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特許7078533炎症促進性細胞へのマクロファージ分極を改変して癌を治療するための抗ＳＩＲＰａ化合物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-23
(45)【発行日】2022-05-31
(54)【発明の名称】炎症促進性細胞へのマクロファージ分極を改変して癌を治療するための抗ＳＩＲＰａ化合物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20220524BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220524BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220524BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 D
A61K39/395 U
A61K39/395 E
A61K39/395 G
A61K39/395 T
A61P43/00 121
A61P35/00
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2018521040
(86)(22)【出願日】2016-10-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-10-25
(86)【国際出願番号】 EP2016075466
(87)【国際公開番号】W WO2017068164
(87)【国際公開日】2017-04-27
【審査請求日】2019-10-21
(31)【優先権主張番号】15190918.1
(32)【優先日】2015-10-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】518135870
【氏名又は名称】オーエスイー イムノセラピューティクス
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(72)【発明者】
【氏名】ポワリエ，ニコラ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァンノーヴ，ベルナール
(72)【発明者】
【氏名】ゴティエ，ヴァネッサ
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０６３２３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】GAUTTIER, V. et al.，Eur J Cancer，2016年07月，Vol. 61, Suppl. 1，pp. S216-S217
【文献】WEISKOPF, K. et al.，Blood，2014年，Vol. 124, No.21，Abstract No. 2729
【文献】ZHAO, X.W. et al.，Proc Natl Acad Sci U S A，2011年，Vol. 108, No.45，pp. 18342-18347
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬組成物であって、
－ 抗体又は抗原結合部分から成る群より選択される抗ＳＩＲＰａ化合物であって、ＳＩＲＰａの細胞外ドメインと特異的に結合し、ＳＩＲＰａ経路を遮断する抗ＳＩＲＰａ化合物と、
これと併用される、
－ 抗ＰＤＬ１遮断抗体、抗ＰＤ１遮断抗体および抗ＣＴＬＡ－４遮断抗体から成る群より選択される免疫チェックポイント遮断薬あるいは抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体から成る群より選択される第２の治療剤
とを含み、
