特許 7075359 オリゴヌクレオチドの精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-17

(45)【発行日】2022-05-25

(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチドの精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィー

(51)【国際特許分類】

   C07H 1/06 20060101AFI20220518BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20220518BHJP

【ＦＩ】

C07H1/06

C12N15/10 112Z

C12N15/10 ZNA

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2018565677

(86)(22)【出願日】2017-06-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-07-04

(86)【国際出願番号】 US2017037126

(87)【国際公開番号】W WO2017218454

(87)【国際公開日】2017-12-21

【審査請求日】2020-06-12

(31)【優先権主張番号】62/492,402

(32)【優先日】2017-05-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/349,970

(32)【優先日】2016-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】398050098

【氏名又は名称】バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】グロンケ，ロバート・エス

(72)【発明者】

【氏名】ジョシ，ラトネッシュ・エス

【審査官】神谷 昌克

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第０２／００４０２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表平１０－５０５５７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６１－０７２７９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６０－１０４０９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６－５０１２５０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｈ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップであって、塩が硫酸アンモニウムである、ステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の３２～７８％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップであって、疎水性吸着剤がフェニルまたはヘキシルを含む、ステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのｎ－１不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。

【請求項2】

標的のチオール化オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップであって、塩が硫酸アンモニウムである、ステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の４０～１００％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップであって、疎水性吸着剤がフェニルまたはヘキシルを含む、ステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。

【請求項3】

前記塩が前記混合物に塩水溶液として添加されるか、または前記塩が前記混合物に直接溶解され、かつ、前記洗浄ステップの流速が負荷流速よりも遅い、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記溶離液が、水、塩水溶液、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコール、またはそれらの混合物から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の１～２５％、１０～２５％もしくは５～１０％を含まないように遅延されるか、または前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の１～２５％、５～１０％もしくは１０～２５％を含まない、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記疎水性吸着剤が少なくとも１５ｃｍの床高で充填される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記標的オリゴヌクレオチドが１５～２５個のヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン（５－メチルウラシル）、シトシン、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、７－デアザプリン、及び５－ヒドロキシメチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記標的オリゴヌクレオチドが、置換されていてもよい糖を含むか、２つの非ジェミナル環原子が架橋して二環式核酸（ＢＮＡ）を形成しているか、または、前記糖の環酸素原子が、ＳもしくはＮ（Ｒ）（式中、ＲはＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルである）に置き換えられているか、あるいはこれらの組み合わせである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記糖が、２’位において、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２（式中、ｎ及びｍは独立して、１～１０である）で置換されているか、または前記糖が、２’においてＯ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３で置換されている、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記標的オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡのみ、ＤＮＡのみ、ＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせ、またはギャップマーを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記標的オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記標的オリゴヌクレオチドの配列が（配列番号１）または（配列番号２）である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記標的オリゴヌクレオチドが、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのｎ－１不純物を更に含む、請求項２に記載の方法。

【請求項17】

前記生成物関連不純物が、少なくとも１つの脱塩基不純物、少なくとも１つのＣＮＥｔ不純物、または少なくとも１つのＮ＋１不純物を更に含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３４９，９７０号及び２０１７年５月１日に出願された米国仮特許出願第６２／４９２，４０２号に基づく出願日の利益を主張するものであり、各出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年６月１２日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、１２３４２９－００１２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、８３９バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

オリゴヌクレオチドは、研究及び医学的目的のために化学的に合成され得る短いＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーである。オリゴヌクレオチドは、典型的には、特定の配列を生成するためのヌクレオチド残基の段階的な付加によって調製される。合成中にステップのいずれかが非効率的であると、その結果、ヌクレオシドを欠いているオリゴマー（「Ｎ－１不純物」）または望ましいホスホチオエステル結合の代わりにホスホジエステル結合を有するオリゴマー（「Ｐ＝Ｏ不純物」）が生じる可能性がある。加えて、合成中または合成後の酸化条件への曝露により、Ｐ＝Ｓ結合がＰ＝Ｏ結合に変換され、Ｐ＝Ｏ不純物が生じる場合がある。望ましい配列をもつオリゴヌクレオチドの合成完了後、標的オリゴヌクレオチドは、失敗した配列の全てならびにＮ－１不純物及びＰ＝Ｏ不純物と併せて混合物として得られる。これらの不純物は次に、標的オリゴヌクレオチドから分離する必要がある。

【0004】

一般的に使用されている分離技術の１つは、オリゴヌクレオチドを精製するために使用される逆相高圧液体クロマトグラフィー（ｒｐ－ＨＰＬＣ）であるが、ｒｐ－ＨＰＬＣは一般に、Ｎ－１不純物、Ｐ＝Ｏ不純物、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及び／またはＮ＋１不純物を効果的に除去することができない。ｒｐ－ＨＰＬＣの別の不利な点としては、かなりの量の有機溶媒の使用が挙げられ、このため、処分上の問題のほか、防爆設備において精製を行う必要性が生じる。

【0005】

したがって、Ｎ－１不純物、Ｐ＝Ｏ不純物、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及び／またはＮ＋１不純物を除去することができ、かつ大規模な商業的プロセスに好適なオリゴヌクレオチド精製方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して標的オリゴヌクレオチドを精製する方法を記載する。特に、本明細書に記載の方法は、特定の動的負荷容量で、標的オリゴヌクレオチドと生成物関連不純物との混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂（または疎水性吸着剤）に適用することを含む。特許請求される方法は、標的オリゴヌクレオチドからのＮ－１不純物及びＰ＝Ｏ不純物の分離を改善するとともに、精製プロセス中の有機溶媒の使用を回避する。ある特定の実施形態では、特許請求される方法は、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及び／またはＮ＋１不純物を除去することもできる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】動的負荷容量とＰ＝Ｏ不純物の除去との間の関係を示すプロットである。

