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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-20
(45)【発行日】2022-05-30
(54)【発明の名称】Ｄ－プシコースを有効成分とする皮膚機能改善組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/60 20060101AFI20220523BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220523BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20220523BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220523BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20220523BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220523BHJP
【ＦＩ】
A61K8/60
A61P17/00
A61P17/16
A61P43/00 105
A61Q19/00
A61Q19/08
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2016158542
(22)【出願日】2016-08-12
(65)【公開番号】P2017036276
(43)【公開日】2017-02-16
【審査請求日】2019-08-07
【審判番号】
【審判請求日】2021-02-01
(31)【優先権主張番号】P 2015159330
(32)【優先日】2015-08-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】501117443
【氏名又は名称】株式会社セレーネ
(73)【特許権者】
【識別番号】511156092
【氏名又は名称】株式会社レアスウィート
(73)【特許権者】
【識別番号】515221576
【氏名又は名称】株式会社レアスウィートコスメ
(73)【特許権者】
【識別番号】304028346
【氏名又は名称】国立大学法人 香川大学
(74)【代理人】
【識別番号】100123984
【弁理士】
【氏名又は名称】須藤 晃伸
(74)【代理人】
【識別番号】100102314
【弁理士】
【氏名又は名称】須藤 阿佐子
(72)【発明者】
【氏名】中村 照彦
(72)【発明者】
【氏名】近藤 浩二
(72)【発明者】
【氏名】小出 克元
(72)【発明者】
【氏名】木下 秀之
(72)【発明者】
【氏名】徳田 雅明
(72)【発明者】
【氏名】永竿 智久
【合議体】
【審判長】前田 佳与子
【審判官】中西 聡
【審判官】穴吹 智子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０００－１０３７２８号公報（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０００－１０９４１９号公報（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第３５７８６５５号明細書（ＵＳ，Ａ）
【文献】特表２００４－５２９９５８号公報（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／１７５１１９号（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－１６６９６４号公報（ＪＰ，Ａ）
【文献】ＤＥＮＤＡ，Ｍ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅｓ ｏｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂａｒｒｉｅｒ ｒｅｃｏ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１１，Ｖｏｌ．２０，ｐ．９４３－９４４
【文献】高橋元次，皮膚計測・評価法の進歩，フレグランスジャーナル，２０１０，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１２，ｐ．５３－６３
【文献】海老原全，皮膚バリア機能からみたアトピー性皮膚炎の治療，アレルギー，２０１４，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．６，ｐ．７５８－７６３
【文献】北島康雄，皮膚バリア機能とその制御，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，２００７，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４，ｐ．４２４－４３２
【文献】池田志斈，角化症研究の流れ－当教室のトピックスを中心に－，順天堂医学，２００６，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．１，ｐ．４５－５４
【文献】秋山真志，ヒト角層細胞のｃｅｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅの発生とその機能障害を来す病態の解析，コスメトロジー研究報告，２００１，Ｖｏｌ．９，ｐ．６２－６８
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K31/00-33/44
A61P1/00-43/00
A61K1/00-43/00
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｄ－プシコースおよび／またはＤ－プシコースのケトン基がアルコール基となった糖アルコール、Ｄ－プシコースのアルコール基が酸化したウロン酸、Ｄ－プシコースのアルコール基がＮＨ２基で置換されたアミノ糖から選ばれるＤ－プシコース誘導体を有効成分とする、フィラグリンおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤であって
生体の皮膚に適用すると、フィラグリンの発現を増加させるフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現を増加させるトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【請求項2】
前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加が、皮膚のバリア機能の向上作用を有する皮膚保湿機能を発揮させる、請求項１に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【請求項3】
前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加が、保湿機能の向上作用を有する皮膚保湿機能を発揮させる、請求項１に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【請求項4】
前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加に加え、生体の皮膚に適用すると、ＩＶ型コラーゲン、およびオキシタラン線維とエラウニン線維のいずれかまたは両方でのエラスチン、のいずれか１以上の発現を惹起させる、請求項１、２または３に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【請求項5】
前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加が、皮膚粘弾性の向上作用を有する抗老化機能を発揮させる、請求項４に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【請求項6】
前記フィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤が、化粧料（但し医薬部外品を含む）、保湿用の化粧料（但し医薬部外品を含む）、またはスキンケア用剤である皮膚外用剤として使用される、請求項１ないし５いずれかのフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【請求項7】
前記皮膚外用剤が、肌荒れ、乾燥肌改善及び予防用の皮膚外用剤であることを特徴とする、請求項６に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化粧料などの皮膚外用の組成物に好適な皮膚機能改善組成物に関し、詳しくは、希少糖であるＤ－プシコースを有効成分として配合した皮膚保湿剤、皮膚抗酸化剤および皮膚抗老化剤から選ばれる剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
皮膚は外界と接し、様々な環境下から体内の生命活動を保護する人体で最大の臓器である。人体の約７０％が水分によって占められていることから、皮膚の役割の一つとして、体内から水分を必要以上に逃がさないことが挙げられる。皮膚からの過剰な水分蒸散を抑制し、皮膚の水分保持能力を向上させると、皮膚を健康な状態に保つことが出来る。従来、経皮水分蒸散量を抑制する目的で、皮膚に塗布する外用剤等の開発が行われているが、安価で安全性が高く、かつ、肌の潤いを保つための皮膚機能改善組成物が求められている。
ところで自然界にその存在量が少ない単糖およびその誘導体と定義されている希少糖は、食後血糖値上昇抑制作用、脂肪蓄積抑制作用、動脈硬化予防作用、血圧上昇抑制作用、抗酸化作用など数々の作用が報告されており、メタボリックシンドローム対策にも期待される新たな機能性素材として注目されている。希少糖のなかでもＤ－アロース、Ｄ－プシコースは大量生産が可能となり、その生理活性について様々な研究開発がなされてきている。
ところで自然界にその存在量が少ない単糖およびその誘導体と定義されている希少糖は、食後血糖値上昇抑制作用、脂肪蓄積抑制作用、動脈硬化予防作用、血圧上昇抑制作用、抗酸化作用など数々の作用が報告されており、メタボリックシンドローム対策にも期待される新たな機能性素材として注目されている。希少糖のなかでもＤ－アロース、Ｄ－プシコースは大量生産が可能となり、その生理活性について様々な研究開発がなされてきている。
【0003】
例えば、Ｄ－プシコースについては、皮膚に関する症状の緩和用の薬剤類の原料の一部として使用されている例が見受けられる。
例えば、高齢者および認知症患者に伴う随伴諸症状に適合する改善、緩和、治療効果に優れた、認知症治療薬、飲食品および皮膚用薬剤であって、フェルラ酸、カカオ・カカオ油脂成分と希少糖（Ｄ－プシコース、Ｄ－アロース）より選択した１種類以上を配合する認知症治療薬、飲食品および皮膚用薬剤（特許文献１）や、５炭糖および６炭糖から選ばれる１種乃至は２種以上とトレハロースおよびその誘導体から選ばれる１種乃至は２種以上とからなる保湿用の組成物を化粧料などの皮膚外用の組成物に含有させる。この組成物によれば、トレハロース類の保湿機能を高める手段を提供することができる（特許文献２）。
例えば、高齢者および認知症患者に伴う随伴諸症状に適合する改善、緩和、治療効果に優れた、認知症治療薬、飲食品および皮膚用薬剤であって、フェルラ酸、カカオ・カカオ油脂成分と希少糖（Ｄ－プシコース、Ｄ－アロース）より選択した１種類以上を配合する認知症治療薬、飲食品および皮膚用薬剤（特許文献１）や、５炭糖および６炭糖から選ばれる１種乃至は２種以上とトレハロースおよびその誘導体から選ばれる１種乃至は２種以上とからなる保湿用の組成物を化粧料などの皮膚外用の組成物に含有させる。この組成物によれば、トレハロース類の保湿機能を高める手段を提供することができる（特許文献２）。
【0004】
また、二糖類および金属イオンでの治療により皮膚刺激原因物質または皮膚過敏化原因物質により生ずる皮膚悪反応を低減する組成物、並びに皮膚刺激原因物質または皮膚過敏化原因物質により生ずる皮膚悪反応を低減するための方法、および二糖類および／または金属イオン組成物の適用により、少なくとも一つの炎症原因物質に対する炎症応答を治療するための方法は、二糖類における単糖類がプシコースから選ばれていてもよいとされている（特許文献３）、また、４－イソシアノ－フェニル基ならびに４－（２－イソシアノエチル）－フェニル基に、ラムノースなどのデオキシ糖、ガラクトースなどのアルドヘキソース、プシコースなどのケトヘキソース、グルコサミンなどのアミノ糖ならびにアラビノースなどのアルドペントースがグリコシド結合した構造を有するαまたはβ－Ｄ－アルドース誘導体およびαまたはβ－Ｄ－ケトース誘導体、若しくは、αまたはβ－Ｌ－アルドース誘導体およびαまたはβ－Ｌ－ケトース誘導体からなる、日焼け後の色素沈着によるシミ、ソバカス、或いは、生まれつきまたは生後しばらく経ってから生じる皮膚の色素細胞、毛細血管、その他皮膚の構成要素の異常に伴う疾病の予防、治療に有効なチロシナーゼ阻害活性に基づくメラニン産生抑制物質（特許文献４）が提案されている。
【0005】
さらに、ケラチン組織の処理および保護用組成物を供し、該組成物は外的ダメージからケラチン組織を保護するのに相乗的に有効な結合量で存在する少なくとも１つの植物エキスと糖からなり、植物エキスはポテトエキス、ヤドリギエキス、アボカドエキス、小麦胚芽エキス、アカバナエキスおよびインゲンマメエキスから選択される、該ヘキソースはアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、ソルボース、プシコース、フラクトースおよびタガロースから選択される（特許文献５）が提案されている。
このように、服用あるいは皮膚に塗布する薬剤あるいは化粧料などの有効成分の化学構造の一部としてあるいは助材として添加される物質にＤ－プシコースが使用されていることが知られている。しかしながら、これら文献には皮膚保湿効果、皮膚抗酸化効果および皮膚抗老化効果についての記載は見あたらない。
このように、服用あるいは皮膚に塗布する薬剤あるいは化粧料などの有効成分の化学構造の一部としてあるいは助材として添加される物質にＤ－プシコースが使用されていることが知られている。しかしながら、これら文献には皮膚保湿効果、皮膚抗酸化効果および皮膚抗老化効果についての記載は見あたらない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１４－８４２９１号公報
