特許 7074792 ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインから構成されるキメラタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-16

(45)【発行日】2022-05-24

(54)【発明の名称】ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインから構成されるキメラタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220517BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220517BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220517BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220517BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20220517BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220517BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220517BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/63 Z

C07K19/00

A61P29/00

A61K45/06

A61P43/00 121

A61K39/395 D

A61K39/395 N

【請求項の数】 22

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020065513

(22)【出願日】2020-04-01

(62)【分割の表示】P 2016549449の分割

【原出願日】2015-02-02

(65)【公開番号】P2020120666

(43)【公開日】2020-08-13

【審査請求日】2020-04-23

(31)【優先権主張番号】61/934,828

(32)【優先日】2014-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508098350

【氏名又は名称】メドイミューン・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ

【住所又は居所原語表記】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｇｒａｎｔａ Ｐａｒｋ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ２１ ６ＧＨ，Ｅｎｇｌａｎｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ダレン・スコフィールド

(72)【発明者】

【氏名】マシュー・アレクサンダー・スリーマン

(72)【発明者】

【氏名】イアン・パトリック・チェッセル

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン・ハッチャー

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド・ロウ

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５０７９２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１２６７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特許第５０９６１６７（ＪＰ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ Ｃ０７Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効量の結合性分子を含む、対象における疼痛を治療する方法に使用するための医薬組成物であって、前記結合性分子は、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含み、該ＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、そして該ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲの可溶性フラグメントを含み、ＴＮＦＲの可溶性フラグメントは、ＴＮＦαに結合することができ、
抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＨドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＬドメインを含み、
該ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
該ＨＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
該ＨＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）、またはＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）を含み、
該ＬＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、
該ＬＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、および
該ＬＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
該ＶＨドメインは、配列番号３または９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
該ＶＬドメインは、配列番号７または９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、
前記医薬組成物。

【請求項2】

システインが、配列番号７の１０２、１０３、または１０４位に対応するアミノ酸位置のＶＬドメインに存在し、システインが、配列番号３の４４位に対応するアミノ酸位置のＶＨドメインに存在する、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項3】

抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｈ₂Ｌ₂抗体全体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはＦ（ａｂ）₂フラグメントである、請求項１または２に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項4】

ＴＮＦＲはＴＮＦＲ－２である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項5】

抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ヒト化、キメラ、霊長類化、または完全ヒトのものである、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項6】

結合性分子は、リンカーを介してＴＮＦαアンタゴニストに融合しているＮＧＦアンタゴニストを含む融合タンパク質を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項7】

結合性分子は、融合タンパク質のホモ二量体を含む、請求項６に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物であって、
前記結合性分子は、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含み、該ＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、そして該ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲ－２の可溶性フラグメントを含み、ＴＮＦＲ－２の可溶性フラグメントは、ＴＮＦαに結合することができ、該抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＨドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＬドメインを含み、
該ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
該ＨＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
該ＨＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）、またはＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）を含み、
該ＬＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、
該ＬＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、および
該ＬＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、そして
システインが、該ＶＨドメインにおいて、配列番号９４の４４位のアミノ酸に対応するアミノ酸に存在し、そして、システインが、該ＶＬドメインにおいて、配列番号９５の１０３位のアミノ酸に対応するアミノ酸に存在し、
ＶＨドメインは、配列番号３または９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ＶＬドメインは、配列番号７または９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
該結合分子は、ＮＧＦとＴＮＦαに結合することができる、前記医薬組成物。

【請求項9】

抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項10】

抗ＮＧＦ ｓｃＦｖフラグメントは、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）₃（配列番号１５）、および
配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項11】

抗ＮＧＦ ｓｃＦｖフラグメントは、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸２０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）₄（配列番号１９）、および配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項12】

ＴＮＦＲはＴＮＦＲ－２であり、ＴＮＦＲ－２フラグメントは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合している、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項13】

免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項14】

ＴＮＦαアンタゴニストは、配列番号１３に記載するアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列、またはその機能的なフラグメントを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項15】

ＴＮＦαアンタゴニストは、配列番号１３のアミノ酸１～２３５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項16】

結合性分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号１３のアミノ酸１～２３５に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性フラグメント、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、アミノ酸１０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）₂（配列番号９８）、配列番号３または９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）₃（配列番号１５）、および配列番号７または９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項17】

結合性分子は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項18】

結合性分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性７５ｋＤフラグメント、アミノ酸１０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）₂（配列番号９８）、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸２０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）₄（配列番号１９）、および配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項19】

結合性分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項20】

結合性分子は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項21】

疼痛は、神経因性疼痛、急性疼痛、短期間の疼痛、持続性もしくは慢性の侵害受容性疼痛、または持続性もしくは慢性の神経因性疼痛である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項22】

（ａ）疼痛は、糖尿病性神経因性疼痛であるか；
（ｂ）疼痛は、接触性異痛症、神経痛、反射性交感神経性ジストロフィー／カウサルギー、癌性疼痛、幻肢痛、絞扼性ニューロパシー、および末梢神経障害から選択される神経因性疼痛であるか；
（ｃ）疼痛は、外科手術、創傷、帯状疱疹、糖尿病性神経障害、足もしくは手の切断、もしくは癌による、神経損傷後の神経因性疼痛であるか；
（ｄ）疼痛は、例えば、糖尿病、ＨＩＶ、慢性的なアルコール使用、毒素に対する曝露、もしくはビタミン欠乏症による末梢神経障害であるか；
（ｅ）疼痛は、慢性侵害受容性疼痛であるか；
（ｆ）疼痛は、炎症性の侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、もしくは両方を含む慢性疼痛であるか；または
（ｇ）疼痛は、骨関節炎もしくは関節リウマチの疼痛である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１４年２月２日出願の米国仮特許出願第６１／９３４，８２８号の利益を主張するものである。上記に言及した出願の教示を全て、参照によって本明細書に組み入れる。

【0002】

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出した配列表を含み、その全文を参照によって本明細書に組み入れる。前記ＡＳＣＩＩのコピーは２０１５年１月２９日に作成したものであり、１１０４２１－００５４－ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズ１３４，７２１バイトである。

【背景技術】

【0003】

疼痛は、それに対して医学的支援が探求される最も一般的な症状の１つであり、医師を訪れる全患者の主訴の半数である。疼痛の薬物療法は多数存在し広く使用されているものの、疼痛、特に慢性疼痛の排除は成功していない。よって、社会に対する負担は依然として大きい。様々な研究により、疼痛は、毎年５０００万日の就業時間の喪失、および生産力の６１２億ドルの喪失をもたらすことが推定される。慢性疼痛患者では、利用可能な処方処置の選択肢で疼痛をマネージできるのは約半数にすぎない。また、疼痛の処方薬物療法の市場の合計は、１年あたりおよそ２５０億ドルである。これらのデータが示唆する通り、安全かつ効果的な新規な鎮痛薬が依然として大いに必要とされている。

【0004】

分泌される神経成長因子（ＮＧＦまたはベータＮＧＦ）の組織レベルを低下させ、または効果を阻害する治療薬は、まさにこのような新規な鎮痛薬である可能性がある。ＮＧＦは神経系の発生においてよく知られている中心的な役割を果たすが；ＮＧＦは、動物およびヒトにおける疼痛を引き起こすため、疼痛に対する十分に確証された標的でもある。成人では、特にＮＧＦは、中枢および末梢のニューロンのサブセットの健康および生存を促進する（非特許文献１）。ＮＧＦは、これらのニューロンの機能的な特徴の変化の一因ともなり、侵害受容器と呼ばれる疼痛の感覚受容器の感受性または興奮性の緊張性制御を行う（非特許文献２；非特許文献３）。侵害受容器は、疼痛の知覚（侵害受容）を生じる様々な侵害刺激を感知し、中枢神経系に伝達する。ＮＧＦ受容体は侵害受容器上に位置する。ＮＧＦの発現は、傷害を受け、炎症を起こした組織で増大し、ヒトの疼痛状態で上方制御される。よって、侵害受容におけるＮＧＦの役割のため、ＮＧＦのレベルを低減するＮＧＦ結合性薬剤には鎮痛性の治療法として有用性がある。

【0005】

ＮＧＦ自体を皮下注射すると、ヒトおよび動物に疼痛を生ずる。注射したＮＧＦは、急速な温熱性痛覚過敏を引き起こし、引き続き遅延性の温熱性痛覚過敏および機械的異痛症を引き起こす（非特許文献４；非特許文献５）。内因性に分泌されるＮＧＦは同様に侵害受容促進性である。組織損傷が誘発するＮＧＦの放出および末梢における後続の作用は、「末梢性感作」のプロセスを介して、温熱性痛覚過敏の誘発において主要な役割を果たす（非特許文献６）。組織損傷は侵害受容促進性および炎症促進性のサイトカインの放出を促進し、これらがひいてはケラチン生成細胞および線維芽細胞からのＮＧＦの放出を誘発する。この放出されたＮＧＦは侵害受容器に直接作用して、侵害性の侵襲から数分以内に有痛性または侵害受容性の状態を誘発する。よって、ＮＧＦは間接的にも作用して、侵害受容性／疼痛状態を誘発し、その状態をフィードフォワード放出に維持する。これが肥満細胞の脱顆粒を誘発し、ヒスタミンおよびセロトニンなどの侵害受容促進性薬剤、ならびに重要なことに、より多くのＮＧＦを放出させ、また交感神経末端を刺激してノルアドレナリンなどの侵害受容促進性神経伝達物質を放出させ得る（非特許文献７）。

【0006】

ＮＧＦの組織レベルは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）およびカラゲナンを注射した動物で上昇する（非特許文献７；非特許文献８）。ＮＧＦは、ラットにおけるＤＲＧ（後根神経節）のカプサイシン応答を増強する。ＮＧＦレベルの上昇は、関節リウマチ（非特許文献９）または膀胱炎（非特許文献１０）に罹患している患者で実証されている。齧歯動物では、末梢神経損傷によりマクロファージ、線維芽細胞、およびシュワン細胞におけるＮＧＦのｍＲＮＡの発現が増大する（非特許文献１１）。トランスジェニックマウスにおけるＮＧＦの過剰発現は、野生型マウスの上記の神経損傷後の、神経因性疼痛挙動の増強をもたらす（非特許文献１２）。数時間および１５日にわたるＮＧＦレベルの上昇は、脊髄の侵害受容性経路におけるシナプスでの神経伝達の増強である、「中枢性感作」の促進において役割を果たす。中枢性感作は、持続性および慢性の痛覚過敏および異痛症をもたらす。このプロセスは、ＮＧＦとＮＧＦの高親和性受容体であるチロシン受容体キナーゼＡ（ｔｒｋＡ）との複合体の内部移行に関与すると考えられる。これらの複合体の、ＤＲＧにおける侵害受容器細胞体への逆行性の輸送は、脊髄の後角において、サブスタンスＰなどの侵害受容性神経ペプチドの分泌、またはカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化、およびＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体活性化を増強し（非特許文献１３）、侵害受容経路の感作を促進する全てのプロセスを増強する。ＮＧＦは、ナトリウムチャネルサブタイプおよびカプサイシン受容体、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）を含めた、電位依存性およびリガンド開口型のイオンチャネルの上方制御および再分布における役割も果たす（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。伝達物質、受容体、およびイオンチャネルの活性および／または発現の改変が、神経因性疼痛状態に関連する侵害受容器の感受性および興奮性の増大の根底にある。

【0007】

ＮＧＦ誘発性の侵害受容／疼痛は、高親和性のＮＧＦ受容体であるｔｒｋＡ（チロシン受容体キナーゼ－Ａ）によって媒介される（非特許文献１７）。ＤＲＧにおける侵害受容器細胞体の約４０～４５％がｔｒｋＡを発現する。これらは、直径の小さい繊維、すなわちＣ線維の細胞体であり、分泌される侵害受容促進性ペプチドであるサブスタンスＰおよびＣＧＲＰも発現する。これらの線維は、後角のラミナＩおよびＩＩにおいて終結し、そこで中枢神経系に、末梢の侵害受容器が感知した侵害刺激を伝達する。ｔｒｋＡ遺伝子の変異または欠失は、ヒト（非特許文献１８）およびｔｒｋＡノックアウトマウス（非特許文献１９）の両方で、痛覚の喪失を特徴とする表現型を生ずる。ｔｒｋＡの発現が、関節炎（非特許文献２０）もしくは膀胱炎の（ｃｙｓｔｉｔｉｃ）疼痛（非特許文献２１）、またはＣＦＡもしくはカラゲナンの足中への注射によって誘発された炎症痛（非特許文献２２）のモデルに供された動物で上方制御されるのは意義深い。

【0008】

ＮＧＦは、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）にも結合する。ｐ７５ＮＴＲの役割は、その細胞環境に依存的であり、それと一緒に付属的な、または共受容体の機能を果たすと考えられている他の受容体の存在に依存的である。ｔｒｋＡとｐ７５ＮＴＲとの相互作用は、ＮＧＦに対する高親和性の結合部位の形成をもたらす。ＮＧＦ媒介性疼痛シグナリングにおけるこのような受容体の相互作用の重要性は明らかではないが、最近の研究は、関連し得る細胞プロセスへのｐ７５ＮＴＲの関与を示唆している（非特許文献２３）。しかし、ｐ７５ＮＴＲノックアウトマウスは侵害刺激に対する閾値の上昇を示すものの、ＮＧＦの痛覚過敏効果に依然として応答性であり、これらの効果を媒介するのにｔｒｋＡ受容体単独で十分であることが示唆される（非特許文献２４）。

【0009】

ＮＧＦの遮断により、慢性侵害受容性疼痛において、例えば、骨関節炎（ＯＡ）および慢性腰痛において、ＮＳＡＩＤに対し、段階的に変化する効果を生ずる。ＮＧＦを標的化する数々の治療用抗体の候補が、前臨床および臨床開発の様々な段階にある。このような抗体には、例えば、ＩｇＧ２フォーマットにおけるヒト化抗体であるタネズマブ（ＰＦ－
４３８３１１９；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＩｇＧ４フォーマットにおけるヒト抗体であるＳＡＲ１６４８７７／ＲＥＧＮ４７５（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ／Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＩｇＧ２フォーマットにおけるヒト抗体であるＡＭＧ４０３（Ａｍｇｅｎ／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）；ＩｇＧ４フォーマットにおけるヒト化抗体であるＰＧ１１０（ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ／Ａｂｂｏｔｔ）が含まれる。別の治療用抗体の一候補は特許文献１に開示されており、この開示は、ＮＧＦ抗体、およびＮＧＦが役割を果たす疾患または障害を開示した抗体で処置する方法に関する。ＭＥＤＩ－５７８はＩｇＧ４フォーマットにおけるヒト抗体である。これらの候補が開発されているのにかかわらず、頑強な効果および改善された安全プロファイルを有するＮＧＦ結合性薬剤によって、広範囲の疼痛状態に鎮痛性の軽減を提供する必要性が依然としてある。

【0010】

腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、カケクチンとも呼ばれ、細胞毒性、免疫細胞の増殖、炎症、腫瘍原性、およびウイルス複製を含めた広範囲の生物学的活性を有する多面的なサイトカインである。非特許文献２５。ＴＮＦαは、膜貫通型タンパク質（ｔｍＴＮＦα）として最初に生成され、次いでメタロプロテイナーゼによって可溶型（ｓＴＮＦα）に切断される。非特許文献２６。ＴＮＦα（約１７ｋＤａ）は、強固なホモ三量体分子として存在し、細胞表面ＴＮＦ受容体１またはＴＮＦ受容体２に結合し、受容体のオリゴマー形成およびシグナル伝達を誘発する。

【0011】

炎症性サイトカイン、特にＴＮＦαは、痛覚過敏の発生における役割があることが知られている。非特許文献２７。いくつかの予備的なデータが、ＴＮＦαインヒビターは神経因性疼痛のコントロールにおいて有用であり得ることを示している。例えば、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０を参照されたい。神経因性疼痛の処置における単一の治療法としてＴＮＦαインヒビターを試験する臨床試験からの結果は、依然として結論が出ていない。非特許文献２７を参照されたい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】ＷＯ２００６／０７７４４１

【非特許文献】

【0013】

【文献】ＨｕａｎｇおよびＲｅｉｃｈａｒｄｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：６７７～７３６頁（２００１）

【文献】Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、８０：４９５～５０５頁（２００２）

【文献】Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、７：１３～１７頁（２００１）

【文献】Ｐｅｔｔｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：２４４～４６頁（１９９４）

【文献】ＭｃＡｒｔｈｕｒら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５４：１０８０～８８頁（２０００）

【文献】ＭｅｎｄｅｌｌおよびＡｒｖａｎｉａｎ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．、４０：２３０～３９頁（２００２）

【文献】ＭａおよびＷｏｏｌｆ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．、８：８０７～１０頁（１９９７）

【文献】ＡｍａｎｎおよびＳｃｈｕｌｉｇｏｉ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、２７８：１７３～７８頁（２０００）

【文献】ＡｌｏｅおよびＴｕｖｅｒｉ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１５：４３３～３８頁（１９９７）

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【文献】Ｒａｍｅｒら、Ｐａｉｎ、補完６：Ｓ１１１～２０頁（１９９８）

【文献】Ｓａｈら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．、２：４６０～７２頁（２００３）

【文献】Ｍａｍｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：４８９０７～１３頁（１９９９）

【文献】Ｆｊｅｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、５７：３９～４７頁（１９９９）

【文献】Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、８０：４９５～５０５頁（２００２）

【文献】Ｓａｈら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃ．、２：４６０～７２頁（２００３）

【文献】Ｉｎｄｏ、Ｃｌｉｎ．Ａｕｔｏｎ．Ｒｅｓ．、１２巻（補完１）：Ｉ２０～Ｉ３２頁（２００２）

【文献】ｄｅ Ｃａｓｔｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１０：１４６～５２頁（１９９８）

【文献】Ｐｏｚｚａら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２７：１１２１～２７頁（２０００）

【文献】ＱｉａｏおよびＶｉｚｚａｒｄ、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４５４：２００～１１頁（２００２）

【文献】Ｃｈｏら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、７１６：１９７～２０１頁（１９９６）

【文献】ＺｈａｎｇおよびＮｉｃｏｌ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、３６６：１８７～９２頁（２００４）

【文献】Ｂｅｒｇｍａｎｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、２５５：８７～９０頁（１９９８）

【文献】Ｋｉｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７４：１３７４頁（２００７）

【文献】Ｗａｌｌｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、８巻（１０）：６０１頁（２００８）

【文献】Ｌｅｕｎｇ，Ｌ．およびＣａｈｉｌｌ，ＣＭ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、７：２７頁（２０１０）

【文献】Ｓｏｍｍｅｒ Ｃら、Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．、６：６７～７２頁（２００１）

【文献】Ｃｏｈｅｎら、Ａ＆Ａ、２０１３年２月、１１６、２、４５５～４６２頁

【文献】Ｇｅｎｅｖａｙら、Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ、２００４、６３、１１２０～１１２３頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

疼痛の試験にＮＧＦ標的化およびＴＮＦα標的化の候補が開発されているのにも関わらず、現在の標準的なケアより有効性の優れた薬剤によって、様々な疼痛状態に対する鎮痛性の軽減を提供することが依然として必要とされている。本開示は、有効性を増大し、疼痛患者に対して投与の量および頻度の両方を低減する潜在性のあり得る、ＮＧＦおよびＴＮＦαの両方を標的化する併用処置を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本開示は、対象における疼痛をコントロールするための方法であって、有効量の神経成長因子（ＮＧＦ）アンタゴニストおよび腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アンタゴニスト、またはＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む結合性分子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、投与は、単独で投与する等量のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストよりも効果的に、対象における疼痛をコントロールする。いくつかの実施形態において、本方法は、ＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストを同時投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストを、逐次的または同時に投与する。

【0016】

いくつかの実施形態において、本方法は、対象における疼痛を、防ぎ、低減し、軽減し、または除去するのに十分である。いくつかの実施形態において、疼痛は、急性疼痛、短期間の疼痛、持続性もしくは慢性の侵害受容性疼痛、または持続性もしくは慢性の神経因性疼痛である。いくつかの実施形態において、本方法は、対象における疼痛をコントロールするのに、単独で投与する等量のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％効果的である。

【0017】

いくつかの実施形態において、結合性分子のＴＮＦαアンタゴニストポーションは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。

【0018】

いくつかの実施形態において、結合性分子のＮＧＦアンタゴニストポーションは、抗ＮＧＦ抗体、またはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＴｒｋＡ、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲの両方に対するＮＧＦの結合を阻害することができる。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦのｐ７５ＮＴＲに対する結合よりもＮＧＦのＴｒｋＡに対する結合を優先的にブロックする。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、約０．２５～０．４４ｎＭの親和性でヒトＮＧＦに結合する。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＭＥＤＩ－５７８と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＭＥＤＩ－５７８のヒトＮＧＦに対する結合を競合的に阻害する。

【0019】

いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＨドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＬドメインを含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４または最高２個のアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号５または最高２個のアミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号６、最高２個のアミノ酸置換を有する配列番号６、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）、またはＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１は、配列番号８または最高２個のアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号９または最高２個のアミノ酸置換を有する配列番号９のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号１０または最高２個のアミノ酸置換を有する配列番号１０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号
３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９４のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、Ｈ_２Ｌ_２抗体全体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ヒト化、キメラ、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）、または完全ヒトのものである。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖフラグメントである。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖはＳＳ安定化されている。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖフラグメントは、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１５）、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖフラグメントは、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸２０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_４（配列番号１９）、および配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0021】

いくつかの態様において、本方法は、ＴＮＦαのＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）に対する結合を阻害するＴＮＦαアンタゴニストを投与し、それによりＴＮＦα活性をブロックすることを含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαアンタゴニストは、抗ＴＮＦα抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＨドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のＣＤＲのセットを含む抗体ＶＬドメインを含み、ＣＤＲは、インフリキシマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、またはアダリムマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と同一である。

【0022】

いくつかの実施形態において、結合性分子は、完全な抗ＴＮＦα抗体、および抗ＴＮＦα抗体の重鎖のＣ末端に融合している抗ＮＧＦ ｓｃＦｖを含む。この結合性分子は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖を含むことができる。