ＳＩＲＰａ陽性急性骨髄白血病を除く癌の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項2】
前記抗ＳＩＲＰａ化合物は、腫瘍内の炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記抗ＳＩＲＰａ化合物は、Ｍ１型マクロファージによるマーカーＣＤ８６及びＣＣＲ７の少なくとも一つの発現を増加させ、また／あるいは、前記Ｍ１型マクロファージによるＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ１２ｐ４０及びＩＬ１２から成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインの分泌を増加させることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記Ｍ１型マクロファージは、ＩＬ－１２ｐ４０と、ＣＤ８６及びＣＣＲ７から選択される少なく一つのマーカー、及び／または、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＣＣＬ－２から成る群から選択される少なくとも一つのサイトカインとを発現することを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記癌は固形癌であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記癌は肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸癌、胸腺腫、神経膠腫、黒色腫、白血病及び骨髄増殖性疾患、特に肝細胞癌又は黒色腫から成る群より選択されることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記第２の治療剤は、抗ＰＤ１遮断抗体及び抗ＰＤＬ１遮断抗体から成る群より選択される免疫チェックポイント遮断薬であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記第２の治療剤は、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、炎症促進性環境を誘導するためにＭ２型マクロファージ分極を阻害する方法を提供し、結果として癌、感染症、ワクチン接種、外傷及び慢性炎症性疾患における免疫応答を適切なものにする。
【0002】
本発明は特に、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能な抗ＳＩＲＰａ化合物の使用に関する。好ましい実施形態では、このような化合物を使用して癌を治療する。興味深いことに、本発明は免疫系を含む間接的な経路を介して癌の治療を可能にする。
【背景技術】
【0003】
非制御下の細胞増殖に起因する癌は様々な疾患群を形成する。外科手術及び放射線療法は全ての癌、特に転移期を治療できる訳ではない。より効果的な治療は、患者の全器官に到達することが求められる：これは腫瘍細胞の死滅を誘導することが可能な現代の化学療法の場合である。しかし、薬物の細胞毒性効果が依然として化学療法の大きな障害となっている。
【0004】
分子生物学や遺伝学の登場により、癌細胞発生につながる機序及び「標的療法」が理解できるようになってきた。これらの治療は化学療法と組み合わせて、健康な細胞は避けて腫瘍細胞を攻撃する。しかし、これらの療法は患者の平均余命を有意に延長するが、依然として治癒をもたらすものではない。今日では、ヒト腫瘍細胞が治療に耐性となり、免疫系による監視を逃れるようにうまく確立されている。従って、併用療法は患者を治癒するために不可欠であるが、副作用の問題が増えるという欠点がある。
【0005】
癌免疫療法の分野で行われた初期の研究は、免疫系のエフェクター細胞を「ブースト」し、それら細胞を腫瘍に対してより攻撃的にすることを目的としていた。この戦略は実際、ある程度成功している。
