。

【0036】

一般的には、ステップ（ｂ）における沈殿は、ステップ（ａ）で得られた懸濁液を、Ｃ７～Ｃ９のカルボン酸、好ましくはオクタン酸で処理して、ウイルスを不活性化し、夾雑タンパク質（例えば、プロテアーゼ、ウイルスなど）を沈殿させることを含む。この沈殿ステップは、当技術分野で周知であり、例えば、ＥＰ０４４７５８５Ａ、ＷＯ２０１１／１３１７８６およびＷＯ２０１１／１３１７８７に記載されている。沈殿したタンパク質を、免疫グロブリン含有懸濁液から除去して、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を得る。

【0037】

Ｃ７～Ｃ９のカルボン酸、特にオクタン酸による処理は、再可溶化された免疫グロブリンを含有する懸濁液を、カルボン酸と接触させることにより、例えば、カルボン酸を懸濁液に添加することにより、または、懸濁液中でカルボン酸を発生させることにより、達成され得る。Ｃ７～Ｃ９のカルボン酸は、好ましくは、少なくともカルボン酸０．３５ｇ／ｇタンパク質の濃度から、最大カルボン酸０．８ｇ／ｇタンパク質の濃度で存在する。より多量のカルボン酸も同様に用いられ得るが、一般的には、免疫グロブリン収量の損失をもたらす。より好ましくは、カルボン酸は、カルボン酸０．４５ｇ～０．６ｇ／ｇタンパク質で存在し、最も好ましくはカルボン酸約０．５ｇ／ｇタンパク質で存在する。カルボン酸を添加する前のタンパク質濃度は、一般的には、２０～６０ｇ／ｌ、好ましくは２５～４０ｇ／ｌである。

【0038】

本発明の好ましい実施形態によると、再可溶化された免疫グロブリンを含有する懸濁液の、例えばオクタン酸による処理は、振動攪拌機を用いて混合することにより行われる。例えばＷＯ２０１１／１３１７８６において記載されるように、振動攪拌機を使用すると、ウイルス粒子、特に通常はオクタン酸処理の影響をあまり受けない非エンベロープウイルスの、不活性化および除去が向上し得、不要なタンパク質（プロテアーゼを含む）をより効率的に除去することができる。これにより、さらに下流の処理ステップに適した中間産物が得られる。化学薬品／医薬品業界での使用に適した、いかなる種類の市販の振動攪拌機も使用することができる。好適な振動攪拌機の例は、Ｇｒａｂｅｒ＋Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ ＧｍｂＨから入手可能である。特に、「Ｌａｂｏｒｍｏｄｅｌｌ Ｔｙｐ１」Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒはラボスケールの実験に使用することができ、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｍｉｘｅｒ Ｔｙｐ４」は実生産スケールの調製に使用することができる。振動式混合機（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｍｉｘｅｒ）は、製造業者の説明書に従い使用することができ、特に、製造業者によって、タンパク質を含有する溶液を混合するのに適していると記載されている設定において、使用することができる。例えば、振動式混合機は通常、１０ｍｍ未満の振幅、１００Ｈｚ未満で運転させることができ、例えば、本発明者らは、「Ｌａｂｏｒｍｏｄｅｌｌ Ｔｙｐ１」を用いたラボスケールでの振動混合を、２３０Ｖの電源を使用する場合には、５０Ｈｚで行った。混合プロセスの振動振幅は、好ましくは、０～３ｍｍの間で変化させることができる。ラボスケール実験には直径２３ｍｍ～６５ｍｍののスターラープレートを使用でき、実生産スケールには直径３９５ｍｍのスターラープレート（孔径：１３．５ｍｍ～１６ｍｍ）を使用することができる。

【0039】

混合中のステップ（ｂ）の懸濁液のｐＨの値は、好ましくは４．３～５．５、より好ましくは４．５～５．３の範囲に調整される。混合は、酢酸ナトリウムバッファー、例えば、約０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーを用いて、行うことができる。ステップ（ｂ）において混合を行う際の温度は、好ましくは１６～３５℃、より好ましくは１８～３０℃の範囲である。振動攪拌機を用いた混合時間は、特に限定されないが、好ましくは少なくとも１０分間～最長３時間であり、より好ましくは４０～１２０分間の範囲である。インキュベーション時間が３０分未満であると、ウイルス不活性化レベルが低下することがある。

【0040】

ステップ（ｂ）におけるＣ７～Ｃ９のカルボン酸処理は、再可溶化された免疫グロブリン懸濁液を、リン酸三カルシウムなどの吸着剤で処理して、タンパク質を沈殿、および吸着させることを含んでよい。好ましくは、リン酸三カルシウムなどの吸着剤は、０．０１～０．０２ｋｇ／ｋｇ懸濁液の濃度で添加される。リン酸三カルシウムは、カルボン酸と同時に、別々に、または順次添加することができる。好ましい実施形態では、リン酸カルシウムは、カルボン酸による処理を開始後、少なくとも２０分で添加される。

【0041】

沈殿させた夾雑タンパク質を懸濁液から除去して、夾雑タンパク質の含量が低減された、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を得る。この除去ステップは、特に限定されず、当技術分野で既知のいかなる好適な方法によっても実施することができる。好ましくは、除去ステップは、濾過を用いて実施され、場合によっては限外濾過および／または透析濾過ステップを続けて、沈殿に使用されたオクタン酸などのカルボン酸を除去する。ステップ（ｂ）で得られた不純物が除去された免疫グロブリン組成物は、好ましくは、組成物におけるタンパク質の総量４０ｇ／ｌに基づき、３ｍＵ／ｍｌ未満の血栓形成活性（ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＴＧＡ）、通常のヒトの血漿の１０％未満、より好ましくは５％未満のプレカリクレインアクチベーター、２０μ／ｌ未満のタンパク質分解活性、および０．２ｇ／ｌのα_２－マクログロブリンを含む。より具体的には、ステップ（ｂ）において、１．５ｍＵ／ｍｌ未満の血栓形成活性（ＴＧＡ）、通常のヒトの血漿の２．５％未満のプレカリクレインアクチベーター、１１Ｕ／ｌのタンパク質分解活性、および０．１ｇ／ｌ未満のα_２－マクログロブリンを達成することができる。この中間組成物におけるプロパージン含量は、一般的には、７５μｇ／ｍｇタンパク質を超える。

【0042】

夾雑タンパク質の除去に続いて、ステップ（ｂ）はさらに、さらなるウイルス不活性化のための弱酸処理を含み得る。弱酸処理のために、タンパク質除去後に得られた免疫グロブリン組成物を、３．８～４．５、好ましくは３．９～４．１の範囲のｐＨでインキュベートして、インキュベート溶液を得る。弱酸条件は、好適な酸を、免疫グロブリン組成物に添加することにより、作り出すことができる。例えば、０．２Ｍ ＨＣｌを添加することにより、所望のｐＨ値に調整することができる。このインキュベーションステップは、好ましくは、３５～４０℃の範囲の温度で行われる。インキュベーション時間は、好ましくは少なくとも２時間～最長２４時間であり、より好ましくは少なくとも９時間～最長１６時間である。

【0043】

カルボン酸による、および場合により吸着剤による処理後に、不純物が除去された免疫グロブリン組成物は、一般的には、不純物が除去された免疫グロブリン組成物における免疫グロブリンの総量に基づき、約８５～９４重量％の範囲のＩｇＧ含有量、約３～９重量％の範囲のＩｇＡ含有量、および約３～９重量％の範囲のＩｇＭ含有量を有する。