【0023】

いくつかの実施形態において、ＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦＲの可溶性ＴＮＦα結合性フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲ－２またはその可溶性フラグメントである。他の実施形態において、ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲ－１またはその可溶性フラグメントである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲ－１の可溶性フラグメントは５５ｋＤフラグメントである。他の実施形態において、ＴＮＦＲ－２フラグメントの可溶性フラグメントは７５ｋＤフラグメントである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＲフラグメントは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合している。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインで
ある。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαアンタゴニストは、配列番号１３に記載するアミノ酸配列のセット、またはその機能的なフラグメントを有する。

【0024】

いくつかの実施形態において、結合性分子は、リンカーを介してＴＮＦαアンタゴニストに融合しているＮＧＦアンタゴニストを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、結合性分子は、融合タンパク質のホモ二量体である。

【0025】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメインであり、ＴＮＦαアンタゴニストは、そのカルボキシ末端が免疫グロブリンＦｃドメインに融合しているＴＮＦＲ－２の、可溶性ＴＮＦα結合性フラグメントである。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、リンカーを介して免疫グロブリンＦｃドメインのカルボキシ末端に融合している。

【0026】

いくつかの実施形態において、結合性分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性７５ｋＤフラグメント、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、アミノ酸１０個のリンカー（ＧＧＧＧＳ）_２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_３、（配列番号１５）、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。いくつかの実施形態において、結合性分子は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。いくつかの実施形態において、結合性分子は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、結合性分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性７５ｋＤフラグメント、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、アミノ酸１０個のリンカー（ＧＧＧＧＳ）_２、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨ、アミノ酸２０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_４、（配列番号１９）、および配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。いくつかの実施形態において、結合性分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。いくつかの実施形態において、結合性分子は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。

【0028】

いくつかの実施形態において、結合性分子は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性７５ｋＤフラグメント、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、リンカー配列、および抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメインを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。

【0029】

本開示は、細胞におけるｐ３８リン酸化を阻害するための方法も提供し、本方法は、細胞を、本明細書に記載する任意のポリペプチド（例えば、本明細書に記載するＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む任意の結合性分子）と接触させることを含む。本開示は、細胞におけるＥＲＫリン酸化を阻害するための方法も提供し、本方法は、細胞を、本明細書に記載する任意のポリペプチド（例えば、本明細書に記載するＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む任意の結合性分子）と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、細胞は神経細胞である。他の実施形態において、細胞は末梢神経細胞である。さらに他の実施形態において、細胞は中枢神経細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物における。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、細胞は細胞の培養物中にある。

【0030】

本開示は、本明細書に開示する結合性分子をコードするポリヌクレオチド配列、これら
のポリヌクレオチド配列を含むベクター、およびこれらのポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も提供する。

【0031】

本開示は、本明細書に記載する結合性分子を生成する方法も提供する。

【0032】

本開示は、本明細書に記載する結合性分子を含む組成物、医薬組成物、およびキットも提供する。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質（パネルＡ）、および抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメインに融合しているＴＮＦＲ２－Ｆｃドメインを含む、例示的な多特異的結合性分子であるＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（パネルＢ）を示す概略図である。

【図2】図２Ａは、精製したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のバッチにおける凝集物、モノマー、およびタンパク質断片化のレベルのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。図２Ｂは、還元および非還元条件下での、精製したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４および精製したＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。ゲルローディングの順序：１．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４、２．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＬ－ＶＨ（リバースの可変ドメイン遺伝子の配向で抗ＮＧＦ ｓｃＦｖに融合しているＴＮＦＲ２－Ｆｃ）、３．ＴＮＦＲ２－Ｆｃに無関係のｓｃＦｖ１、４．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ、５．ＴＮＦＲ２－Ｆｃに無関係のｓｃＦｖ２。

【図3】図３Ａは、プロテインＡカラム精製後のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の純度を示す図である。図３Ｂは、ＳＰセファロースカラム上で第２の精製工程後のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の純度を示す図である。

【図4】示差走査熱量測定を用いたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の安定性分析を示す図である。

【図5】ＥＬＩＳＡによって決定した、ＴＮＦαおよびＮＧＦの単一および一緒の両方に対するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の結合を示す図である。図５Ａは、ＮＧＦに対する結合を示し、図５ＢはＴＮＦαに対する結合を示し、図５ＣはＴＮＦαおよびＮＧＦに対する同時の結合を示す。

【図6】ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の表面プラズモン共鳴結合アッセイのセンサーグラムを示す図である。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４多特異的抗体の同時発生的な抗原結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて行った。同時の抗原結合を、センサー表面に結合しているＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を上回る、ＴＮＦαおよびＮＧＦの連続的な結合により評価した。センサーグラムの第１の部分は、多特異的抗体に対する飽和量のＴＮＦαの結合を示し、センサーグラムの第２の部分は、再びＴＮＦα（表面が飽和されていたことを示す）、または等モルのＴＮＦαおよびＮＧＦの混合物のいずれかである第２の抗原を適用した場合の結合を示す。共鳴単位の増大は、多特異的分子に対するＮＧＦの結合に、ゆえに同時の抗原の係合に同等であった。アッセイを、逆の順序で抗原を加えてやはり行い、これらのデータを確認した。

【図7-1】ＴＦ－１細胞のＮＧＦ媒介性増殖の阻害を示す図である。Ａ．ＮＧＦアンタゴニスト添加の非存在下のＮＧＦ媒介性増殖。Ｂ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４によるヒトＮＧＦ応答の阻害。Ｃ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４によるマウスＮＧＦ応答の阻害。ＮＧＦの活性は通常ＲＬＵ－相対発光単位で表され、ＮＧＦ媒介性増殖の％は、以下の式：１００^＊（ウエルのＲＬＵ－バックグラウンドのＲＬＵ）／（合計ＲＬＵ－バックグラウンドのＲＬＵ）を用いてＮＧＦリガンド単独に対する応答％として算出され、式中、バックグラウンドのＲＬＵ＝培地対照の平均、およびＲＬＵ合計＝リガンドのみの対照の平均である。Ｄ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶａｒＢおよびヌディマブ（ｎｄｉｍａｂ）ＶａｒＢによるヒトＮＧＦ応答の阻害。Ｅ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶａｒＢおよびヌディマブＶａｒＢによるマウスＮＧＦ応答の阻害。

【図7-2】図７－１の続き。

【図8-1】Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性の阻害を示す図である。Ａ．ＴＮＦαアンタゴニスト添加の非存在下の、Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性。Ｂ．アンタゴニスト添加の非存在下の、応答のパーセントとして示す、Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性の阻害。ＴＮＦの活性は通常、相対蛍光単位ＲＦＵとして表され、ＴＮＦ媒介性カスパーゼ３放出の％を、上記図７Ｃにおいて記載する式を用いて、ＴＮＦリガンド単独に対する応答％として算出した：Ｃ．関連の分子ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢおよびヌディマブＶａｒＢに対して同様の結果が示される。

【図8-2】図８－１の続き。

【図9】部分的坐骨神経ライゲーション誘発性機械的痛覚過敏に対する、エタネルセプトおよびＭＥＤＩ－５７８での併用処置の効果を示す図である。結果を、同側／反対側比として示す。１群あたりＮ＝９～１０。データを、時間および処置を依存性因子として、二元配置のＡＮＯＶＡ分析を用いて分析した。引き続き、統計学的有意性をボンフェローニの事後検定を用いて得た。^＊＊＊Ｏｐ＋ＣＡＴ－２５１対照に対してｐ＜０．００１

【図10A】部分的坐骨神経ライゲーション誘発性機械的痛覚過敏に対するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を示す図である。結果を、同側／反対側比として示す。１群あたりＮ＝１０。データを、時間および処置を依存性因子として、二元配置のＡＮＯＶＡ分析を用いて分析した。引き続き、統計学的有意性をボンフェローニの事後検定を用いて得た。^＊＊＊二特異的アイソタイプ対照に対してｐ＜０．００１。

【図10B】関連分子であるＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢと同様の結果を示す図である。

【図11】ＭＥＤＩ－５７８およびエタネルセプトの同時投与の、機械的痛覚過敏の関節痛モデルにおける疼痛減少に対する効果を示す図である。１群あたりＮ＝９～１０。データを、二元配置のＡＮＯＶＡ分析を用いて分析した。引き続き、統計学的有意性をボンフェローニの事後検定を用いて得た。^＊ｐ＞０．０５、^＊＊＊ＣＡＴ－２５１対照に対してｐ＜０．００１

【図12】機械的痛覚過敏の関節痛モデルにおける疼痛減少に対するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を示す図である。１群あたりＮ＝９～１０。データを、二元配置のＡＮＯＶＡ分析を用いて分析した。引き続き、統計学的有意性をボンフェローニの事後検定を用いて得た。^＊＊＊二特異的アイソタイプ対照に対してｐ＜０．００１。

【図13】ラットモデルにおける、５つの異なる用量のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの、ＣＦＡ誘発性痛覚過敏に対する効果を示す図である。

【図14】ホスホ－ｐ３８反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップである。

【図15】ＴＮＦα、ＮＧＦ、またはＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せの、ｐ３８リン酸化に対する効果を示す用量反応曲線である。

【図16】ホスホ－ＥＲＫ反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップである。

【図17】ＴＮＦα、ＮＧＦ、またはＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せの、ＥＲＫリン酸化に対する効果を示す用量反応曲線である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

定義
「一つの（ａ）」または「一つの（ａｎ）」の実体の語は、その実体の１つまたはそれ以上を意味することに留意されたい。したがって、「一つの（ａ）」（または「一つの（ａｎ）」、「１つまたはそれ以上」、および「少なくとも１つ」の語は、本明細書において交換可能に用いることができる。

【0035】

さらに、「および／または」は、本明細書で用いる場合、２つの特定する特徴または構成成分の各々の、他の特徴もしくは構成成分と一緒の、または他の特徴もしくは構成成分なしでの特定の開示と理解されたい。よって、本明細書の「Ａおよび／またはＢ」などの句において用いる「および／または」の語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」
（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句において用いる「および／または」の語は、以下の態様の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

【0036】

態様を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の言語とともに本明細書に記載する場合はいつでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の語で記載する他の同様の態様も提供されることが理解される。

【0037】

別段の規定がなければ、本明細書で用いる技術用語および科学用語は全て、本開示が関する技術分野における通常の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ、Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ、第２版、２００２年、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｅｖｉｓｅｄ、２０００年、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示において用いる多くの用語の全般的な辞書を当業者に提供する。

【0038】

単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ）（ＳＩ）が認めた形態において記載する。数字の範囲は、範囲を規定する数を含める。別段の指示がなければ、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシの向きにおいて記す。本明細書に提供する見出しは本開示の多様な態様を限定するものではなく、本明細書を全体として参照することによって有することができる。したがって、直下に規定される語は、その全文を本明細書に参照することにより、より全体的に規定される。

【0039】

本明細書で用いる「結合性分子」の語は、その最も広い意味において、抗原決定基、例えば抗原に特異的に結合する分子を意味する。結合性分子の非限定的な例には、抗原特異的な結合を各々保持する、抗体またはそのフラグメント、可溶性受容体融合タンパク質またはそのフラグメント、非免疫グロブリン骨格またはそのフラグメントが含まれる。例示的な非免疫グロブリン骨格には、Ｔｎ３（Ｋｏｉｄｅら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０１２年１月１３日；４１５巻（２）：３９３～４０５頁）、ＤＡＲＰｉｎ（ＢｏｅｒｓｍａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１、２２巻（６）：８４９～５７頁）、アンチカリン（ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０１２；５０３：１５７～８８頁）が含まれる。例示的な可溶性受容体融合タンパク質および抗体を以下に提供する。ある実施形態において、結合性分子は、このような抗体またはそのフラグメント、可溶性受容体融合タンパク質またはそのフラグメント、および非免疫グロブリンベースの骨格またはそのフラグメントの組合せを含むように操作することができる。

【0040】

抗原を認識する結合性分子、または結合性分子のあらゆるポーションを、本明細書において「結合性ドメイン」と呼ぶ。天然に存在する抗体などのフルサイズの結合性分子に特に言及しなければ、「結合性分子」の語は、制限なく、フルサイズの抗体または他の非抗体結合性分子、およびこのような結合性分子の抗原結合性フラグメント、バリアント、類似体、または誘導体、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子、またはフルサイズの結合性分子と同様に抗原に結合する、操作されている結合性分子もしくはフ
ラグメントを包含する。

【0041】

ある実施形態において、本開示は、ある種の多特異的結合性分子、例えば、二特異的、三特異的、四特異的などの結合性分子、またはこれらの抗原結合性フラグメント、バリアント、もしくは誘導体を提供する。本明細書で用いる、多特異的結合性分子は、１つもしくはそれ以上の抗体結合性ドメイン、１つもしくはそれ以上の非抗体結合性ドメイン、またはこれらの組合せを含むことができる。

【0042】

「神経成長因子」（「ＮＧＦ」）の語は、文献においてベータ神経成長因子とも呼ばれ、本明細書で用いる通り、様々なニューロンの成長および生存において機能する、分泌されたタンパク質を意味する。ヒトＮＧＦはＧｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＮＰ＿００２４９７．２と表され、本明細書では配列番号１と表す。本明細書で用いるＮＧＦの語は、ヒトＮＧＦに限定されず、ヒトＮＧＦの全種のオルソログを含む。「ＮＧＦ」の語は、ＮＧＦのプロ型、プロＮＧＦ、全長のＮＧＦ、および細胞内のプロセシングに起因するあらゆる形態のＮＧＦを包含する。この語は、天然に存在するＮＧＦのバリアント、例えば、スプライスバリアント、アレルのバリアント、およびイソ型も包含する。ＮＧＦは、２つの受容体：ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５（ＮＴＲ））および膜貫通型チロシンキナーゼであるＴｒｋＡに結合することができる。ＮＧＦは、侵害受容器の感作を媒介することが知られている疼痛に対する、十分に確証されている標的である。

【0043】

様々な薬剤が、ＮＧＦ活性のアンタゴニストとして試験されている。このような抗ＮＧＦ剤の１つがｔｒｋＡ－Ｆｃであるが、ｔｒｋＡ－Ｆｃは内在性ＮＧＦに結合し、それによって内在性ＮＧＦを失活させる、囮またはスカベンジャーとして作用する。ＴｒｋＡ－Ｆｃは、ＩｇＧ抗体の定常ドメインフラグメント（Ｆｃ）に連結している、ｔｒｋＡのＮＧＦ結合性領域からなる融合タンパク質である。ＴｒｋＡ－Ｆｃは、ナイーブ動物において痛覚鈍麻を生成し、侵害受容器の応答を低減し、無髄の痛覚ニューロンの出芽を低減する（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．Ｌ．ら（１９９８）Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１０：１２８２～９１頁）。

【0044】

ＮＧＦレベルは侵害刺激に応答して末梢で増大し、抗体の血液脳関門透過性は低いため、ＮＧＦ媒介性疼痛は、本明細書に記載する結合性分子での安全で効果的な処置に特に良好に適する。本明細書に記載する治療法および組成物において用いることができる、数々の抗ＮＧＦ抗体およびその抗原結合性フラグメントは文献において見出すことができ、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９６４５８およびＷＯ０４／０３２８７０を参照されたい。

【0045】

「ＭＥＤＩ－５７８」の語は、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を意味し、これは、両方ともその全文を参照によって本明細書に組み入れる、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００２３８号および米国特許出願公開第２００８／０１０７６５８ Ａ１号の主題である。ＭＥＤＩ－５７８の重鎖および軽鎖の配列をそれぞれ、配列番号３および７に示す。

【0046】

ＮＧＦ－ＮＧの語は、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を意味する。ＮＧＦ－ＮＧ重鎖および軽鎖の配列をそれぞれ、配列番号２４および２６に示す。

【0047】

「腫瘍壊死因子アルファ」（「ＴＮＦα」）の語は、本明細書において、ＴＮＦリガンドのスーパーファミリーではなく、特定のＴＮＦαタンパク質を意味するのに用いる、カケクチン、ＡＰＣ１タンパク質；腫瘍壊死因子；ＴＮＦ；または腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー２とも、文献において呼ばれる。ヒトＴＮＦαは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＮＰ＿０００５８５．２と表され、配列番号２と表す。本明細書で用いるＴＮＦαの語はヒトＴＮＦに限定されず、ヒトＴＮＦαの全種のオルソログを含む。「Ｔ
ＮＦα」の語は、ＴＮＦαのプロ型、プロＴＮＦα、全長のＴＮＦα、および細胞内のプロセシングに起因するあらゆる形態のＴＮＦαを包含する。この語は、天然に存在する、および天然に存在しない、ＴＮＦαのバリアント、例えば、スプライスバリアント、アレルのバリアント、およびイソ型も包含する。ＴＮＦαは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ受容体１型；ＣＤ１２０ａ；ｐ５５／６０）およびＴＮＦＲ２（ＴＮＦ受容体２型；ＣＤ１２０ｂ；ｐ７５／８０）の２つの受容体に結合することができる。ＴＮＦαは、神経炎症における機能など、炎症誘発性サイトカインとして機能する。例えば、ＴＮＦαは、神経因性疼痛の産生において機能的に関与すると考えられている（Ｌｅｕｎｇ，Ｌ．およびＣａｈｉｌｌ，ＣＭ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、７：２７頁（２０１０））。

【0048】

多数のＴＮＦαアンタゴニストが当技術分野では知られており、多くが治療薬として市販されている。治療において用いることができる市販のＴＮＦアルファアンタゴニスト、および本明細書に提供する組成物の例として、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ／Ｐｆｉｚｅｒ）、インフリキシマブ（例えば、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、セルトリズマブペゴル（例えば、ＣＩＭＺＩＡ（登録商標）、ＵＣＢ）、ゴリムマブ（例えば、ＳＩＭＰＯＮＩ（商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、およびアダリムマブ（例えば、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）／ＴＲＵＤＥＸＡ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ）が含まれる。

【0049】

「単離された」結合性分子、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物は、天然に存在しない形態における、結合性分子、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物を意味する。単離された結合性分子、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物は、これらが最早天然に見出される形態ではない程度に、変化され、適用され、組み合わされ、復元され、操作され、または他の方法で扱われているものを含む。いくつかの態様において、単離された、結合性分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物は、「組換え」である。

【0050】

本明細書で用いる「多機能性ポリペプチド」および「二機能性ポリペプチド」の語は、２つ以上の抗原を標的化するようにデザインされている、天然に存在しない結合性分子を意味する。本明細書に記載する多機能性ポリペプチドは、２つの異なる所望の生物学的機能を単一の結合性分子にまとめるようにデザインされている、遺伝子操作した融合タンパク質であるのが典型的である。例えば、多機能性ポリペプチドは、多機能性結合性分子であってもよい。本明細書に記載する例示的な多機能性ポリペプチドは、ＮＧＦアンタゴニストドメイン（例えば、１つまたはそれ以上の天然のＮＧＦ機能をブロックし、低減し、または阻害するペプチドドメイン）、およびＴＮＦαアンタゴニストドメイン（例えば、１つまたはそれ以上の天然のＴＮＦα機能をブロックし、低減し、または阻害するペプチドドメイン）を含む多機能性結合性分子である。

【0051】

本明細書に提供する多機能性ポリペプチドの１グループは、多特異的結合性分子、例えば、１つもしくはそれ以上の抗体結合性ドメインを含む結合性分子、例えば「多特異的抗体」、１つもしくはそれ以上の非抗体結合性ドメイン、例えば囮受容体、またはこれらの組合せである。例えば、１つもしくはそれ以上の抗体結合性ドメイン、１つもしくはそれ以上の非抗体結合性ドメイン、またはこれらの組合せを含む多特異的結合性分子は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識し、結合することができる結合性ドメインを有する分子である。異なるエピトープは、同じ分子（例えば、同じＮＧＦ）内にあってもよく、または、例えば、ＮＧＦおよび別のエピトープ含有分子（例えばＴＮＦα）を特異的に認識し、結合することができる諸多特異的結合性分子がＮＧＦおよびＴＮＦαを特異的に認識するように異なる分子上にあってもよい。

【0052】

例えば、１つまたはそれ以上の抗体結合性ドメイン、１つまたはそれ以上の非抗体結合性ドメイン、またはこれらの組合せを含めた、多特異的結合性分子を作成するための技術は、当技術分野において入手できる（Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．ら、２００９、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３９３：６７２～９２頁；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７～５３９頁；Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１頁；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１：１２０頁；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５～３６５９頁；Ｓｈａｌａｂｙら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７～２２５頁；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７～１５５３頁；Ｇｒｕｂｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８頁；および米国特許第５，７３１，１６８号）。２価を超える抗体も企図される。例えば、三特異的抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７、６０頁（１９９１））。

【0053】

「抗体」の語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組合せなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いる「抗体」の語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、二特異的、三特異的、四特異的などの多特異的抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から産生された抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定ポーションを含む融合タンパク質、ならびに抗体が所望の生物学的活性を表すのであれば、抗原認識部位を含むあらゆる他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性にそれぞれ基づいた、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のいずれであってよい。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なり、かつよく知られているサブユニット構造および３次元立体配置を有する。

【0054】

いくつかの実施形態において、「ブロック性の」結合性分子、例えば、ブロック性の抗体、または「アンタゴニスト」結合性分子、例えばアンタゴニスト抗体または融合タンパク質は、ＮＧＦまたはＴＮＦαなどに結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。ある態様において、ブロック性の抗体またはアンタゴニスト結合性分子は、抗原の生物学的活性を、実質的または完全に阻害する。例えば、生物学的活性を、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに１００％低減することができる。本明細書で用いる「アンタゴニスト」および「アンタゴニストドメイン」は、その標的（例えば、ＴＮＦαまたはＮＧＦ）に結合し、それにより標的が受容体と相互作用するのをブロックまたは阻害するポリペプチドまたは他の分子を含む。ＮＧＦおよび／またはＴＮＦαアンタゴニストは、よって、ＮＧＦのｔｒｋＡもしくはｐ７５ニューロトロフィンとの相互作用を、またはＴＮＦαのＴＮＦＲ－１もしくはＴＮＦＲ－２との相互作用をブロックまたは阻害する分子を含む。ＮＧＦおよび／またはＴＮＦαアンタゴニストは、ｐ３８リン酸化および／またはＥＲＫリン酸化を低減する分子も含む。例示的なアンタゴニストには、それだけには限定されないが、抗体またはその抗原結合性フラグメント、および標的特異的な、可溶性の、非シグナリング受容体ペプチド（「囮受容体」もしくはそのリガンド結合性フラグメント）が含まれる。

