特許 7078227 概日リズム変調及びそれに起因する症状の予防又は改善用の内服剤並びに飲食品組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-23

(45)【発行日】2022-05-31

(54)【発明の名称】概日リズム変調及びそれに起因する症状の予防又は改善用の内服剤並びに飲食品組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/352 20060101AFI20220524BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220524BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20220524BHJP

   A23L 33/105 20160101ALN20220524BHJP

【ＦＩ】

A61K31/352

A61P25/00

A61P25/20

A23L33/105

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2018153937

(22)【出願日】2018-08-20

(65)【公開番号】P2020029407

(43)【公開日】2020-02-27

【審査請求日】2021-03-31

(73)【特許権者】

【識別番号】591046892

【氏名又は名称】富士産業株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】899000068

【氏名又は名称】学校法人早稲田大学

(74)【代理人】

【識別番号】240000327

【弁護士】

【氏名又は名称】弁護士法人クレオ国際法律特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】草野 崇一

(72)【発明者】

【氏名】柴田 重信

【審査官】松本 淳

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１０／１４０４０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００８－２６６３１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】HE, B. et al，The Small Molecule Nobiletin Targets the Molecular Oscillator to Enhance Circadian Rhythms and Protect against Metabolic Syndrome，Cell Metabolism，2016年，Vol.23，pp.610-621

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用内服剤。

【請求項2】

４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用飲食品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、概日リズム変調及びそれに起因する代謝異常や症状を改善する内服剤並びに飲食品組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

我々の体の細胞のほとんどは約24時間周期の体内時計（概日リズム）を有しており、さまざまな生理機能に昼・夜の情報を与えることで、生体の恒常性維持に役立っている。ヒトでは、睡眠や覚醒、血圧や体温の調節、ホルモン分泌などが体内時計によって制御されている。体内時計は、脳の視交叉上核と呼ばれる部分に主時計が存在し、大脳皮質や海馬などには脳時計が存在する。また、心臓、肝臓、腸、肺、骨格筋などには末梢時計が存在する。しかしながら、これら体内時計の乱れは肥満、糖尿病などの代謝障害や、睡眠障害、うつ病、免疫・アレルギー疾患、さらにはがんの発症にもつながることが知られている。

【0003】

一方において、現代社会においては、海外旅行による時差ぼけをはじめ、慢性的睡眠時間の不足、効率重視のシフト勤務や昼夜交代勤務、夜型生活などによる社会的時差ぼけが大衆化し、体内時計の乱れを伴う上記のような代謝異常や作業効率低下が社会問題となっている。さらには、高齢者においては体内時計が前倒しになり、調節機能も衰えているため、過度の早寝早起きや浅い睡眠によって睡眠障害が生じ、日常生活にも支障をもたらしている。加えて、血圧、体温、ホルモン分泌などの生体リズムにも障害が生じて、治療が必要となっている例も多い。

【0004】

体内時計は、時計遺伝子（Bmall、Clock、Periodなど）と呼ばれる遺伝子群によって制御されている。これまでに時計遺伝子に影響を及ぼす成分やエキス類として、黒生姜を含有する時計遺伝子発現促進用組成物（例えば特許文献1参照）や、プロゲステロンおよびその誘導体を含む概日リズム障害治療薬（例えば特許文献2参照）、あるいはまた、パッションフラワーエキスによる時計遺伝子発現の増大効果（例えば非特許文献1参照）や、プロシアニジンによる時計遺伝子発現調節作用（例えば非特許文献2参照）などが報告されている。

【0005】

しかしながら、実際に上記のような概日リズム変調に対して症状を改善するために有効的に利用されている例はほとんど知られておらず、概日リズム変調に起因するさまざまな障害・疾患を制御することのできる薬剤や食品成分の開発が期待されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開2016-210703号公報

【文献】特開2010-77081号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】Toda, K., et al., Int. J. Biomed. Sci., 13(2) :84-92 (2017).

