特許 7078115 光散乱検出装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-23

(45)【発行日】2022-05-31

(54)【発明の名称】光散乱検出装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/14 20060101AFI20220524BHJP

【ＦＩ】

G01N15/14 D

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020532094

(86)(22)【出願日】2018-07-26

(86)【国際出願番号】 JP2018028124

(87)【国際公開番号】W WO2020021682

(87)【国際公開日】2020-01-30

【審査請求日】2020-10-20

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100179969

【弁理士】

【氏名又は名称】駒井 慎二

(74)【代理人】

【識別番号】100173532

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 彰文

(72)【発明者】

【氏名】山口 亨

(72)【発明者】

【氏名】笠谷 敦

【審査官】海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６０－２４３５６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０２－０５５９３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６１－０３８４４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－１５６６６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０２－０７７６３６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ １５／００－１５／１４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体試料中の微粒子を検出するための光散乱検出装置であって、
液体試料を保持する透明な試料セルと、
前記試料セルに、該液体試料の中心軸に対して傾斜した角度からコヒーレント光を照射する光源と、
前記液体試料から周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する結像光学系と、
前記結像光学系に入射する散乱角範囲を制限するためのスリットが形成されたスリット板と、
前記結像光学系からの集光を受光する検出器と、
を備え、
前記スリットの中心軸は、前記結像光学系の中心軸から鉛直方向一方へ偏心して配置されていることを特徴とする光散乱検出装置。

【請求項2】

前記スリットは、鉛直方向に縦長に形成されている、請求項１に記載の光散乱検出装置。

【請求項3】

前記スリットは、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状であって、前記結像光学系の中心軸から鉛直方向の上方へ偏心して配置されており、
前記スリットの前記結像光学系の中心軸からの鉛直方向の下方長さをａ、上方長さをｂとした場合に、ａ＜ｂの関係を有する、請求項１または請求項２に記載の光散乱検出装置。

【請求項4】

前記試料セルから前記検出器に至る検出光学系は、前記試料セルの周囲にセル中心軸から等間隔で複数配置されており、
前記スリットの下方長さａと上方長さｂとの長さ比は、前記試料セルに対する各検出器の配置角度に応じて、ａ≦ｂの条件下で調整される、請求項３に記載の光散乱検出装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体試料中に分散している微粒子の分子量や回転半径（サイズ）等を測定するための微粒子検出装置に利用される光散乱検出装置に関する。

【背景技術】

【0002】

液体試料中に分散しているタンパク質等の微粒子を分離するための手法として、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）が知られている。近年、クロマトグラフィ検出装置としては、紫外線（ＵＶ）吸光度検出装置や示差屈折率検出装置に加え、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出装置が用いられている。ＭＡＬＳ検出装置は、測定試料の分子量や粒子径が算出可能であるという特長がある（特許文献１および２参照）。

【0003】

図７は、原点に散乱光発生光源を配置した場合の散乱光放射方向の座標系を示している。図７に示すように、ＸＹ面上においてＸ方向正方向に光が入射し、ＸＹ面上における光の進行方向からの散乱角度をθ、ＸＹ面上からの角度をφと定義する。

【0004】

次に、図８は、ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の平面図を、図９は側面図を示している。図８および図９において、１１０は試料セル、１１１は液体試料、１２０は光源、１２１は集光レンズ、１４０はスリット板、１５０は結像レンズ、１６０はアパーチャ板、１７０は検出器である。図８および図９に示すように、円筒体状の試料セル１１０の内部に液体試料１１１を通液し、試料セル１１０および流路中心を通るように光源１２０から光を照射する。光源としては、通常、可視レーザ光が用いられる。光の進行方向からの角度θが水平面上（ＸＹ平面上）の散乱角として定義され、異なる散乱角を検出するように試料セル１１０および流路中心を通る水平面上（ＸＹ平面上）に検出器１７０が複数配置される。図８は、θ１，θ２の配置角度で検出器１７０を２個配置した例である。

【0005】

円筒体状の試料セル１１０の場合、ガラスと空気との界面及びガラスと流路との界面における反射光が迷光として検出器１７０に入り、検出器１７０の検出精度を悪化させるという課題があった。その解決策として、発明者は、図９に示すように、試料セル１１０に対して入射光をチルト（角度α）させることによって、上記迷光を低減させる手法を見出した（非特許文献１参照）。

