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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-19
(45)【発行日】2022-05-27
(54)【発明の名称】セロオリゴ糖の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/00 20060101AFI20220520BHJP
【ＦＩ】
C12P19/00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2018088774
(22)【出願日】2018-05-02
(65)【公開番号】P2019193601
(43)【公開日】2019-11-07
【審査請求日】2021-02-02
(73)【特許権者】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000003506
【氏名又は名称】第一工業製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100076314
【弁理士】
【氏名又は名称】蔦田 正人
(74)【代理人】
【識別番号】100112612
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 哲士
(74)【代理人】
【識別番号】100112623
【弁理士】
【氏名又は名称】富田 克幸
(74)【代理人】
【識別番号】100163393
【弁理士】
【氏名又は名称】有近 康臣
(74)【代理人】
【識別番号】100189393
【弁理士】
【氏名又は名称】前澤 龍
(74)【代理人】
【識別番号】100203091
【弁理士】
【氏名又は名称】水鳥 正裕
(72)【発明者】
【氏名】芹澤 武
(72)【発明者】
【氏名】澤田 敏樹
(72)【発明者】
【氏名】西浦 聖人
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１１３９３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１０６０１３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Carbohydr. Res.，2009年，Vol.344, No.18，pp.2468-2473
【文献】Anal. Chem.，2015年，Vol.87, No.19，pp.9639-9646
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
α－グルコース－１－リン酸と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含み、
前記水溶性有機溶媒が、炭素数１～４のアルコール類、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも一種である、
セロオリゴ糖の製造方法。
【請求項2】
前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１に記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵素を用いたセロオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
酵素を用いたセルロースオリゴマー、即ちセロオリゴ糖の製造方法として、過リン酸分解酵素であるセロデキストリンホスホリラーゼの逆反応を利用した合成法が知られている。
【0003】
例えば、非特許文献１には、α－グルコース－１－リン酸とプライマーとしてのグルコースとを、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させることにより、平均重合度９のセロオリゴ糖を合成することが記載されている。
【0004】
また、特許文献１には、可溶性澱粉にα－グルカンホスホリラーゼを作用させてグルコース－１－リン酸を生成し、得られたグルコース－１－リン酸をグルコースの存在下にセロビオースホスホリラーゼ及びセロデキストリンホスホリラーゼと反応させることにより重合度２～６のセロオリゴ糖を合成することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００１－１１２４９６号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Masao Hiraishi他５名,”Synthesis of Highly Ordered Cellulose II in vitro usingCellodextrin Phosphsrylase”, Carbohydrate Research, Vol. 344, (2009) pp.2468-2473
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
一般に、酵素は水溶液中で生化学反応を触媒し、有機溶媒の存在下では容易に変性・失活してその触媒機能を喪失することから、セロデキストリンホスホリラーゼを用いたセロオリゴ糖の酵素合成についても、従来は反応溶媒として水を用いて、緩衝液中で反応を行っている。
【0008】
しかしながら、反応溶媒として水を用いた場合、セロオリゴ糖の重合度の分布が広く、平均重合度に対して相当程度大きな重合度を持つセロオリゴ糖が生成されることが判明した。このような高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制して重合度の分布を小さくすることがセロオリゴ糖の性能向上の観点から望ましい場合がある。
【0009】
本発明の実施形態は、以上の点に鑑み、セロオリゴ糖の酵素合成において高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法は、α－グルコース－１－リン酸と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含むものである。
【発明の効果】
【0011】
本発明の実施形態であると、セロデキストリンホスホリラーゼを用いたセロオリゴ糖の酵素合成において、反応溶媒として水溶性有機溶媒を添加した混合溶媒を用いることにより、高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制することができ、重合度の分布が小さいセロオリゴ糖を合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における酵素反応後の溶液状態を示す写真である。
【図2】セロビオースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における酵素反応後の溶液状態を示す写真である。
【図3】グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。
【図4】セロビオースプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。
【図5】セロビオースプライマー合成系における、２種の洗浄溶媒それぞれについての、沈殿生成物と上清中の生成物のＭＳスペクトルを示す図である。
【図6】セロビオースプライマー合成系における、沈殿生成物と上清中の生成物のＭＳスペクトルを示す図である。
【図7】エチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。
【図8】オクチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加試験における沈殿生成物のＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本実施形態に係るセロオリゴ糖の製造方法は、α－グルコース－１－リン酸（以下、αＧ１Ｐということがある）と、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種のプライマーとを、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒中で、セロデキストリンホスホリラーゼ（以下、ＣＤＰということがある）と反応させるものである。
【0014】
この反応は、ＣＤＰの逆反応を利用した合成法であり、αＧ１Ｐをグルコース供与体とし、グルコース、セロビオース及びアルキル化グルコースからなる群から選択される少なくとも一種をプライマー（即ち、グルコース受容体）として、これらをＣＤＰと反応させることにより、プライマーに対してαＧ１Ｐがモノマーとして逐次的に重合される。
【0015】
例えば、プライマーがグルコースの場合の反応は以下に示す通りである。
また、プライマーがセロビオースである場合の反応は以下に示す通りである。
また、プライマーがアルキル化グルコースである場合の反応は以下に示す通りである。
【化1】
【化2】
【化3】
【0016】
上記の反応式中において、ｎは整数であり、セロオリゴ糖の重合度を示す。また、Ｒはアルキル基を示す。
【0017】
アルキル化グルコースにおけるアルキル基としては、例えば、炭素数１～１２のアルキル基が挙げられる。そのため、上記の反応式中のアルキル基Ｒの炭素数は好ましくは１～１２である。具体的には、エチルグルコシド、オクチルグルコシド、デシルグルコシド、ドデシルグルコシドなどが挙げられる。
【0018】
ＣＤＰについては、クロストリジウム・サーモセラリム（Clostridium thermocellum）、セルロモナス（Cellulomonas）属などの微生物が産生することが知られており、これらの微生物を利用して公知の方法により取得することができる。例えば、ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１－８に記載の方法に準じて、大腸菌発現系によりClostridium thermocellum YM4由来ＣＤＰを調製することができる。
【0019】
なお、ＣＤＰの酵素量は、例えばαＧ１Ｐとセロビオース及びＣＤＰをインキュベーションし、ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間当たり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕとして求めることができる。
【0020】
本実施形態では、上記のＣＤＰを用いたセロオリゴ糖の酵素合成において、反応溶媒として、水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いることを特徴とする。混合溶媒は、水と水溶性有機溶媒を混合してなる溶媒であり、通常は水溶液である緩衝液と水溶性有機溶媒とを混合して得られる。
【0021】
