特許 7075680 オリゴヌクレオチド合成用セグメントおよびその製造方法、ならびにそれを用いたオリゴヌクレオチドの合成方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-18

(45)【発行日】2022-05-26

(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチド合成用セグメントおよびその製造方法、ならびにそれを用いたオリゴヌクレオチドの合成方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/04 20060101AFI20220519BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALN20220519BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20220519BHJP

【ＦＩ】

C07H21/04 Z

C07H21/04 A

A61K31/7088

A61K48/00

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020517079

(86)(22)【出願日】2019-05-07

(86)【国際出願番号】 JP2019018299

(87)【国際公開番号】W WO2019212061

(87)【国際公開日】2019-11-07

【審査請求日】2020-10-30

(31)【優先権主張番号】P 2018088912

(32)【優先日】2018-05-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】518156680

【氏名又は名称】株式会社ナティアス

(74)【代理人】

【識別番号】100112737

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 考晴

(74)【代理人】

【識別番号】100140914

【弁理士】

【氏名又は名称】三苫 貴織

(74)【代理人】

【識別番号】100136168

【弁理士】

【氏名又は名称】川上 美紀

(74)【代理人】

【識別番号】100196117

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 利恵

(72)【発明者】

【氏名】片岡 正典

【審査官】三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００７／１１１１３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第１９９６／０１６０７３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１１／０６１１１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０２４７７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表平０８－５０２６４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】JANCZYK,M. et al，A new and convenient approach for the preparation of β-cyanoethyl protected trinucleotide phosphora，Organic & Biomolecular Chemistry，2012年，Vol.10, No.8，pp.1510-1513

【文献】HASSLER,M. et al，RNA synthesis via dimer and trimer phosphoramidite block coupling，Tetrahedron Letters，2011年，Vol.52, No.20，pp.2575-2578

【文献】CHEN,C. et al，Convergent Solution Phase Synthesis of Chimeric Oligonucleotides by a 2+2 and 3+3 Phosphoramidite St，Australian Journal of Chemistry，2010年，Vol.63, No.2，pp.227-235

【文献】GAYTAN,P. et al，TrimerDimer: an oligonucleotide-based saturation mutagenesis approach that removes redundant and sto，Nucleic Acids Research，2009年，Vol.37, No.18，pp.e125/1-e125/13

【文献】LYTTLE,M.H. et al，Mutagenesis using trinucleotide β-cyanoethylphosphoramidites，BioTechniques，1995年，Vol.19, No.2，pp.274-8, 280-1

【文献】VIRNEKAES,B. et al，Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for rando，Nucleic Acids Research，1994年，Vol.22, No.25，pp.5600-5607

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｈ ２１／０４

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ａ６１Ｋ ４８／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）：

【化1】

（式中、
Ｂは、独立して、保護基によって保護された、または未保護ヌクレオシド塩基であり；
Ｒ^１は、保護基であり；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３であり；
Ｒ^５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；
Ｘは、独立して、非共有電子対、＝Ｏ、または＝Ｓであって、少なくとも１つが非共有電子対であり；
Ｙは、独立して、Ｈ、ＮＨＲ^６、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；
Ｒ^６は、Ｈ、脂肪族基、芳香族基であり；
Ｚは、独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；
（ｍ＋ｎ）の値は、２以上２３以下の整数である）
で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメント。

【請求項2】

前記式（Ｉ）において、前記Ｂが保護基によって保護されたヌクレオシド塩基であるとき、該保護基がアシル系保護基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド合成用セグメント。

【請求項3】

前記式（Ｉ）において、
前記Ｒ^１が、酸性条件下で除去可能な保護基またはトリアルキルシリル基であり、
前記ＹがＨまたはｔ－ブチルジメチルシリル基で保護された水酸基であり、
前記ＺがＨであり、
前記Ｒ^５がイソプロピル基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド合成用セグメント。

【請求項4】

下記式（Ｉ）：

【化2】

（式中、
Ｂは、独立して、保護基で保護された、または未保護ヌクレオシド塩基であり；
Ｒ^１は、保護基であり；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３であり；
Ｒ^５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；
Ｘは、独立して、非共有電子対、＝Ｏ、または＝Ｓであって、少なくとも１つが非共有電子対であり；
Ｙは、独立して、Ｈ、ＮＨＲ^６、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；
Ｒ^６は、Ｈ、脂肪族基、芳香族基であり；
Ｚは、独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；
（ｍ＋ｎ）の値は、２以上２３以下の整数である）
で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントの製造方法であって、
（ａ）下記式（ＩＩ）：

【化3】

によって表されるヌクレオシドを、Ｒ^２Ｐ｛Ｎ（Ｒ^５）_２｝_２の構造を有する三価リン化合物、および、下記式（ＩＩＩ）：

【化4】

の構造を有するヌクレオシドと反応させ、下記式（ＩＶ）：

【化5】

の構造を有する化合物を調製する工程と、
（ｂ）前記式（ＩＶ）の構造を有する化合物を、Ｒ^３Ｐ｛Ｎ（Ｒ^５）_２｝_２の構造を有する三価リン化合物、および、上記式（ＩＩＩ）の構造を有するヌクレオシド、または、下記式（Ｖ）：