【文献】Ribas-Latre, A., et al., Mol. Nutr. Food Res., 59(5) :865-878 (2015).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、上記課題を解決し、食経験が豊富で副作用の心配のない食品成分を有効成分として含有することにより、概日リズム変調及びそれに起因する代謝異常や症状に対して優れた予防又は改善効果を有する内服剤および飲食品組成物を開発することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

ポリメトキシフラボノイドであるノビレチンは、カンキツ特有のフラボノイドであるが、近年、がん予防、老化抑制、抗動脈硬化作用等さまざまな生理作用が知られるようになってきた。

【0010】

本発明者らは、ノビレチンを多く含有するカンキツ類の果皮を用い、特定種類の麹菌で発酵することにより、主成分のノビレチンが４’－デメチルノビレチンに変換することを明らかにした。また、本発明者らは、４’－デメチルノビレチンが、優れた記憶改善作用を有することも見出した（特許第5667561号公報参照）。

【0011】

本発明者らは、さらに４’－デメチルノビレチンの機能性について検討を重ねた結果、細胞レベルでは体内時計周期延長作用を有することを認めた。また、概日リズム変調を起こすモデル系として、末梢時計のリズム低下や位相後退を特徴とする高脂肪食摂取動物モデル系を用いて検討した結果、高脂肪食摂取群は活動量の低下が認められた。一方、４’－デメチルノビレチン摂取群は低下した活動量がもとに戻ることを認め、その有効性が明らかとなった。これらの知見に基づき、本発明は完成されるに至った。

【0012】

即ち、本発明に係る概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用内服剤は、４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有することを特徴とする。
本発明に係る概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用飲食品組成物は、４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有することを特徴とする。

【発明の効果】

【0013】

本発明は、４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有することにより、概日リズム変調及びそれに起因する代謝異常や症状に対して優れた予防又は改善効果を有する内服剤および飲食品組成物を提供することを可能とする。

【0014】

また、４’－デメチルノビレチンはカンキツ果皮成分のノビレチンから麹菌発酵法により変換して得ることができるため、本発明の内服剤及び飲食品組成物は食経験が豊富で副作用の心配がない。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】MEF細胞における４’－デメチルノビレチンの体内時計周期延長作用を示す図である。図１中、各マーカーは上から順に、コントロール（蒸留水添加）、ノビレチン50μM、100μM添加、４’－デメチルノビレチン50μM、100μM添加、の結果を示す。＊＊＊＊は、p＜0.0001でコントロールに対し有意差があることを示し、バーは標準偏差を示す。横軸は周期（hr）を示す。

【図2】概日リズム変調モデルマウスの活動リズムパターンを示す図である。図２において、実線は普通食群、点線は高脂肪食群、の活動リズムを示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示し、横軸は1日を24分割したゾーンタイム（ZT0～23）を示す。バーは標準偏差を示す。

【図3】概日リズム変調モデルマウスの活動量を示す図である。図３において、棒グラフは1日の明期と暗期における活動量を示し、左の棒グラフは普通食群、右の棒グラフは高脂肪食群、をそれぞれ示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示す。バーは標準偏差を示す。

【図4】４’－デメチルノビレチン群の活動リズムパターンを示す図である。図４において、実線は対照群（control、無添加）、点線はノビレチン群、一点破線は４’－デメチルノビレチン群、の活動リズムを示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示し、横軸は1日を24分割したゾーンタイム（ZT0～23）を示す。バーは標準偏差を示す。

【図5】４’－デメチルノビレチン群の活動量を示す図である。図５において、棒グラフは1日の明期と暗期における活動量を示し、左の棒グラフは対照群（control、無添加）、真ん中の棒グラフはノビレチン群、右の棒グラフは４’－デメチルノビレチン群、をそれぞれ示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示す。バーは標準偏差を示す。なお、＊は、p＜0.05で４’－デメチルノビレチン群（合計）が対照群（合計）に対して有意差があることを示し、＊＊は、p＜0.01で４’－デメチルノビレチン群（暗期）が対照群（暗期）に対して有意差があることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の実施形態は、４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用内服剤に関する。
本発明のもう一つの実施形態は、４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用飲食品組成物に関する。

【0017】

〔４’－デメチルノビレチン〕
４’－デメチルノビレチン（式１）は市販されていないが、合成品を用いることができる。あるいは、先に報告した特許第5667561号公報に記載の方法により、ノビレチンを含有するカンキツ類、特に果皮を用いた麹菌発酵により得られた４’－デメチルノビレチン純品（単離物）または４’－デメチルノビレチン含有組成物を用いることができる。合成品よりも、麹菌発酵によるノビレチンの生物変換を利用する特許第5667561号公報に記載の方法の方が簡便なため、好適である。

【0018】

【化1】

【0019】

４’－デメチルノビレチンは、ノビレチンが体内で吸収された後にできる代謝産物の一つでもある。カンキツ果皮はマーマレード、砂糖煮などのお菓子の原料として利用され、また、ノビレチン含量の高いマンダリンオレンジ（Citrus reticulata）はチンピとして長年の食経験があるため、４’－デメチルノビレチンおよびその含有組成物は、副作用の心配がなく、安心して経口摂取することができる。

