特許 7075494 シュードペドバクターサルタンス由来フコース転移酵素を用いた２’－フコシルラクトースの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-17

(45)【発行日】2022-05-25

(54)【発明の名称】シュードペドバクターサルタンス由来フコース転移酵素を用いた２’－フコシルラクトースの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20220518BHJP

   C12P 19/12 20060101ALI20220518BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20220518BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20220518BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20220518BHJP

   C12N 15/61 20060101ALN20220518BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12P19/12

C12N15/54

C12N15/60

C12N15/52 Z

C12N15/61

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020544739

(86)(22)【出願日】2019-02-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-06-17

(86)【国際出願番号】 KR2019001837

(87)【国際公開番号】W WO2019194410

(87)【国際公開日】2019-10-10

【審査請求日】2020-08-25

(31)【優先権主張番号】10-2018-0039121

(32)【優先日】2018-04-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0017144

(32)【優先日】2019-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517399125

【氏名又は名称】アドヴァンスド プロテイン テクノロジーズ コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．

【住所又は居所原語表記】１４７， Ｇｗａｎｇｇｙｏ－ｒｏ， Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ－ｇｕ， Ｓｕｗｏｎ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １６２２９， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100121382

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 託嗣

(72)【発明者】

【氏名】シン，チョル ス

(72)【発明者】

【氏名】ユン，ジョン ウォン

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ヨン ハ

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ヨン ソン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ボ ミ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジン キョン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ガ ウン

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】韓国登録特許第１０－１５４４１８４（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】国際公開第２０１７／１８８６８４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１５３３００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J.Biotechnol.，2015年，Vol.210，p.107-115

【文献】Bioprocess Biosyst. Eng.，2013年，Vol.36，p.749-756

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｐ １９／１２

Ｃ１２Ｎ １５／５４

Ｃ１２Ｎ １５／６０

Ｃ１２Ｎ １５／５２

Ｃ１２Ｎ １５／６１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）から由来した配列番号５に該当するアミノ酸配列を有するα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現するように形質転換され、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現するように形質転換され、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現するように形質転換され、ラクトースパーミアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現するように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする、組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物。

【請求項2】

前記組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）及びコリネバクテリウムサーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）の中から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物。

【請求項3】

前記配列番号５に該当するアミノ酸配列を有するα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、配列番号４に記載の核酸配列に暗号化されたことを特徴とする、請求項１に記載の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物。

【請求項4】

前記組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過剰発現(overexpression)するように形質転換され、ＧＴＰ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過剰発現するように形質転換されたことを特徴とする、請求項１に記載の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物。

【請求項5】

ラクトース添加の培地にて、請求項１の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物を培養することを特徴とする、２’－フコシルラクトースの生産方法。

【請求項6】

前記培地は、グルコースをさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の２’－フコシルラクトースの生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、２’－フコシルラクトース（２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ，２’－ＦＬ）の生産方法に関し、より具体的には、シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）から由来したフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を挿入した、組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物で２’－フコシルラクトースを生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人の母乳には、２００余種以上の独特の構造を持つオリゴ糖（ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＨＭＯ）が、他の哺乳類の乳に比べて非常に高い濃度（５～１５ｇ／Ｌ）で存在する。ＨＭＯは、Ｄ－グルコース（Ｇｌｃ）、Ｄ－ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｅｔｙｌグルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ）、Ｌ－フコース（Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ，Ｆｕｃ）、及びシアル酸（ｓｉａｌｃ ａｃｉｄ）［Ｓｉａ；Ｎ－ａｃｅｔｙｌ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｎｅｕ５Ａｃ）］で構成されている。

【0003】

ＨＭＯの構造は非常に多様で複雑なため、異なる残基及びグリコシル結合を有する２００個程度の異性体が、互いに異なる重合度（ＤＰ３－２０）で存在しうる。ただし、構造的複雑性にもかかわらず、ＨＭＯはいくつかの共通した構造を示すが、大部分のＨＭＯは、還元末端にラクトース（Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）残基を有する。ラクトースのＧａｌは、α－（２，３）－とα－（２，６）－結合により、それぞれ３－シアリルラクトース（３－ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ）又は６－シアリルラクトース（６－ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ）の形態にシアル化し、α－（１，２）－とα－（１，３）－結合により、それぞれ２－フコシルラクトース（２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ，２’－ＦＬ）又は３－フコシルラクトース（３’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ，３－ＦＬ）の形態にフコシル化（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されうる。