【文献】特開２０００－１０９４１１９号公報
【文献】特表２００５－５２７６０１号公報
【文献】特開２００４－３３９１５２号公報
【文献】特表２００３－５２６６４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
このように、皮膚保湿剤、皮膚抗酸化剤および皮膚抗老化剤については、皮膚保湿性、皮膚耐老化性、皮膚抗酸化性の作用効果を発揮する安価で安全性が高い化合物を見出すことが求められている。そこで本発明はこのような従来の事情に対処して、皮膚保湿性、皮膚耐老化性、皮膚抗酸化性の作用効果を発揮する安価で安全性が高い化合物を有効成分とする皮膚改善組成物、化粧料または皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、皮膚保湿剤、皮膚抗酸化剤および皮膚抗老化剤などとして有用であり、しかも生体に悪影響を与えない安全性を有する化合物を求めて研究開発を進める中で、従来、低カロリー甘味料あるいは服用することにより血糖値の低下作用などを発揮する化合物として知られているＤ－プシコースおよび／またはその誘導体が、生体の皮膚に適用することにより有用な作用効果を発揮することを見出して本発明を完成するに至った。
Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体を生体の皮膚に適用すると、ＩＶ型コラーゲンの増加およびオキシタラン線維とエラウニン線維の両方でエラスチンの増加が認められ、加齢や紫外線による皮膚の老化現象が緩和、防止されることが判明した。また、ＩＶ型コラーゲンやエラスチンの増加により皮膚の弾力性が向上する。
さらに、Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体を生体の皮膚に適用すると、フィラグリンの発現およびトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現が増加し、角質層の層状化の改善が認められた。この現象は生体皮膚の保湿性が向上したことを示している。
このように、Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体が、生体の皮膚に対して保湿性、耐老化性、抗酸化性の作用効果を発揮することが実験的に得られた結果が本発明の基礎となった。
Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体を生体の皮膚に適用すると、ＩＶ型コラーゲンの増加およびオキシタラン線維とエラウニン線維の両方でエラスチンの増加が認められ、加齢や紫外線による皮膚の老化現象が緩和、防止されることが判明した。また、ＩＶ型コラーゲンやエラスチンの増加により皮膚の弾力性が向上する。
さらに、Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体を生体の皮膚に適用すると、フィラグリンの発現およびトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現が増加し、角質層の層状化の改善が認められた。この現象は生体皮膚の保湿性が向上したことを示している。
このように、Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体が、生体の皮膚に対して保湿性、耐老化性、抗酸化性の作用効果を発揮することが実験的に得られた結果が本発明の基礎となった。
【0009】
本発明は以下（１）～（７）に記載されたフィラグリンおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤を要旨とする。
（１）Ｄ－プシコースおよび／またはＤ－プシコースのケトン基がアルコール基となった糖アルコール、Ｄ－プシコースのアルコール基が酸化したウロン酸、Ｄ－プシコースのアルコール基がＮＨ２基で置換されたアミノ糖から選ばれるＤ－プシコース誘導体を有効成分とする、フィラグリンおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤であって
生体の皮膚に適用すると、フィラグリンの発現を増加させるフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現を増加させるトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（２）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加が、皮膚のバリア機能の向上作用を有する皮膚保湿機能を発揮させる、上記（１）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（３）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加が、保湿機能の向上作用を有する皮膚保湿機能を発揮させる、上記（１）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（４）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加に加え、生体の皮膚に適用すると、ＩＶ型コラーゲン、およびオキシタラン線維とエラウニン線維のいずれかまたは両方でのエラスチン、のいずれか１以上の発現を惹起させる、上記（１）、（２）または（３）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（５）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加が、皮膚粘弾性の向上作用を有する抗老化機能を発揮させる、上記（４）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（１）Ｄ－プシコースおよび／またはＤ－プシコースのケトン基がアルコール基となった糖アルコール、Ｄ－プシコースのアルコール基が酸化したウロン酸、Ｄ－プシコースのアルコール基がＮＨ２基で置換されたアミノ糖から選ばれるＤ－プシコース誘導体を有効成分とする、フィラグリンおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤であって
生体の皮膚に適用すると、フィラグリンの発現を増加させるフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現を増加させるトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（２）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加が、皮膚のバリア機能の向上作用を有する皮膚保湿機能を発揮させる、上記（１）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（３）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加が、保湿機能の向上作用を有する皮膚保湿機能を発揮させる、上記（１）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（４）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現の増加に加え、生体の皮膚に適用すると、ＩＶ型コラーゲン、およびオキシタラン線維とエラウニン線維のいずれかまたは両方でのエラスチン、のいずれか１以上の発現を惹起させる、上記（１）、（２）または（３）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（５）前記フィラグリントおよび/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加が、皮膚粘弾性の向上作用を有する抗老化機能を発揮させる、上記（４）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【0010】
（６）前記フィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤が、化粧料（但し医薬部外品を含む）、保湿用の化粧料（但し医薬部外品を含む）、またはスキンケア用剤である皮膚外用剤として使用される、上記（１）ないし（５）いずれかのフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（７）前記皮膚外用剤が、肌荒れ、乾燥肌改善及び予防用の皮膚外用剤であることを特徴とする、上記（６）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
（７）前記皮膚外用剤が、肌荒れ、乾燥肌改善及び予防用の皮膚外用剤であることを特徴とする、上記（６）に記載のフィラグリンの発現増加剤および/またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現増加剤。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、皮膚保湿性、皮膚耐老化性、皮膚抗酸化性の作用効果を発揮する安価で安全性が高いＤ－プシコースおよび／またはその誘導体を有効成分として含有する皮膚改善組成物、化粧料または皮膚外用剤を提供することができる。Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体を生体の皮膚に対して適用することにより、保湿性、耐老化性、抗酸化性の作用効果を発揮するものであり、Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体を有効成分として含有する化粧料、皮膚外用剤などとして皮膚に適用することができ優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品のアンチエイジング作用の評価を示す顕微鏡像（抗エラスチン抗体を用いた染色では、空試験バッチ、Ｄ０（Ｔ０）では、真皮乳頭層のオキシタラン線維（Ｆｏｘ）の染色はやや明瞭で、エラウニン繊維（Ｅｌａｕ）の染色は明瞭であった。真皮網状層のエラスチン線維の染色は明瞭であったことを示す顕微鏡像）。
【図2】アンチエイジング作用の評価において、エラスチン免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめ（ヒト皮膚外植片の真皮乳頭層のオキシタラン線維（Ｆｏｘ）とエラウニン線維（Ｅｌａｕ）の染色状態）を示す。
【図3】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品のアンチエイジング作用の評価を示す顕微鏡像（抗ＩＶ型コラーゲン抗体を用いた染色では、Ｄ０（Ｔ０）では、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）に沿ってやや明瞭かつ均一な染色が認められたことを示す顕微鏡像）。
【図4】アンチエイジング作用の評価において、ＩＶ型コラーゲンの免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめ（ヒト皮膚外植片のＩＶ型コラーゲン染色状態）を示す。
【図5】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品のアンチエイジング作用の評価を示す顕微鏡像（Ｄ１０でのエラスチンの発現は、２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではオキシタラン繊維でわずかに増加し、エラウニン繊維でもわずかに増加したことを示す顕微鏡像）。
【図6】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品のアンチエイジング作用の評価を示す顕微鏡像（ＩＶ型コラーゲンの免疫染色において２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではＩＶ型コラーゲンの発現がわずかに増加したことを示す顕微鏡像）。
【図7】（ａ）ＴＭＧ－１が触媒する分子反応の概略図。（ｂ）ＦＩＴＣで標識したＴＭＧ－１の免疫染色の顕微鏡像。
【図8】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品の保湿作用の評価を示す顕微鏡像（フィラグリン免疫染色において、対照バッチ（Ｔ０）では、角質層底部の２～３細胞層で中程度からやや明瞭（強度）な染色が認められたことを示す顕微鏡像）。
【図9】保湿作用の評価において、フィラグリン免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを示す。
【図10】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品の保湿作用の評価を示す顕微鏡像（ＴＧＭ－１免疫染色において、対照バッチ（Ｔ０）では、角質層底部で中等度からやや明瞭な染色が認められたことを示す顕微鏡像）。
【図11】保湿作用の評価において、ＴＧＭ－１免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを示す。
【図12】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品の保湿作用の評価を示す顕微鏡像（フィラグリン免疫染色において、２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では４～５細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加したことを示す顕微鏡像）。
【図13】ヒトの生態皮膚外植片を用いた製品の保湿作用の評価を示す顕微鏡像（ＴＧＭ－１免疫染色において、２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では３～４細胞層でＴＧＭ－１の発現がわずかに増加したことを示す顕微鏡像）。
【図14】２０％Ｄ-プシコースを５日間塗布したマウスの皮膚において、ＩＶ型コラーゲンの発現は、Ｄ-プシコースを塗らない皮膚における発現量を１００％とした場合、平均１６９％の発現が起こっていたことを示す図面である。
【図15】２０％Ｄ-プシコースを５日間塗布したマウスの皮膚において、エラスチンの発現は、Ｄ-プシコースを塗らない皮膚における発現量を１００％とした場合、平均１０４％の発現が起こっていたことを示す図面である。
