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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-16
(45)【発行日】2022-05-24
(54)【発明の名称】神経筋接合部関連疾患の処置方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/433 20060101AFI20220517BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20220517BHJP
【ＦＩ】
A61K31/433
A61P21/04
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2020125311
(22)【出願日】2020-07-22
(62)【分割の表示】P 2017522734の分割
【原出願日】2015-07-16
(65)【公開番号】P2020183431
(43)【公開日】2020-11-12
【審査請求日】2020-08-19
(31)【優先権主張番号】14306159.6
(32)【優先日】2014-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】14307063.9
(32)【優先日】2014-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591049848
【氏名又は名称】アンセルム
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ
(73)【特許権者】
【識別番号】592236245
【氏名又は名称】サントル・ナシオナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(73)【特許権者】
【識別番号】517016473
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・デカルト
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｐａｒｉｓ Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ
(73)【特許権者】
【識別番号】511236062
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ デ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ロール・ストロクリック
(72)【発明者】
【氏名】ジュリアン・メッセアン
(72)【発明者】
【氏名】ペリーヌ・ドゥレ
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドル・ドベルタン
(72)【発明者】
【氏名】クレール・ルゲ
【審査官】菊池 美香
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１５１３５９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／４３３
Ａ６１Ｐ ２１／０４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害剤の少なくとも１つを含む、対象体における神経筋接合部関連疾患を処置するための医薬であって、該疾患が、重症筋無力症または先天性筋無力症候群であり、ＧＳＫ３の阻害剤がチデグルシブ（tideglusib）である、医薬。
【請求項2】
疾患が重症筋無力症である、請求項１記載の医薬。
【請求項3】
疾患が先天性筋無力症候群である、請求項１記載の医薬。
【請求項4】
対象体がヒトである、請求項１～３いずれか１項記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経筋接合部関連疾患の処置方法に関する。
【背景技術】
【0002】
神経筋接合部（ＮＭＪ）は、運動ニューロンと骨格筋線維との間にあるコリン作動性シナプスである。この化学的シナプスの形成は、前シナプス運動軸索（presynaptic motor axon）と後シナプス筋線維（postsynaptic muscle fiber）との間の経シナプスダイアログ（trans-synaptic dialogue）の確立に基づく（非特許文献１）。
【0003】
神経筋伝達異常は多数の疾患を引き起こす。遺伝子の変異、ならびにＮＭＪ形成および維持にとって重大な意味を持つタンパク質に対して作られる自己抗体の変異は、主にさまざまな程度の骨格筋脱力および過度の易疲労性（excessive fatigability）によって特徴付けられる不均質な障害である筋無力症候群（ＭＳ）の原因となる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。筋特異的チロシンキナーゼ受容体ＭｕＳＫ、および低密度リポタンパク質受容体のメンバーであるその補助受容体（co-receptor）ＬＲＰ４は、ＮＭＪ形成および維持の全ての工程を調節する中心的なハブを構成する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。そうであるから、ＭｕＳＫは自己免疫障害である重症筋無力症（ＭＧ）における抗体に対する標的であり、そのキナーゼおよび細胞外ドメインの両方におけるいくつかの変異がヒトにおけるＭＵＳＫ関連先天性ＭＳ（ＣＭＳ）の原因である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ＭｕＳＫは、その細胞外領域に、Ｗｎｔ分子と相互作用することが知られているＦｒｉｚｚｌｅｄ様ドメイン（システインリッチドメイン、ＣＲＤ）を含有する（非特許文献５；非特許文献１５；非特許文献１６）。この研究について特に興味深いことは、最近、ＭｕＳＫ ＣＲＤがＩｇ１／２自己抗体と一緒に、抗ＡＣｈＲ（アセチルコリン受容体）陰性ＭＧ患者において同定されたことであり、ＣＲＤの大部分の欠失をもたらすＭｕＳＫ外部ドメインにおけるホモ接合型欠失に関連する重篤なＣＭＳのケースが同定された（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。
【0004】
ＮＭＪ形成は、ＬＲＰ４と結合した後にシスにおいてＭｕＳＫを活性化する神経分泌型アグリンに依存する。アグリン誘発性ＭｕＳＫ活性化は、ＡＣｈＲのクラスター形成および再構築をもたらす複数のシグナル伝達経路を刺激する（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。ＮＭＪ形成の初期段階の期間中、神経支配前に、ＡＣｈＲクラスターが筋肉の広範の中心的な予定領域内に凝集する（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。筋肉標的がシナプス接合を受ける準備をする、筋肉プレパターン化と称されるこの工程は、ＭｕＳＫ／Ｌｒｐ４複合体の活性化に基づいている（非特許文献２６；非特許文献７）。しかしながら、ＡＣｈＲプレパターン化を調節するシグナル伝達メカニズムは、依然として大部分が不明のままである。ＮＭＪ形成におけるＷｎｔシグナル伝達の役割を示す証拠は増えている（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９）。Ｗｎｔは、シナプス形成および軸索ガイダンスを包含する多数の発生経路に関与する分泌型糖タンパク質の一ファミリーである（非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３）。Ｗｎｔタンパク質は、また、骨格筋発生および再生の間に必須の役割を果たす（非特許文献３４）。ＮＭＪにおいて、Ｗｎｔ４およびＷｎｔ１１は、筋肉プレパターン化および軸索ガイダンスのために必要である（非特許文献２６；非特許文献３５；非特許文献３６）。加えて、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ９ａおよびＷｎｔ１１は、そのＣＲＤを介してＭｕＳＫを結合することができる（非特許文献３６；非特許文献３７）。まとめると、これらのデータは、ＭｕＳＫ ＣＲＤの機能障害が患者における筋無力症候群の発症に関連し得ることを示唆しているが、しかしながら、Ｗｎｔ誘発ＮＭＪ形成および維持におけるＭｕＳＫ ＣＲＤの役割の根底にある生理病理学的メカニズムはまだ研究されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Sanes, J.R., and Lichtman, J.W. (2001). Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2, 791-805
【文献】Berrih-Aknin, S., Frenkian-Cuvelier, M., and Eymard, B. (2014). Diagnostic and clinical classification of autoimmune myasthenia gravis. J. Autoimmun. 48-49, 143-148
【文献】Eymard, B., Hantai, D., and Estournet, B. (2013). Congenital myasthenic syndromes. Handb. Clin. Neurol. 113, 1469-1480
【文献】Hantai, D., Nicole, S., and Eymard, B. (2013). Congenital myasthenic syndromes: an update. Curr. Opin. Neurol. 26, 561-568
【文献】DeChiara, T.M., Bowen, D.C., Valenzuela, D.M., Simmons, M.V., Poueymirou, W.T., Thomas, S., Kinetz, E., Compton, D.L., Rojas, E., Park, J.S., et al. (1996). The receptor tyrosine kinase MuSK is required for neuromuscular junction formation in vivo. Cell 85, 501-512
【文献】Hesser, B.A., Henschel, O., and Witzemann, V. (2006). Synapse disassembly and formation of new synapses in postnatal muscle upon conditional inactivation of MuSK. Mol. Cell. Neurosci. 31, 470-480
【文献】Kim, N., and Burden, S.J. (2008). MuSK controls where motor axons grow and form synapses. Nat. Neurosci. 11, 19-27
【文献】Valenzuela, D.M., Stitt, T.N., DiStefano, P.S., Rojas, E., Mattsson, K., Compton, D.L., Nunez, L., Park, J.S., Stark, J.L., and Gies, D.R. (1995). Receptor tyrosine kinase specific for the skeletal muscle lineage: expression in embryonic muscle, at the neuromuscular junction, and after injury. Neuron 15, 573-584
【文献】Weatherbee, S.D., Anderson, K.V., and Niswander, L.A. (2006). LDL-receptor-related protein 4 is crucial for formation of the neuromuscular junction. Dev. Camb. Engl. 133, 4993-5000
【文献】Ben Ammar, A., Soltanzadeh, P., Bauche, S., Richard, P., Goillot, E., Herbst, R., Gaudon, K., Huze, C., Schaeffer, L., Yamanashi, Y., et al. (2013). A mutation causes MuSK reduced sensitivity to agrin and congenital myasthenia. PloS One 8, e53826
【文献】Chevessier, F., Faraut, B., Ravel-Chapuis, A., Richard, P., Gaudon, K., Bauche, S., Prioleau, C., Herbst, R., Goillot, E., Ioos, C., et al. (2004). MUSK, a new target for mutations causing congenital myasthenic syndrome. Hum. Mol. Genet. 13, 3229-3240
【文献】Maselli, R.A., Arredondo, J., Cagney, O., Ng, J.J., Anderson, J.A., Williams, C., Gerke, B.J., Soliven, B., and Wollmann, R.L. (2010). Mutations in MUSK causing congenital myasthenic syndrome impair MuSK-Dok-7 interaction. Hum. Mol. Genet. 19, 2370-2379
【文献】Mihaylova, V., Salih, M.A.M., Mukhtar, M.M., Abuzeid, H.A., El-Sadig, S.M., von der Hagen, M., Huebner, A., Nuernberg, G., Abicht, A., Mueller, J.S., et al. (2009). Refinement of the clinical phenotype in musk-related congenital myasthenic syndromes. Neurology 73, 1926-1928
【文献】Vincent, A., and Leite, M.I. (2005). Neuromuscular junction autoimmune disease: muscle specific kinase antibodies and treatments for myasthenia gravis. Curr. Opin. Neurol. 18, 519-525
【文献】Masiakowski, P., and Yancopoulos, G.D. (1998). The Wnt receptor CRD domain is also found in MuSK and related orphan receptor tyrosine kinases. Curr. Biol. CB 8, R407
【文献】Stiegler, A.L., Burden, S.J., and Hubbard, S.R. (2009). Crystal structure of the frizzled-like cysteine-rich domain of the receptor tyrosine kinase MuSK. J. Mol. Biol. 393, 1-9
【文献】Takamori, M. (2012). Structure of the neuromuscular junction: function and cooperative mechanisms in the synapse. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1274, 14-23
【文献】Takamori, M., Nakamura, T., and Motomura, M. (2013). Antibodies against Wnt receptor of muscle-specific tyrosine kinase in myasthenia gravis. J. Neuroimmunol. 254, 183-186
【文献】Koenig et al., unpublished data
【文献】Kim, N., Stiegler, A.L., Cameron, T.O., Hallock, P.T., Gomez, A.M., Huang, J.H., Hubbard, S.R., Dustin, M.L., and Burden, S.J. (2008). Lrp4 is a receptor for Agrin and forms a complex with MuSK. Cell 135, 334-342
【文献】Zhang, B., Luo, S., Wang, Q., Suzuki, T., Xiong, W.C., and Mei, L. (2008). LRP4 serves as a coreceptor of agrin. Neuron 60, 285-297
【文献】Zhang, W., Coldefy, A.-S., Hubbard, S.R., and Burden, S.J. (2011). Agrin binds to the N-terminal region of Lrp4 protein and stimulates association between Lrp4 and the first immunoglobulin-like domain in muscle-specific kinase (MuSK). J. Biol. Chem. 286, 40624-40630
【文献】Arber, S., Burden, S.J., and Harris, A.J. (2002). Patterning of skeletal muscle. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 100-103
【文献】Lin, W., Burgess, R.W., Dominguez, B., Pfaff, S.L., Sanes, J.R., and Lee, K.F. (2001). Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse. Nature 410, 1057-1064
【文献】Yang, X., Arber, S., William, C., Li, L., Tanabe, Y., Jessell, T.M., Birchmeier, C., and Burden, S.J. (2001). Patterning of muscle acetylcholine receptor gene expression in the absence of motor innervation. Neuron 30, 399-410
【文献】Jing, L., Lefebvre, J.L., Gordon, L.R., and Granato, M. (2009). Wnt signals organize synaptic prepattern and axon guidance through the zebrafish unplugged/MuSK receptor. Neuron 61, 721-733
【文献】Budnik, V., and Salinas, P.C. (2011). Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 151-159
【文献】Speese, S.D., and Budnik, V. (2007). Wnts: up-and-coming at the synapse. Trends Neurosci. 30, 268-275
【文献】Wu, H., Xiong, W.C., and Mei, L. (2010). To build a synapse: signaling pathways in neuromuscular junction assembly. Dev. Camb. Engl. 137, 1017-1033
【文献】Van Amerongen, R., and Nusse, R. (2009). Towards an integrated view of Wnt signaling in development. Dev. Camb. Engl. 136, 3205-3214
【文献】Dickins, E.M., and Salinas, P.C. (2013). Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front. Cell. Neurosci. 7, 162
【文献】Salinas, P.C. (2012). Wnt signaling in the vertebrate central nervous system: from axon guidance to synaptic function. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4
【文献】Willert, K., and Nusse, R. (2012). Wnt proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007864
【文献】Von Maltzahn, J., Chang, N.C., Bentzinger, C.F., and Rudnicki, M.A. (2012). Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609
【文献】Gordon, L.R., Gribble, K.D., Syrett, C.M., and Granato, M. (2012). Initiation of synapse formation by Wnt-induced MuSK endocytosis. Dev. Camb. Engl. 139, 1023-1033
【文献】Strochlic, L., Falk, J., Goillot, E., Sigoillot, S., Bourgeois, F., Delers, P., Rouviere, J., Swain, A., Castellani, V., Schaeffer, L., et al. (2012). Wnt4 Participates in the Formation of Vertebrate Neuromuscular Junction. PLoS ONE 7, e29976
【文献】Zhang, B., Liang, C., Bates, R., Yin, Y., Xiong, W.-C., and Mei, L. (2012). Wnt proteins regulate acetylcholine receptor clustering in muscle cells. Mol. Brain 5, 7
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、神経筋接合部関連疾患の処置方法に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【0007】
シナプス形成は、前シナプス細胞と後シナプス細胞との間の経シナプスダイアログの確立に依存する。神経筋シナプス（ＮＭＪ）において、この重大な意味を持つダイアログの撹乱（perturbation）は、筋無力症候群のような神経筋障害を引き起こす。筋特異的チロシンキナーゼ受容体ＭｕＳＫは、その細胞外領域に、ＮＭＪ形成の間の筋肉プレパターン化および軸索ガイダンスに必要なＷｎｔ分子と相互作用することが知られているＦｒｉｚｚｌｅｄ様ドメイン（システインリッチドメイン、ＣＲＤ）を含有する。ＭｕＳＫ ＣＲＤの機能不全は、筋無力症候群の発症に関連し得るが、しかしながら、Ｗｎｔ誘発ＮＭＪ形成および維持におけるＭｕＳＫ ＣＲＤ機能は、依然として解明されていない。今般、本発明者らは、マウスにおけるＭｕＳＫのＣＲＤ欠失が、（ｉ）ＡＣｈＲクラスターの数、サイズおよび密度の急激な低下ならびに（ｉｉ）ＡＣｈＲクラスターをバイパスする過剰な運動軸索伸長を包含する、筋肉プレパターン化およびシナプス分化の両方の強い異常を引き起こすことを見出した。ＮＭＪは、形成することができ、変異マウスは生存可能であるが、しだいに、ＮＭＪの破壊（dismantlement）、筋力低下および易疲労感に関連するＣＭＳ臨床症状を発生した。特に興味深いことには、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける塩化リチウム（ＧＳＫ３阻害剤）の薬理学的注射を介するＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の強制的な活性化は、ほとんど完全に、前シナプス欠陥および後シナプス欠陥を救済する。まとめると、これらのデータから、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻害剤が神経筋接合部関連疾患の処置に適していることが明らかになった。
【0008】
したがって、本発明は、神経筋接合部関連疾患の処置を必要とする対象体における神経筋接合部関連疾患の処置方法であって、該患者に、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の少なくとも１つの阻害剤の治療有効量を投与することからなる方法に関する。
【0009】
処置は、神経筋接合部関連疾患に罹患している対象体の治療的処置および神経筋接合部関連疾患に罹患していない対象体（例えば、高リスクで神経筋接合部関連疾患であると同定された対象体）の予防的処置を含む、いかなる目的のためでもあり得る。本明細書で用いる場合、用語「処置」、「処置する」および「処置すること」とは、本明細書に記載される疾患もしくは障害（すなわち、神経筋接合部関連疾患）の進行を食い止めること、軽減すること、もしくは妨げること、または取られた手段の不在下で生じることと比べて本明細書に記載される疾患もしくは障害の発生（incidence）もしくは発症（onset）を遅延させること、なくすこと、もしくは減少させることをいう。本明細書で用いる場合、用語「予防」または「予防的使用」および「予防的処置」とは、本明細書に記載の疾患（すなわち、神経筋接合部関連疾患）を予防することを目的とするいずれもの医療的または公衆衛生的手段（medical and public health procedure）をいう。本明細書で用いる場合、用語「予防する」、「予防」および「予防すること」とは、所定の状態（すなわち、神経筋接合部関連疾患）を獲得するかまたは発症するリスクの軽減、または病気ではないが該状態（すなわち、神経筋接合部関連疾患）の患者であったかもしくはほぼ該患者である対象体における該状態（すなわち、神経筋接合部関連疾患）の再発の軽減もしくは阻止をいう。
【0010】
本発明の方法は、特に、広範囲に及ぶ神経筋接合部関連疾患の処置に適している。本明細書で用いる場合、「神経筋接合部関連疾患」とは、神経筋接合部での損傷および／または神経筋接合部に対する損傷により生じる疾患をいう。神経筋接合部関連疾患または状態は、例えば、重症筋無力症、実験的後天性重症筋無力症症候群、ランバート・イートン症候群、ミラー・フィッシャー症候群、先天性筋無力症候群、ボツリヌス中毒、有機リン中毒、および神経筋接合部に支障を来す他の毒素であり得るが、多発性硬化症、ポンペ病、およびバース症候群でもあり得る。
【0011】
本明細書で用いる場合、用語「ＧＳＫ３」とは、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３をいう。ＧＳＫ３は、活性がＡｋｔリン酸化によって阻害されるタンパク質セリンスレオニンキナーゼである。ＧＳＫ３は、グリコーゲン合成酵素、いくつかの転写因子、および翻訳開始因子を包含するさまざまな基質をリン酸化する。ＧＳＫ３は、代謝、細胞生存、増殖、および分化を包含する複数の細胞プロセスに関与している。本明細書で用いる場合、用語「ＧＳＫ３阻害剤」とは、ＧＳＫ３の活性または発現を阻害することができるいかなる化合物もいう。該用語は、現在知られているＧＳＫ３阻害剤、および／または、後に発見または創作され得るＧＳＫ３阻害剤を包含し、本明細書に記載の対象とともに用いることができる。
【0012】
いくつかのＧＳＫ３阻害剤が同定されており、当該技術分野で周知である：
－ Arfeen M, Bharatam PV. Design of glycogen synthase kinase-3 inhibitors: an overview on recent advancements. Curr Pharm Des. 2013;19(26):4755-75. Review.
－ Osolodkin DI, Palyulin VA, Zefirov NS. Glycogen synthase kinase 3 as an anticancer drug target: novel experimental findings and trends in the design of inhibitors. Curr Pharm Des. 2013;19(4):665-79. Review.
－ Garcia I, Fall Y, Gomez G. QSAR, docking, and CoMFA studies of GSK3 inhibitors. Curr Pharm Des. 2010;16(24):2666-75. Review.
－ Eldar-Finkelman H, Licht-Murava A, Pietrokovski S, Eisenstein M. Substrate competitive GSK-3 inhibitors - strategy and implications. Biochim Biophys Acta. 2010 Mar;1804(3):598-603.
－ Takahashi-Yanaga F, Sasaguri T. Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta(GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway: inhibitors of the Wnt/beta-catenin signaling pathway as novel anticancer drugs. J Pharmacol Sci. 2009 Feb;109(2):179-83.
－ －Duchowicz PR, Castro EA. QSAR studies for the pharmacological inhibition of glycogen synthase kinase. Med Chem. 2007 Jul;3(4):393-417. Review.
－ Arfeen M, Bharatam PV. Design of glycogen synthase kinase-3 inhibitors: an overview on recent advancements. Curr Pharm Des. 2013;19(26):4755-75. Review.
－ Osolodkin DI, Palyulin VA, Zefirov NS. Glycogen synthase kinase 3 as an anticancer drug target: novel experimental findings and trends in the design of inhibitors. Curr Pharm Des. 2013;19(4):665-79. Review.
－ Garcia I, Fall Y, Gomez G. QSAR, docking, and CoMFA studies of GSK3 inhibitors. Curr Pharm Des. 2010;16(24):2666-75. Review.
－ Eldar-Finkelman H, Licht-Murava A, Pietrokovski S, Eisenstein M. Substrate competitive GSK-3 inhibitors - strategy and implications. Biochim Biophys Acta. 2010 Mar;1804(3):598-603.
－ Takahashi-Yanaga F, Sasaguri T. Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta(GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway: inhibitors of the Wnt/beta-catenin signaling pathway as novel anticancer drugs. J Pharmacol Sci. 2009 Feb;109(2):179-83.
－ －Duchowicz PR, Castro EA. QSAR studies for the pharmacological inhibition of glycogen synthase kinase. Med Chem. 2007 Jul;3(4):393-417. Review.