【0044】

ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）の不純物が除去された免疫グロブリン組成物は、好ましくは弱酸処理後に、カラムに配置された陰イオン交換樹脂を用いて、イオン交換クロマトグラフィーに供される。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＩｇＭおよびＩｇＡ、並びに場合によりＩｇＧを陰イオン交換樹脂に実質的に結合させるように調整したｐＨおよび電気伝導度の条件下で行われる。本明細書で用いられる「実質的に」という用語は、個々のそれぞれの免疫グロブリンＩｇＭ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＧのうち、陰イオン交換クロマトグラフィーに供したそれぞれの免疫グロブリンの量に基づき、少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％が、該樹脂に結合することを意味する。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶液条件が、ＩｇＧが実質的に結合するように調整されているか否かに応じて、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物は、フロースルー画分中に得られるか、および／または、ＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に結合したままであるｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陰イオン交換樹脂からＩｇＧを溶出した後に、得ることができる。ＩｇＧ回収後に、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物は、場合により、陰イオン交換樹脂からＩｇＭおよび／またはＩｇＡを溶出することにより、得ることができる。しかしながら、ＩｇＧがフロースルー画分で得られるか溶出後に得られるかにかかわらず、プロパージンは常に、ＩｇＧ富化免疫グロブリン画分中のＩｇＧと共に見られる。

【0045】

本発明の好ましい実施形態によると、ステップ（ｂ）で得られた不純物が除去された免疫グロブリン組成物は、ＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に実質的に結合し、かつ、ＩｇＧがＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物としてフロースルー画分中に得られるｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陰イオン交換樹脂と接触させる。一般的には、フロースルー条件は、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、ｐＨが６．７～７．５、好ましくは６．９～７．３の範囲、最も好ましくは約７．１に調整され、電気伝導度が４～７．５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは５．５～７ｍＳ／ｃｍの範囲に調整された溶液条件下で、陰イオン交換クロマトグラフィーに供することによって達成される。クロマトグラフィーに用いられる溶液中の電気伝導度は、一般的には、塩濃度を調整することにより調整され、例えばＮａＣｌを用いる。陰イオン交換クロマトグラフィーが、６．７未満のｐＨで、および／または、７．５ｍＳ／ｃｍを超える電気伝導度で行われる場合、ＩｇＧ富化フロースルー画分中のＩｇＧ含量は増加するであろうが、該フロースルー画分は不必要に高いＩｇＡ含量を含有し得る。それゆえに、これらの条件下では、少量のＩｇＧが陰イオン交換樹脂に結合したままであるが、大部分のＩｇＧがフロースルー画分中に見出されるであろう。結合したＩｇＭ、ＩｇＡおよび残留ＩｇＧの免疫グロブリンを含有する陰イオン交換樹脂は、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファーなどの洗浄バッファーで洗浄することができ、洗浄画分はＩｇＧ含有フロースルー画分と組み合わせることができる。

【0046】

本発明のさらなる実施形態によると、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、全ての免疫グロブリン、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡが陰イオン交換樹脂に実質的に結合するｐＨおよび電気伝導度の溶液条件下で、該樹脂と接触させてよい。一般的には、これらの条件は、ＩｇＭおよびＩｇＡの結合に用いられる値よりも高いｐＨ値で、特に８以上のｐＨ値で、および、低い電気伝導度で、特に、２ｍＳ／ｃｍ以下の電気伝導度で、達成される。次に、少量のＩｇＧが陰イオン交換樹脂に結合したままであろうフロースルーモードについて上述した条件下で溶出バッファーを使用して、結合したＩｇＧを溶出して、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得る。

【0047】

ＩｇＧを回収してＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得た後、陰イオン交換樹脂に結合したＩｇＭおよび／またはＩｇＡを、残存ＩｇＧと共に該樹脂から溶出することにより、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物を得ることができる。免疫グロブリンＩｇＭおよびＩｇＡは、互いに独立して、または一斉に、溶出することができる。しかしながら、好ましくは、ＩｇＭおよびＩｇＡは一緒に、かつ、陰イオン交換樹脂に結合した残存ＩｇＧと共に溶出され、ＩｇＭおよびＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物が得られるであろう。該樹脂からＩｇＭ、ＩｇＡおよび残存ＩｇＧを溶出した後、得られた免疫グロブリン画分中のＩｇＧ含量は、ＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物中のＩｇＭ分子に対する安定化効果を有する上で十分な量である。一般的には、ＩｇＭおよびＩｇＡが富化された免疫グロブリン組成物は、溶出画分中の免疫グロブリンの総量に基づき、１０～３５重量％の範囲のＩｇＭ、１０～３５重量％の範囲のＩｇＡ、および４０～７５重量％の範囲のＩｇＧを含む。好ましくは、ＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物は、溶出画分中の免疫グロブリンの総量に基づき、１５～３０重量％の範囲のＩｇＭを含み、最も好ましくは少なくとも１８重量％のＩｇＭを含み、１５～３０重量％の範囲のＩｇＡを含み、かつ、４５～７０重量％の範囲のＩｇＧを含む。これらのＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物において、ＩｇＧは一般的には分子基準でＩｇＧサブクラスの分布を有し、総ＩｇＧ含量に対して、ＩｇＧ４が１０％を超えて、好ましくは１２％を超えて、最も好ましくは１５％を超えて、富化されている。これにより、患者に投与したときの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）がより低くなり、したがって最終的な医薬用調製物の品質が向上する。

【0048】

一般的には、ＩｇＭ、ＩｇＡ、および残存ＩｇＧの溶出は、すべての結合した免疫グロブリンを１つ以上の亜画分（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎ）に溶出させるように調整した溶出バッファーにおける電気伝導度を含む条件下で行われ、一般的には、塩濃度を上げることによって調整され、例えばＮａＣｌで調整される。好ましくは、溶出は、少なくとも２０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは少なくとも２５ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは少なくとも２８ｍＳ／ｃｍに調整した電気伝導度で行われる。より低い電気伝導度は、陰イオン交換樹脂からのＩｇＭの不完全な溶出をもたらし、そして結果として、ＩｇＭ含量が減少した組成物をもたらし得るので、あまり望ましくない。電気伝導度の上限は、通常、結合した不純物の望ましくない溶出をもたらさない限り、ＩｇＭの溶出にとって重要ではない。従って、該樹脂にしっかりと結合した非免疫グロブリンである不純物がＩｇＭ／ＩｇＡ／ＩｇＧ溶出物に溶出するのを避けるために、電気伝導度は十分に低くあるべきであり、好ましくは、４０ｍＳ／ｃｍ未満であるべきである。一般的には、溶出は、６．５～７．５の範囲に調整されたｐＨで行われる。

【0049】

上記で得られたＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン調製物は、総量５０ｇ／ｌの免疫グロブリン調製物に基づき、以下の程度の不純物を有し得る：３ｍＵ／ｍｌ未満の血栓形成活性（ＴＧＡ）、０．２ｍＵ／ｍｌ未満の第ＸＩａ因子、および０．１ｇ／ｌ未満のセルロプラスミン。不純物は、以下の程度に低濃度でさえあってよい：１．５ｍＵ／ｍｌ以下の血栓形成活性（ＴＧＡ）；通常のヒトの血漿の２．５％未満のプレカリクレインアクチベーター；および０．０２ｇ／ｌ未満のセルロプラスミン。

【0050】

ステップ（ｃ）で用いられる陰イオン交換樹脂の種類は、特に限定されず、いかなる従来の陰イオン交換樹脂も含む。好適な陰イオン交換樹脂には、例えば、マクロポーラス陰イオン交換樹脂、およびテンタクル（ｔｅｎｔａｃｌｅ）構造を有する陰イオン交換樹脂が含まれる。マクロポーラス陰イオン交換樹脂、特にテンタクル構造を有さないものは、より高い圧力安定性を示し、したがってより高い流速を可能にするので好ましい。しかしながら、商品名Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^{（登録商標）}で市販されている樹脂などの、テンタクル構造を有する陰イオン交換樹脂を使用することもできる。

【0051】

マクロポーラス陰イオン交換樹脂の孔径は、その細孔内に免疫グロブリン組成物からＩｇＭおよびＩｇＡ分子を吸着するのに、十分な大きさであるべきである。本発明のプロセスで用いられるマクロポーラス陰イオン交換樹脂は、一般的には、少なくとも５０ｎｍの、例えば、５０～４００ｎｍの範囲の、公称孔径を有する。孔径の上限（ｕｐｐｅｒ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）は特に重要ではなく、樹脂の圧力安定性および／または表面積によってのみ限定される。マクロポーラス陰イオン交換樹脂の孔径は、例えば、ヨーロッパ薬局方７．０，２０１１，２．９．３２に従った、水銀圧入法による従来法で決定することができる。本発明において有用である陰イオン交換樹脂の、イオン性官能基は重要ではない。有用な陰イオン交換樹脂は、一般的には、第一級、第二級、第三級もしくは第四級アンモニウム基（例えば、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）基）、または第四級化ポリエチレンイミンを含み得る。強陰イオン交換樹脂が好ましい。本発明のプロセスに有用なマクロポーラス陰イオン交換樹脂、例えば、商品名ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ^{（登録商標）}ＨＱ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^{（登録商標）}ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ^{（登録商標）}Ｑ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＣＩＭ^{（登録商標）}ＱＡ（Ｂｉｏ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）で、市販されている。ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱなどの陰イオン交換樹脂が好ましい。