水溶性有機溶媒とは、２０℃において水１００ｍＬへの溶解度が５ｍＬ以上の有機溶媒であり、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔ－ブタノールなどの炭素数１～４のアルコール類； アセトンなどのケトン類； テトラヒドロフランなどのエーテル類 Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアミド類； アセトニトリルなどのニトリル類； ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類などが挙げられる。これらはいずれか一種用いても、２種以上組み合わせて用いてもよい。水溶性有機溶媒として、より好ましくは、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択される少なくとも一種を用いることである。
【0022】
水溶性有機溶媒と混合する緩衝液としては、特に限定されず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられ、反応温度において反応溶媒のｐＨを５～９程度に維持できる緩衝液が好ましく用いられる。
【0023】
水と水溶性有機溶媒との使用割合は、特に限定されず、混合溶媒１００体積％として、水溶性有機溶媒が５～５０体積％であることが好ましく、より好ましくは５～４０体積％であり、更に好ましくは５～３０体積％であり、１０～２５体積％でもよく、１０～２０体積％でもよい。
【0024】
反応条件については特に限定しないが、以下の通りであることが好ましい。αＧ１Ｐの濃度は、１０～１０００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１００～３００ｍＭである。プライマー（グルコース、セロビオース、アルキル化グルコース）の濃度は、１０～２００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは３０～７０ｍＭである。ＣＤＰの濃度は、０．０１～１．５Ｕ／ｍＬであることが好ましく、より好ましくは０．０５～０．５Ｕ／ｍＬである。また、緩衝液の濃度（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＨＥＰＥＳの濃度）としては、１００～１０００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは２５０～７５０ｍＭである。反応温度としては、１０～８０℃でもよく、２０～７０℃でもよい。また、反応時間としては、１時間～１５日間でもよく、１日間～１０日間でもよい。
【0025】
反応終了後、セロオリゴ糖を含む反応液を得ることができる。該反応液には酵素であるＣＤＰやプライマーなどが含まれるため、これを除去するために洗浄を行ってもよい。洗浄は、遠心により沈殿物と上清を分離し、洗浄溶媒を用いて沈殿物を再分散させる工程を繰り返すことにより行うことができ、セロオリゴ糖が得られる。洗浄溶媒としては、反応溶媒と同様の水と水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いてもよく、あるいはまた水を用いてもよい。セロオリゴ糖は、上記の沈殿物（沈殿生成物）として得られるが、上清中にも含まれており、従って、上清中の生成物を回収することによってもセロオリゴ糖が得られる。
【0026】
得られるセロオリゴ糖は、グルコースがβ－１，４グリコシド結合により連結された構造を持つオリゴ糖である。セロオリゴ糖の重合度（即ち、上記式中のｎ）は、例えば４以上でもよく、５以上でもよく、６以上でもよく、また、例えば１５以下でもよく、１３以下でもよく、１１以下でもよい。平均重合度（ＤＰ）は、特に限定しないが、例えば５．５以上でもよく、６．０以上でもよく、６．３以上でもよく、また、例えば９．０以下でもよく、８．５以下でもよく、８．３以下でもよい。
【0027】
本実施形態により得られるセロオリゴ糖は、グルコースやセロビオースをプライマーとして用いて合成した場合のようにアルキル化されてないものでもよく、あるいはまた、アルキル化グルコースをプライマーとして用いて合成した場合のようにアルキル化されたものでもよい。すなわち、本実施形態に係るセロオリゴ糖は、アルキル化セロオリゴ糖のようなセロオリゴ糖の誘導体も包含するものである。ナトリウムイオン付加体やカリウムイオン付加体などのアルカリ金属イオン付加体も当然に包含される。なお、アルキル化グルコースをプライマーとして用いて合成した後、アルキル基を公知の方法で加水分解することにより、アルキル化されていないセロオリゴ糖を製造してもよい。
【0028】
本実施形態であると、ＣＤＰを用いたセロオリゴ糖の酵素合成において、反応溶媒として水と水溶性有機溶媒との混合溶媒を用いることにより、高重合度のセロオリゴ糖の生成を抑制し、比較的重合度が低いセロオリゴ糖を選択的に得ることができる。
【0029】
プライマーとしては、グルコースよりもセロビオースを用いた方が生成物の重合度選択性がより高くなり、重合度の分布をより狭くすることができる。その理由は、これにより限定することを意図するものではないが、セロビオースの方が、酵素間における反応開始までの時間がより均一になるためと考えられる。
【0030】
本実施形態に係るセロオリゴ糖の用途は、特に限定されず、例えば医薬品分野など、公知の様々な用途に用いることができる。
【実施例】
【0031】
以下、実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0032】
１．実験方法
１－１．試薬
ＬＢ－ＢＲＯＴＨ ＬＥＮＮＯＸ及びＬＢ－ＡＧＡＲ ＬＥＮＮＯＸはフナコシより購入した。グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル－β－Ｄ（－）－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１－ブタノール、αＧ１Ｐ二ナトリウム・ｎ水和物、４０％重水酸化ナトリウム重水溶液は和光純薬より購入した。
１－１．試薬
ＬＢ－ＢＲＯＴＨ ＬＥＮＮＯＸ及びＬＢ－ＡＧＡＲ ＬＥＮＮＯＸはフナコシより購入した。グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル－β－Ｄ（－）－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１－ブタノール、αＧ１Ｐ二ナトリウム・ｎ水和物、４０％重水酸化ナトリウム重水溶液は和光純薬より購入した。
【0033】
Ｄ－（＋）－セロビオースはナカライテスクより購入した。ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）アガロースゲルはＱＩＡＧＥＮより購入した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）はタカラバイオより購入した。
【0034】
アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、重水、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ １－７ ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐ１４Ｒ ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（Ｐ１４Ｒ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ ＡＣＴＨ Ｆｒａｇｍｅｎｔ １８－３９ ＭＡＬＤＩ－ＭＳスタンダード（ＡＣＴＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アセトニトリルはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
【0035】
その他の試薬は、特に表記しない限りナカライテスクより購入し、特級以上の試薬を使用した。
【0036】
超純水は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ－１０， Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された水を使用した。純水はＴＡＮＫ ６０ Ｌｉｔｅ ＰＥ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された水を使用した。
【0037】
１－２．セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の調製及び酵素活性評価
ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１－８に記載の方法と同様の方法により調製した。詳細は以下の通り。
ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１－８に記載の方法と同様の方法により調製した。詳細は以下の通り。
【0038】
１－２－１．試薬の調製
（１）滅菌精製水
５００ｍＬ広口メディウム瓶に超純水５００ｍＬを採取してオートクレーブ（１２１℃、２０分間、ＢＳ－２４５、ＴＯＭＹ）して室温で保存した。
（１）滅菌精製水
５００ｍＬ広口メディウム瓶に超純水５００ｍＬを採取してオートクレーブ（１２１℃、２０分間、ＢＳ－２４５、ＴＯＭＹ）して室温で保存した。
【0039】
（２）５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液
カナマイシン硫酸塩１．５ｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して－２０℃で保存した。
カナマイシン硫酸塩１．５ｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して－２０℃で保存した。
【0040】
（３）１０ｍＭＩＰＴＧストック溶液
ＩＰＴＧ７１．５ｍｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内においてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して－２０℃で保存した。
ＩＰＴＧ７１．５ｍｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内においてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して－２０℃で保存した。
【0041】
（４）ＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレート
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ－ＡＧＡＲ ＬＥＮＮＯＸ２．８ｇを採取し、超純水８０ｍＬを添加して溶解させてオートクレーブした。６０℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液８０μＬを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、４℃で保存した。調製後１ヶ月以内に使用した。
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ－ＡＧＡＲ ＬＥＮＮＯＸ２．８ｇを採取し、超純水８０ｍＬを添加して溶解させてオートクレーブした。６０℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液８０μＬを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、４℃で保存した。調製後１ヶ月以内に使用した。