【0020】

特許第5667561号公報に記載された方法に準じた、４’－デメチルノビレチンおよびその含有組成物の製造方法について、以下に説明する。
当該製造方法は、下記の発酵原料を麹菌発酵させる工程からなる。

【0021】

〔発酵原料〕
麹菌発酵の原料は、ポリメトキシフラボノイドであるノビレチンを含有するカンキツ類の‘果実’（果皮、果汁、果肉、種子などを含む果実全体）であるが、特には、ノビレチンの含有率、廃棄物の有効利用の観点から、‘果皮’を用いることが望ましい。

【0022】

また、カンキツ類の種類としては、ノビレチンを含有するカンキツ類であれば、如何なる品種、系統のもの（例えば、ポンカン、シークワーシャ、タンジェリン、タチバナなど）も用いることもできる。

【0023】

なお、発酵原料としては、カンキツ類の植物体の他の部分（例えば、葉、芽、茎、花、など）を含むものを用いてもよいが、ノビレチンの含有率の点でこれらを含まないものであることが望ましい。

【0024】

上記カンキツ類は、好ましくは、収穫・採取した生のもの、水洗いしたもの、を用いることが望ましいが、乾燥、凍結、長期保存したものなどであっても用いることができる。
また、カンキツ類はそのままの形態で用いてもよいが、刻むか、砕片化するか、擂潰するかのいずれかの破砕処理を行うことが望ましい。

【0025】

当該破砕処理は、カンキツ類をいくつかの破片に大きめに刻むこと、細かい小片に細断すること、破砕すること、擂り潰すこと、粉末状にすること、等、幅広い行為を含むものである。好ましくは、１～数ｃｍ程度に大きめに刻んだ状態にすることによって、行うことができる。

【0026】

またさらには、これら発酵原料から、予めノビレチンを抽出して得た抽出物（エキス、乾燥物）や、純品のノビレチンとして単離したものを用いることもできる。
なお、これら発酵原料は、後記の麹菌発酵を行う前に、加熱処理を行って、原料中の雑菌を殺菌しておくことが好ましい。

【0027】

〔麹菌発酵工程〕
前記発酵原料を発酵させる麹菌としては、例えばアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii)、リゾプス属糸状菌（別名クモノスカビ）、などを用いることができる。また、これらを混合させて用いてもよい。

【0028】

前記麹菌のうち好ましくは、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、を用いると、４’－デメチルノビレチンを高い含有率で得ることができる。

【0029】

発酵原料へ前記麹菌を接種する方法としては、麹菌の胞子を発酵原料に直接振りかけて付着させることができる。また、予め前記麹菌を液体培養により予備発酵した培地を、発酵原料全体に行き渡るように接種してもよい。

【0030】

前記麹菌を発酵原料に接種する場合の微生物発酵条件としては、好気的条件で行うことが望ましいことから、例えば有底円筒状の底部が広く深さが浅い容器が好適である。
このような容器の底部に、発酵原料を万遍なく広げ、空気との接触面積が大きくなるようにするとよい。

【0031】

発酵温度としては、前記麹菌の生育に好適な条件として、好ましくは１０～４０℃、より好ましくは２０～４０℃、さらに好ましくは２５～３２℃で行われる。加えて、前記麹菌の生育に好適な条件として、暗所で発酵させるのが好ましい。また、原料中に十分な水分が含まれている状態であることが好ましい。

【0032】

４’－デメチルノビレチンを多量に得るための微生物発酵の発酵期間としては、１～１４日間とすることができ、好ましくは２～１４日間、より好ましくは２～１０日間、さらに好ましくは２～７日間である。
この発酵期間が１日間未満の場合には、前記麹菌による微生物発酵がほとんど進行していないことから十分な４’－デメチルノビレチンが得られない。また、逆に１４日間を超える場合には、微生物変換により生成された４’－デメチルノビレチンの分解が進み、またカンキツ由来の好ましい芳香が消失する。

【0033】

また、当該麹菌発酵においては、麹菌から分泌される酵素によって、ノビレチンがデメチル化され、４’－デメチルノビレチンへと変換させるものである。
従って、麹菌発酵を行う代わりに、当該麹菌もしくは発酵後に得られる発酵物から溶液抽出を行ってノビレチンをデメチル化する酵素を含む酵素液を得、当該酵素を用いて前記原料と酵素反応を行って反応物を得ることで、４’－デメチルノビレチンを得ることも可能である。
具体的には、当該麹菌発酵後の発酵物からの水溶解物を回収し、粗酵素液として用いることで、酵素反応を行うことができる。