【化6】

の構造を有する化合物、または、下記式（ＶＩ）：

【化7】

の構造を有する化合物と反応させ、下記式（ＶＩＩ）：

【化8】

の構造を有する化合物を調製する工程と、
（ｃ）必要に応じて、前記工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返す工程と、
（ｄ）得られた中間体を、Ｒ^４Ｐ｛Ｎ（Ｒ^５）_２｝_２の構造を有する三価リン化合物と反応させ、前記式（Ｉ）の構造を有するセグメントを調製する工程と、を含む製造方法。

【請求項5】

前記式（Ｉ）において、前記Ｂが保護基で保護されたヌクレオシドであるとき、該保護基がアシル系保護基である、請求項４に記載の製造方法。

【請求項6】

前記式（Ｉ）において、
前記Ｒ^１が、酸性条件下で除去可能な保護基であり、
前記ＹがＨまたはｔ－ブチルジメチルシリル基で保護された水酸基であり、
前記ＺがＨであり、
前記Ｒ^５がイソプロピル基である、請求項４に記載の製造方法。

【請求項7】

必要に応じて、前記工程（ａ）で得られた式（ＩＶ）で表わされる化合物、または前記工程（ｂ）で得られた式（ＶＩＩ）で表わされる化合物に対して、酸化剤または硫化剤を反応させる工程を含む、請求項４に記載の製造方法。

【請求項8】

請求項１に記載の式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントを用いたオリゴヌクレオチドの合成方法であって、
（ａ）前記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントのアミダイト部分と、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの水酸基との縮合工程と、
（ｂ）前記縮合工程で得られた亜リン酸結合部分の酸化または硫化工程と、
（ｃ）前記縮合工程でヌクレオシドまたはヌクレオチドと縮合された前記オリゴヌクレオチド合成用セグメントの末端保護基の脱保護工程と、
を含む合成方法。

【請求項9】

溶液中で前記各工程を行う、請求項８に記載の合成方法。

【請求項10】

固相担体上で前記各工程を行う、請求項８に記載の合成方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オリゴヌクレオチド合成用セグメントおよびその製造方法、ならびにそれを用いたオリゴヌクレオチドの合成方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

近年、天然型または非天然型オリゴヌクレオチドを基本骨格とする核酸医薬への注目度が高まっている。目的とした作用が得られるように設計した核酸医薬を得るためには、化学合成法による製造方法が用いられている。

【0003】

従来法によるオリゴヌクレオチド合成においては、モノマーアミダイトを原料とし、１塩基ずつ段階的にカップリング反応を行い、ヌクレオチドの長さを伸長していく方法が主として用いられている（非特許文献１参照）。オリゴヌクレオチド合成における１塩基ずつの伸長にあたっては、モノマーアミダイトとヌクレオシドの５´－水酸基とを反応させるカップリング反応に加えて、３価のリンを酸化または硫化する工程と、次のカップリング反応に備えてヌクレオシドの５´－水酸基の保護基を脱保護する工程が必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３，ｐｐ．３－２１（１９８７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、従来法で使用されている原料を用いた場合、上記オリゴヌクレオチド合成における各カップリング反応の収率は必ずしも１００％には到達しない。このため、ある程度の長さを有するオリゴヌクレオチドを高効率で合成することは難しい。

【0006】

カップリング反応に続く酸化／硫化工程、脱保護工程もまた、必ずしも１００％では進行しない。このため、目的とするオリゴヌクレオチドの長さが長くなるほど、目的とする長さを有するオリゴヌクレオチドの収率は低下していく。

【0007】

さらに、目的とする長さを有するオリゴヌクレオチドを最終的に得る段階では、上記のような各工程で生じた副生成物や試薬の残渣を除去する精製工程を行う必要がある。オリゴヌクレオチドＮ量体を合成する場合に生じる、１塩基ずつ伸長する合成方法における副生成物の代表的なものとして、カップリング工程で生じる、１塩基分だけ短い（Ｎ－１）量体、２塩基分だけ短い（Ｎ－２）量体等がある。このような（Ｎ－１）量体、（Ｎ－２）量体は、目的とするＮ量体と構造や物性が非常に類似している。このため、クロマトグラフィー等を用いてＮ量体を精製する段階で、目的とするＮ量体の移動度と、副生成物である（Ｎ－１）量体、（Ｎ－２）量体等の移動度との差が小さい。このことから、Ｎ量体とそれ以外とを正確に分離するための精製負荷が大きいという問題が存在する。

【0008】

また、汎用されているオリゴヌクレオチド合成では、固相担体に３´－末端を固定したヌクレオシドに対して５´－方向に鎖伸長を行う固相合成法が用いられている。この方法においては、固相合成に用いられるモノマーアミダイトの市販品を購入するか、実験者が自ら調製する必要がある。一般に、市販されているモノマーアミダイトは高価であり、目的とするオリゴヌクレオチドを大量に合成するための障害となっている。また、実験者が自ら調製する場合には、目的とするモノマーアミダイトを高純度かつ高収量で準備しておく必要がある。モノマーヌクレオチドが高純度でなければ、オリゴヌクレオチド合成におけるカップリング反応に影響を及ぼすおそれが高いためである。

【0009】

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、より簡便に精製でき、かつ、大量に供給することができるオリゴヌクレオチド合成用セグメントおよびその製造方法、ならびにそれを用いたオリゴヌクレオチドの合成方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記課題を解決するために、本発明のオリゴヌクレオチド合成用セグメントおよびその製造方法、ならびにそれを用いたオリゴヌクレオチドの合成方法は、以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、下記式（Ｉ）：