【0013】
ＧＳＫ３阻害剤の例としては、リチウム、特に塩化リチウム、ＡＲ－Ａ０１４４１８、４－アシルアミノ－６－アリールフロ[２,３－ｄ]ピリミジン、リチウム、ＳＢ－４１５２８６、Ｐ２４、ＣＴ９８０１４、ＣＨＩＲ９８０２３、ＡＲＡ０１４４１８、ＡＴ７５１９、ＤＭ２０４、Ｅｖｏｃａｐｉｌ、ＬＹ２０９０３１４、Ｎｅｕ１２０、ＮＰ０１１３９、ＮＰ０３、ＮＰ０６０１０３、ＮＰ０７、ＮＰ１０３、ＳＡＲ５０２２５０、ＶＸ６０８およびチデグルシブ（tideglusib）が挙げられる。
【0014】
ＧＳＫ３阻害剤の他の例としては、欧州特許出願公開第２４３３６３６号、国際公開第２００７０３１８７８号、国際公開第２００７０１６５３９号、国際公開第２００９００７４５７号および国際公開第２００５０５１３９２号、米国特許第７５９５３１９号、米国特許出願公開第２００９００４１８６３号、米国特許出願公開第２００９０２３３９９３号、欧州特許出願公開第１７３９０８７号、国際公開第２００１０７０７２９号、国際公開第０３／００４４７２号、国際公開第０３／０５５４９２号、国際公開第０３／０８２８５３号、国際公開第０６／００１７５４号、国際公開第０７／０４０４３６号、国際公開第０７／０４０４３８号、国際公開第０７／０４０４３９号、国際公開第０７／０４０４４０号、国際公開第０８／００２２４４号および国際公開第０８／９９２２４５号、国際公開第００／２１９２７号、欧州特許出願公開第４７０４９０号、国際公開第９３／１８７６６号、国際公開第９３／１８７６５号、欧州特許出願公開第３９７０６０号、国際公開第９８／１１１０３号、国際公開第９８／１１１０２号、国際公開第９８／０４５５２号、国際公開第９８／０４５５１号、独国特許出願公開第４２４３３２１号、独国特許出願公開第４００５９７０号、独国特許出願公開第３９１４７６４号、国際公開第９６／０４９０６号、国際公開第９５／０７９１０号、独国特許出願公開第４２１７９６４号、米国特許第５,８５６,５１７号、米国特許第５,８９１,９０１号、国際公開第９９／４２１００号、欧州特許出願公開第３２８０２６号、欧州特許出願公開第３８４３４９号、欧州特許出願公開第５４０９５６号、独国特許出願公開第４００５９６９号および欧州特許出願公開第５０８７９２号に記載のもの（出典明示により本明細書の一部を構成する）が挙げられる。
【0015】
特定のＧＳＫ３阻害剤は、３－[７－(２－モルホリン－４－イルエトキシ)キナゾリン－４－イル]－２－オキソ－１,３－ジヒドロインドール－５－カルボニトリル；３－[７－(２－メトキシエトキシ)キナゾリン－４－イル]－２－オキソ－１,３－ジヒドロインドール－５－カルボニトリル；３－[７－[２－(２－メトキシエトキシ)エトキシ]キナゾリン－４－イル]－２－オキソ－１,３－ジヒドロインドール－５－カルボニトリル；３－[７－(３－モルホリン－４－イルプロポキシ)キナゾリン－４－イル]－２－オキソ－１,３－ジヒドロインドール－５－カルボニトリル；２－ヒドロキシ－３－[５－(４－メチルピペラジン－１－カルボニル)ピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；１－[(４－メトキシフェニル)メチル]－３－(５－ニトロ－１,３－チアゾール－２－イル)尿素；２－ヒドロキシ－３－[５－[(４－フェニルピペラジン－１－イル)メチル]ピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；２－ヒドロキシ－３－[５－(モルホリン－４－イルメチル)ピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；２－ヒドロキシ－３－[５－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；２－ヒドロキシ－３－[５－[(４－メチルピペラジン－１－イル)メチル]ピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；３－[５－(モルホリン－４－イルメチル)ピリジン－２－イル]－５－ニトロ－１Ｈ－インドール－２－オール；２－ヒドロキシ－３－[５－(ピロリジン－１－イルメチル)ピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；[６－(２－ヒドロキシ－５－ニトロ－１Ｈ－インドール－３－イル)ピリジン－３－イル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；２－ヒドロキシ－３－[５－(１－ピペリジルメチル)ピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－５－カルボニトリル；２－ヒドロキシ－３－[５－(モルホリン－４－イルメチル)ピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル；２－ヒドロキシ－３－[５－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルピリジン－２－イル]－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル；３－フルオロ－３－[５－(モルホリン－４－イルメチル)ピリジン－２－イル]－２－オキソ－１Ｈ－インドール－６－カルボニトリル；[４－[５－(４－メトキシフェニル)－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－８－イル]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；３－(４－メトキシフェニル)－Ｎ－(２－モルホリン－４－イルエチル)－５,７－ジアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,８－テトラエン－９－カルボキサミド；３－(４－クロロフェニル)－Ｎ－(２－モルホリン－４－イルエチル)－５,７－ジアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,８－テトラエン－９－カルボキサミド；５－フルオロ－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]－４－(２－メチル－３－プロパン－２－イル－イミダゾール－４－イル)ピリミジン－２－アミン；[４－[[５－フルオロ－４－(２－メチル－３－プロパン－２－イル－イミダゾール－４－イル)ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；[４－[[５－フルオロ－４－(２－メチル－３－プロパン－２－イル－イミダゾール－４－イル)ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－フェニル－メタノン；Ｎ－(３－メトキシプロピル)－８－[４－(トリフルオロメチル)フェニル]－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－カルボキサミド；５－(４－メトキシフェニル)－８－[４－(１－ピペリジルメチル)フェニル]－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン；Ｎ－(３－メトキシプロピル)－８－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－カルボキサミド；[４－[[５－フルオロ－４－(２－メチル－３－プロパン－２－イル－イミダゾール－４－イル)ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－ピリジン－２－イル－メタノン；[４－[[４－(３－シクロヘキシル－２－メチル－イミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]ピリミジン－２－アミン；４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－Ｎ－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；[４－[５－(４－クロロフェニル)－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－８－イル]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；Ｎ－(３－メトキシプロピル)－８－[３－(２,２,３,３－テトラフルオロプロポキシメチル)フェニル]－２,７,９－２０トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－カルボキサミド；[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－ピリジン－２－イル－メタノン；[４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－ピリジン－２－イル－メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；[４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－Ｎ－[４－[(４－メチルピペラジン－１－３０ イル)メチル]フェニル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(４－メチルスルホニルフェニル)ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(６－メチルピリジン－３－イル)ピリミジン－２－アミン；[４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]－２－(トリフルオロメトキシ)フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－フルオロ－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]－４－[３－(オキサン－４－イル)－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；アゼチジン－１－イル－[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]メタノン；５－フルオロ－Ｎ－[３－メチル－４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－Ｎ－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]－４－[３－(オキサン－４－イル)－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]－４－[３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；[４－[[５－フルオロ－４－[３－(オキサン－４－イル)－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－[５－フルオロ－２－[[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]アミノ]ピリミジン－４－イル]－１－(オキサン－４－イル)イミダゾール－２－カルボニトリル；５－フルオロ－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；[４－[[５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；Ｎ－(２－シアノエチル)－３－[５－(４－メトキシフェニル)－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－８－イル]ベンズアミド；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－メチルスルホニル－３－(トリフルオロメチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；アゼチジン－１－イル－[４－[８－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－イル]フェニル]メタノン；８－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]－Ｎ－ピリジン－３－イル－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－カルボキサミド；２－[３－[８－[４－(４－メチルピペラジン－１－カルボニル)フェニル]－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－イル]フェノキシ]アセトニトリル；５－フルオロ－Ｎ－(４－メチルスルフブニルフェニル)－４－[３－プロパン－２－イル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]－４－[３－プロパン－２－イル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；
[４－[[５－フルオロ－４－[３－プロパン－２－イル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(４－メチルスルホニルフェニル)ピリミジン－２－アミン；４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]ピリミジン－２－アミン；[４－[[４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；５－(４－メトキシフェニル)－８－(３－メチルスルホニルフェニル)－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン；[４－[５－(３－フルオロ－４－メトキシ－フェニル)－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－８－イル]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(６－メチルスルホニルピリジン－３－イル)ピリミジン－２－アミン;（２,６－ジメチルモルホリン－４－イル)－[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]メタノン；[５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(１－モルホリン－４－イルエチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－Ｎ－(４－メチルスルフブニルフェニル)－４－[３－(オキサン－４－イル)－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；アゼチジン－１－イル－[２－クロロ－４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]－２－メチル－フェニル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[５－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]－２－(トリフルオロメトキシ)フェニル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[３－クロロ－５－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[６－(モルホリン－４－イルメチル)ピリジン－３－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(６－プロパン－２－イルスルホニルピリジン－３－イル)ピリミジン－２－アミン；アゼチジン－１－イル－[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；Ｎ－(６－エチルスルホニルピリジン－３－イル)－５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－(オキサン－４－イル)－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－Ｎ－メチル－Ｎ－プロパン－２－イル－ピリジン－２－カルボキサミド；Ｎ－エチル－５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－Ｎ－メチル－ピリジン－２－カルボキサミド；３－[４－[８－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－カルボニル]ピペラジン－１－イル]プロパンニトリル；[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(１－ピペリジル)メタノン；アゼチジン－１－イル－[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[６－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルピリジン－３－イル]ピリミジン－２－アミン；Ｎ－[６－[(４,４－ジフルオロ－１－ピペリジル)メチル]ピリジン－３－イル]－５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(オキサン－４－イル)ピリミジン－２－アミン；１－[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－１－ピペリジル]エタノン；[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－１－ピペリジル]－フェニル－メタノン；１－[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－１－ピペリジル]－２－フェニル－エタノン；４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピペリジン－１－カルボン酸ベンジル；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(１－メチルスルホニル－４－ピペリジル)ピリミジン－２－アミン；Ｎ－[１－(ベンゼンスルホニル)－４－ピペリジル]－５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－Ｎ,Ｎ－ジメチル－ピリジン－２－スルホンアミドからなる群から選択される化合物；それらの異性体、代謝物、プロドラッグもしくは薬学的に許容される塩、または溶媒和物、またはそれらの薬学的に許容される塩の溶媒和物である。
[４－[[５－フルオロ－４－[３－プロパン－２－イル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(４－メチルスルホニルフェニル)ピリミジン－２－アミン；４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルフェニル]ピリミジン－２－アミン；[４－[[４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；５－(４－メトキシフェニル)－８－(３－メチルスルホニルフェニル)－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン；[４－[５－(３－フルオロ－４－メトキシ－フェニル)－２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－８－イル]フェニル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(６－メチルスルホニルピリジン－３－イル)ピリミジン－２－アミン;（２,６－ジメチルモルホリン－４－イル)－[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]メタノン；[５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[４－(１－モルホリン－４－イルエチル)フェニル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－Ｎ－(４－メチルスルフブニルフェニル)－４－[３－(オキサン－４－イル)－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；アゼチジン－１－イル－[２－クロロ－４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]フェニル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]－２－メチル－フェニル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[５－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[４－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]－２－(トリフルオロメトキシ)フェニル]メタノン；アゼチジン－１－イル－[３－クロロ－５－[[４－(２,３－ジメチルイミダゾール－４－イル)－５－フルオロ－ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[６－(モルホリン－４－イルメチル)ピリジン－３－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(６－プロパン－２－イルスルホニルピリジン－３－イル)ピリミジン－２－アミン；アゼチジン－１－イル－[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；Ｎ－(６－エチルスルホニルピリジン－３－イル)－５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－(オキサン－４－イル)－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－Ｎ－メチル－Ｎ－プロパン－２－イル－ピリジン－２－カルボキサミド；Ｎ－エチル－５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－Ｎ－メチル－ピリジン－２－カルボキサミド；３－[４－[８－[４－(モルホリン－４－イルメチル)フェニル]２,７,９－トリアザビシクロ[４.３.０]ノナ－１,３,５,７－テトラエン－５－カルボニル]ピペラジン－１－イル]プロパンニトリル；[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(４－メチルピペラジン－１－イル)メタノン；[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]－(１－ピペリジル)メタノン；アゼチジン－１－イル－[３－クロロ－５－[[５－フルオロ－４－[３－メチル－２－(トリフルオロメチル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピリジン－２－イル]メタノン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－[６－(４－メチルピペラジン－１－イル)スルホニルピリジン－３－イル]ピリミジン－２－アミン；Ｎ－[６－[(４,４－ジフルオロ－１－ピペリジル)メチル]ピリジン－３－イル]－５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(オキサン－４－イル)ピリミジン－２－アミン；１－[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－１－ピペリジル]エタノン；[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－１－ピペリジル]－フェニル－メタノン；１－[４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－１－ピペリジル]－２－フェニル－エタノン；４－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]ピペリジン－１－カルボン酸ベンジル；５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]－Ｎ－(１－メチルスルホニル－４－ピペリジル)ピリミジン－２－アミン；Ｎ－[１－(ベンゼンスルホニル)－４－ピペリジル]－５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－アミン；５－[[５－フルオロ－４－[２－メチル－３－(オキサン－４－イル)イミダゾール－４－イル]ピリミジン－２－イル]アミノ]－Ｎ,Ｎ－ジメチル－ピリジン－２－スルホンアミドからなる群から選択される化合物；それらの異性体、代謝物、プロドラッグもしくは薬学的に許容される塩、または溶媒和物、またはそれらの薬学的に許容される塩の溶媒和物である。
【0016】
「発現阻害剤」とは、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然または合成化合物をいう。
【0017】
いくつかの実施態様において、該遺伝子発現阻害剤はｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。
【0018】
本発明で用いるための遺伝子発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとし得る。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を包含するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに結合することによって標的ｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用し、その結果、タンパク質翻訳を防止するかまたはｍＲＮＡ分解を増加させ、これにより、細胞内の標的タンパク質（すなわち、ＧＳＫ３）のレベルを低下させてその活性を低下させる。例えば、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写配列の特有の領域に対して相補的な、少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば慣用のホスホジエステル技術によって、合成することができ、例えば静脈注射または点滴静注によって、投与することができる。配列が知られている遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を用いる方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６,５６６,１３５号、第６,５６６,１３１号、第６,３６５,３５４号、第６,４１０,３２３号、第６,１０７,０９１号、第６,０４６,３２１号および第５,９８１,７３２を参照）。
【0019】
低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において用いるための遺伝子発現阻害剤として機能することができる。遺伝子発現は、腫瘍、対象体または細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、または低分子二本鎖ＲＮＡの生産をもたらすベクターもしくは構築物と接触させることによって減少し、その結果、遺伝子発現が特異的に阻害される（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。適当なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡコード化ベクターを選択する方法は、当該技術分野において、配列が知られている遺伝子について周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999)；Elbashir, S. M. et al. (2001)；Hannon, GJ. (2002)；McManus, MT. et al. (2002)；Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６,５７３,０９９号および第６,５０６,５５９号；ならびに国際公開第０１／３６６４６号、第９９／３２６１９号および第０１／６８８３６号を参照）。
【0020】
リボザイムもまた、本発明において用いるための遺伝子発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒する能力を有する酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、リボザイム分子と相補的標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレアーゼ的開裂（endonucleolytic cleavage）を包含する。したがって、標的ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的開裂を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子工学的に創られたヘアピンまたはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。いずれの潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位も、まず、典型的には配列ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位について標的分子をスキャニングすることによって同定される。同定した後、開裂部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する約１５～２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものにし得る二次構造のような予測される構造的特徴について評価することができる。候補標的の適合性もまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、それらの相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの到達性を試験することで評価できる。