【0034】

上記の麹菌発酵を行うことによって、前記カンキツ原料に含有されるポリメトキシフラボノイドであるノビレチンは、すべて４’－デメチルノビレチンに変換される。
具体的には、前記カンキツ原料を麹菌発酵することによって、４’－デメチルノビレチンが乾燥質量あたり約０．５～１．５質量％（具体的には、約１質量％）という、高い含有率の麹菌発酵物を得ることができる。
従って、ここで得られた麹菌発酵物を、得られたそのままの形態で、もしくは、加工（例えば、細片化、擂潰、粉末化、乾燥、など）して、本実施形態の内服剤又は飲食品組成物の有効成分として用いることができる。

【0035】

〔溶液抽出工程〕
なお、純度の点を鑑みると、本実施形態の内服剤又は飲食品組成物の製造においては、前記麹菌発酵の後に得られる発酵物から溶液抽出を行って、抽出物を得ることが望ましい。

【0036】

当該溶液抽出工程は、前記麹菌発酵物に対して直接行うこともできるが、前記麹菌発酵物について、さらに細片化、破砕、擂潰、粉末化等のいずれかの処理を行った後に得られたものに対して行うことが望ましい。

【0037】

溶液抽出工程に用いる溶媒は、水、緩衝液、有機溶媒、またはそれらの含水溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノールのような低級脂肪族アルコールや、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等が挙げられる。
これらの溶媒の中でも、水、エタノールあるいは含水エタノールが抽出効率や取り扱いやすさ、安全性の面で特に好ましい。

【0038】

含水エタノールを用いる場合には、終濃度２０％（v/v）以上の含水エタノールを用いて抽出を行うことで、４’－デメチルノビレチンの抽出効率を向上できるため好ましい。

【0039】

抽出条件としては、前記原料（好ましくは砕片化物）に対して、前記溶媒を、１～２０倍量、好ましくは２～１０倍量（いずれも質量比）加え、０℃～溶媒の沸点の温度条件、好ましくは室温～溶媒の沸点以下の温度で、５分間～１ヶ月間、好ましくは２０分間～１週間、浸漬もしくは振盪することにより、抽出することが可能である。

【0040】

得られた抽出液は、凍結乾燥やエバポレーター等を用いて乾燥させることで、濃縮乾固物とすることができる。
また、溶液抽出工程は、異なる複数の溶媒で、複数回行うこともできる。

【0041】

上記により得られた抽出物（前記抽出液や濃縮乾固物）は、老齢化による早期覚醒や中途覚醒あるいは夜型生活・シフト勤務などの社会的時差ぼけによる概日リズム変調、及びこれに起因する代謝異常などの諸症状に対して優れた予防又は改善作用を有するため、そのまま本実施形態の内服剤又は飲食品組成物の有効成分として用いることができる。

【0042】

〔精製工程〕
また、上記抽出物に対して、精製工程を行うことによって、４’－デメチルノビレチン含有量をさらに高めることができる。
精製工程としては、液－液分離抽出や、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、活性炭、合成吸着樹脂担体等によるカラム精製により、高含有組成物を得ることができる。以下に好適な精製条件の一例を示す。

【0043】

まず、熱水抽出により得られた抽出液を、水で平衡化した多孔性合成吸着樹脂（具体的には、ダイヤイオンHP20（三菱化学社製））のカラムに供した後、水で非吸着成分を除き、さらに３７～３９％（v/v）エタノール（具体的には３８％（v/v）エタノール）で溶出される液を除去する。
次に、４０～４２％（v/v）エタノール（具体的には４１％（v/v）エタノール）で溶出される成分を回収することにより、４’－デメチルノビレチンを選択的に分離し、４’－デメチルノビレチン高含有組成物を得ることができる。
なお、上記に記載した好適な条件で抽出および精製を行うことにより、４’－デメチルノビレチン20％（w/w）以上を高含有する組成物を得ることができる。

【0044】

また、上記のように得られた４’－デメチルノビレチン含有組成物は、さらにＯＤＳカラムクロマトグラフィー（具体的には６０％（v/v）メタノール溶出）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（具体的にはヘキサン／エタノール（７：３））、ＯＤＳ－ＨＰＬＣ（具体的には３３％（v/v）アセトニトリル・水の混合溶媒）に供し、目的ピークを採取することで、４’－デメチルノビレチンの純品を単離することができる。