【化1】

で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントである。

【0011】

前記式（Ｉ）中、Ｂは、独立して、保護または未保護ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、保護基であり；Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３であり；Ｒ^５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｘは、独立して、非共有電子対、＝Ｏ、または＝Ｓであり；Ｙは、独立して、Ｈ、ＮＨＲ^６、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３またはアシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｒ^６は、Ｈ、脂肪族基、芳香族基であり；Ｚは、独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；（ｍ＋ｎ）の値は、２以上２３以下の整数である。

【0012】

上記第１の態様においては、前記式（Ｉ）におけるＢが保護基によって保護されたヌクレオシド塩基であるとき、該保護基がアシル系保護基であってもよい。

【0013】

上記第１の態様においては、前記式（Ｉ）において、前記Ｒ^１が、酸性条件下で除去可能な保護基またはトリアルキルシリル基であり、前記Ｙが好ましくはＨまたはｔ－ブチルジメチルシリル基で保護された水酸基であり、前記Ｚが好ましくはＨであり、前記Ｒ^５がイソプロピル基であってもよい。

【0014】

本発明の第２の態様は、下記式（Ｉ）：

【化2】

で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントの製造方法である。

【0015】

前記式（Ｉ）中、Ｂは、独立して、保護または未保護ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、保護基であり；Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３であり；Ｒ^５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｘは、独立して、非共有電子対、＝Ｏ、または＝Ｓであり；Ｙは、独立して、Ｈ、ＮＨＲ^６、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３またはアシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｒ^６は、Ｈ、脂肪族基、芳香族基であり；Ｚは、独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；（ｍ＋ｎ）の値は、２以上２３以下の整数である。

【0016】

前記製造方法は、
（ａ）下記式（ＩＩ）：

【化3】

によって表されるヌクレオシドを、Ｒ^２Ｐ｛Ｎ（Ｒ^５）_２｝_２の構造を有する三価リン化合物、および、下記式（ＩＩＩ）：

【化4】

の構造を有するヌクレオシドと反応させ、下記式（ＩＶ）：

【化5】

の構造を有する化合物を調製する工程と、
（ｂ）前記式（ＩＶ）の構造を有する化合物を、Ｒ^３Ｐ｛Ｎ（Ｒ^５）_２｝_２の構造を有する三価リン化合物、および、上記式（ＩＩＩ）の構造を有するヌクレオシド、または、下記式（Ｖ）：

【化6】

の構造を有する化合物、または、下記式（ＶＩ）：

【化7】

の構造を有する化合物と反応させ、下記式（ＶＩＩ）：

【化8】

の構造を有する化合物を調製する工程と、
（ｃ）必要に応じて、前記工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返す工程と、
（ｄ）得られた中間体を、Ｒ^４Ｐ｛Ｎ（Ｒ^５）_２｝_２の構造を有する三価リン化合物と反応させ、前記式（Ｉ）の構造を有するセグメントを調製する工程と、を含む。

【0017】

上記第２の態様において、前記式（Ｉ）におけるＢが保護基によって保護されたヌクレオシドであるとき、該保護基がアシル系保護基であってもよい。

【0018】

前記第２の態様において、前記式（Ｉ）において、前記Ｒ^１が、酸性条件下で除去可能な保護基またはトリアルキルシリル基であり、前記Ｙが好ましくはＨまたはｔ－ブチルジメチルシリル基で保護された水酸基であり、前記Ｚが好ましくはＨであり、前記Ｒ^５がイソプロピル基であってもよい。

【0019】

上記第２の態様において、必要に応じて、前記工程（ａ）で得られた式（IV）で表わされる化合物、または前記工程（ｂ）で得られた式（VII）で表わされる化合物に対して、酸化剤または硫化剤を反応させる工程を含んでもよい。

【0020】

本発明の第３の態様は、上記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントを用いたオリゴヌクレオチドの合成方法である。

【0021】

前記合成方法は、（ａ）前記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントのアミダイト部分と、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの水酸基との縮合工程と、（ｂ）前記縮合工程で得られた亜リン酸結合部分の酸化工程と、（ｃ）前記縮合工程でヌクレオシドまたはヌクレオチドと縮合された前記オリゴヌクレオチド合成用セグメントの末端保護基の脱保護工程と、を含む。

【0022】

上記第３の態様においては、溶液中で前記各工程を行ってもよい。

【0023】

上記第３の態様においては、固相担体上で前記各工程を行ってもよい。

【発明の効果】

【0024】

本発明のオリゴヌクレオチド合成用セグメントによれば、汎用されているモノマーのアミダイトを用いて段階的にオリゴヌクレオチドを合成する場合と比べて、工程数を減らすことができる。このため、目的とする長さのオリゴヌクレオチドの収率を従来法での収率よりも向上することができる。

【0025】

さらに、本発明のオリゴヌクレオチド合成用セグメントを用いてＮ量体のオリゴヌクレオチドを合成する場合、Ｎ－１～Ｎ－３の長さを有する副生成物が生じない。このため、目的とするＮ量体のオリゴヌクレオチドの精製負荷を小さくすることができることで、より簡便に精製することができ、かつ、より大量に目的物を供給することができる、という効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】実施例１で得られたオリゴヌクレオチド合成用セグメントであるｄＴ３量体アミダイトのＥＳＩ－ＭＳスペクトルを表した図である。

【図2】実施例１で得られたオリゴヌクレオチド合成用セグメントであるｄＴ３量体アミダイトの^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを表した図である。