【0042】
（５）５０％グリセロール溶液
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にグリセロール５０ｍＬ、超純水５０ｍＬを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にグリセロール５０ｍＬ、超純水５０ｍＬを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
【0043】
（６）ＬＢ培地
５００ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ－ＢＲＯＴＨ ＬＥＮＮＯＸ１０ｇを純水５００ｍＬに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
５００ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ－ＢＲＯＴＨ ＬＥＮＮＯＸ１０ｇを純水５００ｍＬに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
【0044】
（７）ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）
３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）４．１８ｇを約６００ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１Ｌにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）４．１８ｇを約６００ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１Ｌにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【0045】
（８）７０％エタノール（バイオテクノロジーグレード）
エタノール（バイオテクノロジーグレード）１４０ｍＬ及び超純水６０ｍＬを２５０ｍＬ広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
エタノール（バイオテクノロジーグレード）１４０ｍＬ及び超純水６０ｍＬを２５０ｍＬ広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
【0046】
（９）洗浄バッファー（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール３４０ｍｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール３４０ｍｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【0047】
（１０）溶出バッファー（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール８．５１ｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール８．５１ｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【0048】
（１１）５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液
アジ化ナトリウム５００ｍｇをプラスチック製スパチュラにより秤量してＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を添加して全量が１０ｍＬとなるよう溶解させて４℃で遮光保存した。
アジ化ナトリウム５００ｍｇをプラスチック製スパチュラにより秤量してＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を添加して全量が１０ｍＬとなるよう溶解させて４℃で遮光保存した。
【0049】
（１２）３０％アクリルアミド／ビス混合溶液
アクリルアミド２９．２ｇ、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド０．８ｇを約７０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で遮光保存した。
アクリルアミド２９．２ｇ、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド０．８ｇを約７０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で遮光保存した。
【0050】
（１３）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）１８．１７ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ８．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）１８．１７ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ８．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
【0051】
（１４）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）
Ｔｒｉｓ６．０６ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ６．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
Ｔｒｉｓ６．０６ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ６．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
【0052】
（１５）１０％ＳＤＳ水溶液
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０ｇを約９０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして室温で保存した。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０ｇを約９０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして室温で保存した。
【0053】
（１６）１０％ＡＰＳ水溶液
過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．１ｇを約１ｍＬの超純水に溶解させて４℃で保存した。
過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．１ｇを約１ｍＬの超純水に溶解させて４℃で保存した。
【0054】
（１７）飽和１－ブタノール
１－ブタノールと超純水を２：１の割合で混合して室温で保存した。
１－ブタノールと超純水を２：１の割合で混合して室温で保存した。
【0055】
（１８）５×泳動バッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、９６０ｍＭグリシン、０．５％ＳＤＳ）
Ｔｒｉｓ１５．１ｇ、グリシン７２．１ｇ、ＳＤＳ５．０ｇを全量が１Ｌとなるように超純水に溶解させて４℃で保存した。使用の際は超純水で５倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で２回とした。
Ｔｒｉｓ１５．１ｇ、グリシン７２．１ｇ、ＳＤＳ５．０ｇを全量が１Ｌとなるように超純水に溶解させて４℃で保存した。使用の際は超純水で５倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で２回とした。
【0056】
（１９）５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０５％ブロモフェノールブルー、１０％ＳＤＳ、５０％グリセロール）
Ｔｒｉｓ２．４２ｇ、ＳＤＳ１０．０ｇ、ブロモフェノールブルー５０ｍｇを５０ｍＬのグリセロールと約４０ｍＬの超純水を添加して溶解させた。６Ｎ塩酸を用いてｐＨ６．８に調整後、１００ｍＬにメスアップした。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。
Ｔｒｉｓ２．４２ｇ、ＳＤＳ１０．０ｇ、ブロモフェノールブルー５０ｍｇを５０ｍＬのグリセロールと約４０ｍＬの超純水を添加して溶解させた。６Ｎ塩酸を用いてｐＨ６．８に調整後、１００ｍＬにメスアップした。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。
【0057】
（２０）１Ｍ ＤＴＴ溶液
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）約１５０ｍｇを１Ｍとなるように約１ｍＬの超純水を添加して溶解させ、－２０℃で保存した。
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）約１５０ｍｇを１Ｍとなるように約１ｍＬの超純水を添加して溶解させ、－２０℃で保存した。
【0058】
（２１）固定液
酢酸５０ｍＬ、エタノール２００ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
酢酸５０ｍＬ、エタノール２００ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
【0059】
（２２）脱色液
酢酸４０ｍＬ、エタノール１２５ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
酢酸４０ｍＬ、エタノール１２５ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
【0060】
（２３）染色液
クマシーブリリアントブルーＲ－２５０ ０．２５ｇを脱色液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
クマシーブリリアントブルーＲ－２５０ ０．２５ｇを脱色液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
【0061】
１－２－２．大腸菌の培養及びＣＤＰの発現