【0045】

上記により得られる４’－デメチルノビレチンは、４’位が脱メチル化したノビレチンのモノデメチル体である。４’－デメチルノビレチンは脱メチル化により極性が高くなり、ノビレチンに比べてアルコール、水への溶解性に優れる。

【0046】

また、４’－デメチルノビレチンは、概日リズム変調、及びそれに起因する代謝異常などの諸症状に対し、ノビレチンに比べて優れた予防又は改善作用を有する。

【0047】

したがって、４’－デメチルノビレチンは、概日リズム変調およびそれに起因する症状に対する優れた予防又は改善剤として、本実施形態の内服剤又は飲食品組成物に添加することができる。

【0048】

〔内服剤及び飲食品組成物〕
本実施形態は、４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用内服剤に関する。
本実施形態は、４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、概日リズム変調およびそれに起因する症状の予防又は改善用飲食品組成物に関する。

【0049】

上記の４’－デメチルノビレチンは、純品（単離物）や、上記の方法により得られる発酵生成物やその粗精製物（‘溶液抽出物’、‘高含有組成物’など）として各種原料に混合することで、内服剤及び飲食品組成物の有効成分として用いることができる。
ここにおいて、「内服剤」には医薬品、医薬部外品が含まれる。
また、「飲食品組成物」には一般的な飲食品と機能性食品、機能性飲料が含まれる。

【0050】

４’－デメチルノビレチンの有効摂取量としては、体重60kgの成人１日あたり、1mg以上、好ましくは5mg以上経口摂取することにより、老齢化による早期覚醒や中途覚醒あるいは夜型生活・シフト勤務などの社会的時差ぼけによる概日リズム変調、及びそれに起因する症状に対する優れた改善作用を得ることができる。

【0051】

従って、この必要量を確保できる形態や摂取方法（回数、量）で、４’－デメチルノビレチンを摂取することで、上記薬理作用が得られることが期待される。ただし、対象の年齢、体重、症状、摂取スケジュール、製剤形態などにより、摂取量を適宜決定することが望ましい。

【0052】

また、内服剤の形態としては、例えば、粉末状、細粒状、顆粒状、などとすることができ、カプセルに充填する形態の他、水に分散した溶液の形態、クリーム状、賦形剤等と混和して得られる錠剤の形態とすることもできる。

【0053】

本実施形態の内服剤には、４’－デメチルノビレチンまたはその含有組成物以外にも、本発明の効果を奏する範囲内で、薬理学的に許容され得る各種担体や添加剤、他の薬効成分などが含まれていても良い。

【0054】

また、飲食品組成物の形態としては、種々の食品原料や添加剤などと混合して、例えば、ビスケット、スナック菓子、ガム、チュアブル錠、清涼飲料水、ドリンク、スープ、ゼリー、キャンディ等の形態とすることができる。

【0055】

内服剤及び飲食品組成物における４’－デメチルノビレチンの含有量としては、上記の有効摂取量を担保できるような量であればよいが、具体的には、0.001質量％以上、好ましくは0.01質量％以上、さらに好ましくは0.1質量％以上となるように含有させることができる。また、上限としては、20質量％以下を挙げることができる。

【実施例】

【0056】

以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。

【0057】

＜実施例１＞ ４’－デメチルノビレチン含有組成物の調製
特許第5667561号公報に記載の方法に準じて、ポンカン果皮を麹菌発酵することによりノビレチン変換物４’－デメチルノビレチン含有組成物を調製した。

【0058】

すなわち、ポンカン果皮50ｋｇを刻んで細片化し、蒸煮処理により滅菌処理を行った。得られたポンカン果皮に、全体に行き渡るようにアスペルギルス・アワモリ（（株）ビオック製）を接種した。そして、30℃の恒温室内にて発酵処理（麹菌発酵）を好気的に5日間行うことで、麹菌発酵物を得た。

【0059】

得られた麹菌発酵物30kgに対して水180Lを添加し、100℃において1時間熱水抽出した後、連続遠心によりエキスを得た。当該エキスを、あらかじめ水で平衡化したダイヤイオンHP20（多孔性合成吸着樹脂カラム）に供し、10Lの水で非吸着成分を除いた後、さらに10Lの38％（v/v）エタノールで溶出する成分を除いた。次いで、10Lの41％（v/v）エタノールで溶出する成分を回収した。当該回収物をロータリーエバポレーターで濃縮乾固することにより、４’－デメチルノビレチン含有組成物（４’－デメチルノビレチン含有量23％）を得た。