【図2】動的負荷容量とＮ－１不純物の除去との間の関係を示すプロットである。

【図3】脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及びＰ＝Ｏ不純物の例示的な構造を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明は、オリゴヌクレオチドの合成中に発生する生成物関連不純物からオリゴヌクレオチドを分離するための方法に関する。標的オリゴヌクレオチドのみならず様々な生成物関連不純物も含有する粗製のオリゴヌクレオチド混合物を、特定の動的負荷容量で疎水性吸着剤に適用する、新しいプロセスが開発された。この新しい方法は、Ｎ－１不純物及びＰ＝Ｏ不純物を含む、ある特定の生成物関連不純物の除去を改善する。標的オリゴヌクレオチドの疎水性は、そのＮ－１不純物及びＰ＝Ｏ不純物と比較して同様であると予想され、これらの不純物はまた、疎水性相互作用に依拠するプロセス規模のｒｐ－ＨＰＬＣによって除去されないため、このような改善は驚くべきものであった。ある特定の実施形態では、特許請求される方法は、ｒｐ－ＨＰＬＣによる除去が困難な脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及びＮ＋１不純物を除去することもできる。

【0009】

本発明の第１の実施形態は、標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約３２～約７８％の動的負荷容量において、希釈された混合物を疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、生成物関連不純物が少なくとも１つのＮ－１不純物を含み、これにより生成物関連不純物から標的オリゴヌクレオチドが分離される、方法である。

【0010】

本発明の第２の実施形態は、標的のチオール化オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約４０～約１００％の動的負荷容量において、希釈された混合物を疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、生成物関連不純物が少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を含み、これにより生成物関連不純物から標的オリゴヌクレオチドが分離される、方法である。

【0011】

本明細書で使用されるとき、「生成物関連不純物」とは、標的オリゴヌクレオチドの合成中に発生する不要な副産物を指す。ある特定の実施形態では、生成物関連不純物は、ｉ）Ｎ－１不純物、ｉｉ）Ｐ＝Ｏ不純物、またはｉｉｉ）それらの組み合わせ、またはｉｖ）これら３つのうちのいずれかの混合物である。本明細書で使用されるとき、「Ｎ－１不純物」とは、カップリング反応の失敗が原因で、標的オリゴヌクレオチドと比べていずれかの位置で１つのヌクレオシドが欠損しているオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用されるとき、「Ｐ＝Ｏ不純物」とは、硫化反応の失敗または合成後の意図せぬ酸化が原因で、標的オリゴヌクレオチドの望ましいホスホロチオエート結合の代わりにホスホジエステル結合を含有するオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第１の実施形態に関して記載される方法を使用して、Ｎ－１不純物と併せてＰ＝Ｏ不純物を除去することができる。ある特定の実施形態では、第２の実施形態に関して記載される方法を使用して、Ｐ＝Ｏ不純物と併せてＮ－１不純物を除去することができる。

【0012】

ある特定の実施形態では、生成物関連不純物は、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物及び／またはＮ＋１不純物を含む場合もある。本明細書で使用されるとき、「Ｎ＋１不純物」とは、標的オリゴヌクレオチドと比べていずれかの位置で１つの更なるヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用されるとき、「脱塩基不純物」とは、標的オリゴヌクレオチドと比較して核酸塩基を欠損している１つ以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドであり、ここでヌクレオシドは、以下に示す構造、

【0013】

【化1】

【0014】

を有する。

【0015】

脱塩基不純物の例示的な構造を図３に示す。特定の実施形態では、脱塩基不純物において欠損している核酸塩基は、アデノシン及び／またはグアニンである。本明細書で使用されるとき、「ＣＮＥｔ」不純物とは、標的オリゴヌクレオチドの非修飾チミン核酸塩基の代わりに修飾チミン核酸塩基を含有するオリゴヌクレオチドであり、ここで修飾チミン核酸塩基は、以下の構造、

【0016】

【化2】

【0017】

を有する。ＣＮＥｔ不純物の例示的な構造を図３に示す。

【0018】

ある特定の実施形態では、生成物関連不純物は、ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）不純物を含む。本明細書で使用されるとき、「ショートマー不純物」とは、標的オリゴヌクレオチドと比べていずれかの位置で１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くのヌクレオシドが欠損しているオリゴヌクレオチドである。

【0019】

ある特定の実施形態では、生成物関連不純物は、初期溶出不純物（ＥＥＩ：ｅａｒｌｉｅｒ－ｅｌｕｔｉｎｇ ｉｍｐｕｒｉｔｙ）を含む。本明細書で使用されるとき、「初期溶出不純物」とは、本明細書に記載の精製方法を使用した場合に標的オリゴヌクレオチドの前に溶出する不純物である。一実施形態では、ＥＥＩは、Ｎ－１不純物等のショートマー不純物、Ｐ＝Ｏ不純物、及び／または脱塩基不純物を含む。

【0020】

ある特定の実施形態では、生成物関連不純物は、後期溶出不純物（ＬＥＩ：ｌａｔｅｒ－ｅｌｕｔｉｎｇ ｉｍｐｕｒｉｔｙ）を含む。本明細書で使用されるとき、「後期溶出不純物」とは、本明細書に記載の精製方法を使用した場合に標的オリゴヌクレオチドの後に溶出する不純物である。一実施形態では、ＬＥＩは、Ｎ＋１不純物を含む。