【図3】実施例１で得られたオリゴヌクレオチド合成用セグメントを用いて合成したオリゴチミジン１８量体のＬＣスペクトルを表した図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下に、本発明に係るオリゴヌクレオチド合成用セグメントを得るための一実施形態について説明する。
本実施形態におけるオリゴヌクレオチド合成用セグメントは、下記式（Ｉ）：

【化9】

で表される構造を有する。
前記式（Ｉ）中、Ｂは、独立して、保護または未保護ヌクレオシド塩基であり；Ｒ^１は、保護基であり；Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_３であり；Ｒ^５は、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；Ｘは、独立して、非共有電子対、＝Ｏ、または＝Ｓであり；Ｙは、独立して、Ｈ、ＮＨＲ^６、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３またはアシル系保護基、エーテル系保護基、シリル系保護基で保護された水酸基であり；Ｒ^６は、Ｈ、脂肪族基、芳香族基であり；Ｚは、独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲンであるか、または、前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；（ｍ＋ｎ）の値は、２以上２３以下の整数である。

【0028】

本実施形態におけるオリゴヌクレオチド合成用セグメントは、（１）５´－水酸基および必要に応じてヌクレオシド塩基部分を保護基で保護し、３´－水酸基を無保護としたヌクレオシド（以下、「５´－保護・３´－無保護ヌクレオシド」という）を出発物質として、３´－水酸基にリン酸化を行って３´－ホスホロアミダイトを反応系中で中間体として得、（２）得られた中間体と、必要に応じてヌクレオシド塩基部分を保護基で保護し、その一方で３´－水酸基と５´－水酸基の両方を無保護としたヌクレオシド（以下、「３´，５´－無保護ヌクレオシド」という）の５´－水酸基との反応を行い、３´－末端に残っている無保護の３´－水酸基を３価のリン酸化剤と反応させて、ホスホロアミダイト化することで得られる。（２）を必要回数（ｎ回）繰り返すことで（ｎ＋１）量体ヌクレオチドホスホロアミダイトが合成される。

【0029】

これに対し、従来法でヌクレオチド２量体や３量体を合成する場合には、５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドに対して、３´－水酸基を保護する反応を行い、その後で５´－水酸基の保護基のみを除去する反応を行って、３´－水酸基および必要に応じてヌクレオシド塩基部分を保護基で保護し、５´－水酸基を無保護としたヌクレオシド（以下、「５´－無保護・３´－保護ヌクレオシド」という）を予め調製しておく必要があった。これに対して本実施形態では、従来法よりも保護基が一つ少ない、５´－水酸基と３´－水酸基の両方を無保護としたヌクレオシドをセグメント合成に用いることができる。このため、セグメント合成の主要原料の一つである、３´，５´－無保護ヌクレオシドを、従来法に比して少ない工程数で調製することができることで、低コスト・短時間でより大量に合成することができる。

【0030】

本実施形態におけるヌクレオシド塩基は、アデニル基、グアニル基、シトシニル基、チミニル基、ウラシル基などの天然型塩基、５－メチルシトシニル基、５－フルオロウラシル基、７－メチルグアニル基、７－デアザアデニル基などの修飾塩基を含む。これらのヌクレオシド塩基中のアミノ基は、ベンジル系保護基、アリル系保護基、カルバメート系保護基、アシル系保護基を含む。好ましくは、アセチル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、イソプロピルカルボニル基などのアシル系保護基を用いる。

【0031】

本実施形態における脂肪族基は、飽和または不飽和の、直鎖状または分岐しているＣ_１－Ｃ_１８炭化水素、飽和または不飽和の環状Ｃ_３－Ｃ_１８炭化水素を含む。好ましくは、飽和または不飽和の、Ｃ_１－Ｃ_８炭化水素またはＣ_３－Ｃ_８環状炭化水素である。本実施形態における芳香族基は、フェニル基などの炭素環式芳香環、ナフチル基などの炭素環式芳香環または非炭素式芳香環に縮合した炭素環式芳香環を含む。本実施形態における脂肪族基、芳香族基は、飽和または不飽和の、Ｃ_１－Ｃ_８炭化水素またはＣ_３－Ｃ_８環状炭化水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、芳香環などの置換基で置換されていてもよい。

【0032】

本実施形態における５´－、３´－または２´－水酸基の保護基は、酸性条件下で除去可能な保護基、アシル系保護基、シリル系保護基を含む。酸性条件下で除去可能な保護基は、置換または未置換のトリチル基を含むエーテル系保護基、ピキシル基、置換または未置換のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基を含み、代表的な保護基として４，４´－ジメトキシトリチル基がある。シリル系保護基は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基を含む。アシル系保護基は、アセチル基、ベンゾイル基を含む。また、４´－位と２´－位とを架橋するように結合したヌクレオシドを原料として用いることもできる。この場合、４´－位と２´－位とは、（４´－位）－Ｌ－Ｏ－（２´－位）という結合を形成することができ、Ｌの例としてＣ_１－Ｃ_６アルキレン基（途中の炭素原子が、酸素原子、アルキル基が結合した窒素原子と置換されていてもよい）がある。