【0006】

次に、図１０および図１１は、散乱光強度と散乱角の関係を示している。すなわち、図１０及び図１１は、Ｍｉｅ散乱の理論式に従って、入射波長６６０ｎｍ、屈折率１．３３の溶媒中での屈折率１．５９の粒子の散乱パターンを計算した結果である。粒子径は、１ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍとした。図１０は水平方向（θ方向）の散乱角度パターンであり、図１１は鉛直方向（φ方向）の散乱角度パターンである。試料が入射光の波長に比べて十分小さい場合、θ方向への散乱光は等方的に発生し、散乱光強度の散乱角依存性はない。試料の粒子径が大きくなるに従い、散乱光は前方（θが小さい方向）への散乱が強くなる。φ方向には、φが大きくなるに従い、散乱光強度が小さくなる傾向がある。

【0007】

また、ＭＡＬＳ検出装置では、低い濃度の試料が測定でき、かつ、高いＳ／Ｎ比の装置が望ましい。そのためには、試料から発生する散乱光を効率的に検出器に入るようにする光学系が求められる。言い換えると、各検出器に入る散乱光の立体角が大きい必要がある。検出器の立体角を大きくする際に、水平方向（光軸面上）の立体角を大きくすると、各検出器の角度分解能が悪くなってしまうため、鉛直方向の立体角を大きく取ることが望ましい。ただし、立体角を大きくすべく検出器サイズを大きくすることは、暗電流が増加するため、好ましくない。

【0008】

検出器サイズを大きくすることなく、立体角を大きく取るためには、レンズ等で散乱光を集光する方法が採られる（非特許文献１）。具体的には、セル流路で発生した散乱光が結像レンズを介して、検出器で結像する配置である。そこで、水平方向の立体角を小さくし、鉛直方向の立体角を大きくするために、結像レンズの入射側に、水平方向の開口幅が狭く、鉛直方向に広い開口長を有するスリットが設けられる。これにより、角度分解能が悪化することなく、散乱光を効率的に検出することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】特開平０７－７２０６８号公報、

【文献】特開２０１５－１１１１６３号公報

【文献】「光散乱法によるタンパク質の絶対分子量と複合体形成の解析」、尾高雅文、生物工学８９巻

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

検出器に入る光量を増加させるためには、結像レンズの入射側に配置されたスリットの鉛直方向の開口長を大きく設定する必要がある。しかし、スリットの鉛直方向の開口長を大きく設定すると、試料セルのガラスと空気との界面及びガラスと流路との界面での反射光が、迷光として検出器に入射される。反射光は散乱光に比べて強度が大きいため、検出器のダイナミックレンジが低下するとともに、迷光の強度変動により検出器の検出精度が悪化する。一方、この迷光を除去するために、入射光のチルト角度αを大きく設定すると、図１１に示したように鉛直方向の散乱角度φが大きくなり、スリットに入る散乱光強度が低下し、Ｓ／Ｎ比が低下する。

【0011】

そこで、本発明は、入射光のチルト角度αを大きく設定することなく、結像レンズの入射側スリットの鉛直方向の立体角を大きく設定することができ、高いＳ／Ｎ比で検出精度よく測定することができる光散乱検出装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の一態様に係る光散乱検出装置は、液体試料中の微粒子を検出するための光散乱検出装置であって、液体試料を保持する透明な試料セルと、上記試料セルに、該液体試料の中心軸に対して傾斜した角度からコヒーレント光を照射する光源と、上記液体試料から周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する結像光学系と、上記結像光学系に入射する散乱角範囲を制限するためのスリットが形成されたスリット板と、上記結像光学系からの集光を受光する検出器と、を備え、上記スリットの中心軸は、前記結像光学系の中心軸から鉛直方向一方へ偏心して配置されていることを特徴とする。

【0013】

上記光散乱検出装置の構成において、上記スリットは、鉛直方向に縦長に形成されていることが好ましい。

【0014】

また、上記スリットは、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状であって、上記結像光学系の中心軸から鉛直方向の上方へ偏心して配置されており、上記スリットの前記結像光学系の中心軸からの鉛直方向の下方長さをａ、上方長さをｂとした場合に、ａ＜ｂの関係を有することが好ましい。

【0016】

そして、上記試料セルから上記検出器に至る検出光学系は、上記試料セルの周囲にセル中心軸から等間隔で複数配されており、上記スリットの下方長さａと上方長さｂとの長さ比は、上記試料セルに対する各検出器の配置角度に応じて、ａ≦ｂの条件下で調整されることが好ましい。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、入射光のチルト角度αを大きく設定することなく、結像レンズの入射側スリットの鉛直方向の立体角を大きく設定することができ、高いＳ／Ｎ比で検出精度よく測定することができる光散乱検出装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本発明に係る光散乱検出装置の一実施形態の側面図である。