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰグリセロールストックの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Clostridiumthermocellum YM4由来ＣＤＰの遺伝子を含むプラスミドをもつＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ）のグリセロールストックからＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌し、３７℃で８～１２時間培養した。予め乾熱滅菌した試験管に５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液５μＬとＬＢ培地５ｍＬの混合溶液を加えた後、加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから植菌した。ＯＤ６６０が０．６～０．８に達するまで振盪培養機（ＢＲ－２３ＦＰ、ＴＡＩＴＥＣ）を用いて３７℃で振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。その後、培養液８００μＬを１．７ｍＬチューブに採取し、５０％グリセロール溶液１００μＬを添加して混合した。液体窒素で凍結して－８０℃で保存した。
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰグリセロールストックの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Clostridiumthermocellum YM4由来ＣＤＰの遺伝子を含むプラスミドをもつＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ）のグリセロールストックからＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌し、３７℃で８～１２時間培養した。予め乾熱滅菌した試験管に５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液５μＬとＬＢ培地５ｍＬの混合溶液を加えた後、加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから植菌した。ＯＤ６６０が０．６～０．８に達するまで振盪培養機（ＢＲ－２３ＦＰ、ＴＡＩＴＥＣ）を用いて３７℃で振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。その後、培養液８００μＬを１．７ｍＬチューブに採取し、５０％グリセロール溶液１００μＬを添加して混合した。液体窒素で凍結して－８０℃で保存した。
【0062】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰマスタープレートの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰのグリセロールストックもしくは作製後１ヶ月以内のマスタープレートからＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８～１２時間培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま４℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８～１２時間培養して４℃で保存した。
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰのグリセロールストックもしくは作製後１ヶ月以内のマスタープレートからＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８～１２時間培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま４℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにＬＢ－ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８～１２時間培養して４℃で保存した。
【0063】
（３）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ前培養液の調製
乾熱滅菌した試験管にＬＢ培地３ｍＬを採取して５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３μＬを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて３７℃で１０～１２時間振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。
乾熱滅菌した試験管にＬＢ培地３ｍＬを採取して５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３μＬを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて３７℃で１０～１２時間振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。
【0064】
（４）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰの培養とＣＤＰの発現
２本の１Ｌバッフル付きフラスコにＬＢ－ＢＲＯＴＨ ＬＥＮＮＯＸ６ｇをそれぞれ秤量した後、純水３００ｍＬを加えてオートクレーブして放冷した。５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３００μＬをそれぞれに添加して混合した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ前培養液３００μＬを加えた。振盪培養機を用いて３０℃で振盪培養（回転、６００ｒｐｍ）してＯＤ６６０が０．５５～０．６０に達したことを確認後、１０ｍＭ ＩＰＴＧストック溶液３ｍＬをそれぞれ加えて２５℃で２０時間振盪培養（回転、２００ｒｐｍ）してＣＤＰを発現させた。
２本の１Ｌバッフル付きフラスコにＬＢ－ＢＲＯＴＨ ＬＥＮＮＯＸ６ｇをそれぞれ秤量した後、純水３００ｍＬを加えてオートクレーブして放冷した。５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３００μＬをそれぞれに添加して混合した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ前培養液３００μＬを加えた。振盪培養機を用いて３０℃で振盪培養（回転、６００ｒｐｍ）してＯＤ６６０が０．５５～０．６０に達したことを確認後、１０ｍＭ ＩＰＴＧストック溶液３ｍＬをそれぞれ加えて２５℃で２０時間振盪培養（回転、２００ｒｐｍ）してＣＤＰを発現させた。
【0065】
１－２－３．Ｈｉｓタグ精製及び緩衝液置換
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰの破砕によるＣＤＰの抽出
１－２－２項（４）で調製したＣＤＰを発現させたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ懸濁液を５０ｍＬチューブ１２本に約５０ｍＬずつ均等に分注し、遠心機（遠心機：ＥＸ－１２６、ＴＯＭＹ、ローター：３８５０－０４Ｐ、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間、４℃）した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰペレットにＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えてそれぞれ約１５ｍＬにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ懸濁液を４本の１００ｍＬ自立式チューブに約４５ｍＬずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて超音波照射してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰを破砕した。超音波照射は、ｐｏｗｅｒ：２００Ｗ（ダイヤル１０）、ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ：３０％の条件で２サイクル（５秒間超音波照射と２５秒間インターバルの４回繰り返しを１サイクル）行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液中のプロテアーゼ等によるＣＤＰの分解を防ぐために、以降はＥ．ｃｏｌｉ破砕液は常に氷浴した。４本の１００ｍＬチューブ中のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液をそれぞれ５０ｍＬチューブに移して遠心（３５００ｒｐｍ、＞２０分間、４℃）した。その後、デカンテーションにより上清を５０ｍＬチューブに回収した。
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰの破砕によるＣＤＰの抽出
１－２－２項（４）で調製したＣＤＰを発現させたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ懸濁液を５０ｍＬチューブ１２本に約５０ｍＬずつ均等に分注し、遠心機（遠心機：ＥＸ－１２６、ＴＯＭＹ、ローター：３８５０－０４Ｐ、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間、４℃）した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰペレットにＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えてそれぞれ約１５ｍＬにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ懸濁液を４本の１００ｍＬ自立式チューブに約４５ｍＬずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて超音波照射してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰを破砕した。超音波照射は、ｐｏｗｅｒ：２００Ｗ（ダイヤル１０）、ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ：３０％の条件で２サイクル（５秒間超音波照射と２５秒間インターバルの４回繰り返しを１サイクル）行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液中のプロテアーゼ等によるＣＤＰの分解を防ぐために、以降はＥ．ｃｏｌｉ破砕液は常に氷浴した。４本の１００ｍＬチューブ中のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液をそれぞれ５０ｍＬチューブに移して遠心（３５００ｒｐｍ、＞２０分間、４℃）した。その後、デカンテーションにより上清を５０ｍＬチューブに回収した。
【0066】
（２）Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムによるＣＤＰの精製