【図16】２０％Ｄ-プシコースを５日間塗布したマウスの皮膚において、フィラグリンの発現は、Ｄ-プシコースを塗らない皮膚における発現量を１００％とした場合、平均５２８％の発現が起こっていたことを示す図面である。
【図17】２０％Ｄ-プシコースを５日間塗布したマウスの皮膚において、ＴＧＭ-１の発現は、Ｄ-プシコースを塗らない皮膚における発現量を１００％とした場合、平均４１８％の発現が起こっていたことを示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、Ｄ－プシコースおよび／またはその誘導体を有効成分とする皮膚機能改善組成物、特に、皮膚保湿剤、皮膚抗酸化剤および皮膚抗老化剤から選ばれる剤に関する。生体皮膚の保湿性、抗酸化性、あるいは老化に関連する因子としてフィラグリン、トランスグルタミナーゼＩ、ＩＶ型コラーゲンおよびエラスチンに発明者らは注目し、これらの因子に対するＤ－プシコースの影響を詳細に研究することにより、Ｄ－プシコースの新たな特性を見出した。本発明は、生体皮膚の保湿性および抗酸化性の向上、あるいは老化現象の抑制に効果を発揮するものであり、Ｄ－プシコースを含有した皮膚外用剤および化粧料として提供することにより、生体皮膚の皮膚機能改善、劣化の防止あるいは劣化の進行の抑制を図るものである。具体的には、オールインワンゲル、クリーム、エッセンス、ローション、洗顔クリームなどの化粧料を挙げることができる。
【0014】
まず、本発明において、Ｄ－プシコースの生体皮膚への作用を確認するための指標として用いたフィラグリン、トランスグルタミナーゼＩ、ＩＶ型コラーゲンおよびエラスチンの生体皮膚組織との関連を簡単に説明する。
【0015】
皮膚の弾性を維持する機構としては、弾性線維とコラーゲン線維が関与しており、弾性系線維はコラーゲン線維とともに細胞外基質の主要な線維成分であり、動脈、肺、皮膚、靭帯など弾性力を必要とする組織，器官に広く分布している。弾性系線維は形態学的観察より、エラスチンと微細線維から構成され、その比率により、微細線維のみから構成されるオキシタラン線維、エラスチンの周囲と内部に多数の微細線維が存在するエラウニン線維、多量のエラスチンと少数の微細線維をもつ弾性線維の３種類に分類されている。弾性系線維およびコラーゲン線維は皮膚の自然な加齢や、紫外線への暴露などの環境要因により変性が生じることが知られている。そこで、コラーゲン線維およびエラスチンを指標として皮膚の弾性、加齢、環境要因による皮膚の劣化を評価することができると考えられる。
【0016】
［ＩＶ型コラーゲン］
脊椎動物のコラーゲンは２８分子種から成る大規模なスーパーファミリーを構成しているが、ＩＶ型コラーゲンは、その中でも独特であり、多くの他のコラーゲンとは異なり、基底膜（ＢＭｓ）中にのみ存在し、遺伝子学的に異なるα１からα６の６種類のα鎖で構成される。ＩＶ型コラーゲンは、ラミニン、プロテオグリカンおよびナイドジェンとともに「金網状の」網目構造を形成する。皮膚の自然な加齢や、紫外線への暴露などの環境要因により、ＩＶ型コラーゲンの変性が生じる可能性がある。
脊椎動物のコラーゲンは２８分子種から成る大規模なスーパーファミリーを構成しているが、ＩＶ型コラーゲンは、その中でも独特であり、多くの他のコラーゲンとは異なり、基底膜（ＢＭｓ）中にのみ存在し、遺伝子学的に異なるα１からα６の６種類のα鎖で構成される。ＩＶ型コラーゲンは、ラミニン、プロテオグリカンおよびナイドジェンとともに「金網状の」網目構造を形成する。皮膚の自然な加齢や、紫外線への暴露などの環境要因により、ＩＶ型コラーゲンの変性が生じる可能性がある。
【0017】
［エラスチン］
エラスチンは、皮膚の弾性を司る結合組織の蛋白質であり、リジン残基の架橋で結合される可動性の疎水域を形成するグリシン、プロリンなどの疎水性アミノ酸に富んでいる。エラスチンの主な機能は、水和した際に弾力的に伸縮を繰り返す能力であり、また、エラスチンは皮膚の弾性繊維の主要成分（９０％）である。メチルグリオキサールの生成や紫外線への暴露など複数の要因により、エラスチンなどの真皮の弾力網が損傷を受ける可能性があるため、皮膚化粧品研究では、エラスチンを真皮の細胞外基質の構造状態を示すバイオマーカーとして用いることが多い。
また、エラスチンは、コラーゲンと共に網目状にネットワークを形成し、コラーゲンの線維をつなぎ止めるようにして支えている弾力線維であり、弾性に富む組織に多く存在しているタンパク質の一種で、ゴムのように伸縮する性質があることで肌に柔軟性を与えるとともに、コラーゲンの網目状部分を結び付け、コラーゲンと一緒にエラスチンも肌のハリを維持し、シワやたるみを防いでいる。エラスチンが不足するとコラーゲンを支えることができなくなり、肌の弾力がなくなり、シワやたるみの原因に繋がってくる。紫外線やストレスなどで蓄積される活性酸素も、エラスチンやコラーゲンなど肌組織に悪影響を与え、長年にわたる強い紫外線の影響や、日々私たちの生活環境により、コラーゲンと密接に関係しているエラスチンとのネットワークが破壊され、肌のハリや弾力性がなくなってしまい、大きなシワができてしまうことになる。
エラスチンは、皮膚の弾性を司る結合組織の蛋白質であり、リジン残基の架橋で結合される可動性の疎水域を形成するグリシン、プロリンなどの疎水性アミノ酸に富んでいる。エラスチンの主な機能は、水和した際に弾力的に伸縮を繰り返す能力であり、また、エラスチンは皮膚の弾性繊維の主要成分（９０％）である。メチルグリオキサールの生成や紫外線への暴露など複数の要因により、エラスチンなどの真皮の弾力網が損傷を受ける可能性があるため、皮膚化粧品研究では、エラスチンを真皮の細胞外基質の構造状態を示すバイオマーカーとして用いることが多い。
また、エラスチンは、コラーゲンと共に網目状にネットワークを形成し、コラーゲンの線維をつなぎ止めるようにして支えている弾力線維であり、弾性に富む組織に多く存在しているタンパク質の一種で、ゴムのように伸縮する性質があることで肌に柔軟性を与えるとともに、コラーゲンの網目状部分を結び付け、コラーゲンと一緒にエラスチンも肌のハリを維持し、シワやたるみを防いでいる。エラスチンが不足するとコラーゲンを支えることができなくなり、肌の弾力がなくなり、シワやたるみの原因に繋がってくる。紫外線やストレスなどで蓄積される活性酸素も、エラスチンやコラーゲンなど肌組織に悪影響を与え、長年にわたる強い紫外線の影響や、日々私たちの生活環境により、コラーゲンと密接に関係しているエラスチンとのネットワークが破壊され、肌のハリや弾力性がなくなってしまい、大きなシワができてしまうことになる。
【0018】
一方、皮膚の保湿性に関しては、フィラグリンおよびトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－Ｉ）が関連していることが知られており、これらを指標とすることで皮膚の保湿性を評価することができる。
【0019】
［フィラグリン］
フィラグリンとは、皮膚の角質層に存在するたんぱく質の１種であり、角質層のなかで水分を保つ働きをする天然保湿因子ＮＭＦは約半分をアミノ酸が占めているが、これらのアミノ酸はフィラグリンが分解されて生成されたものである。フィラグリンは、保湿作用はもちろん紫外線によるダメージを防ぐなど皮膚のバリア機能にもなっている。フィラグリンが生成され続け、正しく働けば、肌の透明感や張りは守られるが、フィラグリンの生成量は幼児期が一番多く、その後減少傾向を示し、ストレスや紫外線といった外的な刺激を受けるとさらに生成量が減少する。
フィラグリンとは、皮膚の角質層に存在するたんぱく質の１種であり、角質層のなかで水分を保つ働きをする天然保湿因子ＮＭＦは約半分をアミノ酸が占めているが、これらのアミノ酸はフィラグリンが分解されて生成されたものである。フィラグリンは、保湿作用はもちろん紫外線によるダメージを防ぐなど皮膚のバリア機能にもなっている。フィラグリンが生成され続け、正しく働けば、肌の透明感や張りは守られるが、フィラグリンの生成量は幼児期が一番多く、その後減少傾向を示し、ストレスや紫外線といった外的な刺激を受けるとさらに生成量が減少する。
【0020】
［トランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－Ｉ）］
表皮の角化細胞では、分化の最終段階でケラチン凝集、核変性、および形質膜と強靱で不溶性の蛋白質様エンベロープとの交換が起こる。この蛋白質様エンベロープは、コーニファイドエンベロープであり、細胞外脂質に架橋してバリア機能を発揮する。トランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ）は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性の架橋酵素であり、蛋白結合グルタミンのカルボキサミド基と様々な一級アミン（多くはリジン残基のアミノ基）との間のアシル転移反応を触媒し、蛋白質間にイソペプチド結合を形成し、不溶性の高分子構造を形成する。ヒトの７つのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅｓ）のうち４つ（１、２、３、５）は、皮膚を含む最終分化過程にある上皮に発現する。ＴＧａｓｅ１は、ロリクリン、トリコヒアリン、ＳＰＲ１、２、３などの基質の架橋に必須である。トランスグルタミナーゼが蛋白質を架橋することで、蛋白質分解性の変性に対する抵抗性が高まる。
表皮の角化細胞では、分化の最終段階でケラチン凝集、核変性、および形質膜と強靱で不溶性の蛋白質様エンベロープとの交換が起こる。この蛋白質様エンベロープは、コーニファイドエンベロープであり、細胞外脂質に架橋してバリア機能を発揮する。トランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ）は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性の架橋酵素であり、蛋白結合グルタミンのカルボキサミド基と様々な一級アミン（多くはリジン残基のアミノ基）との間のアシル転移反応を触媒し、蛋白質間にイソペプチド結合を形成し、不溶性の高分子構造を形成する。ヒトの７つのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅｓ）のうち４つ（１、２、３、５）は、皮膚を含む最終分化過程にある上皮に発現する。ＴＧａｓｅ１は、ロリクリン、トリコヒアリン、ＳＰＲ１、２、３などの基質の架橋に必須である。トランスグルタミナーゼが蛋白質を架橋することで、蛋白質分解性の変性に対する抵抗性が高まる。
【0021】
本発明のＤ－プシコースおよび／またはその誘導体を有効成分とする皮膚保湿剤、皮膚抗酸化剤および皮膚抗老化剤は、特に、化粧料、皮膚外用剤あるいはスキンケア用材として使用することが最適であり、肌荒れ、乾燥肌改善および予防用の皮膚外用剤としての使用が好ましくは挙げられる。
本発明の皮膚機能改善組成物、ならびに、これらの剤には、Ｄ－プシコースが０．１～４０質量％含有されていることが好ましく、０．１質量％未満では所期の目的が達成され難いことがあり、４０質量％を超えると多量のＤ－プシコースを剤中に必要とされる状態に保持することが困難となるばかりか、多量使用することによるコスト高および作用効果の頭打ちの両面からも好ましくはない。さらに好ましい範囲は０．２～３０質量％、最も好ましくは０．５～２０質量％の範囲を挙げることができる。
本発明の皮膚機能改善組成物、ならびに、これらの剤には、Ｄ－プシコースが０．１～４０質量％含有されていることが好ましく、０．１質量％未満では所期の目的が達成され難いことがあり、４０質量％を超えると多量のＤ－プシコースを剤中に必要とされる状態に保持することが困難となるばかりか、多量使用することによるコスト高および作用効果の頭打ちの両面からも好ましくはない。さらに好ましい範囲は０．２～３０質量％、最も好ましくは０．５～２０質量％の範囲を挙げることができる。
【0022】
［Ｄ－プシコース］
本発明の有効成分であるＤ－プシコースは希少糖の一種であり、自然界には微量にしか存在しない単糖である。糖の基本単位である単糖（炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類あるが、自然界に多量に存在するアルドースとしてはＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノースの６種類がある。ケトースとしては、自然界には、Ｄ－フラクトースが多量に存在しており、他のケトースは希少糖に包含され、そのなかにＤ－プシコースが含まれている。
Ｄ－プシコースは、自然界から抽出されたもの、化学的または生物学的な方法により合成されたものなどを含めてどのような手段により入手してもよい。Ｄ－プシコースは、果糖に特定の酵素を作用させることにより得られ、Ｄ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼを作用させた場合には収率２０～２５％で生成し、Ｄ－プシコース・３－エピメラーゼを作用させた場合には３０％程度の収率で生成する。さらにホウ酸を併用した場合には６０％程度の収率で生成するとの報告がされている。
本発明の有効成分であるＤ－プシコースは希少糖の一種であり、自然界には微量にしか存在しない単糖である。糖の基本単位である単糖（炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類あるが、自然界に多量に存在するアルドースとしてはＤ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノースの６種類がある。ケトースとしては、自然界には、Ｄ－フラクトースが多量に存在しており、他のケトースは希少糖に包含され、そのなかにＤ－プシコースが含まれている。
Ｄ－プシコースは、自然界から抽出されたもの、化学的または生物学的な方法により合成されたものなどを含めてどのような手段により入手してもよい。Ｄ－プシコースは、果糖に特定の酵素を作用させることにより得られ、Ｄ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼを作用させた場合には収率２０～２５％で生成し、Ｄ－プシコース・３－エピメラーゼを作用させた場合には３０％程度の収率で生成する。さらにホウ酸を併用した場合には６０％程度の収率で生成するとの報告がされている。
【0023】
［Ｄ－プシコース誘導体］
本発明で用いるＤ－プシコースの誘導体は、Ｄ－プシコースを出発化合物としてその分子の構造を化学反応により変換した化合物である。Ｄ－プシコースを含む六炭糖の誘導体には、糖アルコール（単糖類を還元すると、アルデヒド基およびケトン基はアルコール基となり、炭素原子と同数の多価アルコールとなる）や、ウロン酸（単糖類のアルコール基が酸化したもので、天然ではＤ－グルクロン酸、ガラクチュロン酸、マンヌロン酸が知られている）、アミノ糖（糖分子のＯＨ基がＮＨ２基で置換されたもの、グルコサミン、コンドロサミン、配糖体などがある）などが一般的であるが、それらに限定されるものではない。Ｄ－プシコースの誘導体としては、その糖アルコール、ウロン酸、アミノ糖などが好ましいものとして例示される。