【0021】

「オリゴヌクレオチド」とは、複数の結合したヌクレオシドを含む化合物を意味する。ある特定の実施形態では、複数のヌクレオシドのうちの１つ以上は修飾されている。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡのみ、ＤＮＡのみを含むか、またはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む。特定の実施形態では、標的オリゴヌクレオチドはギャップマーである。「ギャップマー」とは、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内部領域が１個以上のヌクレオシドを有する外部領域間に位置付けられるキメラ化合物を意味し、内部領域を含むこれらのヌクレオシドは、外部領域を含むヌクレオシドまたは複数のヌクレオシドとは化学的に異なる。ある特定の実施形態では、標的オリゴヌクレオチドは、１０～１００、１０～５０、１０～２５、１５～１００、１５～５０、または１５～２５個のヌクレオチドを含む。

【0022】

「ヌクレオシド」とは、核酸塩基及び糖部分を含む化合物を意味する。ヌクレオシドとしては、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに模倣塩基及び／または糖基を有するヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。「修飾ヌクレオシド」とは、天然に存在するＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオシドと比較して少なくとも１つの修飾を含むヌクレオシドである。そのような修飾は、糖部分及び／または核酸塩基にあってもよい。ヌクレオシドは、核酸塩基または糖部分のいずれかにおいて、多様な置換基のうちのいずれで修飾されていてもよい。

【0023】

「ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドの一部として２つのヌクレオシドをひとつに結合させる結合基を含むヌクレオシドを指す。結合基の２つの主なクラスは、リン原子の存在または非存在によって定義される。代表的なリン含有結合としては、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン不含結合基としては、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）、シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）_２－Ｏ－）、及びＮ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、結合基は、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）またはホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。ある特定の実施形態では、第１及び第２の実施形態に関して記載される方法の標的オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、またはそれらの組み合わせのみを結合基として含む。

【0024】

「核酸塩基」は、ヌクレオシドの複素環塩基部分を意味する。ある特定の実施形態では、核酸塩基は、別の核酸の核酸塩基に水素結合することが可能な任意の原子または原子群を含み得る。核酸塩基は、天然に存在してもよいし、または修飾されていてもよい。「非修飾」または「天然」核酸塩基、例えばプリン核酸塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン核酸塩基のチミン（Ｔ）（または５－メチルウラシル）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）に加えて、例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、７－デアザプリン、及び５－ヒドロキシメチルシトシンを含む、当業者に公知である多くの修飾核酸塩基または核酸塩基模倣物が、第１または第２のいずれかの実施形態に記載の方法によって分離される標的オリゴヌクレオチドへの組み込みに適している。ある特定の実施形態では、この方法は、第１または第２の実施形態に関して記載されるとおりであり、核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン（５－メチルウラシル）、及び５－メチルシトシンから選択される。

【0025】

「糖部分」とは、天然糖もしくは修飾糖、または糖代用物を意味する。

【0026】

「天然糖」とは、ＤＮＡ（２’－Ｈ）またはＲＮＡ（２’－ＯＨ）のリボフラノース部分を意味する。

【0027】

「修飾糖」とは、天然糖のもの以外の少なくとも１つの置換基を含むリボフラノース部分を意味する。そのような修飾は、限定されないが、置換基の付加、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための非ジェミナル環原子の架橋、リボシル環酸素原子の、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ^１）（Ｒ）^２（Ｒは、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、または保護基である）への置き換え、及びこれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、糖は、ＨまたはＯＨ以外の置換基を含むように２’位で修飾されている（「２’修飾」または「２’置換」）。代替的には、修飾は、糖の５’位にある。ある特定の実施形態では、糖は、糖の２’位及び５’位で修飾されている。

【0028】

本発明で有用な糖修飾の例としては、ＯＨ、Ｆ、Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル（ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）から選択される糖置換基を含む化合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、そのような置換基は、ハライド（Ｆを含むがこれに限定されない）、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、－ＯＣＦ_３、Ｏ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－ＣＨ_３、２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、またはＯ－ＣＨ_２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）（式中、各Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ_１～Ｃ_１０アルキルである）の中から選択される。特に、第１及び第２の実施形態に記載の方法において使用するのに好適な修飾ヌクレオシドは、２’－メトキシエトキシ（「ＭＯＥ」もしくは「２’－ＭＯＥ」または「２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３」）、２’－Ｏ－メチル（「２’－ＯＭｅ」または２’－Ｏ－ＣＨ_３）、または２’－フルオロ（２’－Ｆ）である。

【0029】

ある特定の実施形態では、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２（式中、ｎ及びｍは独立して、１～約１０である）から選択される置換基を２’位に有する修飾ヌクレオシドである。他の２’－糖置換基としては、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクリル、及びアミノアルキルアミノが挙げられる。

【0030】

ある特定の実施形態では、アセチル（Ａｃ）；ベンゾイル（Ｂｚ）；ベンジル（Ｂｎ）；β－メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）；ジメトキシトリチル、［ビス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）；メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）；メトキシトリチル［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル、ＭＭＴ）；ｐ－メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）；メチルチオメチルエーテル；ピバロイル（Ｐｉｖ）；テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；トリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）；シリルエーテル（トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）エーテル、トリ－イソ－プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）エーテル、及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテルを含むがこれらに限定されない）；メチルエーテル、エトキシエチルエーテル（ＥＥ）、及び５’－Ｏ－（α－メチル－６－ニトロピペロニルオキシカルボニル）（ＭｅＮＰＯＣ）から選択される酸素原子の置換基を５’位に有する修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、５’位は－ＯＤＭＴである。