【0006】
癌治療に革命をもたらす新世代の免疫療法分子は、これら細胞の抑制機構を遮断し、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）がその作用を発揮できるようにする。これは「阻害物質を阻害する」という概念である。抗ＣＴＬＡ‐４抗体（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））は、転移性形態の悪性黒色腫を治療するための最初の分子であり、患者の６～１０ヶ月の平均生存期間を延長し、患者の４分の１は２年後にまだ生存している。残念ながら、これらの結果そのものは目を見張るものではあるが、依然としてほとんどの患者を治癒させるものではない。
【0007】
本発明は、「阻害物質を阻害する」アプローチに依拠し、免疫療法において有用な新規の方法を提供する。より具体的には、本発明は、炎症促進性環境を誘発するためにマクロファージ分極を改変する方法に関する。この方法は、Ｍ２型マクロファージが提供する抗炎症シグナルを阻害し、Ｍ１型マクロファージが提供する炎症促進性シグナルに有利に働くように、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージを阻害しないことが可能な抗ＳＩＲＰａ化合物の使用にある。このアプローチにより、特に癌細胞を除去する際、Ｔエフェクター細胞の作用に有利な炎症環境を再構築することが可能になる。
【0008】
マクロファージの可塑性及び分極
マクロファージは造血系の中で可塑性が最も高い細胞である。マクロファージは自然免疫（貪食作用許容能）及び適応免疫（細胞分極）の両方に関与するが、個体発生、恒常性及び組織修復にも関与する（非特許文献１；非特許文献２）。マクロファージは全組織に存在する。マクロファージは広範な表現型多様性及び機能的多様性を有する。個体発生中、マクロファージ細胞はまた、多様な起源を示し、これは成人期まで持続する。
組織において、単球‐マクロファージは環境刺激物質（微生物感染、細胞損傷、リンパ球活性化からの生成物）に反応し、個別の表現型を獲得する。以前から、これらの細胞は炎症状態に関連して二元的な様式でそれらの機能に従って分類されている。
マクロファージは造血系の中で可塑性が最も高い細胞である。マクロファージは自然免疫（貪食作用許容能）及び適応免疫（細胞分極）の両方に関与するが、個体発生、恒常性及び組織修復にも関与する（非特許文献１；非特許文献２）。マクロファージは全組織に存在する。マクロファージは広範な表現型多様性及び機能的多様性を有する。個体発生中、マクロファージ細胞はまた、多様な起源を示し、これは成人期まで持続する。
組織において、単球‐マクロファージは環境刺激物質（微生物感染、細胞損傷、リンパ球活性化からの生成物）に反応し、個別の表現型を獲得する。以前から、これらの細胞は炎症状態に関連して二元的な様式でそれらの機能に従って分類されている。
【0009】
受け取った刺激物質、単球‐マクロファージに応じて、これらはトランスクリプトームを再プログラミングし、個別の機能的スペクトル及び表現型スペクトルが得られる。
マクロファージは、２つの亜集団又は分極（又は活性化）状態：従来的な活性化表現型Ｍ１及び代替的な活性化表現型Ｍ２：に簡略的に分類される（非特許文献３）。Ｍ１分類は、インビトロでＩＦＮｇ因子単独での使用、又はＬＰＳなどの微生物因子もしくはＴＮＦ‐α及びＧＭ‐ＣＳＦなどの炎症性サイトカインとの併用と関連付ける。分極Ｍ２はむしろＩＬ４又はＩＬ１３と関連している（非特許文献４）。他のサイトカインはまた、炎症において役割を担うＡｒｇ１（アルギナーゼ１）、ＣＣＬ２４又はＣＣＬ１７の過剰発現を誘導するＩＬ３３などのＭ２型分極を誘導するものとして同定される。ＩＬ２１、及びより一般的にはＣＳＦ１は、マクロファージの分極において主要な役割を担う。マクロファージはまた、Ｍ２の一般的な特徴を共有する「Ｍ２様」状態を獲得し得る。実際、ＬＰＳ、ＩＬ‐１、グルココルチコイド、ＴＧＦベータ、Ｗｎｔ５ａ及びＩＬ１０に関連する免疫複合体などの多数の刺激物質は、「Ｍ２様」型の機能的表現型をもたらす。