【0055】

「抗体フラグメント」の語は、インタクトな抗体のポーションを意味し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を意味する。抗体フラグメントの例には、それだけには限定され
ないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント、直鎖状抗体、単鎖抗体、および抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が含まれる。本明細書の他所に記載する、非抗体結合性分子の抗原結合性フラグメントも、本開示が提供するものである。

【0056】

「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基すなわちエピトープの極めて特異的な認識および結合に関与する均一な抗体の集団を意味する。これは、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体と対照的である。「モノクローナル抗体」の語は、インタクトおよび全長両方のモノクローナル抗体、および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体ポーションを含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含むあらゆる他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、それだけには限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物によるものを含めた、任意の数々の方法において作成された抗体を意味する。

【0057】

「ヒト化抗体」の語は、最小の非ヒト（例えばマウス）配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラの免疫グロブリン、またはこれらのフラグメントである、非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を意味する。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター）のＣＤＲからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２～５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３～３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４～１５３６頁）。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種からの抗体における相当する残基で置き換えられている。ヒト化抗体を、Ｆｖフレームワーク領域および／または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかにおけるさらなる残基の置換によってさらに修飾して、抗体の特異性、親和性、および／または能力を改良し最適化することができる。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに相当するＣＤＲ領域の全て、または実質的に全てを含む可変ドメインの、少なくとも１つの、典型的には２つまたは３つの実質的に全てを含み、全ての、または実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンのものであるのが典型的である免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくともポーションも含むことができる。ヒト化抗体を産生するのに用いられる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号または第５，６３９，６４１号に記載されている。

【0058】

抗体の「可変領域」は、単独または組合せいずれかにおける、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を意味する。重鎖および軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続される、４つのフレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲによって互い非常に接近して保持され、他の鎖からのＣＤＲが抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための技術は少なくとも２つ存在する：（１）異種間の配列可変性に基づく取組み（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、（第５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；および（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく取組み（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２７３：９２７～９４８頁））。加えて、ＣＤＲを決定するために、当技術分野において、これら２つの取組みを組み合わせたものがときに用いられる。

【0059】

可変ドメインにおける残基に言及する場合、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムが一般的に用いられる（軽鎖の残基およそ１～１０７および重鎖の残基およそ１～１１３）（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。

【0060】

Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置のナンバリングは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）における抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの編集に用いられるナンバリングシステムを意味する。このナンバリングシステムを用いると、実際の直鎖状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮、またはＦＲもしくはＣＤＲへの挿入に相当する、数個またはさらなるアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ）を含むことができる。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準の」Ｋａｂａｔナンバリングした配列と、抗体の配列のホモロジーの領域でのアラインメントによって、所与の抗体に対して決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに、構造上のループの位置に言及している（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～９１７頁（１９８７））。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｈ１ループの終端は、Ｋａｂａｔナンバリングの従来法を用いてナンバリングした場合、ループの長さに応じてＨ３２からＨ３４の間で変動する（これはＫａｂａｔのナンバリングスキームがＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂの挿入を位置付けるからであり；３５Ａも３５Ｂも存在しなければループは３２で終わり；３５Ａだけが存在すればループは３３で終わり；３５Ａおよび３５Ｂの両方が存在すればループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造上のループとの間の折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアによって用いられる。比較を以下の表１に提供する。

【0061】

【表1】

【0062】

「ヒト抗体」の語は、天然のヒト抗体、または当技術分野では知られている任意の技術を用いて作成された、天然のヒト抗体に相当するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、インタクトもしくは全長の抗体、これらのフラグメント、なら
びに／または少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖およびヒト重鎖のポリペプチドを含む抗体が含まれる。

【0063】

「キメラ抗体」の語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を意味する。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有する１種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に相当し、定常領域は、その種における免疫応答を誘発するのを避けるために別の種（通常ヒト）に由来する抗体における配列に相同である。１つまたはそれ以上の抗体結合性ドメイン、１つまたはそれ以上の非抗体結合性ドメイン、またはこれらの組合せ、例えば、本明細書に提供するＴＮＦαアンタゴニストおよび／またはＮＧＦアンタゴニストを含む多特異的結合性分子は、天然の、または非変更の定常領域を含むおよそ同じ免疫原性の抗体と比べ、腫瘍の局在化の増大、または血清半減期の短縮など、所望の生化学的特徴を提供するために、１つまたはそれ以上の定常領域ドメインの少なくともフラクションが欠失され、でなければ変更されている抗体の定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を含むことができる。本明細書に提供する修飾された定常領域は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３）のうちの１つもしくはそれ以上に対する、および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する、変更または修飾を含むことができる。いくつかの態様において、１つまたはそれ以上の定常ドメインは、部分的または全体的に欠失し得る。いくつかの態様において、ＣＨ２ドメイン全体が欠失し得る（ΔＣＨ２構築物）。例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ Ｖら、２００８、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６４：７００～４頁；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ Ｖら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４６：１７５０～５頁；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ら、２００６．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１：２３５１４～２３５２４頁；およびＤａｌｌ’Ａｃｑｕａら、２００２．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９：５１７１～５１８０頁を参照されたい。

【0064】

「エピトープ」または「抗原決定基」の語は本明細書において交換可能に用い、特定の抗体が認識し、特異的に結合することができる抗原のポーションを意味する。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、近接するアミノ酸、およびタンパク質を３次元的にフォールディングすることにより並置される近接しないアミノ酸の両方から形成することができる。近接するアミノ酸から形成されたエピトープは、タンパク質が変性するときに保持されるのが典型的であり、３次元的にフォールディングすることにより形成されたエピトープは、タンパク質が変性するときに失われるのが典型的である。エピトープは、独特の空間立体コンフォメーションにおける、少なくとも３つの、より通常は少なくとも５または８～１０個のアミノ酸を含むのが典型的である。本明細書に記載するエピトープを、エピトープを形成する特定のアミノ酸に対して規定する必要はない。いくつかの態様において、エピトープは、ポリペプチド抗原のペプチドサブユニットに対する結合を調べることにより、または抗原特異的抗体のグループによる抗原に対する結合の競合を調べることにより、同定することができる。

【0065】

「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、それらに対して診断、予後、または治療が望ましい、あらゆる対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜、家禽、スポーツ動物、および動物園の動物が含まれ、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどが含まれる。

【0066】

「組成物」および「医薬組成物」の語は、有効成分の生物学的活性を効果的にするような形態における調製物、および組成物を投与する対象に対して許容できないほど毒性である付加的な構成成分を含まない調製物を意味する。このような組成物は無菌であり得る。

【0067】

本明細書で用いる「有効量」および「治療有効量」の語は、対象における疼痛をコントロールするのに有効な、１つまたはそれ以上の治療用組成物の量を意味する。「疼痛をコントロールする」の語および文法上等価な語は、本明細書において、疼痛をコントロールする必要がある対象における、あらゆる有益な、または所望の効果を記述するのに用いられる。例えば、本明細書に記載する有効量の１つまたはそれ以上の治療用組成物は、対象において、例えば、疼痛を防ぎ、容認できるレベルの疼痛を維持し、疼痛を軽減し、疼痛を低減し、疼痛を最小にし、または疼痛を排除することができる。

【0068】

本明細書で用いる「投与する」の語は、対象に、本明細書に記載する１つまたはそれ以上の治療用組成物、例えば、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む二機能性ポリペプチド、ＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニストの組合せを含む治療用組成物、または一方がＮＧＦアンタゴニストを含み、一方がＴＮＦαアンタゴニストを含む別々の治療用組成物を投与することを意味する。「同時投与する」の語は、対象に、例えば、一方がＮＧＦアンタゴニストを含み、一方がＴＮＦαアンタゴニストを含む、２つ以上の治療用組成物を投与することを意味する。本明細書で用いる同時投与は、２つ以上の治療用組成物を対象に同時に投与することを含むが、必要とするものではない。２つ以上の治療用組成物を、対象に、逐次的に、例えば、３０分置いて、１時間置いて、２時間置いて、３時間置いて、４時間置いて、または５時間以上置いて投与することができる。本明細書に記載する同時投与の順序およびタイミングは、固定していてもよく、または健康管理の専門家の判断に基づいて変動してもよい。

【0069】

「ポリヌクレオチド」および「核酸」の語は、共有結合的に連結されているヌクレオチド残基を含む高分子化合物を意味する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、もしくは二本鎖、ベクター、プラスミド、ファージ、またはウイルスであってよい。

【0070】

「ベクター」の語は、宿主細胞において対象の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を１つまたはそれ以上送達し、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、それだけには限定されないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドもしくはファージベクター、陽イオン性縮合剤と会合しているＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されているＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、およびある種の真核細胞、例えば生成細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ）が含まれる。

【0071】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の語は、本明細書において交換可能に用いて、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを意味する。ポリマーは、直鎖でも、または分枝鎖でもよく、修飾されているアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸がポリマーを中断してもよい。この語はまた、天然に、または介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含し；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはあらゆる他の扱いもしくは修飾、例えば、標識化構成成分とのコンジュゲーションも包含する。定義内には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸なども含む）の１つまたはそれ以上の類似体を含むポリペプチド、および当技術分野では知られている他の修飾も含まれる。

【0072】

「保存的アミノ酸置換」は、一アミノ酸残基が、同様の側鎖を有する別の一アミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において規定されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニ
ルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。例えば、フェニルアラニンの、チロシンに対する置換は保存的置換である。ある態様において、本明細書に提供するポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含むポリペプチドの結合または他の機能的活性を抑止しない。機能に影響を及ぼさない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２：１１８０～１１８７頁（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１２：８７９～８８４頁（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４１２～４１７頁（１９９７）を参照されたい）。

【0073】

ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む結合性分子
本開示は、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む二機能性ポリペプチドを提供する。ある態様において、本明細書に提供する二機能性ポリペプチドの有効量の投与は、単独で投与する等量のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストを含む二機能性ポリペプチドよりも効果的に、それを必要とする対象における疼痛をコントロールすることができる。本明細書に提供する二機能性ポリペプチドは、あらゆる順序、構造、またはコンフォメーションにおける、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含むことができる。あらゆる適切なＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストが、本明細書に提供する二機能性ポリペプチドの一部であり得る。例示的なＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニストを、本開示の他所に記載する。

【0074】

ある態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ活性を阻害することができる非抗体分子またはその結合性ドメイン、例えば、ＴｒｋＡの可溶性ＮＧＦ結合性フラグメントである。ある態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントである。適切な抗ＮＧＦアンタゴニストは、例えば、ＴｒｋＡ、ｐ７５ＮＲＴ、またはＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＲＴの両方に対するＮＧＦの結合を阻害することができるアンタゴニスト抗体である。ある態様において、抗ＮＧＦアンタゴニスト、例えば、本明細書に提供する二機能性分子において用いるためのアンタゴニスト抗体またはそのフラグメント、例えば多機能性結合性分子は、ＮＧＦのｐ７５ＮＲＴに対する結合よりも、ＮＧＦのＴｒｋＡに対する結合を優先的にブロックすることができる。

【0075】

二機能性ポリペプチドにおいて用いるための、例示的な抗体またはそのフラグメント、例えば、本明細書に開示する多特異的結合性分子は、その全文を参照によって本明細書に組み入れる、米国出願公開第２００８／０１０７６５８号において入手できる。ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、抗ＮＧＦ抗体ＭＥＤＩ－５７８よりも高い親和性でＮＧＦを競合的に阻害することができ、またはＮＧＦに結合することができるのと同じエピトープに結合する。ある実施形態において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、１、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、または０．２ｎＭ以下の親和性でヒトＮＧＦおよび／またはラットＮＧＦに結合する。例えば、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ヒトＮＧＦに約０．２～０．８、０．２～０．７、０．２～０６、０．２～０．５、および／または０．２５～０．４４ｎＭの親和性で、ラットＮＧＦに約０．２～０．９、０．２～０．８、および／または０．２５～０．７０ｎＭの親和性で結合し得る。

【0076】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントはＭＥＤＩ－５７８である。ＭＥＤＩ－５７８は、クローン１２５２Ａ５として、米国出願公開第２００８／０１０７６５８号に開示されている。他の態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは
、タネズマブ（ＲＮ－６２４）、ヒト化抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｋｉｖｉｔｚら、（２０１３）ＰＡＩＮ、１５４、９、１６０３～１６１頁に記載されている）、フルラヌマブ、完全ヒト抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ａｍｇｅｎ；Ｓａｎｇａら、ＰＡＩＮ、１５４巻、１０号、２０１３年１０月、１９１０～１９１９頁に記載されている）；ＲＥＧＮ４７５／ＳＡＲ１６４８７７、完全ヒト抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎａｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＡＢＴ－１１０（ＰＧ１１０）、ヒト化抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。二機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子に含まれる抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、例えば、ヒト化、キメラ、霊長類化、または完全ヒトであってよい。

【0077】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＭＥＤＩ－５７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＨドメイン、保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を、最高１、２、３、４、５個、またはそれを超えて有するＭＥＤＩ－５７８重鎖ＣＤＲのバリアントを含む。例えば、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号４である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上、例えば、１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号４であるＨＣＤＲ１を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号５である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号５であるＨＣＤＲ２を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号６である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号６であるＨＣＤＲ３を含むことができる。ある態様において、ＨＣＤＲ３は、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）、またはＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むことができる。

【0078】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＭＥＤＩ－５７８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＬドメイン、最高１、２、３、４、５個、またはそれを超えるアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有するＭＥＤＩ－５７８の軽鎖ＣＤＲのバリアントを含む。ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号８である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号８であるＬＣＲＤ１を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号９である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号９であるＬＣＤＲ２を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号１０である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号１０であるＬＣＤＲ３を含むことができる。

【0079】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。

【0080】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号７のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬド
メインを含む。

【0081】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９４のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。

【0082】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号９５のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。

【0083】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、および９６のうちのいずれか１つの、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＨドメイン、または最高１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有するこれらのバリアントを含む。

【0084】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、および９７のうちのいずれか１つの、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＬドメイン、または最高１、２、３、４、５個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を有するこれらのバリアントを含む。

【0085】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、および９６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、および９６のうちのいずれか１つのＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。

【0086】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、および９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、および９７のうちのいずれか１つのＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。

【0087】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＮＧＦ－ＮＧのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＨドメイン、最高１、２、３、４、５、またはそれを超える保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有するＮＧＦ－ＮＧ重鎖ＣＤＲのバリアントを含む。例えば、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号８８である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号８８であるＨＣＤＲ１を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号８９である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号８９であるＨＣＤＲ２を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号９０である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号９０であるＨＣＤＲ３を含むことができる。

【0088】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、ＮＧＦ－ＮＧのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＬドメイン、最高１、２、３、４、５、またはそれを超える保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有するＮＧＦ－ＮＧ軽鎖ＣＤＲのバリアントを含む。ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号９１である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号９１であるＬＣＤＲ１を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号９２である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号９２であるＬＣＤＲ２を含むことができる。同様に、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列が正確に配列番号９３である、またはアミノ酸配列が１つもしくはそれ以上の、例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれを超えるアミノ酸置換を有する配列番号９３であるＬＣＤＲ３を含むことができる。

【0089】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号２４のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。

【0090】

ある態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＮＧＦ抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。

【0091】

多機能性ポリペプチド、例えば本開示が提供する多特異的結合性分子は、完全な抗ＮＧＦ抗体、すなわち、Ｈ_２Ｌ_２フォーマットにおける２本の完全な重鎖および２本の完全な軽鎖を含む抗体を含むことができる。抗ＮＧＦ抗体が完全な抗体である場合、１つまたはそれ以上のＴＮＦαアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体の１つもしくはそれ以上の重鎖のＮ末端もしくはＣ末端に、または抗ＮＧＦ抗体の１つもしくはそれ以上の軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端に融合することができる。あるいは、多機能性ポリペプチド、例えば本開示が提供する多特異的結合性分子は、抗ＮＧＦ抗体の抗原結合性フラグメントを含むことができる。ある態様において、抗ＮＧＦ抗体フラグメントは、抗体の定常ドメインの任意のポーションを含むことができ、または可変ドメインだけを含むことができる。多特異的結合性分子などの二機能性ポリペプチドに含まれるための、例示的な抗ＮＧＦ抗体フ
ラグメントには、それだけには限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが含まれる。

【0092】

本明細書に提供するある例示的な組成物において、抗ＮＧＦ抗体は、ｓｃＦｖフラグメント、例えば、ＭＥＤＩ－５７８のｓｃＦｖフラグメント、またはそのＮＧＦ結合性バリアントである。本明細書に提供するある例示的な組成物において、抗ＮＧＦ抗体は、ｓｃＦｖフラグメント、例えば、ＮＧＦ－ＮＧのｓｃＦｖフラグメント、またはそのＮＧＦ結合性バリアントである。抗ＮＧＦ ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインを、Ｎ－ＶＨ－ＶＬ－ＣまたはＮ－ＶＬ－ＶＨ－Ｃいずれかの任意の順序で含むことができる。ｓｃＦｖ分子は典型的には、ＶＨおよびＶＬドメインが柔軟なリンカーを介して接続されるように操作される。様々なリンカーを含めた例示的なｓｃＦｖ構造は、両方ともその全文を参照によって本明細書に組み入れる、Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３９３：６７２～９２頁（２００９）、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０７０５６５に見出すことができる。当業者には理解される通り、ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、標準のＦａｂのコンフォメーションに存在する可変ドメインに比べて安定性が低下し得る。いくつかの態様において、ｓｃＦｖは、安定化の変異を導入することにより、または鎖間ジスルフィド結合（複数可）（例えば、ＳＳ－安定化）を導入することにより、構造的に安定化することができる。しかし、安定化の変異および／または鎖間ジスルフィド結合の導入は必要とされず、ある態様においては存在しない。数々の、当技術分野が認める方法が、ｓｃＦｖポリペプチドを安定化するのに利用可能である。

【0093】

本明細書に提供する二機能性ポリペプチドのドメイン／領域を繋ぐのにリンカーを用いることができる。リンカーは、二機能性分子のＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを接続するのに用いることができ、ｓｃＦｖの可変重鎖および軽鎖を相互接続するのにも用いることができる。リンカーの例示的な、非限定的な例として、少なくとも４個の残基を含むポリペプチド鎖がある。このようなリンカーのポーションは、柔軟で、親水性であり、自身（リンカーポーションもしくは柔軟なリンカーポーション）の２次構造を殆どまたは全く有し得ない。二機能性ポリペプチド分子を組み立てた後、アミノ酸少なくとも４個のリンカーを用いて、相互に近く位置付けられるドメインおよび／または領域を繋げることができる。より長いリンカーも用いることができる。よって、リンカーは、残基約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個であってよい。リンカーはまた、例えば、残基約１００～１７５個でもよい。多数のリンカーを用いて二機能性ポリペプチド分子のポーションを相互接続する場合、リンカーは同じでも、または異なってもよい（例えば、同じもしくは異なる長さおよび／もしくはアミノ酸配列）。

【0094】

二機能性ポリペプチド分子におけるリンカー（複数可）は、所望の構造の形成を促進する。リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎ残基（式中、ｎは少なくとも１、２、および最高例えば３、４、５、６、１０、２０、５０、１００、もしくはそれを超える整数である）を含むことができ、いくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基が全体にわたって分散されて可溶性を増大する。あるいは、リンカーがＯ－連結グリコシル化に供される場合など、ある種のリンカーはいかなるセリン残基を含まない。いくつかの態様において、例えば、リンカーの二量体化を用いて二機能性ポリペプチドのドメインを適切にフォールディングされた立体配置にする場合、リンカーはシステイン残基を含むことができる。いくつかの態様において、二機能性ポリペプチドは、ポリペプチドのドメインを繋ぐポリペプチドリンカーを少なくとも１、２、３、４個、またはそれを超えて含むことができる。

【0095】

いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、残基１～５０個、残基１～２５個
、残基２５～５０個、または残基３０～５０個を含むことができる。いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、Ｆｃ部分のポーションを含むことができる。例えば、いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４抗体の免疫グロブリンヒンジドメインのポーション、またはこれらのバリアントを含むことができる。

【0096】

いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含むことができ、またはｇｌｙ－ｓｅｒリンカーからなっていてもよい。本明細書で用いる「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」の語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを意味する。例示的なｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎのアミノ酸配列を含み、式中、ｎは、少なくとも１、２、および最高、例えば、３、４、５、６、１０、２０、５０、１００、またはそれを超える整数である。いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子に由来する）の少なくともポーション、および一連のｇｌｙ－ｓｅｒアミノ酸残基（例えば、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎなどのｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を含むことができる。

【0097】

多機能性ポリペプチド、例えば多特異的結合性分子がｓｃＦｖを含む場合、柔軟なリンカーはｓｃＦｖの重鎖および軽鎖を接続することができる。この柔軟なリンカーは一般的にヒンジポーションを含まないが、むしろｇｌｙ－ｓｅｒリンカーまたは他の柔軟なリンカーである。ｓｃＦｖのドメインを相互接続する柔軟なリンカーの長さおよびアミノ酸配列は、容易に選択し、最適化することができる。

【0098】

ある態様において、多機能性ポリペプチド、例えば多特異的結合性分子は、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖフラグメントを含むことができ、このフラグメントは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨ、アミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_３、およびＶＬを含む。ある実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬを繋ぐリンカーは、アミノ酸２０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_４である。ある態様において、ＶＨは配列番号３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＶＬは配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＶＨは、配列番号２４、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、９４、および９６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＶＬは、配列番号２６、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、９５、および９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号３、２４、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、９４、および９６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＶＬドメインは、配列番号７、２６、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、９５、および９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。

【0099】

他の態様において、ポリペプチドの安定性は、ＶＨおよびＶＬドメイン内のある種の残基をシステイン残基に修飾することにより、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド結合を付加することにより改善することができる。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら（２００９）ＭＡｂｓ １、１２８～４１頁；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ
．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０、７５３８～４２頁；Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．ら、（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、３７７、１３５～９頁を参照されたい。例えば、ＶＬの１００、１０１、または１０２位のグリシン残基をシステイン残基に修飾することができ、ＶＨの４４位のグリシン残基をシステイン残基に修飾することができる。