【0052】

一般的には、陰イオン交換樹脂に負荷される免疫グロブリンの量は、樹脂１Ｌ当たり３０～５０ｇの範囲であり、好ましくは樹脂１Ｌ当たり３５～４５ｇの範囲である。より少ない量は経済的ではないが、より多い量（例えば、樹脂１Ｌ当たり５０ｇを超える量）はフロースルー画分中のＩｇＡの量を増加させ得る。

【0053】

好ましくは、マクロポーラス陰イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィーは、少なくとも２００ｃｍ／ｈ、より好ましくは少なくとも４５０ｃｍ／ｈ、および最も好ましくは少なくとも６００ｃｍ／ｈの線流速で行われる。これらの条件下で、カラムのベッド高は、有利には２０～３０ｃｍである。このように、マクロポーラス陰イオン交換樹脂を使用すると、１バッチ当たり１０ｋｇを超えるタンパク質、またはさらには１バッチ当たり３０ｋｇを超えるタンパク質のバッチなどの、大きな工業用バッチの処理時間を著しく短縮することができる。そうでなければ、サイクル数を減らすことで処理時間を短縮するのに、はるかに大きいカラムとはるかに多くのクロマトグラフィー樹脂が必要になり、プロセスを技術的により複雑で高価なものにする。免疫グロブリン溶液は、高流速および高圧のこれらの条件下で安定的に処理され得ることが見出されているが、そうでなければ非常に感受性の高いＩｇＭ分子は、様々な条件下で不安定になる傾向がある。

【0054】

ステップ（ｃ）においてフロースルー画分中に、および／または、陰イオン交換樹脂からの溶出後に得られる、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物は、一般的には、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９８重量％、より好ましくは少なくとも９９％、９９．５％、９９．７％またはさらには９９．９重量％のＩｇＧ含量を有する。しかしながら、これらの組成物は依然として、ヨーロッパ薬局方による許容限界を満たすのには高すぎるＡＣＡを有する。上述したように、高ＡＣＡはすでにプロパージンの存在が原因であることが判明しており、プロパージンはすでにＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩおよびＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ画分Ａ＋Ｉに存在し、精製ステップ（ｂ）でも、ステップ（c）の陰イオン交換クロマトグラフィーでも除去されない。

【0055】

ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の溶液条件下で、陽イオン交換材料による処理に供して、フロースルー画分に陽イオン交換材料からＩｇＧを回収することにより、および／またはプロパージンが陽イオン交換材料に結合したままである条件下で、陽イオン交換材料からＩｇＧを溶出することによって、プロパージン含量が低減されたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を得ることにより、ステップ（ｄ）において不必要に高いＡＣＡを低減できることが今回見出された。

【0056】

ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の、陽イオン交換材料による処理は、バッチ式または連続式で行うことができ、ここで、陽イオン交換材料は、管（ｖｅｓｓｅｌ）またはクロマトグラフィーカラムに配置されていてもよく、または、陽イオン膜吸着体（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｄｓｏｒｂｅｒ）の形態であってもよい。

【0057】

好ましくは、ステップ（ｄ）におけるＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の処理は、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンが陽イオン交換材料に結合し、かつ、ＩｇＧが陽イオン交換材料に結合することが本質的に妨げられている条件下で、陽イオン交換交換クロマトグラフィーに供することにより行われる。ＩｇＧはその後、フロースルー画分において、非結合免疫グロブリンとして、陽イオン交換材料から回収される。経済的な理由から、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン交換材料と接触させるための条件は、一般的には、陽イオン交換クロマトグラフィーに供されるＩｇＧ富化組成物に含有される総ＩｇＧの重量に基づき、ＩｇＧが陽イオン交換材料に１重量％を超えて結合することを妨げるように、調整される。一般的には、陽イオン交換クロマトグラフィーは、独立して、５．０～６．０、好ましくは５．２～５．８、最も好ましくは５．４～５．６の範囲のｐＨ、および、１６～３０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは２０～２８ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは２２～２６ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度に調整された条件下で、行われる。

【0058】

本発明のさらなる実施形態によると、ステップ（ｄ）におけるＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の処理は、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンが陽イオン膜吸着体に結合し、かつ、ＩｇＧが陽イオン膜吸着体に結合することが本質的に妨げられている条件下で、陽イオン膜吸着体に接触させることにより行われる。ＩｇＧはその後、フロースルー画分において、非結合免疫グロブリンとして、陽イオン膜吸着体から回収される。ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を陽イオン膜吸着体と接触させる条件は、陽イオン交換クロマトグラフィーに用いられる条件に相当する。

【0059】

あるいは、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の処理は、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、プロパージンおよびＩｇＧの両方が陽イオン交換材料に結合する低電気伝導度の条件下で、陽イオン交換クロマトグラフィーに供すること、または、陽イオン交換膜と接触させることを含んでよい。結合したＩｇＧはその後、プロパージンが陽イオン交換材料に結合したままである条件下で、該樹脂からＩｇＧを溶出することよって、陽イオン交換材料から回収される。一般的には、ＩｇＧが陽イオン交換樹脂に結合するのを妨げるために上記で使用したものと同じｐＨおよび電気伝導度、すなわち、５．０～６．０の範囲、好ましくは５．２～５．８、最も好ましくは５．４～５．６の範囲のｐＨ値、および、６～３０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは２０～２８ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは２２～２６ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度に、独立して調整した溶出バッファーを使用して、陽イオン交換材料からＩｇＧを溶出する。

【0060】

陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン膜吸着体で使用される陽イオン交換材料は特に限定されず、カルボン酸基またはスルホン酸基（例えば、スルホプロピル基）を含有し、ＩｇＧが細孔内に拡散することを可能にする孔径を有する、弱陽イオン交換樹脂および強陽イオン交換樹脂などの、ＩｇＧクロマトグラフィーに好適ないかなる従来の陽イオン交換樹脂も含む。好適な陽イオン交換樹脂は、例えば、商品名ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}ＨＳ（ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}ＨＳ５０など）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^{（登録商標）}ＥＭＤ ＳＯ_３ ^－、およびＥｓｈｍｕｎｏ^{（登録商標）}ＣＰＸで市販されている。陽イオン交換材料は、管またはクロマトグラフィーカラムに配置されていてよい。陽イオン吸着体は、例えば、商品名Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓで市販されている。

【0061】

陽イオン交換材料へのタンパク質負荷量は、一般的には、最大５ｇタンパク質／ｇ陽イオン交換材料であり、好ましくは、０．０１～５ｇタンパク質／ｇ陽イオン交換材料であり、例えば、０．１ｇ～５ｇタンパク質／ｇ陽イオン交換材料である。陽イオン交換クロマトグラフィーの流速は、通常、２００～８００ｃｍ／ｈの範囲であり、陽イオン膜吸着体の流速は、最大５０００ｃｍ／ｈであってよい。

【0062】

陰イオン交換クロマトグラフィー後に得られるＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物についての、本発明のプロセスのステップ（ｄ）における、上述のような陽イオン交換材料によるプロパージン含有ＩｇＧ組成物の処理はまた、一般に、プロパージン含有ＩｇＧ組成物におけるプロパージン含量を低減させるために用いることができる。

【0063】

それゆえ、本発明はさらに、プロパージン含有ＩｇＧ組成物におけるプロパージン含量を低減するためのプロセスに対するものであり、該プロセスは、プロパージン含有ＩｇＧ組成物を、プロパージンが陽イオン交換材料に結合するｐＨおよび電気伝導度の条件下で、陽イオン交換材料による処理に供して、プロパージン含量が低減されたＩｇＧ組成物を得ることを含む。