マクロファージは、２つの亜集団又は分極（又は活性化）状態：従来的な活性化表現型Ｍ１及び代替的な活性化表現型Ｍ２：に簡略的に分類される（非特許文献３）。Ｍ１分類は、インビトロでＩＦＮｇ因子単独での使用、又はＬＰＳなどの微生物因子もしくはＴＮＦ‐α及びＧＭ‐ＣＳＦなどの炎症性サイトカインとの併用と関連付ける。分極Ｍ２はむしろＩＬ４又はＩＬ１３と関連している（非特許文献４）。他のサイトカインはまた、炎症において役割を担うＡｒｇ１（アルギナーゼ１）、ＣＣＬ２４又はＣＣＬ１７の過剰発現を誘導するＩＬ３３などのＭ２型分極を誘導するものとして同定される。ＩＬ２１、及びより一般的にはＣＳＦ１は、マクロファージの分極において主要な役割を担う。マクロファージはまた、Ｍ２の一般的な特徴を共有する「Ｍ２様」状態を獲得し得る。実際、ＬＰＳ、ＩＬ‐１、グルココルチコイド、ＴＧＦベータ、Ｗｎｔ５ａ及びＩＬ１０に関連する免疫複合体などの多数の刺激物質は、「Ｍ２様」型の機能的表現型をもたらす。
【0010】
同様に、インビボ研究により、Ｍ１、Ｍ２及びＭ２様マクロファージの存在が分かってきた。これらのサブタイプは、環境複合体系に統合されなければならない一連の機能状態の極端なタイプのみを表す。
【0011】
一般に、Ｍ１マクロファージはＩＬ１２ｈｉｇｈ、ＩＬ２３ｈｉｇｈ及びＩＬ１０ｌｏｗ表現型を呈し、反応性酸素種（ＲＯＳ）、酸化窒素（ＮＯ）の中間体、及び炎症性サイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６）などの分子エフェクターを生成する。Ｍ１マクロファージはＴｈ１応答に関与し、細胞内寄生生物に対する耐性の役割を担い、腫瘍細胞を排除する重要なエフェクターである。対照的に、Ｍ２マクロファージはＩＬ１２ｌｏｗ、ＩＬ‐２３ｌｏｗ及びＩＬ１０ｈｉｇｈ表現型を有し、環境中に存在する刺激物質に応じて炎症性サイトカインの産生は多様である。Ｍ２細胞は、その表面にスカベンジャー、マンノース及びガラクトース型受容体が強く発現する。アルギニンの代謝はオルニチン及びポリアミン代謝に変わる。Ｍ２マクロファージは一般に、Ｔｈ２型応答、寄生生物除去、炎症の低減、組織修復促進、血管新生、腫瘍増殖及び免疫調節に関連する。
【0012】
Ｍ１及びＭ２はケモカインの個別の発現プロファイルも有する。Ｍ１マクロファージは、Ｔｈ１を誘引することが知られているＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０ケモカインを発現し、Ｍ２マクロファージはＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４を発現する。ＣＣＬ２及びＣＸＣＬ４などのケモカインはマクロファージをＭ２様表現型に分極させることも可能である。
【0013】
それらの分極状態に依存して、これらマクロファージは鉄、葉酸及びグルコース代謝の点で異なる特徴を有する。例えば、Ｍ１は、フェリチンなどの鉄貯蔵に関与するタンパク質を大量に発現するが、細胞外培地への鉄輸送に関与するフェロポーチンは微弱にしか発現しない。逆に、Ｍ２マクロファージはフェリチンを低レベルに発現するが、フェロポーチンを高レベルに発現する。この差異は、いくつかの研究で観察されているように、Ｍ１の静菌効果（感染に対する防御）、及び腫瘍増殖も促進するＭ２マクロファージによる組織修復促進効果などの機能的結果をもたらし得る。これらの分極性に従ったマクロファージによる鉄の管理は、個体の状態に応じてマクロファージの分極を制御することの重要性を強調する重要な要素である。
【0014】