本発明で用いるＤ－プシコースの誘導体は、Ｄ－プシコースを出発化合物としてその分子の構造を化学反応により変換した化合物である。Ｄ－プシコースを含む六炭糖の誘導体には、糖アルコール（単糖類を還元すると、アルデヒド基およびケトン基はアルコール基となり、炭素原子と同数の多価アルコールとなる）や、ウロン酸（単糖類のアルコール基が酸化したもので、天然ではＤ－グルクロン酸、ガラクチュロン酸、マンヌロン酸が知られている）、アミノ糖（糖分子のＯＨ基がＮＨ２基で置換されたもの、グルコサミン、コンドロサミン、配糖体などがある）などが一般的であるが、それらに限定されるものではない。Ｄ－プシコースの誘導体としては、その糖アルコール、ウロン酸、アミノ糖などが好ましいものとして例示される。
【0024】
［人の生体皮膚外植片に対するアンチエイジング作用の評価］
人の生体皮膚外植片に対するＤ－プシコースのアンチエイジング作用の評価する試験を行ったところ以下の結果を得た。
１０％濃度のＤ－プシコースでは、試験開始５日後にＩＶ型コラーゲン発現がわずかながら増加、１０日後にはオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現が中程度に増加し、わずかなアンチエイジング作用が認められた。
また、２０％濃度のＤ－プシコースでは、試験開始５日後にコラーゲン網の密度が中程度に増加し、ＩＶ型コラーゲンの発現が５日後にはわずかに、１０日後には中程度に増加したことから、中程度のアンチエイジング作用が認められた。同時に、５日後および１０日後にはオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現がわずかに増加した。
したがって、Ｄ－プシコースによりＩＶ型コラーゲン発現の増加、およびオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現が増加することが見出された。これらの線維類が増加することは、加齢や、紫外線などの環境要因からの影響を軽減してアンチエイジング効果が示されていることとなる。また、コラーゲンやこれらの線維が増加することは皮膚の粘弾性が向上することに相当する。
人の生体皮膚外植片に対するＤ－プシコースのアンチエイジング作用の評価する試験を行ったところ以下の結果を得た。
１０％濃度のＤ－プシコースでは、試験開始５日後にＩＶ型コラーゲン発現がわずかながら増加、１０日後にはオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現が中程度に増加し、わずかなアンチエイジング作用が認められた。
また、２０％濃度のＤ－プシコースでは、試験開始５日後にコラーゲン網の密度が中程度に増加し、ＩＶ型コラーゲンの発現が５日後にはわずかに、１０日後には中程度に増加したことから、中程度のアンチエイジング作用が認められた。同時に、５日後および１０日後にはオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現がわずかに増加した。
したがって、Ｄ－プシコースによりＩＶ型コラーゲン発現の増加、およびオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現が増加することが見出された。これらの線維類が増加することは、加齢や、紫外線などの環境要因からの影響を軽減してアンチエイジング効果が示されていることとなる。また、コラーゲンやこれらの線維が増加することは皮膚の粘弾性が向上することに相当する。
【0025】
［人の生体皮膚外植片に対する保湿作用の評価］
人の生体皮膚外植片に対するＤ－プシコースの保湿効果を評価する試験を行ったところ以下の結果を得た。
１０％濃度のＤ－プシコースでは、角質層の脱脂洗浄後に皮膚バリア機能に極めてわずかながら作用が認められた。脱脂洗浄から３および２４時間後にフィラグリンの発現がわずかに増加した。解析した他の評価項目に対する影響は認められなかった。
また、２０％濃度のＤ－プシコースでは、角質層の脱脂洗浄後に皮膚バリア機能にわずかな作用が認められた。脱脂洗浄から２４時間後に角質層の層状化の改善が認められた。また、脱脂洗浄から３時間および２４時間後にフィラグリンの発現がわずかに増加し、脱脂洗浄から２４時間後にはＴＧＭ－１の発現がわずかに増加した。
人の生体皮膚外植片に対するＤ－プシコースによるフィラグリンおよびトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現量の増加することは保湿作用効果が向上することを意味するとともに、加齢や紫外線などの環境による皮膚の劣化を緩和あるいは防止することを示している、こうした作用効果はＤ－プシコースにより新たに見出されたものである。
人の生体皮膚外植片に対するＤ－プシコースの保湿効果を評価する試験を行ったところ以下の結果を得た。
１０％濃度のＤ－プシコースでは、角質層の脱脂洗浄後に皮膚バリア機能に極めてわずかながら作用が認められた。脱脂洗浄から３および２４時間後にフィラグリンの発現がわずかに増加した。解析した他の評価項目に対する影響は認められなかった。
また、２０％濃度のＤ－プシコースでは、角質層の脱脂洗浄後に皮膚バリア機能にわずかな作用が認められた。脱脂洗浄から２４時間後に角質層の層状化の改善が認められた。また、脱脂洗浄から３時間および２４時間後にフィラグリンの発現がわずかに増加し、脱脂洗浄から２４時間後にはＴＧＭ－１の発現がわずかに増加した。
人の生体皮膚外植片に対するＤ－プシコースによるフィラグリンおよびトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ－１）の発現量の増加することは保湿作用効果が向上することを意味するとともに、加齢や紫外線などの環境による皮膚の劣化を緩和あるいは防止することを示している、こうした作用効果はＤ－プシコースにより新たに見出されたものである。
【実施例1】
【0026】
［本実施例の目的］
本試験の目的は、異なる濃度の単糖がヒトの生体皮膚外植片の表皮および真皮構造に及ぼすアンチエイジング作用を評価することである。皮膚には表皮と真皮があり、皮膚のみずみずしさを保つには真皮に存在する蛋白質が重要である。このうちコラーゲンは線維を形成し、一番存在量が多く、真皮層の水分を除いた７０％、線維質の９０％はコラーゲンである。そしてこのコラーゲンに巻き付いて構造を強化しているのが、弾力性に富むエラスチンである。このコラーゲンとエラスチンによって形成されている網目状の構造内に、ヒアルロン酸やグリコサミノグリカンなどが水分を豊富に抱えてゼリー状になり満たされている。これらの蛋白質は線維芽細胞から分泌される。
コラーゲンには、１０種類以上の種類があるが、皮膚の真皮にはＩ型コラーゲンが最も多く（９０％）、その他にＩＩＩ型コラーゲンも存在する。最近注目されているコラーゲンが、ＩＶ型コラーゲンであり、表皮と真皮の境界の基底層に存在する。基底膜は真皮の毛細血管から表皮へと栄養素や酸素を届けたり、逆に表皮の老廃物を回収するなど健康な表皮をつくる重要な役割を果たしているため、最近のアンチエイジング研究では基底層の主成分であるＩＶ型コラーゲンを正常に保つことの重要性も指摘されている。
エラスチン線維の主成分はミクロフィブリル（フィブリリン）と無定型エラスチンであるが，そのほかにもいくつかの分子が結合している。２種類の主成分の比率は真皮内の位置によって異なり、線維の構造や機能にはその組成が反映されている。ミクロフィブリルが多いオキシタラン線維は、基底膜から垂直に伸び乳頭層を貫通して乳頭層と網状層の結合部に達し、水平に走行したより太いエラウニン線維に結合している。エラウニン線維は架橋されたエラスチンをオキシタラン線維よりも多く含む。
本試験の目的は、異なる濃度の単糖がヒトの生体皮膚外植片の表皮および真皮構造に及ぼすアンチエイジング作用を評価することである。皮膚には表皮と真皮があり、皮膚のみずみずしさを保つには真皮に存在する蛋白質が重要である。このうちコラーゲンは線維を形成し、一番存在量が多く、真皮層の水分を除いた７０％、線維質の９０％はコラーゲンである。そしてこのコラーゲンに巻き付いて構造を強化しているのが、弾力性に富むエラスチンである。このコラーゲンとエラスチンによって形成されている網目状の構造内に、ヒアルロン酸やグリコサミノグリカンなどが水分を豊富に抱えてゼリー状になり満たされている。これらの蛋白質は線維芽細胞から分泌される。
コラーゲンには、１０種類以上の種類があるが、皮膚の真皮にはＩ型コラーゲンが最も多く（９０％）、その他にＩＩＩ型コラーゲンも存在する。最近注目されているコラーゲンが、ＩＶ型コラーゲンであり、表皮と真皮の境界の基底層に存在する。基底膜は真皮の毛細血管から表皮へと栄養素や酸素を届けたり、逆に表皮の老廃物を回収するなど健康な表皮をつくる重要な役割を果たしているため、最近のアンチエイジング研究では基底層の主成分であるＩＶ型コラーゲンを正常に保つことの重要性も指摘されている。
エラスチン線維の主成分はミクロフィブリル（フィブリリン）と無定型エラスチンであるが，そのほかにもいくつかの分子が結合している。２種類の主成分の比率は真皮内の位置によって異なり、線維の構造や機能にはその組成が反映されている。ミクロフィブリルが多いオキシタラン線維は、基底膜から垂直に伸び乳頭層を貫通して乳頭層と網状層の結合部に達し、水平に走行したより太いエラウニン線維に結合している。エラウニン線維は架橋されたエラスチンをオキシタラン線維よりも多く含む。
【0027】
本実施例において、アンチエイジング作用は以下の方法により評価した。
・ マッソン３色染色法による一般形態の観察
・ＩＶ型コラーゲンの免疫染色
・エラスチンの免疫染色
・ マッソン３色染色法による一般形態の観察
・ＩＶ型コラーゲンの免疫染色
・エラスチンの免疫染色
【0028】
［材料および方法］
１．Ｄ－プシコース
試験に使用したＤ－プシコースを表１に示す。
１．Ｄ－プシコース
試験に使用したＤ－プシコースを表１に示す。
【0029】
【表1】
【0030】
２．Ｄ－プシコース溶液の調製
試験は２種類の濃度のＤ－プシコース溶液を用いて行った。
・蒸留水で１０％に希釈（Ｐ１）
・蒸留水で２０％に希釈（Ｐ２）
３．皮膚外植片の作製
４９歳の女性の腹壁形成術時に、２１の皮膚外植片（径平均１１ｍｍ）を作製した。この外植片を、ＢＥＭ培地（ＢＩＯ－ＥＣの外植片培地）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の加湿条件下、生存状態で培養した。これらの外植片を表２に示すように６片からなる３バッチと３片からなる１バッチに分けた。
試験は２種類の濃度のＤ－プシコース溶液を用いて行った。
・蒸留水で１０％に希釈（Ｐ１）
・蒸留水で２０％に希釈（Ｐ２）
３．皮膚外植片の作製
４９歳の女性の腹壁形成術時に、２１の皮膚外植片（径平均１１ｍｍ）を作製した。この外植片を、ＢＥＭ培地（ＢＩＯ－ＥＣの外植片培地）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の加湿条件下、生存状態で培養した。これらの外植片を表２に示すように６片からなる３バッチと３片からなる１バッチに分けた。
【0031】
【表2】
【0032】
４．Ｄ－プシコースの適用
培養０日（Ｄ０）、培養３日（Ｄ３）、培養４日（Ｄ４）、培養６日（Ｄ６）および培養７日（Ｄ７）に、小さなスパーテルを用いてＤ－プシコース溶液を各外植片に２μＬずつ局所塗布した。対照片に塗布は行わなかった。各外植片の培地はＤ３、Ｄ５およびＤ７に交換し、新たな培地と入れ替えた。
５．サンプリング
Ｄ０にバッチＴ０の外植片をすべて採取し、２つに切断した。一方を緩衝ホルマリン液で固定し、もう一方を－８０℃で凍結した。Ｄ５及びＤ１０に、指定したバッチから３片を採取し、同様に処理した。
培養０日（Ｄ０）、培養３日（Ｄ３）、培養４日（Ｄ４）、培養６日（Ｄ６）および培養７日（Ｄ７）に、小さなスパーテルを用いてＤ－プシコース溶液を各外植片に２μＬずつ局所塗布した。対照片に塗布は行わなかった。各外植片の培地はＤ３、Ｄ５およびＤ７に交換し、新たな培地と入れ替えた。
５．サンプリング
Ｄ０にバッチＴ０の外植片をすべて採取し、２つに切断した。一方を緩衝ホルマリン液で固定し、もう一方を－８０℃で凍結した。Ｄ５及びＤ１０に、指定したバッチから３片を採取し、同様に処理した。
【0033】
６．組織学的処理
緩衝ホルマリン液中で２４時間固定後、Ｌｅｉｃａ ＴＰ １０１０自動脱水機を用いて試料を脱水し、パラフィンに含浸させた。その後、Ｌｅｉｃａ ＥＧ １１６０包埋ステーションを用いて試料を包埋した。Ｌｅｉｃａ ＲＭ ２１２５ Ｍｉｎｏｔ型ミクロトームを用いて厚さ５μｍの切片を作製し、これらの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）シラン処理スライドガラス上に固定した。Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢまたはＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４３顕微鏡を用いて顕微鏡検査を実施した。顕微鏡像は、ＤＰ７２ ＯｌｙｍｐｕｓカメラおよびＣｅｌｌＤ ｓｔｏｒｉｎｇソフトウェアを用いてデジタル化した。
６．１．一般形態
マッソン３色染色ゴルドナー変法によりパラフィン切片を染色し、一般形態を観察した。
６．２．ＩＶ型コラーゲン免疫染色
ＩＶ型コラーゲン免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで１００倍に希釈したウサギポリクローナル抗ＩＶ型コラーゲン抗体（ＳＢＡ、参照番号１３４０－０１）を凍結切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増強システム（ＰＫ－７２００、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて室温で１時間放置した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号Ｓａ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウム（赤色）で後染色した。
６．３．エラスチン免疫染色