【0064】

陽イオン交換材料による処理に供されるプロパージン含有ＩｇＧ組成物は、プロパージン含有ＩｇＧ組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９８重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％のＩｇＧ含量を、好ましくは有する、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物であってよい。

【0065】

陽イオン交換材料による処理および回収後に得られたＩｇＧ調製物は、ポリクローナルであり、陰イオン交換クロマトグラフィー後と実質的に同じＩｇＧ含量を有するが、プロパージン含量が低減している。一般的には、陽イオン交換材料による処理後に得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物のＩｇＧ含量は、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９８重量％、より好ましくは少なくとも９９％、９９．５％、９９．７％またはさらには９９．９重量％である。好ましくは、ＩｇＧ調製物は、分子基準で、総ＩｇＧ含有量に基づき、少なくとも１．０％、好ましくは少なくとも１．４％、より好ましくは少なくとも２．０％のＩｇＧ４を含有し、天然の分布に十分類似している。ＩｇＧサブクラスの分布は、当技術分野で既知の方法に従い容易に決定することができ、例えば、ヨーロッパ薬局方７．０，２０１１；２．７．１に従い比濁法（Ｓｉｅｍｅｎｓ ＢＮ Ｐｒｏｓｐｅｃ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定することができる。

【0066】

例えば、陽イオン交換クロマトフィー後、または、陽イオン膜吸着体による処理後に得られた、回収されたＩｇＧを、ウイルス不活性化および濃縮のために、さらなる従来の下流処理に供してよい。具体的には、回収されたＩｇＧを、孔径約２０ｎｍのナノフィルターを用いたナノ濾過に供して、潜在的に存在するウイルスを除去してもよい。得られた溶液はさらに、限外濾過および／または透析濾過により、濃縮されてよい。

【0067】

同様に、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に、場合により、例えば限外濾過によるさらなる濃縮の後に得られた、ＩｇＭおよびＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物を、ウイルス不活性化のためのその後の処理に供して、ウイルス不活性化調製物を得てもよい。ウイルス不活性化は、ナノ濾過および／またはＵＶＣ照射を含んでよい。

【0068】

照射は、当技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ２０１１／１３１７８６およびＷＯ２０１１／１３１７８７に記載されている方法によって、行うことができる。具体的には、溶出物を、ＵＶｉｖａｔｅｃ^{（登録商標）}装置（Ｂａｙｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）などの市販の装置を用いてＵＶＣ光で処理して、ＵＶＣ照射溶液を得ることができる。潜在的に存在するウイルスをさらに不活性化するために、インキュベート溶液は、２５４±１０ｎｍで、２００～５００Ｊ／ｍ^２、より具体的には、２００～３００Ｊ／ｍ^２で処理することが好ましい。穏やかな条件下のＵＶＣ処理はまた、オクタン処理後に得られる無色透明の濾液で可能である。しかしながら、より乳白色または不透明な溶液の場合は、免疫グロブリンに対する潜在的に有害な影響を伴う、より長い照射時間を必要とし得る。一般的には、ＵＶＣ照射は、陰イオン交換クロマトグラフィーの完了後にのみ行われる。

【0069】

処理される免疫グロブリン溶液はまた、ウイルス不活性化のために、ナノフィルターで濾過されてもよい。孔径７５±５ｎｍ～３５±５ｎｍのフィルター、または、公称孔径７５～３５ｎｍを有するフィルター（例えば、Ｐａｌｌ Ｕｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０）を、該プロセス中の様々な段階で用いることができる（例えば、公称孔径５０ｎｍは、５０ｎｍ以上の大きさのウイルスに対して、保持率４ｌｏｇ_１０以上であることを意味する）。好ましい実施形態では、ＵＶＣ照射前に得られた免疫グロブリン溶液を、ナノ濾過、好ましくは孔径４０～５０ｎｍを有するフィルターを用いるナノ濾過に供する。このステップは、滅菌条件下で行われることが好ましい。

【0070】

好ましくは、本発明のプロセスは、調製物中の免疫グロブリンの１つ以上の化学的または酵素的修飾、または免疫グロブリンの熱処理（例えば、１０分間以上の、４２℃以上の温度での免疫グロブリンの処理）を含まない。より具体的には、本発明のプロセスは、抗体を、βプロピオラクトンおよび／またはペプシンと接触させるステップを含まない。

【0071】

本発明のプロセスは、高純度で、優れた収量の、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物と、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物との同時製造を可能にする。本プロセスは、通常の血漿に存在する本質的に全ての免疫グロブリンを含有する血漿画分から開始し、Ｃｏｈｎ画分ＩＩなどのＩｇＧが豊富な画分の別の沈殿を必要としない。

【0072】

本発明のプロセスは、５００ドナー以上からプールされた血漿からでさえも、ＡＣＡが低いＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物の調製を可能にする。何百ものドナーからプールされた血漿は、高い抗体多様性を特徴とし、通常、高いＡＣＡを有することが期待され得る。しかしながら、本発明のプロセスより入手可能で、５００ドナー以上由来のＩｇＧを含むＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物は、プロパージンおよびＩｇＧ重合体の含量が極めて低く、さらに、残存血栓形成活性（ＴＧＡ）、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）および第ＸＩ因子（ＦＸＩ）が低い。この結果、ヨーロッパ薬局方８で要求される、１ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満のＡＣＡが得られる。従って、実験データは、本発明のプロセスによって得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物が、現在市場で入手可能な市販の医薬用ＩｇＧ組成物のいずれにも見られない、独特の性質の組み合わせを有することを示している。

【0073】

陽イオン交換材料による処理およびウイルス不活性化後に得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物は、医薬用免疫グロブリン組成物に直接製剤化してもよく、および／または無菌条件下で容器、例えば、バイアルまたはアンプルに充填してもよい。従って、本発明はさらに、
（ｉ）組成物に対し、少なくとも４５ｇ／ｌのＩｇＧ含量；
（ｉｉ）組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９５重量％のＩｇＧ含量；
（ｉｉｉ）組成物における総免疫グロブリンに対し、０．０１μｇ／ｍｇ以下のプロパージン含量；および
（ｉｖ）組成物におけるＩｇＧの総量に基づき、０．０５％以下のＩｇＧ重合体の含量、
を有する、５００ドナー以上の血漿から得られたＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物に対するものである。

【0074】

ＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物はポリクローナルであり、ヒト対象にとって医薬的に許容でき、かつ、注射による静脈内または筋肉内投与に好適な免疫グロブリン組成物であることを意味する。

【0075】

好ましくは、本発明のＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物は、４５～２２５ｇ／ｌ（約５％～約２０％）の範囲のＩｇＧ含量を有し、例えば、約５％のＩｇＧ組成物については４５～５５ｇ／ｌの範囲、約１０％のＩｇＧ組成物については９５～１０５ｇ／ｌの範囲、または、皮下投与用のＩｇＧ組成物については１６０～２１０ｇ／ｌの範囲のＩｇＧ含量を有する。

【0076】

好ましくは、本発明のＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物は、ＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物における免疫グロブリンの総重量に基づき、少なくとも９８重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％、およびより好ましくは少なくとも９９％、９９．５％、９９．７％またはさらには９９．９重量％のＩｇＧ含量を有する。

【0077】

好ましくは、ＩｇＧ調製物は、分子基準で、総ＩｇＧ含有量に基づき、少なくとも１．０％、好ましくは少なくとも１．４％、より好ましくは少なくとも２．０％のＩｇＧ４を含有する。

【0078】

好ましくは、本発明のＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物は、組成物において、免疫グロブリン１ｍｇ当たり０．００５μｇ以下のプロパージン含量を有する。