【0100】

多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的分子は、ＴＮＦαアンタゴニストドメインを含むことができる。ある態様において、ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、細胞の表面上でＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）に対するＴＮＦαの結合を阻害し、それによりＴＮＦ活性をブロックすることができる。

【0101】

ある態様において、本明細書に提供する多機能性ポリペプチドのＴＮＦαアンタゴニストドメインは、抗ＴＮＦα抗体またはその抗原結合性フラグメントである。ある態様において、抗ＴＮＦα抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、またはこれらのあらゆる抗体の抗原結合性フラグメントである。

【0102】

ある態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、抗ＴＮＦα抗体であるインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブのうちのいずれか、またはこれらのうちのいずれかの抗体の抗原結合性フラグメントよりも高い親和性でＴＮＦαを競合的に阻害することができ、またはＴＮＦαに結合することができるのと同じエピトープに結合する。ある態様において、抗ＴＮＦα抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブ、またはこれらのうちのいずれかの抗体の抗原結合性フラグメントである。これら抗ＴＮＦα抗体の構造および配列は、本明細書に記載する通り、必要以上の実験をせずに、当業者には容易に入手でき、多機能性ポリペプチド、例えば多特異的結合性分子に含まれ得る。多機能性ポリペプチドに含まれる抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、例えば、ヒト化、キメラ、霊長類化、または完全ヒトであってよい。

【0103】

ある態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＨドメイン、または最高１、２、３、４、５個、もしくはそれを超える保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有する、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブの重鎖ＣＤＲのバリアントを含む。

【0104】

ある態様において、抗ＮＦα抗体またはそのフラグメントは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体ＶＬドメイン、または最高１、２、３、４、５個、もしくはそれを超える保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有するインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブの重鎖ＣＤＲのバリアントを含む。

【0105】

ある態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブのＶＨアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブのＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。

【0106】

ある態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、インフリキシマブ、ア
ダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブのＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブのＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。

【0107】

ある態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、配列番号２８のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。

【0108】

ある態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。いくつかの態様において、抗ＴＮＦα抗体またはそのフラグメントは、配列番号２９のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。

【0109】

多機能性ポリペプチド、例えば、本開示が提供する多特異的結合性分子は、完全な抗ＴＮＦα抗体、すなわち、Ｈ_２Ｌ_２フォーマットにおける２本の完全な重鎖および２本の完全な軽鎖を含む抗体を含むことができる。抗ＴＮＦα抗体が完全な抗体である場合、１つまたはそれ以上のＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＴＮＦα抗体の１つもしくはそれ以上の重鎖のＮ末端もしくはＣ末端に、または抗ＴＮＦα抗体の１つもしくはそれ以上の軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端に融合することができる。あるいは、多機能性ポリペプチド、例えば本開示が提供する多特異的結合性分子は、抗ＴＮＦα抗体の抗原結合性フラグメントを含むことができる。ある態様において、抗ＴＮＦα抗体フラグメントは、抗体の定常ドメインの任意のポーションを含むことができ、または可変ドメインだけを含むことができる。多機能性ポリペプチドに含まれるための、例示的な抗ＴＮＦα抗体フラグメントには、それだけには限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが含まれる。

【0110】

いくつかの態様において、多機能性分子はヌディマブｖａｒＢであり、これは完全な抗ＴＮＦα抗体を含む分子であり、すなわちＭＥＤＩ－５７８ ｓｃＦｖが抗ＴＮＦα抗体の重鎖のＣ末端に融合している、Ｈ_２Ｌ_２フォーマットにおける２本の完全な重鎖および２本の完全な軽鎖を含む抗体である。ヌディマブｖａｒＢは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの態様において、二機能性分子は、配列番号２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0111】

ある態様において、抗ＴＮＦα抗体は、ｓｃＦｖフラグメント、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、もしくはゴリムマブに由来するｓｃＦｖフラグメント、またはそのＴＮＦα結合性バリアントである。抗ＴＮＦα ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインを、Ｎ－ＶＨ－ＶＬ－ＣまたはＮ－ＶＬ－ＶＨ－Ｃいずれかの任意の順序で含むことができる。ｓｃＦｖ分子は典型的には、ＶＨおよびＶＬドメインが柔軟なリンカーを介して接続されるように操作されており、上記に記載した通り、数々の異なる構造を想定することができる。抗ＴＮＦα ｓｃＦｖポリペプチドは、やはり上記に記載した通りに安定化することができる。

【0112】

ある態様において、ＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦＲ－１またはＴＮＦＲ－２などのＴＮＦ受容体のＴＮＦα結合性可溶性フラグメント、またはそれらのバリアント、またはそれらの可溶性フラグメントである。ある態様において、ＴＮＦＲ－１の可溶性フラグメントは５５ｋＤフラグメントである。ある実施形態において、ＴＮＦＲ－２の可溶性フラグメントは７５ｋＤフラグメントである。ある態様において、ＴＮＦ受容体フラグメントは、異種ポリペプチド、例えば免疫グロブリンＦｃフラグメント、例えばＩｇＧ１Ｆｃドメインに融合している。ある態様において、ＴＮＦαアンタゴニストは、配列番号１３に記載するアミノ酸、またはそのＴＮＦα結合性フラグメントを含む。ＴＮＦＲ－２ポーションは、配列番号１３のアミノ酸１から２３５を含む。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントのバリアントは、配列番号１３のアミノ酸１から２３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントのバリアントは、例えば、アミノ酸１、２、３、４、５、１０、２０、４０、または５０個の挿入、置換、または欠失を除いて、配列番号１３のアミノ酸１から２３５を含む。ＩｇＧ１Ｆｃポーションは、配列番号１３のアミノ酸２３６から４６７を含む。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントは、任意のヒトもしくは非ヒト抗体のＦｃポーションに、または安定性を提供する任意の他のタンパク質もしくは非タンパク質物質、例えば、アルブミンもしくはポリエチレングリコールに融合していてもよい。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントのバリアントは、配列番号１３のアミノ酸２３６から４６７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントのバリアントは、例えば、アミノ酸１、２、３、４、５、１０、２０、４０、または５０個の挿入、置換、または欠失を除いて配列番号１３のアミノ酸２３６から４６７を含む。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントのバリアントは、配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントのバリアントは、例えば、アミノ酸１、２、３、４、５、１０、２０、２０、４０、または５０個の挿入、置換、または欠失を除いて配列番号１３を含む。

【0113】

ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントは、単鎖融合タンパク質である。ある態様において、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントは、例えば、２つのＦｃドメイン間のジスルフィド結合を介して会合している２つの融合タンパク質のダイマーである。

【0114】

本明細書に提供する多機能性ポリペプチド、例えば多特異的結合性分子は、様々な異なる構造およびコンフォメーションを有することができる。一態様において、本明細書に提供する多機能性ポリペプチドは、上記に記載した通りＮＧＦアンタゴニストドメインが、上記に記載した通りＴＮＦαアンタゴニストドメインに、柔軟なリンカーを介して融合している、融合タンパク質を含む。リンカーの例を本明細書他所に記載する。ある態様において、多機能性ポリペプチドは、融合タンパク質のホモ二量体を含む。

【0115】

例示的な一態様において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＭＥＤＩ－５７８などに由来する抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメインであり、ＴＮＦαアンタゴニストは可溶性であり、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性可溶性フラグメントは、そのカルボキシ末端で免疫グロブリンＦｃドメインに融合している、多機能性ポリペプチドを提供する。抗ＮＧＦ ｓｃＦｖは、いくつかの態様において、免疫グロブリンＦｃドメインのカルボキシ末端に、リンカーを介して融合し得る。ある態様において、この多機能性ポリペプチドのモノマーは、各サブユニットが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性７５ｋＤフラグメント、
ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、アミノ酸１０個のリンカー（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号９８）、配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＨ、アミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１５）、および配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＬを含む、ホモ二量体を形成する。一態様において、多機能性ポリペプチドは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４であり、これは配列番号１４のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。いくつかの態様において、多機能性ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。

【0116】

別の例示的な一態様において、多機能性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合性７５ｋＤフラグメント、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、アミノ酸１０個のリンカー（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号９８）、配列番号９４のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＨ、アミノ酸２０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_４（配列番号１９）、および配列番号９５のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＬを含む。いくつかの態様において、多機能性ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢである。いくつかの態様において、多機能性ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。

【0117】

ポリペプチド
本明細書に提供するポリペプチド、例えば、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む多機能性ポリペプチド、またはＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドは、天然のポリペプチドに由来する組換えポリペプチドでも、または合成のポリペプチドでもよい。当技術分野において、いくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能の大幅な影響なく変動し得ることが認識されよう。よって、本開示は、実質的な活性を有する、またはＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む、本明細書に提供するポリペプチドのバリエーションをさらに提供する。このような変異体は、欠失、挿入、逆位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、反復、および型置換（ｔｙｐｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を含む。

【0118】

ポリペプチドおよび類似体を、通常タンパク質の一部ではない付加的な化学部分を含むようにさらに修飾してもよい。これら誘導体化した部分は、タンパク質の溶解性、生物学的半減期、または吸収を改善することができる。部分はまた、タンパク質などのあらゆる所望の副作用を低減または除去することができる。これらの部分に対する概要は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（２０００）に見出すことができる。

【0119】

ある態様において、本明細書に提供する多機能性ポリペプチドは、抗体ではないＮＧＦまたはＴＮＦα結合性ドメインを含むことができる。タンパク質の標的に対して高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを同定し、生成するための様々な方法が、当技術分野において知られている。例えば、各々その全文を参照によって本明細書に組み入れる、Ｓｋｅｒｒａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：２９５～３０４頁（２００７）、Ｈｏｓｓｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５：１４～２７頁（２００６）、Ｇｉｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：６５３～６５８頁（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５：２６６８～７６頁（２００８）、およびＳｋｅｒｒａ、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５：２６７７～８３頁（２００８）を参照されたい。ある態様において、ファージディスプレイ技術を用いて、適切な多機能性
ポリペプチドを同定／生成することができる。ある態様において、多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子は、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、およびチオレドキシンからなる群から選択されるタイプのタンパク質骨格を含むことができる。

【0120】

ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本開示は、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む多機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。本開示は、ＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニストをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに提供する。ある態様において、このようなポリヌクレオチドは、ＮＧＦまたはそのフラグメントに特異的に結合し、ＴＮＦαまたはそのフラグメントにも結合する、ペプチドドメインをコードする。例えば、本開示は、抗ＮＧＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドドメイン、およびＴＮＦαアンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦα抗体またはその抗原結合性フラグメント、もしくはＴＮＦＲ２などのＴＮＦ受容体の可溶性ＴＮＦα結合性ポーション）を含むポリペプチドドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態でも、またはＤＮＡの形態でもよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含み；二本鎖でも、または一本鎖でもよく、一本鎖である場合はコード鎖でも、または非コード（アンチセンス）鎖でもよい。

【0121】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載する多機能性ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１６、１８、もしくは９９のヌクレオチド配列、またはこれらのフラグメント、または配列番号１６、１８、もしくは９９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列、またはこれらのフラグメントを含む。

【0122】

本明細書に記載する単離されたポリペプチドは、当技術分野では知られている任意の適切な方法により生成することができる。このような方法は、直接的なタンパク質合成方法から、単離されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、適切な形質転換した宿主においてこれらの配列を発現させる方法までの範囲である。いくつかの態様において、ＤＮＡ配列は、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む多機能性ポリペプチド、またはＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、単離し、または合成することによって組換え技術を用いて構築する。したがって、本開示は、上記に詳しく記載した、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む二機能性ポリペプチドコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。

【0123】

いくつかの態様において、対象の多特異的結合性分子などの多機能性ポリペプチド、またはＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いて化学合成により構築することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の多機能性ポリペプチドのアミノ酸配列をベースにし、対象の組換えポリペプチドを生成させる宿主細胞において好ましいコドンを選択して、デザインすることができる。標準的な方法を適用して、対象の多機能性ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、バックトランスレートされた（ｂａｃｋ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）遺伝子を構築することができる。さらに、特定の多機能性ポリペプチドまたは個々のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドのポーションをコ
ードする小型のオリゴヌクレオチドをいくつか合成し、次いでライゲーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、相補性を組み立てるために５’または３’オーバーハングを含むのが典型的である。

【0124】

ある態様において、本明細書に提供するポリペプチドは、コードされたポリペプチドの精製などを可能にするマーカー配列に対して、同じリーディングフレームにおいて融合している、成熟ポリペプチドに対するコード配列を含むことができる。例えば、マーカー配列は、細菌の宿主の場合、マーカーに融合している成熟ポリペプチドを精製するために提供される、ｐＱＥ－９ベクターによって供給されるヘキサ－ヒスチジンタグであってよく、またはマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ－７細胞）を用いる場合、インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。

【0125】

本明細書に提供するポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、または両方における改変をさらに含むことができる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレントの置換、付加、または欠失を生成する改変を含むが、コードされるポリペプチドの性質または活性を改変しない。いくつかの態様において、ヌクレオチドバリアントは、遺伝コードの縮重のため、サイレント置換によって生成される。ポリヌクレオチドバリアントは、特定の宿主に対してコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）などの細菌の宿主が好むコドンに変化させる）などの様々な理由で、生成することができる。

【0126】

本明細書に記載するポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も提供する。組立て（合成、部位特異的変異誘発、または別の方法による）後、特定の単離された対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、発現ベクター中に挿入し、所望の宿主中でタンパク質を発現させるのに好適な発現制御配列に作動可能に連結してもよい。本開示はこのようなベクターを提供する。ヌクレオチドシーケンシング、制限酵素切断マッピング、および適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現により、適切な組立てを確認することができる。当技術分野ではよく知られている通り、宿主において高発現レベルのトランスフェクトされた遺伝子を得るために、遺伝子は、選ばれた発現宿主において機能的である、転写および翻訳の発現制御配列に作動可能に連結していなければならない。

【0127】

ある態様において、組換え発現ベクターを用いて、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む多特異的結合性分子などの多機能性ポリペプチド、またはＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードするＤＮＡを、増幅し、発現させることができる。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結している、多機能性ポリペプチド、またはＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードする、合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントを有する、複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は一般的に、以下に詳しく記載する通り、（１）遺伝子発現において制御の役割を有する遺伝子エレメント（単数もしくは複数）、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される、構造またはコード配列、ならびに（３）好適な転写および翻訳の開始および終結の配列の組立てを含む。このような調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含むことができる。複製開始点によって通常付与される、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子を、さらに組み入れてもよい。ＤＮＡ領域は、これらが相互に機能的に関連する場合、作動可能に連結されている。例えば、シグナルペプチドのためのＤＮＡ（分泌リーダー）は、ポリペプチドの
分泌に関与する前駆体として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターは、配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合性部位は、翻訳を可能にするように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結されている。イースト発現系における使用を意図する構造エレメントは、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質は、リーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、Ｎ末端のメチオニン残基を含むことができる。この残基は、発現された組換えタンパク質から場合により引き続き切断されて、最終生成物を生ずる。

【0128】

発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。広範囲の発現宿主／ベクターの組合せを用いることができる。真核生物の宿主に有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌の宿主に有用な発現ベクターには、知られている細菌のプラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびこれらの誘導体を含めた大腸菌からのプラスミド、広範囲の宿主のプラスミド、例えば、Ｍ１３、および一本鎖ＤＮＡ繊維状ファージが含まれる。

【0129】

本開示は、本明細書に提供するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書に提供するポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、好適なプロモーターの制御下の、原核生物、イースト、昆虫、または高次の真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の生物体、例えば、大腸菌または桿菌が含まれる。高次の真核細胞には、以下に記載する通り、哺乳動物起源の確立された細胞株が含まれる。細胞フリーの翻訳系も用いることができる。細菌、真菌、イースト、および哺乳動物の細胞宿主と用いるのに好適なクローニングベクターおよび発現ベクターは、その関連の開示を参照によって本明細書に組み入れる、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８５年）によって記載されている。抗体生成を含めたタンパク質生成方法に関するさらなる情報は、例えば、各々その全文を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６，４１３，７４６号および第６，６６０，５０１号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０４００９８２３号に見出すことができる。

【0130】

様々な哺乳動物または昆虫の細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることができるのも有利である。組換えタンパク質は一般的に、正確にフォールディングされ、適切に修飾され、完全に機能的であるため、組換えタンパク質の発現を哺乳動物細胞において行うことができる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ、２３：１７５頁、１９８１）によって記載されている、ＨＥＫ－２９３およびＨＥＫ－２９３Ｔ、サル腎細胞のＣＯＳ－７系、ならびに例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株を含めた他の細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複写開始点、発現させようとする遺伝子に連結されている適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’に隣接する非転写配列、ならびに５’または３’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合性部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプタ部位、ならびに転写終結配列を含むことができる。昆虫細胞において異種タンパク質を生成させるためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：４７頁（１９８８）によって概説されている。

【0131】

本開示は、本明細書に記載する多機能性ポリペプチドを生成する方法、またはＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニストをそれぞれ含む個々のポリペプチドを生成するための方法をさらに提供する。本方法は、上記に記載した宿主細胞を、多機能性ポリペ
プチドまたは個々のポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、多機能性ポリペプチドまたは個々のポリペプチドを回収することを伴う。

【0132】

組換えタンパク質を長期に高収率で生成するには、安定な発現が好適である。例えば、多機能性ポリペプチドを安定して発現する細胞株を操作してもよい。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞を、好適な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換してもよい。外来のＤＮＡを導入した後、操作した細胞を、濃縮培地（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｄｉａ）中で１～２日間増殖させてもよく、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、プラスミドを細胞の染色体に安定して組み入れ、成長して増殖巣を形成できるようにし、ひいては増殖巣をクローニングし、拡大して細胞株とすることができる。この方法を用いて、多機能性ポリペプチドを発現する細胞株を操作してもよい。

【0133】

ある実施形態において、本明細書に表す多機能性ポリペプチドを、多機能性ポリペプチドを一過性に発現させる細胞株において発現させる。一過性のトランスフェクションは、細胞株中に導入された核酸は、その細胞のゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ中に組み入れられないが、細胞中でエピソームなどの染色体外エレメントとして維持されるプロセスである。エピソームの核酸の転写プロセスは影響を受けず、エピソームの核酸によってコードされるタンパク質が生成される。

【0134】

安定な、または一過性にトランスフェクトされたいずれかの細胞株は、ポリペプチドの発現および生成をもたらす、当技術分野では知られている細胞培養培地中および条件下で維持される。ある実施形態において、哺乳動物細胞の培養培地は、ＤＭＥＭまたはＨａｍＦ１２などを含めた、市販の培地製剤をベースとする。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、細胞の成長および生物学的タンパク質の発現の両方における増大を支持するように修飾される。本明細書で用いる「細胞培養培地」、「培養培地」、および「培地製剤」の語は、多細胞生物または組織の外側の人工的なｉｎ ｖｉｔｒｏ環境において、細胞を維持、成長、繁殖、または拡大するための栄養溶液を意味する。細胞培養培地を、例えば、細胞の成長を促進するように調合する細胞培養成長培地、または組換えタンパク質生成を促進するように調合する細胞培養生成培地を含めた、特定の細胞培養の使用に最適化してもよい。栄養、成分、および構成成分の語は交換可能に用いて、細胞培養培地を作り上げる構成要素を意味し得る。

【0135】

様々な実施形態において、細胞株は、流加法を用いて維持される。本明細書で用いる「流加法」は、最初に基本培地でインキュベートした後、流加細胞培養物を、さらなる栄養とともに供給する方法を意味する。例えば、流加法は、所与の期間内の決定された補給計画にしたがって、補充の培地を加えることを含むことができる。よって「流加細胞培養」は、典型的には哺乳動物の細胞および培養培地を培養容器に最初に補充し、培養中に、周期的に細胞および／または生成物を回収し、または回収せずに、さらなる培養栄養素を培養物に、連続的に、また何回かに分けて補給した後、培養を終了する細胞培養を意味する。

【0136】

いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、基礎培地、および基礎培地の改変をもたらす、少なくとも１つの加水分解産物、例えば、ダイズベースの、加水分解産物、イーストベースの加水分解産物、または２タイプの加水分解産物の組合せを含む。さらなる栄養素はときに、濃縮基礎培地など、基礎培地のみを含むことができ、または加水分解産物のみ、もしくは濃縮した加水分解産物を含むことができる。適切な基礎培地には、それだけには限定されないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最
小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、アルファ最小必須培地（α－ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＰＦ ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ無タンパク質培地（Ｓｉｇｍａ）、またはＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ無血清培地ＣＨＯ細胞用無タンパク質（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびイスコフ改変ダルベッコ培地を参照されたい）が含まれる。本明細書の技術において用いることができる基礎培地の他の例には、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００））が含まれる。

【0137】

ある実施形態において、基礎培地は無血清であってよく、これは培地が血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、もしくは当業者には知られているいずれの他の動物由来の血清）も含まない、または動物タンパク質を含まない培地、または既知組成培地であることを意味する。

【0138】

基礎培地を、様々な無機および有機のバッファー、界面活性剤（複数可）、および塩化ナトリウムなど、標準の基礎培地に見出されるある種の非栄養成分を除去するために、修飾してもよい。このような構成成分を基礎細胞培地から除去することで、残りの栄養成分の濃度が増大し、全体的な細胞の成長およびタンパク質発現が改善し得る。加えて、省略した構成成分を、細胞培養条件の必要性にしたがって、修飾した基礎細胞培地を含む細胞培養培地に戻し加えてもよい。ある実施形態において、細胞培養培地は、修飾した基礎細胞培地、および少なくとも１つの以下の栄養素、鉄源、組換え成長因子；バッファー；界面活性剤；浸透圧調節剤；エネルギー源；および非動物性加水分解産物を含む。加えて、修飾した基礎細胞培地は、場合により、アミノ酸、ビタミン、またはアミノ酸およびビタミン両方の組合せを含むことができる。いくつかの実施形態において、修飾した基礎培地は、Ｌ－グルタミンなどのグルタミン、および／またはメトトレキセートをさらに含む。