【0031】

修飾糖部分を有するヌクレオシドの例は、限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル、５’－ＯＤＭＴ、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、及び２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３の置換基を含むヌクレオシドを含む。

【0032】

ある特定の実施形態では、２’－糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位のいずれかにある。ある特定のそのような実施形態では、２’－アラビノ修飾は、２’－Ｆアラビノ（ＦＡＮＡ）である。また、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上または２’－５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位において同様の修飾を行うこともできる。

【0033】

本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語は、完全に飽和した分枝状または非分枝状の炭化水素部分を指す。好ましくは、アルキルは、１～２０個の炭素原子、より好ましくは１～１６個の炭素原子、１～１０個の炭素原子、１～６個の炭素原子、または１～４個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、アルキルは、６～２０個の炭素原子を含む。アルキルの代表的な例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、またはｎ－デシルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0034】

「アルケニル」とは、直鎖状でも分枝状でもよく、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和炭化水素基を指す。２～６個の炭素原子を有するアルケニル基が好ましい場合がある。アルケニル基は、１つ、２つ、または３つ以上の炭素－炭素二重結合を含有してもよい。アルケニル基の例としては、エテニル、ｎ－プロペニル、イソプロペニル、ｎ－ブタ－２－エニル、ｎ－ヘキサ－３－エニル等が挙げられる。

【0035】

「アルキニル」とは、直鎖状でも分枝状でもよく、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和炭化水素基を指す。２～６個の炭素原子を有するアルキニル基が好ましい場合がある。アルキニル基は、１つ、２つ、または３つ以上の炭素－炭素三重結合を含有してもよい。アルキニル基の例としては、エチニル、ｎ－プロピニル、ｎ－ブタ－２－イニル、ｎ－ヘキサ－３－イニル等が挙げられる。

【0036】

「アリール」という用語は、環部分に６～１４個の炭素原子を有する、単環式、二環式、または三環式の芳香族炭化水素基を指す。一実施形態では、アリールという用語は、６～１０個の炭素原子を有する単環式及び二環式の芳香族炭化水素基を指す。アリール基の代表的な例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、及びアントラセニルが挙げられる。「アリール」という用語は、少なくとも１つの環が芳香族であり、かつ１つまたは２つの非芳香族炭化水素環（複数可）に縮合している、二環式または三環式基も指す。非限定的な例としては、テトラヒドロナフタレン、ジヒドロナフタレニル、及びインダニルが挙げられる。「アリールアルキル」とは、アルキレンリンカーを介して分子の残部に結合したアリール基である。「アルカリール」とは、アリーレンリンカーを介して分子の残部に結合したアルキル基である。

【0037】

本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」という用語は、飽和または不飽和の、単環式または二環式の環系（例えば、架橋環系またはスピロ環系）で、３～７つの環員、または特に３～６つの環員もしくは５～７つの環員を有し、環員のうち少なくとも１つがヘテロ原子であり、環員のうち最大４つ（例えば、１、２、３、または４つ）がヘテロ原子であり得るものを指し、ここでヘテロ原子は、独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択され、Ｃは酸化型（例えば、Ｃ（Ｏ））であってよく、Ｎは酸化型（例えば、Ｎ（Ｏ））または四級化型であってよく、Ｓは任意選択でスルホキシド及びスルホンに酸化されていてもよい。不飽和の複素環式環は、ヘテロアリール環を含む。本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」という用語は、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１～４つのヘテロ原子を有する、芳香族の５員または６員の単環式環系を指し、ここでＮは酸化型（例えば、Ｎ（Ｏ））または四級化型であってよく、Ｓは任意選択でスルホキシド及びスルホンに酸化されていてもよい。一実施形態では、ヘテロシクリルは、３～７員の飽和単環式環、または３～６員の飽和単環式環、または５～７員の飽和単環式環である。一実施形態では、ヘテロシクリルは、３～７員の単環式環、または３～６員の単環式環、または５～７員の単環式環である。別の実施形態では、ヘテロシクリルは、６員または７員の二環式環である。ヘテロシクリル基は、ヘテロ原子または炭素原子に結合していてもよい。

【0038】

「二環式ヌクレオシド」または「ＢＮＡ」とは、ヌクレオシドの糖部分が、糖環の２つの炭素原子をつなぐ架橋を含むことにより、二環式糖部分が形成されたヌクレオシドを意味する。ＢＮＡの例は、限定されないが、リボシル環の４’及び２’の原子間に架橋を含むヌクレオシド（「４’－２’二環式ヌクレオシド」）、例えば、糖環の２’炭素原子と４’炭素原子とをつなぐようにフラノース環の２つの炭素原子をつなぐ架橋を含むフラノース環を含む。

【0039】

ある特定の実施形態では、標的オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＢＮＡヌクレオシドを含み、ここで架橋は、式：４’－β－Ｄ－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（β－Ｄ－ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ_２）－Ｓ－２；４’－α－Ｌ－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（α－Ｌ－ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－Ｃ（ＣＨ_３）_２－Ｏ－２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２を参照のこと）；４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’（「ｃＥｔ」）及び４’－Ｃ－Ｈ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’（２００８年７月１５日に交付された米国特許第７，３９９，８４５号を参照のこと）；４’－ＣＨ_２－Ｎ（ＯＣＨ_３）－２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１を参照のこと）；４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－２’（２００４年９月２日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００４－０１７１５７０号を参照のこと）；４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（２００８年９月２３日に交付された米国特許第７，４２７，６７２号を参照のこと）；４’－ＣＨ_２－Ｃ（ＣＨ_３）－２’及び４’－ＣＨ_２－Ｃ（＝ＣＨ_２）－２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４を参照のこと）のうちの１つを含み、式中、Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、または保護基である。ある特定の実施形態では、本発明は、二環式糖部分ではない修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを提供する。