予め７０％エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径１．８ｃｍ、長さ１０ｃｍのプラスチック製カラムに、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分散液９．８ｍＬを充填した。カラム内を７０％エタノールで満たして流すことでＮＩ－ＮＴＡアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を２回繰り返した。ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）３ｍＬをアプライして流し、さらに３ｍＬアプライした。スパチュラで撹拌してＮｉ－ＮＴＡアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）５ｍＬで４回置換した。
予め７０％エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径１．８ｃｍ、長さ１０ｃｍのプラスチック製カラムに、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分散液９．８ｍＬを充填した。カラム内を７０％エタノールで満たして流すことでＮＩ－ＮＴＡアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を２回繰り返した。ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）３ｍＬをアプライして流し、さらに３ｍＬアプライした。スパチュラで撹拌してＮｉ－ＮＴＡアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）５ｍＬで４回置換した。
【0067】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１－ＣＤＰ破砕液の上清をカラムにアプライし、カラムより流出した溶液を回収してフロースルー溶液とした。洗浄バッファー３～５ｍＬをアプライして置換し、さらに３～５ｍＬアプライした。ピペッティングによりＮｉ－ＮＴＡアガロースゲルを再分散させてゲル層の表面を均一にした後、アプライした洗浄バッファーを流した。さらに洗浄バッファー５ｍＬをアプライして置換する操作を繰り返し、合計で３０ｍＬ以上をアプライした。洗浄バッファーをアプライした際に通過した溶液は全て回収し、洗浄液とした。その後、溶出バッファー３～５ｍＬをアプライし、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつフラクションに分けて回収し、溶出液とした。この操作を繰り返し、合計で溶出バッファー２５ｍＬをアプライした。それぞれのフラクションの吸光度を微量紫外可視分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、２８０ｎｍの吸光度を指標にタンパク質の溶出を確認した。この際、バックグラウンド測定には超純水を用いた。タンパク質の溶出が完了していない場合は、２８０ｎｍの吸収が無くなるまでカラムに溶出バッファーをアプライした。回収した溶出液のうち、吸光度が高いフラクションを回収し、ＣＤＰ溶液とした。
【0068】
（３）ＣＤＰ溶液の緩衝液置換
ＣＤＰ溶液の緩衝液置換はＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、付属の説明書にしたがって行った。ＣＤＰ溶液の容量に応じて、必要な数のＰＤ１０カラムを用いた。付属のアダプターを用いてＰＤ１０カラムを５０ｍＬチューブに固定した。７０％エタノールで満たし、遠心機（ＭＸ－３０５、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（１０００ｇ、２分間、４℃）した。この操作を２回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液をＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で２５０倍希釈して調製した０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を４回繰り返すことでＰＤ１０カラムを緩衝液で置換した。さらに０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液を加え、遠心した。
ＣＤＰ溶液の緩衝液置換はＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、付属の説明書にしたがって行った。ＣＤＰ溶液の容量に応じて、必要な数のＰＤ１０カラムを用いた。付属のアダプターを用いてＰＤ１０カラムを５０ｍＬチューブに固定した。７０％エタノールで満たし、遠心機（ＭＸ－３０５、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（１０００ｇ、２分間、４℃）した。この操作を２回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液をＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で２５０倍希釈して調製した０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を４回繰り返すことでＰＤ１０カラムを緩衝液で置換した。さらに０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ ＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液を加え、遠心した。
【0069】
ＰＤ１０カラムを新たな５０ｍＬチューブに移し、遠心によるＳｅｐｈａｄｅｘの斜面を崩さないようにＣＤＰ溶液をＰＤ１０カラム１本につき１．７５～２．５ｍＬアプライした。前述の遠心時と同じ角度で遠心機に固定し、遠心した。溶出した溶液を回収してＣＤＰストック溶液とし、ＣＤＰストック溶液の２８０ｎｍの吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃにより測定し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。
【0070】
カラム１本につき３０ｍＬのＭＯＰＳ－Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えて静置してカラムを洗浄した。次いで超純水で満たし、遠心する操作を２回繰り返した。同様に５０体積％エタノール水溶液で２回洗浄した。ＰＤ－１０カラムを５０体積％エタノール水溶液で満たして４℃で保存した。
【0071】
１－２－４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によるＣＤＰの精製の確認
（１）１０％アクリルアミドゲルの調製
５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液３．３３ｍＬ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）２．５ｍＬ、超純水４．０１ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液１００μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液５０μＬ、ＴＥＭＥＤ１０μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液３．５ｍＬを２枚のガラスプレートの間隙（０．７５ｍｍ）に加え、飽和１－ブタノール９００μＬを静かに重層し、室温で１時間静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和１－ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
（１）１０％アクリルアミドゲルの調製
５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液３．３３ｍＬ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）２．５ｍＬ、超純水４．０１ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液１００μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液５０μＬ、ＴＥＭＥＤ１０μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液３．５ｍＬを２枚のガラスプレートの間隙（０．７５ｍｍ）に加え、飽和１－ブタノール９００μＬを静かに重層し、室温で１時間静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和１－ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
【0072】
５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液０．４４ｍＬ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）０．４４ｍＬ、超純水２．０３ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液３３μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液１６．７μＬ、ＴＥＭＥＤ１．６５μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。溶液を分離ゲルの上に十分に加え、１０ウェルのコームを空気が入らないように注意しながらセットし、室温で１時間静置して重合した。生成したゲルはガラスプレートごと十分に湿らせたキムワイプで挟み、さらにラップで包み４℃で保存した。
【0073】
（２）電気泳動による評価
１．７ｍＬチューブにＰｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）５μＬ、１Ｍ ＤＴＴ溶液２μＬ、５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２０μＬ、滅菌精製水１７３μＬを加えて混合し、これをマーカーとし、－２０℃で保存した。ＣＤＰストック溶液及びＣＤＰの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ１μＬを５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２μＬ、１Ｍ ＤＴＴ１μＬ、超純水６μＬと混合した。これらと室温で解凍したマーカー１０μＬを１０５℃で熱処理し、卓上小型遠心機（Ｒ５－ＡＱＢＤ０２、Ｒｅｃｅｎｔｔｅｃ）によりスピンダウンした。本項（１）で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器（ミニプロティアンＴｅｔｒａセル、ＢＩＯ ＲＡＤ）にセットし、超純水で５倍希釈した５×泳動バッファーを５００ｍＬ注ぎ、コームを外した。１ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置（ミニプロティアンＴｅｔｒａシステム、ＢＩＯ ＲＡＤ）を用いて電圧１５０Ｖで約４０分間泳動した。バンドがゲルの下端より約１ｃｍ上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー（Ｗａｖｅ－ＰＲ、ＴＡＩＴＥＣＨ）で３０分間振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して６０分間振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して３０分間振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