【0060】

＜実施例２＞ ４’－デメチルノビレチン純品の調製
上記実施例１で得られた４’－デメチルノビレチン含有組成物1.5ｇを20％（v/v）メタノールに溶解し、ODSカラムクロマトグラフィー（内径20mmφ、長さ30cmのカラムに和光ゲル50C18を30ｇ詰めた）に供した。40％（v/v）メタノールで溶出する成分を除去し、60％（v/v）メタノールで溶出する成分を得た。

【0061】

次いで、得られた成分について、展開溶媒ヘキサン／エタノール7：3の条件で分取TLCクロマトグラフィー（シリカゲル70PF₂₅₄プレートワコー、膜厚0.75ｍｍ、和光純薬製）を行い、４’－デメチルノビレチンを含む画分を、UVランプを用いて確認しながら採取した。

【0062】

そして、得られた画分を、分取HPLCカラム（TSK GEL ODS、東ソー社製、4.6mm×25cm）に供し、33％（v/v）アセトニトリルの移動層によって、純品の４’－デメチルノビレチン25mgを得た。

【0063】

＜試験例１＞ ４’－デメチルノビレチンの体内時計周期に対する影響評価
実施例２で得られた４’－デメチルノビレチン単離物を用い、体内時計周期への影響を調べた。

【0064】

細胞はPER2::ルシフェラーゼノックインマウス由来の胚性線維芽細胞（MEF）を用いた。当該マウスは、体内時計遺伝子群の一つであるPer2遺伝子下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入されているため、Per2遺伝子の発現リズムをルシフェリン－ルシフェラーゼ反応による発光リズムで追うことが可能である（Narishige S.ら、Br J Pharmacol.、2014年12月、171巻、24号、5858～5869ページ 参照）。

【0065】

MEF細胞は、5％CO₂存在下、37℃のインキュベータ中（暗黒条件下）で、10％牛胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地（和光純薬製）にて培養し、3日～4日毎に継代を行った。

【0066】

MEF細胞を35-mmディッシュに播種（6×10⁴cell/dish）し、ルシフェリンと共に被検物を添加した。
被検物は滅菌水添加を対照とし、比較対照としてノビレチンを用い、終濃度50μM、100μMとなるよう添加した。４’－デメチルノビレチンは、同様に終濃度50μM、100μMとなるよう添加した。

【0067】

被検物の添加後、体内時計周期の測定を連続１週間行った。
体内時計周期の測定は、微量な発光量を測定することができるルミサイクル（ActiMetrics社）を用いて、PER2::ルシフェラーゼ複合タンパクとルシフェリンが結合することで生じる発光推移を測定することで、Per2遺伝子の発現リズムを発光リズムとして測定できる実験系を用いて行った。

【0068】

体内時計周期に対する作用の解析は、次のようにして行った。
まず、ルミサイクルによる計測データから24時間分の移動平均値を引くディトレンド処理を行い、その後2時間分の移動平均値で平滑化する平滑化処理を行った。次に、得られた波形データの発光値のpeak値を算出した。体内時計周期は、Peak1からPeak3までの２周期に要する時間の平均値として算出した。

【0069】

体内時計周期に対する効果についての解析結果を図１に示す。
図１は、MEF細胞における体内時計周期（２周期平均）の測定結果を示す図である。図１中、各マーカーは上から順に、コントロール（蒸留水添加）、ノビレチン50μM、100μM添加、４’－デメチルノビレチン50μM、100μM添加、の結果を示す。＊＊＊＊は、p＜0.0001でコントロールに対し有意差があることを示し、バーは標準偏差を示す。横軸は周期（hr）を示す。

【0070】

その結果、４’－デメチルノビレチン50μMおよび100μM添加区においては、コントロールの23.5時間に対して、各々、28.6時間、30.4時間へと体内時計周期が顕著に増大した。
一方、比較対照であるノビレチンについては、50μM、100μM添加区共にコントロールとの違いはほとんど示されなかった。
このことから、４’－デメチルノビレチンには細胞レベル（暗黒条件下）では強い体内時計周期延長作用があることが明らかとなった。

【0071】

なお、細胞レベルで体内時計周期延長作用を持つ成分が、動物レベルでは摂取するタイミングでその作用が異なるケースがあることは、よく知られている。
例えば、カフェインの場合、細胞に投与すると体内時計周期延長作用を示すが、ヒトでは摂取させるタイミングによって体内時計周期に対する作用が異なる（科研費ニュース 2016年度、Vol.1、p.19、[online]、平成30年8月16日検索、インターネット（URL:http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/22_letter/data/news_2016_vol1/p19.pdf）参照）。