【0040】

「糖代用物」とは、ヌクレオシドの糖の代わりになることができるリボフラノース環以外の構造を意味する。糖代用物の例としては、６員環、酸素が例えば硫黄または窒素に置き換えられて例えばモルホリノを形成した糖、及び４’－チオ含有糖が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

ある特定の実施形態では、第１または第２のいずれかの実施形態に記載の方法によって分離される標的オリゴヌクレオチドは、
ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１）
の配列（５’から３’）を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、ここで、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオシドであり、各シトシンは、５’－メチルシトシンである。配列番号１はＢＩＩＢ０５８としても知られ、ＷＯ２００７／００２３９０、ＷＯ２０１０／１４８２４９、及びＵＳ８，９８０，８５３に記載されており、各々の教示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0042】

ある特定の実施形態では、第１または第２のいずれかの実施形態に記載の方法によって分離される標的オリゴヌクレオチドは、
ＣＡＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴ（配列番号２）
の配列（５’から３’）を有する５－１０－５ ＭＯＥギャップマーであり、ここで、ヌクレオシド１～５及び１６～２０の各々は、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド６～１５の各々は、２’－デオキシヌクレオシドであり、ヌクレオシド２～３、４～５、１６～１７、及び１８～１９の間のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合であり、ヌクレオシド１～２、３～４、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１２～１３、１３～１４、１４～１５、１５～１６、１７～１８、及び１９～２０の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５’－メチルシトシンである。配列番号２は、次の化学表記：ｍＣｅｓ Ａｅｏ Ｇｅｓ Ｇｅｏ Ａｅｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ ｍＣｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ ｍＣｅｏ Ａｅｓ Ｇｅｏ ｍＣｅｓ Ｔｅによって記述され、ここで、
Ａは、アデニンであり、
ｍＣは、５’－メチルシトシンであり、
Ｇは、グアニンであり、
Ｔは、チミンであり、
ｅは、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース修飾糖であり、
ｄは、２’－デオキシリボース糖であり、
ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
ｏは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。

【0043】

配列番号２はＢＩＩＢ０６７またはＩＳＩＳ ６６６８５３としても知られ、ＷＯ２０１５１５３８００に記載されており、この教示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0044】

疎水性吸着剤（すなわち、「疎水性樹脂」）とは、第１及び第２の実施形態に記載の方法において標的オリゴヌクレオチドが生成物関連不純物から分離され得るように標的オリゴヌクレオチドが結合する任意の物質である。例えば、疎水性吸着剤は、親水性炭水化物：架橋アガロース、及び合成コポリマー物質を含む。特に、疎水性吸着剤は、フェニル、ブチル、またはヘキシルのいずれかを含む。例えば、Ｈｅｘｙｌ６５０Ｃは好適な疎水性吸着剤である。更に、疎水性吸着剤は、少なくとも１５ｃｍ、例えば少なくとも２０ｃｍ、少なくとも２５ｃｍ、もしくは少なくとも３０ｃｍ；または約１５ｃｍ～約３０ｃｍ；約１５ｃｍ～２０ｃｍ、約２０～約２５ｃｍ、もしくは約２５ｃｍ～約３０ｃｍの床高で充填される。

【0045】

「動的負荷容量」は、典型的な流動条件下でクロマトグラフィー樹脂に結合する生成物（例えば、オリゴヌクレオチド生成物）の量と定義され、当業者に公知の数ある負荷因子の中でもとりわけ、特定の流動条件及び負荷塩濃度において決定される。これは、生成物レベルがフロースルー（「破過点」と称される）において測定される前に負荷され得る量に基づいて計算される。特に、分離しようとする物質は、流動様式において（バッチ方式で行われる静的様式とは対照的に）、特定の流速、例えば、約１００～約２５０ｃｍ／時間、特に２００ｃｍ／時間で樹脂に適用される。当業者であれば、塩中の生成物の溶解度に基づいてその塩の濃度を選択し、また、ビーズサイズ、床高、及び他の変数に基づいて流速を選択して、入り口圧力を超えないようにして特定の動的負荷比を達成する方法が分かるであろう。

【0046】

例えば、オリゴヌクレオチド混合物に対する疎水性吸着剤の容量が５０ｍｇ／ｍＬ（動的）である場合、５０ｍｇ／ｍＬの混合物の適用は、１００％の動的負荷容量におけるものとなる。同様に、５０ｍｇ／ｍＬの疎水性吸着剤に対して、２５ｍｇ／ｍＬの混合物の適用は、５０％の動的負荷容量におけるものとなる。第１の実施形態に記載の方法では、動的負荷容量は、約３２％～約７８％、例えば、約３２％～約４５％、約４０％～約５０％、約４５％～約５５％、約５０％～約６０％、約５５％～約６５％、約６０～約７０％、約６５％～約７８％、または約３２％～約５０％、約４０～約７５％、または約５０％～約７８％である。第２の実施形態に記載の方法では、動的負荷容量は、約４０％～約１００％、例えば、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約９０～約１００％、約４０％～約７５％、または約４０％～約６０％、または約４０％～約８０％である。第１及び第２の両実施形態に記載の方法では、動的負荷容量は、約４０％～約７８％、例えば、約４０％～約４５％、約４５％～約５０％、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５～約７０％、約７０％～約７５％、または約４０％～約５０％、約４０～約７５％、または約５０％～約７８％である。