【0004】

母乳において、最も含有量の高いオリゴ糖３種を含めて１３７種のオリゴ糖がフコシル化されていて約７７％を占め、残りのオリゴ糖は、大部分がシアル化されたもの（３９個）であって、約２８％を占める。特に、２－フコシルラクトース及び３－フコシルラクトースは、腸内乳酸菌の生育を手伝うプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）効果、病原菌感染の予防、免疫システムの調節及び頭脳の発達など、乳児の発達及び健康に肯定的影響を及ぼす様々な生物学的活性を提供する主要なＨＭＯであるので、幼児期の母乳の授乳は非常に重要である、と専門家たちは強調している。

【0005】

しかしながら、女性の約２０％は、フコシルオリゴ糖（ｆｕｃｏｓｙｌ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を合成するフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の変異のため、体内でそれらを十分に合成できないものとして知られている。このため、フコシルラクトースの産業的生産が必要なのが実情である。

【0006】

一方、フコシルラクトースの生産方法には、母乳から直接抽出する方法、及び、化学的又は酵素的方法で合成する方法がある。直接抽出する方法は、母乳供給の限界及び低い生産性が問題であり、化学的合成法は、高価の基質、低い異性体選択性（ｓｔｅｒｅｏ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）及び生産収率、毒性の有機溶媒の使用などの問題がある。また、酵素的合成法は、フコースの供与体（ｄｏｎｏｒ）として用いられるＧＤＰ－Ｌ－フコースが非常に高価であり、また、フコース転移酵素の精製に高いコストがかかるという問題点がある。

【0007】

上記のような問題点から、直接抽出、化学的又は酵素的生産法はフコシルラクトースの大量生産に適用し難く、その解決策として、微生物を用いた２’－フコシルラクトースの生産が提案されている。微生物を用いた２’－フコシルラクトースの生産の従来技術は、大部分が、組換え大腸菌を用いたものである。しかし、実験用に用いられる大部分の大腸菌は、実際には病原菌でないにもかかわらず、消費者には有害な菌との認識が強い。

【0008】

また、大腸菌の細胞膜成分がエンドトキシンとして作用し得るため、２’－フコシルラクトースの生産において分離精製に多くのコストがかかる。このため、食品及び医薬品の素材であるフコシルラクトースを生産する宿主細胞として、大腸菌を利用するには、困難があるのが実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明では、食品及び医薬品の素材であるフコシルラクトースを生産する宿主細胞として、シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）から由来したフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を挿入した、組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物を用いて２’－フコシルラクトースを生産する方法を提供しようとする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）から由来した配列番号５に該当するアミノ酸配列を有するα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現するように形質転換され、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現するように形質転換され、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現するように形質転換され、ラクトースパーミアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現するように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする、組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物を提供する。

【0011】

本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）及びコリネバクテリウムサーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）の中から選ばれるいずれか一つであるとよい。。

【0012】

本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物において、前記配列番号５に該当するアミノ酸配列を有するα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、好ましくは、配列番号４に記載の核酸配列に暗号化されたものがよい。

【0013】

本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物において、前記組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、好ましくは、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過剰発現(overexpression)するように形質転換され、ＧＴＰ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過剰発現(overexpression)するように形質転換されたものがよい。

【0014】

また、本発明は、ラクトース添加の培地に、前記本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物を培養することを特徴とする、２’－フコシルラクトースの生産方法を提供する。

【0015】

本発明の２’－フコシルラクトースの生産方法において、前記培地は、好ましくはグルコースをさらに含むとよい。

【発明の効果】

【0016】

本発明のシュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）から由来したフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を挿入した組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、従来の大腸菌に比べて安全でありながらも、高濃度、高収率、及び高い生産性で、２’－フコシルラクトースを生産することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ｐＦＧＷ（Ｐｓ）プラスミドの模式図である。

【図2】ｐＸＩＬプラスミドの模式図である。

【図3】ｐＦＧＷ（Ｈｐ）プラスミドの模式図である。

【図4】ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された、組換え菌株の培養結果である（●：乾燥細胞重量、■：ラクトース、▼：グルコース、◆：２’－ＦＬ、◇：ラクテート、○：アセテート）。