【0079】

好ましくは、本発明のＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物は、組成物におけるＩｇＧ総量に基づき、０．０１％以下のＩｇＧ重合体含量を有する。ＩｇＧ重合体は、ＩｇＧ単量体、ＩｇＧ二量体またはＩｇＧフラグメントではない、ＩｇＧ分子のより高度な凝集体として定義される。組成物におけるＩｇＧの総量は、ＩｇＧ単量体、二量体、重合体、およびそれらのフラグメントの合計である。ＩｇＧ単量体、二量体、重合体、およびそれらのフラグメントの比率は、ヨーロッパ薬局方８．０（２．２．３０－「静脈内投与のためのヒトの通常の免疫グロブリン」の分子サイズ分布）に従い、ＨＰＳＥＣにより、クロマトグラムの合計面積に対するピーク面積の割合として決定される。

【0080】

一般的には、ＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ重合体の含量は、５℃の温度での長期保存後に変化せず、１５ヵ月間、好ましくは２１ヵ月間の保存後に、好ましくは０．０５％以下、より好ましくは０．０１％以下である。

【0081】

一般的には、１５ヵ月間、好ましくは２１ヵ月間の、２５℃の温度での長期保存後の、ＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ重合体の含量は、１．０％以下、好ましくは０．７５％以下であり、上述のようにＨＰＳＥＣで決定される。

【0082】

本発明のＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物は、グリシンおよびプロリンなどの安定化剤を含有してよいが、例えば、ソルビトール、マンニトール、グルコース、およびトレハロースなどの糖や糖アルコールなどの炭水化物は含まれていないのが好ましい。好ましくは、該組成物は、グリシンまたはプロリンなどの安定化剤と共に製剤化され、特に、該組成物は、４～４．５、好ましくは４．２～４．８の範囲のｐＨで、最も好ましくは約ｐＨ４．６で、グリシンまたはプロリン含有バッファー中で製剤化されてよい。

【0083】

好ましくは、ＩｇＧ富化医薬用組成物は、２．０ｍＵ／ｍｌ未満の第ＸＩａ因子を有する。

【0084】

好ましくは、ＩｇＧ富化医薬用組成物は、第ＸＩ因子の標準（Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ； Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１％未満を含有する。

【0085】

好ましくは、ＩｇＧ富化医薬用組成物における血栓形成活性は、１．５ｍＵ／ｍｌ未満である。

【0086】

本発明のＩｇＧ富化医薬用免疫グロブリン組成物は、好ましくは、低温殺菌されていない。

【0087】

本発明のプロセスにより得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物およびＩｇＭ／ＩｇＡ富化免疫グロブリン組成物は、ＡＣＡが低く、ヨーロッパ薬局方の要件を満たす静脈内投与用の免疫グロブリン組成物として使用することができる。特に、本免疫グロブリン組成物は、（ｉ）化学的に修飾されていない、（ｉｉ）タンパク質分解活性が低い、（ｉｉｉ）抗補体活性が低い、および（ｉｖ）天然で、生物学的に活性なＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡを高レベルで含有している、という利点を有している。

【実施例】

【0088】

免疫グロブリン含量の決定
免疫グロブリン含量は、ヨーロッパ薬局方８．０（２．２．４７－キャピラリー電気泳動)に従い、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）により決定した。免疫グロブリン画分を、それらのランタイム（ｒｕｎ ｔｉｍｅ）に基づく電荷／質量比に従い、キャピラリー中ｐＨ１０で分離し、特徴付けし、２００ｎｍにて測光法で定量した。本手順には、ＵＶ検出器付きのキャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱキャピラリー電気泳動システム、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。サンプルを電気泳動バッファーで希釈して、タンパク質濃度２．５ｇ／ｌとした（ホウ酸バッファー、ｐＨ１０；１０００ｍｌの精製水に、１４．３ｇの四ホウ酸二ナトリウム十水和物を溶解して、１Ｍ ＮａＯＨで調整した）。該混合物を、さらに調製することなく、電気泳動に用いる。電気泳動の手順は、装置の製造業者の説明書に従い実施する。

【0089】

分子サイズ分布の決定
ＩｇＧ免疫グロブリンの分子サイズ分布を、ヨーロッパ薬局方８．０（２．２．３０－「静脈内投与のためのヒトの通常の免疫グロブリン」の分子サイズ分布）に従い、高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により、クロマトグラムの合計面積に対するピーク面積の割合として、決定した。タンパク質混合物を親水性多孔質ゲルに通過させると、分子は分子サイズおよび孔径分布に応じて異なる分布帯に現れる。最大のタンパク質／粒子はゲルを最も速く移動し、一方、小さいタンパク質分子および低分子量の物質は最もゆっくりと移動する。

【0090】

東ソーＴＳＫ－Ｇ ３０００ ＳＷを分離に使用し、１００μｇのタンパク質質量を注入した。分離した画分を、２８０ｎｍで測光法により、カラム出口で検出および定量した。クロマトグラフィーを、機器の製造業者の操作説明書に従い実施した。Ｂｉｏ－Ｒａｄゲル濾過スタンダードを、コントロールとして用いた。免疫グロブリン調製物を、ＳＳＴサンプルとして用いた。ピーク積分のための自動化された方法を用いて、ピークを、重合体、二量体、単量体およびフラグメントの画分に割り当てる。

【0091】

プロパージン濃度の決定
既製の固相ヒトプロパージンＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、製造業者の説明書に従い、ＩｇＧ調製物中のヒトプロパージンのインビトロ定量を行った。手短に言えば、サンプルおよびスタンダードを、ヒトプロパージンを認識する抗体でコーティングされたマイクロタイターウェル中でインキュベートする。ビオチン化されたトレーサー抗体は、捕捉されたヒトプロパージンに結合するであろう。ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートは、ビオチン化されたトレーサー抗体に結合するであろう。ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートは、基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応するであろう。酵素反応を、シュウ酸の添加により停止させる。４５０ｎｍでの吸光度を、分光光度計で測定する。検量線は、吸光度（線形）に対してヒトプロパンジンスタンダードの対応する濃度（対数）をプロットすることによって得られる。スタンダードと同時に分析されるサンプルのヒトプロパージン濃度を、検量線から決定する。

【0092】

抗補体活性（ＡＣＡ）の決定
免疫グロブリンのＡＣＡ試験は、ヨーロッパ薬局方８．０（２．６．１７－免疫グロブリンの抗補体活性の試験）に記載されているように実施した。

【0093】

簡単に説明すると、規定量の試験物質（１０ｍｇの免疫グロブリン）を規定量のモルモットの補体（２０ＣＨ_５０）と共にインキュベートする。残存している補体を滴定し、溶血素で感作したヒツジの赤血球とインキュベートする。最適に感作されたヒツジの赤血球は、ヒツジ赤血球に対する抗体（溶血素）を負荷したヒツジ赤血球からなる。細胞溶解の程度を、５４１ｎｍにて、測光法により決定する。ＡＣＡは、１００％と見なす補体コントロールと比較した、補体の消費量の割合として表される。補体活性の溶血単位（ＣＨ_５０）は、所与の反応条件において、試験において感作されたヒツジの赤血球の半分の溶解を生じる補体の量として、定義される。ヨーロッパ薬局方におけるＡＣＡの許容限界は、補体の消費量が５０％を超えず、免疫グロブリン１ミリグラムあたり１ＣＨ_５０となるように規定されている。

【0094】

血栓形成活性（ＴＧＡ）
蛍光マイクロプレートアッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ）を用いて、血栓形成活性（ＴＧＡ）を決定した。Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ^{（登録商標）}ＴＧＡ ＲＣ Ｈｉｇｈを試薬として用い、Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ^{（登録商標）}ＴＧＡ ＳＵＢを蛍光発生基質として用い、第ＸＩ因子欠損血漿（Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ）を用いた。キャリブレーションは、ＦＸＩａの国際標準物質、１３／１００（ＮＩＢＳＣ）で行った。

【0095】

第ＸＩ因子（ＦＸＩ）
市販の標準凝固アッセイ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）を決定した。ＦＸＩが除去された血漿、アクチベーターとしてのＡｃｔｉｎ ＦＳＬ、およびＣａＣｌ_２溶液を、本アッセイで用いた。キャリブレーションは、Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。アッセイの感度を向上させるために、より低い校正範囲にある追加の校正点を含めた。

【0096】

第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）
市販の発色アッセイ（Ｈｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ）を用いて、該試験キットの標準条件を利用して、第ＸＩａ因子を決定した。