【0072】

これは、細胞（in vitro）における体内時計周期の測定が、本試験例のように暗黒条件下で行われるのに対して、ヒトや動物（in vivo）の場合には明期・暗期が存在するため、それが体内時計周期にも影響しているものと考えられる。

【0073】

したがって、本試験例では４’－デメチルノビレチンによる体内時計周期に対する強い延長作用が認められたが、ヒトや動物に摂取させた場合には、これとは異なる結果になる可能性もある。少なくとも本試験例では、４’－デメチルノビレチンが体内時計周期に対して何らかの作用を有することが示された。

【0074】

＜試験例２＞ ４’－デメチルノビレチンの概日リズム変調モデルマウスでの評価
次に、実施例１で調製した４’－デメチルノビレチン含有組成物の概日リズム変調改善作用について検討した。

【0075】

概日リズム変調のモデル系として、C57BL/6Jマウスに2週間以上高脂肪食（脂肪分45％含有）のみを給餌したことにより、概日リズム変調に典型的な症状である末梢時計のリズム低下（活動量の低下を引き起こす）や位相後退（活動リズムの後方向へのずれ）を示す高脂肪食摂取動物モデルマウス（概日リズム変調モデルマウス）を用いて、活動量の面から検討を行った。

【0076】

高脂肪食摂取により哺乳類動物の概日リズムに変調が生じることは既に報告されている（Kohsaka, A., et al., Cell Metabolism (2007) Vol.6, p.414-421.参照）。
なお、本試験例で用いた概日リズム変調モデルマウスにおいては、in vivo imaging法（Tahara, Y., et al., Current Biology (2012) Vol.22, p.1029-1034.参照）によって肝臓の末梢時計のリズム低下と位相後退（Per2遺伝子発現のピーク時刻の遅延）が認められた。

【0077】

概日リズム変調モデルマウスの群分け方法は以下の通りである。対照群、ノビレチン群、４’－デメチルノビレチン群の3群に分けた。ノビレチン群、４’－デメチルノビレチン群には各々、ノビレチン単離物、４’－デメチルノビレチン含有組成物を、高脂肪食（脂肪分45％含有）に対して単離物換算で0.06％混合した餌を給餌した。一方、対照群には高脂肪食のみを給餌した。
なお、概日リズム変調モデルマウスとの比較のため、普通食（脂肪分5％含有）を給餌したこと以外は同条件で飼育したマウスを普通食群とした。

【0078】

マウスは明期12時間・暗期12時間の明暗条件下、餌と水は自由摂食させ、個飼いケージで飼育した。
慣らし期間として全マウスを高脂肪食で1週間飼育した後に、摂食カロリー量や体重が同程度になるように群分けを行い、その後、各餌を給餌した状態で、活動量を測定しながら2週間程度飼育した。

【0079】

活動量の測定は、赤外線センサー（エリアセンサー）を各ケージの上に設置して行った。エリアセンサーのカウント数を活動量として、また各時間帯のカウント数の推移を活動リズムとして評価した。

【0080】

まず、概日リズム変調モデルマウスの特性を評価するため、高脂肪食群（上記「対照群」と同様に、高脂肪食のみを給餌した概日リズム変調モデルマウス）と普通食群の、活動量と活動リズムを比較した。結果を図２、３に示す。

【0081】

図２は、概日リズム変調モデルマウスの活動リズムパターンを示す図である。図２において、実線は普通食群、点線は高脂肪食群、の活動リズムを示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示し、横軸は1日を24分割したゾーンタイム（ZT0～23）を示す。バーは標準偏差を示す。

【0082】

図３は、概日リズム変調モデルマウスの活動量を示す図である。図３において、棒グラフは1日の明期と暗期における活動量を示し、左の棒グラフは普通食群、右の棒グラフは高脂肪食群、をそれぞれ示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示す。バーは標準偏差を示す。

【0083】

その結果、普通食群に比較して、高脂肪食群（概日リズム変調モデルマウス）は、明期、暗期ともに活動量が低下することが分かった（図２、３）。

【0084】

次に、４’－デメチルノビレチン摂取による概日リズム変調モデルマウスの活動量と活動リズムへの影響を検討した。結果を図４、５に示す。

【0085】

図４は、４’－デメチルノビレチン群の活動リズムパターンを示す図である。図４において、実線は対照群（control、無添加）、点線はノビレチン群、一点破線は４’－デメチルノビレチン群、の活動リズムを示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示し、横軸は1日を24分割したゾーンタイム（ZT0～23）を示す。バーは標準偏差を示す。