同様に、マクロファージは正常状態又は病的状態下で組織内の酸素勾配に直面する。マクロファージ又は単球は、それらの解糖代謝を改変することによりこの勾配に適応する。ＨＩＦ１及び２はこれらの改変の転写因子先導物質であり、改変にはケモカイン又はケモカイン受容体ＣＸＣＲ４又はＣＸＣＬ１２及びＶＥＧＦ（血管新生因子）の発現も含まれる。マクロファージは、低酸素状態に対する組織応答に関与している。
【0015】
細胞環境に存在するポリアミンは２型マクロファージ分極因子であることが分かっている。
【0016】
本発明は、抗炎症性Ｍ２型マクロファージを阻害するために、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利になるようにマクロファージの分極を調節することを目的とする。
【0017】
腫瘍微小環境
腫瘍環境には異なる防御細胞が存在する。その細胞の存在は腫瘍の攻撃を意味することから、これは演繹的に矛盾している。実際には、これらの免疫細胞の多くは不活性期に維持され、調節細胞の存在により動作不能にされる。腫瘍と戦う代わりに、これらの調節細胞は障壁の克服を促すことにより腫瘍の発達を促進し、拡大させ、二次腫瘍、すなわち転移を形成させる。
腫瘍環境には異なる防御細胞が存在する。その細胞の存在は腫瘍の攻撃を意味することから、これは演繹的に矛盾している。実際には、これらの免疫細胞の多くは不活性期に維持され、調節細胞の存在により動作不能にされる。腫瘍と戦う代わりに、これらの調節細胞は障壁の克服を促すことにより腫瘍の発達を促進し、拡大させ、二次腫瘍、すなわち転移を形成させる。
【0018】
腫瘍免疫逃避及び免疫抑制機序
炎症の細胞及び分子エフェクターは腫瘍微小環境において重要な役割を担う。実際、９０年代以降、炎症と腫瘍とのこの相互関係は数多くの研究の対象となっている（非特許文献５；非特許文献６）。免疫系を避けるために、腫瘍は３段階：除去‐平衡‐逃避で逃避機序を実行する。第１段階では腫瘍細胞を認識する免疫機序を除去する。次に、腫瘍細胞と免疫：殺傷と生存との間に平衡を確立する。この平衡は、腫瘍が進行することなく数年持続できる。この期間中、腫瘍細胞は遺伝的に不安定であり、最終的に逃避し、上記抑制機序の誘導、すなわち抗腫瘍応答の遮断により、適切な免疫応答を誘導するか、又は抗腫瘍免疫応答を阻害する。その後、細胞は正常であると認識される。
炎症の細胞及び分子エフェクターは腫瘍微小環境において重要な役割を担う。実際、９０年代以降、炎症と腫瘍とのこの相互関係は数多くの研究の対象となっている（非特許文献５；非特許文献６）。免疫系を避けるために、腫瘍は３段階：除去‐平衡‐逃避で逃避機序を実行する。第１段階では腫瘍細胞を認識する免疫機序を除去する。次に、腫瘍細胞と免疫：殺傷と生存との間に平衡を確立する。この平衡は、腫瘍が進行することなく数年持続できる。この期間中、腫瘍細胞は遺伝的に不安定であり、最終的に逃避し、上記抑制機序の誘導、すなわち抗腫瘍応答の遮断により、適切な免疫応答を誘導するか、又は抗腫瘍免疫応答を阻害する。その後、細胞は正常であると認識される。
【0019】
この上記抑制機序において、炎症性細胞及び分子が重要な役割を担う。適応免疫応答は樹状細胞の分化及び活性化の阻害（ＩＬ１０及びＶＥＧＦなどの腫瘍微小環境因子中の存在を介して）につながる多数の経路を活性化することにより抑制／遮断される。また、末梢血及びリンパ節における調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増加が、自然応答及び適応性応答を阻害する。ＭＤＳＣ（骨髄由来抑制細胞）及びＴＡＭ（腫瘍関連マクロファージ又はＭ２）などの微小環境における腫瘍抑制細胞の存在は、サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリックスを分解する酵素、及びプロテアーゼの分泌による予後不良の腫瘍発生に影響を及ぼす（非特許文献７）。
【0020】