【0021】
遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムのどちらも公知の方法によって調製され得る。これらとしては、例えば固相ホスホラミダイト化学合成法によるような化学合成技術が挙げられる。別法として、アンチセンスＲＮＡ分子を、該ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボ転写によって生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様なベクターに組み込まれ得る。細胞内安定性および半減期を高める手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対するさまざまな修飾を導入することができる。可能な修飾としては、分子の５'および／または３'末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴヌクレオチド骨格内でのホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエートもしくは２'－Ｏ－メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0022】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、単独で、またはベクターと関連して、インビボで送達され得る。最も広い意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸の細胞への輸送を促進する能力を有するビヒクルである。好ましくは、該ベクターは、ベクターの不在下で引き起こされる分解の程度と比べて少ない分解で核酸を細胞へ輸送する。一般に、本発明において有用なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルスまたは細菌源から誘導された他のビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、好ましいタイプのベクターであり、下記のウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにレトロウイルスのようなＲＮＡウイルス。命名されていないが当該技術分野で公知の他のベクターを容易に用いることができる。
【0023】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が、関心のある遺伝子に置き換えられている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとしている。非細胞変性ウイルスとしては、ライフサイクルがゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写およびそれに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組み込みを含むレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられる。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療試験のために認可されている。複製が欠損している（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示する能力を有するが、感染性粒子を産生する能力がない）レトロウイルスが最も有用である。このような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、一般的に、インビボにおいて遺伝子の高効率形質導入に対する有用性がある。複製欠損レトロウイルスを作製するための標準プロトコール（プラスミドへの外来性遺伝物質の組み込み工程、プラスミドによるパッケージング細胞株のトランスフェクション工程、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生工程、組織培養培地からのウイルス粒子の回収工程およびウイルス粒子の標的細胞への感染工程を含む）は、KRIEGLER（A Laboratory Manual,“W.H. Freeman C.O., New York, 1990）およびMURRY（“Methods in Molecular Biology,”vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）により提供されている。
【0024】
特定の用途に好ましいウイルスは、遺伝子療法におけるヒトへの使用に対して既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損となるように改変することができ、広範囲に及ぶ細胞型および種への感染能を有する。さらに、熱および脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞への高い形質導入頻度；ならびに結果的に複数のシリーズの形質導入を可能にする重複感染阻害の欠如などの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒトの細胞ＤＮＡに組み込むことができ、それによって、レトロウイルス感染に特徴的な挿入変異の可能性および挿入された遺伝子の発現の変動を最小限にすることができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において、選択圧の不在下で１００回超の継代の間追跡されており、このことは、アデノ随伴ウイルスゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスは、染色体外でも機能することができる。
【0025】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当該技術分野において詳しく記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照。ここ数年、プラスミドベクターは、インビボで抗原コード遺伝子を細胞へ送達するためのＤＮＡワクチンとして用いられている。それらは、ウイルスベクターの多くと同様に安全性への問題がないため、これについて特に有利である。しかしながら、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、該プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特異的断片を除去および付加するために制限酵素および連結反応を使用するように特注設計され得る。プラスミドは、さまざまな非経口経路、粘膜経路および局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内経路、皮内経路、皮下経路またはその他の経路によって注入され得る。該プラスミドはまた、鼻腔内スプレー剤または滴剤によって、直腸坐剤によって、および経口的にも投与され得る。該プラスミドはまた、遺伝子銃を使用して上皮または粘膜表面にも投与され得る。該プラスミドは、水溶液で提供されるか、金粒子上で乾燥されるか、またはリポソーム、デンドリマー、コクリエートおよびマイクロカプセル化が挙げられるがこれらに限定されない別のＤＮＡ送達系と共同で存在することができる。
【0026】
典型的には、ＧＳＫ３阻害剤は、治療有効量で患者に投与される。
【0027】
上記ＧＳＫ３阻害剤の「治療有効量」とは、該化合物の十分な量を意味する。しかしながら、当然のことながら、本発明の化合物および組成物の総一日使用量は、主治医により適切な医学的判断の範囲内で決定される。特定の対象体に対する特定の治療上有効な用量レベルは、処置される障害および障害の重篤度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物、対象体の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および使用される特定の化合物の排泄速度；処置期間；使用される特定のポリペプチドと併用または同時使用される薬物；ならびに医学分野で周知の類似の因子を包含するさまざまな因子によって決まる。例えば、所望の治療効果を得るために必要な用量よりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が得られるまで徐々に用量を増加させていくことは、十分に当該分野の技術の範囲内である。しかしながら、該生成物の日用量は、成人１人あたり０.０１～１,０００ｍｇ／日の広範囲にわたって変動し得る。典型的には、該組成物は、処置対象体に対して用量の対症調整のために、活性成分０.０１、０.０５、０.１、０.５、１.０、２.５、５.０、１０.０、１５.０、２５.０、５０.０、１００、２５０および５００ｍｇを含有する。医薬は、典型的には、活性成分を約０.０１ｍｇ～約５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～約１００ｍｇ含有する。薬物の有効量は、通常、１日あたり体重１ｋｇにつき０.０００２ｍｇ～約２０ｍｇ、特に、１日あたり体重１ｋｇにつき約０.００１ｍｇ～７ｍｇの用量レベルで供給される。
【0028】
本発明にしたがって、ＧＳＫ３阻害剤は、医薬組成物の形態で対象体へ投与される。典型的には、ＧＳＫ３阻害剤は、薬学的に許容される賦形剤、および所望により生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて治療組成物を形成することができる。「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、必要に応じて、哺乳動物、特にヒトへ投与した場合に副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じない分子実体および組成物をいう。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、非毒性の固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、カプセル化材料または任意の種類の製剤化補助剤をいう。
【0029】
経口投与、舌下投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、局所投与または直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は、単独でまたは別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用の薬学的支持剤との混合物として、動物およびヒトへ投与され得る。好適な単位投与剤形は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤もしくは液剤のような経口経路剤形、舌下および頬側投与剤形、エアゾール剤、留置剤、皮下投与剤形、経皮投与剤形、局所投与剤形、腹腔内投与剤形、筋肉内投与剤形、静脈内投与剤形、皮下投与剤形、経皮投与剤形、クモ膜下腔内投与剤形および鼻腔内投与剤形ならびに直腸投与剤形を含む。
【0030】
典型的には、該医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムおよび同類のもの、または該塩の混合物）、または場合に応じて滅菌水または生理食塩水の添加後に注射液剤の構成を可能にする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であってよい。注射用に適している医薬剤形としては、滅菌水性液剤または懸濁剤；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射用液剤または懸濁剤の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。あらゆる場合において、該剤形は、無菌でなければならず、注射針の通過が容易である程度に流動性を持っていなければならない。該剤形は、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌類のような微生物の汚染作用から保護されていなければならない。本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として含む液剤は、好適にはヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と混合した水で調製され得る。分散製剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物で、および油で調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。ＧＳＫ３阻害剤は、中性型または塩型で組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）および塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸および同類のもののような有機酸で形成される酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインおよび同類のもののような有機塩基から誘導され得る。該担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、ならびに同類のもの）、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および同類のものによりもたらされ得る。多くの場合には、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むのが望ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によりもたらされ得る。滅菌注射液剤は、必要の量の活性化合物を必要に応じて上記で列挙された他の成分のいくつかと共に適当な溶媒中に配合し、その後滅菌濾過を行うことによって調製される。一般的に、分散製剤は、種々の滅菌活性成分を、分散基剤および上記で列挙したものから選択される必要な別の成分を含有する滅菌ビヒクルに取り込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌散剤の場合には、典型的な調製方法は、活性成分とさらなる所望の成分との粉末を予め調製しておいたそれらの滅菌濾過溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。直接注射のためのより濃縮されたかまたは非常に濃縮された溶液の調製はまた、ＤＭＳＯの溶媒としての使用が極めて迅速な浸透をもたらすと想定される場合に、高濃度の該活性剤を小さな腫瘍領域に送達するとも考えられる。製剤化の後、液剤は、該投与製剤に適合する方法で、かつ、治療上有効であるような量で、投与される。該製剤は、上記の注射用液剤のタイプのような種々の投与剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤および同類のものもまた用いることができる。水性溶液での非経口投与について、例えば、該溶液は、必要に応じて、適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にされる。これらの特定の水性液剤は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に適している。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は、当業者であれば本明細書に照らして分かる。投与量の多少の変動は、処置される対象体の状態に応じて必ず生じる。いずれにしても、投与責任者が個々の対象体に適切な用量を決定する。
【0031】
以下の図面および実施例によって本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例および図面は、如何なる場合も、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】ＭｕＳＫΔＣＲＤトランスジェニックマウスの生成。（Ａ）野生型（ＷＴ）アレル、ＭｕＳＫｆｌｏｘ（ＣＲＤ）アレルおよび組換えＭｕＳＫΔＣＲＤアレルの概略図。矢じり印、遺伝子型同定のためのプライマー。（Ｂ）注入したＥＳ変異クローンのＮｅｏサザンブロットハイブリダイゼーション解析の例。（Ｃ）ＰＣＲによる遺伝子型同定。２３４および２００ｂｐバンドは、それぞれ、ＷＴアレルおよびＭｕＳＫΔＣＲＤアレルを表す。（Ｄ）ＭｕＳＫ－ＨＡもしくはＭｕＳＫΔＣＲＤ－ＨＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、またはＭｕＳＫ免疫沈降後のＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管において、ＭｕＳＫ抗体を用いるＭｕＳＫまたはＭｕＳＫΔＣＲＤのウエスタンブロット。（Ｅ）ＭｕＳＫ－ＨＡまたはＭｕＳＫΔＣＲＤ－ＨＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における細胞表面ならびに総ＭｕＳＫ－ＨＡおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ－ＨＡのウエスタンブロット。トランスフェリン受容体（Ｔｆｒ）およびα－チューブリンをそれぞれビオチン化タンパク質およびインプットについてのローディングコントロールとして使用する。ＭｕＳＫ－ＷＴ－ＨＡまたはＭｕＳＫΔＣＲＤ－ＨＡのトランスフェクションを二重に行った。（Ｆ）α－ＢＴＸ（ＡＣｈＲ、緑）と一緒にＭｕＳＫ抗体（赤）で染色したＰ６０ ＷＴまたはＭｕＳＫΔＣＲＤ ＴＡ筋肉横断面の共焦点像。（Ｇ）シナプスでのＷＴおよび変異ＭｕＳＫシグナル強度の定量化。（Ｈ）Ｐ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ由来の単離されたＴＡ筋線維に行われたアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のKoelleの組織化学染色。（Ｉ）Ｐ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤヒラメ筋および横隔膜から抽出したＡＣｈＥ活性の定量化。（Ｊ）ＷＴまたはＭｕＳＫΔＣＲＤ初代培養から単離され筋管であって、組換えアグリンによって処理または非処理の、α－ＢＴＸで染色された筋管の例。（Ｋ）ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤの筋管内のＡＣｈＲクラスターの数の定量分析。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。***ｐ＜０.００１。ｎｓ、有意ではない。Ｎ＝３の独立した実験。重ね合わせ像（merged image）におけるスケールバー：Ｅにおいて２０μｍ；Ｇにおいて５０μｍ。
【0033】
【図2】ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚における障害のある筋肉プレパターン化。（Ａ－Ｂ）α－ＢＴＸ（ＡＣｈＲ、緑、Ｂ）と一緒にニューロフィラメント（ＮＦ、赤）およびシナプトフィジン（Ｓｙｎ、赤）抗体（Ａ－Ｂ）で染色したＥ１４ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ胚からの全載左片側横隔膜（whole mount left hemidiaphragm）の共焦点像。矢じり印、ＡＣｈＲクラスター。白色の破線はシナプス終板帯を描いており、ほとんどのＡＣｈＲクラスターを含む。（Ｃ－Ｈ）平均神経突起長さ（Ｃ）、終板帯の幅（Ｄ）、ＡＣｈＲクラスターの数（Ｅ）、体積（Ｆ）、強度（Ｇ）および非神経支配ＡＣｈＲクラスター（Ｈ）の定量分析。分析したＡＣｈＲクラスターの数：ＷＴにおいて７９０、ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて４６１。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。*ｐ＜０.０５、**ｐ＜０.０１、および***ｐ＜０.００１、一遺伝子型につきＮ＝４の胚、マン・ホイットニーのＵ検定。重ね合わせ像におけるスケールバー：Ａにおいて３００μｍ；Ｂにおいて５０μｍ。
【0034】
【図3】Ｅ１８.５ ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚における異常なＮＭＪ形成。（Ａ）ＡＣｈＲクラスターを可視化するためにα－ＢＴＸで染色したＥ１８.５ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ胚からの全載左片側横隔膜の共焦点像。右のパネルは、左のパネルの枠で囲んだ領域の拡大像を示す。白色の破線はシナプス終板帯を描いており、ほとんどのＡＣｈＲクラスターを含む。右のパネルにおける挿入図は、挿入図は、ＡＣｈＲクラスターの高倍率図である。（Ｂ－Ｅ）終板帯の幅（Ｂ）、ＡＣｈＲクラスターの数（Ｃ）、体積（Ｄ）および強度（Ｅ）の定量化。分析したＡＣｈＲクラスターの数：ＷＴにおいて８０６、ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて６０４。（Ｆ）図２Ｂにおけると同様に染色されたＥ１８.５ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ胚からの全載左片側横隔膜の共焦点像。（Ｇ－Ｊ）第１および第２神経枝の長さ（Ｇ－Ｈ）および数（Ｉ－Ｊ）の定量分析。分析した第１枝の数：ＷＴにおいて２７３、ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて３０９；第２枝の数：ＷＴにおいて２６６、ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて３１０。データは平均値±ＳＥＭとして示されている。*ｐ＜０.０５、**ｐ＜０.０１、および***ｐ＜０.００１、ｎｓ、有意ではない。一遺伝子型につきＮ＝６の胚、マン・ホイットニーのＵ検定。重ね合わせ像におけるスケールバー：Ａ、３００μｍ；Ｆ、５０μｍ。
【0035】
【0036】
【図5】ＭｕＳＫΔＣＲＤ成体マウスにおける未熟な断片化ＮＭＪ。Ｐ２０およびＰ６０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ＴＡからの全載単離筋線維を、α－ＢＴＸ（ＡＣｈＲ、緑）と一緒にニューロフィラメント（ＮＦ、赤）およびシナプトフィジン（Ｓｙｎ、赤）抗体で染色した。（Ａ）Ｐ２０およびＰ６０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスからのシナプスの共焦点像。Ｐ６０ ＮＭＪについては、再生像の上部の図は、右側に表される。（Ｂ－Ｄ）Ｐ２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける、ＡＣｈＲクラスター面積（Ｂ）、シナプトフィジン面積（Ｃ）および前シナプス要素と後シナプス要素との重複面積（Ｄ）の定量分析。（Ｅ－Ｈ）Ｐ６０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける、ＡＣｈＲクラスターあたりの断片の数（Ｅ）、ＡＣｈＲクラスター面積（Ｆ）、シナプトフィジン面積（Ｇ）および前シナプス要素と後シナプス要素との重複比（Ｈ）の定量分析。データは、少なくとも５０個のＮＭＪの平均値±ＳＥＭとして示されている。*ｐ＜０.０５、***ｐ＜０.００１、ｎｓ、有意ではない。一遺伝子型につきＮ＝６の動物、マン・ホイットニーのＵ検定。重ね合わせ像におけるスケールバー、１０μｍ。
【0037】
【図6】ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける無秩序な（disorganised）ＮＭＪ超微細構造。（Ａ－Ｇ）Ｐ１２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ＴＡ ＮＭＪの代表的な電子顕微鏡写真（ＥＭ）。Ａ－Ｃ、ＷＴ ＮＭＪの例。Ｄ－Ｇ、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪの例。ＢおよびＥは、それぞれ、ＡおよびＤのより高倍率図である。（Ｈ－Ｊ）ＷＴマウスと比べたＭｕＳＫΔＣＲＤにおける、シナプス小胞密度（Ｈ）、直径（Ｉ）およびＪＦの数（Ｊ）の定量分析。（Ｋ）Ｐ１２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ＴＡ構造の代表的なＥＭ。（Ｌ）ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスおよびＷＴマウスのＺ線間の距離の定量化。（Ｍ）Ｐ１２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ＴＡにおけるミエリン鞘の代表的なＥＭ。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。ｎｓ、有意ではない。１遺伝子型につきＮ＝４の動物、マン・ホイットニーのＵ検定。Ｎ、神経；ＭＦ、筋線維；ＳＶ、シナプス小胞；ＪＦ、接合部の線；ｍ、ミトコンドリア；ＳＢＬ、シナプス基底膜；矢印、前シナプス膜；矢じり印、後シナプス膜；白色の矢印、Ｚ線；星印、Ｍ線。スケールバー：Ａ－Ｇにおいて５００ｎｍ；ＨおよびＪにおいて１μｍ。
【0038】
【図7】ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは筋力低下、易疲労感および筋収縮低下を徐々に発症する。（Ａ）Ｐ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスのマイクロコンピューター断層撮影スキャン。（Ｂ）Ｐ１２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ脊柱後弯指数。（Ｃ）さまざまな時点（Ｐ２０、Ｐ４０、Ｐ６０およびＰ９０）でのレールグリップ試験（rail-grip test）の間の落下までの潜時（latency to fall）定量化。（Ｄ－Ｅ）ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける前肢（Ｄ）および後肢（Ｅ）の握力（grip strength）の定量化。（Ｆ）ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ Ｐ１２０単離マウス片側横隔膜における運動神経の刺激によって誘起される単収縮および強縮の代表的な例。２０、４０、６０、８０および１００Ｈｚで、１回の刺激または高頻度反復刺激（６００ｍｓ持続）によって横隔神経を刺激した。（Ｇ－Ｈ）ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける神経を誘起した１回の単収縮および高頻度反復刺激のピーク振幅。ｍＮ：ミリニュートン；ｇ：グラム。（Ｉ）ＷＴにおけるよりもＭｕＳＫΔＣＲＤにおける方がより明白な程度の疲労を誘発した高頻度反復神経刺激の例（６０Ｈｚ、１Ｈｚで６００ｍｓ持続）。（Ｊ）ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤにおける易疲労感の定量化。（Ｋ）ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉において観察された独特の刺激によって誘発された自発性単収縮の例。下線は刺激因子に相当する。ＷＴにおける換算表はＭｕＳＫΔＣＲＤに適用される。（Ｌ）図２Ｂにおけると同様に染色した全載Ｐ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ左片側横隔膜の共焦点像。矢印、後シナプスの消失。矢じり印、除神経した後シナプス。星印、断片化ＮＭＪ。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。*ｐ＜０.０５。Ａ－ＢおよびＬにおいて一遺伝子型につきＮ＝３の動物、Ｃ－Ｅにおいて一遺伝子型につきＮ＝６の動物、Ｆ－Ｋにおいて一遺伝子型につきＮ＝５の動物。マン・ホイットニーのＵ検定。Ｌにおけるスケールバー、５０μｍ。
【0039】
【図8】ＬｉＣｌ処理はＭｕＳＫΔＣＲＤ胚におけるＮＭＪ異常を救済する。（Ａ－Ｂ）ＷＴまたはＭｕＳＫΔＣＲＤ初代培養から単離された、Ｗｎｔ１１によって処理もしくは非処理（Ａ）またはＬｉＣｌによって処理もしくは非処理（Ｂ)の筋管におけるＡＣｈＲクラスターの数の定量分析。（Ｃ）βカテニンの核への移行（矢じり印）を可視化するためにＤａｐｉと一緒にβカテニンで染色した、Ｗｎｔ１１処理ＷＴ、Ｗｎｔ１１処理ＭｕＳＫΔＣＲＤおよびＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ初代筋管の例。（Ｄ）図２Ｂにおけるように染色した全載Ｅ１８.５ ＷＴ、ＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤおよびＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ左片側横隔膜の共焦点像。白色の破線はシナプス終板帯を描いており、ほとんどのＡＣｈＲクラスターを含む。（Ｅ－Ｌ）終板帯の幅（Ｅ）、ＡＣｈＲクラスターの数（Ｆ）、体積（Ｇ）および強度（Ｈ）の定量化。試験したＡＣｈＲクラスターの数：ＷＴにおいて２２３５、ＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において８４６、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において１７１４。（Ｆ－Ｉ）第１および第２神経枝の長さ（Ｉ－Ｊ）、ならびに神経突起バイパスの数および長さ（Ｋ－Ｌ）の定量分析。一条件につき少なくとも３００～４００本の第１および第２神経枝を分析した。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。*ｐ＜０.０５、**ｐ＜０.０１、および***ｐ＜０.００１。ｎｓ、有意ではない。一遺伝子型につきＮ＝６の胚、二元配置ＡＮＯＶＡまたはマン・ホイットニーのＵ検定。重ね合わせ像におけるスケールバー：Ｃにおいて２０μｍ；Ｄにおいて５０μｍ。
【0040】