【0139】

いくつかの実施形態において、タンパク質の生成は、当技術分野では知られている、流加、バッチ、還流、または持続的なフィードバイオリアクター方法を用いた、バイオリアクタープロセスによって大量に行われる。大規模なバイオリアクターは、容量少なくとも５０Ｌリットル、ときに約５００リットルを超え、または１０００から１０００００リットルの容量を有する。これらのバイオリアクターは攪拌機の羽根車を用いて酸素および栄養を分配することができる。小規模のバイオリアクターは一般的に、容積およそ１００リットルを超えない細胞の培養を意味し、約１リットルから約１００リットルの範囲であり得る。あるいは、単回使用のバイオリアクター（ＳＵＢ）を、大規模または小規模いずれかの培養に用いてもよい。

【0140】

温度、ｐＨ、撹拌、通気、および接種密度は、用いる宿主細胞、および発現させようとする組換えタンパク質に応じて変動し得る。例えば、組換えタンパク質細胞培養物を、３０℃から４５℃の間の温度に維持してもよい。培養培地のｐＨを、ｐＨが最適レベルにあるように、培養プロセスの間モニタリングしてもよく、最適レベルのｐＨはある種の宿主細胞に対して、６．０から８．０のｐＨ範囲内であってよい。羽根車が駆動する混合を、このような培養方法に、撹拌のために用いてもよい。羽根車の回転速度は、尖端速度およそ５０から２００ｃｍ／秒であり得るが、当技術分野では知られている他のエアリフトまたは他の混合／通気系を、培養中の宿主細胞のタイプに応じて用いてもよい。さらにまた、選択した培養中の宿主細胞に応じて、培養物中溶解酸素濃度およそ２０％から８０％の空気飽和を維持するように、十分な通気を供給する。あるいは、バイオリアクターは、空気または酸素を、培養培地中に直接散布し得る。中空糸膜通気装置を用いるバブルフリー通気システムを含めた、酸素を供給する他の方法が存在する。

【0141】

タンパク質の精製
上記に記載した通り形質転換された宿主が生成したタンパク質を、任意の適切な方法にしたがって精製することができる。このような標準的な方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質を精製するためのあらゆる他の標準的な技術によるものが含まれる。アフィニティタグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合性ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼをタンパク質に付着させて、好適なアフィニティカラム上を通過させることにより、容易に精製することができる。単離したタンパク質を、タンパク質分解、核磁気共鳴分析法、およびエックス線結晶構造解析などの技術を用いて、物理的に特徴付けることもできる。

【0142】

例えば、組換えタンパク質を培養培地中に分泌する系からの上清を、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットなどの市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて最初に濃縮することができる。濃縮工程後、濃縮物を適切な精製マトリクスに適用することができる。あるいは、ペンダントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリクスまたは基質などの陰イオン交換樹脂を用いることができる。マトリクスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般的に用いる他のタイプであってよい。あるいは、陽イオン交換工程を用いることができる。適切な陽イオン交換物質には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリクスが含まれる。最後に、疎水性ＲＰ－ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントのメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた１つまたはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）工程を用いて、ＮＧＦ結合性薬剤をさらに精製することができる。様々な組合せの、いくつかの、または全ての前述の精製工程をやはり用いて、均一な組換えタンパク質を提供することができる。

【0143】

細菌培養物において生成された組換えタンパク質を、例えば、細胞ペレットから最初に抽出し、引き続き濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程の１つまたはそれ以上によって単離することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終の精製工程に用いることができる。組換えタンパク質の発現において使用した微生物細胞を、凍結－溶解サイクル、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた、任意の便利な方法によって破壊することができる。

【0144】

組換えポリペプチドを精製するのに当技術分野において知られている方法は、例えば、各々その全文を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許公開第２００８／０３１２４２５号、第２００８／０１７７０４８号、および第２００９／０１８７００５号に記載されているものも含む。

【0145】

使用方法および医薬組成物
本開示は、治療有効量のＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子を投与することを含み、またはＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストを同時投与することを含む、対象における疼痛をコントロールまたは処置するための方法を提供する。ある態様において、対象はヒトである。

【0146】

本開示は、ＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子を含む、または本明細書に提供するＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストの組合せを含む医薬組成物をさらに提供する。ある態様において、医薬組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む。これらの医薬組成物は、疼痛、例えば、神経因性疼痛および炎症性（例えば、骨関節炎または関節リウマチの）疼痛を処置するのに有用である。

【0147】

本明細書に提供するＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニストを含む、多機能性ポリペプチドおよび組成物は、それだけには限定されないが、神経因性疼痛などの疼痛のコントロールまたは処置を含めた様々な適用において有用であり得る。使用する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法でも、ｅｘ ｖｉｔｒｏ法でも、またはｉｎ ｖｉｖｏ法でもよい。

【0148】

ある態様において、ＮＧＦ結合性薬剤（例えば、抗体またはポリペプチド）で処置する疾患、障害、または状態は、疼痛に関連する。ある態様において、疼痛は、慢性の侵害受容性疼痛、慢性の腰痛、神経因性疼痛、癌の疼痛、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）、または内臓痛の状態に関連する。

【0149】

本開示は、対象における疼痛をコントロールするための方法であって、疼痛コントロールを必要とする対象に有効量の神経成長因子（ＮＧＦ）アンタゴニストおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）アンタゴニストを投与することを含み、投与は、単独で投与する等量のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストよりも効果的に、対象における疼痛をコントロールすることができる。

【0150】

ある態様において、投与は、ＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニストの、併用治療としての同時投与である。本明細書の他所に論じる通り、個々の成分は、同時に、または逐次的に投与することができる。個々のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストは、本明細書に提供するいずれかのＮＧＦまたはＴＮＦαアンタゴニスト、例えば、可溶性ＮＧＦ結合性ＴｒｋＡ受容体フラグメント、抗ＮＧＦ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、ＴＮＦ受容体の可溶性ＴＮＦα結合性フラグメント、例えば、ＴＮＦＲ－２、または抗ＴＮＦα抗体もしくはそのフラグメント、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、もしくはこれらのいずれかの抗体の抗原結合性フラグメントであってよい。

【0151】

同時投与は、疼痛をコントロールするのに必要とされる、様々な投与量の各々のアンタゴニストを含むことができる。いくつかの態様において、同時投与は、個々の治療として通常投与するよりも、より低用量、またはより低頻度の用量の各構成成分を含むことができ、それによってさらなる安定性、利便性、および経済性がもたらされる。

【0152】

ある態様において、本明細書に提供する疼痛をコントロールする方法は、多機能性ポリペプチド、例えば、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む多特異的結合性分子の投与を含む。本方法において用いるための例示的な多機能性ポリペプチドは、本明細書に詳しく記載するものである。本開示に基づき、本方法において有用なさらなる多機能性ポリペプチドは、当業者には明らかである。

【0153】

単独で投与する構成成分「よりも効果的に」疼痛をコントロールすることは、併用処置が、個々に投与する等量のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストいずれかよりも疼痛をコントロールするのに効果的であることを意味する。ある態様において、および以下により詳しく記載する通り、本明細書に提供する疼痛をコントロールする方法は、相乗的な効能を提供することができ、例えば、ＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニスト両方を投与する効果は、相加効果を超える効果を提供することができ、またはＮＧＦアンタゴニストもＴＮＦαアンタゴニストも個別には効果的ではない場合に効果的であり得る。ある態様において、併用により、用量を節約することができ、例えば、個々の構成成分を同時投与した場合の有効用量は、いずれかの構成成分の個々の有効用量未満であり得る。

【0154】

ある態様において、本明細書に提供する疼痛をコントロールする方法は、対象における
疼痛をコントロールするのに、単独で投与する等量のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％効果的である。ある態様において、対象に同時投与する個々のＮＧＦアンタゴニストもしくはＴＮＦαアンタゴニストの用量、または本明細書に提供する二機能性ポリペプチドの投与時に提供される相対的な用量のＮＧＦアンタゴニストまたはＴＮＦαアンタゴニストの用量は、単独で投与する構成成分に必要な用量より、例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低くてもよい。

【0155】

疼痛のコントロールの効能は、数々の異なるスケールにしたがって経験される疼痛の質および強度を格付けするよう、患者に頼むことによって測定することができる。言語による疼痛のスケールは、言葉を用いて、疼痛なし、軽度の疼痛、中等度の疼痛、および重度の疼痛からの範囲を、各々に０～３からのスコアを割り当てて記載する。あるいは、患者に、０（疼痛なし）から１０（可能な最悪の疼痛）までの数値の疼痛スケールにしたがって患者の疼痛を格付けするよう頼んでもよい。視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）上の垂直線または水平線に、疼痛なしから可能な最悪の疼痛までの疼痛を記述する言葉をつけ、患者に、自身の現在の疼痛のレベルを表す点に、線に印をつけるよう頼む。ＭｃＧｉｌｌ疼痛指標により、患者は、自身の疼痛を最もよく記述する言葉を、叩打（ｐｏｕｎｄｉｎｇ）、灼熱（ｂｕｒｎｉｎｇ）、締め付け（ｐｉｎｃｈｉｎｇ）などの一連の短いリストから選択することによって、疼痛の質および強度の両方を記述できるようになる。ＶＡＳ、もしくはＦＡＣＥＳなどの数値スケールを用いるのに困難を経験する成人には、または非言語の患者には、行動評価尺度（Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｒａｔｉｎｇ ｓｃａｌｅ）などの他の疼痛スケールを用いることができる。機能的活動スコアは、患者に疼痛のある領域に関する課題を実行するよう頼むことにより、患者が自身の疼痛によってどのように妨げられるかに関する。これらのタイプのスケールを用いた疼痛スコアにおける改善は、鎮痛薬の効能における改善を潜在的に示すものである。

【0156】

本明細書に記載する疼痛をコントロールする方法にしたがって、投与は、疼痛のコントロールを必要とする対象における疼痛をコントロールするのに十分であり、例えば、ＮＧＦアンタゴニストおよびＴＮＦαアンタゴニストの同時投与、または多機能性ポリペプチド、例えば、ＮＧＦアンタゴニストドメインおよびＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む多特異的結合性分子の投与は、対象における疼痛を防ぎ、低減し、軽減し、または除去することができる。ある態様において、疼痛は、急性の疼痛、短期間の疼痛、持続性もしくは慢性の侵害受容性疼痛、または持続性もしくは慢性の神経因性疼痛であってよい。

【0157】

ある態様において、製剤は、ＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子、または本明細書に提供するＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストの組合せを、薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体、賦形剤）と組み合わせることによって、貯蔵および使用のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００年）。適切な薬学的に許容されるビヒクルには、それだけには限定されないが、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの非毒性のバッファー；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば、アミノ酸残基約１０個未満）；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタ
ミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩形成性の対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。

【0158】

本開示の多機能性ポリペプチドは、分子の物理化学的性質および送達経路に応じて、液体、半流動性、または固体形態において調合することができる。製剤は、賦形剤、または賦形剤の組合せ、例えば：糖、アミノ酸、および界面活性剤を含むことができる。液体製剤は、広範囲のポリペプチド濃度およびｐＨを含むことができる。固体製剤は、例えば超臨界流体技術による、凍結乾燥、噴霧乾燥、または乾燥などによって生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する製剤はいずれも凍結乾燥製剤である。

【0159】

特定の一実施形態において、本開示の多機能性ポリペプチドは、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、Ｌ－アルギニン－ＨＣＬ５０ｍＭ、ショ糖１５０ｍＭ、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５中に調合される。

【0160】

本明細書に提供する医薬組成物は、局所処置または全身処置のいずれかのための任意の数々の方法において投与することができる。投与は、局所的（例えば、膣および直腸の送達を含めた粘膜へ）、例えば、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、ならびに粉末剤（ｐｏｗｄｅｒ）；肺（例えば、ネブライザーにより含まれる粉末剤もしくはエアロゾル剤の吸入もしくはガス注入；気管内、鼻腔内、上皮、および経皮によって）；経口；または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入を含めた非経口；または頭蓋内（例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内）投与であってよい。

【0161】

本明細書に提供するＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド、または本明細書に提供するＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストの組合せは、併用医薬製剤、または併用治療としての投薬レジメンにおいて、抗侵害受容性の性質がある第２の（または第３の）化合物とさらに組み合わせることができる。

【0162】

疼痛の処置では、好適な用量のＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子、または本明細書に提供するＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストの組合せは、全て処置する医師の裁量の下、処置しようとする疼痛のタイプ、疼痛の重症度および経過、疼痛の応答性、多機能性ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せを治療目的で投与するのか、または予防目的で投与するのか、以前の治療法、患者の病歴などによって決まる。多機能性ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せは、一度に投与しても、または効果的な疼痛コントロールを維持するように数日から数か月まで続く一連の処置にわたって投与してもよい。最適な投薬計画は、患者の身体における薬物の蓄積を測定することから算出することができ、個々の抗体またはポリペプチドの相対的強度に応じて変動する。投薬する医師は、最適の用量、投薬方法、および反復速度を容易に決定することができる。

【0163】

多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子またはポリペプチドの併用治療の投与は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」、すなわち、有効成分を一緒に用いる場合に実現される効果が、化合物を別々に用いることに起因する効果の和を上回ることを証明することができる。相乗効果は、有効成分が：（１）単一の、多機能性融合ポリペプチドとして投与され；（２）組合せの単位剤形製剤において同時に、同時調
合され、投与され、もしくは送達され；（３）別々の製剤として交互に、もしくは並行して送達され；または（４）いくつかの他のレジメンによる場合に達成することができる。交互療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）において送達する場合は、化合物を逐次的に、例えば、別々のシリンジ中の異なる注射によって投与または送達する場合に相乗効果を達成することができる。一般的に、交互療法の間は有効用量の各有効成分を逐次的に投与するが、併用治療では有効用量の２つ以上の有効成分を一緒に投与する。

【0164】

疼痛
「疼痛」は、最も広い用法において、それを経験する個体にとって極めて自覚的であり、環境および文化的背景を含めた個体の精神状態による影響を受ける、経験的な現象を意味する。「身体的な」疼痛は通常、実際の、または潜在的な組織損傷の原因となる、非当事者にとって知覚できる刺激に関連し得る。この意味では、疼痛は、国際疼痛学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ
Ｐａｉｎ）（ＩＡＳＰ）によると、「実際の、または潜在的な組織損傷に関連し、このような損傷に関して記述される、感覚的および感情的な経験」とみなすことができる。しかし、疼痛には知覚できる原因がない場合がある。例えば、ときに持続性の心理学的要因または症候群による既存の身体的疼痛の増悪を含めた心因性疼痛、知覚できる疼痛の原因のいかなる証拠のない精神的障害を有するヒトにおいて知覚される疼痛。

【0165】

疼痛のタイプ
疼痛には、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛／神経原性疼痛、突出痛、異痛症、痛覚過敏、知覚過敏、異常感覚、錯感覚、ヒペルパチー、幻肢痛、心因性疼痛、有痛性感覚脱失、神経痛、神経炎が含まれる。他の範疇には、悪性疼痛、狭心痛、および／または特発性疼痛、複合性局所性疼痛症候群Ｉ、複合性局所性疼痛症候群ＩＩが含まれる。疼痛のタイプおよび症状が相互に排他的である必要はない。これらの語はＩＡＳＰによって規定されるものとされる。

【0166】

侵害受容性疼痛は、侵害刺激に応答して、末梢神経における特殊化された感覚性の侵害受容器によって始まり、侵害受容器は侵害刺激を活動電位にコードする。侵害受容器は一般的に、Ａδ線維および（ポリモーダル）Ｃ線維上にあり、皮膚直下、腱、関節、および身体器官において終結する遊離の神経終末部である。後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンは、末梢と脊髄との間の情報交換の部位を提供する。シグナルは、脳幹および視床部位へ、最終的に大脳皮質へ脊髄を介して処理され、大脳皮質で通常（常にではないが）疼痛の感覚を誘発する。侵害受容性疼痛は、身体組織を刺激または損傷する可能性がある、広範囲の、化学的、熱的、生物学的（例えば、炎症）、または機械的なイベントに起因し得、これらは概ね、侵害受容器における侵害受容性の活動を引き起こすのに必要とされる強度の最小のある閾値を超えるものである。

【0167】

神経因性疼痛は一般的に、末梢神経系または中枢神経系における異常機能の結果であり、それぞれ末梢神経因性疼痛または中枢神経因性疼痛を生じる。神経因性疼痛は、ＩＡＳＰにより、一次病巣、または神経系における機能不全によって始まり、または引き起こされる疼痛と定義される。神経因性疼痛は、特に慢性の場合、神経系に対する実際の損傷をしばしば伴う。炎症性の侵害受容性疼痛は、一般的に、組織損傷、および結果として生じる炎症プロセスの結果である。神経因性疼痛は、組織に対する観察できる損傷が全て見かけの上で治癒したずっと後まで（例えば、数か月または数年後）持続し得る。

【0168】

神経因性疼痛の場合、患部領域からの感覚処理が異常となり得、通常疼痛を起こさない非侵害性の刺激（例えば、熱的、触覚／圧力）も異常となることがあり（すなわち、異痛症）、または侵害刺激は通常有痛性の刺激に応答して誇張された疼痛の知覚を誘発し得る（すなわち、痛覚過敏）。加えて、電気的な刺痛もしくはショック、または「ピンと針」
同様の感覚（すなわち、錯感覚）、および／または不快な特質のある感覚（すなわち、異常感覚）を、正常な刺激が誘発し得る。突出痛は、既存の慢性痛の悪化である。ヒペルパシーは、刺激に対する異常に有痛性の反応に起因する、有痛性の症候群である。刺激は、殆どの場合、疼痛閾値の増大に反復性であり、疼痛閾値は、患者が疼痛と認識することができる疼痛の最小の経験と考えることができる。

【0169】

神経因性疼痛の例には、接触性異痛症（例えば、神経損傷後に誘発される）、神経痛（例えば、ヘルペス後（すなわち帯状疱疹後）神経痛、三叉神経痛）、反射性交感神経性ジストロフィー／カウサルギー（神経外傷）、癌性疼痛の構成成分（例えば、癌自体による、または炎症などの状態に関連する、または化学療法、外科手術、もしくは放射線療法などの処置による疼痛）、幻肢痛、絞扼性ニューロパシー（例えば、手根管症候群）、ならびに末梢神経障害などの神経障害（例えば、糖尿病、ＨＩＶ、慢性的なアルコール使用、他の毒素（化学療法の多くを含む）に対する曝露、ビタミン欠乏症、および多種多様の他の医学的状態）が含まれる。神経因性疼痛には、例えば、外科手術、創傷、帯状疱疹、糖尿病性神経障害、足または手の切断、癌などの様々な原因による、神経損傷後の神経系の病理学的操作（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）の発現によって誘発される疼痛が含まれる。神経因性疼痛に関連する医学的状態には、外傷性神経損傷、脳卒中、多発性硬化症、脊髄空洞症、脊髄損傷、および癌が含まれる。

【0170】

疼痛を引き起こす刺激は、それ自体が疼痛の経験の一因となり得る炎症性応答をしばしば呼び起こす。ある状態では、疼痛は、侵害受容性の、および神経因性の要因が複雑に混ざり合うことによって引き起こされると思われる。例えば、慢性疼痛はしばしば、炎症性の侵害受容性疼痛もしくは神経因性疼痛、または両方が混ざり合ったものを含む。神経系が最初に機能不全または損傷し、それが炎症性メディエータの神経性の放出、およびその後の神経因性炎症を誘発し得る。例えば、片頭痛は、神経因性疼痛および侵害受容性疼痛が混ざり合ったものを表し得る。また、筋膜痛は、筋肉からの侵害受容性のインプットにおそらく二次的なものであるが、異常な筋肉活動性は神経障害性状態の結果であり得る。

【0171】

ＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニストを含むキット
本開示は、本明細書に記載する方法を行うのに用いることができる、ＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド、例えば、本明細書に提供する多特異的結合性分子、または本明細書に提供するＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストの組合せを含むキットを提供する。ある態様において、キットは、ＴＮＦαアンタゴニストおよびＮＧＦアンタゴニストを含む少なくとも多機能性融合ポリペプチド、例えば、配列番号１４もしくは１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを、１つもしくはそれ以上の容器中に、またはＮＧＦアンタゴニスト（例えばＭＥＤＩ－５７８）およびＴＮＦαアンタゴニスト（例えばインフリキシマブもしくはアダリムマブなどの抗ＴＮＦα抗体）の組合せ、またはＴＮＦ受容体のＴＮＦα結合性可溶性フラグメント、例えばＴＮＦＲ２－Ｆｃを含む。当業者であれば、本明細書に提供する、開示されたＴＮＦαおよびＮＧＦアンタゴニストは、当技術分野ではよく知られている確立されたキットフォーマットの１つの中に容易に組み入れることができることを容易に認められよう。

【実施例】

【0172】

本開示をここに全般的に記述するが、本開示は以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、以下の実施例は、単に、本開示のある種の態様および実施形態を説明する目的で含まれるものであり、本開示を限定しようとするものではない。

【0173】

実施例１－抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ／ＴＮＦＲ２－Ｆｃ多特異的結合性分子の構築およびキャラクタリゼーション
多機能性分子、具体的に抗ＮＧＦ抗体ドメインおよびＴＮＦＲ２－Ｆｃドメインを含む
多特異的結合性分子を、以下の通り生成した。Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３９３：６７２～９２頁（２００９）、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０７０５６５号に記載されるＢｓ３Ａｂフォーマットにしたがって、抗ＮＧＦ抗体ｓｃＦｖフラグメントを、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１３）のＣ末端に、重鎖ＣＨ３ドメインを介して融合した。構造図を図１に示す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃポリペプチドおよび多特異的結合性分子をコードするＤＮＡ構築物を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により合成した。多特異的結合性分子には、アミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１５）を介して１つに連結される、ＭＥＤＩ－５７８のＶＨドメイン（配列番号３）およびＶＬドメイン（配列番号７）を含む抗ＮＧＦ ｓｃＦｖを構築した。ｓｃＦｖのＮ末端を、アミノ酸１０個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_２を介して、配列番号１３のＣ末端に融合した。この多特異的結合性分子を、本明細書においてＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４と呼ぶ。多特異的結合性分子をコードするＤＮＡ構築物を、Ｂｓ３Ａｂ発現ベクターにクローニングするために、３’終端に終止コドンおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むように操作した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４をコードするＤＮＡ配列を配列番号１６に表し、そのアミノ酸配列を配列番号１４に表す。