【図2】本実施形態に係る光散乱検出装置の一部拡大側面図である。

【図3】本実施形態に係る光散乱検出装置の平面図である。

【図4】光線追跡シミュレーションにおける配置および部材寸法を説明するための側面図である。

【図5】検出器をθ=１５度に配置した場合における光線追跡シミュレーション結果を説明するための平面図である。

【図6】検出器をθ=１５度に配置した場合における光線追跡シミュレーション結果を説明するための側面図である。

【図7】原点に散乱光発生光源を配置した場合の散乱光放射方向の座標系である。

【図8】ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の平面図である。

【図9】ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の側面図である。

【図10】散乱光強度と散乱角の関係（水平方向の散乱角度パターン）の説明図である。

【図11】散乱光強度と散乱角の関係（鉛直方向の散乱角度パターン）の説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明に係る光散乱検出装置の一実施形態について図面を参照して説明する。なお、各図において、同一の符号を付したものは、同一又は同様の構成を有する。

【0021】

〔光散乱検出装置の構成〕
まず、図１から図３を参照して、本発明に係る光散乱検出装置の一実施形態の構成について説明する。図１は、本発明に係る光散乱検出装置の一実施形態の側面図である。図２は、本実施形態に係る光散乱検出装置の一部拡大側面図である。図１および図２に示すように、本実施形態に係る光散乱検出装置１は、液体試料中に分散しているタンパク質等の微粒子の分子量や回転半径（サイズ）を検出する装置である。光散乱検出装置１は、試料セル１０、光源２０、スリット板４０、結像光学系５０、アパーチャ６０および検出器７０を備える。以下、各構成要素ごとに説明する。

【0022】

試料セル１０は、内部の流路に液体試料を保持する透明な円筒体状のセルである。試料セル１０は、例えば、無色透明な石英ガラスによって形成されている。

【0023】

光源２０は、試料セル１０にコヒーレント光を照射する。「コヒーレント光」とは、光束内の任意の２点における光波の位相関係が時間的に不変で一定に保たれており、任意の方法で光束を分割した後、大きな光路差を与えて再び重ね合わせても完全な干渉性を示す光をいう。光源２０としては、例えば、可視光レーザを照射するためのレーザ光源が採用される。自然界には完全なコヒーレント光は存在せず、シングルモードで発振するレーザ光はコヒーレント状態に近い光である。

【0024】

光源２０から試料セル１０に至る入射光の光路Ｌ１には、集光光学系２１が配置されている。集光光学系２１としては、例えば、単一の集光レンズが採用されている。この集光レンズは、平凸レンズであり、光源２０からの光の入射側が凸面で、出射側が平面に形成されている。本実施形態では、集光光学系２１として、単一の集光レンズを採用しているが、集光光学系２１は複数の複合レンズや集光ミラーを組み合わせて構成してもよい。

【0025】

光源２０および集光光学系２１は、光源２０から試料セル１０に入射するコヒーレント光の光軸が、試料セル１０及び検出器７０を含む平面（ＸＹ平面）から所定の角度（チルト角度α）で傾斜するように配置されている。具体的には、試料セル１０に対して入射光が斜め上方から入射するように、光源２０および集光光学系２１が配置されている。試料セル１０に対して入射光をチルト（角度α）させることによって、試料セル１０のガラスと空気との界面及びガラスと流路との界面〔以下、「セル界面」と総称する。）での反射光による迷光を低減させることができる。光源２０から照射されたレーザ光は、集光光学系２１を通過した後、試料セル１０の中心軸付近に集光する。

【0026】

試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上には、検出光学系３０が配置されている。本実施形態の検出光学系３０は、スリット板４０、結像光学系５０、アパーチャ板６０及び検出器７０から構成されている。

【0027】

結像光学系５０は、試料セル１０から周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する。結像光学系５０としては、例えば、単一の結像レンズが採用されている。この結像レンズは、平凸レンズであり、試料セル１０からの散乱光の入射側が平面で、出射側が凸面に形成されている。本実施形態では、結像光学系５０として、単一の結像レンズを採用したが、結像光学系５０は複数の複合レンズや結像ミラーを組み合わせて構成してもよい。

【0028】

スリット板４０は、試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上において、試料セル１０と結像光学系５０との間に配置されている。スリット板４０は、結像光学系５０に入射する散乱角範囲を制限する。すなわち、スリット板４０に開口されたスリット４１は、水平方向の散乱角を制限し、且つ、鉛直方向の光束を多く取り込むために、鉛直方向に縦長であって、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状である。具体的には、スリット４１は、鉛直方向に縦長の長方形状や長孔形状を呈している。