【0047】

第３の実施形態では、この方法は、第１または第２のいずれかの実施形態に関して記載されるとおりであり、塩は混合物に塩水溶液として添加されるか、または塩は混合物に直接溶解される。特に、塩は、ＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、またはＮａ^＋のうちのいずれかのカチオン、及びＦ^－、［ＳＯ_４］^－２、［ＨＰＯ_４］^－２、酢酸イオン、もしくはＣｌ^－からなるいずれかのアニオン、またはそれらの組み合わせを含む。具体的には、塩は硫酸アンモニウムである。

【0048】

第４の実施形態では、この方法は、第１、第２、または第３の実施形態のいずれかに関して記載されるとおりであり、洗浄ステップの流速は負荷流速よりも遅い。特に、負荷ステップの流速は、約１５０ｃｍ／時間～約２５０ｃｍ／時間であり、洗浄ステップの流速は、約５０ｃｍ／時間～約１５０ｃｍ／時間であり、例えば、負荷ステップの流速は、約１７５ｃｍ／時間～約２２５ｃｍ／時間であり、洗浄ステップの流速は、約７５ｃｍ／時間～約１２５ｃｍ／時間である。特に、負荷ステップの流速は、約２００ｃｍ／時間からであり、洗浄ステップの流速は、約１００ｃｍ／時間からである。

【0049】

第５の実施形態では、この方法は、第１、第２、第３、または第４の実施形態のいずれかに関して記載されるとおりであり、溶離液は、水、塩水溶液、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコール、またはそれらの混合物から選択される。特に、塩は、ＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、またはＮａ^＋のうちのいずれかのカチオン、及びＦ^－、［ＳＯ_４］^－２、［ＨＰＯ_４］^－２、酢酸イオン、もしくはＣｌ^－からなるいずれかのアニオン、またはそれらの組み合わせを含む。特定すると、塩は硫酸アンモニウムである。

【0050】

第６の実施形態では、この方法は、第１、第２、第３、第４、または第５の実施形態のいずれかに関して記載されるとおりであり、溶出液の収集は、生成物の溶出ピークの最初の２～２５％、最初の２～１０％、最初の２～８％、最初の４～６％、最初の５～１０％、または最初の１０～２５％を含まないように遅延される。より具体的な実施形態では、収集は、生成物の溶出ピークの最初の５％を含まないように遅延される。特に、溶出液は複数の画分に収集され、画分サイズは、別々の画分中の生成物関連不純物から標的オリゴヌクレオチドを分離するように調節される。画分サイズは、オリゴヌクレオチドと生成物関連不純物との間の溶出時間の差、分離しようとする標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する粗生成物の量等に部分的に応じて、当業者によって容易に決定され得る。

【0051】

また第６の実施形態では、この方法は、第１、第２、第３、第４、または第５の実施形態のいずれかに関して記載されるとおりであり、溶出液の収集は、生成物の溶出ピークの最初と最後の２～２５％を含まない。より具体的には、溶出液の収集は、生成物の溶出ピークの最初と最後の２～１０％、最初と最後の２～８％、最初と最後の４～６％、最初と最後の５～１０％、または最初と最後の１０～２５％を含まない。別の具体的な実施形態では、溶出液の収集は、生成物の溶出ピークの最初と最後の５％を含まない。

【0052】

一実施形態では、イソクラチック洗浄方式として知られる洗浄ステップ中、洗浄液を一定に保つ。代替的には、グラジエント洗浄方式として知られる洗浄ステップ中、洗浄液を変化させる。グラジエント洗浄において、洗浄液は、高イオン強度または極性から低イオン強度または極性に変化させてよい。極性またはイオン強度の低下は、水溶液の塩濃度を低下させること、または、より極性のある溶媒、例えば水、もしくは他の極性溶媒、例えば、エチレンもしくはプロピレングリコールの、より高塩濃度の溶液に対する体積比を増加させることにより、達成することができる。代替的には、洗浄液は、低極性または高イオン強度から高極性または低イオン強度に変化させてもよい。別の代替形態では、グラジエント洗浄ステップの後にイソクラチック洗浄ステップが続いてもよく、またはその逆であってもよい。

【0053】

一実施形態では、イソクラチック溶出方式として知られる溶出中、溶離液を一定に保つ。代替的には、グラジエント溶出方式として知られる溶出中、溶離液を変化させる。グラジエント溶出において、溶離液は、高イオン強度または低極性から低イオン強度または高極性に変化させてよい。極性の上昇またはイオン強度の低下は、水溶液の塩濃度を低下させること、または、より極性のある溶媒、例えば水、もしくは他の極性溶媒、例えば、エチレンもしくはプロピレングリコールの、より高塩濃度の溶液に対する体積比を増加させることにより、達成することができる。代替的には、溶離液は、低極性または高イオン強度から高極性または低イオン強度に変化させてもよい。別の代替形態では、グラジエント溶出の後にイソクラチック溶出が続いてもよく、またはその逆であってもよい。

【0054】

一実施形態では、本明細書に記載される本発明の方法は、ＥＥＩ及び／またはＬＥＩを除去することもできる。別の実施形態では、本明細書に記載される本発明の方法は、ショートマー不純物、Ｎ＋１不純物、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及びＰ＝Ｏ不純物から選択される少なくとも１つの生成物関連不純物を除去することができる。別の実施形態では、本明細書に記載される本発明の方法は、Ｎ－１不純物、Ｐ＝Ｏ不純物、ならびに、Ｎ－１不純物以外のショートマー不純物、Ｎ＋１不純物、脱塩基不純物、及びＣＮＥｔ不純物から選択される少なくとも１つの生成物関連不純物を除去することができる。別の実施形態では、本明細書に記載される本発明の方法は、Ｎ－１不純物、Ｐ＝Ｏ不純物、Ｎ－１不純物以外のショートマー不純物、Ｎ＋１不純物、脱塩基不純物、及びＣＮＥｔ不純物を除去することができる。