【図9】ＬｉＣｌ処理は、ＭｕＳＫΔＣＲＤ成体マウスにおけるＮＭＪ形態異常および運動機能を回復させる。（Ａ）α－ＢＴＸ（ＡＣｈＲ、緑）およびＤａｐｉ（青）と一緒にβカテニン（赤）抗体で染色したＰ４０ ＮａＣｌ処理またはＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ全載単離ＴＡ筋線維からのシナプスの共焦点像。シナプス下核（subsynaptic nucleus）に対応する分節線（segmented lines）に沿ってβカテニンおよびＤａｐｉの蛍光強度を測定する強度プロットプロファイルの例は、右側に示される（ａ、ＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ；ｂ、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ）。（Ｂ）α－ＢＴＸ（ＡＣｈＲ、緑）と一緒にニューロフィラメント（ＮＦ、赤）およびシナプトフィジン（Ｓｙｎ、赤）抗体で染色したＰ４０ ＷＴ、ＮａＣｌ処理またはＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ全載単離ＴＡ筋線維からのシナプスの共焦点像。（Ｃ－Ｅ）ＡＣｈＲクラスターの面積（Ｃ）、シナプトフィジンの面積（Ｄ）およびＡＣｈＲクラスターあたりの断片の数（Ｅ）の定量分析。（Ｆ）さまざまな時点（Ｐ２０、Ｐ４０、Ｐ６０およびＰ９０）でのレールグリップ試験の間の落下までの潜時定量化。（ＧおよびＨ）ＷＴ、ＮａＣｌ処理またはＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける前肢（Ｇ）および後肢（Ｈ）の握力の定量化。データは、少なくとも５０個のＮＭＪの平均値±ＳＥＭとして示されている。*ｐ＜０.０５、**ｐ＜０.０１、および***ｐ＜０.００１；ｎｓ、有意ではない。一遺伝子型につきＮ＝６の動物、二元配置ＡＮＯＶＡ。重ね合わせ像におけるスケールバー：ＡおよびＢ、１０μｍ。
【実施例】
【0041】
材料および方法
動物
マウスに対する全ての実験は、欧州共同体ガイドライン法（European Community guidelines legislation）に従って行われ、Paris Descartes Universityの地方倫理委員会によって審査された（Ｎｏ．ＣＥＥＡ３４.ＬＳ.０３０.１２）。本研究者らは、Direction des Services Veterinaires（Prefecture de Police, Paris, France）によって届けられた生きている脊椎動物に対して実験を行う有効な許可証（Ｎｏ．Ａ－７５－１９７０）を持っていた。Paris Descartes Universityの動物舎および実験室は、同当局の同意を得ていた（Ｎｏ．Ｂ７５－０６－０７）。実験手順は、Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスに対して行われ、常に変異マウスを野生型同腹仔（Wt littermate）と比較した。
動物
マウスに対する全ての実験は、欧州共同体ガイドライン法（European Community guidelines legislation）に従って行われ、Paris Descartes Universityの地方倫理委員会によって審査された（Ｎｏ．ＣＥＥＡ３４.ＬＳ.０３０.１２）。本研究者らは、Direction des Services Veterinaires（Prefecture de Police, Paris, France）によって届けられた生きている脊椎動物に対して実験を行う有効な許可証（Ｎｏ．Ａ－７５－１９７０）を持っていた。Paris Descartes Universityの動物舎および実験室は、同当局の同意を得ていた（Ｎｏ．Ｂ７５－０６－０７）。実験手順は、Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスに対して行われ、常に変異マウスを野生型同腹仔（Wt littermate）と比較した。
【0042】
ＭｕＳＫΔＣＲＤ変異マウスの発生および遺伝子型判定。
Mouse Clinical Institute（ＭＣＩ／ＩＣＳ）にて、ｆｌｏｘｅｄネオマイシン耐性カセットおよびプロタミン－Ｃｒｅカセットを含有する私有のベクター（Illkirch, France; http://www-mci.u-strasbg.fr）を用いて、ＣＲＤに対応するＭｕＳＫ ３１５－４７８アミノ酸を欠いているＭｕＳＫΔＣＲＤ／ΔＣＲＤ変異マウス株を確立した。キメラマウスがＣｒｅ発現マウスを用いて繁殖された場合、構築ベクターにおけるプロタミンカセットの使用は、ｆｌｏｘｅｄ領域のオート切除のための有効な解決法を提供する。ターゲティングベクターは、ＰＣＲ産物の連続クローニングによって構築されており、５.５ｋｂ断片（５'ホモロジーアームに相当する）、プロタミンＣｒｅおよびネオマイシン選択カセットを含む４ｋｂ ｆｌｏｘｅｄ断片、ならびに５ｋｂ断片（３'ホモロジーアームに相当する）を含有していた。ｆｌｏｘｅｄ断片を区切る２つのＬｏｘＰ配列は、エクソン９の上流、かつ、エクソン１１の下流に位置していた。Ｂａｌｂ／ＣＮマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中にて線状化構築物をエレクトロポレーション処理した。５'外部およびプロタミンＣｒｅ（ターゲティングベクター内）ＬｏｎｇＲａｎｇｅ ＰＣＲならびにＮｅｏサザンブロットによって標的ＥＳクローンを選別した。２つの陽性ＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６Ｎ胚盤胞中に注入し、誘導された雄性キメラは、生殖系列伝達をもたらした。生じた株を、ＣＲＥ遺伝子がニワトリβアクチンプロモーターによって駆動される純粋な近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｎに基づいて産生されてｆｌｏｘｅｄ領域の欠損を誘発する高くてより安定な組換え効率を示すＣｒｅ ｄｅｌｅｔｅｒマウス（Birling et al., 2012）と交配させた。ＷＴアレルおよびＭｕＳＫΔＣＲＤアレルの遺伝子型判定のために順方向（Ｅｆ）および逆方向（ＷｒおよびＬｘｒ）プライマーを用いた。ＷＴ増幅配列は２３４ｂｐ長であったが、ノックアウト増幅は２００ｂｐ長であった。
Mouse Clinical Institute（ＭＣＩ／ＩＣＳ）にて、ｆｌｏｘｅｄネオマイシン耐性カセットおよびプロタミン－Ｃｒｅカセットを含有する私有のベクター（Illkirch, France; http://www-mci.u-strasbg.fr）を用いて、ＣＲＤに対応するＭｕＳＫ ３１５－４７８アミノ酸を欠いているＭｕＳＫΔＣＲＤ／ΔＣＲＤ変異マウス株を確立した。キメラマウスがＣｒｅ発現マウスを用いて繁殖された場合、構築ベクターにおけるプロタミンカセットの使用は、ｆｌｏｘｅｄ領域のオート切除のための有効な解決法を提供する。ターゲティングベクターは、ＰＣＲ産物の連続クローニングによって構築されており、５.５ｋｂ断片（５'ホモロジーアームに相当する）、プロタミンＣｒｅおよびネオマイシン選択カセットを含む４ｋｂ ｆｌｏｘｅｄ断片、ならびに５ｋｂ断片（３'ホモロジーアームに相当する）を含有していた。ｆｌｏｘｅｄ断片を区切る２つのＬｏｘＰ配列は、エクソン９の上流、かつ、エクソン１１の下流に位置していた。Ｂａｌｂ／ＣＮマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中にて線状化構築物をエレクトロポレーション処理した。５'外部およびプロタミンＣｒｅ（ターゲティングベクター内）ＬｏｎｇＲａｎｇｅ ＰＣＲならびにＮｅｏサザンブロットによって標的ＥＳクローンを選別した。２つの陽性ＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６Ｎ胚盤胞中に注入し、誘導された雄性キメラは、生殖系列伝達をもたらした。生じた株を、ＣＲＥ遺伝子がニワトリβアクチンプロモーターによって駆動される純粋な近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｎに基づいて産生されてｆｌｏｘｅｄ領域の欠損を誘発する高くてより安定な組換え効率を示すＣｒｅ ｄｅｌｅｔｅｒマウス（Birling et al., 2012）と交配させた。ＷＴアレルおよびＭｕＳＫΔＣＲＤアレルの遺伝子型判定のために順方向（Ｅｆ）および逆方向（ＷｒおよびＬｘｒ）プライマーを用いた。ＷＴ増幅配列は２３４ｂｐ長であったが、ノックアウト増幅は２００ｂｐ長であった。
【0043】
抗体
以下の抗体を用いた：ポリクローナルおよびモノクローナルＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（Life Technologies、１／１０００）、ポリクローナルＣｙTM３－コンジュゲート（Jackson immunoresearch、１／１０００）、モノクローナルおよびポリクローナルペルオキシダーゼコンジュゲート（Amersham、１／１００００）、ウサギモノクローナル抗シナプトフィジン（Life Technologies、１／５）、ポリクローナル抗ニューロフィラメント６８ｋＤａ（Chemicon、１／１０００）、ポリクローナル抗ニューロフィラメント１６５ｋＤａ（DSHB, Iowa, USA、１／７５０）、ポリクローナル抗ＨＡ（１／２５００；Abcam）、モノクローナル抗βカテニン（Life Technologies、１／５００）。ポリクローナル抗ＭｕＳＫ（Abcam、１／２００）、モノクローナル抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ、Invitrogen、１／５００）および抗αチューブリン（Sigma-Aldrich、１／６０００）をウエスタンブロットに用いた。免疫組織化学に用いたポリクローナル抗ＭｕＳＫ（１／５００）はM. Ruegg（Germany）からの贈り物である。Ｄａｐｉ（１／２００００）およびαブンガロトキシン（α－ＢＴＸ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（１／１０００）は、それぞれ、EuromedexおよびLife Technologiesから購入した。
以下の抗体を用いた：ポリクローナルおよびモノクローナルＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（Life Technologies、１／１０００）、ポリクローナルＣｙTM３－コンジュゲート（Jackson immunoresearch、１／１０００）、モノクローナルおよびポリクローナルペルオキシダーゼコンジュゲート（Amersham、１／１００００）、ウサギモノクローナル抗シナプトフィジン（Life Technologies、１／５）、ポリクローナル抗ニューロフィラメント６８ｋＤａ（Chemicon、１／１０００）、ポリクローナル抗ニューロフィラメント１６５ｋＤａ（DSHB, Iowa, USA、１／７５０）、ポリクローナル抗ＨＡ（１／２５００；Abcam）、モノクローナル抗βカテニン（Life Technologies、１／５００）。ポリクローナル抗ＭｕＳＫ（Abcam、１／２００）、モノクローナル抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ、Invitrogen、１／５００）および抗αチューブリン（Sigma-Aldrich、１／６０００）をウエスタンブロットに用いた。免疫組織化学に用いたポリクローナル抗ＭｕＳＫ（１／５００）はM. Ruegg（Germany）からの贈り物である。Ｄａｐｉ（１／２００００）およびαブンガロトキシン（α－ＢＴＸ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（１／１０００）は、それぞれ、EuromedexおよびLife Technologiesから購入した。
【0044】
プラスミド
ラットＭｕＳＫ－ＨＡおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ｃＤＮＡプラスミドは、従前に記載されていた（Cartaud et al., 2004；Strochlic et al., 2012)。
ラットＭｕＳＫ－ＨＡおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ｃＤＮＡプラスミドは、従前に記載されていた（Cartaud et al., 2004；Strochlic et al., 2012)。
【0045】
細胞表面ＭｕＳＫおよびＭｕＳＫΔＣＲＤのビオチン化ならびにウエスタンブロット分析
３７℃で５％ＣＯ2下、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび２％ペニシリン／ストレプトマイシン（５００Ｕ）を添加したＤＭＥＭ中にてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。細胞を７０％コンフルエンスまで増殖させ、Ｆｕｇｅｎ（Promega）トランスフェクション技術を用いてトランスフェクトした（プラスミド２～７μｇ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、１ｍＭ ＭｇＣｌ2および０.１ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する冷ＰＢＳで洗浄し、同バッファー中にて０.５ｍｇ／ｍｌ ＥＺ－ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＳＳ－ビオチン（Thermo Scientific Pierce）と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。５０ｍＭグリシンおよび０.５％ＢＳＡと一緒に５分間インキュベートすることによって、該標識化反応をクエンチした。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含有する溶解バッファー（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ３ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ １％）中にて細胞をすすいで収穫した。ライセートを２００００ｇで１５分間遠心分離し、上清をセファロースビーズで前清浄した。ＢＳＡ処理ストレプトアビジンアガロースビーズ（Thermo Scientific Pierce）と一緒に４℃で３０時間インキュベートすることによって、ビオチン標識タンパク質を回収した。結合したタンパク質を７％ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ酢酸塩ゲルによって分解し、ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロットによって検出した。ローディングコントロールとして膜トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を用いて、結果を正規化した。ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて、全および細胞表面ＭｕＳＫまたはＭｕＳＫΔＣＲＤタンパク質の相対シグナル強度を測定した。全抽出物中のＭｕＳＫおよびＭｕＳＫΔＣＲＤのレベルをチューブリンΑシグナルに正規化した。
３７℃で５％ＣＯ2下、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび２％ペニシリン／ストレプトマイシン（５００Ｕ）を添加したＤＭＥＭ中にてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。細胞を７０％コンフルエンスまで増殖させ、Ｆｕｇｅｎ（Promega）トランスフェクション技術を用いてトランスフェクトした（プラスミド２～７μｇ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、１ｍＭ ＭｇＣｌ2および０.１ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する冷ＰＢＳで洗浄し、同バッファー中にて０.５ｍｇ／ｍｌ ＥＺ－ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＳＳ－ビオチン（Thermo Scientific Pierce）と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。５０ｍＭグリシンおよび０.５％ＢＳＡと一緒に５分間インキュベートすることによって、該標識化反応をクエンチした。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含有する溶解バッファー（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ３ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ １％）中にて細胞をすすいで収穫した。ライセートを２００００ｇで１５分間遠心分離し、上清をセファロースビーズで前清浄した。ＢＳＡ処理ストレプトアビジンアガロースビーズ（Thermo Scientific Pierce）と一緒に４℃で３０時間インキュベートすることによって、ビオチン標識タンパク質を回収した。結合したタンパク質を７％ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ酢酸塩ゲルによって分解し、ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロットによって検出した。ローディングコントロールとして膜トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を用いて、結果を正規化した。ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて、全および細胞表面ＭｕＳＫまたはＭｕＳＫΔＣＲＤタンパク質の相対シグナル強度を測定した。全抽出物中のＭｕＳＫおよびＭｕＳＫΔＣＲＤのレベルをチューブリンΑシグナルに正規化した。
【0046】
筋肉初代培養。
ＭｕＳΔＣＲＤまたはＷＴマウスからのＰ７－Ｐ１０後肢前脛骨筋（ＴＡ）および腓腹筋から筋肉細胞を単離した。すなわち、筋組織を切り取り、結合組織から分離し、切断用培地（dissecting medium）（２ｍＭグルタミン、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（５００Ｕ）、２％ファンギゾンを含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２培地）中にてミンチ状にし、水浴中、０.２％Ｉ型コラゲナーゼ（Gibco）を含有する切断用培地中にて３７℃で９０分間分離させた。細胞を遠心分離し、濾過し、増殖培地（２０％ウマ血清および２％Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇを添加した切断用培地、Pall）に再懸濁させた。一夜プレプレーティングした後、細胞をマトリゲル（Corning）塗布ディッシュ中にて３～５日間増殖させ、分化用培地（２％ウマ血清を添加した切断用培地）中にて５日間分化させた。示された場合には、筋管を組換えアグリン（０.４μｇ／ｍｌ、R&D system）、Ｗｎｔ１１（１０ｎｇ／ｍｌ、R&D system）またはＬｉＣｌ（２.５ｍＭ、Sigma）で１６時間処理した。
ＭｕＳΔＣＲＤまたはＷＴマウスからのＰ７－Ｐ１０後肢前脛骨筋（ＴＡ）および腓腹筋から筋肉細胞を単離した。すなわち、筋組織を切り取り、結合組織から分離し、切断用培地（dissecting medium）（２ｍＭグルタミン、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（５００Ｕ）、２％ファンギゾンを含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２培地）中にてミンチ状にし、水浴中、０.２％Ｉ型コラゲナーゼ（Gibco）を含有する切断用培地中にて３７℃で９０分間分離させた。細胞を遠心分離し、濾過し、増殖培地（２０％ウマ血清および２％Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇを添加した切断用培地、Pall）に再懸濁させた。一夜プレプレーティングした後、細胞をマトリゲル（Corning）塗布ディッシュ中にて３～５日間増殖させ、分化用培地（２％ウマ血清を添加した切断用培地）中にて５日間分化させた。示された場合には、筋管を組換えアグリン（０.４μｇ／ｍｌ、R&D system）、Ｗｎｔ１１（１０ｎｇ／ｍｌ、R&D system）またはＬｉＣｌ（２.５ｍＭ、Sigma）で１６時間処理した。
【0047】
コンピューター断層撮影スキャン分析および脊柱後弯指数の測定。
ＥＡ２４９６（Montrouge）の画像処理研究室内に設置された画像処理用プラットフォームＰＩＰＡと協力してマイクロコンピューター断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）スキャン分析を行った。空気中１.５％イソフルラン（TEC 3 Anesteo France）を用いてＰ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスを鎮静させた。各動物の背臥位および腹臥位における全身を、活動的な形態でＱｕａｎｔｕｍ ＦＸ Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒマイクロＣＴ装置（Caliper Rikagu）によってスキャンした。管電圧９０ｋＶおよび管電流１６０μＡを選択した。総スキャン時間は、１回の総動物スキャンあたり２×１７秒であった。像のスキャンフィールドは、１１８マイクロの空間分解能（ボクセルサイズ）をもって２×６０ｍｍであった。各スキャンは、分解能／線量比を最適化することによって達成された。したがって、選択された分解能のために、各動物を２６ｍＧｙの低線量に曝露した。画像再構成および測定は、Ｏｓｉｒｉｘソフトウエアｖ.５.６によって行われた。従前に記載されている直接多断面再構成像（direct multiplanar reconstruction）（Laws and Hoey, 2004）から脊柱後弯指数（ＫＩ）を決定した。すなわち、第七頸椎（Ｃ７）から第六腰椎（Ｌ６）までの距離（Ｄ１）、次に、Ｄ１から最大椎骨湾曲点までの垂直距離（Ｄ２）を測定した。ＫＩは、Ｄ１／Ｄ２比に相当する。ＫＩは、後弯症に反比例する。
ＥＡ２４９６（Montrouge）の画像処理研究室内に設置された画像処理用プラットフォームＰＩＰＡと協力してマイクロコンピューター断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）スキャン分析を行った。空気中１.５％イソフルラン（TEC 3 Anesteo France）を用いてＰ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスを鎮静させた。各動物の背臥位および腹臥位における全身を、活動的な形態でＱｕａｎｔｕｍ ＦＸ Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒマイクロＣＴ装置（Caliper Rikagu）によってスキャンした。管電圧９０ｋＶおよび管電流１６０μＡを選択した。総スキャン時間は、１回の総動物スキャンあたり２×１７秒であった。像のスキャンフィールドは、１１８マイクロの空間分解能（ボクセルサイズ）をもって２×６０ｍｍであった。各スキャンは、分解能／線量比を最適化することによって達成された。したがって、選択された分解能のために、各動物を２６ｍＧｙの低線量に曝露した。画像再構成および測定は、Ｏｓｉｒｉｘソフトウエアｖ.５.６によって行われた。従前に記載されている直接多断面再構成像（direct multiplanar reconstruction）（Laws and Hoey, 2004）から脊柱後弯指数（ＫＩ）を決定した。すなわち、第七頸椎（Ｃ７）から第六腰椎（Ｌ６）までの距離（Ｄ１）、次に、Ｄ１から最大椎骨湾曲点までの垂直距離（Ｄ２）を測定した。ＫＩは、Ｄ１／Ｄ２比に相当する。ＫＩは、後弯症に反比例する。
【0048】
握力測定
空中につり下げられた金属レールを動物に握らせ、該動物のレールを離すまでの潜時を記録した。各マウス（遺伝子型ごとにＮ＝６）を、試験と試験の間に少なくとも１０分の休憩時間をとりながら５回試験した。
ＴＲＥＡＴ－ＮＭＤガイドラインに従って握力張力計（grip force tensiometer）（Bioseb）を用いて握力を測定した。製造者の使用説明書に従って前肢および後肢の牽引強度を記録した。動物１匹につき３回測定を行った。
空中につり下げられた金属レールを動物に握らせ、該動物のレールを離すまでの潜時を記録した。各マウス（遺伝子型ごとにＮ＝６）を、試験と試験の間に少なくとも１０分の休憩時間をとりながら５回試験した。
ＴＲＥＡＴ－ＮＭＤガイドラインに従って握力張力計（grip force tensiometer）（Bioseb）を用いて握力を測定した。製造者の使用説明書に従って前肢および後肢の牽引強度を記録した。動物１匹につき３回測定を行った。
【0049】
エクスビボ等尺性張力分析
Ｐ１２０ ＷｔおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスを頸椎の脱臼によって安楽死させた後、即時に全採血した。それぞれに横隔神経が付随している左片側横隔膜筋肉を、以下の組成：１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１ｍＭグルコースおよび５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７.４でバッファー処理）のクレブス・リンゲル溶液で満たしたシリコーンで裏打ちされた浴中にて標本に載せ、連続的に２３.１±０.４℃にてＯ２で灌流した。片側横隔膜腱（肋骨側）の１つをシリコーンコーティングした浴にステンレス鋼製ピンによって留め、その他の腱を、調整可能ステンレス綱フックによって、ＦＴ０３等尺性力変換器（Grass Instruments, West Warwick, RＩ, USA）にシルク糸で縛った。０.１５ｍｓ期間の最大上電流パルスをもって、本明細書に示された頻度で、神経の直径に適した吸引微小電極を介して運動神経を刺激することによって筋肉単収縮および強縮を誘起した。研究した各調製物について、静止張力を実験開始時に調節し（最大収縮応答を得るため）、実験期間全体にわたってモニターした。等尺性変換器からのシグナルを増幅し、回収し、Ａｘｏｓｃｏｐｅ ９ソフトウエア（Axon Instruments)を用いて、アナログ・デジタル変換インターフェースボード（Ｄｉｇｉｄａｔａ １２００、Axon Instruments, Union City, CA, USA）を装備したコンピューターの助けを借りてデジタル化した。
Ｐ１２０ ＷｔおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスを頸椎の脱臼によって安楽死させた後、即時に全採血した。それぞれに横隔神経が付随している左片側横隔膜筋肉を、以下の組成：１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１ｍＭグルコースおよび５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７.４でバッファー処理）のクレブス・リンゲル溶液で満たしたシリコーンで裏打ちされた浴中にて標本に載せ、連続的に２３.１±０.４℃にてＯ２で灌流した。片側横隔膜腱（肋骨側）の１つをシリコーンコーティングした浴にステンレス鋼製ピンによって留め、その他の腱を、調整可能ステンレス綱フックによって、ＦＴ０３等尺性力変換器（Grass Instruments, West Warwick, RＩ, USA）にシルク糸で縛った。０.１５ｍｓ期間の最大上電流パルスをもって、本明細書に示された頻度で、神経の直径に適した吸引微小電極を介して運動神経を刺激することによって筋肉単収縮および強縮を誘起した。研究した各調製物について、静止張力を実験開始時に調節し（最大収縮応答を得るため）、実験期間全体にわたってモニターした。等尺性変換器からのシグナルを増幅し、回収し、Ａｘｏｓｃｏｐｅ ９ソフトウエア（Axon Instruments)を用いて、アナログ・デジタル変換インターフェースボード（Ｄｉｇｉｄａｔａ １２００、Axon Instruments, Union City, CA, USA）を装備したコンピューターの助けを借りてデジタル化した。
【0050】
電子顕微鏡
空気中１.５％イソフルラン（Minerve Equipement veterinaire）を用いてＰ１２０ ＷｔおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスを鎮静させた。次に、前脛骨筋を切断し、すぐに、ＰＢＳ中２％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒド中にて室温で１時間および４℃で一夜固定した。ＴＡ筋肉をＰＢＳですすぎ、Koelleプロトコールに従ったＡＣｈＥ染色を行った。終板含有組織ブロックを小片に切断した。その後、組織試料を０.１Ｍリン酸ナトリウムバッファーで３回洗浄し、リン酸ナトリウムバッファー中１％オスミウム酸中にて４度で３０分間インキュベートし、エタノール勾配液（７０％エタノール中にて２×１０分、９０％エタノール中にて２×１０分、および１００％エタノール中にて２×１０分）で脱水した。次に、試料をプロピレン中にて１分間、および５０％ ５０％ Ｅｐｏｎ－５０％プロピレンオキシド中にて１０分間の２回インキュベートし、次に、Ｅｐｏｎ中に包埋し、重合のために６０℃で２４時間インキュベートした。最後に、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓで９０ｎｍ切片に切断し、室温にて、２％酢酸ウラニルで１０分間、およびクエン酸鉛で４分間染色するために碁盤目状に積層した。ＪＥＯＬ １０１１透過型電子顕微鏡で観察を行い、ＧＡＴＡＮ Ｅｒｌａｎｇｓｈｅｎ １０００カメラを用いて８０ｋｖで画像を記録した。