【0029】

スリット４１の中心軸４１Ｓは、結像光学系５０の中心軸５０Ｓから鉛直方向一方へ偏心して配置されている。光源２０の照射光が試料セル１０の斜め上方から入射するため、試料セル１０の空気とガラスとの界面およびガラスと液体との界面（以下、「セル界面」という。）で生じた反射光ＲＬが迷光として下方へ偏り易い。したがって、本実施形態のスリット４１の中心軸４１Ｓは、反射光（迷光）ＲＬを制限すべく、結像光学系５０の中心軸５０Ｓから鉛直方向の上方へ偏心して配置されている。

【0030】

具体的には、図２に示すように、スリット４１の結像光学系５０の中心軸５０Ｓからの鉛直方向の下方長さをａ、上方長さをｂとした場合に、スリット４１の下方長さａと上方長さｂの関係はａ＜ｂとなるように設定される。入射光は下方から上方へ入射してもよく、その場合は、スリット４１の下方長さａと上方長さｂとの関係はａ＞ｂとなるように設定される。

【0031】

アパーチャ板６０は、試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上において、検出器７０よりも結像光学系側に配置されている。アパーチャ板６０は迷光を制限する機能を有し、アパーチャ６１は検出器７０の受光面前で開口している。

【0032】

検出器７０は、結像光学系５０からの集光を受光する。すなわち、結像光学系５０の焦点に、検出器７０の受光面が位置している。本実施形態の検出器７０としては、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）を採用しているが、２次元ＣＭＯＳ等のアレイ検出器を採用してもよい。

【0033】

図３は、本実施形態に係る光散乱検出装置の一実施形態の平面図である。図３に示すように、試料セル１０から検出器７０に至る検出光学系３０は、試料セル１０の周囲にセル中心軸Ｓから等間隔ｄで複数配されている。光の進行方向からの角度θが水平面上（ＸＹ平面上）の散乱角として定義される。異なる散乱角を検出できるように、試料セル１０およびセル中心軸Ｓを通る水平面上（ＸＹ平面上）に検出器７０が複数配置される。図３の態様では、θ１，θ２の配置角度で検出光学系３０、３１が２系配置されている。

【0034】

試料セル１０の周囲に等間隔ｄで複数の検出器７０を備える場合、試料セル１０に対する各検出器７０の配置角度に応じて、スリット４１の下方長さａと上方長さｂとの長さ比は、ａ≦ｂの条件下で調整される。すなわち、図３において、散乱角θ２に配置した検出光学系３１は、散乱角θ１に配置した検出光学系３０よりも、セル界面での反射光の影響が少ない。散乱角θ２＝９０度の検出光学系３１は、セル界面での反射光の影響が少ないので、ａを大きく設定して、ｂに近づけることで、鉛直方向の立体角を最適化することができる。

【0035】

〔光散乱検出装置の作用〕
次に、図１から図６を参照して、本実施形態に係る光散乱検出装置１の作用について説明する。

【0036】

図１および図２に示すように、円筒体状の試料セル１０の流路に液体試料１１が通液される。液体試料１１の通液が完了すると、光源２０から集光光学系２１を介してコヒーレント光である可視レーザ光が照射される。可視レーザ光は、光路Ｌ１に沿って進むことにより、レーザ光が試料セル１０の流路内の液体試料１１に入射する。液体試料１１にレーザ光が入射されると、その光は液体試料１１に含まれる微粒子に当たって所定の散乱角を以て散乱する。そして、試料セル１０から出射した散乱光は、スリット板４０のスリット４１を通過した後、結像光学系５０およびアパーチャ板６０を経て、検出器７０の受光面上に受光される。

【0037】

試料セル１０から散乱光が出射する際、試料セル１０のセル界面において、反射光ＲＬが迷光として生じる。光源２０の照射光が試料セル１０の斜め上方からチルト角度αで入射するため、試料セル１０のセル界面で生じた反射光（迷光）は下方へ偏り易い。本実施形態のスリット４１は、結像光学系５０の中心軸５０Ｓから鉛直方向の上方へ偏心配置されているので、スリット板４０の板部分で下方へ偏った反射光（迷光）ＲＬを制限することができる。