【図5】ペドバクターサルタンス（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された、組換え菌株の培養結果である（●：乾燥細胞重量、■：ラクトース、▼：グルコース、◆：２’－ＦＬ、◇：ラクテート、○：アセテート）。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）から由来した配列番号５に該当するアミノ酸配列を有するα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現するように形質転換され、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現するように形質転換され、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現するように形質転換され、ラクトースパーミアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現するように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｒａｓｅ）及びＧＴＰ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする、組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物を提供する。

【0019】

本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）及びコリネバクテリウムサーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）の中から選ばれるいずれか一つであるとよい。

【0020】

一方、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）は、現在、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に分類されるので、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）菌株も本発明の範疇に含まれる。

【0021】

また、ユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）データベースによれば、ブレビバクテリウムサッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）は、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の同義語として用いられており、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）もコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の別名とされているので、ブレビバクテリウムサッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）及びブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）も本発明の範疇に含まれる（Ｗ．ＬＩＥＢＬ ｅｔ ａｌ．，ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＢＣＡ ＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ．１９９１，ｐ．２５５－２６０；ＬＯＴＨＡＲ ＥＧＧＥＬＩＮＧ ｅｔ ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．３，２０１－２１３．２００１；Ｊｉｌｌ Ａ．Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６１（１９８９）３２９－３３４）。

【0022】

本発明者らは、以前に、大韓民国登録特許第１０－１７３１２６３００００号（２０１７．０４．２４）を通して、コリネバクテリウムを用いた２’－フコシルラクトースの生産方法について特許を取得したことがある。本発明では、シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）から由来したフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を、コリネバクテリウムに挿入することによって、既存のヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｖａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）から由来したフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を、コリネバクテリウムに挿入することによって生産された２’－フコシルラクトースに比べて、著しく多量の２’フコシルラクトースを得ることができた。

【0023】

一方、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）又はコリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）は、従来に使用した大腸菌とは違い、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）と認められた菌株であるだけでなく、エンドトキシンを生産せず、食品添加物であるアミノ酸及び核酸の産業的生産に広く用いられている菌株である。したがって、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）又はコリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）は、食品及び医薬品の素材の生産に適した菌株であるといえ、安全性の面において消費者の心配を払拭できるという長所がある。

【0024】

一方、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）及びコリネバクテリウムサーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）を含むコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、大腸菌とは菌株自体の遺伝的特性が異なるため、大腸菌に適用した戦略とは異なる戦略を用いる必要がある。２’－フコシルラクトースを生産するためには、大腸菌であっても、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物であっても、基本的に、外来のα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を導入しなければならないというのは同一であるが、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物であると、この他に、さらに、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｇｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）、及びラクトースパーミアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を導入する必要がある。

【0025】

ここで、本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物において、前記配列番号５に該当するアミノ酸配列を有するα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、好ましくは配列番号４に記載の核酸配列に暗号化されたものがよく、前記ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ－４，６－ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＧＤＰ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＤＰ－４－ｋｅｔｏ－６－ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ－３，５－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ－４－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＷｃａＧ）及びラクトースパーミアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を暗号化する遺伝子は、周知のものを使用できるが、好ましくは、大腸菌から由来したものを使用するとよい。ただし、ラクトースパーミアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）は、菌株の外部に存在するラクトースを菌株の内部に輸送することに関与する酵素であるが、本発明においてＬａｃオペロンは、ラクトースを流入するために導入しているので、敢えてｌａｃＡ遺伝子まで導入する必要はなく、ｌａｃＹ遺伝子を導入するだけで足りる。

【0026】

一方、組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ，ＭａｎＢ）、ＧＴＰ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭａｎＣ）を暗号化する遺伝子を、自分自身で保有していて発現させることができるので、敢えてこの酵素を過剰発現させる必要はないのであるが、大量生産のためには、この酵素を過剰発現させなければならない。したがって、本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物において、前記組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物は、好ましくは、ホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過剰発現するように形質転換されるとともに、ＧＴＰ－マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ－ｍａｎｎｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過剰発現するように形質転換されたものがよい。

【0027】

また、本発明は、ラクトース添加の培地にて、前記本発明の組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物を培養することを特徴とする２’－フコシルラクトースの生産方法を提供する。下記の本発明の実験による場合、既存の菌株を使用する場合に比べて、より、高濃度、高収率、高い生産性で、２’－フコシルラクトースを組換えコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＰ．）微生物から生産することができた。