空気中１.５％イソフルラン（Minerve Equipement veterinaire）を用いてＰ１２０ ＷｔおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスを鎮静させた。次に、前脛骨筋を切断し、すぐに、ＰＢＳ中２％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒド中にて室温で１時間および４℃で一夜固定した。ＴＡ筋肉をＰＢＳですすぎ、Koelleプロトコールに従ったＡＣｈＥ染色を行った。終板含有組織ブロックを小片に切断した。その後、組織試料を０.１Ｍリン酸ナトリウムバッファーで３回洗浄し、リン酸ナトリウムバッファー中１％オスミウム酸中にて４度で３０分間インキュベートし、エタノール勾配液（７０％エタノール中にて２×１０分、９０％エタノール中にて２×１０分、および１００％エタノール中にて２×１０分）で脱水した。次に、試料をプロピレン中にて１分間、および５０％ ５０％ Ｅｐｏｎ－５０％プロピレンオキシド中にて１０分間の２回インキュベートし、次に、Ｅｐｏｎ中に包埋し、重合のために６０℃で２４時間インキュベートした。最後に、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓで９０ｎｍ切片に切断し、室温にて、２％酢酸ウラニルで１０分間、およびクエン酸鉛で４分間染色するために碁盤目状に積層した。ＪＥＯＬ １０１１透過型電子顕微鏡で観察を行い、ＧＡＴＡＮ Ｅｒｌａｎｇｓｈｅｎ １０００カメラを用いて８０ｋｖで画像を記録した。
【0051】
横隔膜の全載染色
横隔膜筋を切断し、室温で１時間固定し（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）、さらに４℃で一夜固定した（ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド）。筋肉をＰＢＳで１５分間ずつ３回洗浄し、ＰＢＳ中１００ｍＭグリシンと一緒に１５分間インキュベートし、ＰＢＳですすいだ。筋肉を１時間透過処理し（ＰＢＳ中０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０,５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中にて４時間ブロックした。筋肉を、ブロッキング溶液中にてニューロフィラメントおよびシナプトフィジンに対するウサギポリクローナル抗体と一緒に４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳによる１時間洗浄を３回行った後、筋肉を、ブロッキング溶液中にてＡｌｅｘａ－４８８ヤギ抗ウサギＩgＧおよびＡｌｅｘａ－５９４－コンジュゲート－αブンガロトキシン（α－ＢＧＴ）と一緒に４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳによる１時間洗浄を３回行った後、筋肉をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Labs）封入剤中に平らに載せる。
横隔膜筋を切断し、室温で１時間固定し（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）、さらに４℃で一夜固定した（ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒド）。筋肉をＰＢＳで１５分間ずつ３回洗浄し、ＰＢＳ中１００ｍＭグリシンと一緒に１５分間インキュベートし、ＰＢＳですすいだ。筋肉を１時間透過処理し（ＰＢＳ中０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０,５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中にて４時間ブロックした。筋肉を、ブロッキング溶液中にてニューロフィラメントおよびシナプトフィジンに対するウサギポリクローナル抗体と一緒に４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳによる１時間洗浄を３回行った後、筋肉を、ブロッキング溶液中にてＡｌｅｘａ－４８８ヤギ抗ウサギＩgＧおよびＡｌｅｘａ－５９４－コンジュゲート－αブンガロトキシン（α－ＢＧＴ）と一緒に４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳによる１時間洗浄を３回行った後、筋肉をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Labs）封入剤中に平らに載せる。
【0052】
免疫組織化学（俊樹切片および単離筋線維）
組織切片分析のため、Ｐ９０ 成体マウスからの切断したヒラメ筋および前脛骨筋を４℃で１時間固定し（ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ中にて４℃で２回すすぎ、４℃で一夜凍結防止し（ＰＢＳ中３０％シュークロース）、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（Sakura）中に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結した。クリオスタットクロス切片（１２μｍ）をＰＢＳ中０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間透過処理し、全載免疫染色（whole mount immunostaining）に関して種々の抗体で標識した。インキュベーション時間は以下のとおりであった：ブロッキングのために１時間、１次抗体と一緒のインキュベーションのために４℃で一夜、２次抗体と一緒のインキュベーションのために１時間。
単離筋線維分析のため、Ｐ２０およびＰ６０成体マウスから切断して単離したヒラメ筋、長指伸（ＥＤＬ）筋および前脛骨筋線維を４℃で３０分間固定し（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）、室温にてＰＢＳですすいだ。単離筋線維を、全載免疫染色に関して抗体で標識した。インキュベーション時間は以下のとおりであった：ブロッキングのために３時間、１次または２次抗体と一緒のインキュベーションのために４℃で一夜。
組織切片分析のため、Ｐ９０ 成体マウスからの切断したヒラメ筋および前脛骨筋を４℃で１時間固定し（ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ中にて４℃で２回すすぎ、４℃で一夜凍結防止し（ＰＢＳ中３０％シュークロース）、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（Sakura）中に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結した。クリオスタットクロス切片（１２μｍ）をＰＢＳ中０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間透過処理し、全載免疫染色（whole mount immunostaining）に関して種々の抗体で標識した。インキュベーション時間は以下のとおりであった：ブロッキングのために１時間、１次抗体と一緒のインキュベーションのために４℃で一夜、２次抗体と一緒のインキュベーションのために１時間。
単離筋線維分析のため、Ｐ２０およびＰ６０成体マウスから切断して単離したヒラメ筋、長指伸（ＥＤＬ）筋および前脛骨筋線維を４℃で３０分間固定し（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）、室温にてＰＢＳですすいだ。単離筋線維を、全載免疫染色に関して抗体で標識した。インキュベーション時間は以下のとおりであった：ブロッキングのために３時間、１次または２次抗体と一緒のインキュベーションのために４℃で一夜。
【0053】
画像収集および加工処理
全ての画像を、Ｆａｓｔ １３９４ Ｄｉｇｉｔａｌ ＣＣＤ ＦｉｒｅＷｉｒｅカメラ（Ｒｅｔｉｇａ ２０００Ｒモデル；Qimaging）および２０倍対物レンズを装備した顕微鏡（ＢＸ６１モデル；Olympus）、または２０倍対物レンズおよび６３倍油対物レンズを装備した共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ－７１０）によって収集した。収集したＺスタック共焦点画像（１～１,５μｍ（２０倍）ｚ工程を持つ５～２０のスタック）および画像取り込みを、ＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて行った。同レーザー出力およびパラメーター設定は、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉間の公正な比較を確実にするように適用した。横隔膜全体のサイズをカバーするようにマルチタイルスキャン（Multiple Tile Scanned）画像を撮影した。提示された共焦点像は、各セットのスタックを重ねることによって得られる単一像である。ＡＣｈＲクラスターの数、体積および強度の定量化について、ＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒｓｉｏｎ １.４６ｍ）ｐｌｕｇｉｎ“３Ｄ ｏｂｊｅｃｔ ｃｏｕｎｔｅｒ”（Bolte and Cordelieres, 2006）を使用して画像スタックを定量化した。ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ画像間で同じである、ＡＣｈＲクラスターの目視検査によって限界強度を設定した。主神経幹からの２つの最も離れたＡＣｈＲクラスター間の距離によって終板帯幅を同定した。横隔膜全体をカバーする規則的間隔の約１００の測定を行った。各遺伝子型の少なくとも４つの横隔膜または５０の単離筋線維を分析し、定量化した。分節線内でβカテニンおよびＤａｐｉ蛍光の強度を測定するＩｍａｇｅＪ強度プロットプロファイルを用いて定量化するために核に対応する画像スタックを使用して、単離筋線維におけるシナプス下核へのβカテニン移行を評価した。
全ての画像を、Ｆａｓｔ １３９４ Ｄｉｇｉｔａｌ ＣＣＤ ＦｉｒｅＷｉｒｅカメラ（Ｒｅｔｉｇａ ２０００Ｒモデル；Qimaging）および２０倍対物レンズを装備した顕微鏡（ＢＸ６１モデル；Olympus）、または２０倍対物レンズおよび６３倍油対物レンズを装備した共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ－７１０）によって収集した。収集したＺスタック共焦点画像（１～１,５μｍ（２０倍）ｚ工程を持つ５～２０のスタック）および画像取り込みを、ＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて行った。同レーザー出力およびパラメーター設定は、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉間の公正な比較を確実にするように適用した。横隔膜全体のサイズをカバーするようにマルチタイルスキャン（Multiple Tile Scanned）画像を撮影した。提示された共焦点像は、各セットのスタックを重ねることによって得られる単一像である。ＡＣｈＲクラスターの数、体積および強度の定量化について、ＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒｓｉｏｎ １.４６ｍ）ｐｌｕｇｉｎ“３Ｄ ｏｂｊｅｃｔ ｃｏｕｎｔｅｒ”（Bolte and Cordelieres, 2006）を使用して画像スタックを定量化した。ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ画像間で同じである、ＡＣｈＲクラスターの目視検査によって限界強度を設定した。主神経幹からの２つの最も離れたＡＣｈＲクラスター間の距離によって終板帯幅を同定した。横隔膜全体をカバーする規則的間隔の約１００の測定を行った。各遺伝子型の少なくとも４つの横隔膜または５０の単離筋線維を分析し、定量化した。分節線内でβカテニンおよびＤａｐｉ蛍光の強度を測定するＩｍａｇｅＪ強度プロットプロファイルを用いて定量化するために核に対応する画像スタックを使用して、単離筋線維におけるシナプス下核へのβカテニン移行を評価した。
【0054】
新生仔マウスおよび妊娠マウス腹腔内注射。
Ｅ１２妊娠マウスまたはＰ１０成体マウスにＬｉＣｌ（Sigma、６００ｍＭ－体重１ｇあたり１０μｌ）またはプラセボＮａＣｌ溶液体重（０,０００９％－体重１ｇあたり１０μｌ）を腹腔内注射した。Ｅ１２からＥ１８まで、またはＰ１０からＰ６０まで、連日注射を行った。胚の遺伝子型判定の後、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスのＥ１８.５またはＰ６０横隔膜を分析し、ＷＴまたはＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤと比較した。
Ｅ１２妊娠マウスまたはＰ１０成体マウスにＬｉＣｌ（Sigma、６００ｍＭ－体重１ｇあたり１０μｌ）またはプラセボＮａＣｌ溶液体重（０,０００９％－体重１ｇあたり１０μｌ）を腹腔内注射した。Ｅ１２からＥ１８まで、またはＰ１０からＰ６０まで、連日注射を行った。胚の遺伝子型判定の後、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスのＥ１８.５またはＰ６０横隔膜を分析し、ＷＴまたはＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤと比較した。
【0055】
統計分析
全てのデータを平均値±ＳＥＭで表した。Ｐｒｉｓｍ ６.０（Graphpad）ソフトウエアを用いて統計分析およびグラフを行った。適当（有意とみなされるＰ＜０.０５）であれば、全てのデータをマン・ホイットニーのＵ検定または二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析した。各実験を最低３回行った。
全てのデータを平均値±ＳＥＭで表した。Ｐｒｉｓｍ ６.０（Graphpad）ソフトウエアを用いて統計分析およびグラフを行った。適当（有意とみなされるＰ＜０.０５）であれば、全てのデータをマン・ホイットニーのＵ検定または二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析した。各実験を最低３回行った。
【0056】
結果
ＭｕＳＫΔＣＲＤトランスジェニックマウスの作成。
本発明者らは、相同組換えによってＭｕＳＫ ＣＲＤから削除されたマウス株を産生した（図１Ａ）。本発明者らは、エクソン９の上流、かつ、エクソン１１の下流にある２つのｌｏｘＰ部位と隣接しているＭｕＳＫ遺伝子からなるターゲティングベクターを作成して、ＭｕＳＫ－ＣＲＤ ｆｌｏｘｅｄアレルを構築した。Ｂａｌｂ／ＣＮマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中にて該構築物をエレクトロポレーション処理し、注入クローンをＮｅｏプローブを用いて２つの別々の消化に対して行ったＮｅｏサザンブロットによって制御して、相同組換えによる５'アーム組込み（Ａｐａ Ｌ１およびＥｃｏ Ｒ１）および３'アーム組込み（Ｄｒｄ１およびＸｃｍ１、図１Ｂ）を検証した。全ての消化について、正しい組込みおよび第２ランダム組込み不在を示す予想されたサイズの単一バンドを得た。２つの陽性で独立したＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｎ胚盤胞中に注入して、２匹の独立したＭｕＳＫｆｌｏｘ(ＣＲＤ)マウスを作成した。次に、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損を有する子孫を作成するために、これらのマウスをＣｒｅ ｄｅｌｅｔｅｒマウスと交配させた（材料および方法、図１Ｃを参照）。さらにまた、そのＣＲＤから欠損したＭｕＳＫに相当する単一バンドがＭｕＳＫ免疫沈降後のＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管において検出され、ＣＲＤ欠損が変異マウスにおいて生じたことが確認された（図１Ｄ）。ヘテロ接合ＭｕＳＫ＋／ΔＣＲＤおよびホモ接合ＭｕＳＫΔＣＲＤ／ΔＣＲＤ（ＭｕＳＫΔＣＲＤ）の両変異マウスは野生型（ＷＴ）マウスと区別できなかった。ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスの５％は、体重およびサイズが小さく、呼吸不全および四肢運動不全を呈し、出生後数日で死亡したが、ほとんどは、生存可能であり、ミルクを吸引でき、正常な受胎能を有する成人期まで発育した。加えて、ＭｕＳＫΔＣＲＤおよびＷＴマウス間の重量曲線の差異は検出できなかった。
ＭｕＳＫΔＣＲＤトランスジェニックマウスの作成。
本発明者らは、相同組換えによってＭｕＳＫ ＣＲＤから削除されたマウス株を産生した（図１Ａ）。本発明者らは、エクソン９の上流、かつ、エクソン１１の下流にある２つのｌｏｘＰ部位と隣接しているＭｕＳＫ遺伝子からなるターゲティングベクターを作成して、ＭｕＳＫ－ＣＲＤ ｆｌｏｘｅｄアレルを構築した。Ｂａｌｂ／ＣＮマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中にて該構築物をエレクトロポレーション処理し、注入クローンをＮｅｏプローブを用いて２つの別々の消化に対して行ったＮｅｏサザンブロットによって制御して、相同組換えによる５'アーム組込み（Ａｐａ Ｌ１およびＥｃｏ Ｒ１）および３'アーム組込み（Ｄｒｄ１およびＸｃｍ１、図１Ｂ）を検証した。全ての消化について、正しい組込みおよび第２ランダム組込み不在を示す予想されたサイズの単一バンドを得た。２つの陽性で独立したＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｎ胚盤胞中に注入して、２匹の独立したＭｕＳＫｆｌｏｘ(ＣＲＤ)マウスを作成した。次に、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損を有する子孫を作成するために、これらのマウスをＣｒｅ ｄｅｌｅｔｅｒマウスと交配させた（材料および方法、図１Ｃを参照）。さらにまた、そのＣＲＤから欠損したＭｕＳＫに相当する単一バンドがＭｕＳＫ免疫沈降後のＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管において検出され、ＣＲＤ欠損が変異マウスにおいて生じたことが確認された（図１Ｄ）。ヘテロ接合ＭｕＳＫ＋／ΔＣＲＤおよびホモ接合ＭｕＳＫΔＣＲＤ／ΔＣＲＤ（ＭｕＳＫΔＣＲＤ）の両変異マウスは野生型（ＷＴ）マウスと区別できなかった。ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスの５％は、体重およびサイズが小さく、呼吸不全および四肢運動不全を呈し、出生後数日で死亡したが、ほとんどは、生存可能であり、ミルクを吸引でき、正常な受胎能を有する成人期まで発育した。加えて、ＭｕＳＫΔＣＲＤおよびＷＴマウス間の重量曲線の差異は検出できなかった。
【0057】
ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損が細胞膜での変異ＭｕＳＫ発現の欠損をもたらし得ることを考えると、本発明者らは、インビトロビオチン化実験および組織免疫組織化学を用いて、膜ＷＴまたは変異ＭｕＳＫのレベルを定量化した。ＭｕＳＫ－ＨＡまたはＭｕＳＫΔＣＲＤ－ＨＡを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞内での表面タンパク質のビオチン化による標識化は、形質膜での同じようなレベルのＭｕＳＫおよびＭｕＳＫΔＣＲＤを示した（図１Ｅ）。さらにまた、ＷＴおよび変異ＭｕＳＫの両方は、Ｐ６０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ前脛骨筋（ＴＡ）におけるα－ブンガロトキシン（ＢＴＸ）で標識された膜ＡＣｈＲクラスターと共存しており、これは、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がＮＭＪでの変異ＭｕＳＫ膜発現を妨げないことを示している（図１Ｆ）。シナプスでのＷＴおよび変異ＭｕＳＫシグナル強度のレベルの定量化は、ＷＴマウスと比べてＭｕＳＫΔＣＲＤが７０％増加することを示した（図１Ｇ）。加えて、シナプスでのＭｕＳＫ局在化は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を後シナプス膜内に留めるために必要とされるので（Cartaud et al., 2004）、本発明者らは、ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉内でＡＣｈＥ局在化および活性が妨げられたかを問うた。組織化学的染色法により、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ Ｐ９０ ＴＡ筋肉の両方の後シナプス膜内に蓄積されたことが明らかになった（図１Ｈ）。ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉間のＡＣｈＥ活性の差異は検出できなかった（図１Ｉ）。
【0058】
ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がアグリン－Ｌｒｐ４－ＭｕＳＫシグナル伝達を妨げることができたかを試験するために、本発明者らは、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋肉培養物においてアグリン誘導ＡＣｈＲクラスターを定量化した。ＷＴ一次筋管と比べてＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管におけるアグリン処理後のＡＣｈＲクラスターの数の差異は検出されず、これは、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損がアグリン誘導ＡＣｈＲクラスター化を撹乱しない（not perturb）ことを示している。これらのデータは、アグリンがＬｒｐ４／ＭｕＳＫΔＣＲＤ複合体においてＬｒｐ４と相互に作用することができること、およびＭｕＳＫΔＣＲＤ／Ｌｒｐ４相互作用が下流シグナル伝達を伝達することができることを示唆している（図１Ｊおよび１Ｋ）。
【0059】
ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損はＮＭＪ形成に影響を及ぼす。
Ｗｎｔが、ＭｕＳＫ ＣＲＤとの結合を介してＮＭＪ形成の初期の段階の間に役割を果たすことが知られていると考えると（Jing et al., 2009；Strochlic et al., 2012）、本発明者らは、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損が発生の間にＮＭＪ不全を引き起こすかどうかを試験する。まず、本発明者らは、Ｅ１４ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ胚におけるＮＭＪ表現型を比較した（図２）。全載横隔膜を、α－ＢＴＸで染色してＡＣｈＲクラスターを検出し、ニューロフィラメント（ＮＦ）およびシナプトフィジン（Ｓｙｎ）に対する抗体の混合物で染色してそれぞれ軸索側枝および神経終末を標識した。各片側横隔膜の背側および腹側の両方が神経支配されており、これは、軸索伸長がＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において十分に発生することを示している（図２Ａ）。それにもかかわらず、神経突起は、長さが８２％まで増大した（図２Ｂおよび２Ｃ）。この前シナプス欠損に加えて、ＡＣｈＲクラスターもまたＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において影響を受けた。ＷＴ胚において、ＡＣｈＲクラスターは、プレパターン化の間予測どおり筋肉の中心ゾーンに集中した。対照的に、変異胚においては、ＡＣｈＲクラスターはほとんど検出できず、２倍広い筋肉領域に分布していた（図２Ｂおよび２Ｄ、矢じり印）。定量分析により、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＡＣｈＲクラスターの数が平均６４％減少したことが明らかになった（図２Ｅ）。さらにまた、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＡＣｈＲクラスター体積および強度は、それぞれ、７０％および６５％低下し、非神経支配ＡＣｈＲクラスターをＷＴ胚と比べてＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において３０％増加させた（図２Ｆ～２Ｈ）。これらの結果は、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がＡＣｈＲプレパターン化の激しい低下とともにＮＭＪの初期発生異常をもたらすことを示唆している。
Ｗｎｔが、ＭｕＳＫ ＣＲＤとの結合を介してＮＭＪ形成の初期の段階の間に役割を果たすことが知られていると考えると（Jing et al., 2009；Strochlic et al., 2012）、本発明者らは、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損が発生の間にＮＭＪ不全を引き起こすかどうかを試験する。まず、本発明者らは、Ｅ１４ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ胚におけるＮＭＪ表現型を比較した（図２）。全載横隔膜を、α－ＢＴＸで染色してＡＣｈＲクラスターを検出し、ニューロフィラメント（ＮＦ）およびシナプトフィジン（Ｓｙｎ）に対する抗体の混合物で染色してそれぞれ軸索側枝および神経終末を標識した。各片側横隔膜の背側および腹側の両方が神経支配されており、これは、軸索伸長がＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において十分に発生することを示している（図２Ａ）。それにもかかわらず、神経突起は、長さが８２％まで増大した（図２Ｂおよび２Ｃ）。この前シナプス欠損に加えて、ＡＣｈＲクラスターもまたＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において影響を受けた。ＷＴ胚において、ＡＣｈＲクラスターは、プレパターン化の間予測どおり筋肉の中心ゾーンに集中した。対照的に、変異胚においては、ＡＣｈＲクラスターはほとんど検出できず、２倍広い筋肉領域に分布していた（図２Ｂおよび２Ｄ、矢じり印）。定量分析により、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＡＣｈＲクラスターの数が平均６４％減少したことが明らかになった（図２Ｅ）。さらにまた、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＡＣｈＲクラスター体積および強度は、それぞれ、７０％および６５％低下し、非神経支配ＡＣｈＲクラスターをＷＴ胚と比べてＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において３０％増加させた（図２Ｆ～２Ｈ）。これらの結果は、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がＡＣｈＲプレパターン化の激しい低下とともにＮＭＪの初期発生異常をもたらすことを示唆している。
【0060】
本発明者らは、さらに、Ｅ１８.５ ＭｕＳＫΔＣＲＤ横隔膜における発生の間の後期にＮＭＪ形態を分析した（図３）。ＡＣｈＲクラスターはＷＴ片側横隔膜において薄い終板帯に厳しく制限されたが、該終板帯の幅は、ＭｕＳＫΔＣＲＤにおけるよりも２倍大きかった（図３Ａおよび３Ｂ）。さらにまた、ＡＣｈＲクラスターは数が４０％減少し（図３Ｃ）、体積が２５％減少し（図３Ｄ）、強度が１４％減少した（図３Ｅ）。全てのＡＣｈＲクラスターは、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて神経支配されたが、しかしながら、ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚は、運動軸索の異常な伸長、ＡＣｈＲクラスターのバイパス形成、および筋肉の末梢へ向かう過剰な成長を示した（図３Ｆ）。第１枝および第２枝は有意には影響を受けなかったが、第１枝および第２枝の長さは、ＷＴ胚と比べてＭｕＳＫΔＣＲＤ変異体において、それぞれ、７５％および４６％増大した（図３Ｇ－Ｊ）。
【0061】
まとめると、これらの結果は、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損が、プレパターン化した神経系ＡＣｈＲクラスターの減少および過剰増殖性神経突起伸長によって例示されるように、ＮＭＪ形成を激しく撹乱することを示している。
【0062】
ＭｕＳＫΔＣＲＤ成体マウスは未熟な断片化ＮＭＪを示す。
先に記載したように、ＭｕＳＫΔＣＲＤ変異マウスは出生時に生存可能である。したがって、本発明者らは、発生の間に見られたＮＭＪ欠損が新生仔および成体変異マウスにおいても検出されるかどうかと疑問に思った。横隔膜のＰ５ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ全載標本において分析されたＮＭＪ表現型は、ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において観察されたものと同様のＭｕＳＫΔＣＲＤにおけるＡＣｈＲクラスター欠損および神経突起伸長欠損を明らかにした（図４Ａ－Ｅ）。前シナプスおよび後シナプスカウンターパートがＭｕＳＫΔＣＲＤ成体マウスにおいてもなお影響を受けたかどうかを評価するために、本発明者らは、Ｐ２０およびＰ６０でＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ＴＡ筋肉からの単離筋線維についてのＮＭＪ形態を分析した（図５）。出生時、終板の形状は卵形であり、ＮＭＪが成熟するにつれて、終板は、それらの分枝した出生後トポロジーを獲得し始める（Kummer et al., 2006；Marques et al., 2000）。Ｐ２０ ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて、分析した終板のほとんどが卵形であり、穿孔処理したＷＴのものと比べてコンパクトであり、これは、ＮＭＪが未熟であることを示唆している（図５Ａ、左側のパネル）。ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスの分析したＡＣｈＲ終板のどちらも、神経終末染色によって確認されるように神経支配されており、ＡＣｈＲクラスターと共存していた（図５Ａ、左側のパネル）。しかしながら、定量分析によって、前および後シナプス要素間の最終的な重複部分に影響を及ばさずに、接合部１つあたりのＡＣｈＲクラスターの数および神経終末面積がＷＴマウスと比べてＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいてそれぞれ４９％および５８％有意に減少したことが明らかになった（図５Ｂ－Ｄ）。