エラスチン免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで８００倍に希釈したウサギポリクローナル抗エラスチン抗体（Ｎｏｖｏｔｅｃ、参照番号２５０１１）を凍結切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増強システム（ＰＫ－７２００、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて室温で２時間放置した後、ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号Ｓａ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウム（赤色）で後染色した。
緩衝ホルマリン液中で２４時間固定後、Ｌｅｉｃａ ＴＰ １０１０自動脱水機を用いて試料を脱水し、パラフィンに含浸させた。その後、Ｌｅｉｃａ ＥＧ １１６０包埋ステーションを用いて試料を包埋した。Ｌｅｉｃａ ＲＭ ２１２５ Ｍｉｎｏｔ型ミクロトームを用いて厚さ５μｍの切片を作製し、これらの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）シラン処理スライドガラス上に固定した。Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢまたはＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４３顕微鏡を用いて顕微鏡検査を実施した。顕微鏡像は、ＤＰ７２ ＯｌｙｍｐｕｓカメラおよびＣｅｌｌＤ ｓｔｏｒｉｎｇソフトウェアを用いてデジタル化した。
６．１．一般形態
マッソン３色染色ゴルドナー変法によりパラフィン切片を染色し、一般形態を観察した。
６．２．ＩＶ型コラーゲン免疫染色
ＩＶ型コラーゲン免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで１００倍に希釈したウサギポリクローナル抗ＩＶ型コラーゲン抗体（ＳＢＡ、参照番号１３４０－０１）を凍結切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増強システム（ＰＫ－７２００、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて室温で１時間放置した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号Ｓａ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウム（赤色）で後染色した。
６．３．エラスチン免疫染色
エラスチン免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで８００倍に希釈したウサギポリクローナル抗エラスチン抗体（Ｎｏｖｏｔｅｃ、参照番号２５０１１）を凍結切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増強システム（ＰＫ－７２００、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて室温で２時間放置した後、ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号Ｓａ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウム（赤色）で後染色した。
【0034】
［結果］
１．一般形態
空試験バッチ、（塗布なし、培養０日）（Ｄ０（Ｔ０））
角質層はやや厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は極めて中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
１．一般形態
空試験バッチ、（塗布なし、培養０日）（Ｄ０（Ｔ０））
角質層はやや厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は極めて中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
【0035】
［培養５日後］
空試験バッチ、（塗布なし、培養５日）（Ｄ５（ＴＪ５））
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は明瞭である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ１塗布バッチ、（１０％Ｄ－プシコース塗布、培養５日）（Ｄ５（Ｐ１Ｊ５））
角質層はやや厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は極めて中程度である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ２処理バッチ、（２０％Ｄ－プシコース塗布、培養５日）（Ｄ５（Ｐ２Ｊ５））
角質層はやや厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は明瞭である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である
空試験バッチ、（塗布なし、培養５日）（Ｄ５（ＴＪ５））
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は明瞭である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ１塗布バッチ、（１０％Ｄ－プシコース塗布、培養５日）（Ｄ５（Ｐ１Ｊ５））
角質層はやや厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は極めて中程度である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ２処理バッチ、（２０％Ｄ－プシコース塗布、培養５日）（Ｄ５（Ｐ２Ｊ５））
角質層はやや厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は明瞭である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である
【0036】
［培養１０日後］
空試験バッチ、（塗布なし、培養１０日）（Ｄ１０（ＴＪ１０））
角質層は厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ１塗布バッチ、（１０％Ｄ－プシコース塗布、培養１０日）（Ｄ１０（Ｐ１Ｊ１０））
角質層は厚く、中程度に層状化している。
表皮には、細胞層上部の核濃縮を伴う多数の細胞を特徴とする形態変化を呈する細胞層が４～５層認められる。基底層には中程度の海面状態が観察される。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ２塗布バッチ、（２０％Ｄ－プシコース塗布、培養１０日）（Ｄ１０（Ｐ２Ｊ１０））
角質層は厚く、中程度に層状化している。
表皮は良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
空試験バッチ、（塗布なし、培養１０日）（Ｄ１０（ＴＪ１０））
角質層は厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ１塗布バッチ、（１０％Ｄ－プシコース塗布、培養１０日）（Ｄ１０（Ｐ１Ｊ１０））
角質層は厚く、中程度に層状化している。
表皮には、細胞層上部の核濃縮を伴う多数の細胞を特徴とする形態変化を呈する細胞層が４～５層認められる。基底層には中程度の海面状態が観察される。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
Ｐ２塗布バッチ、（２０％Ｄ－プシコース塗布、培養１０日）（Ｄ１０（Ｐ２Ｊ１０））
角質層は厚く、中程度に層状化している。
表皮は良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には低密度のコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
【0037】
２．皮膚外植片中のエラスチン
抗エラスチン抗体を用いて染色していない陰性対照に陽性所見は認められなかった。抗エラスチン抗体を用いた染色では、Ｄ０（Ｔ０）では、真皮乳頭層のオキシタラン線維（Ｆｏｘ）の染色はやや明瞭で、エラウニン繊維（Ｅｌａｕ）の染色は明瞭であった。真皮網状層のエラスチン線維の染色は明瞭であった（図１参照）。
エラスチン免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図２に示す。いずれの解析対象バッチでも、真皮網状層のエラスチン繊維の染色は明瞭であった。
抗エラスチン抗体を用いて染色していない陰性対照に陽性所見は認められなかった。抗エラスチン抗体を用いた染色では、Ｄ０（Ｔ０）では、真皮乳頭層のオキシタラン線維（Ｆｏｘ）の染色はやや明瞭で、エラウニン繊維（Ｅｌａｕ）の染色は明瞭であった。真皮網状層のエラスチン線維の染色は明瞭であった（図１参照）。
エラスチン免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図２に示す。いずれの解析対象バッチでも、真皮網状層のエラスチン繊維の染色は明瞭であった。
【0038】
３．皮膚外植片中のＩＶ型コラーゲン
抗ＩＶ型コラーゲン抗体を用いて染色していない陰性対照に染色は認められなかった。抗ＩＶ型コラーゲン抗体を用いた染色では、Ｄ０（Ｔ０）では、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）に沿ってやや明瞭かつ均一な染色が認められた（図３参照）。
ＩＶ型コラーゲンの免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図４に示す。
抗ＩＶ型コラーゲン抗体を用いて染色していない陰性対照に染色は認められなかった。抗ＩＶ型コラーゲン抗体を用いた染色では、Ｄ０（Ｔ０）では、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）に沿ってやや明瞭かつ均一な染色が認められた（図３参照）。
ＩＶ型コラーゲンの免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図４に示す。
【0039】
［考察］
１．一般形態
［培養日数０（Ｄ０）］
角質層はやや厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は極めて中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
［培養５日後（Ｄ５）］
一般形態はＴ０の観察結果に類似していた。
Ｄ５の空試験バッチ（ＴＪ５）と比較したＤ－プシコース塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）では変化は認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではコラーゲン網の密度に中程度の増加が認められた。
１．一般形態
［培養日数０（Ｄ０）］
角質層はやや厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が４～５層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は極めて中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
［培養５日後（Ｄ５）］
一般形態はＴ０の観察結果に類似していた。
Ｄ５の空試験バッチ（ＴＪ５）と比較したＤ－プシコース塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）では変化は認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではコラーゲン網の密度に中程度の増加が認められた。
【0040】
［培養１０日後（Ｄ１０）］
一般形態はＤ５で観察された形態と同等であった。
空試験バッチ（ＴＪ１０）と比較した製品塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）では細胞層上部の核濃縮を伴う多数の細胞を特徴とする中程度の形態変化が認められ、基底層には中程度の海面状態が認められた。この変化は、角化細胞の分化過程で異常が生じ、顆粒層に核濃縮を伴う細胞が発現したことによるものと考えられる。
・２０％Ｄ－プシコースではまったく変化は認められなかった。
一般形態はＤ５で観察された形態と同等であった。
空試験バッチ（ＴＪ１０）と比較した製品塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）では細胞層上部の核濃縮を伴う多数の細胞を特徴とする中程度の形態変化が認められ、基底層には中程度の海面状態が認められた。この変化は、角化細胞の分化過程で異常が生じ、顆粒層に核濃縮を伴う細胞が発現したことによるものと考えられる。
・２０％Ｄ－プシコースではまったく変化は認められなかった。
【0041】
２．エラスチン免疫染色の状態
［培養０日（Ｄ０）］
真皮乳頭層のオキシタラン線維（Ｆｏｘ）の染色はやや明瞭で、エラウニン繊維（Ｅｌａｕ）の染色は明瞭であった。
［培養０日（Ｄ０）］
真皮乳頭層のオキシタラン線維（Ｆｏｘ）の染色はやや明瞭で、エラウニン繊維（Ｅｌａｕ）の染色は明瞭であった。
【0042】
［培養５日後（Ｄ５）］
Ｄ５でのエラスチンの発現は、Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と類似していた。
Ｄ５の空試験バッチ（ＴＪ５）と比較した製品塗布がエラスチン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではオキシタラン線維でわずかに減少したが、エラウニン繊維では変化は認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２１）ではオキシタラン線維でわずかに増加し、エラウニン繊維でもわずかに増加した。
Ｄ５でのエラスチンの発現は、Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と類似していた。