１．７ｍＬチューブにＰｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）５μＬ、１Ｍ ＤＴＴ溶液２μＬ、５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２０μＬ、滅菌精製水１７３μＬを加えて混合し、これをマーカーとし、－２０℃で保存した。ＣＤＰストック溶液及びＣＤＰの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ１μＬを５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２μＬ、１Ｍ ＤＴＴ１μＬ、超純水６μＬと混合した。これらと室温で解凍したマーカー１０μＬを１０５℃で熱処理し、卓上小型遠心機（Ｒ５－ＡＱＢＤ０２、Ｒｅｃｅｎｔｔｅｃ）によりスピンダウンした。本項（１）で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器（ミニプロティアンＴｅｔｒａセル、ＢＩＯ ＲＡＤ）にセットし、超純水で５倍希釈した５×泳動バッファーを５００ｍＬ注ぎ、コームを外した。１ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置（ミニプロティアンＴｅｔｒａシステム、ＢＩＯ ＲＡＤ）を用いて電圧１５０Ｖで約４０分間泳動した。バンドがゲルの下端より約１ｃｍ上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー（Ｗａｖｅ－ＰＲ、ＴＡＩＴＥＣＨ）で３０分間振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して６０分間振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して３０分間振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
【0074】
１－２－５．ＣＤＰの酵素活性測定
Ｄ－（＋）－セロビオースを３００ｍＭとなるように超純水を用いて溶解させ、セロビオースストック溶液とした。ＣＤＰの活性は以下のように測定した。αＧ１Ｐ５０ｍＭとＤ－（＋）－セロビオース５０ｍＭ、及び所定倍率希釈されたＣＤＰを含む３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を３７℃でインキュベーションした。ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義した際のＵ／ｍＬを求め、酵素活性とした。ＣＤＰの希釈率は、反応時間が１００分の際におけるαＧ１Ｐの転化率が１０％以下になるように決定した。
Ｄ－（＋）－セロビオースを３００ｍＭとなるように超純水を用いて溶解させ、セロビオースストック溶液とした。ＣＤＰの活性は以下のように測定した。αＧ１Ｐ５０ｍＭとＤ－（＋）－セロビオース５０ｍＭ、及び所定倍率希釈されたＣＤＰを含む３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を３７℃でインキュベーションした。ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義した際のＵ／ｍＬを求め、酵素活性とした。ＣＤＰの希釈率は、反応時間が１００分の際におけるαＧ１Ｐの転化率が１０％以下になるように決定した。
【0075】
１－３．セロオリゴ糖の酵素合成
１－３－１．ＣＤＰによるセロオリゴ糖の酵素合成（プライマー：グルコース）
２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２３．８ｇを約６０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１００ｍＬにメスアップしてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。これをＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）とし、４℃で保存した。
１－３－１．ＣＤＰによるセロオリゴ糖の酵素合成（プライマー：グルコース）
２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２３．８ｇを約６０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１００ｍＬにメスアップしてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。これをＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）とし、４℃で保存した。
【0076】
Ｄ－（＋）－グルコース及びαＧ１Ｐ二ナトリウムｎ水和物を所定量秤量し、それぞれ１Ｍとなるよう超純水に溶解させて、１Ｍグルコースストック溶液及び１ＭαＧ１Ｐ水溶液を得た。
【0077】
ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ＭαＧ１Ｐ水溶液、１Ｍグルコースストック溶液を反応時の濃度がそれぞれ５００ｍＭ、２００ｍＭ、５０ｍＭとなるよう４ｍＬチューブに加え、水溶性有機溶媒として所定量のメタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、使用するＣＤＰストック溶液の量を考慮し、超純水でメスアップした。超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。終濃度が０．２Ｕ／ｍＬになるようＣＤＰストック溶液を適量加え、気泡が発生しないようピペッティングにより混合した。１．７ｍＬチューブもしくは１ｍＬマイティーバイアルに所定量分取し、６０℃で３日間インキュベーションした。
【0078】
反応溶媒である混合溶媒に関し、１０体積％のＭｅＯＨを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ７．５）を１０％ＭｅＯＨと表すこととした（即ち、混合溶媒中に１０体積％のＭｅＯＨを含む）。他の混合溶媒についても同様に表す。なお、コントロールとして、水溶性有機溶媒を添加せず、その他は同様にしてインキュベーションしたものを「（－）」と表す。
【0079】
１－３－２．ＣＤＰによるセロオリゴ糖の酵素合成（プライマー：セロビオース）
１Ｍグルコースストック溶液の代わりに３００ｍＭセロビオースストック溶液を用い、その他は１－３－１項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。
１Ｍグルコースストック溶液の代わりに３００ｍＭセロビオースストック溶液を用い、その他は１－３－１項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。
【0080】
１－３－３．ＣＤＰによるセロオリゴ糖の酵素合成（プライマー：アルキル化グルコース）
１Ｍグルコースストック溶液の代わりに、３００ｍＭエチルグルコシドストック溶液又は３００ｍＭオクチルグルコシドストック溶液を用い、その他は１－３－１項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。３００ｍＭエチルグルコシドストック溶液及び３００ｍＭオクチルグルコシドストック溶液は、エチルβ－Ｄ－グルコシド（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）及びｎ－オクチルβ－グルコシド（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を所定量秤量し、それぞれ３００ｍＭとなるよう超純水に溶解させて調製したものである。
１Ｍグルコースストック溶液の代わりに、３００ｍＭエチルグルコシドストック溶液又は３００ｍＭオクチルグルコシドストック溶液を用い、その他は１－３－１項と同様にしてセロオリゴ糖の酵素合成反応を行った。３００ｍＭエチルグルコシドストック溶液及び３００ｍＭオクチルグルコシドストック溶液は、エチルβ－Ｄ－グルコシド（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）及びｎ－オクチルβ－グルコシド（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を所定量秤量し、それぞれ３００ｍＭとなるよう超純水に溶解させて調製したものである。
【0081】
１－３－４．酵素合成されたセロオリゴ糖の精製
１－３－１～３項において調製された生成物を各種分析に用いるために、超純水又は超純水と有機溶媒の混合溶媒を洗浄溶媒として用いて精製した。詳細には、洗浄溶媒を加えてピペッティングによる水流により生成物を機械的に破壊して分散させ、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間以上、４℃）し、上清を除去した。洗浄溶媒を加えて１０倍希釈し沈澱物を再分散させ、遠心する操作を５回繰り返し、溶液の置換率が９９．９９９％以上となるまで精製した。精製した分散液を１００℃のヒートブロックにより１０分間加熱することで、残存するＣＤＰを失活させた。なお、コントロール（－）については、洗浄溶媒として超純水を用いて精製した。
１－３－１～３項において調製された生成物を各種分析に用いるために、超純水又は超純水と有機溶媒の混合溶媒を洗浄溶媒として用いて精製した。詳細には、洗浄溶媒を加えてピペッティングによる水流により生成物を機械的に破壊して分散させ、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間以上、４℃）し、上清を除去した。洗浄溶媒を加えて１０倍希釈し沈澱物を再分散させ、遠心する操作を５回繰り返し、溶液の置換率が９９．９９９％以上となるまで精製した。精製した分散液を１００℃のヒートブロックにより１０分間加熱することで、残存するＣＤＰを失活させた。なお、コントロール（－）については、洗浄溶媒として超純水を用いて精製した。
【0082】
生成物の収量は、精製後の水分散液を絶乾することで算出した。予め１０５℃で２４時間乾燥させ、デシケーター内で放冷したサンプル管を秤量し、精製後の水分散液を加えて１０５℃で２４時間乾燥させ、その後デシケーター内で放冷して秤量した。乾燥前後の重量の差から生成物の濃度を算出した。この操作は同時に３回行い、それらの平均値より生成物の収量を算出した。