免疫療法は安全ではあるが、一部の癌では、末梢血やリンパ器官内に、また免疫療法治療を妨害する腫瘍環境内に免疫抑制細胞が存在することにより部分的に有効性が中程度になる。ほとんどの癌患者において増加するＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ及びＴＡＭなどの抑制性細胞に作用することにより免疫療法の有効性を改善するため、いくつかの戦略が実施されてきており、又は現在試験されている。癌患者で頻繁に観察される抗腫瘍応答の障害にこれらの集団が寄与していることが明らかになりつつある。
【0021】
従って、これらの細胞型の調節による免疫抑制との闘いは、免疫療法の有効性を高める重要な鍵であり、癌患者の予後を改善するはずである。本発明は、免疫療法に好都合な免疫環境を提供するために、Ｍ１型マクロファージに有利になるようにマクロファージ集団のＭ１／Ｍ２バランスを改変することを目的とする。
【0022】
マクロファージ及び癌
マクロファージは腫瘍中に多数見られる。初めこの細胞集団は抗腫瘍応答に関与していると考えられていたが、多くの実験及び臨床研究から、マクロファージは腫瘍の開始及び進行に、ならびに転移過程に関与することが分かってきた。腫瘍過程中、マクロファージはＩＦＮγ、ＴＮＦ‐α及びＩＬ６などの炎症促進性サイトカインを分泌し、慢性的炎症を形成して開始及び腫瘍進行を引き起こす他の免疫細胞を誘引する。しかし、腫瘍が導入されると、腫瘍マクロファージ（ＴＡＭ）は免疫抑制性細胞プロファイルをとり、活性が低くなり、腫瘍増殖及び悪性腫瘍へ移行させる。ＴＡＭは、腫瘍細胞の移動、血管外遊出及び浸潤（転移）に関与し、腫瘍血管新生に関与する（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。
マクロファージは腫瘍中に多数見られる。初めこの細胞集団は抗腫瘍応答に関与していると考えられていたが、多くの実験及び臨床研究から、マクロファージは腫瘍の開始及び進行に、ならびに転移過程に関与することが分かってきた。腫瘍過程中、マクロファージはＩＦＮγ、ＴＮＦ‐α及びＩＬ６などの炎症促進性サイトカインを分泌し、慢性的炎症を形成して開始及び腫瘍進行を引き起こす他の免疫細胞を誘引する。しかし、腫瘍が導入されると、腫瘍マクロファージ（ＴＡＭ）は免疫抑制性細胞プロファイルをとり、活性が低くなり、腫瘍増殖及び悪性腫瘍へ移行させる。ＴＡＭは、腫瘍細胞の移動、血管外遊出及び浸潤（転移）に関与し、腫瘍血管新生に関与する（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。
【0023】
腫瘍に到達する単球Ｌｙ６Ｃ＋（ＣＤ１４＋）／ＣＤ１１ｂｈｉｇｈは、Ｌｙ６Ｃ及びＣＤ１１ｂマーカーの減少やＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、ＶＣＡＭ及びＣＤ１１ｃの発現などの表現型変化を受ける。しかし、ＴＡＭの分化及び分布は腫瘍の解剖学的局在及びその発生段階に依存する。定義「ＴＡＭの機能」は以前は抗腫瘍Ｍ１マクロファージ型（ｉＮＯＳ誘導型）及びＭ２腫瘍促進性ＡＲＧ陽性マクロファージ型に基づいていた。このかなり単純化された二分類法は、高可塑性のＴＡＭが、その抑制機能に有利に働き、腫瘍細胞に対する耐性に関与するＴｒｅｇの動員を可能にするサイトカイン及びケモカイン環境にあるという文脈に置かれていなければならない（非特許文献１１；非特許文献２）。
【0024】
本発明は、転移過程を含む腫瘍過程を減少又は阻止するためのＴＡＭの阻害に関する。
【0025】
ＣＤ４７‐ＳＩＲＰａ経路
ＣＤ１７２ａ又はＳＨＰＳ‐１とも呼ばれ、本明細書では「ＳＩＲＰａ」と記載されているシグナル調節タンパク質アルファは、Ｓｒｃ相同領域２（ＳＨ２）ドメイン―ホスファターゼを含む―ＳＨＰ‐１及びＳＨＰ‐２に関連するマクロファージ及び骨髄細胞に主に存在する膜タンパク質として最初に同定されたものである。ＳＩＲＰａは、密接に関連したＳＩＲＰタンパク質のＳＩＲＰ対合受容体ファミリーのプロトタイプメンバーである。ＣＤ４７がＳＩＲＰａに関与すると、宿主細胞の貪食作用を阻害する下方制御シグナルが生じ、従ってＣＤ４７は「ドント・イート・ミー」シグナルとして機能する。