【0174】

ＴＮＦ－ＮＧＦ多特異的結合性分子の熱安定性を、多特異的結合性分子のＭＥＤＩ－５７８ｓｃＦｖポーションのＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド結合を付加することによって改善した。これは、ＶＨドメイン（配列番号９４）のアミノ酸４４に、およびＶＬドメイン（配列番号９５）のアミノ酸１０２にＧ→Ｃ変異を導入することによって行った。このクローンをＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢと名付けた。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのアミノ酸配列を配列番号１７に表す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢをコードするＤＮＡ配列を配列番号１８に表す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を配列番号９９に表す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４と、ｓｃＦｖポーションのＶＨおよびＶＬを連結するアミノ酸１５個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）_３がアミノ酸２０個のリンカー（ＧＧＧＧＳ）_４（配列番号１９）で置き換えられている点がさらに異なる。示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４およびＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのＴｍを測定した。この方法は、蛍光色素であるシプロオレンジ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取込みを測定するものであり、シプロオレンジは、高温に曝されると、タンパク質ドメインのアンフォールディングの間に曝露される疎水性表面に結合する。ＤＳＦアッセイでは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＴｍは６２℃であり、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのＴｍは６６℃であった。したがって、多特異的分子のＭＥＤＩ－５７８ ｓｃＦｖポーションにおける鎖間ジスルフィド結合の付加により、分子の熱安定性が４℃改善された。

【0175】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質およびＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を、ＣＨＯ細胞懸濁液中、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて一過性に発現させた。細胞を、ＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に維持した。小規模のトランスフェクションからの培養回収物を、製造元のプロトコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にしたがって、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製し、引き続き１％ショ糖、ＮａＣｌ１００ｍＭ、Ｌ－アルギニン塩酸塩２５ｍＭ、およびリン酸ナトリウム２５ｍＭ（ｐＨ６．３）中でバッファー交換した。組換えタンパク質の純度を、還元的条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（以下の方法を参照されたい）を用いて分析し、理論的に決定された吸光係数を用いて２８０ｎｍの吸光係数を読み取ることによって濃度を決定した。

【0176】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質、およびＴＮＦ－ＮＧＦ多特異的構築物、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の、小規模の一過性発現およびプロテインＡカラム精製により、それぞれ収量３６．６および７９．９ｍｇＬ^－１がもたらされた。

【0177】

より大きなバッチのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を以下の通り生成した。大規模トランスフェクション（最大６Ｌ）からの粗製培養物回収物を、深層ろ過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてろ過し、バッファーＡ（リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．２）で予め平衡化した１．６×２０ｃｍプロテインＡアガロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にローディングした。次いで、カラムをバッファーＡで洗浄し、生成物を、段階勾配のバッファーＢ（酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ＜４．０）において溶出した。生成物を、バッファーＣ（酢酸ナトリウムバッファー５０ｍＭ、ｐＨ＜５．５）中、予め平衡化した１．６×２０ｃｍＰｏｒｏｓ ＨＳ５０カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にローディングし、バッファーＣ中で洗浄することにより、さらに精製し、次いで引き続き生成物を酢酸ナトリウムバッファー５０ｍＭ、ｐＨ＜５．５中ＮａＣｌ ０から１Ｍの直線状勾配中で溶出した。得られた溶出液を、サイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。タンパク質濃度を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ５２０分光光度計でＡ２８０分光光度法により、算出された吸光係数１．３６を用いて決定した。

【0178】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４をキャラクタリゼーションするための方法
ウエスタンブロット分析を、標準のプロトコールを用いて行った。タンパク質を、フッ化ポリビニリデン膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に、Ｘｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造元の指示にしたがって移した。膜を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中３％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末で、室温で１時間ブロックした。ウエスタンブロットを、標準のプロトコールを用いて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）で展開した。

【0179】

サイズ排除ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ－ＳＥＣ－Ｓ３０００（３００×７．８ｍｍ）カラムを装着したＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステム（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｐｕｍｐ－３０７、ＵＶ／Ｖｉｓ－１５１ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒ－２１５ ａｎｄ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ－８１９）を用いて、流速１ｍｌ／分の移動相Ｄ－ＰＢＳ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。試料２５μＬをカラム上に注入し、タンパク質種の分離をＡ２８０ｎｍでモニタリングした。

【0180】

小規模精製したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の酵素的脱グリコシルを、ＥＤＧＬＹキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、製造元のプロトコールにしたがって行った。タンパク質を、変性および天然両方の条件下で脱グリコシルした。変性タンパク質に対して、タンパク質３０μｇを、ＰＮＧａｓｅ Ｆ，Ｏ－グリコシダーゼ、およびα－（２→３，６，８，９）－ノイラミニダーゼ、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、およびβ－（１→４）－ガラクトシダーゼで、３７℃で３時間、脱グリコシルした。天然の条件下、タンパク質３５μｇを、上記と同じセットの酵素で、３７℃で３日間脱グリコシルした。脱グリコシルしたタンパク質を、クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、およびウエスタンブロットにより標準のアッセイプロトコールを用いて分析した。

【0181】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＮ末端アミノ酸シーケンシングを、以下の通り行った。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４およそ２μｇを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上、標準のプロトコールを用いて流した。タンパク質を、Ｘｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造元の指示にしたがってＰＶＤＦ膜上に移した。膜を、オービタルシェーカーのプラットホーム上、０．１％（ｗ／ｖ）アミドブラックでおよそ１５分間染色し、次いでｄＨ_２Ｏで洗浄して、ＰＶＤＦ膜のバックグラウンド染色を低減した。膜を空気乾燥した後、Ｎ末端をシーケンシングした。対象のバンドを切り出し、多特異的結合性分子のＮ末端の配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４９４ ＨＴシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎ
ｃｉｓｃｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）上、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ１４０ＡマイクロＨＰＬＣを用いたオンラインフェニルチオヒダントイン分析で行った。

【0182】

キャラクタリゼーション結果
精製したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４およびＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、凝集、モノマー、およびタンパク質フラグメンテーションのレベルに対してプロファイリングした（図２Ａおよび２Ｂ）。モノマーを含む主ピークは、存在する全タンパク質のおよそ９０％を構成し、残りのおよそ１０％のタンパク質の質量はカラム保持時間がより短く、より高次の種または凝集物が存在することが示された。しかし、ＳＥＣ－ＨＰＬＣからのモノマーのピークには顕著なショルダーが２つあり、このピーク内のタンパク質は単一の種ではないことが示された。クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、還元条件下、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４では明確な２本のバンドを（およそ１００および７５ｋＤに）示し、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質でも同様に明確な２本のバンドを（およそ７０および４５ｋＤに）示した（図２Ｂ）。非還元条件下では、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４ではメジャーバンドが３本存在し（１５０と２５０ｋＤとの間）、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質ではメジャーバンド１本およびマイナーバンド１本がそれぞれ、およそ１５０および１２０ｋＤに存在した。還元条件下の２本のバンド間の分子量の差は、ｓｃＦｖフラグメントのサイズにおよそ等しかったため（約２６．５ｋＤ）、何の形態の多特異的結合性分子が産生されているかを理解するために、さらなる分析を行った。天然の条件下の質量分光分析により、精製された２つの別々のタンパク質調製物に対して、精製したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４調製物中に、およそ１２５、１５２、および１７６ｋＤの３つの分子量が存在したＳＤＳ－ＰＡＧＥデータが確認された（図２Ｃ）。

【0183】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって観察されたバンドパターンがＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の異なるグリコシル化によるのであれば、脱グリコシルされると、これは単一のバンドに分解される。しかし、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４が、天然のタンパク質または変性したタンパク質のいずれかとして脱グリコシルされた場合、バンドパターンは、還元条件下および非還元条件下の両方で維持された（データは示さず）。グリコシルおよび脱グリコシル両方のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的抗体でウエスタンブロット染色すると、予想された全長のバンドおよび低分子量のバンドの両方とも、抗Ｆｃ特異的抗体と反応性であったことが示された（データは示さず）。

【0184】

切断した生成物の最終的な同定を、タンパク質のＮ末端アミノ酸シーケンシングによって行った。これにより、切断したタンパク質のＮ末端の最初の８個のアミノ酸はＳＭＡＰＧＡＶＨであり、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４配列（配列番号１４）のアミノ酸１７６から１８３に相当することが明らかになった。これは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＮ末端のアミノ酸１７５個が切断され、このためアミノ酸４２個のＴＮＦＲ２ドメインだけが残ったことを表していた。これにより、本発明者らは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分光法、およびＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析から質量データを正確に解釈することができた。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４ダイマーには可能な組合せが３つ存在し、全て以下の精製したタンパク質調製物中に存在した：（１）全長のホモ二量体、（２）全長および切断された種のヘテロ二量体、ならびに（３）切断された種のホモ二量体。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の生物学的活性を正確に測定するために、全長のホモ二量体の調製物を、２工程のカラムクロマトグラフィープロセスによって産生した。第１の工程では、プロテインＡ精製後、生成物はモノマー８０．５％を含み（図３Ａ）、第２のカラム精製工程（ＳＰセファロース）後、モノマーのパーセント値は９７．８％であった（図３Ｂ）。全プロセスにわたる収率は７．３％であった。

【0185】

実施例２－示差走査熱量計（ＤＳＣ）による熱安定性分析
自動ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を熱量測定に用いた。ヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌバッファーｐＨ６．０ ２５ｍＭ中１ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料を試験した。タンパク質試料およびバッファーを、２５℃から１００℃まで、１時間あたり９５℃の速度の直線状の熱傾斜にかけた。バッファーを、Ｏｒｉｇｉｎ７ソフトウエアを用いて、タンパク質試料からの基準として差引き、熱転移を決定した。

【0186】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（図４）に対する示差熱図は、変性温度（Ｔｍ）６４℃、６７℃、および８４℃に３つの明確なアンフォールディング転移を示す。本発明者らは、Ｔｍ６４℃は、ＴＮＦＲ２ドメインおよび抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメイン両方の変性に相当し、Ｔｍ６７℃および８４℃はそれぞれ、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに対する変性Ｔｍに典型的であると推定した（例えば、Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３９３：６７２～９２頁（２００９）、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０７０５６５号）。理論に拘泥しようとするものではないが、ｓｃＦｖは一般的に、他の抗体ドメインより変性温度が低く、これらのアンフォールディングは単一の転移のイベントを特徴とする（Ｒｏｂｅｒｇｅら、２００６、Ｊｕｎｇら、１９９９、Ｔｉｓｃｈｅｎｋｏら、１９９８）。

【0187】

実施例３－ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４に対する抗原結合の確認
Ａ．ＥＬＩＳＡによる単一および二重の抗原結合
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐウエルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中５μｇ ｍｌ^－１に希釈したＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０μｌで、４℃で一夜コーティングした。翌日、コーティング溶液を除去し、ウエルをブロッキングバッファー［３％スキムミルク－ＰＢＳ］１５０μｌで、室温で１時間ブロックした。ウエルをＰＢＳ中で３回すすいだ後、ブロッキングバッファー中で作成したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の希釈段階５０μｌを加えた。室温で１時間後、ウエルを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％ｖ／ｖ；ＰＢＳ－Ｔ）中で３回洗浄した。次いで、ビオチン化ＮＧＦ５０マイクロリットルをウエルに加え、室温でさらなる１時間インキュベートした後、上記の通り洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰ５０μｌを加えた（１：１００）。室温で１時間後、ウエルをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンチジン基質５０μｌを加え、色を発色させた。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えることによって反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。得られたデータを、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて分析した。単一抗原結合ＥＬＩＳＡに対して、ウエルをＴＮＦαまたはＮＧＦ－ビオチンのいずれかで上記の通りコーティングし、抗体の結合を抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：５０００）で検出し、色を上記の通り発色させた。

【0188】

ＥＬＩＳＡの結果を図５に示す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、ＴＮＦαおよびＮＧＦ両方の抗原に結合するようにデザインしたものである。単一抗原の結合を、最初に１つの抗原を９６ウエルマイクロタイタープレート上に固定化し、引き続き段階希釈のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を加えることによって行った。特異的な結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ＩｇＧＦｃ特異的抗体を用いることによって検出した。二重抗原結合ＥＬＩＳＡでは、第１の抗原であるＴＮＦαをＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、次いで段階希釈のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を加え、引き続き固定濃度の第２のビオチン化抗原であるＮＧＦを加えた。次いで、特異的な結合を、ＨＲＰコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、単一抗原結合ＥＬＩＳＡではＴＮＦαおよびＮＧＦに結合した（図５ＡおよびＢ）。二重抗原結合ＥＬＩＳＡでは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４はＴＮＦαおよびＮＧＦの両方に同時に結合した（図５Ｃ）。

【0189】

Ｂ．表面プラズモン共鳴法による同時の抗原結合
同時の抗原結合実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、実質的にＤｉｍａｓｉ，Ｎ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３９３：６７２～９２頁（２００９）に記載されている通りに行った。簡潔に述べると、ＣＭ５センサーチップを用いて、１００ｎＭのおよそ１５００共鳴単位のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を固定化した。次いで、ＴＮＦαおよびＮＧＦに対する同時発生的な結合（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）に、センサーチップ表面を用いた。抗原を、ＨＢＳ－ＥＰバッファー［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．００５％Ｐ２０］中で調製した。流速３０μｌ／分を、全ての結合の測定に用いた。多特異的抗体のＴＮＦαおよびＮＧＦに対する同時の結合（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ）を決定するために、ＴＮＦα（分子量、１７．５ｋＤ）１μＭを、センサーチップ表面上に注入し、注入が完了したら、次いで、ともに１μＭのＴＮＦαおよびＮＧＦ（分子量、１３．５ｋＤ）の混合物を注入した。ＮＧＦ結合段階の間にＴＮＦαが解離してシグナルが喪失するのを防ぐために、ＮＧＦとの混合物中にＴＮＦαを含めた。対照として、同様の結合手順を行い、最終の注入時はＴＮＦαだけを加え、この注入に対して共鳴単位におけるさらなる増大がなかったことで、飽和レベルのＴＮＦαが結合したことが示された。ＴＮＦαおよびＮＧＦの注入の順序を逆転した、同様の結合および対照実験を行った。

【0190】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の同時の抗原結合を、表面プラズモン共鳴法によってキャラクタリゼーションした。結合のイベントを、逐次的に定性分析した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４をセンサーチップ表面上に、アミンカップリング化学反応を用いて、共有結合的に固定化した。引き続き、第１の抗原を注入してＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の結合を飽和レベルにし、次いで第２の抗原を、抗原１との等モル混合物として注入した。結合のセンサーグラムは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４がＴＮＦαおよびＮＧＦに同時に結合したことを明らかに示すものであった（図６）。抗原を注入する順序に関係なく、２つの抗原の同時の結合が生じた。

【0191】

実施例４－ＮＧＦにより誘発されるＴＦ－１細胞増殖の阻害
ＴＦ－１細胞（ＥＣＡＣＣカタログ番号９３０２２３０７）を、９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）において、無血清培養培地５０μｌ中１．５×１０^４細胞／ウエルに接種し、５％ＣＯ_２、３７℃で１８時間インキュベートした。組換えヒト（Ｓｉｇｍａ）またはマウスＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４、ＭＥＤＩ－５７８ ＩｇＧ１ ＴＭ ＹＴＥ、ＭＥＤＩ－５７８に対する非結合性ＩｇＧ１ ＴＭ ＹＴＥアイソタイプ対照、または非結合性二特異的アイソタイプ対照Ｒ３４７ Ｂｓ３Ａｂの希釈物と、９６ウエル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中、３７℃で３０分間、プレインキュベートした。次いで、各試料５０マイクロリットルを細胞プレートに加え、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション期間後、細胞ＴＩＴＲＥ ＧＬＯ（登録商標）アッセイバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを加え、プレートを、５％ＣＯ_２、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、発光を、標準の発光プロトコールを用いて測定した。抗体の非存在下の標準のＮＧＦ誘発性ＴＦ－１増殖を、図７Ａに示す。

【0192】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の機能的活性を、ＮＧＦ誘発性ＴＦ－１の増殖を用いて決定した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、ヒトおよびマウス両方のＮＧＦ誘発性増殖を完全に阻害することができた（それぞれ図７Ｂおよび７Ｃ）。図７Ｂ：ＴＦ－１細胞を、ＥＣ_８０濃度に相当する組換えヒトＮＧＦで刺激した。細胞を、希釈段階の抗体とリガンドと４８時間インキュベートし、その後、細胞の増殖を、細胞ＴＩＴＲＥ ＧＬＯ（登録商標）アッセイバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１０分間培養することにより定量した。図７Ｃ：ＴＦ－１細胞を、ＥＣ_８０濃度に相当する組換えマウスＮＧＦで刺激した。細胞を
、希釈段階の抗体とリガンドと４８時間インキュベートし、その後、細胞の増殖を、細胞ＴＩＴＲＥ ＧＬＯ（登録商標）アッセイバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１０分間、培養することにより定量した。これらのデータは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＮＧＦ阻害性ポーションは生物学的に活性であり、ＭＥＤＩ－５７８に対してＩｇＧ１ＴＭと同様の作用強度で、ＮＧＦ誘発性増殖を阻害することを実証するものである。同様のデータがＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ、および別のＴＮＦ－ＮＧＦ多特異的結合性分子であるヌディマブｖａｒＢ（図７Ｄおよび７Ｅ）でも観察された。ヌディマブｖａｒＢは、完全な抗ＴＮＦα抗体、すなわち、Ｈ_２Ｌ_２フォーマットにおける２本の完全な重鎖および２本の完全な軽鎖を含む抗体を含み、ＭＥＤＩ－５７８ ｓｃＦｖは、抗ＴＮＦα抗体の重鎖のＣ末端に融合していた。ヌディマブｖａｒＢの軽鎖を配列番号２０に示し、ヌディマブｖａｒＢの重鎖を配列番号２２に示す。

【0193】

実施例５－ＴＮＦαによって誘発されるＵ９３７細胞アポトーシスの阻害
Ｕ９３７細胞（ＥＣＡＣＣカタログ番号８５０１１４４０）を、９６ウエル黒壁組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）において、培養培地５０μｌ中、８×１０^５細胞／ウエルの濃度に塗抹した。Ｕ９３７細胞を、ＥＣ_８０濃度に相当する組換えヒトＴＮＦαで刺激した。細胞を、希釈段階の抗体とリガンドと２時間インキュベートし、その後、カスパーゼ３活性を、カスパーゼ３アッセイ反応バッファーと２時間培養することによって定量した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４、非結合性二特異的アイソタイプ対照であるＲ３４７ Ｂｓ３Ａｂ、およびエタネルセプトを、３７℃で３０分間、細胞とプレインキュベートした。この後、組換えヒトＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０μｌを加えて、２０ｎｇ／ｍｌの最終アッセイ濃度を得、引き続き３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション期間後、カスパーゼ３アッセイ反応バッファー（０．２％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ、０．５％ｖ／ｖ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０μＭ ＤＥＶＤ－Ｒ１１０基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））５０μｌを加え、細胞を３７℃で２．５時間インキュベートした。蛍光を、励起４７５ｎｍおよび発光５１２ｎｍにより測定した。ＴＮＦαアンタゴニスト非存在下のカスパーゼ活性を図８Ａに示す。

【0194】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の機能的活性を、Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性アッセイを用いて決定した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、エタネルセプト同様、ＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性を完全に阻害した（図８Ｂ）。これは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＴＮＦα阻害ポーションは、生物学的に活性であり、エタネルセプトと同様の作用強度を有することを明らかに示す。同様のデータが、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢおよびヌディマブｖａｒＢでも観察された（図８Ｃを参照されたい）。

【0195】

実施例６－ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ ｖｉｖｏ手順は全て、ＵＫ内務省動物（科学手順）法（Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ）（１９８６年）にしたがって行い、地域の倫理員会によって認可された。Ｃ５７Ｂ１／６メスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＵＫ）を一貫して用いた。マウスを、個々に換気したケージ（ＩＶＣ）中、１ケージあたり５／６の群において収容し、１２時間の明暗周期（７：００～１９：００照明オン）下、食餌および水を自由に摂取させた。収容し、手順を行う部屋を２４℃に維持し、従来の無線局による一定のバックグラウンドノイズを維持した。全てのマウスに、各試験を始める少なくとも５日前に、同定の目的で、麻酔下（酸素中３％イソフルラン）応答器（ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ）の挿入を施した。

【0196】

Ａ．神経因性疼痛のＳｅｌｔｚｅｒモデル
機械的痛覚過敏を、鎮痛作用測定装置（Ｒａｎｄａｌｌ ＬＯ、Ｓｅｌｉｔｔｏ ＪＪ、Ａｒｃｈ Ｉｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ Ｔｈｅｒ．、１１１：４０９～１９頁（
１９５７））（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を用いて決定した。中止の応答が観察されるまで、順番に各後ろ足の背側表面に増大性の力を適用した。力の適用をこの点で停止し、体重をグラムで記録した。データを、同側および反対側の足に対する中止の閾値としてグラムで表した。ベースラインの読みが確立した後、およそ等しい同側／反対側比でマウスを２群に分け、外科手術を施した。マウスを３％イソフルランで麻酔した。この後、鈍的切開によって中央大腿レベルを切開することにより、左坐骨神経およそ１ｃｍを曝露した。次いで、縫合（１０／０ Ｖｉｒｇｉｎ Ｓｉｌｋ：Ｅｔｈｉｃｏｎ）を、背側３番目の神経を通過させ、きつく縛った。のりを用いて切開を閉じ、マウスを少なくとも７日間回復させた後、試験を開始した。偽手術マウスに同じプロトコールを施したが、神経の曝露後、傷口をのり付けし、回復させた。手術７日および１０日後、痛覚過敏に対してマウスを試験した。１０日目の試験後、手術したマウスを、ＣＡＴ２５１ ＩｇＧ１アイソタイプ対照（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、またはエタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）およびＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）の組合せを投与する群にさらに再分割した。偽手術したマウスには全てＣＡＴ２５１（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投与した。機械的痛覚過敏を、投薬後４時間、１、２、３、４、および７日に測定した。