先に記載したように、ＭｕＳＫΔＣＲＤ変異マウスは出生時に生存可能である。したがって、本発明者らは、発生の間に見られたＮＭＪ欠損が新生仔および成体変異マウスにおいても検出されるかどうかと疑問に思った。横隔膜のＰ５ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ全載標本において分析されたＮＭＪ表現型は、ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において観察されたものと同様のＭｕＳＫΔＣＲＤにおけるＡＣｈＲクラスター欠損および神経突起伸長欠損を明らかにした（図４Ａ－Ｅ）。前シナプスおよび後シナプスカウンターパートがＭｕＳＫΔＣＲＤ成体マウスにおいてもなお影響を受けたかどうかを評価するために、本発明者らは、Ｐ２０およびＰ６０でＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ ＴＡ筋肉からの単離筋線維についてのＮＭＪ形態を分析した（図５）。出生時、終板の形状は卵形であり、ＮＭＪが成熟するにつれて、終板は、それらの分枝した出生後トポロジーを獲得し始める（Kummer et al., 2006；Marques et al., 2000）。Ｐ２０ ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて、分析した終板のほとんどが卵形であり、穿孔処理したＷＴのものと比べてコンパクトであり、これは、ＮＭＪが未熟であることを示唆している（図５Ａ、左側のパネル）。ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスの分析したＡＣｈＲ終板のどちらも、神経終末染色によって確認されるように神経支配されており、ＡＣｈＲクラスターと共存していた（図５Ａ、左側のパネル）。しかしながら、定量分析によって、前および後シナプス要素間の最終的な重複部分に影響を及ばさずに、接合部１つあたりのＡＣｈＲクラスターの数および神経終末面積がＷＴマウスと比べてＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいてそれぞれ４９％および５８％有意に減少したことが明らかになった（図５Ｂ－Ｄ）。
【0063】
Ｐ６０で、ＷＴ ＮＭＪは、連続的な枝分れした出生後トポロジーを形成し、典型的な「プレッツェル様」構造を示した（図５Ａ、右側のパネル）。この段階で、ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて分析したＮＭＪの１０％は、形状がＷＴのものと類似していた。しかしながら、ほとんど（分析したＮＭＪの９０％）のＭｕＳＫΔＣＲＤシナプスの構造は、下記の特徴をもって大幅に変わった：後シナプスネットワークは不連続であり、単離ＡＣｈＲクラスターが頻繁に見られ、これは、ＮＭＪの断片化を示唆している。実際に、ＮＭＪ１つあたりのＡＣｈＲ断片の数は４倍増加した（図５Ｅ）。さらにまた、ＮＭＪ１つあたりの総占有ＡＣｈＲクラスター面積は４０％有意に減少し、これは、ＡＣｈＲリッチドメインの減少を示唆している（図５Ｆ）。軸索側枝は、不連続であり、後シナプス体（postsynaptic apparatus）パーセリングとの相互関係において断片化されていると思われた。神経終末面積は、前および後シナプス要素間の重複部分に影響を及ぼさずに、３９％減少した（図５Ｇおよび５Ｈ）。速筋（fast-twitch）長指伸筋（ＥＤＬ）および遅筋（slow-twitch）ヒラメ筋を包含する他のタイプの筋肉においても同様のＮＭＪ欠損が見られた。
【0064】
まとめると、本発明者らが得た知見は、ＭｕＳＫのＣＲＤ欠損が、最終的には成体マウスにおける前および後シナプス体の激しい破壊を引き起こすＮＭＪ成熟を撹乱することを示している。
【0065】
ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスはＮＭＪ超微細構造の変化を示す。
ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける超微細構造レベルでの筋肉およびＮＭＪsの形態学的変化を分析するために、本発明者らは、Ｐ１２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスのＴＡ筋肉に対する電子顕微鏡分析を行った（図６Ａ－Ｍ）。神経終末の前シナプス分化は軸索原形質内に大量のミトコンドリアを有するＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて正常である思われたが、定量分析によって、ＭｕＳＫΔＣＲＤシナプス小胞密度は、平均シナプス小胞直径に影響を及ぼさないＷＴマウスと比べて６７％減少することが判明した（図６Ｈおよび６Ｉ）。さらにまた、後シナプス側では、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪの約３０％がＷＴマウスと比べて、極めて無秩序なまたは非常に少ない接合部ヒダ（junctional fold）（ＪＦ）を示した（ＭｕＳＫΔＣＲＤにおけるＪＦの７８％減少、図６Ａ－Ｆおよび６Ｊ）。ある場合には、ＷＴと比べて、ＪＦと筋線維との距離が増大し、後シナプス膜の下における大量のミトコンドリアの蓄積がＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて見られた（図６Ｇ）。しかしながら、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ全筋肉構造間の形態学差異は検出できなかった（図６Ｋ）。実際、筋節形成（sarcomeric organization）およびＺ線間の距離は、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウス間で類似していた（図６Ｌ）。加えて、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは、ミエリン鞘直径の変化を全く示さなかった（図６Ｍ）。
ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける超微細構造レベルでの筋肉およびＮＭＪsの形態学的変化を分析するために、本発明者らは、Ｐ１２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスのＴＡ筋肉に対する電子顕微鏡分析を行った（図６Ａ－Ｍ）。神経終末の前シナプス分化は軸索原形質内に大量のミトコンドリアを有するＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて正常である思われたが、定量分析によって、ＭｕＳＫΔＣＲＤシナプス小胞密度は、平均シナプス小胞直径に影響を及ぼさないＷＴマウスと比べて６７％減少することが判明した（図６Ｈおよび６Ｉ）。さらにまた、後シナプス側では、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪの約３０％がＷＴマウスと比べて、極めて無秩序なまたは非常に少ない接合部ヒダ（junctional fold）（ＪＦ）を示した（ＭｕＳＫΔＣＲＤにおけるＪＦの７８％減少、図６Ａ－Ｆおよび６Ｊ）。ある場合には、ＷＴと比べて、ＪＦと筋線維との距離が増大し、後シナプス膜の下における大量のミトコンドリアの蓄積がＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて見られた（図６Ｇ）。しかしながら、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ全筋肉構造間の形態学差異は検出できなかった（図６Ｋ）。実際、筋節形成（sarcomeric organization）およびＺ線間の距離は、ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウス間で類似していた（図６Ｌ）。加えて、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは、ミエリン鞘直径の変化を全く示さなかった（図６Ｍ）。
【0066】
まとめると、これらの結果は、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損が、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪにおける前および後シナプス超微細構造の両方を変化させ、運動活性欠損を引き起こし得ることを示している。
【0067】
ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスはしだいに筋力低下、疲労および運動欠損を発生する。
出生後の最初の２週間、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは、ＷＴマウスと比べて筋力低下の肉眼的身体的徴候を全く示さずに正常に成長した。この期間の後、骨盤部および肩甲部の縮みによって生じる異常な脊椎湾曲によって体幹領域の変化がしだいに明らかになってきた。Ｐ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスに対して行われたコンピューター断層撮影スキャン分析は、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスによって発生した脊柱後弯を例示する（図７Ａ）。脊柱後弯重篤度を評価するために用いた脊柱後弯指数（ＫＩ、材料および方法を参照）は、ＷＴと比べてＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて有意に減少し、変異マウスにおける重篤な脊椎変形の存在を確認した（図７Ｂ、Laws and Hoey, 2004）。ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて運動機能が変わったかどうかを評価するために、本発明者らは、若年マウスおよび成体マウスに対してグリップ試験アッセイを行った。レールから落下するまでの潜時は、ＷＴマウスでは年齢とともに増加したが、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは、落下までの潜時の減少によって決定されるようにＰ２０からＰ９０まで乏しい運動能力を示した（潜時減少：Ｐ２０、６２％；Ｐ４０、３３％；Ｐ６０、６４％；Ｐ９０、７２％；図７Ｃ）。ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける運動欠損の原因をさらに研究するために、本発明者らは、前肢の握力（図７Ｄ）および後肢の握力（図７Ｅ）を測定した。ＷＴマウスにおけると同様にＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて、前肢および後肢の握力は年齢とともに増大した。しかしながら、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスの握力は、全ての時点で、ＷＴマウスと比べて低下しており、筋力低下を示した（前肢握力の低下：Ｐ２０、２６％；Ｐ４０、２３％；Ｐ６０、２０％；Ｐ９０、３０％；後肢握力の低下：Ｐ２０、３７％；Ｐ４０、１８％；Ｐ６０、２３％；Ｐ９０、２１％；図７Ｄおよび７Ｅ）。
出生後の最初の２週間、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは、ＷＴマウスと比べて筋力低下の肉眼的身体的徴候を全く示さずに正常に成長した。この期間の後、骨盤部および肩甲部の縮みによって生じる異常な脊椎湾曲によって体幹領域の変化がしだいに明らかになってきた。Ｐ９０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤマウスに対して行われたコンピューター断層撮影スキャン分析は、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスによって発生した脊柱後弯を例示する（図７Ａ）。脊柱後弯重篤度を評価するために用いた脊柱後弯指数（ＫＩ、材料および方法を参照）は、ＷＴと比べてＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて有意に減少し、変異マウスにおける重篤な脊椎変形の存在を確認した（図７Ｂ、Laws and Hoey, 2004）。ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて運動機能が変わったかどうかを評価するために、本発明者らは、若年マウスおよび成体マウスに対してグリップ試験アッセイを行った。レールから落下するまでの潜時は、ＷＴマウスでは年齢とともに増加したが、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは、落下までの潜時の減少によって決定されるようにＰ２０からＰ９０まで乏しい運動能力を示した（潜時減少：Ｐ２０、６２％；Ｐ４０、３３％；Ｐ６０、６４％；Ｐ９０、７２％；図７Ｃ）。ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける運動欠損の原因をさらに研究するために、本発明者らは、前肢の握力（図７Ｄ）および後肢の握力（図７Ｅ）を測定した。ＷＴマウスにおけると同様にＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて、前肢および後肢の握力は年齢とともに増大した。しかしながら、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスの握力は、全ての時点で、ＷＴマウスと比べて低下しており、筋力低下を示した（前肢握力の低下：Ｐ２０、２６％；Ｐ４０、２３％；Ｐ６０、２０％；Ｐ９０、３０％；後肢握力の低下：Ｐ２０、３７％；Ｐ４０、１８％；Ｐ６０、２３％；Ｐ９０、２１％；図７Ｄおよび７Ｅ）。
【0068】
ＭｕＳＫΔＣＲＤにおける筋力低下のアッセイを確認するために、本発明者らは、エクスビボで異なる頻度での横隔神経刺激に応答して単収縮および強縮を誘起するＰ１２０ ＷＴおよびＭｕＳＫΔＣＲＤ左片側横隔膜の能力を分析した。図７Ｆに示されるように、ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉と同様にＷＴは、広範に及ぶ神経－刺激頻度で、強縮を発生し、維持した。しかしながら、ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉は、発生した力がＷＴのものよりも小さかった。実際に、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて、神経刺激後の筋肉単収縮の強度は、単回および高頻度反復刺激のいずれの後も、ＷＴマウスと比べて有意に低下した（筋肉単収縮の強度低下：単回単収縮、５９％；Ｔ４０Ｈｚ、５４％；Ｔ６０Ｈｚ、４７％；Ｔ８０Ｈｚ、４４％；Ｔ１００Ｈｚ、４２％；図７Ｇ）。筋肉重量（ｇ）に対して正規化された筋肉強度（ｍＮ）と定義される、発生した筋肉特異的な力は、単回および高頻度反復（Ｔ１００Ｈｚ）刺激のいずれの後も、ＷＴ筋肉と比べてＭｕＳＫΔＣＲＤにおいてそれぞれ５２％および２４％有意に低下した（図７Ｈ）。ＮＭＪ構造変化の予測される病態生理学的結果は、無筋力症において見られる疲労性の筋力低下である（Hantai et al., 2013）。したがって、本発明者らは、一連の高頻度反復性神経刺激（Ｔ６０Ｈｚ）の後の筋肉疲労強度を評価し、ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉がＷＴ筋肉よりも強い疲労度を示したことを見出した（易疲労感の増大：３０％、図７Ｉおよび７Ｊ）。興味深いことに、本発明者らは、また、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおける唯一の刺激によって１つの単収縮が誘発された後に自然発症性単収縮を観察しており、これは筋肉脱神経プロセスの存在を示唆している（図７Ｋ、Heckmann and Ludin, 1982）。この組織をさらに確認するために、Ｐ９０ ＭｕＳＫΔＣＲＤ全載横隔膜標本において、非神経支配ＡＣｈＲクラスターを検出することができた（図７Ｌ）。
【0069】
本発明者らのデータは、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損が、運動能力を損ない、筋肉強度に影響を及ぼし、筋肉易疲労感の増加を引き起こすことを示している。これは、ＣＭＳに罹患している患者において一般的に見られる臨床症状と一致している。
【0070】
塩化リチウムは、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスのＮＭＪ表現型を救済する。
Ｗｎｔ／ＭｕＳＫ相互作用を障害するＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損は、ＮＭＪでのＷｎｔシグナル伝達を撹乱すると考えられる。実際に、ＭｕＳＫ ＣＲＤと相互作用することが知られていてＡＣｈＲクラスター化に必要なＷｎｔファミリーの一員であるＷｎｔ１１（Jing et al., 2009；Zhang et al., 2012）によるＷＴ一次筋管の処理は、Ｗｎｔ１１処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管において完全に消失した（８０％減少）ＡＣｈＲクラスターの数の４.５倍増加を誘発し、これは、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がＷｎｔ誘発性ＡＣｈＲクラスター化を変えることを示している（図８Ａ）。加えて、核へのβカテニン移行は、Ｗｎｔ１１処理ＷＴ一次筋管と比べてＷｎｔ１１処理ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて強く低減され、これは、ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉細胞において、カノニカル（canonical）経路のＷｎｔ活性化が影響を受けることを示している（図８Ｃ）。従前の報告は、Ｗｎｔカノニカル経路が神経筋シナプス形成に関与していることを示唆しているので（Li et al., 2008；Liu et al., 2012；Wu et al., 2012）、本発明者らは、発生期間のＷｎｔβカテニンシグナル伝達経路の強制活性化はＮＭＪ形成不全を阻止することができ、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪ表現型を少なくとも部分的に補うことができると判断した。この仮説を試験するために、本発明者らは、Ｇｓｋ３の周知の可逆的阻害剤およびＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の活性化剤であるＬｉＣｌを用いて薬理学的アプローチを設定した（Klein and Melton, 1996；Stambolic et al., 1996；Wada, 2009）。ＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管のＬｉＣｌ処理によって、Ｗｎｔ１１処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋管と比べて、ＡＣｈＲクラスターの数が６倍増加し、核へのβカテニン移行が増大し、これは、ＬｉＣｌがＭｕＳＫΔＣＲＤ筋管におけるＡＣｈＲクラスター化およびＷｎｔカノニカルシグナル伝達を救済することができることを示唆している（図８Ｂおよび８Ｃ）。次に、本発明者らは、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおけるインビボでのＮＭＪ形成に対するＬｉＣｌ処理の効果を試験した。妊娠マウスにおけるＥ１２からＥ１８.５のＬｉＣｌまたはプラセボ（ＮａＣｌ）の反復腹腔内注射を行い、Ｅ１８.５ ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪの表現型とＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤおよびＷＴ ＮＭＪを比較した（図８Ｄ）。注目すべきことに、ＬｉＣｌ処理は、Ｅ１８.５ ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚における後シナプス表現型をほとんど完全に救済した（図８Ｄ）。ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚の終板帯の幅は、ＮａＣｌ処理変異胚と比べて２３％減少し、ＷＴ胚の終板帯に近かった（図８Ｅ）。さらにまた、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚は、数（１０３％）、体積（１８６％）および強度（２０％）においてＡＣｈＲクラスターを増大させ、ＷＴ胚とほとんど区別できなかった（図８Ｆ－Ｈ）。加えて、前シナプス欠損は、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて改善された。ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて見られる第１枝および第２枝の伸長は、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚においてそれぞれ３５％および２８％減少し、ＷＴ胚とほとんど同じであった（図８Ｉおよび８Ｊ）。加えて、神経突起バイパスの数および長さは、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において、ＮａＣｌ処理のものと比べてそれぞれ３３％および１３８％減少した（図８Ｋおよび８Ｌ）。まとめると、これらの結果は、ＬｉＣｌ処理がＭｕＳＫΔＣＲＤ変異体の前および後シナプス欠損のどちらもほとんど完全に救済し、ＮＭＪはＷＴ ＮＭＪと表現型的に区別できないことを示している。
Ｗｎｔ／ＭｕＳＫ相互作用を障害するＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損は、ＮＭＪでのＷｎｔシグナル伝達を撹乱すると考えられる。実際に、ＭｕＳＫ ＣＲＤと相互作用することが知られていてＡＣｈＲクラスター化に必要なＷｎｔファミリーの一員であるＷｎｔ１１（Jing et al., 2009；Zhang et al., 2012）によるＷＴ一次筋管の処理は、Ｗｎｔ１１処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管において完全に消失した（８０％減少）ＡＣｈＲクラスターの数の４.５倍増加を誘発し、これは、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がＷｎｔ誘発性ＡＣｈＲクラスター化を変えることを示している（図８Ａ）。加えて、核へのβカテニン移行は、Ｗｎｔ１１処理ＷＴ一次筋管と比べてＷｎｔ１１処理ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて強く低減され、これは、ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋肉細胞において、カノニカル（canonical）経路のＷｎｔ活性化が影響を受けることを示している（図８Ｃ）。従前の報告は、Ｗｎｔカノニカル経路が神経筋シナプス形成に関与していることを示唆しているので（Li et al., 2008；Liu et al., 2012；Wu et al., 2012）、本発明者らは、発生期間のＷｎｔβカテニンシグナル伝達経路の強制活性化はＮＭＪ形成不全を阻止することができ、ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪ表現型を少なくとも部分的に補うことができると判断した。この仮説を試験するために、本発明者らは、Ｇｓｋ３の周知の可逆的阻害剤およびＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の活性化剤であるＬｉＣｌを用いて薬理学的アプローチを設定した（Klein and Melton, 1996；Stambolic et al., 1996；Wada, 2009）。ＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管のＬｉＣｌ処理によって、Ｗｎｔ１１処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ筋管と比べて、ＡＣｈＲクラスターの数が６倍増加し、核へのβカテニン移行が増大し、これは、ＬｉＣｌがＭｕＳＫΔＣＲＤ筋管におけるＡＣｈＲクラスター化およびＷｎｔカノニカルシグナル伝達を救済することができることを示唆している（図８Ｂおよび８Ｃ）。次に、本発明者らは、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおけるインビボでのＮＭＪ形成に対するＬｉＣｌ処理の効果を試験した。妊娠マウスにおけるＥ１２からＥ１８.５のＬｉＣｌまたはプラセボ（ＮａＣｌ）の反復腹腔内注射を行い、Ｅ１８.５ ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪの表現型とＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤおよびＷＴ ＮＭＪを比較した（図８Ｄ）。注目すべきことに、ＬｉＣｌ処理は、Ｅ１８.５ ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚における後シナプス表現型をほとんど完全に救済した（図８Ｄ）。ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚の終板帯の幅は、ＮａＣｌ処理変異胚と比べて２３％減少し、ＷＴ胚の終板帯に近かった（図８Ｅ）。さらにまた、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚は、数（１０３％）、体積（１８６％）および強度（２０％）においてＡＣｈＲクラスターを増大させ、ＷＴ胚とほとんど区別できなかった（図８Ｆ－Ｈ）。加えて、前シナプス欠損は、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて改善された。ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいて見られる第１枝および第２枝の伸長は、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚においてそれぞれ３５％および２８％減少し、ＷＴ胚とほとんど同じであった（図８Ｉおよび８Ｊ）。加えて、神経突起バイパスの数および長さは、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において、ＮａＣｌ処理のものと比べてそれぞれ３３％および１３８％減少した（図８Ｋおよび８Ｌ）。まとめると、これらの結果は、ＬｉＣｌ処理がＭｕＳＫΔＣＲＤ変異体の前および後シナプス欠損のどちらもほとんど完全に救済し、ＮＭＪはＷＴ ＮＭＪと表現型的に区別できないことを示している。
【0071】
成人期におけるＮＭＪ維持に対するＬｉＣｌ処理の有益な効果をさらに研究するために、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスに、Ｐ１０からＰ６０までＬｉＣｌまたはプラセボ（ＮａＣｌ）を注射し、ＮＭＪ形態および運動機能ならびにシナプス下核へのβカテニン移行を分析した（図９）。分節線に沿ってβカテニンおよびＤａｐｉの蛍光強度を測定する強度プロットプロファイルに示されるように、ＬｉＣｌ処理は、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤにおいてＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ単離Ｐ４０ ＴＡ筋線維と比べてシナプス下核βカテニン移行の強い増加をもたらした（図９Ａ）。加えて、本発明者らは、ＬｉＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤからのＰ４０ ＴＡ単離筋線維のＮＭＪ構造はＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪと比べてサイズが増大することを見出した（図９Ｂ）。ＬｉＣｌ処理変異体におけるＡＣｈＲクラスターおよびシナプトフィジンの面積は、ＮａＣｌ処理マウスと比べてそれぞれ４０％および１０５％増大した（図９Ｃおよび９Ｄ）。重要なことに、ＬｉＣｌ処理変異体における一ＮＭＪあたりのＡＣｈＲ断片数は、ＮａＣｌ処理マウスと比べて４４％減少した（図９Ｅ）。さらにまた、ＬｉＣｌ処理は、ＮａＣｌ処理ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスと比べて、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスがレールグリップから落下するまでの潜時および前肢および後肢の強度を有意に向上させた（図９Ｆ－Ｈ）。まとめると、これらのデータは、出生後ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスへのＬｉＣｌ処理はＮＭＪ形態学的欠損および筋肉強度を改善し、シナプス核へのβカテニン移行を回復させることを示しており、ＭｕＳＫ ＣＲＤが、Ｗｎｔ βカテニンシグナル伝達経路の活性化を介するとある程度思われる成人期におけるＮＭＪ維持の間に役割を果たすことを示唆している。
【0072】
考察：