【0097】

実施例１
実施例１ａ
ＩｇＭ富化免疫グロブリン組成物の調製
５００人を超えるドナー由来の分画するためのヒトの血漿（２０００ｌ）を、出発物質として用いた。血漿をプールエリア（ｐｏｏｌｉｎｇ ａｒｅａ）に移して、プールした。

【0098】

第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィルブランド因子、およびフィブリノーゲン凝固因子を分離するために、寒冷沈降（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）ステップを実施した。クリオプレシピテートを得るために、温度範囲が２±２℃に保たれるように、穏やかに攪拌しながら、血漿の温度を調整した。これらの条件下において、クリオプレシピテートは、解凍した血漿中に溶解せずに存在する。クリオプレシピートを、ウェストファリアセパレーター（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ｓｅｐａｒａｔｏｒ）などの連続運転遠心分離機によって、血漿から分離した。

【0099】

寒冷沈降ステップの上清から、以下の通り、エタノール沈殿によりＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩを沈殿させた。

【0100】

クリオプレシピテート分離後に残った遠心分離上清の温度を、２±２°Ｃに調整した。タンパク質溶液のｐＨの値を、ｐＨ５．９に調整した。続いて、温度を－５℃に下げ、エタノールを添加して２０容量％の最終濃度とした。ステンレス製容器内で常時ゆっくり撹拌しながら、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩを沈殿させた。フィルタープレスを用いて、パーライトまたは珪藻土などの濾過助剤を添加して、デプスフィルターシートで、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ沈殿を、濾過により上清から分離した。Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩをフィルターシートから回収した。このＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ沈殿物は、全ての免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）を、およそ以下の割合で含んでいた：ＩｇＧ７５％、ＩｇＭ１３％、およびＩｇＡ１２％。

【0101】

得られたＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ沈殿物９０ｋｇを、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）４５０ｋｇに再懸濁し、２２℃で６０分間混合した。懸濁液のｐＨを、酢酸で４．８に調整した。

【0102】

続いて、オクタン酸による処理を実施した。室温にて、７．７ｋｇのオクタン酸を添加することにより、該溶液を処理した。オクタン酸をゆっくり添加し、タンパク質溶液をさらに、振動式混合機（Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒ^{（登録商標）}、Ｓｉｚｅ ４、Ｇｒａｂｅｒ＋Ｐｆｅｎｎｉｇｅｒ ＧｍｂＨ、Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒはレベル２～３に調整）を用いて、６０分間混合した。

【0103】

オクタン酸反応を完了させるために、以下の通り、リン酸カルシウム処理を行った。

【0104】

およそ１．１ｋｇのＣａ_３（ＰＯ_４）_２を添加し、さらに、該タンパク質溶液を１５分を超えて混合し、デプスフィルターシートで濾過した。濾液をさらに処理した。得られたタンパク質溶液を限外濾過に供し、約５０ｇ／ｌのタンパク質濃度とした。該タンパク質溶液を０．０２Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５に対して透析濾過し、その後、約４０ｇ／ｌのタンパク質濃度に調整した。

【0105】

ウイルスを不活性化させるために、以下の通り、タンパク質溶液をｐＨ４．０で処理した。ｐＨを、０．２Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ４．０に調整し、得られた溶液を３７℃で８時間インキュベートした。得られたタンパク質溶液は、次の分布で、免疫グロブリンを含有する：９０％ＩｇＧ、５％ＩｇＡ、および５％ＩｇＭ。

【0106】

得られたタンパク質溶液を、付随タンパク質を除去し、かつ、ＩｇＧおよびＩｇＭ富化免疫グロブリン組成物を得るために、さらに、マクロポーラス陰イオン交換樹脂を用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理した。

【0107】

中間タンパク質溶液１キログラム当たり０．００１２１ｋｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）を撹拌しながら添加して溶解させ、固体ＮａＣｌを用いて電気伝導度を６ｍＳ／ｃｍに調整した。１Ｍ ＮａＯＨを添加することにより、該タンパク質溶液をｐＨ７．１に調整した。マクロポーラス陰イオン交換樹脂（ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ陰イオン交換樹脂、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カラムのベッド高：２５ｃｍ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ７．１、５０ｍＭ ＮａＣｌ、８００ｃｍ／ｈの線流速）で平衡化した。タンパク質溶液を、樹脂１リットル当たり４０ｇのタンパク質で、陰イオン交換樹脂に負荷した。カラムを、平衡化バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．１、８００ｃｍ／ｈ）で洗浄した。

【0108】

ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物が、フロースルー画分において得られ、さらに、以下の実施例３に記載したように処理した。

【0109】

ＩｇＭ富化画分を、以下の通りに電気伝導度を増加させることによって、溶出した：３００ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．１の１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー溶液を、８００ｃｍ／ｈで使用して、ＩｇＭ富化画分を溶出する。溶出画分は、５８％ＩｇＧ、２２％ＩｇＡおよび２０％ＩｇＭを含有していた。

【0110】

タンパク質溶液を、ウイルス除去ステップとして、Ｐａｌｌ社の、Ｕｌｔｉｐｏｒ ＶＦ ＤＶ５０フィルターに通して濾過した。さらなるウイルス不活性化のために、ＵＶＣ線量２２５Ｊ／ｍ^２で、フロースルーＵＶｉｖａｔｅｃｈ処理装置（Ｂａｙｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、２５４ｎｍでＵＶＣ光処理することにより、濾液をさらに処理した。製造業者の説明書を用いて、ＵＶＣ反応機を通過する流速を計算した。照射されたタンパク質溶液を、限外濾過によりタンパク質濃度が５０ｇ／Ｌになるように濃縮し、透析濾過（０．３Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ４．５）を使用）に供した。最終産物を０．２μｍのフィルターに通して濾過し、２℃～８℃で保存した。

【0111】

得られた免疫グロブリン組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン濃度で、総免疫グロブリン含量に基づき、２２重量％のＩｇＭ含量、２２重量％のＩｇＡ含量および５６重量％のＩｇＧ含量を有していた。ＡＣＡは、０．３４ＣＨ５０／ｍｇであった。

【0112】

実施例１ｂ
より大量の処理
より大量のタンパク質を処理するために、マクロポーラス陰イオン交換樹脂上で、複数の精製サイクルを行った。この目的のために、クロマトグラフィーサイクルに、クリーニングステップを組み込んだ。具体的には、実施例１ａに記載したようにして得られた、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ含有中間タンパク質溶液からのＩｇＭ富化画分の溶出後に、カラムを１Ｍ ＮａＣｌ溶液でストリッピングして、残存結合タンパク質を溶出させた。カラムをさらに、３カラム容量の１Ｍ ＮａＯＨで再生し、さらなるサイクルを、平衡化バッファーを用いた平衡化フェーズによって開始した。合計で、８００ｃｍ／ｈの線流速での１２回の精製サイクルを、いかなる精製上の性能を損なうことなく行った。

【0113】

実施例２
テンタクル樹脂を用いたＩｇＭ富化免疫グロブリン組成物の調製
ｐＨ４での処理のステップを含む最初の処理を、実施例１ａに記載したように行った。

【0114】

付随タンパク質を除去し、他の免疫グロブリンと比較して割合が増加したＩｇＭを含む溶液を得るために、得られたタンパク質溶液を、以下の通り、さらにテンタクル陰イオン交換樹脂を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理した。

【0115】

中間物（タンパク質濃度：４１ｇ／ｌ）を、Ｔｒｉｓバッファー（最終濃度：１０ｍＭ）でｐＨ７．１に調整した。タンパク質溶液の電気伝導度を、ＮａＣｌを用いて６ｍＳ／ｃｍ（２０℃）に調整した。

【0116】

クロマトグラフィーカラム（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^{（登録商標）}ＴＭＡＥ、ベッド高：３９．５ｃｍ、カラム容量：８０ｍｌ）を、１０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．１／５０ｍＭ ＮａＣｌにより、１５０ｃｍ／ｈの線流速で平衡化して、樹脂１ｍｌ当たり４０ｍｇの負荷量に達するまで、タンパク質溶液をクロマトグラフィーカラムにポンプで注入した。実験中、１５０ｃｍ／ｈの線流速を保った。ＵＶセンサーを用いて、クロマトグラフィーをモニターした。結合画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０／３００ｍＭ ＮａＣｌにより溶出した。溶出画分を回収した。これを、実施例１ａに記載したようにさらに処理することができる。