Ｄ５の空試験バッチ（ＴＪ５）と比較した製品塗布がエラスチン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではオキシタラン線維でわずかに減少したが、エラウニン繊維では変化は認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２１）ではオキシタラン線維でわずかに増加し、エラウニン繊維でもわずかに増加した。
【0043】
［培養１０日後（Ｄ１０）］
Ｄ１０でのエラスチンの発現は、Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と類似していた。
Ｄ１０の空試験バッチ（ＴＪ１０）と比較した製品塗布がエラスチン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではオキシタラン線維で中程度に増加し、エラウニン繊維でも中程度に増加した。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではオキシタラン繊維でわずかに増加し、エラウニン繊維でもわずかに増加した（図５参照）。
いずれの解析対象バッチでも、弾性繊維上のエラスチンの発現に差は認められなかった。
Ｄ１０でのエラスチンの発現は、Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と類似していた。
Ｄ１０の空試験バッチ（ＴＪ１０）と比較した製品塗布がエラスチン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではオキシタラン線維で中程度に増加し、エラウニン繊維でも中程度に増加した。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではオキシタラン繊維でわずかに増加し、エラウニン繊維でもわずかに増加した（図５参照）。
いずれの解析対象バッチでも、弾性繊維上のエラスチンの発現に差は認められなかった。
【0044】
３．ＩＶ型コラーゲン免疫染色
［培養０日（Ｄ０）］
真皮表皮接合部（ＤＥＪ）に沿ってやや明瞭かつ均一な染色が認められた。
［培養０日（Ｄ０）］
真皮表皮接合部（ＤＥＪ）に沿ってやや明瞭かつ均一な染色が認められた。
【0045】
［培養５日後（Ｄ５）］
Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と比較すると、ＩＶ型コラーゲンの発現はわずかに減少していた。
Ｄ５の空試験バッチ（ＴＪ５）と比較した製品塗布がＩＶ型コラーゲン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではＩＶ型コラーゲンの発現がわずかに増加した。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではＩＶ型コラーゲンの発現が中程度に増加した。
Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と比較すると、ＩＶ型コラーゲンの発現はわずかに減少していた。
Ｄ５の空試験バッチ（ＴＪ５）と比較した製品塗布がＩＶ型コラーゲン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではＩＶ型コラーゲンの発現がわずかに増加した。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではＩＶ型コラーゲンの発現が中程度に増加した。
【0046】
［培養１０日後（Ｄ１０）］
Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と比較すると、ＩＶ型コラーゲンの発現はわずかに減少した。
Ｄ１０の空試験バッチ（ＴＪ１０）と比較した製品塗布がＩＶ型コラーゲン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではＩＶ型コラーゲンの発現がわずかに減少した。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではＩＶ型コラーゲンの発現がわずかに増加した（図６参照）。
Ｄ０の空試験バッチ（Ｔ０）と比較すると、ＩＶ型コラーゲンの発現はわずかに減少した。
Ｄ１０の空試験バッチ（ＴＪ１０）と比較した製品塗布がＩＶ型コラーゲン発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）ではＩＶ型コラーゲンの発現がわずかに減少した。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）ではＩＶ型コラーゲンの発現がわずかに増加した（図６参照）。
【0047】
［結論］
これらの試験結果を培養５日後（Ｄ５）または培養１０日後（Ｄ１０）の空試験バッチ（ＴＪ５、ＴＪ１０）と比較した結果を以下の表３に示す。表３中のＦｏｘはオキシタラン線維を示し、Ｅｌａｕはエラウニン線維を示す。
これらの試験結果を培養５日後（Ｄ５）または培養１０日後（Ｄ１０）の空試験バッチ（ＴＪ５、ＴＪ１０）と比較した結果を以下の表３に示す。表３中のＦｏｘはオキシタラン線維を示し、Ｅｌａｕはエラウニン線維を示す。
【0048】
【表3】
【0049】
上述の試験結果から以下の結論が得られた。
１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）では、培養５日後（Ｄ５）にＩＶ型コラーゲン発現がわずかに増加、培養１０日後（Ｄ１０）にオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現が中程度に増加し、わずかなアンチエイジング作用が認められた。
２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）では、培養５日後（Ｄ５）にコラーゲン網の密度が中程度に増加し、ＩＶ型コラーゲンの発現が培養５日後（Ｄ５）にはわずかに、培養１０日後（Ｄ１０）には中程度に増加したことから、中程度のアンチエイジング作用が認められた。同時に、培養５日後（Ｄ５）および培養１０日後（Ｄ１０）にオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現がわずかに増加した。
１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）では、培養５日後（Ｄ５）にＩＶ型コラーゲン発現がわずかに増加、培養１０日後（Ｄ１０）にオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現が中程度に増加し、わずかなアンチエイジング作用が認められた。
２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）では、培養５日後（Ｄ５）にコラーゲン網の密度が中程度に増加し、ＩＶ型コラーゲンの発現が培養５日後（Ｄ５）にはわずかに、培養１０日後（Ｄ１０）には中程度に増加したことから、中程度のアンチエイジング作用が認められた。同時に、培養５日後（Ｄ５）および培養１０日後（Ｄ１０）にオキシタラン線維とエラウニン繊維の両方でエラスチン発現がわずかに増加した。
【実施例2】
【0050】
本実施例は、異なる濃度の単糖が脱脂洗浄したヒトの生体皮膚外植片に及ぼす保湿作用を評価することである。そのマーカーとしてフィラグリンとトランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ－１）を解析する。
フィラグリンとは、皮膚の角質層に存在する蛋白質の1種である。角質層のなかで水分を保つ働きをする天然保湿因子Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ＮＭＦ）は人間自身がもともと持っている肌中の保湿成分で、角層、角層細胞の中に１０～３０％あり、水を吸収し、保持する物質のこと。主な成分は、アミノ酸類、乳酸、尿素、クエン酸塩などで、いずれも水分をかかえこむ力がある。約半分を占めるアミノ酸はフィラグリンが分解されて生成されるものである。有棘層で前駆体（ぜんくたい）のプロフィラグリンとして産生され、分解を重ねることで顆粒層でＮＭＦに変化する。フィラグリンは保湿作用はもちろん、紫外線によるダメージを防ぐなど皮膚のバリアー機能も司っている。
トランスグルタミナーゼ（ＴＭＧ）は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性の架橋酵素であり、蛋白結合グルタミンのカルボキサミド基と様々な一級アミン（多くはリジン残基のアミノ基）との間のアシル転移反応を触媒し、蛋白質間にイソペプチド結合を形成し、不溶性の高分子構造を形成する（図７）。この酵素のアイソタイプ（遺伝子異型）の一つであるトランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ－１）は皮膚に多く存在する。表皮の角質層は、体内の水分の蒸散や外界からの刺激や異物侵入を防ぐバリア機能を担っている。角質層は角質細胞と細胞間脂質から構成され、角質細胞は コーニファイドエンベロープ（Ｃｏｒｍｉｆｉｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）と呼ばれる細胞膜様構造体で包まれている。コーニファイドエンベロープは、安定な角質細胞構造の構築に寄与しており、皮膚のバリア機能維持にとって重要な構造である。コーニファイドエンベロープは、角層の基底層にあるケラチノサイト（角化細胞）が角化するとともに、角化に必要なタンパク質であるインボルクリンやロリクリン等の蛋白質が合成され、次いでそれらの蛋白質がトランスグルタミナーゼ１の活性化により架橋されることで形成される。トランスグルタミナーゼ１の活性は、コーニファイドエンベロープの正常な形成と表皮の正常な角化、ひいては皮膚の保湿機能の維持・改善にとって重要である。
フィラグリンとは、皮膚の角質層に存在する蛋白質の1種である。角質層のなかで水分を保つ働きをする天然保湿因子Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ＮＭＦ）は人間自身がもともと持っている肌中の保湿成分で、角層、角層細胞の中に１０～３０％あり、水を吸収し、保持する物質のこと。主な成分は、アミノ酸類、乳酸、尿素、クエン酸塩などで、いずれも水分をかかえこむ力がある。約半分を占めるアミノ酸はフィラグリンが分解されて生成されるものである。有棘層で前駆体（ぜんくたい）のプロフィラグリンとして産生され、分解を重ねることで顆粒層でＮＭＦに変化する。フィラグリンは保湿作用はもちろん、紫外線によるダメージを防ぐなど皮膚のバリアー機能も司っている。
トランスグルタミナーゼ（ＴＭＧ）は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）依存性の架橋酵素であり、蛋白結合グルタミンのカルボキサミド基と様々な一級アミン（多くはリジン残基のアミノ基）との間のアシル転移反応を触媒し、蛋白質間にイソペプチド結合を形成し、不溶性の高分子構造を形成する（図７）。この酵素のアイソタイプ（遺伝子異型）の一つであるトランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ－１）は皮膚に多く存在する。表皮の角質層は、体内の水分の蒸散や外界からの刺激や異物侵入を防ぐバリア機能を担っている。角質層は角質細胞と細胞間脂質から構成され、角質細胞は コーニファイドエンベロープ（Ｃｏｒｍｉｆｉｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）と呼ばれる細胞膜様構造体で包まれている。コーニファイドエンベロープは、安定な角質細胞構造の構築に寄与しており、皮膚のバリア機能維持にとって重要な構造である。コーニファイドエンベロープは、角層の基底層にあるケラチノサイト（角化細胞）が角化するとともに、角化に必要なタンパク質であるインボルクリンやロリクリン等の蛋白質が合成され、次いでそれらの蛋白質がトランスグルタミナーゼ１の活性化により架橋されることで形成される。トランスグルタミナーゼ１の活性は、コーニファイドエンベロープの正常な形成と表皮の正常な角化、ひいては皮膚の保湿機能の維持・改善にとって重要である。
【0051】
本実施例において、保湿作用は以下の方法により評価した。
・ 一般形態の観察
・ フィラグリン免疫染色
・ ＴＧＭ－１免疫染色
・ 一般形態の観察
・ フィラグリン免疫染色
・ ＴＧＭ－１免疫染色
【0052】
［材料および方法］
1. Ｄ－プシコース
本試験では、実施例１と同様にＤ－プシコースを蒸留水で希釈し、濃度を１０％（Ｐ１）および２０％（Ｐ２）（ｍ／ｖ）とした。
２．外植片の作製の調製
４７歳の白人女性（参照番号：Ｐ１２３８－ＡＢ４７）の腹壁形成術時に、２４の皮膚外植片（径平均１１±１ｍｍ）を作製した。この外植片を、ＢＥＭ培地（ＢＩＯ－ＥＣの外植片培地）を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の加湿条件下、生存状態で培養した。
３．脱脂洗浄
以下のプロトコールに従い、バリア機能に変化を加えた。
・ １００％エタノールで皮膚外植片表面を洗浄する
・皮膚外植片表面を脱脂液（エーテル：アセトン＝１：１）で２回処理する
・ Ｋｉｍｔｅｃｈ（商標）ティッシュで皮膚外植片表面を拭く
これらの外植片を下記に示すように５バッチに分けた。
1. Ｄ－プシコース
本試験では、実施例１と同様にＤ－プシコースを蒸留水で希釈し、濃度を１０％（Ｐ１）および２０％（Ｐ２）（ｍ／ｖ）とした。
２．外植片の作製の調製
４７歳の白人女性（参照番号：Ｐ１２３８－ＡＢ４７）の腹壁形成術時に、２４の皮膚外植片（径平均１１±１ｍｍ）を作製した。この外植片を、ＢＥＭ培地（ＢＩＯ－ＥＣの外植片培地）を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の加湿条件下、生存状態で培養した。
３．脱脂洗浄
以下のプロトコールに従い、バリア機能に変化を加えた。
・ １００％エタノールで皮膚外植片表面を洗浄する
・皮膚外植片表面を脱脂液（エーテル：アセトン＝１：１）で２回処理する
・ Ｋｉｍｔｅｃｈ（商標）ティッシュで皮膚外植片表面を拭く
これらの外植片を下記に示すように５バッチに分けた。
【0053】
【表4】
【0054】
４．Ｄ－プシコースの皮膚外植片への適用
培養０日（Ｄａｙ０）に皮膚外植片表面を脱脂洗浄し、小さなスパーテルを用いてＤ－プシコースを濃度１０％（ＤＰ１）および２０％（ＤＰ２）の溶液を外植片に２μＬずつ局所塗布した。対照片（バッチＴ０、Ｄ０およびＤ）に塗布は行わなかった。
５．サンプリング