ここで、本発明者らは、インビボでのＮＭＪ形成および維持の間のＭｕＳＫ－Ｗｎｔ結合ドメイン（ＣＲＤ）の機能的役割を研究してきた。この目的で、本発明者らは、ＭｕＳＫ ＣＲＤを欠いている変異マウスを作成した。ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損は、主に（ｉ）ＡＣｈＲクラスターの急激な低下および（ｉｉ）ＡＣｈＲクラスターをバイパスする過剰増殖性軸索伸長によって特徴付けられる、初期筋肉プレパターン化（Ｅ１４）およびＮＭＪ分化（Ｅ１８.５）の間に前および後シナプス要素の両方に重篤な変化をもたらす。さらにまた、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損は、ＣＭＳの他のマウスモデルにおいて従前に見られたような脊柱後弯、ＮＭＪ破壊、筋力低下および易疲労感（Bogdanik and Burgess, 2011；Chevessier et al. ,2008, 2012；Gomez et al. ,1997；Webster et al. ,2013）を包含するＣＭＳ様症状を含む、成体マウスにおいて病原となる。本発明者らは、また、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおけるＮＭＪ神経支配欠損はインビボでのＬｉＣｌ処理によって救済され得ることを報告している。まとめると、本発明者らのデータは、成人期におけるＮＭＪ形成および機能におけるＭｕＳＫ ＣＲＤのための臨床的役割を明らかにする。
ここで、本発明者らは、インビボでのＮＭＪ形成および維持の間のＭｕＳＫ－Ｗｎｔ結合ドメイン（ＣＲＤ）の機能的役割を研究してきた。この目的で、本発明者らは、ＭｕＳＫ ＣＲＤを欠いている変異マウスを作成した。ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損は、主に（ｉ）ＡＣｈＲクラスターの急激な低下および（ｉｉ）ＡＣｈＲクラスターをバイパスする過剰増殖性軸索伸長によって特徴付けられる、初期筋肉プレパターン化（Ｅ１４）およびＮＭＪ分化（Ｅ１８.５）の間に前および後シナプス要素の両方に重篤な変化をもたらす。さらにまた、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損は、ＣＭＳの他のマウスモデルにおいて従前に見られたような脊柱後弯、ＮＭＪ破壊、筋力低下および易疲労感（Bogdanik and Burgess, 2011；Chevessier et al. ,2008, 2012；Gomez et al. ,1997；Webster et al. ,2013）を包含するＣＭＳ様症状を含む、成体マウスにおいて病原となる。本発明者らは、また、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおけるＮＭＪ神経支配欠損はインビボでのＬｉＣｌ処理によって救済され得ることを報告している。まとめると、本発明者らのデータは、成人期におけるＮＭＪ形成および機能におけるＭｕＳＫ ＣＲＤのための臨床的役割を明らかにする。
【0073】
Ｗｎｔタンパク質は、ＮＭＪ形成の間の初期に筋肉プレパターン化に関与することが知られている（Wu et al., 2010）。さらにまた、ゼブラフィッシュにおいて、Ｗｎｔ１１誘発性非神経性（aneural）ＡＣｈＲクラスター化は、Ｕｎｐｐｌｕｇｇｅｄ／ＭｕＳＫＤのＣＲＤを必要とする（Jing et al., 2009）。しかしながら、筋肉プレパターン化を欠くゼブラフィッシュは、ＮＭＪを形成することができ、完全に運動性があり、ＮＭＪ機能におけるプレパターン化の正確な役割の問題が未解決のままとなっている（Jing et al., 2009；Gordon et al., 2012）。ここで、本発明者らは、ＡＣｈＲクラスターの数が激減し（６３％）、非神経支配ＡＣｈＲクラスターがＥ１４ ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において強く増加している（３０％）ので、哺乳動物におけるＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損が筋肉プレパターン化を著しく損なうことを示している。なぜＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損が筋肉プレパターン化を完全に破壊しないかという疑問は依然として明らかになっていない。３つの仮説は、この所見を説明することができた：第１に、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がＷｎｔタンパク質のＭｕＳＫへの結合活性を低下させるが完全に阻害しないことがインビトロで示されている（Barik et al., 2014；Zhang et al., 2012）。かくして、本発明者らは、Ｗｎｔ誘起性筋肉プレパターン化がＭｕＳＫにおいて他のドメインを必要とすることを排除することはできない。第２に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体は、骨格筋細胞において発現され、Ｗｎｔシグナル伝達を媒介して筋肉プレパターン化に寄与することができた（Aviles et al., 2014；Strochlic et al., 2012）。最後に、初期融合筋線維におけるＭｕＳＫおよびＬｒｐ４発現は、ＭｕＳＫを自己活性化し、筋肉プレパターン化を開始するのに十分であることが示唆されている（Burden et al., 2013；Kim and Burden, 2008）。ＭｕＳＫ ＣＲＤへのＷｎｔ結合は、したがって、ＭｕＳＫ活性化を維持または強化して筋肉プレパターン化を増幅する。
【0074】
本発明者らの結果は、ＮＭＪでのＭｕＳＫΔＣＲＤ発現が変異体においてＷＴマウスと比べて７０％増加することを示している。ゼブラフィッシュにおいて、Ｗｎｔタンパク質がＷｎｔ誘発性ＭｕＳＫエンドサイトーシスの活性化を介して形質膜でのＭｕＳＫ発現のレベルを調節することが示されている（Gordon et al., 2012）。したがって、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損は、形質膜から細胞内コンパートメントへのＭｕＳＫ移行を妨げ、ＭｕＳＫ膜蓄積を引き起こし、Ｗｎｔ／ＭｕＳＫ下流シグナル伝達を減少させる。したがって、本発明者らは、Ｗｎｔ１１誘発性ＡＣｈＲクラスター化および核へのβカテニン移行がＭｕＳＫΔＣＲＤ一次筋管において障害されることを示しており、これは、ＭｕＳＫ ＣＲＤの欠損がＮＭＪ形成の間、下流Ｗｎｔカノニカルシグナル伝達を変えることを示唆している
【0075】
神経支配とともに、神経終末はアグリンを放出し、該アグリンはＬｒｐ４と結合し、その後、ＭｕＳＫリン酸化を増加させ、さらに、ＡＣｈＲクラスター化を亢進する（Kim et al., 2008；Zhang et al., 2008, 2011）。ＮＭＪ形成に関与する鍵分子のうち、ＭｕＳＫ、Ｌｒｐ４、ＲａｐｓｙｎおよびＤｏｋ７ノックアウトマウスは、非神経性およびアグリン誘発性の両方のＡＣｈＲクラスターを欠いている（DeChiara et al., 1996；Gautam et al., 1999；Okada et al., 2006；Weatherbee et al., 2006）。対照的に、筋肉プレパターン化はＭｕＳＫΔＣＲＤ胚において重大な影響を受けるが、本発明者らの結果は、Ｅ１８.５で、神経支配後、ＮＭＪはＡＣｈＲクラスターを形成することができるが、ＡＣｈＲクラスターの数（３０％）、体積および密度の減少をともなって異常であることを示しており、これは、（ｉ）プレパターン化が必須ではないがＮＭＪ分化の正常な進行に必要であること、（ｉｉ）神経支配だけが初期ＡＣｈＲクラスター欠損を部分的に補うことを示唆している。本発明者らは、ＭｕＳＫ ＣＲＤ欠損が一次筋管におけるアグリン誘発性ＡＣｈＲクラスター化に影響を及ぼさないことを示しているので、Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｚｄを含む後シナプス膜で他の受容体と結合することができ、したがって、シグナル伝達メカニズムを活性化し、アグリン誘発性ＡＣｈＲクラスター化の阻害を引き起こすことができる。これと一致して、最近、Ｆｚｄ９は、ＮＭＪが生じた場合に骨格筋において高度に発現され、培養筋管におけるその過剰発現はアグリン誘発性ＡＣｈＲクラスター化を障害することが示された（Aviles et al., 2014）。
【0076】
ＭｕＳＫヌル変異マウスにおいて、運動軸索は筋肉全体に過剰に伸長する（DeChiara et al., 1996）。同様に、筋肉プレパターン化の間およびＮＭＪ形成の間の後期の両方で、ＭｕＳＫΔＣＲＤ運動軸索は、ＡＣｈＲクラスターをオーバーシュートし、筋肉全体に異常に伸長する。この結果は、運動軸索に対する筋肉逆行性停止シグナルを調節する際のＭｕＳＫ ＣＲＤの重要性を明確に示している。この仮説の裏付けとして、マウスにおけるインビボでのＬｒｐ４およびβカテニンを含むＷｎｔカノニカルシグナル伝達の筋肉主要成分の条件無効化または過剰発現の研究は、Ｗｎｔカノニカルシグナル伝達が前シナプス分化に必要な逆行性シグナル伝達を指示する役割を示唆している（Li et al., 2008；Liu et al., 2012；Wu et al., 2012a, 2012b）。
【0077】
興味深いことに、深刻なＮＭＪ形成欠損にもかかわらず、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスは、出生時に生存可能であり、最初の２週間は明らかに異常な表現型もなく成人期に達する。対照的に、ＭｕＳＫを欠損しているマウスは、ＮＭＪを形成できず、呼吸不全により出生時に死亡する（DeChiara et al., 1996）。これらのデータは、ＣＲＤから抹消されたＭｕＳＫの残りの活性は変異マウスを致死から保護するのに十分であることを示唆している。しかしながら、出生から２週間後に、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスはＣＭＳ様症状を発症し始める。成体ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪの形態学的分析により、Ｐ２０で未熟な表現型に次いでＰ６０で深刻な破壊を有する異常な終板構造物が明らかになっている。これは、横隔膜、ＴＡ、ヒラメ筋およびＥＤＬを含む、分析された全ての筋肉において見られ、全ての横紋筋がＮＭＪ完全性を保証するのにＭｕＳＫ ＣＲＤが必要であることを示唆している。変異胚において見られるものと同様のＮＭＪ欠損がＰ５ ＭｕＳＫΔＣＲＤ横隔膜において検出されるので、この異常なＮＭＪ表現型は、発生の間の初期ＮＭＪ欠損の結果であると考えられる。この仮説において、ＮＭＪ形成の間の初期のシナプス位置決めの役割以外に、筋肉プレパターン化は、成体マウスにおけるＮＭＪ機能化における今までのところ予想されていなかった役割も有する。しかしながら、本発明者らは、成人期におけるＮＭＪ維持の間の特異的なＭｕＳＫ ＣＲＤに依存するＷｎｔの役割を排除することはできない。胚におけるＮＭＪ形成および成人期におけるＮＭＪ維持の間のＭｕＳＫ ＣＲＤの役割を識別するためにさらなる研究が必要である。
【0078】
ＮＭＪ断片化は、ＣＭＳ患者において記載されているように（Slater et al., 2006）、しばしば、筋力低下と関連している。実際に、ＭｕＳＫΔＣＲＤ成体マウスは、神経刺激に応答するエクスビボ等尺性横隔膜収縮および易疲労感測定であるグリップ試験アッセイにおける異常な能力によって明らかになる疲労性の筋力低下を発症する。興味深いことに、等尺性横隔膜収縮について試験した５匹のマウスのうち１匹の異常マウスは、筋肉脱神経によってしばしば生じる現象である、唯一の刺激後の自然発症性単収縮を示す（Heckmann and Ludin, 1982）。この観察結果と一致して、Ｐ９０ ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおけるＮＭＪ神経支配パターンの分析は、非神経支配ＡＣｈＲクラスターの存在を明らかにしており、脱神経様プロセスを示唆している。
【0079】
成体ＭｕＳＫΔＣＲＤ ＮＭＪの電子顕微鏡分析は、前シナプス小胞密度、およびわずかであるか高度である無秩序な接合部ヒダ（ＪＦ）を伴う後シナプスヒダ構造の異常を明らかにする。ＡＣｈＲクラスターおよびＪＦは、ＪＦの深部で濃縮された電位開口型ナトリウムチャネルの活性化を引き起こす効率的な終板電位の発生に必要である（Engel and Fumagalli, 1982；Marques et al., 2000）。かくして、前シナプス小胞密度の低下、断片化終板および無秩序なまたはわずかなＪＦは、ほぼ確実に、成体ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおいて見られる疲労性の筋力低下の原因である。本発明者らの筋肉パターンの研究は、線維サイズ減少をともなう軽度の筋肉萎縮（データを示していない）以外の主要な変化を明らかにしていない。この筋肉萎縮は、該筋力低下に関与し得るが、筋肉栄養機能のために筋肉活性が必要とされるので、欠損ＮＭＪ維持からも生じ得る（Schiaffino et al., 2007）。
【0080】
ＬｉＣｌは、現在、双極型障害、パーキンソン病およびハンチントン病を処置するために薬理学的試薬として用いられている（Klein and Melton, 1996；Schou, 2001；Chiu et al., 2011；Yong et al., 2011）。注目すべきことに、ＬｉＣｌ処置は、βカテニンシグナル伝達を救済し、ＭｕＳＫΔＣＲＤ胚および成体マウスの両方においてＮＭＪ欠損障害を改善し、これは、ＭｕＳＫΔＣＲＤマウスにおけるＮＭＪ形成および維持の間に見られる当該欠損がＷｎｔカノニカルシグナル伝達経路の阻害に部分的に起因することを示唆している。しかしながら、Ｇｓｋ３がＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲまたはＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫを包含する複数のシグナル伝達経路と相互作用する中心的なキナーゼであることを考えると、本発明者らは、ＬｉＣｌがＮＭＪ発生に関与する他のシグナル伝達経路を調節する可能性を排除することはできない（McCubrey et al., 2014）。興味深いことに、ＬｉＣｌは、Ｗｎｔカノニカル経路の活性化による眼咽頭筋型筋ジストロフィーの処置において効果的であること、および筋強直性ジストロフィーのマウスモデルにおける骨格筋強度を向上させることが示されている（Abu-Baker et al., 2013；Jones et al., 2012）。本発明者らの結果は、ＬｉＣｌまたは他のＧｓｋ３阻害剤が、Ｗｎｔ－ＭｕＳＫ欠損に関連する神経筋障害の治療薬として、またはその現在利用可能な処置を補って用いることもできる証拠を最初に提供する。
【0081】
参考文献：
Throughout this application, various references describe the state of the art to which this invention pertains. The disclosures of these references are hereby incorporated by reference into the present disclosure.
Van Amerongen, R., and Nusse, R. (2009). Towards an integrated view of Wnt signaling in development. Dev. Camb. Engl. 136, 3205-3214.
Ben Ammar, A., Soltanzadeh, P., Bauche, S., Richard, P., Goillot, E., Herbst, R., Gaudon, K., Huze, C., Schaeffer, L., Yamanashi, Y., et al. (2013). A mutation causes MuSK reduced sensitivity to agrin and congenital myasthenia. PloS One 8, e53826.
Arber, S., Burden, S.J., and Harris, A.J. (2002). Patterning of skeletal muscle. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 100-103.
Aviles, E.C., Pinto, C., Hanna, P., Ojeda, J., Perez, V., De Ferrari, G.V., Zamorano, P., Albistur, M., Sandoval, D., and Henriquez, J.P. (2014). Frizzled-9 impairs acetylcholine receptor clustering in skeletal muscle cells. Front. Cell. Neurosci. 8, 110.
Abu-Baker, A., Laganiere, J., Gaudet, R., Rochefort, D., Brais, B., Neri, C., Dion, P.A., and Rouleau, G.A. (2013). Lithium chloride attenuates cell death in oculopharyngeal muscular dystrophy by perturbing Wnt/β-catenin pathway. Cell Death Dis. 4, e821.
Barik, A., Zhang, B., Sohal, G.S., Xiong, W.-C., and Mei, L. (2014). Crosstalk between Agrin and Wnt signaling pathways in development of vertebrate neuromuscular junction. Dev. Neurobiol.
Berrih-Aknin, S., Frenkian-Cuvelier, M., and Eymard, B. (2014). Diagnostic and clinical classification of autoimmune myasthenia gravis. J. Autoimmun. 48-49, 143-148.
Budnik, V., and Salinas, P.C. (2011). Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 151-159.
Cartaud, A., Strochlic, L., Guerra, M., Blanchard, B., Lambergeon, M., Krejci, E., Cartaud, J., and Legay, C. (2004). MuSK is required for anchoring acetylcholinesterase at the neuromuscular junction. J. Cell Biol. 165, 505-515.
Chevessier, F., Faraut, B., Ravel-Chapuis, A., Richard, P., Gaudon, K., Bauche, S., Prioleau, C., Herbst, R., Goillot, E., Ioos, C., et al. (2004). MUSK, a new target for mutations causing congenital myasthenic syndrome. Hum. Mol. Genet. 13, 3229-3240.
Chiu, C.-T., Liu, G., Leeds, P., and Chuang, D.-M. (2011). Combined treatment with the mood stabilizers lithium and valproate produces multiple beneficial effects in transgenic mouse models of Huntington's disease. Neuropsychopharmacol. Off. Publ. Am. Coll. Neuropsychopharmacol. 36, 2406-2421.
DeChiara, T.M., Bowen, D.C., Valenzuela, D.M., Simmons, M.V., Poueymirou, W.T., Thomas, S., Kinetz, E., Compton, D.L., Rojas, E., Park, J.S., et al. (1996). The receptor tyrosine kinase MuSK is required for neuromuscular junction formation in vivo. Cell 85, 501-512.
Dickins, E.M., and Salinas, P.C. (2013). Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front. Cell. Neurosci. 7, 162.
Engel, A.G., and Fumagalli, G. (1982). Mechanisms of acetylcholine receptor loss from the neuromuscular junction. Ciba Found. Symp. 197-224.
Eymard, B., Hantai, D., and Estournet, B. (2013). Congenital myasthenic syndromes. Handb. Clin. Neurol. 113, 1469-1480.
Gautam, M., DeChiara, T.M., Glass, D.J., Yancopoulos, G.D., and Sanes, J.R. (1999). Distinct phenotypes of mutant mice lacking agrin, MuSK, or rapsyn. Brain Res. Dev. Brain Res. 114, 171-178.
Gordon, L.R., Gribble, K.D., Syrett, C.M., and Granato, M. (2012). Initiation of synapse formation by Wnt-induced MuSK endocytosis. Dev. Camb. Engl. 139, 1023-1033.
Gould, T.D. (2006). Targeting glycogen synthase kinase-3 as an approach to develop novel mood-stabilising medications. Expert Opin. Ther. Targets 10, 377-392.
Guergueltcheva, V., Mueller, J.S., Dusl, M., Senderek, J., Oldfors, A., Lindbergh, C., Maxwell, S., Colomer, J., Mallebrera, C.J., Nascimento, A., et al. (2011). Congenital myasthenic syndrome with tubular aggregates caused by GFPT1 mutations. J. Neurol.
Hantai, D., Nicole, S., and Eymard, B. (2013). Congenital myasthenic syndromes: an update. Curr. Opin. Neurol. 26, 561-568.
Hesser, B.A., Henschel, O., and Witzemann, V. (2006). Synapse disassembly and formation of new synapses in postnatal muscle upon conditional inactivation of MuSK. Mol. Cell. Neurosci. 31, 470-480.
Hoch, W., McConville, J., Helms, S., Newsom-Davis, J., Melms, A., and Vincent, A. (2001). Auto-antibodies to the receptor tyrosine kinase MuSK in patients with myasthenia gravis without acetylcholine receptor antibodies. Nat. Med. 7, 365-368.
Jing, L., Lefebvre, J.L., Gordon, L.R., and Granato, M. (2009). Wnt signals organize synaptic prepattern and axon guidance through the zebrafish unplugged/MuSK receptor. Neuron 61, 721-733.
Jones, K., Wei, C., Iakova, P., Bugiardini, E., Schneider-Gold, C., Meola, G., Woodgett, J., Killian, J., Timchenko, N.A., and Timchenko, L.T. (2012). GSK3β mediates muscle pathology in myotonic dystrophy. J. Clin. Invest. 122, 4461-4472.
Kim, N., and Burden, S.J. (2008). MuSK controls where motor axons grow and form synapses. Nat. Neurosci. 11, 19-27.
Kim, N., Stiegler, A.L., Cameron, T.O., Hallock, P.T., Gomez, A.M., Huang, J.H., Hubbard, S.R., Dustin, M.L., and Burden, S.J. (2008). Lrp4 is a receptor for Agrin and forms a complex with MuSK. Cell 135, 334-342.
Klein, P.S., and Melton, D.A. (1996). A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 8455-8459.
Kummer, T.T., Misgeld, T., and Sanes, J.R. (2006). Assembly of the postsynaptic membrane at the neuromuscular junction: paradigm lost. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 74-82.
Li, X.-M., Dong, X.-P., Luo, S.-W., Zhang, B., Lee, D.-H., Ting, A.K.L., Neiswender, H., Kim, C.-H., Carpenter-Hyland, E., Gao, T.-M., et al. (2008). Retrograde regulation of motoneuron differentiation by muscle beta-catenin. Nat. Neurosci. 11, 262-268.
Lin, S., Landmann, L., Ruegg, M.A., and Brenner, H.R. (2008). The role of nerve- versus muscle-derived factors in mammalian neuromuscular junction formation. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 28, 3333-3340.
Lin, W., Burgess, R.W., Dominguez, B., Pfaff, S.L., Sanes, J.R., and Lee, K.F. (2001). Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse. Nature 410, 1057-1064.
Liu, Y., Sugiura, Y., Wu, F., Mi, W., Taketo, M.M., Cannon, S., Carroll, T., and Lin, W. (2012). β-Catenin stabilization in skeletal muscles, but not in motor neurons, leads to aberrant motor innervation of the muscle during neuromuscular development in mice. Dev. Biol. 366, 255-267.
Makoukji, J., Belle, M., Meffre, D., Stassart, R., Grenier, J., Shackleford, G., Fledrich, R., Fonte, C., Branchu, J., Goulard, M., et al. (2012a). Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 3973-3978.
Makoukji, J., Belle, M., Meffre, D., Stassart, R., Grenier, J., Shackleford, G., Fledrich, R., Fonte, C., Branchu, J., Goulard, M., et al. (2012b). Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 3973-3978.
Von Maltzahn, J., Chang, N.C., Bentzinger, C.F., and Rudnicki, M.A. (2012). Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609.
Marques, M.J., Conchello, J.A., and Lichtman, J.W. (2000). From plaque to pretzel: fold formation and acetylcholine receptor loss at the developing neuromuscular junction. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 20, 3663-3675.