【0055】

「標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から標的オリゴヌクレオチドを分離すること」または「生成物関連不純物を除去すること」とは、本明細書に記載の生成物関連不純物、例えばＮ－１不純物、Ｐ＝Ｏ不純物、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、またはＮ＋１不純物のうちの１つ以上の、少なくとも１５％、例えば、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％を、混合物から除去することを意味する。

【実施例】

【0056】

実施例１ Ｎ－１不純物またはＰ＝Ｏ不純物の除去
物質：
カラム：６．８４ｍＬ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ高置換
床高：２０ｃｍ
生成物希釈緩衝液：８５０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
平衡化緩衝液：８００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
粗生成物負荷：７６５ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
洗浄緩衝液：４４０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
溶出緩衝液：４０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
ストリップ：脱イオン水
定置洗浄：１Ｎ水酸化ナトリウム
保存：０．１Ｎ水酸化ナトリウム
ＵＶモニタ：２９５ｎｍ

【0057】

方法：
－試料の調製：試料（配列番号２）を希釈緩衝液で１０倍に希釈した（最終的な硫酸アンモニウム濃度は７６５ｍＭである）。
－サイクル法：２００ｃｍ／時間で４カラム体積（ＣＶ）の８００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）によりカラムを平衡化した。次の３つの異なる動的負荷容量において、２００ｃｍ／時間の速度で試料を負荷した：
ラン１：８．８％の動的負荷容量で負荷。
ラン２：４７％の動的負荷容量で負荷。
ラン３：１００％の動的負荷容量で負荷。
１００ｃｍ／時間で７ＣＶの４４０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）を用い、カラムを洗浄した。２００ｃｍ／時間で６ＣＶの４０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）を用い、カラム溶出を行った。２００ｃｍ／時間で２ＣＶの脱イオン水を用い、カラムのストリッピングを行った。２００ｃｍ／時間で３ＣＶの１Ｎ水酸化ナトリウムによりカラムを清浄にし、２００ｃｍ／時間で３ＣＶの０．１Ｎ水酸化ナトリウム中に保存した。

【0058】

結果：
ｎ－１不純物及びＰ＝Ｏ不純物の相対除去量を、それぞれ、以下の表１及び２に提供する。

【0059】

【表1】

【0060】

【表2】

【0061】

表１及び２に記載の結果に基づくと、ｎ－１不純物及びＰ＝Ｏ不純物を除去するためには適切な動的負荷容量の使用が必要である。

【0062】

実施例２ 動的負荷容量とＰ＝Ｏ不純物除去との間の関係
実験計画法（ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ（商標）ｖ９）ソフトウェアを使用し、Ｐ＝Ｏ生成物関連不純物の除去に対する動的負荷容量の影響の評価を完了した。統計的設計法の種類は、中心複合であった。研究の種類は、応答曲面法であった。床高２０ｃｍ及び動的結合容量４５ｍｇ／ｍＬのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用い、５０ランを行った。洗浄緩衝液は４４０ｍＭ硫酸アンモニウムであり、溶出緩衝液は４０ｍＭ硫酸アンモニウムであった。それぞれ７カラム体積及び６カラム体積の洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を使用した。実施例１において上記したものと同じ条件を使用し、配列番号２をオリゴヌクレオチドとして使用した。

【0063】

この分析の結果は、Ｐ＝Ｏ不純物に関しては、負荷容量が４２％～１００％（すなわち、図１のチャートにおいて１９ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬ）のとき、Ｐ＝Ｏ不純物の除去が改善することを示す。

【0064】

実施例３ 動的負荷容量とＮ－１不純物除去との間の関係
Ｎ－１生成物関連不純物の除去に対する動的負荷容量の影響の評価を図２に示す。図２には５ランがプロットされており、これらは、４５ｍｇ／ｍＬの疎水性吸着剤の９、２４、４７、６９、及び１００％の負荷容量に対応する。Ｎ－１の低減率は、粗生物中のＮ－１の出発レベルから計算した。この分析により、負荷比がＮ－１の低減において重要な唯一の因子であると結論された。したがって、この統計分析によれば、他の変数は、Ｎ－１の低減に対して重要でない。

【0065】

物質：
カラム：６．８４ｍＬ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ高置換（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐ／Ｃ：１７－０９７３－０５）
床高：２０ｃｍ
生成物希釈緩衝液：８５０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
平衡化緩衝液：８００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
粗生成物負荷：７６５ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
洗浄緩衝液：４４０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
４００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
溶出緩衝液：４０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
ストリップ：脱イオン水
定置洗浄：１Ｎ水酸化ナトリウム
保存：０．１Ｎ水酸化ナトリウム
ＵＶモニタ：２９５ｎｍ

【0066】

方法：
－試料の調製：試料（配列番号２）を希釈緩衝液で１０倍に希釈した（最終的な硫酸アンモニウム濃度は７６５ｍＭである）。
－サイクル法：２００ｃｍ／時間で４カラム体積（ＣＶ）の８００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）によりカラムを平衡化した。表３に示した５つの異なる負荷比において、２００ｃｍ／時間の速度で試料を負荷した。

【0067】

【表3】

【0068】

表３に規定の洗浄緩衝液及びＣＶを用い、１００ｃｍ／時間でカラムを洗浄した。表３に規定の溶出緩衝液及びＣＶを用い、２００ｃｍ／時間でカラム溶出を行った。２００ｃｍ／時間で２ＣＶの脱イオン水を用い、カラムのストリッピングを行った。２００ｃｍ／時間で３ＣＶの１Ｎ水酸化ナトリウムによりカラムを清浄にし、２００ｃｍ／時間で３ＣＶの０．１Ｎ水酸化ナトリウム中に保存した。