【0028】

一方、本発明の２’－フコシルラクトースの生産方法において、前記培地は、好ましくは高濃度のグルコースをさらに含むことがよい。グルコースが培地に追加されることによって菌株の生育が活発になり、より高い生産性で２’－フコシルラクトースを生産することができる。

【0029】

一方、前記本発明の２’－フコシルラクトースの生産方法は、好ましくは、グルコース又はラクトースをさらに供給する流加式培養がよい。流加式培養によってグルコース又はラクトースを持続して供給すると、細胞の成長をより増大させ、高純度、高収率、高生産性でフコシルラクトースを生産できるからである。流加式培養に関する細部の枝葉の技術も、当業界における公知技術を用いることができ、それについては記載を省略する。

【0030】

以下、本発明の内容を、下記実施例を用いて、より詳細に説明する。ただし、本発明の権利範囲は、下記実施例に限定されず、それと等価の技術的思想の変形も含む。

【0031】

一方、下記では宿主細胞としてコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）だけを用いて効果を確認したが、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）と、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、及び、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）は、形質転換システムが同一に適用され得るので、同一の効果が期待できる。

【0032】

［製造例１：組換えプラスミドの作製］
プラスミドの作製及び２’－フコシルラクトース（ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ，２’－ＦＬ）の生産のために、それぞれ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１６５５及びコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ １３０３２を使用した。

【0033】

ｐＦＧＷ（Ｐｓ）プラスミドを構築するために、大腸菌であるＫ－１２ ＭＧ１６５５のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡから、２つのＤＮＡプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）ＧＷ－Ｆ及びＧＷ－Ｒを用いたＰＣＲ反応によって、ｇｍｄ－ｗｃａＧ遺伝子クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を増幅した。また、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ １３０３２のゲノムＤＮＡから、２つのＤＮＡプライマーＳｏｄ－Ｆ及びＳｏｄ－Ｒを用いたＰＣＲ反応によって、Ｓｏｄ遺伝子のプロモーターを増幅した。この後、２つのＤＮＡプライマーＳｏｄ－Ｆ及びＧＷ－Ｒを用いて、オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲ反応によって、ｐＳｏｄ－Ｇｍｄ－ＷｃａＧ ＤＮＡ切片を合成した。

【0034】

また、ｐＸＭＪ１９プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）から、２つのＤＮＡプライマーＴｅｒ－Ｆ及びＴｅｒ－Ｒを用いたＰＣＲ反応を用いて転写終結配列を増幅した。この後、前記合成したｐＳｏｄ－Ｇｍｄ－ＷｃａＧ及び転写終結配列を鋳型として、２つのＤＮＡプライマーＳｏｄ－Ｆ及びＴｅｒ－Ｒを用いたＰＣＲ反応によって、ｐＳｏｄ－Ｇｍｄ－ＷｃａＧ－ｔｅｒ配列を合成し、これを、制限酵素ＢａｍＨＩで切り取ったｐＣＥＳ２０８プラスミドに挿入してｐＧＷプラスミドを構築した。

【0035】

また、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２のゲノムＤＮＡから、２つのＤＮＡプライマーＴｕｆ－Ｆ１及びＴｕｆ－Ｒ１を用いたＰＣＲ反応によって、Ｔｕｆ遺伝子プロモーターを増幅した。また、合成されたシュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）ＤＳＭ１２１４５由来α－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）から、２つのＤＮＡプライマーＦＴ（Ｐｓ）－Ｆ及びＦＴ（Ｐｓ）－Ｒを用いたＰＣＲ反応によって、α－１，２－フコース転移酵素を増幅した。この後、２つのプライマーＴｕｆ－Ｆ及びＦＴ（Ｐｓ）－Ｒを用いてオーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲ反応によって、ｐＴｕｆ－ＦＴ（Ｐｓ）ＤＮＡ切片を合成した。前記構築されたｐＧＷプラスミドに、制限酵素ＮｏｔＩを処理してｐＴｕｆ－ＦＴ（Ｐｓ）を挿入することによってｐＦＧＷ（Ｐｓ）プラスミドを構築した。