【0033】

上記工程（１）では、５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドの３´－水酸基を、３価のリン酸化剤と反応させて３´－ホスホロアミダイトを系中で生成させた後、得られた３´－ホスホロアミダイトを単離精製することなく、アミダイト部分を活性化する活性化剤を添加した後、３´，５´－無保護ヌクレオシドと反応させることで、１塩基分の伸長を行う。さらに３価のリン酸化剤と反応させて３´－ホスホロアミダイトを生成させる。３価のリン酸化剤の代表的なものとしては、ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２、ＣＨ_２＝ＣＨＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２があるが、これらに限定されない。活性化剤の代表的なものとしては、１Ｈ－テトラゾール、Ｓ－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、ジシアノイミダゾールや、スルホン酸とアゾールまたは３級アミンの塩があるが、これらに限定されない。反応は、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、トルエン等の溶媒を乾燥させたものの中で行う。

【0034】

上記工程（１）においては、５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドの溶液（０．２～０．４Ｍ）に、３価のリン酸化剤（５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドの１．０５～１．２当量）および活性化剤（５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドの０．４～０．７当量）を加え、室温で２～５時間攪拌する。得られた３´－ホスホロアミダイトをシリカゲル精製後、続く工程（２）を行う。

【0035】

上記工程（２）では、上記工程（１）で得られた３´－ホスホロアミダイトに、３´，５´－無保護ヌクレオシド（５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドの１．３～２．０当量）および活性化剤（５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドの２～３当量）を加え、室温で０．５～１．５時間反応させ、シリカゲル濾過とろ液の濃縮を経て、１塩基分伸長した、３´－末端に無保護水酸基を有するヌクレオチド中間体を得る。収率は、約６０～９５％である。このヌクレオチド中間体の溶液（０．０５～０．４Ｍ）に対して、３価のリン酸化剤（５´－保護・３´－無保護ヌクレオシドの１．２～２．０当量）および活性化剤（５´－保護・３´－無保護ヌクレオチドの０．５～１．０当量）と反応させて３量体ヌクレオチド３´－ホスホロアミダイトが得られる。必要に応じて、さらに工程（２）を行うことで、４量体以上のヌクレオチドが得られる。４量体以上のセグメントを合成する場合には、１塩基ずつ伸張させていく方法の別法として、既に２量体以上となっているセグメントどうしを縮合させることで、２以上の塩基分を一度に伸張させることもできる。

【0036】

上記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントを用いたオリゴヌクレオチドの合成は、溶液中で行う（以下、「液相合成法」という）ことができ、また固相担体上で行う（以下、「固相合成法」という）こともできる。液相合成法で合成を行う場合には、反応溶媒に対する溶解性を高めるために３´末端側のヌクレオシドの３´－水酸基にシリル系の保護基、または脂肪族を含む保護基を導入したものを用い、そのものに対して（ａ）前記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントとの縮合工程と、（ｂ）前記縮合工程で得られた亜リン酸結合部分の酸化または硫化工程と、（ｃ）前記縮合工程でヌクレオシドまたはヌクレオチドと縮合された前記オリゴヌクレオチド合成用セグメントの末端保護基の脱保護工程を繰り返す。固相合成法で合成を行う場合には、（ａ）前記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントとの縮合工程と、（ｂ）固相担体上のヌクレオシドまたはヌクレオチドの未反応の５´－水酸基のキャッピング工程と、（ｃ）前記縮合工程で得られた亜リン酸結合部分の酸化工程と、（ｄ）前記縮合工程でヌクレオシドまたはヌクレオチドと縮合された前記オリゴヌクレオチド合成用セグメントの末端保護基の脱保護工程を繰り返す。両方法とも、その後の塩基性条件での処理により、目的のオリゴヌクレオチドを得ることができる。

【0037】

具体的には、液相合成法、固相合成法のどちらを用いる場合も、オリゴヌクレオチド合成の第１段階として、上記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントの３´－末端アミダイトを活性化剤で活性化し、５´－水酸基を無保護としたヌクレオシドまたはヌクレオチドと縮合させる反応を行う。活性化剤としては、汎用されている３価のリンを活性化させる活性化剤を用いることができ、例えば１Ｈ－テトラゾール、Ｓ－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、ジシアノイミダゾールや、スルホン酸とアゾールまたは３級アミンからなる塩があるが、これらに限定されない。本縮合反応に必要な時間は、一般的に１分～３０分程度であり、反応を行うスケールに依存する。

【0038】

次に、オリゴヌクレオチド合成の第２段階として、上記縮合反応で得られた中間体を、酸化剤または硫化剤と反応させて、５価のホスフェートまたはチオホスフェートヌクレオチドを得る。

【0039】

次いで、オリゴヌクレオチド合成の第３段階として、上記酸化または硫化反応で得られた中間体を、無水の酸性溶液と反応させて、５´－水酸基無保護ヌクレオチドを得る。

【0040】

本実施形態におけるオリゴヌクレオチド合成用セグメントを用いて合成したオリゴヌクレオチド中の、ヌクレオシド塩基の保護基、５´－、３´－または２´－水酸基の保護基、リン酸結合中のリン酸の保護基は、用いられている保護基に対応した脱保護条件下で脱保護される。

【0041】

以下の実施例は、本発明の一実施形態を説明し、例示するものである。実施例１および実施例２に示す手順に従い、上記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントの一つである４量体ホスホロアミダイトを合成した。また、実施例３に示す手順に従い、上記式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド合成用セグメントの一つである５量体ホスホロアミダイトを合成した。さらに、実施例４に示す手順に従い、上記式（Ｉ）で表される化合物の一例である３量体ホスホロアミダイトを用いてオリゴヌクレオチド１８量体を合成した。