【0083】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）法による測定を用いる場合は、精製後の分散液を超純水により希釈して用いた。
【0084】
１－４．酵素合成されたセロオリゴ糖の特性評価
１－４－１．生成物の反転倒立試験
１ｍＬマイティーバイアルを用いて調製したサンプルについて、反転倒立試験によりゲル化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物が流動しなかった場合にゲル状の構造体を形成したと判断した。
１－４－１．生成物の反転倒立試験
１ｍＬマイティーバイアルを用いて調製したサンプルについて、反転倒立試験によりゲル化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物が流動しなかった場合にゲル状の構造体を形成したと判断した。
【0085】
１－４－２．生成物の化学構造の評価
（１）生成物の収量測定
１－３－４項で示した手法で、絶乾により収量を算出した。
（１）生成物の収量測定
１－３－４項で示した手法で、絶乾により収量を算出した。
【0086】
（２）生成物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定
質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはＢｒａｄｙｋｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ １－７水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ１－７、０．０５質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０質量％アセトニトリル）、Ｐ１４Ｒ水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ Ｐ１４Ｒ、０．１質量％ＴＦＡ）、ＡＣＴＨ ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ ＡＣＴＨ ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９、０．１質量％ＴＦＡ）それぞれ５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＢＡ水溶液５μＬ、１．０質量％ＴＦＡ水溶液１μＬ、アセトニトリル４μＬを１．７ｍＬチューブ中で混合して調製した。
質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはＢｒａｄｙｋｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ １－７水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ１－７、０．０５質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０質量％アセトニトリル）、Ｐ１４Ｒ水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ Ｐ１４Ｒ、０．１質量％ＴＦＡ）、ＡＣＴＨ ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ ＡＣＴＨ ｆｒａｇｍｅｎｔ１８－３９、０．１質量％ＴＦＡ）それぞれ５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＢＡ水溶液５μＬ、１．０質量％ＴＦＡ水溶液１μＬ、アセトニトリル４μＬを１．７ｍＬチューブ中で混合して調製した。
【0087】
生成物の測定サンプルは、０．１％（ｗ／ｖ）とした生成物の水分散液１μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＢＡ水溶液１μＬ、トリフルオロ酢酸（０．２体積％）のアセトニトリル溶液３μＬを、水酸化カリウム（３．３質量％）のメタノール溶液により洗浄したマイティーバイアル中で混合して調製した。
【0088】
標準サンプル及び生成物の測定サンプルそれぞれ１μＬをサンプルプレートにマウントし、風乾させる操作を５回繰り返した。１時間以上、真空乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＡＸＩＭＡ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、島津製作所）で測定した。測定条件はＭｏｄｅ：Ｌｉｎｅｒ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ：１．０－３０００．０、Ｍａｘ Ｌｅａｓｅｒ Ｒａｐ Ｒａｔｅ：１０、ｐｏｗｅｒ：１００、ｐｒｏｆｉｌｅｓ：１００、ｓｈｏｔｓ：２、Ｉｏｎ Ｇａｔｅ（Ｄａ）：Ｂｌａｎｋ５００、Ｐｕｌｓｅｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｔ （Ｄａ）：１０００．０とした。
【0089】
測定により得られたＭＳスペクトルは、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：Ｇａｕｓｓｉａｎ、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｗｉｄｔｈ：１９、Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｆｉｌｔｅｒ ｗｉｄｔｈ：１０００の条件で処理した。
【0090】
ナトリウムイオン付加体とカリウムイオン付加体のピーク面積を合計し、各重合度のピーク面積を算出した。算出した各重合度のピーク面積の割合から重合度の平均値を算出し、平均重合度とした。重合度の分布は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを以下の式に従って解析することにより、平均重合度からの標準偏差により評価した。
【数1】
【0091】
２．結果及び考察
２－１．酵素反応後の溶液状態
グルコースもしくはセロビオースをＣＤＰによる酵素合成系に適用した。モノマーとしてαＧ１Ｐ、プライマーとしてグルコースもしくはセロビオースを用い、所定濃度の水溶性有機溶媒を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ７．５）中、６０℃で３日間インキュベーションした。その結果、いずれの水溶性有機溶媒を用いた場合も反応後の溶液全体が白濁したことから、同条件下でプライマーがＣＤＰにより認識され、セロオリゴ糖が酵素合成されていることが示唆された（図１（グルコースプライマー合成系）および図２（セロビオースプライマー合成系）参照）。さらに、グルコースプライマーでは反応溶媒として１０％ＥｔＯＨ、２０％ＤＭＳＯを用いた場合、及び、セロビオースプライマーではいずれの反応溶媒の場合も、容器を反転させても溶液が流れ落ちず、ゲル状の構造体が生成された。
２－１．酵素反応後の溶液状態
グルコースもしくはセロビオースをＣＤＰによる酵素合成系に適用した。モノマーとしてαＧ１Ｐ、プライマーとしてグルコースもしくはセロビオースを用い、所定濃度の水溶性有機溶媒を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ７．５）中、６０℃で３日間インキュベーションした。その結果、いずれの水溶性有機溶媒を用いた場合も反応後の溶液全体が白濁したことから、同条件下でプライマーがＣＤＰにより認識され、セロオリゴ糖が酵素合成されていることが示唆された（図１（グルコースプライマー合成系）および図２（セロビオースプライマー合成系）参照）。さらに、グルコースプライマーでは反応溶媒として１０％ＥｔＯＨ、２０％ＤＭＳＯを用いた場合、及び、セロビオースプライマーではいずれの反応溶媒の場合も、容器を反転させても溶液が流れ落ちず、ゲル状の構造体が生成された。
【0092】
２－２．酵素合成されたセロオリゴ糖の重合度とその分布の評価
２－２－１．グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
グルコースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図３に示す通りであり、いずれもｍ／ｚの間隔がグルコシルユニット（１６２Ｄａ）に対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が６～１６量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合、水溶性有機溶媒を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが同等又はやや低くなった。また、標準偏差が小さく、重合度の分布が狭いものであった。また、図３から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、重合度ｎが１４～１６である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
２－２－１．グルコースプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
グルコースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図３に示す通りであり、いずれもｍ／ｚの間隔がグルコシルユニット（１６２Ｄａ）に対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が６～１６量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合、水溶性有機溶媒を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが同等又はやや低くなった。また、標準偏差が小さく、重合度の分布が狭いものであった。また、図３から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、重合度ｎが１４～１６である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
【0093】
下記表１は、図３のＭＳスペクトルデータから１０％ＭｅＯＨと２０％ＤＭＳＯとコントロール（－）についての各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表１から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高いオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、表１では重合度１５及び１６の割合を示していないが、これはそれらの割合が１％未満であるためである。また、表１中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
【表1】
【0094】
２－２－２．セロビオースプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
セロビオースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図４に示す通りであり、いずれもｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が４～１０量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、２－２－１項での結果との対比から明らかなように、セロビオースをプライマーとして用いた場合、グルコースをプライマーとして用いた場合よりも、重合度が低く、その分布も狭いものであり、重合度選択性がより高いことがわかった。
セロビオースプライマーを用いて各種の混合溶媒中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合の有機溶媒を含む水を洗浄溶媒として用いて精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図４に示す通りであり、いずれもｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が４～１０量体程度のセルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、２－２－１項での結果との対比から明らかなように、セロビオースをプライマーとして用いた場合、グルコースをプライマーとして用いた場合よりも、重合度が低く、その分布も狭いものであり、重合度選択性がより高いことがわかった。
【0095】
水溶性有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合、水溶性有機溶媒を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰがやや低くなった。一方、標準偏差についてはコントロール（－）でもかなり小さい値であるため、顕著な違いは認められなかった。しかしながら、図４のＭＳスペクトルから明らかなように、混合溶媒を用いた場合、重合度ｎが８～１０である高重合度のオリゴマーの生成がコントロール（－）に対して抑えられていた。
【0096】
下記表２は、図４のＭＳスペクトルデータから１０％ＭｅＯＨと１５％ＤＭＦと２０％ＤＭＳＯとコントロール（－）についての各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表２から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高い（重合度＝８～９）オリゴマーの生成が抑えられており、特に１５％ＤＭＦと２０％ＤＭＳＯにおいてその効果が高かった。なお、表２中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
【0097】
絶乾により算出した沈澱生成物の収量とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定から算出した平均重合度ＤＰを用いて、モノマーであるαＧ１Ｐの転化率を算出した。結果は表２に示す通りであり、１０％ＭｅＯＨ、１５％ＤＭＦ、２０％ＤＭＳＯ、及びコントロール（－）についてのαＧ１Ｐ転化率はそれぞれおよそ６５％、５０％、６０％、５５％であった。
【表2】
【0098】
２－２－３．洗浄溶媒の影響、及び沈殿生成物と上清中の生成物の違いの確認
２－２－２項と同様にセロビオースプライマーを用いて２０％ＤＭＳＯ中で酵素合成した生成物について、洗浄溶媒として水もしくは２０％ＤＭＳＯを用いて遠心・再分散を５回繰り返し精製した。該精製時における３～５回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、それぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。
２－２－２項と同様にセロビオースプライマーを用いて２０％ＤＭＳＯ中で酵素合成した生成物について、洗浄溶媒として水もしくは２０％ＤＭＳＯを用いて遠心・再分散を５回繰り返し精製した。該精製時における３～５回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、それぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。
【0099】
結果は図５に示す通りであり、ＭＳスペクトル、平均重合度ＤＰ及び標準偏差について洗浄溶媒による違いはほとんどみられなかった。そのため、２－２－２項におけるＭＳスペクトル等の違いは洗浄溶媒によるものではなく、反応溶媒の違いによるものであることがわかった。
【0100】
２－２－４．上清中の生成物の確認
２－２－２項と同様にセロビオースプライマーを用いて２０％ＤＭＳＯ又は３０％ＤＭＳＯ中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散を５回繰り返し精製した。２０％ＤＭＳＯの反応では該精製時における３～５回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、３０％ＤＭＳＯの反応では該精製時における１回遠心後の上清を混合しミリポア社製ＺｉｐＴｉｐにより脱塩して得られた上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、それぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。
２－２－２項と同様にセロビオースプライマーを用いて２０％ＤＭＳＯ又は３０％ＤＭＳＯ中で酵素合成した生成物について、それぞれ反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散を５回繰り返し精製した。２０％ＤＭＳＯの反応では該精製時における３～５回遠心後の上清を混合した上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、３０％ＤＭＳＯの反応では該精製時における１回遠心後の上清を混合しミリポア社製ＺｉｐＴｉｐにより脱塩して得られた上清中の生成物と、５回遠心後の沈殿生成物を、それぞれＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。
【0101】
結果は図６に示す通りであり、３０％ＤＭＳＯを反応溶媒とする場合とする場合も、２０％ＤＭＳＯの場合と同様、重合度ｎが８～１０である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、図６における符号Ｚで示すピークは、ＺｉｐＴｉｐ由来の不純物と考えられる。
【0102】
２－２－５．エチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
エチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を５回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図７に示す通りであり、ｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が６～９量体程度のエチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度ｎが９～１１である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
エチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を５回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図７に示す通りであり、ｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が６～９量体程度のエチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度ｎが９～１１である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
【0103】
下記表３は、図７のＭＳスペクトルデータから各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表３から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高いオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、表３中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
【表3】
【0104】
２－２－６．オクチルグルコシドプライマー合成系への有機溶媒の添加効果
オクチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を５回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図８に示す通りであり、ｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が５～７量体程度のオクチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度ｎが７～９である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
オクチルグルコシドプライマーを用い、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いて酵素合成した沈殿生成物について、反応溶媒と同割合のＤＭＳＯを含む水を洗浄溶媒として用いて遠心・再分散操作を５回繰り返すことにより精製した後、沈殿生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル測定した。得られたＭＳスペクトルは、図８に示す通りであり、ｍ／ｚの間隔がグルコシルユニットに対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が５～７量体程度のオクチル化セルロースオリゴマーのナトリウムイオン付加体もしくはカリウムイオン付加体に一致した。したがって、所定の重合度分布を有するセロオリゴ糖が酵素合成されていることが明らかになった。また、反応溶媒として２０％ＤＭＳＯを用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で酵素合成したコントロール（－）と比較して、平均重合度ＤＰが低く、重合度の分布も狭くなっており、重合度ｎが７～９である高重合度のオリゴマーの生成が抑えられていた。
【0105】
下記表４は、図８のＭＳスペクトルデータから各重合度の割合を算出した結果を示したものである。表４から明らかなように、混合溶媒を用いた場合、コントロール（－）と比較して、重合度の高いオリゴマーの生成が抑えられていた。なお、表４中の「０％」とは検出限界以下であることを意味する。
【表4】
【0106】
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】