【0117】

ＩｇＧ富化フロースルー画分の収量は８４％であった。ＩｇＧ富化画分において、ＩｇＡは、９．８１ｇ／Ｌのタンパク質濃度（Ｂｉｕｒｅｔ ａｓｓａｙにより決定）において、検出限界未満（＜０．０１１６ｇ／Ｌ、Ｓｉｅｍｅｎｓ ＢＮ Ｐｒｏｓｐｅｃ）であった。ＩｇＭ含量は、検出限界未満（＜０．００８４６ｇ／Ｌ）であった。ＩｇＧ４サブクラス含量は２．３１％であった。

【0118】

得られたＩｇＭ富化免疫グロブリン組成物は、５０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン濃度において、総免疫グロブリン含量に基づき、２８重量％のＩｇＭ含量、１９重量％のＩｇＡ含量、および５３重量％のＩｇＧ含量を有していた。

【0119】

実施例３
フロースルーモードにおける、ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の調製（陽イオン交換クロマトグラフィー）

【0120】

実施例１ａにおいてマクロポーラス陰イオン交換クロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ）のフロースルー画分として回収されたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、酢酸ナトリウムバッファーおよびＮａＣｌで、ｐＨ５．５および２２～２６ｍＳ／ｃｍの電気伝導度に調整し、続いて、さらに、陽イオン交換樹脂（ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳ）において、フロースルーモードで、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。本樹脂の結合能は、１００～３０００ｇ／ｌと規定され、３０００ｇ／ｌの負荷量、および８００ｃｍ／ｈの流速で、クロマトグラフィーを行った。

【0121】

陽イオン交換カラムを酢酸バッファー溶液（ｐＨ５．５、ＮａＣｌにより２２、２４および２６ｍＳ／ｃｍに調整）で平衡化した。タンパク質溶液をカラムに負荷し、酢酸バッファー（ｐＨ５．５、ＮａＣｌにより２２～２６ｍＳ／ｃｍに調整）で洗浄した。フロースルー画分および洗浄液を回収し、さらに処理した。残存タンパク質を、１．５Ｍ ＮａＣｌで溶出する。

【0122】

得られたタンパク質溶液を、潜在的に存在するウイルスを除去するために、さらにナノ濾過ステップで処理した。Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥｘ ２０ ｎｍ フィルター（Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ）を、ウイルスフィルターとして用いた。５０ｋｇを超えるタンパク質溶液を、１０ｇ／ｌのタンパク質濃度で、０．１ｍ^２フィルター面積で濾過した。最大圧力は、製造業者の説明書に従い設定した。ナノ濾過中の流速は以下の通りであった。

【0123】

【0124】

得られたタンパク質溶液を、限外濾過により１００ｇ／Ｌを超えるまで濃縮ステップに供し、製剤化バッファー（０．３Ｍグリシン、ｐＨ５．０）中に透析濾過した。得られたタンパク質溶液を、無菌状態を制御するために、０．２μｍフィルターを通して濾過した。

【0125】

得られた免疫グロブリン組成物を、免疫グロブリン含量、サブクラスの分布およびＡＣＡについて解析した。結果を表１に示す。

【0126】

【表1】

【0127】

ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳクロマトグラフィー後に得られた原薬は、ＡＣＡレベルが所望の範囲であった。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭの比率とサブクラスの分布は、さらなるＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳクロマトグラフィーでは変化しなかった。その後のナノ濾過は目立たなかった。

【0128】

実施例４
陽イオン交換クロマトグラフィーの有無による、ＩｇＧ調製物中のプロパージン含量の調査
ＩｇＧ調製物中のプロパージンレベルに対する、陽イオン交換クロマトグラフィーステップの影響を調べるために、プールした血漿から得られたＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩの４つのバッチを、製造スケール（１００ｋｇの画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩを使用）で、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）に再懸濁し、実施例１ａに記載したようにオクタン酸、リン酸三カルシウム、限外濾過－透析濾過（限外濾過－透析濾過）、弱酸処理および陰イオン交換クロマトグラフィーによる処理に供した。バッチ１および２のフロースルー（ＩｇＧ画分）を回収し、直ちに０．３Ｍグリシンバッファー、ｐＨ４．６に対する限外濾過／透析濾過（ｕｌｔｒａ－／ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に供した。バッチ３および４のフロースルーをさらに、実施例３に記載されるように、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）に供し、フロースルーを上述のように限外濾過／透析濾過に供した。このようにして得られた全てのＩｇＧ溶液を、前述の通り、固相ヒトプロパージンＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、免疫グロブリンおよびプロパージン含量について解析した。結果を表２に示す。

【0129】

【表2】

【0130】

表２に示すように、陽イオン交換クロマトグラフィーは、プロパージン含量の大幅な低減をもたらす。

【0131】

実施例５
ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物における、プロパージン含量およびＩｇＧ重合体含量の決定
実施例４に記載される本発明のＩｇＧ調製物（バッチ３および４）をさらに、前述の通り、ＨＰＳＥＣによりＩｇＧ重合体含量について試験した。市販の医薬用ＩｇＧ組成物（ＣＰ－ＩｇＧ１～５）のプロパージンおよびＩｇＧ重合体含量を、比較のために同じ方法で決定した。結果を表３に示す。

【0132】

【表3】

【0133】

表３から分かるように、本発明の方法に従って得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物は、低温殺菌製品であるＣＰ－ＩｇＧ５を除いて、市販の医薬品を下回るプロパージン含量を有する。同様に、本発明のＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ重合体含量は、ＣＰ－ＩｇＧ１を除いて、全ての医薬用ＩｇＧ組成物を下回っていた。

【0134】

実施例６
ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物における、血栓形成活性（ＴＧＡ）、第ＸＩａ因子および第ＸＩ因子（ＦＸＩ）の決定。
陽イオン交換クロマトグラフィー後に、実施例４に記載したようにして得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物（３バッチ）を、前述の通り、市販のアッセイを用いて、ＴＧＡ、ＦＸＩａおよびＦＸについて試験した（バッチ５～７）。結果を表４に示す。

【0135】

【表4】

【0136】

その結果、残存ＴＧＡ、ＦＸＩａ、ＦＸＩは認められなかった（適用方法の検出限界未満）。

【0137】

実施例７
ＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の長期安定性
陽イオン交換クロマトグラフィーの後に、実施例４に記載したようにして得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物（１１８ｇ免疫グロブリン／ｌ）を、上述のようにＨＰＳＥＣを用いて、５℃および２５℃で、それぞれ９０週間にわたって、長期安定性について試験した。結果を表５に示す。

【0138】

【表5】

【0139】

結果から分かるように、５℃で９０週間保存後に、ＩｇＧ重合体は検出されなかった。２５℃で保存した後では、９０週間後にＩｇＧ重合体含量は、１．０％未満に留まっている。

【0140】

実施例８
結合モードにおけるＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物の調製（陽イオン交換クロマトグラフィー）
実施例１で記載したようにして、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーとして得られたＩｇＧ画分を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５に対して限外濾過／透析濾過して、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳでの、結合モードにおける陽イオン交換クロマトグラフィーのための物質を調製した。

【0141】

調製した物質を、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳにうまく結合させ、ＩｇＧ画分をバッファー（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５±０．１、電気伝導度２４±２ｍＳ／ｃｍ）で溶出した。得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物は、０．５８ＣＨ５０／ｍｇタンパク質のＡＣＡ値を有した。

【0142】

実施例９
異なる電気伝導度でのＡＣＡ破過曲線（ｂｒｅａｋ－ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｕｒｖｅ）（陽イオン交換クロマトグラフィー)
実施例１に記載したようにして、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーとして得られたＩｇＧ画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６．５ｍＭ酢酸ナトリウムに対して限外濾過／透析濾過して、ＮａＣｌを用いてｐＨ５．５および２２、２４および２６ｍＳ／ｃｍの電気伝導度に調整した。０．８ｍｌのカラム容量のＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳカラムを用いて、ＡＣＡ破過曲線を得た。ＡＣＡを除去するために、タンパク質溶液を８００ｃｍ／ｈの流速でＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳカラム上にポンプで注入した。