【0042】

〔実施例１〕４量体ホスホロアミダイト（３）の合成
（ステップ１：ＤＭＴｒ－Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（１）の合成）

【化10】

【0043】

５´－Ｏ－ＤＭＴｒチミジン（１６．３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（９０ｍＬ）に、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（１０．５ｍＬ、３３．０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアミン（２．１２ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（１．０５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）をこの順に室温で加えた。室温で３時間撹拌した後、反応液をチミジン（１０．９ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）および１Ｈ－テトラゾール（５．２５ｇ、７５．０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（９０ｍＬ）に加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液に１８０ｍＬのジクロロメタンを加えた後、３４０ｇのシリカゲルに供して、ジクロロメタンで洗浄した。得られたろ液を、減圧下で濃縮することにより中間体を得た。中間体をジクロロメタン（１８０ｍＬ）に溶解した後、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（１２．４ｍＬ、３９．０ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（１．０５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）をこの順に室温で加えた。室温で３時間撹拌した後、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のホスホロアミダイト１を得た（２４．２ｇ、収率７４．４％）。
ＭＳ：１１０８．４（ＭＮａ^＋）

【0044】

（ステップ２：ＤＭＴｒ－Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（２）の合成）

【化11】

【0045】

上記ホスホロアミダイト１（１０．０ｇ、９．２１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２３ｍＬ）を、チミジン（２．９０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）および１Ｈ－テトラゾール（１．９４ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）に滴下し、室温で１時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン（４６ｍＬ）を加えた後、３４０ｇのシリカゲルに供して、ジクロロメタンで洗浄した。濾液を濃縮後ジクロロメタン溶液（８１ｍＬ）に溶解し、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（３．１９ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（０．４ｇ、５．７０ｍｍｏｌ）をこの順に室温で加えた。室温で３時間撹拌した後、ジクロロメタン（１６３ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のホスホロアミダイト２を得た（９．６５ｇ、収率７３．４％）。得られたホスホロアミダイト２のＥＳＩ－ＭＳスペクトルを図１に、^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを図２に、それぞれ示した。
ＭＳ：１４４８．５（ＭＮａ^＋）

【0046】

（ステップ３：ＤＭＴｒ－Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（３）の合成）

【化12】

【0047】

上記ホスホロアミダイト２（１０．０ｇ、７．０１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７０ｍＬ）を、チミジン（２．２１ｇ、９．１１ｍｍｏｌ）および１Ｈ－テトラゾール（１．４７ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（９０ｍＬ）に加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン（１４０ｍＬ）を加えたのち、３４０ｇのシリカゲルに供して、ジクロロメタンで洗浄した。濾液を濃縮後ジクロロメタン溶液（７０ｍＬ）に溶解し、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（２．８９ｍＬ、９．１１ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（０．３４０ｇ、４．９０ｍｍｏｌ）をこの順に室温で加えた。室温で３時間撹拌した後、ジクロロメタン（１４０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の４量体ホスホロアミダイト３を得た（９．４０ｇ、収率７５．９％）。
ＭＳ：１７９１．６（ＭＮａ^＋）

【0048】

〔実施例２〕４量体ホスホロアミダイト（６）の合成
（ステップ４：ＤＭＴｒ－Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（４）の合成）

【化13】

【0049】

５´－Ｏ－ＤＭＴｒチミジン（１６．３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（９０ｍＬ）に、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（１０．５ｍＬ、３３．０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアミン（２．１２ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（１．０５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）をこの順に室温で加えた。室温で３時間撹拌した後、反応液をＮ４－ベンゾイルシチジン（１２．９ｇ、３９．０ｍｍｏｌ）および１Ｈ－テトラゾール（６．３１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（９０ｍＬ）に加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液に１８０ｍＬのジクロロメタンを加えた後、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（１２．４ｍＬ、３９．０ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（１．０５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）をこの順に室温で加えた。室温で３時間撹拌した後、３４０ｇのシリカゲルに供して、ジクロロメタンで洗浄した。得られたろ液を、減圧下で濃縮することにより中間体を得た（収率７０－９０％）。中間体をジクロロメタン（１８０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のホスホロアミダイト４を得た（２７．１ｇ、収率７７．０％）。
ＭＳ：１１９７．４（ＭＮａ^＋）

【0050】

（ステップ５：ｄＧ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ（５）の合成）

【化14】

【0051】

２－シアノエチル５´－Ｏ－ＤＭＴｒ－Ｎ２－イソブチリル－グアノシン３´－（Ｎ，Ｎ´－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（３０．０ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）とチミジン（１１．２ｇ、４６．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１８０ｍＬ）に１Ｈ－テトラゾール（７．５０ｇ、１０７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液にフェニルアセチルジスルフィド（３２．４ｇ、１０７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間撹拌した。１８０ｍＬのジクロロメタンを加えた後、３４０ｇのシリカゲルに供して、ジクロロメタンで洗浄した。得られたろ液を、減圧下で濃縮することにより生成物を得た（収率７０－９０％）。ジクロロメタン（１８０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、中間体を得た（収率７０－９０％）。中間体（１５ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）に３％ジクロロ酢酸ジクロロメタン溶液を０℃下１０００ｍＬ加え、室温で３０分撹拌した。反応液を１５００ｇのシリカゲルに供して、酢酸エチルで洗浄した。さらに、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の２量体５を得た（２２．１ｇ、収率８７．３％）。
ＭＳ：７２３．２（ＭＮａ^＋）