【0086】

図５は、４’－デメチルノビレチン群の活動量を示す図である。図５において、棒グラフは1日の明期と暗期における活動量を示し、左の棒グラフは対照群（control、無添加）、真ん中の棒グラフはノビレチン群、右の棒グラフは４’－デメチルノビレチン群、をそれぞれ示す。縦軸は1分間当たりのカウント数（counts/minute）を示す。バーは標準偏差を示す。なお、＊は、p＜0.05で４’－デメチルノビレチン群（合計）が対照群（合計）に対して有意差があることを示し、＊＊は、p＜0.01で４’－デメチルノビレチン群（暗期）が対照群（暗期）に対して有意差があることを示す。

【0087】

その結果、ノビレチン群の活動量は対照群の活動量に比べて、明期、暗期ともに変化は示されなかった（図５）。
これに対して、４’－デメチルノビレチン群については、明期の対照群の活動量1.4[counts/minute]と比較して４’－デメチルノビレチン群で3.2[counts/minute]であり、また、暗期の対照群の活動量12.1[counts/minute]と比較して４’－デメチルノビレチン群で17.0[counts/minute]であり、明期、暗期ともに高い活動量を示した（図４、５）。特にマウスの活動が高まる暗期においては有意な活動量の増大が認められ、明期、暗期の合計活動量も４’－デメチルノビレチン群で有意な増大が示された（図５）。
このことは、高脂肪食摂取に伴う概日リズム変調が４’－デメチルノビレチン摂取により改善されたことを示している。

【0088】

なお、データは示していないが、４’－デメチルノビレチン群マウスの肝臓の末梢時計の周期を前述のin vivo imaging法によって測定した結果、高脂肪食群で見られたリズム低下と位相後退が改善され、普通食群に近い状態まで回復していた。

【0089】

本試験例の概日リズム変調マウスは、末梢時計のリズム低下と位相後退を伴うことを特徴とするモデル系である。ヒトの場合、末梢リズムの低下は夜間の高カロリー食や老齢化、また、位相後退は夜間の光照射によってそれぞれ生じるため、パソコンやスマートフォン利用の夜型生活者、あるいはシフトワーカーの工場や病院勤務者によく見られる状態に該当する。
したがって、本試験例の結果から、４’－デメチルノビレチンの摂取により、高齢者や夜型生活者、シフトワーカー等の概日リズム変調を改善し、これに起因する糖、脂質代謝異常や睡眠障害、活力低下、うつ症状等についても軽減することが可能となると期待される。

【0090】

＜処方例１＞ 機能性食品（サプリメント）
以下の質量比で各原料を配合し、常法により200mg錠剤を製造した。本錠剤は２錠／日、４’－デメチルノビレチンとして約5mg／日摂取されるものである。

【0091】

４’－デメチルノビレチン含有組成物（実施例１） 5.5 ％
デキストリン 35.0 ％
結晶セルロース 25.0 ％
乳糖 18.0 ％
乳清カルシウム 14.5 ％
ショ糖エステル 2.0 ％

【0092】

＜処方例２＞ 機能性飲料
以下の質量比で各原料を配合し、常法により100mL／ボトルの機能性飲料を製造した。本飲料は１本／日、４’－デメチルノビレチンとして約5mg／日摂取されるものである。

【0093】

４’－デメチルノビレチン含有組成物（実施例１） 0.022 ％
フルクトース 6.0 ％
リンゴ酸 5.0 ％
香料 0.1 ％
水 88.88 ％

【0094】

＜処方例３＞ 内服剤（医薬品）
以下の質量比で各原料を配合し、常法により100mg錠剤を製造した。本錠剤は１錠／日、４’－デメチルノビレチンとして約10mg／日摂取されるものである。

【0095】

４’－デメチルノビレチン（実施例２） 10.0 ％
結晶セルロース 75.0 ％
乳糖 11.0 ％
無水ケイ酸 2.0 ％
ショ糖エステル 2.0 ％

【産業上の利用可能性】

【0096】

本発明は、食経験が豊富で副作用の心配がない原料である４’－デメチルノビレチンを有効成分原料として含有する内服剤または飲食品組成物を提供する。
したがって、本発明は高齢者の早期覚醒や中途覚醒あるいは夜型生活・シフト勤務などの社会的時差ぼけによる概日リズム変調、並びにこれに起因する代謝異常などの症状に対する優れた改善効果を有する内服剤または飲食品組成物の開発への貢献が期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】