【0143】

表６は、意図した電気伝導度でのＡＣＡの破過（ｂｒｅａｋ－ｔｈｒｏｕｇｈ）について得られた結果を示す。全ての場合において、ＡＣＡは、少なくとも３ｇタンパク質／ｍｌゲルの負荷量まで、効率的に除去される。ＡＣＡレベルは、より高い負荷量で、再び上昇する。電気伝導度がより高いほど、ＡＣＡレベルの上昇が速い。

【0144】

【表6】

【0145】

実施例１０
電気伝導度の変化（陽イオン交換クロマトグラフィー）
実施例１のようにして、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーとして得られたＩｇＧ画分を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーおよびＮａＣｌを用いて、ｐＨ５．５および１６～３０ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導度に調整した。このようにして調製した物質を、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳカラム（カラム負荷量５００ｇ／ｌ）にアプライして、画分を回収し、ＡＣＡレベルを決定した。結果を表７に示す。

【0146】

【表7】

【0147】

ＡＣＡレベルの低減が、広範囲の電気伝導度の設定値にわたって実現され得た。電気伝導度が低いとＩｇＧの収量が損失するリスクがあり、電気伝導度が高いとＡＣＡが破過するリスクがある。

【0148】

実施例１１
流速の変化 (陽イオン交換クロマトグラフィー)
実施例１に記載したようにして、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーとして得られたＩｇＧ画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６．５ｍＭ酢酸ナトリウム、２２５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．５；電気伝導度２２ｍＳ／ｃｍ）に対して、限外濾過／透析濾過した。このようにして調製した物質を、２００、５００および８００ｃｍ／ｈで、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳカラムにアプライした（負荷量１．２ｇ／ｍｌＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳ）。フロースルー画分を回収して、ＡＣＡレベルを決定した。結果を表８に示す。

【0149】

【表8】

【0150】

表８から分かるように、流速はＡＣＡに顕著な影響を及ぼさない。

【0151】

実施例１２
陽イオン交換材料としての膜吸着体
実施例１に記載したようにして、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーとして得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物におけるＡＣＡの除去を、陽イオン膜吸着体（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ）を用いて、ＩｇＧに対する非結合モードで試験した。ＩｇＧ富化溶液を、酢酸ナトリウムバッファーを用いてｐＨ５．５に調整し、２２５ｍＭの塩化ナトリウム濃度（２４ｍＳ／ｃｍの電気伝導度に相当）とした。これらの条件下で、ＩｇＧは陽イオン交換材料に結合しない。膜吸着体モジュールに、０．５ｇ／ｍｌ樹脂を充填した。フロースルー画分および高塩濃度溶出画分（１．５Ｍ ＮａＣｌ）を回収して、ＡＣＡについて解析した。フロースルー画分のＡＣＡ値は低く（ＣＨ５０／ｍｇ＝０．４４）、一方、結合画分はＡＣＡ含量が豊富であった（ＣＨ５０／ｍｇ＞１．５）。

【0152】

実施例１３
バッチ式における、陽イオン交換樹脂の使用
実施例１に記載したようにして、ＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーからのフロースルーとして得られたＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６．５ｍＭ酢酸ナトリウム、２２５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．５；電気伝導度２１ｍＳ／ｃｍ）に対して限外濾過／透析濾過して、タンパク質含量５０ｇ／ｌに調整した。ＰＯＲＯＳ５０ＨＳクロマトグラフィー材料を粉末として加え、懸濁液を室温で１時間穏やかに振盪した。以下の量のＰＯＲＯＳ５０ＨＳを、このようにしてバッチ式で試験した。結果を表９に示す。

【0153】

【表9】

【0154】

２５０ｍｇＰＯＲＯＳ^{（登録商標）}５０ＨＳ／ｇタンパク質を超える負荷条件で、ＡＣＡを１ＣＨ５０／ｍｇ未満に除去することに成功した。

【0155】

実施例１４
プロパージン添加（ｓｐｉｋｅ）実験
プロパージン含量とＡＣＡとの間の相関を証明するために、１ｍｇ／ｍｌプロパージン溶液（Ｑｕｉｄｅｌから入手）を、精製（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）のために陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて処理した２つの異なる１０％ＩｇＧ免疫グロブリン（ＩＶＩｇ調製物ＡおよびＢ）に添加し、ＡＣＡを測定した。表１０に示したように、プロパージン添加濃度が２００μｇ／ｍｌに至るまで、プロパージン濃度を増加させると、線形依存的にＡＣＡが増加する。

【0156】

【表10】

【0157】

実施例１５
オクタン処理後のプロパージン含量に及ぼす、再可溶化バッファーの影響
再可溶化の条件と、オクタン酸処理後のプロパージン含量との間の相関を証明するために、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩを、脱イオン水および３つの異なる再可溶化バッファーに再懸濁した。実施例１ａに概説したように、画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩの懸濁液を、オクタン酸（ｐＨ４．８、懸濁液１ｋｇ当たり１７．５ｇ／ｋｇのオクタン酸）およびリン酸三カルシウムによる処理に供した。沈殿物を深層濾過により除去し、得られたタンパク質溶液を、限外濾過／透析濾過およびｐＨ４での弱酸処理に供した。このようにして得られた、不純物が除去された免疫グロブリン組成物を、プロパージン含量について、解析した。結果を表１１に示す。

【0158】

【表11】

【0159】

結果からわかるように、オクタン酸処理後に得られた免疫グロブリン組成物におけるプロパージン含量は、再可溶化バッファーのモル濃度が増加するにつれて増加する。

【0160】

実施例１６
陰イオン交換クロマトグラフィー後に得られるＩｇＧ富化免疫グロブリン組成物におけるプロパージン含量に及ぼす、再可溶化バッファーの影響
陰イオン交換クロマトグラフィー後に得られたＩｇＧ調製物におけるプロパージン含量に対する再可溶化バッファーの影響を調べるために、Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩを、注入用水（ＷＦＩ）または１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）のいずれかに、画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩとバッファーが１：４で、再懸濁した。両方の懸濁液を、実施例１３に記載したように、オクタン酸およびリン酸三カルシウムで処理した後、限外濾過－透析濾過およびｐＨ４での弱酸処理を行った。得られた免疫グロブリン組成物を、実施例１ａに記載したように、ＰＯＲＯＳ５０ＨＱにおける陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られたフロースルー画分（ＩｇＧ富化画分）を、０．３Ｍグリシンバッファー、ｐＨ４．６に対する限外濾過／透析濾過に供した。

【0161】

得られたＩｇＧ溶液を、タンパク質およびプロパージン含量について解析した。結果を表１２に示す。

【0162】

【表12】

【0163】

実施例１７
Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩの懸濁液に及ぼす、ＷＦＩおよび酢酸バッファーの影響
画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩを、ＷＦＩ（サンプルＡ）または１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８；サンプルＢ）のいずれかに、画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩとバッファーの重量比が１：４で（３００ｇの画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩに、１２００ｇのバッファーまたはＷＦＩを添加）、実験室スケールで再懸濁した。懸濁液におけるＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの濃度、並びに、免疫グロブリンクラス間の分布を決定した。結果を表１３に示す。

【0164】

【表13】

【0165】

酢酸バッファーに再懸濁したサンプル（サンプルＢ）におけるＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの濃度は、ＷＦＩに再懸濁されたサンプル（サンプルＡ）と比較して増加する。懸濁液サンプルにおいて、ＩｇＭ濃度は、０．６９ｇ／ｌから２．０５ｇ／ｌに増加し、ＩｇＡ濃度は、１．９ｇ／ｌから２．９ｇ／ｌに上昇する。

【0166】

達成された懸濁液量（１５００ｍｌ）に基づき、および、用いられた画分Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩの量に関連して、個々の免疫グロブリンクラスの収量を計算した。酢酸の懸濁液では、収量の増加が、ＩｇＧで７％、ＩｇＡで５１％、およびＩｇＭで２１２％見られた。結果を表１４に示す。

【0167】

【表14】