Ｄ０にバッチＤ０から３つの外植片を採取し、２つに切断した。一方を緩衝ホルマリン液で固定し、もう一方を－８０℃で凍結した。３時間後および２４時間後に各バッチの外植片を採取し、同様に処理した。緩衝ホルマリン液中で２４時間固定後、Ｌｅｉｃａ ＴＰ １０２０自動脱水機を用いて試料を脱水し、パラフィンに含浸させた。その後、Ｌｅｉｃａ ＥＧ １１６０包埋ステーションを用いて試料を包埋した。Ｌｅｉｃａ ＲＭ ２１２５ Ｍｉｎｏｔ型ミクロトームを用いて厚さ５μｍの切片を作製し、これらの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）組織学検査用スライドガラス上に固定した。Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３０５０低温槽を用いて凍結試料から厚さ７μｍの切片を作製し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）シラン処理スライドガラス上に固定した。Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢまたはＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４３顕微鏡を用いて顕微鏡検査を実施した。顕微鏡像は、ＤＰ７２ ＯｌｙｍｐｕｓカメラおよびＣｅｌｌＤ ｓｔｏｒｉｎｇソフトウェアを用いてデジタル化した。
培養０日（Ｄａｙ０）に皮膚外植片表面を脱脂洗浄し、小さなスパーテルを用いてＤ－プシコースを濃度１０％（ＤＰ１）および２０％（ＤＰ２）の溶液を外植片に２μＬずつ局所塗布した。対照片（バッチＴ０、Ｄ０およびＤ）に塗布は行わなかった。
５．サンプリング
Ｄ０にバッチＤ０から３つの外植片を採取し、２つに切断した。一方を緩衝ホルマリン液で固定し、もう一方を－８０℃で凍結した。３時間後および２４時間後に各バッチの外植片を採取し、同様に処理した。緩衝ホルマリン液中で２４時間固定後、Ｌｅｉｃａ ＴＰ １０２０自動脱水機を用いて試料を脱水し、パラフィンに含浸させた。その後、Ｌｅｉｃａ ＥＧ １１６０包埋ステーションを用いて試料を包埋した。Ｌｅｉｃａ ＲＭ ２１２５ Ｍｉｎｏｔ型ミクロトームを用いて厚さ５μｍの切片を作製し、これらの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）組織学検査用スライドガラス上に固定した。Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３０５０低温槽を用いて凍結試料から厚さ７μｍの切片を作製し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）シラン処理スライドガラス上に固定した。Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢまたはＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４３顕微鏡を用いて顕微鏡検査を実施した。顕微鏡像は、ＤＰ７２ ＯｌｙｍｐｕｓカメラおよびＣｅｌｌＤ ｓｔｏｒｉｎｇソフトウェアを用いてデジタル化した。
【0055】
５．１．一般形態
マッソン３色染色ゴルドナー変法によりパラフィン切片を染色し、一般形態を観察した。
５．２．フィラグリン免疫染色
フィラグリン免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで３２００倍に希釈したマウス抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Ｓａｉｎｔ ｃｒｕｚ、参照番号ｓｃ－６６１９２、ｃｌｏｎｅ ＡＫＨ１）を、ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増幅システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＳＡ１００１）を用いて室温で１時間放置した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＳＡ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウムで後染色した。免疫染色は顕微鏡検査により評価した。
５．３．ＴＧＭ－１免疫染色
ＴＧＭ－１免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで１００倍に希釈したマウスモノクローナル抗ヒトＴＧＭ－１抗体（Ｈａｒｂｏｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、ｃｌｏｎｅ Ｂ．Ｃ１）を凍結切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増幅システムを用いて室温で２時間放置した後、ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＳＡ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウムで後染色した。免疫染色は顕微鏡検査により評価した。
マッソン３色染色ゴルドナー変法によりパラフィン切片を染色し、一般形態を観察した。
５．２．フィラグリン免疫染色
フィラグリン免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで３２００倍に希釈したマウス抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Ｓａｉｎｔ ｃｒｕｚ、参照番号ｓｃ－６６１９２、ｃｌｏｎｅ ＡＫＨ１）を、ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増幅システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＳＡ１００１）を用いて室温で１時間放置した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＳＡ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウムで後染色した。免疫染色は顕微鏡検査により評価した。
５．３．ＴＧＭ－１免疫染色
ＴＧＭ－１免疫染色では、Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水ウシ血清アルブミンで１００倍に希釈したマウスモノクローナル抗ヒトＴＧＭ－１抗体（Ｈａｒｂｏｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、ｃｌｏｎｅ Ｂ．Ｃ１）を凍結切片に添加し、ビオチン・ストレプトアビジン増幅システムを用いて室温で２時間放置した後、ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号ＳＡ１００１）で標識した。核はヨウ化プロピジウムで後染色した。免疫染色は顕微鏡検査により評価した。
【0056】
［結果］
１．一般形態
空試験バッチ、（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄なし）（Ｄ０（Ｔ０））
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が２～３層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ、（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）（Ｄ０（Ｄ０））
角質層はわずかに厚みがあり、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が２～３層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ、（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、３時間後サンプリング）（Ｄ３ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
１．一般形態
空試験バッチ、（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄なし）（Ｄ０（Ｔ０））
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が２～３層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ、（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）（Ｄ０（Ｄ０））
角質層はわずかに厚みがあり、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が２～３層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ、（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、３時間後サンプリング）（Ｄ３ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
【0057】
脱脂洗浄バッチ（１０％Ｄ－プシコース塗布、脱脂洗浄あり、３時間後サンプリング）（ＤＰ１ ３ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（２０％Ｄ－プシコース塗布、脱脂洗浄あり、３時間後サンプリング）（ＤＰ２ ３ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈している細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（２０％Ｄ－プシコース塗布、脱脂洗浄あり、３時間後サンプリング）（ＤＰ２ ３ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈している細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
【0058】
脱脂洗浄バッチ（脱脂洗浄あり、２４時間後サンプリング）（Ｄ２４ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（１０％Ｄ－プシコース塗布、脱脂洗浄あり、２４時間後サンプリング）（ＤＰ１ ２４ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（２０％Ｄ－プシコース塗布、脱脂洗浄あり、２４時間後サンプリング）（ＤＰ２ ２４ｈ）
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（１０％Ｄ－プシコース塗布、脱脂洗浄あり、２４時間後サンプリング）（ＤＰ１ ２４ｈ）
角質層は中程度に厚く、わずかに層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（２０％Ｄ－プシコース塗布、脱脂洗浄あり、２４時間後サンプリング）（ＤＰ２ ２４ｈ）
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が３～４層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層には中程度に密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
【0059】
２．フィラグリン
抗フィラグリン抗体未処理の陰性対照に染色は認められなかった。
対照バッチ（Ｔ０）では、角質層底部の２～３細胞層で中程度からやや明瞭（強度）な染色が認められた（図８参照）。
フィラグリン免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図９に示す。
抗フィラグリン抗体未処理の陰性対照に染色は認められなかった。
対照バッチ（Ｔ０）では、角質層底部の２～３細胞層で中程度からやや明瞭（強度）な染色が認められた（図８参照）。
フィラグリン免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図９に示す。
【0060】
３．ＴＧＭ－１
抗ＴＧＭ－１抗体未処理の陰性対照に染色は認められなかった。対照バッチ（Ｔ０）では、角質層底部で中等度からやや明瞭な染色が認められた（図１０参照）。ＴＧＭ－１免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図１１に示す。
抗ＴＧＭ－１抗体未処理の陰性対照に染色は認められなかった。対照バッチ（Ｔ０）では、角質層底部で中等度からやや明瞭な染色が認められた（図１０参照）。ＴＧＭ－１免疫染色におけるバッチの染色状態のまとめを図１１に示す。
【0061】
［考察］
１．一般形態
空試験バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし）、Ｄ０（Ｔ０）
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が２～３層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）はバッチＴ０よりも角質層がわずかに密であり、わずかに薄かった。解析した他の評価項目は、バッチＴ０で認められた結果と類似していた。
１．一般形態
空試験バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし）、Ｄ０（Ｔ０）
角質層は中程度に厚く、中程度に層状化している。
表皮には良好な形態を呈する細胞層が２～３層認められる。
表皮真皮接合部の緩衝は中程度である。
真皮乳頭層にはやや密なコラーゲン繊維網がみられる。
真皮細胞の形態は良好である。
脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）はバッチＴ０よりも角質層がわずかに密であり、わずかに薄かった。解析した他の評価項目は、バッチＴ０で認められた結果と類似していた。
【0062】
［培養３時間後の形態］
３時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ３ｈ）では、一般形態はバッチＤ０で認められた形態に類似しており、角質層がわずかに厚かった。
バッチＤ０と比較した製品塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では視認できる変化はまったく認められなかった。