【0036】

一方、ｐＸＩＬプラスミドを構築するために、大腸菌Ｋ－１２ ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから、２つのＤＮＡプライマーｉｌｖＣ－ｌａｃＹ－Ｆ及びｌａｃＹ ｐＸ－Ｒを用いたＰＣＲ反応によって、ｌａｃＹ遺伝子を増幅した。また、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２のゲノムＤＮＡから、２つのＤＮＡプライマーｐＸ－ｉｌｖＣ－Ｆ及びｉｌｖＣ－ｌａｃＹ－Ｒを用いたＰＣＲ反応によって、ｉｌｖＣ遺伝子のプロモーターを増幅した。この後、２つのＤＮＡプライマーｐＸ－ｉｌｖＣ－Ｆ及びｌａｃＹ ｐＸ－Ｒを用いて、オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲ反応によって、ｐｉｌｖＣ－ｌａｃＹ ＤＮＡ切片を合成し、これを、制限酵素ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩが処理されたｐＸプラスミド（ｐＸＭＪ１９）に挿入してｐＸＩＬプラスミドを構築した。

【0037】

一方、ｐＦＧＷ（Ｈｐ）ベクターを構築するために、前記構築されたｐＧＷプラスミドを利用したのであり、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２のゲノムＤＮＡから、２つのＤＮＡプライマーＴｕｆ－Ｆ１及びＴｕｆ－Ｒ２を用いたＰＣＲ反応によって、Ｔｕｆ遺伝子プロモーターを増幅し、コリネバクテリウムグルタミクムのコドンを最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）して合成されたヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ＡＴＣＣ ７００３９２由来のα－１，２－フコース転移酵素（α－１，２－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）から、２つのＤＮＡプライマーＦＴ（Ｈｐ）－Ｆ及びＦＴ（Ｈｐ）－Ｒを用いたＰＣＲ反応によって、α－１，２－フコース転移酵素を増幅した後、２つのプライマーＴｕｆ－Ｆ１及びＦＴ（Ｈｐ）－Ｒを用いて、オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲ反応によって、ｐＴｕｆ－ＦＴ（Ｐｓ）ＤＮＡ切片を合成した。前記構築されたｐＧＷプラスミドに制限酵素ＮｏｔＩを処理してｐＴｕｆ－ＦＴ（Ｈｐ）を挿入することによってｐＦＧＷ（Ｈｐ）プラスミドを構築した。

【0038】

本製造例で使用した菌株（ｓｔｒａｉｎ）、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、核酸及びアミノ酸の配列は、下記の表１～４に記載している。

【0039】

［表１］菌株

【0040】

［表２］核酸及びアミノ酸配列

【0041】

［表３］プライマー

【0042】

［表４］プラスミド

【0043】

［実施例１：シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された組換え菌株の培養］
ｐＦＧＷ（Ｐｓ、図１）及びｐＸＩＬ（図２）が挿入されたコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ １３０３２を、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５μｇ／ｍＬ及びクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）５μｇ／ｍＬを含有する５ｍＬのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地が入れられた実験において、３０℃、２５０ｒｐｍで１２時間、種菌培養した。図１は、ｐＦＧＷ（Ｐｓ）プラスミドの模式図であり、図２は、ｐＸＩＬプラスミドの模式図である。

【0044】

回分式培養は、５０ｍＬの最小培地（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ２０ｇ／Ｌ、尿素(ウレア)５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２ １０ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．２ｍｇ／Ｌ、プロトカテク酸３０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４ ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０２ｍｇ／Ｌ、グルコース４０ｇ／Ｌ、ラクトース１０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）５０ｍＬが入れられた２５０ｍＬフラスコを利用し、３０℃、２５０ｒｐｍで９０時間行った。

【0045】

［比較例１：ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された組換え菌株の培養］
実施例１においてｐＦＧＷ（Ｐｓ、図１）をｐＦＧＷ（Ｈｐ、図３）に変更した以外は同一の培養方法を用いた。図３は、ｐＦＧＷ（Ｈｐ）プラスミドの模式図である。

【0046】

［実験例１：実施例１及び比較例１の組換え菌株における２’－ＦＬ生産の比較］
実施例１及び比較例１で製造された組換え菌株における２’－ＦＬ（２’－フコシルラクトース）の生産量を比較した（図４、図５、表５）。図４は、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された組換え菌株の培養結果であり、図５は、シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された組換え菌株の培養結果である（●：乾燥細胞重量、■：ラクトース、▼：グルコース、◆：２’－ＦＬ、◇：ラクテート、○：アセテート）。

【0047】

［表５］

【0048】

実験の結果、シュードペドバクターサルタンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｄｏｂａcｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された組換え菌株が、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が挿入された組換え菌株に比べて、２’－フコシルラクトースの生産性が、２倍程度高いことが確認できた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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