【0197】

機械的痛覚過敏モデルにおいてエタネルセプトおよびＭＥＤＩ－５７８を同時投与することで、偽手術対照に比べた場合、手術後１０日目に同側／反対側比における有意な低下が顕在化した（図９）。単一用量のエタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）またはＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）いずれかの投与では、この痛覚過敏を有意に元に戻すことはできなかった。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）のＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）と一緒の同時投与は、投薬４時間後の機械的痛覚過敏を有意に元に戻し、効果は投薬後７日目を通して維持された。

【0198】

第２の試験では、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を評価した。機械的痛覚過敏を確立した後、手術後１３日目にマウスにＲ３４７ Ｂｓ３Ａｂアイソタイプ対照（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．もしくは０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投薬した。偽準備した動物に、Ｒ３４７ Ｂｓ３Ａｂアイソタイプ対照（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投与した。上記に記載した通り、投薬４時間後、ならびに投薬後１、２、４、および７日目に、マウスを機械的痛覚過敏に対して試験した。

【0199】

ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の投与は、偽手術した対照と比べた場合、手術後１０日目に同側／反対側比における有意な低下を生じた（図１０Ａ）。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）またはＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）いずれかを投与しても、機械的痛覚過敏を有意に元に戻すことはできなかった。しかし、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．０１および０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）の投与は、投薬４時間後に機械的痛覚過敏を有意に元に戻し、効果は投薬後６日を通して維持された。Ｒ３４７ Ｂｓ３Ａｂ対照の投与後に効果は見られなかった。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢを投与した場合、同様のデータが観察された（図１０Ｂを参照されたい）。これらのデータは、非常に低用量のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は疼痛を有意に元に戻すことができることを示唆しており、この用量と同等の用量のＭＥＤＩ－５７８またはエタネルセプトいずれか単独では、無効または最小に効果的であることが示された。

【0200】

Ｂ．慢性関節痛モデル
機械的痛覚過敏を、マウスインキャパシタンステスター（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ
ｔｅｓｔｅｒ）（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いて決定した
。マウスの後足を別々のセンサー上に載せてマウスを装置に配置し、体重分布を４秒の期間をかけて計算した。データを、同側および反対側の体重保持の比としてグラムで表した。

【0201】

ベースラインの読みを確立した後、マウスをおよそ等しい同側／反対側比で２群に分けた。以下の技術を用いて関節内注射を行った：動物を、酸素中３％イソフルランを用いて麻酔し、左ひざを剪毛し、清浄にした。各マウスのひざ関節に、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（１０ｍｇ／ｍｌ）またはビヒクル（軽油）いずれか１０μｌを、１００μｌＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに搭載した２５ゲージニードルを用いて注射した。注射は、ひざ関節の滑膜腔中に直接行った。上記に記載した通り、マウスを回復させ、注射後７日目および１０日目に、機械的痛覚過敏における変化を再試験した。１０日目の試験後、ＦＣＡ処置したマウスをさらに群に無作為化し、１３日目、マウスにエタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）またはビヒクルを投薬し、その後一用量のＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）またはＣＡＴ２５１アイソタイプ対照（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）を投与した。上記に記載した通り、投薬４時間後、ならびに投薬後１、２、４、および７日目、マウスを機械的痛覚過敏に対して試験した。

【0202】

エタネルセプトおよびＭＥＤＩ－５７８の同時投与の効果を、炎症性疼痛の関節内ＦＣＡモデルを用いて評価した。ＦＣＡの関節内投与は機械的痛覚過敏を引き起こし、これは、ビヒクル対照と比べた場合、７および１０日目に同側／反対側比における有意な低下として顕在化した（図１１）。偽処置群では、処置前のベースラインレベルに比べて、同側／反対側比における低下は観察されなかった。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）＋ＣＡＴ２５１（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ ｉ．ｐ．）＋ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）の投与は、投薬４時間後、ならびに１、２、４、および７日目にＦＣＡ誘発性機械的痛覚過敏をわずかに元に戻したが、これは統計学的有意性に到達できなかった。しかし、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）＋ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ）の投与は、投薬後試験の全ての時間に、ＦＣＡ誘発性機械的痛覚過敏を有意に元に戻した。

【0203】

第２の試験において、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を評価した。ＦＣＡ誘発性機械的痛覚過敏の確立後、ＦＣＡ後１３日目、マウスに：Ｒ３４７ Ｂｓ３Ａｂアイソタイプ対照（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、ＭＥＤＩ－５７８（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、またはＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．００３ｍｇ／ｋｇもしくは０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投薬した。再び、上記に記載した通り、投薬４時間後、ならびに投薬後１、２、４、および７日目、マウスを機械的痛覚過敏に対して試験した。

【0204】

エタネルセプトおよびＭＥＤＩ－５７８の効果と個々に比べた、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（「二特異的」）の効果を、図１２に示す。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ
ｓ．ｃ．）もＭＥＤＩ－５７８（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）も、投薬後のいずれの時間点でも、ＦＣＡ誘発性機械的痛覚過敏を有意に元に戻さなかった。しかし、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の投与は、ＦＣＡ誘発性機械的痛覚過敏を有意に元に戻した。高用量のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）は試験の期間中に有意な活性を示したが、低用量（０．００３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）は投薬後１日目に有意性に到達し、試験の期間中は高用量と同様のレベルのままであった。

【0205】

Ｃ．ラットにおける機械的痛覚過敏の確立されたＦＣＡ誘発性モデル
フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を足底内（ｉｎｔｒａｐｌａｎｔａｒ）注射すると炎症反応を引き起こし、炎症反応は過敏症および浮腫を誘発し、臨床的な炎症性疼痛のいくつかの側面を擬する。これらの効果は、体重負荷を測定するための機器を用いて調
べることができる。体重負荷方法を用いたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４ ＦＣＡ誘発性過敏症の、潜在的な抗痛覚過敏性質の評価。ナイーブラットは、自身の体重を２本の後足間に等しく分配する。しかし、注射した（左の）後足が炎症を起こし、かつ／または痛む場合、罹患している足上により少ない体重をかけるように、体重を再分配する（損傷した足上への体重負荷の低減）。各後足による体重負荷を、ラットインキャパシタンステスター（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて測定した。ラットをインキャパシタンステスターに配置し、後足を別々のセンサー上に置き、両方の後足によって行使された力の平均を４秒かけて記録した。

【0206】

この試験では、ナイーブラット（オス、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ）、１９８～２５８ｇ）を、ホームケージ中、実験室に気候順応し、食餌および水を任意にとらせた。インキャパシタンステスターへの慣らしを数日かけて行った。ベースラインの体重負荷の記録を取った後、傷害を導入した。ＦＣＡ（Ｓｉｇｍａより入手、１ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌ）を左後足へ足底内注射することにより炎症性の過敏症を誘発した。処置前の体重負荷測定を行って、ＦＣＡ後２３時間の過敏症を評価した。

【0207】

次いで、動物をランク付けし、ラテン方格法において、体重負荷ＦＣＡウインドウにしたがって、処置群に無作為化した。ＦＣＡ注射２４時間後、動物を、０．００３、０．０１、０．０３、０．３、および３ｍｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（「二特異的」）のｉ．ｖ．投与、陰性対照の抗体であるＮＩＰ２２８（ハプテンであるニトロフェノールに結合するように産生した抗体）３ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与、ビヒクル（１％メチルセルロース）２ｍｌ／ｋｇのｐ．ｏ．投与、またはインドメタシン１０ｍｇ／ｋｇのｐ．ｏ．投与いずれかで処置した。

【0208】

体重負荷を、抗体／薬物処置４時間および２４時間後に評価した。各時間点で処置群をビヒクル対照群に比べることによって、データを分析した。統計学的分析には、ＡＮＯＶＡの反復測定の後、ＩｎＶｉｖｏＳｔａｔ（ｉｎｖｉｖｏｓｔａｔ．ｃｏ．ｕｋ）を用いた計画的な比較検定が続いた（ｐ＜０．０５を有意とみなした）。結果を図１３に示す。過敏症が有意に元に戻ることが、インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）４時間および２４時間で観察された。０．３および３ｍｇ／ｋｇを投薬したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４では、４時間および２４時間両方で過敏症が有意に元に戻ることが認められ、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の０．００３および０．０３ｍｇ／ｋｇ投薬でも過敏症が有意に元に戻ることが認められたが、後者は２４時間においてのみであった。アイソタイプ対照であるＮＩＰ２２８は、いずれの時間点でもＦＣＡ応答に対する有意な効果がなかった。

【0209】

実施例７－ＴＮＦαおよびＮＧＦのｐ３８リン酸化
文献によると、ｐ３８リン酸化は、神経因性疼痛の発症において重要な役割を果たすことが示唆される。例えば、ｐ３８インヒビターでの処置は、神経部分損傷モデルにおいて（Ｗｅｎ ＹＲら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、２００７、１０７：３１２～３２１頁）、および坐骨の炎症性神経障害モデルにおいて（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＥＤら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００３、２３：１０２６～１０４０頁）、神経因性疼痛の症状の発症を防ぐことが示されている。本実験において、ＴＮＦα、ＮＧＦ、およびＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せの、ｐ３８リン酸化における役割を、細胞培養アッセイにおいて調べた。簡潔に述べると、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ－１細胞（ＰＣ－１２ラット神経内分泌細胞のサブクローン）を、増加する量のＴＮＦα、ＮＧＦ、またはＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せとインキュベートした。２０分のインキュベート期間後、均一時間分解蛍光（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＨＴＲＦ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いてホスホ－ｐ３８を定量した。

【0210】

ＨＴＲＦアッセイ：ＴＮＦα、ＮＧＦ、またはＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せで刺激した
後、細胞上清を速やかに除去し、細胞を溶解バッファー中に溶解した。ホスホ－ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）を、２つの異なる特異的な抗体：ユーロピウムクリプテート（ドナーフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ホスホ－ｐ３８抗体、およびｄ２（アクセプタフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ｐ３８（総）抗体を用いてサンドイッチアッセイのフォーマットにおいて可溶化液中で検出した。抗体を細胞可溶化液とインキュベートし、ＨＴＲＦ比は、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光測定から算出した。

【0211】

データを、６６５ｎｍでの発光と６２０ｎｍでの発光との間の比として算出したＨＴＲＦ比として表す。ホスホ－ｐ３８反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップを図１４に示す。ＴＮＦα、ＮＧＦ、またはＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せの効果を示す用量反応曲線を図１５に示す。図１５から見てとることができる通り、高濃度のＴＮＦαおよびＮＧＦの、ホスホ－ｐ３８に対する併用効果は、いずれかのファクター単独によって誘発されるホスホ－ｐ３８シグナルの合計の予想より大きい。これらのデータは、ＴＮＦαおよびＮＧＦは一緒に作用してｐ３８リン酸化を誘発し得、疼痛をまねく分子シグナリングに２つの経路が関与し得ることを示唆するものである。

【0212】

実施例８－ＴＮＦαおよびＮＧＦによるＥＲＫリン酸化
ｐ３８同様、ＥＲＫも、神経因性疼痛の発生の間に活性化される（Ｚｈｕａｎｇ ＺＹら、Ｐａｉｎ ２００５、１１４：１４９～１５９頁）。本実験において、ＴＮＦα、ＮＧＦ、ならびにＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せのＥＲＫリン酸化における役割を、細胞培養アッセイにおいて調べた。簡潔に述べると、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ－１細胞（ＰＣ－１２ラット神経内分泌細胞のサブクローン）を、増加する量のＴＮＦα、ＮＧＦ、またはＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せとインキュベートした。２０分のインキュベーション期間の後、ホスホ－ＥＲＫを、ＨＴＲＦアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて定量した。

【0213】

ＨＴＲＦアッセイ：刺激後、細胞上清を速やかに除去し、細胞を溶解バッファー中に溶解した。ホスホ－ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）を、２つの異なる特異的な抗体：ユーロピウムクリプテート（ドナーフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ホスホ－ＥＲＫ抗体、およびｄ２（アクセプタフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ＥＲＫ（総）抗体を用いてサンドイッチアッセイのフォーマットにおいて可溶化液中で検出した。抗体を細胞可溶化液とインキュベートし、ＨＴＲＦ比は、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光測定から算出した。

【0214】

データを、６６５ｎｍでの発光と６２０ｎｍでの発光との間の比として算出したＨＴＲＦ比として表す。ホスホ－ＥＲＫ反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップを図１６に示す。ＴＮＦα、ＮＧＦ、またはＴＮＦαおよびＮＧＦの組合せの効果を示す用量反応曲線を図１７に示す。図１７から見てとることができる通り、少量のＴＮＦα単独ではホスホ－ＥＲＫを誘発しなかったが、大量では、ＮＧＦ－誘発性ホスホ－ＥＲＫを増強した。これらのデータは、ＴＮＦαおよびＮＧＦは一緒に作用してｐ３８リン酸化を誘発し得、疼痛をもたらす分子シグナリングにこれら２つの経路が関与し得ることを示唆する。

【0215】

配列表
配列番号１ ＮＰ＿００２４９７．２｜ベータ－神経成長因子前駆体［ヒト］
1 MSMLFYTLIT AFLIGIQAEP HSESNVPAGH TIPQAHWTKL QHSLDTALRR ARSAPAAAIA
61 ARVAGQTRNI TVDPRLFKKR RLRSPRVLFS TQPPREAADT QDLDFEVGGA APFNRTHRSK
121 RSSSHPIFHR GEFSVCDSVS VWVGDKTTAT DIKGKEVMVL GEVNINNSVF KQYFFETKCR
181 DPNPVDSGCR GIDSKHWNSY CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACV CVLSRKAVRR
241 A
配列番号２ ＮＰ＿０００５８５．２｜腫瘍壊死因子［ヒト］
1 MSTESMIRDV ELAEEALPKK TGGPQGSRRC LFLSLFSFLI VAGATTLFCL LHFGVIGPQR
61 EEFPRDLSLI SPLAQAVRSS SRTPSDKPVA HVVANPQAEG QLQWLNRRAN ALLANGVELR
121 DNQLVVPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE
181 TPEGAEAKPW YEPIYLGGVF QLEKGDRLSA EINRPDYLDF AESGQVYFGI IAL
配列番号３ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨ（１２５６Ａ５ ＶＨ）
1 QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS TYGISWVRQA PGQGLEWMGG IIPIFDTGNS
61 AQSFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSS RIYDLNPSLT AYYDMDVWGQ
121 GTMVTVSS
配列番号４ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨＣＤＲ１
1 TYGIS
配列番号５ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨＣＤＲ２
1 GIIPIFDTGN SAQSFQG
配列番号６ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨＣＤＲ３
1 SSRIYDLNPS LTAYYDMDV
配列番号７ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬ（１２５６Ａ５ ＶＬ）
1 QSVLTQPPSV SAAPGQKVTI SCSGSSSNIG NNYVSWYQQL PGTAPKLLIY DNNKRPSGIP
61 DRFSGSKSGT SATLGITGLQ TGDEADYYCG TWDSSLSAWV FGGGTKLTVL
配列番号８ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬＣＤＲ１
1 SGSSSNIGNN YVS
配列番号９ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬＣＤＲ２
1 DNNKRPS
配列番号１０ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬＣＤＲ３
1 GTWDSSLSAW V
配列番号１１
1 SSRIYDFNSA LISYYDMDV
配列番号１２
1 SSRIYDMISS LQPYYDMDV
配列番号１３ 可溶性ＴＮＦＲ２アミノ酸配列
1 LPAQVAFTPY APEPGSTCRL REYYDQTAQM CCSKCSPGQH AKVFCTKTSD TVCDSCEDST
61 YTQLWNWVPE CLSCGSRCSS DQVETQACTR EQNRICTCRP GWYCALSKQE GCRLCAPLRK
121 CRPGFGVARP GTETSDVVCK PCAPGTFSNT TSSTDICRPH QICNVVAIPG NASMDAVCTS
181 TSPTRSMAPG AVHLPQPVST RSQHTQPTPE PSTAPSTSFL LPMGPSPPAE GSTGDEPKSC
241 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
301 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
361 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
421 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
配列番号１４ ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４－アミノ酸配列

【化1】

配列番号１５ （Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３アミノ酸１５個のリンカー配列
１ ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ
配列番号１６ ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４－ヌクレオチド配列
1 CTGCCCGCCC AGGTGGCCTT TACCCCTTAT GCCCCCGAGC CCGGCAGCAC CTGTCGGCTG
61 AGAGAGTACT ACGACCAGAC CGCCCAGATG TGCTGCAGCA AGTGCTCTCC TGGCCAGCAT
121 GCCAAGGTGT TCTGCACCAA GACCAGCGAC ACCGTGTGCG ACAGCTGCGA GGACAGCACC
181 TACACCCAGC TGTGGAACTG GGTGCCCGAG TGCCTGAGCT GCGGCAGCAG ATGCAGCAGC
241 GACCAGGTGG AAACCCAGGC CTGCACCAGA GAGCAGAACC GGATCTGCAC CTGTAGACCC
301 GGCTGGTACT GCGCCCTGAG CAAGCAGGAA GGCTGCAGAC TCTGCGCCCC TCTGCGGAAG
361 TGCAGACCCG GCTTTGGCGT GGCCAGACCC GGCACCGAGA CAAGCGACGT GGTCTGTAAG
421 CCCTGCGCTC CTGGCACCTT CAGCAACACC ACCAGCAGCA CCGACATCTG CAGACCCCAC
481 CAGATCTGCA ACGTGGTGGC CATCCCCGGC AACGCCAGCA TGGATGCCGT CTGCACCAGC
541 ACTAGCCCCA CCAGAAGTAT GGCCCCTGGC GCCGTGCATC TGCCCCAGCC TGTGTCCACC
601 AGAAGCCAGC ACACCCAGCC CACCCCTGAG CCTAGCACCG CCCCCTCCAC CAGCTTTCTG
661 CTGCCTATGG GCCCTAGCCC TCCAGCCGAG GGAAGCACAG GCGACGAGCC CAAGAGCTGC
721 GACAAGACCC ACACCTGTCC CCCCTGCCCT GCCCCTGAAC TGCTGGGCGG ACCCAGCGTG
781 TTCCTGTTCC CCCCAAAGCC CAAGGACACC CTGATGATCA GCCGGACCCC CGAAGTGACC
841 TGCGTGGTGG TGGACGTGTC CCACGAGGAC CCTGAAGTGA AGTTCAATTG GTACGTGGAC
901 GGCGTGGAAG TGCACAACGC CAAGACCAAG CCCAGAGAGG AACAGTACAA CTCCACCTAC
961 CGGGTGGTGT CCGTGCTGAC CGTGCTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA AGAGTACAAG
1021 TGCAAGGTCT CCAACAAGGC CCTGCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCAG CAAGGCCAAG
1081 GGCCAGCCCC GCGAGCCTCA GGTGTACACA CTGCCCCCCA GCCGGGAAGA GATGACCAAG
1141 AACCAGGTGT CCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGATAT CGCCGTGGAA
1201 TGGGAGAGCA ATGGCCAGCC CGAGAACAAC TACAAGACCA CCCCCCCTGT GCTGGACAGC
1261 GACGGCTCAT TCTTCCTGTA CAGCAAGCTG ACCGTGGACA AGAGCCGGTG GCAGCAGGGC
1321 AACGTGTTCA GCTGCAGCGT GATGCACGAG GCCCTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGTCC
1381 CTGAGCCTGA GCCCCGGAAA GGGCGGTGGC GGATCCGGAG GTGGGGGATC TCAGGTGCAG
1441 CTGGTGCAGT CTGGCGCCGA AGTGAAGAAA CCCGGCTCTA GCGTGAAGGT GTCCTGCAAG
1501 GCCAGCGGCG GCACCTTCTC CACCTACGGC ATCAGCTGGG TCCGCCAGGC CCCTGGACAG
1561 GGCCTGGAAT GGATGGGCGG CATCATCCCC ATCTTCGACA CCGGCAACAG CGCCCAGAGC
1621 TTCCAGGGCA GAGTGACCAT CACCGCCGAC GAGAGCACCT CCACCGCCTA CATGGAACTG
1681 AGCAGCCTGC GGAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCAGAAGCAG CCGGATCTAC
1741 GACCTGAACC CCAGCCTGAC CGCCTACTAC GACATGGACG TGTGGGGCCA GGGCACCATG
1801 GTCACAGTGT CTAGCGGAGG CGGCGGATCT GGCGGCGGAG GAAGTGGCGG GGGAGGATCT
1861 GCCCAGAGCG TGCTGACCCA GCCCCCTTCT GTGTCTGCCG CCCCTGGCCA GAAAGTGACC
1921 ATCTCCTGCA GCGGCAGCAG CAGCAACATC GGCAACAACT ACGTGTCCTG GTATCAGCAG
1981 CTGCCCGGCA CCGCCCCTAA GCTGCTGATC TACGACAACA ACAAGCGGCC CAGCGGCATC
2041 CCCGACCGGT TTAGCGGCAG CAAGAGCGGG ACTTCTGCTA CACTGGGCAT CACAGGCCTG
2101 CAGACCGGCG ACGAGGCCGA CTACTACTGC GGCACCTGGG ACAGCAGCCT GAGCGCTTGG
2161 GTGTTCGGCG GAGGCACCAA GCTGACAGTG CTG
配列番号１７－ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ－アミノ酸配列