【0038】

このようにスリット板４０のスリット４１を結像光学系５０の中心軸５０Ｓから鉛直方向の上方へ偏心配置したことにより、分析に有益な散乱光を積極的に結像光学系５０へ入射させることができる。結像光学系５０は、検出器７０の受光面に結像するが、受光面前にアパーチャ板６０が配置されている。したがって、アパーチャ板６０がさらに迷光を制限し、分析に必要な散乱光を検出器７０の受光面に受光させることができる。

【0039】

具体的には、スリット４１の結像光学系５０の中心軸５０Ｓからの鉛直方向の下方長さをａ、上方長さをｂとした場合に、スリット４１の下方長さａと上方長さｂの関係はａ＜ｂとなるように設定される。すなわち、スリット４１の下方向長さａを小さく設定することにより、セル界面での反射光ＲＬをスリット板４０の板部分で遮断することができる。上方向長さｂについては、結像光学系５０の有効径を上限として大きく設定することで、鉛直方向の立体角を大きくすることができる。

【0040】

また、図３に示すように、試料セル１０の周囲には、試料セル１０から検出器７０に至る検出光学系３０がセル中心軸Ｓから等間隔ｄで複数配されている。光散乱検出装置１が試料セル１０の周囲に等間隔ｄで複数の検出光学系３０を備える場合に、スリット４１の下方長さａと上方長さｂとの長さ比は、試料セル１０に対する各検出器７０の配置角度に応じて、ａ≦ｂの条件下で調整される。すなわち、セル界面での反射光ＲＬの影響が少ない散乱角θ２＝９０度に配置した検出光学系３１では、ａを大きく設定し、ｂに近づけることで、鉛直方向の立体角を最適化することができる。

【0041】

〔光線追跡シミュレーション〕
上記実施形態の作用効果を確認すべく、光線追跡シミュレーションを実施した。図４は、光線追跡シミュレーションにおける配置および部材寸法を説明するための側面図である。図５は、検出器（ＰＤ）をθ=１５度に配置した場合における光線追跡シミュレーションの結果を説明するための平面図、図６はその側面図である。

【0042】

図４に示すように、試料セル１０は、例えば、内径が１．６ｍｍで、外径が８．０ｍｍの透明な円筒体状のセルである。試料セル１０の中心軸Ｓから４７ｍｍの位置には、結像レンズ（平凸レンズ）が配置されている。結像レンズは、例えば、凸径がφ１２．７ｍｍで、焦点距離が３８ｍｍに形成されている。試料セル１０の中心軸Ｓから１４０ｍｍの位置には、アパーチャ板６０および２．４ｍｍのＰＤが配置されている。スリット板４０のスリット４１は、例えば、水平方向（ＸＹ方向）幅が３ｍｍで、鉛直方向（Ｚ方向）長さ８．５ｍｍの開口として形成されている。スリット４１の鉛直方向開口については、例えば、結像光学系５０の中心軸５０Ｓを含むＸＹ平面からの下方長さａが－Ｚ方向に２．５ｍｍで、上方向長さｂが＋Ｚ方向に６．０ｍｍに設定されている。

【0043】

図５および図６に示すように、下方長さａと上方長さｂとの関係をａ＜ｂに設定することにより、試料セル１０のセル界面で生じた反射光ＲＬがスリット板４０の板部分により遮断されて検出器７０に到達しないため、精度良い測定が可能である。

【0044】

また、セル界面での反射光ＲＬによる迷光は、検出器７０の配置角度θに依存する。θが小さい場合には、セル界面での反射光ＲＬの影響が大きいため、ａは短くする必要があるが、θが９０度に近い場合にはセル界面での反射光ＲＬは殆ど生じない。検出器７０の配置角度に応じて、ａ≦ｂの条件の下でスリット４１を最適化することで、迷光の低減とＳ／Ｎ比の向上を実現することができる。

【0045】

以上説明したように、本実施形態の光散乱検出装置１によれば、入射光のチルト角度αを大きく設定することなく、結像光学系５０の入射側に配置したスリット板４０のスリット４１の鉛直方向の立体角を大きく設定することができ、高いＳ／Ｎ比で検出精度よく測定することができる光散乱検出装置を提供することができる。

【0046】

上記の実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。実施形態が備える各要素並びにその配置、材料、条件、形状及びサイズ等は、例示したものに限定されるわけではなく適宜変更することができる。また、異なる実施形態で示した構成同士を部分的に置換し又は組み合わせることが可能である。

【符号の説明】

【0047】

１…光散乱検出装置
１０…試料セル
２０…光源
３０…検出光学系
４０…スリット板
４１…スリット
４１Ｓ…スリットの中心軸
５０…結像光学系
５１Ｓ…結像光学系の中心軸
７０…検出器

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】