【0052】

（ステップ６：ＤＭＴｒ－Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｇ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（６）の合成）

【化15】

【0053】

前記化合物４（１０．０ｇ、８．５１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）を、前記化合物５（７．２６ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）および１Ｈ－テトラゾール（１．７９ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４５ｍＬ）に滴下し、室温で１時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン（９０ｍＬ）を加えたのち、３４０ｇのシリカゲルに供して、ジクロロメタンで洗浄した。ろ液を濃縮後ジクロロメタン溶液（８５ｍＬ）に溶解し、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（３．１９ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（０．４２０ｇ、５．９６ｍｍｏｌ）をこの順に室温で加えた。室温で３時間撹拌した後、ジクロロメタン（１７０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のホスホロアミダイト６を得た（９．４２ｇ、収率６３．１％）。
ＭＳ：１９７４．６（ＭＮａ^＋）

【0054】

〔実施例３〕５量体アミダイト（１５）の合成
（ステップ７：ＤＭＴｒ－Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}（８）の合成）

【化16】

【0055】

５´－Ｏ－ＤＭＴｒ－Ｎ－５－ベンゾイル２´－デオキシアデノシン（７）（３．３ｇ、５．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン―アセトニトリル（１：１）溶液（２０ｍＬ）に、アミダイト化試薬ＣＨ_２＝ＣＨＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（２．３ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（０．２５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を０℃下で２回に分けて加えた。室温で１２時間撹拌した後、ジクロロメタン（６０ｍＬ）を加え、ヘキサン―酢酸エチルを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のホスホロアミダイト８を得た（４．０ｇ、収率９４％）。

【0056】

（ステップ８：３´－ＴＢＳ－Ｔ（９）の合成）

【化17】

【0057】

チミジン（１０ｇ、４１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２００ｍＬ）に、イミダゾール（３３、５００ｍｍｏｌ）、塩化ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（２５ｇ、１７０ｍｍｏｌ）を２回に分けて加えた。室温で３時間撹拌した後、反応液にメタノール５ｍＬを加え、蒸留水（１０００ｍＬ）に滴下した。残渣をろ別したのち、ＴＨＦに溶解した。トリフルオロ酢酸（４０ｍＬ）および蒸留水（４０ｍＬ）を０℃で加え、１時間撹拌した。反応液を蒸留水（５００ｍＬ）に滴下し、ジクロロメタン（５００ｍＬ）で抽出した。得られた粗生成物をヘキサン―酢酸エチルを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の３´－保護チミジン９を得た（１３ｇ、収率８８％）。

【0058】

（ステップ９：Ｔ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ｔ_ＯＴＢＳ（１０）の合成）

【化18】

【0059】

ホスホロアミダイト単量体８（１．３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）および３´－保護チミジン９（０．３６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン―アセトニトリル溶液（１：１、１０ｍＬ）に、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（０．６２ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分撹拌した後、ＴＢＨＰ（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド）のデカン溶液（０．６０ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加え、さらに室温で３０分撹拌した。反応液を濃縮後、得られた粗生成物を３％ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）で室温１５分処理した後、反応液をジクロロメタン―メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の５´－無保護ｄＡＴ２量体１０を得た（０．６５ｇ、収率５８％）。

【0060】

（ステップ１０：ＤＭＴｒ－Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ｔ_ＯＴＢＳ（１１）の合成）

【化19】

【0061】

ホスホロアミダイト単量体８（０．８３ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）および５´－無保護ｄＡＴ２量体１０（０．６２ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン―アセトニトリル溶液（１０ｍＬ）に、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（０．４７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分撹拌した後、ＴＢＨＰのデカン溶液（０．４６ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）を加え、さらに室温で３０分撹拌した。反応液を濃縮後、得られた粗生成物をジクロロメタン―メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の５´－ＤＭＴｒ－ｄＡＡＴ３量体１１を得た（０．６５ｇ、収率５８％）。

【0062】

（ステップ１１：ＤＭＴｒ－Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（１２）の合成

【化20】

【0063】

５´－ＤＭＴｒ－ｄＡＡＴ３量体１１（０．９４ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）に、フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液（１．２ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。４時間撹拌した後、反応液を濃縮し、得られた粗生成物をジクロロメタン―メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、真空下１晩乾燥した。この中間体の一部０．７１ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を使用し、ジクロロメタン―アセトニトリル溶液（５．０ｍＬ）とした後に、アミダイト化試薬ＣＨ_２＝ＣＨＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（０．２１ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（０．０２４ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を０℃下で２回に分けて加えた。室温で１２時間撹拌した後、ジクロロメタン（５．０ｍＬ）を加え、ヘキサン―酢酸エチルを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の５´－ＤＭＴｒ保護３量体ホスホロアミダイト１２を得た（０．３９ｇ、通算収率６６％）。

【0064】

（ステップ１２：ＤＭＴｒ－Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ｔ_ＯＴＢＳ（１３）の合成

【化21】

【0065】

５´－ＤＭＴｒ保護ホスホロアミダイト３量体１２（０．５４ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）および５´－無保護二量体１０（０．２４ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン―アセトニトリル溶液（６ｍＬ）に、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（０．１９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で９０分撹拌した後、ＴＢＨＰのデカン溶液（０．２０ｍＬ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、さらに室温で３０分撹拌した。反応液を濃縮後、得られた粗生成物をジクロロメタン―メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の５´，３´－保護ｄＡＡＴＡＴ５量体１３を得た（０．６７ｇ、収率９４％）。