ＣＤ１７２ａ又はＳＨＰＳ‐１とも呼ばれ、本明細書では「ＳＩＲＰａ」と記載されているシグナル調節タンパク質アルファは、Ｓｒｃ相同領域２（ＳＨ２）ドメイン―ホスファターゼを含む―ＳＨＰ‐１及びＳＨＰ‐２に関連するマクロファージ及び骨髄細胞に主に存在する膜タンパク質として最初に同定されたものである。ＳＩＲＰａは、密接に関連したＳＩＲＰタンパク質のＳＩＲＰ対合受容体ファミリーのプロトタイプメンバーである。ＣＤ４７がＳＩＲＰａに関与すると、宿主細胞の貪食作用を阻害する下方制御シグナルが生じ、従ってＣＤ４７は「ドント・イート・ミー」シグナルとして機能する。
【0026】
ＳＩＲＰａは、組織マクロファージの亜集団の大部分を占める単球、顆粒球、組織中の樹状細胞（ＤＣ）のサブセット、数種の骨髄前駆細胞上で、ニューロン上に様々なレベルで、小脳及び海馬の顆粒層などの脳のシナプスが豊富な領域内において顕著に高発現レベルで発現する（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。
【0027】
ＣＤ４７とのＳＩＲＰａ相互作用が主に記載されており、これは宿主細胞貪食作用を阻害する下方制御シグナルをもたらす（非特許文献１５参照）。ＣＤ４７及びＳＩＲＰａは両方とも他の相互作用にも関与する。研究者らは、肺表面タンパク質ＳＰ‐Ａ及びＳＰ‐ＤがＳＩＲＰａとの相互作用を介して肺における炎症反応を制御することを示唆している（非特許文献１６）。
【0028】
ＣＤ４７‐ＳＩＲＰａ相互作用の最も特徴的な生理学的機能の１つは、造血細胞、特に赤血球及び血小板の恒常性における役割である。ＣＤ４７は、「ドント・イート・ミー」シグナルとして作用することから、マクロファージによる宿主細胞貪食作用の重要な決定因子であるため、近年、ＣＤ４７‐ＳＩＲＰａ相互作用が癌細胞除去に寄与している可能性が鋭意検討されている。
【0029】
現在、ＳＩＲＰＡ／ＣＤ４７経路も、マクロファージ貪食作用の増強に全て向けられた様々な医薬開発の対象となっている。実際、感染細胞のように、癌細胞は未知のタンパク質又は異常レベルの正常タンパク質などの異常な荷物を運び、しかもこれらの細胞は免疫制御分子を同時に過剰発現することにより自然免疫制御機構を破壊することが多い。このような機構の１つに、正常細胞に発現される「自己」タンパク質であるＣＤ４７（非特許文献１７）があることが徐々に明らかになっている。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰａなどの数種の異なるリガンドと相互作用する。この特異的相互作用は、貪食マクロファージへ「ドント・イート・ミー」シグナルを送り、その後、標的細胞は影響を受けないままにすることが知られている（非特許文献１８）。癌細胞が治療抗体に被覆されている場合でさえ、癌細胞によるＣＤ４７の過剰発現により、ＣＤ４７はマクロファージに耐性となり（非特許文献１９）、多数の固形癌及び血液癌における不良な臨床転帰と相関している（非特許文献２０；非特許文献２１）。実験モデル、特に免疫不全マウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、ＣＤ４７／ＳＩＲＰａ経路の遮断は、マクロファージによる腫瘍除去の促進、ならびに癌細胞の伝播及び転移形成の減少に非常に有効であった（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。これらの研究では、ＴＡＭ機能又は表現型は研究されていない。マクロファージによる抗体依存性貪食作用を増強することにより、ＣＤ４７／ＳＩＲＰａ経路の遮断は、トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）及びアレムツズマブ（抗ＣＤ５２）などの治療用抗癌抗体の枯渇と相乗的に作用することが報告されている（非特許文献２６）。
【0030】