３時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ３ｈ）では、一般形態はバッチＤ０で認められた形態に類似しており、角質層がわずかに厚かった。
バッチＤ０と比較した製品塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では視認できる変化はまったく認められなかった。
【0063】
［２４時間後の形態］
２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ２４ｈ）では、一般形態はバッチＤ０で認められた形態に類似しており、角質層がわずかに厚かった。
バッチＤ０と比較した製品塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）塗布では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）塗布では角質層の層状化がわずかに進み、中程度に層化していた。
２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ２４ｈ）では、一般形態はバッチＤ０で認められた形態に類似しており、角質層がわずかに厚かった。
バッチＤ０と比較した製品塗布が一般形態に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）塗布では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）塗布では角質層の層状化がわずかに進み、中程度に層化していた。
【0064】
２．フィラグリン
［培養時間なしの形態］
対照バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄なし）（Ｔ０）では、角質層底部の２～３細胞層で中程度からやや明瞭な染色が認められた。
脱脂バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）（Ｄ０）はバッチＴ０よりもフィラグリンの発現がわずかに減少し、１～２細胞層にのみ発現していた。
［３時間後の形態］
３時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、３時間培養）（Ｄ３ｈ）はバッチＤ０よりもフィラグリンの発現がわずかに増加し、２～３細胞層に発現していた。
バッチＤ３ｈと比較したＤ－プシコース塗布がフィラグリンの発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では３～４細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では３～４細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した。
［２４時間後の形態］
２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、２４時間培養）（Ｄ２４ｈ）はバッチＤ０よりもフィラグリンの発現がわずかに増加し、３～４細胞層で認められた。
バッチＤ２４ｈと比較したＤ－プシコース塗布がフィラグリンの発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では４～５細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では４～５細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した（図１２参照）。
［培養時間なしの形態］
対照バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄なし）（Ｔ０）では、角質層底部の２～３細胞層で中程度からやや明瞭な染色が認められた。
脱脂バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）（Ｄ０）はバッチＴ０よりもフィラグリンの発現がわずかに減少し、１～２細胞層にのみ発現していた。
［３時間後の形態］
３時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、３時間培養）（Ｄ３ｈ）はバッチＤ０よりもフィラグリンの発現がわずかに増加し、２～３細胞層に発現していた。
バッチＤ３ｈと比較したＤ－プシコース塗布がフィラグリンの発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では３～４細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では３～４細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した。
［２４時間後の形態］
２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、２４時間培養）（Ｄ２４ｈ）はバッチＤ０よりもフィラグリンの発現がわずかに増加し、３～４細胞層で認められた。
バッチＤ２４ｈと比較したＤ－プシコース塗布がフィラグリンの発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では４～５細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では４～５細胞層でフィラグリンの発現がわずかに増加した（図１２参照）。
【0065】
３．ＴＧＭ－１
［培養時間なしの形態］
対照バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄なし）（Ｔ０）では、角質層底部の２～３細胞層で中程度からやや明瞭な染色が認められた。
脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）（Ｄ０）はバッチＴ０よりもＴＧＭ－１の発現がやや明瞭に減少し、１～２細胞層で認められた。
［３時間後の形態］
３時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、３時間培養）（（Ｄ３ｈ）はバッチＤ０よりもＴＧＭ－１の発現が中程度に増加し、２～３細胞層で認められた。
バッチＤ３ｈと比較したＤ－プシコースの塗布がＴＧＭ－１の発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では視認できる変化はまったく認められなかった。
［２４時間後の形態］
２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、２４時間培養）（Ｄ２４ｈ）はバッチＤ０よりもＴＧＭ－１の発現がやや明瞭に増加し、２～３細胞層で認められた。
バッチＤ２４ｈと比較したＤ－プシコース塗布がＴＧＭ－１の発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では３～４細胞層でＴＧＭ－１の発現がわずかに増加した（図１３参照）。
［培養時間なしの形態］
対照バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄なし）（Ｔ０）では、角質層底部の２～３細胞層で中程度からやや明瞭な染色が認められた。
脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり）（Ｄ０）はバッチＴ０よりもＴＧＭ－１の発現がやや明瞭に減少し、１～２細胞層で認められた。
［３時間後の形態］
３時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、３時間培養）（（Ｄ３ｈ）はバッチＤ０よりもＴＧＭ－１の発現が中程度に増加し、２～３細胞層で認められた。
バッチＤ３ｈと比較したＤ－プシコースの塗布がＴＧＭ－１の発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では視認できる変化はまったく認められなかった。
［２４時間後の形態］
２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ－プシコース塗布なし、脱脂洗浄あり、２４時間培養）（Ｄ２４ｈ）はバッチＤ０よりもＴＧＭ－１の発現がやや明瞭に増加し、２～３細胞層で認められた。
バッチＤ２４ｈと比較したＤ－プシコース塗布がＴＧＭ－１の発現に及ぼす影響：
・１０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ１）では視認できる変化はまったく認められなかった。
・２０％Ｄ－プシコース塗布（Ｐ２）では３～４細胞層でＴＧＭ－１の発現がわずかに増加した（図１３参照）。
【0066】
［結論］
これらの試験結果を３時間後または２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ３ｈ、Ｄ２４ｈ）と比較した結果を以下に示す。
これらの試験結果を３時間後または２４時間後の脱脂洗浄バッチ（Ｄ３ｈ、Ｄ２４ｈ）と比較した結果を以下に示す。
【0067】
【表5】
【0068】
１０％Ｄ－プシコース（Ｐ１）では、角質層の脱脂洗浄後に皮膚バリア機能に極めてわずかな作用が認められた。脱脂洗浄から３および２４時間後にフィラグリンの発現がわずかに増加した。解析した他の評価項目に対する影響は認められなかった。
２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）では、角質層の脱脂洗浄後に皮膚バリア機能にわずかな作用が認められた。脱脂洗浄から２４時間後に角質層の層状化の改善が認められた。また、脱脂洗浄から３および２４時間後にフィラグリンの発現がわずかに増加し、脱脂洗浄から２４時間後にはＴＧＭ－１の発現がわずかに増加した。
２０％Ｄ－プシコースにはフィラグリンの発現を増加し、ＴＧＭ－１の発現を増加することで、角質層の層化を促進して保湿効果を示すことが示唆された。今後はインボルクリンやロリクリンなどの蛋白質発現を確認すること、親水性のＤ－プシコースの皮膚への移行性を高めるための基剤との併用効果を検証すること、Ｄ－プシコースの誘導体の開発などが必要となる。
２０％Ｄ－プシコース（Ｐ２）では、角質層の脱脂洗浄後に皮膚バリア機能にわずかな作用が認められた。脱脂洗浄から２４時間後に角質層の層状化の改善が認められた。また、脱脂洗浄から３および２４時間後にフィラグリンの発現がわずかに増加し、脱脂洗浄から２４時間後にはＴＧＭ－１の発現がわずかに増加した。
２０％Ｄ－プシコースにはフィラグリンの発現を増加し、ＴＧＭ－１の発現を増加することで、角質層の層化を促進して保湿効果を示すことが示唆された。今後はインボルクリンやロリクリンなどの蛋白質発現を確認すること、親水性のＤ－プシコースの皮膚への移行性を高めるための基剤との併用効果を検証すること、Ｄ－プシコースの誘導体の開発などが必要となる。
【実施例3】
【0069】
Ｄ－プシコースを含有するオールインワンゲルを作成した。このゲルは、化粧水、乳液、美容液、ブライトニング、化粧下地の５つのステップを１つに凝縮して、簡単スキンケアを実現したものであり、高い水分保持能力を持ち、肌へのやさしさを持つ保湿ゲルである。各種美容成分にＤ－プシコースを１あるいは３重量％配合するこのゲルはよくのびて肌の奥までうるおいがしみこむ感じがする。実施例1のＤ－プシコースのアンチエイジング作用、実施例２保湿作用についての作用効果に基づく、オールインワンゲルとしてまた皮膚機能の改善組成物として優れた効果を発揮するものと期待される。表６にはプシコースを１重量％含有する組成を示した。
【0070】
【表6】
【実施例4】
【0071】
実施例３とは異なる配合のオールインワンゲルを作成しその組成を表７に示した。各種美容成分にＤ－プシコースを５あるいは１０重量％含有するこのゲルは、実施例３と同様に、よくのびて肌にうるおいが浸透する感じがする。実施例1のＤ－プシコースのアンチエイジング作用、実施例２保湿作用についての作用効果に基づく、オールインワンゲルとしてまた皮膚機能の改善組成物として優れた効果を発揮するものと期待される。
【0072】
【表7】
【実施例5】
【0073】
Ｄ－プシコースを１０重量％含有するクリームを作成した。その組成を表８に示す。各種美容成分にＤ－プシコースを１０重量％配合したクリームは、保湿に適した有効成分で皮膚をしっとり包み込むことができる。実施例1のＤ－プシコースのアンチエイジング作用、実施例２の保湿作用に基づく、保湿性を有し、さらに皮膚の老化現象などを防止する皮膚機能改善性を有する優れた効果を発揮するものと期待される。
【0074】
【表8】
【実施例6】
【0075】
プシコースを５重量％含有するエッセンス（美容液）を作成し、その組成を表９に示した。各種美容成分にＤ－プシコースを５重量％配合したエッセンスは、Ｄ－プシコースの実施例1のアンチエイジング作用、実施例２の保湿作用に基づく、保湿性を有し、さらに皮膚の老化現象などを防止する皮膚機能改善性を有する優れた効果を発揮するものと期待される。
【0076】
【表9】
【実施例7】
【0077】
1. プシコースを５重量％含有するローションを作成しその組成を表１０に示す。各種美容成分にＤ－プシコースを５重量％配合したローションは、使い心地に軽さがあり、使用シーンを選ばないため、普段使いの乾燥対策に効果的である。このローションを長期間使用することにより、実施例1のＤ－プシコースのアンチエイジング作用、実施例２保湿作用についての作用効果に基づく、皮膚機能の改善および老化の防止が達成されることが期待される。
【0078】
【表10】
【実施例8】
【0079】
Ｄ－プシコースを５重量％含有する洗顔フォームを作成し、その組成を表１１に示す。各種美容成分にＤ－プシコースを５重量％配合した洗顔フォームは、肌に負担をかけずに汚れを落としみずみずしい素肌に洗い上げる。この洗顔フォームを継続して使用することにより、実施例1のＤ－プシコースのアンチエイジング作用、実施例２保湿作用についての作用効果に基づく、皮膚機能の改善および老化の防止が達成されるものと期待される。
【0080】
【表11】
【産業上の利用可能性】
【0084】
本発明は、希少糖のＤ－プシコースを含むことを特徴としており、皮膚保湿性、皮膚抗酸化性および皮膚抗老化性の一以上の皮膚機能を改善することができる優れた皮膚機能改善組成物を提供することが期待される。本発明の化粧料などの皮膚外用剤は、継続して塗布することに何らの障害もなく、希少糖のＤ－プシコースを長期間の継続した経皮吸収することが容易となり、皮膚機能の改善に役立つことが期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