【0066】

（ステップ１３：ＤＭＴｒ－Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ｔ_ＯＨ（１４）の合成）

【化22】

【0067】

５´，３´－保護ｄＡＡＴＡＴ５量体１３（０．６７ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）に、フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液を（０．５６ｍＬ、０．５６ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。４時間撹拌した後、反応液を濃縮し、得られた粗生成物をジクロロメタン―メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の５´－保護３´－無保護５量体１４を得た（０．５１ｇ、通算収率８０％）。

【0068】

（ステップ１４：ＤＭＴｒ－Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ａ^Ｂｚ _{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（１５）の合成）

【化23】

【0069】

５´－保護３´－無保護ｄＡＡＴＡＴ５量体１４（０．４６ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン―アセトニトリル溶液（２．０ｍＬ）に、アミダイト化試薬ＣＨ_２＝ＣＨＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（０．８９μＬ、０．３１ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（０．０１０ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を０℃下で２回に分けて加えた。室温で１２時間撹拌した後、ジクロロメタン（５．０ｍＬ）を加え、ヘキサン―酢酸エチルを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の５量体ホスホロアミダイト１５を得た（０．４１ｇ、通算収率８１％）。

【0070】

〔実施例４〕
（ｄＴ_１８の固相合成）
ＮＴＳ社のＭ－２－ＭＸオリゴヌクレオチド固相合成装置において、実施例１で得られた合成セグメント（４量体ホスホロアミダイト）３を用い、ＣｈｅｍＧｅｎｅ社のユニバーサルリンカーＣＰＧ１０００Å（１．０μｍｏｌ）を出発物質として下記のプロトコールでオリゴヌクレオチド（ｄＴ１８量体）を合成した。
合成サイクル：
（縮合）０．１Ｍ４量体ホスホロアミダイト３／アセトニトリル溶液（１４．４μＬ）
０．２５Ｍ５－ベンジルチオテトラゾール／アセトニトリル溶液（２４．８μＬ）
反応時間：２分
（キャッピング）１０％無水酢酸／ＴＨＦ溶液（３２０μＬ）
０．２ＭＮ－メチルイミダゾール／アセトニトリル溶液
反応時間：１分
（酸化）０．０５Ｍヨウ素／水／ピリジン溶液（３２０μＬ）
（脱トリチル化）１０％ジクロロ酢酸／トルエン溶液（７６５μＬ）
反応時間：２分
（切り出し・脱保護）濃アンモニア水
反応時間：６０分、室温

【0071】

得られたｄＴ１８量体のＬＣスペクトルを図３に示した。

【0072】

以上から、本実施形態のオリゴヌクレオチド合成用セグメントによれば、オリゴヌクレオチド合成において、ヌクレオシド３量体以上の長さのアミダイトを用いることができる。このため、目的とする長さがＮ量体であるオリゴヌクレオチドの合成の場合には、汎用されているオリゴヌクレオチド合成のモノマーアミダイトのカップリング工程で生じる、１塩基分だけ短い（Ｎ－１）量体、２塩基分だけ短い（Ｎ－２）量体等が生じ得ない。したがって、オリゴヌクレオチド合成の最終段階で、クロマトグラフィー等を用いてＮ量体を精製する際に、目的とするＮ量体の移動度と、（Ｎ－３）量体以下の長さの副生成物の移動度との差が大きいことから、Ｎ量体とそれ以外とを分離するための精製負荷を小さくすることができる。

【0073】

また、本実施形態のオリゴヌクレオチド合成用セグメントによれば、同じＮ量体のオリゴヌクレオチドを合成するにあたって、従来法である１塩基ずつ伸長を行う方法と比べて、必要となる工程数を減らすことができる。したがって、目的とする長さのオリゴヌクレオチドの収率を向上させることができる。

【0074】

また、本実施形態のオリゴヌクレオチド合成用セグメントの製造にあたっては、セグメントの段階で部分的に酸化／硫化した５価のリン酸結合部分を形成しておくことができる。したがって、オリゴヌクレオチド中の一部のリン酸結合のみを他の部分のリン酸結合と異なる酸化／硫化状態とする場合においても、オリゴヌクレオチド合成の手順を変えることなく、より簡便に、目的とする修飾されたリン酸結合部分を含むオリゴヌクレオチドを合成することができる。

【0075】

さらに、本実施形態のオリゴヌクレオチド合成用セグメントの製造方法においては、５´－水酸基のみ保護したヌクレオシド、または５´－水酸基、３´－水酸基をともに未保護としたヌクレオシドと、アミダイト調製用のリン酸化剤とを直接反応させる。このため、モノマーの３´－アミダイトの市販品を購入したり、予め調製しておく必要が無い。したがって、所望のオリゴヌクレオチド合成用セグメントを従来法と比べて大量に製造することが可能となる。

【0076】

また、本実施形態のオリゴヌクレオチド合成用セグメントは、比較的短鎖のオリゴヌクレオチドを液相合成法で大量に合成する場合に用いることができるとともに、固相合成法による長鎖のオリゴヌクレオチド合成にも用いることができる。したがって、Ｎ－１やＮ－２の長さを有する副生成物が生じないことから、特に長鎖のＮ量体オリゴヌクレオチドを合成した後の精製負荷を小さくすることができ、より簡便な精製で目的とするＮ量体オリゴヌクレオチドを得ることができる。

【図1】

【図2】

【図3】