【0069】

図２に示すように、負荷容量が４０％～７８％であるとき、Ｎ－１不純物の除去が改善する。

【0070】

実施例４ 脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、またはＮ＋１不純物の除去
物質：
カラム：８１ｍＬ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ高置換を充填
床高：１５ｃｍ、ベッド直径：２．６ｃｍ
生成物希釈緩衝液：５７５ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
平衡化緩衝液：５００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
粗生成物負荷：５００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
洗浄緩衝液：２５０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
溶出緩衝液：１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
ストリップ：水
定置洗浄：１Ｎ水酸化ナトリウム
保存：０．１Ｎ水酸化ナトリウム
ＵＶモニタ：２９５ｎｍ

【0071】

方法：
－試料の調製：粗試料（配列番号１）を生成物希釈緩衝液で７．７倍に希釈した（最終的な硫酸アンモニウム濃度は５００ｍＭである）。
－クロマトグラフィーカラム法：１５０ｃｍ／時間で５カラム体積（ＣＶ）の５００ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）によりカラムを平衡化した。希釈した粗試料を、４７％（２６．５ｍｇ生成物／ｍＬ樹脂）の動的負荷容量において１５０ｃｍ／時間の流速で負荷した。

【0072】

７５ｃｍ／時間で７ＣＶの２５０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）を用い、カラムを洗浄した。１５０ｃｍ／時間で９ＣＶの１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）を用い、カラム溶出を行い、ピークを収集した。１５０ｃｍ／時間で３ＣＶの脱イオン水を用い、カラムのストリッピングを行った。１５０ｃｍ／時間で３ＣＶの１Ｎ水酸化ナトリウムによりカラムを清浄にし、１５０ｃｍ／時間で３ＣＶの０．１Ｎ水酸化ナトリウム中に保存した。

【0073】

結果：
粗生物中の量に対する脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及びＮ＋１不純物の相対除去量を、それぞれ、以下の表４、５、及び６に提供する。

【0074】

【表4】

【0075】

【表5】

【0076】

【表6】

【0077】

表４、５、及び６に記載の結果に基づくと、ＨＩＣカラムの動的結合容量の中心で負荷を行うことで、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及びＮ＋１不純物の除去が可能になる。
発明の態様
［態様１］標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約３２～約７８％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのｎ－１不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。
［態様２］標的のチオール化オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約４０～約１００％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。
［態様３］前記塩が前記混合物に塩水溶液として添加されるか、または前記塩が前記混合物に直接溶解される、態様１または２に記載の方法。
［態様４］前記洗浄ステップの流速が負荷流速よりも遅い、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様５］前記溶離液が、水、塩水溶液、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコール、またはそれらの混合物から選択される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様６］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の１～２５％を含まないように遅延される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様７］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の１０～２５％を含まないように遅延される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様８］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の５～１０％を含まないように遅延される、態様１～６のいずれかに記載の方法。
［態様９］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の１～２５％を含まない、態様１～８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の５～１０％を含まない、態様９に記載の方法。
［態様１１］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の１０～２５％を含まない、態様９に記載の方法。
［態様１２］前記疎水性吸着剤が少なくとも１５ｃｍの床高で充填される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１３］前記塩が、ＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、またはＮａ^＋のうちのいずれかのカチオン、及びＦ^－、［ＳＯ_４］^－２、［ＨＰＯ_４］^－２、酢酸イオン、もしくはＣｌ^－からなるいずれかのアニオン、またはそれらの組み合わせを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１４］前記塩が硫酸アンモニウムである、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１５］前記疎水性吸着剤が、フェニル、ブチル、またはヘキシルを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１６］前記標的オリゴヌクレオチドが１５～２５個のヌクレオチドを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１７］前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン（５－メチルウラシル）、シトシン、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、７－デアザプリン、及び５－ヒドロキシメチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１８］前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン（５－メチルウラシル）、及び５－メチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１９］前記標的オリゴヌクレオチドが、任意選択で置換されている糖を含むか、２つの非ジェミナル環原子が架橋して二環式核酸（ＢＮＡ）を形成しているか、または、前記糖の環酸素原子が、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、もしくはＣ（Ｒ_１）（Ｒ）_２（式中、ＲはＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルである）、及びこれらの組み合わせに置き換えられている、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２０］前記糖が、２’位において、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２（式中、ｎ及びｍは独立して、１～約１０である）で置換されている、態様１９に記載の方法。
［態様２１］前記糖が、２’においてＯ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３で置換されている、態様１９に記載の方法。
［態様２２］前記標的オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡのみ、ＤＮＡのみ、またはＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２３］前記標的オリゴヌクレオチドがギャップマーである、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２４］前記標的オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、またはそれらの組み合わせを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２５］前記標的オリゴヌクレオチドの配列が（配列番号１）である、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２６］前記標的オリゴヌクレオチドの配列が（配列番号２）である、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２７］前記標的オリゴヌクレオチドが、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２８］前記標的オリゴヌクレオチドが、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を含まない、態様１～２７のいずれかに記載の方法。
［態様２９］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を更に含む、態様１に記載の方法。
［態様３０］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのｎ－１不純物を更に含む、態様２に記載の方法。
［態様３１］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つの脱塩基不純物を更に含む、態様１～３０のいずれかに記載の方法。
［態様３２］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＣＮＥｔ不純物を更に含む、態様１～３１のいずれかに記載の方法。
［態様３３］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＮ＋１不純物を更に含む、態様１～３２のいずれかに記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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