Maselli, R.A., Arredondo, J., Cagney, O., Ng, J.J., Anderson, J.A., Williams, C., Gerke, B.J., Soliven, B., and Wollmann, R.L. (2010). Mutations in MUSK causing congenital myasthenic syndrome impair MuSK-Dok-7 interaction. Hum. Mol. Genet. 19, 2370-2379.
Masiakowski, P., and Yancopoulos, G.D. (1998). The Wnt receptor CRD domain is also found in MuSK and related orphan receptor tyrosine kinases. Curr. Biol. CB 8, R407.
McCubrey, J.A., Steelman, L.S., Bertrand, F.E., Davis, N.M., Sokolosky, M., Abrams, S.L., Montalto, G., D'Assoro, A.B., Libra, M., Nicoletti, F., et al. (2014). GSK-3 as potential target for therapeutic intervention in cancer. Oncotarget 5, 2881-2911.
Mihaylova, V., Salih, M.A.M., Mukhtar, M.M., Abuzeid, H.A., El-Sadig, S.M., von der Hagen, M., Huebner, A., Nuernberg, G., Abicht, A., Mueller, J.S., et al. (2009). Refinement of the clinical phenotype in musk-related congenital myasthenic syndromes. Neurology 73, 1926-1928.
Morgan-Hughes, J.A. (1998). Tubular aggregates in skeletal muscle: their functional significance and mechanisms of pathogenesis. Curr. Opin. Neurol. 11, 439-442.
Okada, K., Inoue, A., Okada, M., Murata, Y., Kakuta, S., Jigami, T., Kubo, S., Shiraishi, H., Eguchi, K., Motomura, M., et al. (2006). The muscle protein Dok-7 is essential for neuromuscular synaptogenesis. Science 312, 1802-1805.
Punga, A.R., Maj, M., Lin, S., Meinen, S., and Rueegg, M.A. (2011). MuSK levels differ between adult skeletal muscles and influence postsynaptic plasticity. Eur. J. Neurosci. 33, 890-898.
Salinas, P.C. (2012). Wnt signaling in the vertebrate central nervous system: from axon guidance to synaptic function. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4.
Sanes, J.R., and Lichtman, J.W. (2001). Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2, 791-805.
Schou, M. (2001). Lithium treatment at 52. J. Affect. Disord. 67, 21-32.
Slater, C.R., Fawcett, P.R.W., Walls, T.J., Lyons, P.R., Bailey, S.J., Beeson, D., Young, C., and Gardner-Medwin, D. (2006). Pre- and post-synaptic abnormalities associated with impaired neuromuscular transmission in a group of patients with “limb-girdle myasthenia.”Brain J. Neurol. 129, 2061-2076.
Speese, S.D., and Budnik, V. (2007). Wnts: up-and-coming at the synapse. Trends Neurosci. 30, 268-275.
Stambolic, V., Ruel, L., and Woodgett, J.R. (1996). Lithium inhibits glycogen synthase kinase-3 activity and mimics wingless signalling in intact cells. Curr. Biol. CB 6, 1664-1668.
Stiegler, A.L., Burden, S.J., and Hubbard, S.R. (2009). Crystal structure of the frizzled-like cysteine-rich domain of the receptor tyrosine kinase MuSK. J. Mol. Biol. 393, 1-9.
Strochlic, L., Falk, J., Goillot, E., Sigoillot, S., Bourgeois, F., Delers, P., Rouviere, J., Swain, A., Castellani, V., Schaeffer, L., et al. (2012). Wnt4 Participates in the Formation of Vertebrate Neuromuscular Junction. PLoS ONE 7, e29976.
Takamori, M. (2012). Structure of the neuromuscular junction: function and cooperative mechanisms in the synapse. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1274, 14-23.
Takamori, M., Nakamura, T., and Motomura, M. (2013). Antibodies against Wnt receptor of muscle-specific tyrosine kinase in myasthenia gravis. J. Neuroimmunol. 254, 183-186.
Valenzuela, D.M., Stitt, T.N., DiStefano, P.S., Rojas, E., Mattsson, K., Compton, D.L., Nunez, L., Park, J.S., Stark, J.L., and Gies, D.R. (1995). Receptor tyrosine kinase specific for the skeletal muscle lineage: expression in embryonic muscle, at the neuromuscular junction, and after injury. Neuron 15, 573-584.
Vincent, A., and Leite, M.I. (2005). Neuromuscular junction autoimmune disease: muscle specific kinase antibodies and treatments for myasthenia gravis. Curr. Opin. Neurol. 18, 519-525.
Wada, A. (2009). Lithium and neuropsychiatric therapeutics: neuroplasticity via glycogen synthase kinase-3beta, beta-catenin, and neurotrophin cascades. J. Pharmacol. Sci. 110, 14-28.
Weatherbee, S.D., Anderson, K.V., and Niswander, L.A. (2006). LDL-receptor-related protein 4 is crucial for formation of the neuromuscular junction. Dev. Camb. Engl. 133, 4993-5000.
Willert, K., and Nusse, R. (2012). Wnt proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007864.
Wu, H., Xiong, W.C., and Mei, L. (2010). To build a synapse: signaling pathways in neuromuscular junction assembly. Dev. Camb. Engl. 137, 1017-1033.
Wu, H., Lu, Y., Barik, A., Joseph, A., Taketo, M.M., Xiong, W.-C., and Mei, L. (2012a). β-Catenin gain of function in muscles impairs neuromuscular junction formation. Dev. Camb. Engl. 139, 2392-2404.
Wu, H., Lu, Y., Shen, C., Patel, N., Gan, L., Xiong, W.C., and Mei, L. (2012b). Distinct roles of muscle and motoneuron LRP4 in neuromuscular junction formation. Neuron 75, 94-107.
Yang, X., Arber, S., William, C., Li, L., Tanabe, Y., Jessell, T.M., Birchmeier, C., and Burden, S.J. (2001). Patterning of muscle acetylcholine receptor gene expression in the absence of motor innervation. Neuron 30, 399-410.
Yong, Y., Ding, H., Fan, Z., Luo, J., and Ke, Z.-J. (2011). Lithium fails to protect dopaminergic neurons in the 6-OHDA model of Parkinson's disease. Neurochem. Res. 36, 367-374.
Zhang, B., Luo, S., Wang, Q., Suzuki, T., Xiong, W.C., and Mei, L. (2008). LRP4 serves as a coreceptor of agrin. Neuron 60, 285-297.
Zhang, B., Liang, C., Bates, R., Yin, Y., Xiong, W.-C., and Mei, L. (2012). Wnt proteins regulate acetylcholine receptor clustering in muscle cells. Mol. Brain 5, 7.
Zhang, W., Coldefy, A.-S., Hubbard, S.R., and Burden, S.J. (2011). Agrin binds to the N-terminal region of Lrp4 protein and stimulates association between Lrp4 and the first immunoglobulin-like domain in muscle-specific kinase (MuSK). J. Biol. Chem. 286, 40624-40630.
Throughout this application, various references describe the state of the art to which this invention pertains. The disclosures of these references are hereby incorporated by reference into the present disclosure.
Van Amerongen, R., and Nusse, R. (2009). Towards an integrated view of Wnt signaling in development. Dev. Camb. Engl. 136, 3205-3214.
Ben Ammar, A., Soltanzadeh, P., Bauche, S., Richard, P., Goillot, E., Herbst, R., Gaudon, K., Huze, C., Schaeffer, L., Yamanashi, Y., et al. (2013). A mutation causes MuSK reduced sensitivity to agrin and congenital myasthenia. PloS One 8, e53826.
Arber, S., Burden, S.J., and Harris, A.J. (2002). Patterning of skeletal muscle. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 100-103.
Aviles, E.C., Pinto, C., Hanna, P., Ojeda, J., Perez, V., De Ferrari, G.V., Zamorano, P., Albistur, M., Sandoval, D., and Henriquez, J.P. (2014). Frizzled-9 impairs acetylcholine receptor clustering in skeletal muscle cells. Front. Cell. Neurosci. 8, 110.
Abu-Baker, A., Laganiere, J., Gaudet, R., Rochefort, D., Brais, B., Neri, C., Dion, P.A., and Rouleau, G.A. (2013). Lithium chloride attenuates cell death in oculopharyngeal muscular dystrophy by perturbing Wnt/β-catenin pathway. Cell Death Dis. 4, e821.
Barik, A., Zhang, B., Sohal, G.S., Xiong, W.-C., and Mei, L. (2014). Crosstalk between Agrin and Wnt signaling pathways in development of vertebrate neuromuscular junction. Dev. Neurobiol.
Berrih-Aknin, S., Frenkian-Cuvelier, M., and Eymard, B. (2014). Diagnostic and clinical classification of autoimmune myasthenia gravis. J. Autoimmun. 48-49, 143-148.
Budnik, V., and Salinas, P.C. (2011). Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 151-159.
Cartaud, A., Strochlic, L., Guerra, M., Blanchard, B., Lambergeon, M., Krejci, E., Cartaud, J., and Legay, C. (2004). MuSK is required for anchoring acetylcholinesterase at the neuromuscular junction. J. Cell Biol. 165, 505-515.
Chevessier, F., Faraut, B., Ravel-Chapuis, A., Richard, P., Gaudon, K., Bauche, S., Prioleau, C., Herbst, R., Goillot, E., Ioos, C., et al. (2004). MUSK, a new target for mutations causing congenital myasthenic syndrome. Hum. Mol. Genet. 13, 3229-3240.
Chiu, C.-T., Liu, G., Leeds, P., and Chuang, D.-M. (2011). Combined treatment with the mood stabilizers lithium and valproate produces multiple beneficial effects in transgenic mouse models of Huntington's disease. Neuropsychopharmacol. Off. Publ. Am. Coll. Neuropsychopharmacol. 36, 2406-2421.
DeChiara, T.M., Bowen, D.C., Valenzuela, D.M., Simmons, M.V., Poueymirou, W.T., Thomas, S., Kinetz, E., Compton, D.L., Rojas, E., Park, J.S., et al. (1996). The receptor tyrosine kinase MuSK is required for neuromuscular junction formation in vivo. Cell 85, 501-512.
Dickins, E.M., and Salinas, P.C. (2013). Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front. Cell. Neurosci. 7, 162.
Engel, A.G., and Fumagalli, G. (1982). Mechanisms of acetylcholine receptor loss from the neuromuscular junction. Ciba Found. Symp. 197-224.
Eymard, B., Hantai, D., and Estournet, B. (2013). Congenital myasthenic syndromes. Handb. Clin. Neurol. 113, 1469-1480.
Gautam, M., DeChiara, T.M., Glass, D.J., Yancopoulos, G.D., and Sanes, J.R. (1999). Distinct phenotypes of mutant mice lacking agrin, MuSK, or rapsyn. Brain Res. Dev. Brain Res. 114, 171-178.
Gordon, L.R., Gribble, K.D., Syrett, C.M., and Granato, M. (2012). Initiation of synapse formation by Wnt-induced MuSK endocytosis. Dev. Camb. Engl. 139, 1023-1033.
Gould, T.D. (2006). Targeting glycogen synthase kinase-3 as an approach to develop novel mood-stabilising medications. Expert Opin. Ther. Targets 10, 377-392.
Guergueltcheva, V., Mueller, J.S., Dusl, M., Senderek, J., Oldfors, A., Lindbergh, C., Maxwell, S., Colomer, J., Mallebrera, C.J., Nascimento, A., et al. (2011). Congenital myasthenic syndrome with tubular aggregates caused by GFPT1 mutations. J. Neurol.
Hantai, D., Nicole, S., and Eymard, B. (2013). Congenital myasthenic syndromes: an update. Curr. Opin. Neurol. 26, 561-568.
Hesser, B.A., Henschel, O., and Witzemann, V. (2006). Synapse disassembly and formation of new synapses in postnatal muscle upon conditional inactivation of MuSK. Mol. Cell. Neurosci. 31, 470-480.
Hoch, W., McConville, J., Helms, S., Newsom-Davis, J., Melms, A., and Vincent, A. (2001). Auto-antibodies to the receptor tyrosine kinase MuSK in patients with myasthenia gravis without acetylcholine receptor antibodies. Nat. Med. 7, 365-368.
Jing, L., Lefebvre, J.L., Gordon, L.R., and Granato, M. (2009). Wnt signals organize synaptic prepattern and axon guidance through the zebrafish unplugged/MuSK receptor. Neuron 61, 721-733.
Jones, K., Wei, C., Iakova, P., Bugiardini, E., Schneider-Gold, C., Meola, G., Woodgett, J., Killian, J., Timchenko, N.A., and Timchenko, L.T. (2012). GSK3β mediates muscle pathology in myotonic dystrophy. J. Clin. Invest. 122, 4461-4472.
Kim, N., and Burden, S.J. (2008). MuSK controls where motor axons grow and form synapses. Nat. Neurosci. 11, 19-27.
Kim, N., Stiegler, A.L., Cameron, T.O., Hallock, P.T., Gomez, A.M., Huang, J.H., Hubbard, S.R., Dustin, M.L., and Burden, S.J. (2008). Lrp4 is a receptor for Agrin and forms a complex with MuSK. Cell 135, 334-342.
Klein, P.S., and Melton, D.A. (1996). A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 8455-8459.
Kummer, T.T., Misgeld, T., and Sanes, J.R. (2006). Assembly of the postsynaptic membrane at the neuromuscular junction: paradigm lost. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 74-82.
Li, X.-M., Dong, X.-P., Luo, S.-W., Zhang, B., Lee, D.-H., Ting, A.K.L., Neiswender, H., Kim, C.-H., Carpenter-Hyland, E., Gao, T.-M., et al. (2008). Retrograde regulation of motoneuron differentiation by muscle beta-catenin. Nat. Neurosci. 11, 262-268.
Lin, S., Landmann, L., Ruegg, M.A., and Brenner, H.R. (2008). The role of nerve- versus muscle-derived factors in mammalian neuromuscular junction formation. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 28, 3333-3340.
Lin, W., Burgess, R.W., Dominguez, B., Pfaff, S.L., Sanes, J.R., and Lee, K.F. (2001). Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse. Nature 410, 1057-1064.
Liu, Y., Sugiura, Y., Wu, F., Mi, W., Taketo, M.M., Cannon, S., Carroll, T., and Lin, W. (2012). β-Catenin stabilization in skeletal muscles, but not in motor neurons, leads to aberrant motor innervation of the muscle during neuromuscular development in mice. Dev. Biol. 366, 255-267.
Makoukji, J., Belle, M., Meffre, D., Stassart, R., Grenier, J., Shackleford, G., Fledrich, R., Fonte, C., Branchu, J., Goulard, M., et al. (2012a). Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 3973-3978.
Makoukji, J., Belle, M., Meffre, D., Stassart, R., Grenier, J., Shackleford, G., Fledrich, R., Fonte, C., Branchu, J., Goulard, M., et al. (2012b). Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 3973-3978.
Von Maltzahn, J., Chang, N.C., Bentzinger, C.F., and Rudnicki, M.A. (2012). Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609.
Marques, M.J., Conchello, J.A., and Lichtman, J.W. (2000). From plaque to pretzel: fold formation and acetylcholine receptor loss at the developing neuromuscular junction. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 20, 3663-3675.
Maselli, R.A., Arredondo, J., Cagney, O., Ng, J.J., Anderson, J.A., Williams, C., Gerke, B.J., Soliven, B., and Wollmann, R.L. (2010). Mutations in MUSK causing congenital myasthenic syndrome impair MuSK-Dok-7 interaction. Hum. Mol. Genet. 19, 2370-2379.
Masiakowski, P., and Yancopoulos, G.D. (1998). The Wnt receptor CRD domain is also found in MuSK and related orphan receptor tyrosine kinases. Curr. Biol. CB 8, R407.
McCubrey, J.A., Steelman, L.S., Bertrand, F.E., Davis, N.M., Sokolosky, M., Abrams, S.L., Montalto, G., D'Assoro, A.B., Libra, M., Nicoletti, F., et al. (2014). GSK-3 as potential target for therapeutic intervention in cancer. Oncotarget 5, 2881-2911.
Mihaylova, V., Salih, M.A.M., Mukhtar, M.M., Abuzeid, H.A., El-Sadig, S.M., von der Hagen, M., Huebner, A., Nuernberg, G., Abicht, A., Mueller, J.S., et al. (2009). Refinement of the clinical phenotype in musk-related congenital myasthenic syndromes. Neurology 73, 1926-1928.
Morgan-Hughes, J.A. (1998). Tubular aggregates in skeletal muscle: their functional significance and mechanisms of pathogenesis. Curr. Opin. Neurol. 11, 439-442.
Okada, K., Inoue, A., Okada, M., Murata, Y., Kakuta, S., Jigami, T., Kubo, S., Shiraishi, H., Eguchi, K., Motomura, M., et al. (2006). The muscle protein Dok-7 is essential for neuromuscular synaptogenesis. Science 312, 1802-1805.
Punga, A.R., Maj, M., Lin, S., Meinen, S., and Rueegg, M.A. (2011). MuSK levels differ between adult skeletal muscles and influence postsynaptic plasticity. Eur. J. Neurosci. 33, 890-898.
Salinas, P.C. (2012). Wnt signaling in the vertebrate central nervous system: from axon guidance to synaptic function. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4.
Sanes, J.R., and Lichtman, J.W. (2001). Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2, 791-805.
Schou, M. (2001). Lithium treatment at 52. J. Affect. Disord. 67, 21-32.
Slater, C.R., Fawcett, P.R.W., Walls, T.J., Lyons, P.R., Bailey, S.J., Beeson, D., Young, C., and Gardner-Medwin, D. (2006). Pre- and post-synaptic abnormalities associated with impaired neuromuscular transmission in a group of patients with “limb-girdle myasthenia.”Brain J. Neurol. 129, 2061-2076.
Speese, S.D., and Budnik, V. (2007). Wnts: up-and-coming at the synapse. Trends Neurosci. 30, 268-275.
Stambolic, V., Ruel, L., and Woodgett, J.R. (1996). Lithium inhibits glycogen synthase kinase-3 activity and mimics wingless signalling in intact cells. Curr. Biol. CB 6, 1664-1668.
Stiegler, A.L., Burden, S.J., and Hubbard, S.R. (2009). Crystal structure of the frizzled-like cysteine-rich domain of the receptor tyrosine kinase MuSK. J. Mol. Biol. 393, 1-9.
Strochlic, L., Falk, J., Goillot, E., Sigoillot, S., Bourgeois, F., Delers, P., Rouviere, J., Swain, A., Castellani, V., Schaeffer, L., et al. (2012). Wnt4 Participates in the Formation of Vertebrate Neuromuscular Junction. PLoS ONE 7, e29976.
Takamori, M. (2012). Structure of the neuromuscular junction: function and cooperative mechanisms in the synapse. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1274, 14-23.
Takamori, M., Nakamura, T., and Motomura, M. (2013). Antibodies against Wnt receptor of muscle-specific tyrosine kinase in myasthenia gravis. J. Neuroimmunol. 254, 183-186.
Valenzuela, D.M., Stitt, T.N., DiStefano, P.S., Rojas, E., Mattsson, K., Compton, D.L., Nunez, L., Park, J.S., Stark, J.L., and Gies, D.R. (1995). Receptor tyrosine kinase specific for the skeletal muscle lineage: expression in embryonic muscle, at the neuromuscular junction, and after injury. Neuron 15, 573-584.
Vincent, A., and Leite, M.I. (2005). Neuromuscular junction autoimmune disease: muscle specific kinase antibodies and treatments for myasthenia gravis. Curr. Opin. Neurol. 18, 519-525.
Wada, A. (2009). Lithium and neuropsychiatric therapeutics: neuroplasticity via glycogen synthase kinase-3beta, beta-catenin, and neurotrophin cascades. J. Pharmacol. Sci. 110, 14-28.
Weatherbee, S.D., Anderson, K.V., and Niswander, L.A. (2006). LDL-receptor-related protein 4 is crucial for formation of the neuromuscular junction. Dev. Camb. Engl. 133, 4993-5000.
Willert, K., and Nusse, R. (2012). Wnt proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007864.
Wu, H., Xiong, W.C., and Mei, L. (2010). To build a synapse: signaling pathways in neuromuscular junction assembly. Dev. Camb. Engl. 137, 1017-1033.
Wu, H., Lu, Y., Barik, A., Joseph, A., Taketo, M.M., Xiong, W.-C., and Mei, L. (2012a). β-Catenin gain of function in muscles impairs neuromuscular junction formation. Dev. Camb. Engl. 139, 2392-2404.
Wu, H., Lu, Y., Shen, C., Patel, N., Gan, L., Xiong, W.C., and Mei, L. (2012b). Distinct roles of muscle and motoneuron LRP4 in neuromuscular junction formation. Neuron 75, 94-107.
Yang, X., Arber, S., William, C., Li, L., Tanabe, Y., Jessell, T.M., Birchmeier, C., and Burden, S.J. (2001). Patterning of muscle acetylcholine receptor gene expression in the absence of motor innervation. Neuron 30, 399-410.
Yong, Y., Ding, H., Fan, Z., Luo, J., and Ke, Z.-J. (2011). Lithium fails to protect dopaminergic neurons in the 6-OHDA model of Parkinson's disease. Neurochem. Res. 36, 367-374.
Zhang, B., Luo, S., Wang, Q., Suzuki, T., Xiong, W.C., and Mei, L. (2008). LRP4 serves as a coreceptor of agrin. Neuron 60, 285-297.
Zhang, B., Liang, C., Bates, R., Yin, Y., Xiong, W.-C., and Mei, L. (2012). Wnt proteins regulate acetylcholine receptor clustering in muscle cells. Mol. Brain 5, 7.
Zhang, W., Coldefy, A.-S., Hubbard, S.R., and Burden, S.J. (2011). Agrin binds to the N-terminal region of Lrp4 protein and stimulates association between Lrp4 and the first immunoglobulin-like domain in muscle-specific kinase (MuSK). J. Biol. Chem. 286, 40624-40630.
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