【化2】

配列番号１８－ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ－ヌクレオチド配列
1 CTGCCCGCCC AGGTGGCCTT TACCCCTTAT GCCCCCGAGC CCGGCAGCAC CTGTCGGCTG
61 AGAGAGTACT ACGACCAGAC CGCCCAGATG TGCTGCAGCA AGTGCTCTCC TGGCCAGCAT
121 GCCAAGGTGT TCTGCACCAA GACCAGCGAC ACCGTGTGCG ACAGCTGCGA GGACAGCACC
181 TACACCCAGC TGTGGAACTG GGTGCCCGAG TGCCTGAGCT GCGGCAGCAG ATGCAGCAGC
241 GACCAGGTGG AAACCCAGGC CTGCACCAGA GAGCAGAACC GGATCTGCAC CTGTAGACCC
301 GGCTGGTACT GCGCCCTGAG CAAGCAGGAA GGCTGCAGAC TCTGCGCCCC TCTGCGGAAG
361 TGCAGACCCG GCTTTGGCGT GGCCAGACCC GGCACCGAGA CAAGCGACGT GGTCTGCAAG
421 CCCTGCGCTC CTGGCACCTT CAGCAACACC ACCAGCAGCA CCGACATCTG CAGACCCCAC
481 CAGATCTGCA ACGTGGTGGC CATCCCCGGC AACGCCAGCA TGGATGCCGT GTGCACCAGC
541 ACCAGCCCCA CCAGAAGTAT GGCCCCTGGC GCCGTGCATC TGCCCCAGCC TGTGTCCACC
601 AGAAGCCAGC ACACCCAGCC CACCCCTGAG CCTAGCACCG CCCCCTCCAC CAGCTTTCTG
661 CTGCCTATGG GCCCTAGCCC TCCAGCCGAG GGAAGCACAG GCGACGAGCC CAAGAGCTGC
721 GACAAGACCC ACACCTGTCC CCCCTGCCCT GCCCCTGAAC TGCTGGGCGG ACCCAGCGTG
781 TTCCTGTTCC CCCCAAAGCC CAAGGACACC CTGATGATCA GCCGGACCCC CGAAGTGACC
841 TGCGTGGTGG TGGACGTGTC CCACGAGGAC CCTGAAGTGA AGTTCAATTG GTACGTGGAC
901 GGCGTGGAAG TGCACAACGC CAAGACCAAG CCCAGAGAGG AACAGTACAA CTCCACCTAC
961 CGGGTGGTGT CCGTGCTGAC CGTGCTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA AGAGTACAAG
1021 TGCAAAGTCT CCAACAAGGC CCTGCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCAG CAAGGCCAAG
1081 GGCCAGCCCC GCGAGCCTCA gGTGTACACA CTGCCCCCCA GCCGGGAAGA GATGACCAAG
1141 AACCAGGTGT CCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGATAT CGCCGTGGAA
1201 TGGGAGAGCA ACGGCCAGCC CGAGAACAAC TACAAGACCA CCCCCCCTGT GCTGGACAGC
1261 GACGGCTCAT TCTTCCTGTA CAGCAAGCTG ACCGTGGACA AGAGCCGGTG GCAGCAGGGC
1321 AATGTCTTCA GCTGTAGCGT GATGCACGAG GCCCTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGTCC
1381 CTGAGCCTGA GCCCCGGAAA GGGCGGAGGC GGATCCGGAG GTGGGGGATC TCAGGTGCAG
1441 CTGGTGCAGT CTGGCGCCGA AGTGAAGAAA CCCGGCTCTA GCGTGAAGGT GTCCTGCAAG
1501 GCCAGCGGCG GCACCTTCTC CACCTACGGC ATCAGCTGGG TCCGCCAGGC CCCTGGACAG
1561 TGTCTGGAAT GGATGGGCGG CATCATCCCC ATCTTCGACA CCGGCAACAG CGCCCAGAGC
1621 TTCCAGGGCA GAGTGACCAT CACCGCCGAC GAGAGCACCT CCACCGCCTA CATGGAACTG
1681 AGCAGCCTGC GGAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCAGAAGCAG CCGGATCTAC
1741 GACCTGAACC CCAGCCTGAC CGCCTACTAC GACATGGACG TGTGGGGCCA GGGCACCATG
1801 GTCACAGTGT CTAGCGGAGG CGGAGGCAGC GGAGGTGGTG GATCTGGTGG CGGAGGAAGT
1861 GGCGGCGGAG GCTCTCAGAG CGTGCTGACC CAGCCCCCTT CTGTGTCTGC CGCCCCTGGC
1921 CAGAAAGTGA CCATCTCCTG CAGCGGCAGC AGCAGCAACA TCGGCAACAA CTACGTGTCC
1981 TGGTATCAGC AGCTGCCCGG CACCGCCCCT AAGCTGCTGA TCTACGACAA CAACAAGCGG
2041 CCCAGCGGCA TCCCCGACCG GTTTAGCGGC AGCAAGAGCG GGACTTCTGC TACACTGGGC
2101 ATCACAGGCC TGCAGACCGG CGACGAGGCC GACTACTACT GCGGCACCTG GGACAGCAGC
2161 CTGAGCGCTT GGGTGTTCGG CTGCGGCACC AAGCTGACAG TGCTG
配列番号１９－（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４アミノ酸２０個のリンカー配列
1 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
配列番号２０－ヌディマブｖａｒＢ－Ｌ鎖アミノ酸配列
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVY SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRAIGIPA
61 RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPFTFG PGTKVDIKRT VAAPSVFIFP
121 PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL
181 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC
配列番号２１－ヌディマブｖａｒＢ－Ｌ鎖ヌクレオチド配列
1 GAAATCGTGC TGACCCAGAG CCCCGCCACC CTGTCTCTGA GCCCTGGCGA GAGAGCCACC
61 CTGAGCTGCA GAGCCAGCCA GAGCGTGTAC TCCTACCTGG CTTGGTATCA GCAGAAGCCC
121 GGCCAGGCCC CCAGACTGCT GATCTACGAC GCCAGCAACC GGGCCATCGG CATCCCTGCC
181 AGATTTTCTG GCAGCGGCAG CGGCACCGAC TTCACCCTGA CCATCAGCAG CCTGGAACCC
241 GAGGACTTCG CCGTGTACTA CTGCCAGCAG CGGAGCAACT GGCCCCCCTT CACCTTCGGC
301 CCTGGCACCA AGGTGGACAT CAAGCGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG
361 CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC
421 TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC
481 CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG
541 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG
601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT
配列番号２２－ヌディマブｖａｒＢ－Ｈ鎖アミノ酸配列

【化3】

配列番号２３－ヌディマブｖａｒＢ－Ｈ鎖ヌクレオチド配列
1 CAGGTGCAGC TGGTGGAAAG CGGCGGAGGC GTGGTGCAGC CCGGCAGAAG CCTGAGACTG
61 AGCTGCGCTG CCAGCGGCTT CATCTTCAGC AGCTACGCCA TGCACTGGGT CCGCCAGGCC
121 CCTGGCAACG GACTGGAATG GGTGGCCTTC ATGAGCTACG ACGGCAGCAA CAAGAAGTAC
181 GCCGACAGCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC AGCCGGGACA ACAGCAAGAA CACCCTGTAC
241 CTGCAGATGA ACAGCCTGCG GGCTGAGGAC ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CAGAGACCGA
301 GGCATCAGTG CTGGCGGCAA CTACTACTAC TACGGCATGG ACGTGTGGGG CCAGGGCACC
361 ACCGTGACCG TGTCTAGCGC GTCGACCAAG GGCCCATCCG TCTTCCCCCT GGCACCCTCC
421 TCCAAGAGCA CCTCTGGGGG CACAGCGGCC CTGGGCTGCC TGGTCAAGGA CTACTTCCCC
481 GAACCGGTGA CGGTGTCCTG GAACTCAGGC GCTCTGACCA GCGGCGTGCA CACCTTCCCG
541 GCTGTCCTAC AGTCCTCAGG ACTCTACTCC CTCAGCAGCG TGGTGACCGT GCCCTCCAGC
601 AGCTTGGGCA CCCAGACCTA CATCTGCAAC GTGAATCACA AGCCCAGCAA CACCAAGGTG
661 GACAAGAGAG TTGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCA
721 CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC
781 ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT
841 GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG
901 CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG
961 GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC
1021 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT CTACACCCTG
1081 CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC
1141 TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC
1201 AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTATAG CAAGCTCACC
1261 GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT
1321 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAAGG CGGAGGGGGA
1381 TCCGGCGGAG GGGGCTCTCA GGTGCAGCTG GTGCAGTCTG GCGCCGAAGT GAAGAAACCC
1441 GGCTCTAGCG TGAAGGTGTC CTGCAAGGCC AGCGGCGGCA CCTTCTCCAC CTACGGCATC
1501 AGCTGGGTCC GCCAGGCCCC TGGACAGTGT CTGGAATGGA TGGGCGGCAT CATCCCCATC
1561 TTCGACACCG GCAACAGCGC CCAGAGCTTC CAGGGCAGAG TGACCATCAC CGCCGACGAG
1621 AGCACCTCCA CCGCCTACAT GGAACTGAGC AGCCTGCGGA GCGAGGACAC CGCCGTGTAC
1681 TACTGCGCCA GAAGCAGCCG GATCTACGAC CTGAACCCCA GCCTGACCGC CTACTACGAC
1741 ATGGACGTGT GGGGCCAGGG CACCATGGTC ACAGTGTCTA GCGGAGGCGG AGGCAGCGGA
1801 GGTGGTGGAT CTGGTGGCGG AGGAAGTGGC GGCGGAGGCT CTCAGAGCGT GCTGACCCAG
1861 CCCCCTTCTG TGTCTGCCGC CCCTGGCCAG AAAGTGACCA TCTCCTGCAG CGGCAGCAGC
1921 AGCAACATCG GCAACAACTA CGTGTCCTGG TATCAGCAGC TGCCCGGCAC CGCCCCTAAG
1981 CTGCTGATCT ACGACAACAA CAAGCGGCCC AGCGGCATCC CCGACCGGTT TAGCGGCAGC
2041 AAGAGCGGGA CTTCTGCTAC ACTGGGCATC ACAGGCCTGC AGACCGGCGA CGAGGCCGAC
2101 TACTACTGCG GCACCTGGGA CAGCAGCCTG AGCGCTTGGG TGTTCGGCTG CGGCACCAAG
2161 CTGACAGTGC TG
配列番号２４－ＮＧＦ－ＮＧ ＶＨアミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFWFGAFTWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGLTNLAQNFQGRVTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号２５－ＮＧＦ－ＮＧ ＶＨヌクレオチド配列
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggagg caccttctgg ttcggcgcgt tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggaggg attattccta tcttcgggtt gacgaacttg 180
gcacagaact tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcttgag atctgaagac acggccgtat attattgtgc acgttcaagt 300
cgtatctacg atctgaaccc gtccctgacc gcctactacg atatggatgt ctggggccag 360
gggacaatgg tcaccgtctc gagt 384
配列番号２６－ＮＧＦ－ＮＧ ＶＬアミノ酸配列
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号２７－ＮＧＦ－ＮＧ ＶＬヌクレオチド配列
cagtctgtgc tgactcagcc gccatcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc cgacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
配列番号２８－ｎｄｉｍａｂ ＶＨアミノ酸配列
1 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFIFS SYAMHWVRQA PGNGLEWVAF MSYDGSNKKY
61 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR GISAGGNYYY YGMDVWGQGT
121 TVTVSS
配列番号２９－ｎｄｉｍａｂ ＶＬアミノ酸配列
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVY SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRAIGIPA
61 RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPFTFG PGTKVDIK
配列番号３０－１１２６Ｆ１ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQTGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDANRQAVPYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号３１－１１２６Ｆ１ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQMVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号３２－１１２６Ｇ５ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFTSGLAPYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号３３－１１２６Ｇ５ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSTWVFGGGTKLTVL
配列番号３４－１１２６Ｈ５ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDAGNSAQSFQGRVTITADESTSTAHMEVSSLRSEDTAVYYCASSSRIYDHHIQKGGYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号３５－１１２６Ｈ５ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号３６－１１２７Ｄ９ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDYHTIAYYD
配列番号３７－１１２７Ｄ９ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号３８－１１２７Ｆ９ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMKVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDYIPGMRPYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号３９－１１２７Ｆ９ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGNSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSRSGTLATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号４０－１１３１Ｄ７ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFNSSLIAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号４１－１１３１Ｄ７ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDETDYYCGTWDSSLSAWVFSGGTKLTVL
配列番号４２－１１３１Ｈ２ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSTVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号４３－１１３１Ｈ２ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGTSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号４４－１３２Ａ９ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFGTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFEPSLIYYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号４５－１３２Ａ９ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号４６－１１３２Ｈ９ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号４７－１１３２Ｈ９ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPTGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号４８－１１３３Ｃ１１ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号４９－１１３３Ｃ１１ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号５０－１１３４Ｄ９ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVAITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号５１－１１３４Ｄ９ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSGLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号５２－１１４５Ｄ１ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTSNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFRTLYSTYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号５３－１１４５Ｄ１ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGISDRFSGSKSGTSATLGIAGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号５４－１１４６Ｄ７ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号５５－１１４６Ｄ７ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQEVTISCSGSSTNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号５６－１１４７Ｄ２ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVRISCKASGGTFSTYGVSWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号５７－１１４７Ｄ２ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号５８－１１４７Ｇ９ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFNTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTV
配列番号５９－１１４７Ｇ９ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTVSCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号６０－１１５０Ｆ１ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQDRVTITADESTSTAYMEVGSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGHGTMVTVSS
配列番号６１－１１５０Ｆ１ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号６２－１１５２Ｈ５ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLVWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDMISSLQPYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号６３－１１５２Ｈ５ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKATISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号６４－１１５５Ｈ１ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAY
MEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFHLANKGYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号６５－１１５５Ｈ１ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKATISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLDITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号６６－１１５８Ａ１ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFGTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDHHNHVGGYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号６７－１１５８Ａ１ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYASWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDGSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号６８－１１６０Ｅ３ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSAKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号６９－１１６０Ｅ３ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSNSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTV
配列番号７０－１１６５Ｄ４ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号７１－１１６５Ｄ４ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIENNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号７２－１１７５Ｈ８ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQRLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDATTGLTPYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号７３－１１７５Ｈ８ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLRTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号７４－１２１１Ｇ１０ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVRKPGSSVKVSCKAYGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWVGGIIPIFDTRNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDMVSTLIPYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号７５－１２１１Ｇ１０ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号７６－１２１４Ａ１ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDAHLQAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号７７－１２１４Ａ１ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTRDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号７８－１２１４Ｄ１０ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAEAKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGRGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVAITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDAHLNHHGYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号７９－１２１４Ｄ１０ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQAGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号８０－１２１８Ｈ５ ＶＨアミノ酸配列
EVQLVQSGAVVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGSSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号８１－１２１８Ｈ５ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNTGNNYVSWYQQLSGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL
配列番号８２－１２３０Ｈ７ ＶＨアミノ酸配列
EMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFNSALISYYDMDVWGQGTMVTVSS
配列番号８３－１２３０Ｈ７ ＶＬアミノ酸配列
QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTV
配列番号８４－１０８３Ｈ４ ＶＨアミノ酸配列
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFAYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASADYVWGSYRPDWYFDLWGRGTMVTVSS
配列番号８５－１０８３Ｈ４ ＶＬアミノ酸配列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQRLPGAAPQLLIYNNDQRPSGIPDRFSGSKSGTSGSLVISGLQSEDEADYYCASWDDSLNGRVFGGGTKLTVL
配列番号８６－１２２７Ｈ８ ＶＨアミノ酸配列
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGHTFAYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASADYAWESYQPPQINGVWGRGTMVTVSS
配列番号８７－１２２７Ｈ８ ＶＬアミノ酸配列
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTITCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFFFGTGTKLTVL
配列番号８８－ＮＧＦ－ＮＧ ＨＣＤＲ１
FGAFT
配列番号８９－ＮＧＦ－ＮＧ ＨＣＤＲ２
GIIPIFGLTNLAQNFQG
配列番号９０－ＮＧＦ－ＮＧ ＨＣＤＲ３
SSRIYDLNPSLTAYYDMDV
配列番号９１－ＮＧＦ－ＮＧ ＬＣＤＲ１
SGSSSDIGNNYVS
配列番号９２－ＮＧＦ－ＮＧ ＬＣＤＲ２
DNNKRPS
配列番号９３－ＮＧＦ－ＮＧ ＬＣＤＲ３
GTWDSSLSAWV
配列番号９４－Ｇ→Ｃを有するＭＥＤＩ－５７８ ＶＨアミノ酸配列
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS TYGISWVRQA PGQCLEWMGG IIPIFDTGNS
AQSFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSS RIYDLNPSLT AYYDMDVWGQ
GTMVTVSS
配列番号９５－Ｇ→Ｃを有するＭＥＤＩ－５７８ ＶＬアミノ酸配列
QSVLTQPPSV SAAPGQKVTI SCSGSSSNIG NNYVSWYQQL PGTAPKLLIY DNNKRPSGIP
DRFSGSKSGT SATLGITGLQ TGDEADYYCG TWDSSLSAWV FGCGTKLTVL
配列番号９６－１２３０Ｄ８ ＶＨアミノ酸配列
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFPYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCASADYVWESYHPATSLSLWGRGTMVTVSS
配列番号９７－１２３０Ｄ８ ＶＬアミノ酸配列
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCPGSTSNIGNNYVSWYQQRPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISELQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVL
配列番号９８
GGGGSGGGGS
配列番号９９－ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ－コドン最適化ヌクレオチド配列
1 CTGCCCGCCC AGGTGGCCTT TACCCCTTAT GCTCCTGAGC CCGGCTCTAC CTGCCGGCTG
61 AGAGAGTACT ACGACCAGAC CGCCCAGATG TGCTGCTCCA AGTGCTCTCC TGGCCAGCAC
121 GCCAAGGTGT TCTGCACCAA GACCTCCGAT ACCGTGTGCG ACTCCTGCGA GGACTCCACC
181 TACACCCAGC TGTGGAACTG GGTGCCCGAG TGCCTGTCCT GCGGCTCCAG ATGTTCCTCC
241 GACCAGGTGG AAACCCAGGC CTGCACCAGA GAGCAGAACC GGATCTGCAC CTGTCGGCCT
301 GGCTGGTACT GCGCCCTGTC TAAGCAGGAA GGCTGCAGAC TGTGCGCCCC TCTGCGGAAG
361 TGTAGACCTG GCTTTGGCGT GGCCAGACCC GGCACCGAGA CATCTGATGT CGTGTGCAAG
421 CCTTGCGCCC CTGGCACCTT CTCCAACACC ACCTCCTCCA CCGACATCTG CCGGCCTCAC
481 CAGATCTGCA ACGTGGTGGC CATCCCTGGC AACGCCTCTA TGGACGCCGT GTGCACCTCT
541 ACCTCCCCCA CCAGAAGTAT GGCCCCTGGC GCTGTGCATC TGCCCCAGCC TGTGTCTACC
601 AGATCCCAGC ACACCCAGCC CACCCCTGAG CCTTCTACCG CCCCTTCTAC CAGCTTCCTG
661 CTGCCTATGG GCCCTAGCCC TCCTGCTGAG GGATCTACAG GCGACGAGCC CAAGTCCTGC
721 GACAAGACCC ACACCTGTCC CCCTTGTCCT GCCCCTGAAC TGCTGGGCGG ACCTTCCGTG
781 TTCCTGTTCC CCCCAAAGCC CAAGGACACC CTGATGATCA GCCGGACCCC TGAAGTGACC
841 TGCGTGGTGG TGGATGTGTC CCACGAGGAT CCCGAAGTGA AGTTCAATTG GTACGTGGAC
901 GGCGTGGAAG TGCACAACGC CAAGACCAAG CCCAGAGAGG AACAGTACAA CTCCACCTAC
961 CGGGTGGTGT CCGTGCTGAC CGTGCTGCAC CAGGATTGGC TGAACGGCAA AGAGTACAAG
1021 TGCAAGGTGT CCAACAAGGC CCTGCCTGCC CCCATCGAAA AGACCATCTC CAAGGCCAAG
1081 GGCCAGCCCC GGGAACCCCA GGTGTACACA CTGCCCCCTA GCCGGGAAGA GATGACCAAG
1141 AACCAGGTGT CCCTGACCTG TCTCGTGAAG GGCTTCTACC CCTCCGATAT CGCCGTGGAA
1201 TGGGAGTCCA ACGGCCAGCC TGAGAACAAC TACAAGACCA CCCCCCCTGT GCTGGACTCC
1261 GACGGCTCAT TCTTCCTGTA CTCCAAGCTG ACAGTGGACA AGTCCCGGTG GCAGCAGGGC
1321 AACGTGTTCT CCTGCTCCGT GATGCACGAG GCCCTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGTCC
1381 CTGTCCCTGA GCCCTGGAAA AGGCGGCGGA GGATCTGGCG GAGGCGGATC TCAGGTGCAG
1441 CTGGTGCAGT CTGGCGCTGA AGTGAAGAAA CCCGGCTCCT CCGTGAAGGT GTCCTGCAAG
1501 GCTTCTGGCG GCACCTTCTC TACCTACGGC ATCTCCTGGG TGCGACAGGC CCCTGGCCAG
1561 TGCCTGGAAT GGATGGGCGG CATCATCCCC ATCTTCGACA CCGGCAACTC CGCCCAGAGC
1621 TTCCAGGGCA GAGTGACCAT CACCGCCGAC GAGTCTACCT CCACCGCCTA CATGGAACTG
1681 TCCTCCCTGC GGAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCCGGTCCTC TCGGATCTAC
1741 GACCTGAACC CTTCCCTGAC CGCCTACTAC GACATGGACG TGTGGGGCCA GGGCACAATG
1801 GTCACCGTGT CATCTGGTGG TGGCGGCTCT GGTGGCGGAG GAAGTGGGGG AGGGGGTTCT
1861 GGGGGGGGAG GATCTCAGTC TGTGCTGACC CAGCCTCCTT CCGTGTCTGC TGCCCCAGGC
1921 CAGAAAGTGA CAATCTCCTG CAGCGGCTCC AGCTCCAACA TCGGCAACAA CTACGTGTCC
1981 TGGTATCAGC AGCTGCCCGG CACCGCTCCC AAACTGCTGA TCTACGATAA CAACAAGCGG
2041 CCCTCCGGCA TCCCCGACAG ATTCTCCGGC TCTAAGTCCG GCACCTCTGC CACCCTGGGC
2101 ATCACCGGAC TGCAGACAGG CGACGAGGCC GACTACTACT GTGGCACCTG GGACTCCTCC
2161 CTGTCCGCTT GGGTGTTCGG CTGCGGCACC AAACTGACTG TGCTG

【0216】

本開示は、本開示の個々の態様を単一に説明しようとする、記載する特定の態様によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内にある。実際、本明細書に記載し、示すものに加えて、本開示の様々な修飾が、当業者には、前述の記載および添付の図面から明らかになろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとされる。

【0217】

本明細書において言及する刊行物および特許出願は全て、個々の刊行物または特許出願の各々を参照によって組み入れることを具体的に、かつ個々に指定した場合と同程度に参照によって本明細書に組み入れる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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