上記から、ＳＩＲＰａは骨髄細胞の貪食機能、樹状細胞の抗原提示及びサイトカイン分泌、ならびに成熟顆粒球の輸送に関与すると報告されていることが分かる。しかし、マクロファージ分極に対するＳＩＲＰａの機能、及び腫瘍形成中のそれらの強力な抑制機能はこれまで報告されたことはない。
【0031】
特許文献１は、ヒトＳＩＲＰａとＣＤ４７との相互作用を調節する工程を含む、血液癌を治療する方法を開示している。この文献から、ＳＩＲＰａ‐ＣＤ４７の遮断が貪食経路を介した自然免疫系の活性化を誘導することが示された。本特許出願に記載のヒト白血病の移植モデルでは、骨髄細胞を使用し、動物をＣＤ４７のアンタゴニストで処理したときに移植が拒絶された。この結果から、抗ＣＤ４７による処理時に貪食作用が増加したことが示唆されるが、マクロファージの分極状態の改変も、マクロファージの炎症促進機能への改変も示唆されていない。
【0032】
抗炎症及び抗腫瘍治療において使用するために細胞機能を阻害する方法は、特許文献２に記載されている。この方法は、ＳＩＲＰａの細胞外ドメインを特異的に認識し、病的骨髄細胞の機能を阻害する物質を含む薬物を投与する工程を含む。この特許出願の発明者らは、細胞外ドメインに特異的な抗ＳＩＲＰａ抗体が炎症を遮断し、マクロファージ貪食作用を阻害する性質（本文中で病的骨髄細胞の機能と称する）を有することを主張している。この効果は、以下に開示される結果と完全に矛盾しており、マクロファージ分極又は炎症促進性機能に対する抗ＳＩＲＰａ抗体の効果は全く示唆していない。
【0033】
ＳＩＲＰａに結合するＣＤ４７‐Ｆｃ及びＣＤ４７伸長フソ体（ｆｕｓｏｂｏｄｙ）分子を研究し、特許出願特許文献３で請求した。これらの分子は末梢血単球、パンソルビンもしくは溶解性ＣＤ４０Ｌで刺激したＤＣ及び／又は単球誘導型ＤＣ、ならびにＩＦＮγからの免疫複合体刺激細胞サイトカイン放出（例えばＩＬ‐６、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ２３、ＩＬ８及びＴＮＦ‐αの放出）を阻害可能であることが主張されている。これら分子の活性は、本出願で開示された抗ＳＩＲＰａ抗体の活性とは全く異なる。
【0034】
特許文献４には、ＳＩＲＰａ陽性ＡＭＬのモデルにおける抗体抗ヒトＳＩＲＰａ（２９ＡＭ４‐５と呼ばれ、本発明者らに命名されたＳＩＲＰ‐２９に相当する）の使用、すなわち、上記抗体抗ヒトＳＩＲＰａが結合したヒトＳＩＲＰａを発現する一次ヒトＡＭＬ細胞の免疫不全マウスへの異種移植が記載されている。従って、このアプローチは、ヒトＳＩＲＰａを発現する腫瘍細胞に作用する抗ヒトＳＩＲＰａ抗体の使用にある。よって、治療は腫瘍に直接向けられる。
【0035】
Ａｌｂｌａｓ Ｊ．ら（非特許文献２７）は、抗ＳＩＲＰａ抗体（ＥＤ９）が炎症性サイトカイン、特にＴＮＦ‐α及びＩＬ‐６の産生を誘導できないことを観察した（図１Ａ）。しかし、本発明者らは、逆に、この特定の抗体によりＭ２抗炎症性マクロファージがＭ１炎症促進性マクロファージへ再分極可能になることを実証した（実験パートの図１４Ｂ）。結果の違いは、Ａｌｂｌａｓらの著者らはマクロファージ細胞株（ラットＮＲ８３８３細胞株）（もはやＳＩＲＰａを発現しない）を使用し、一方、本発明者らは実験の過程で骨髄由来ラットマクロファージの新たな調製物を使用したという事実により説明できた。
【0036】
特許文献５には、ヒトＳＩＲＰａに結合し、標的細胞上に発現したＣＤ４７と貪食細胞上に発現したＳＩＲＰａとの相互作用を遮断する抗ヒトＳＩＲＰａ抗体が記載されている。この文献では、マクロファージ分極及びマクロファージの炎症促進性機能の増加に対する抗ＳＩＲＰａの効果を示す証拠は示唆も明示もされていない。興味深いことに、特許文献５に名前が記載された発明者らは第５６回ＡＳＨ年次総会において要約を発表した（非特許文献２８）。特許文献５の出願後のこの要約において、彼らは、ＣＤ４７とＳＩＲＰａとの相互作用を遮断する抗ヒトＳＩＲＰａ抗体はヒトマクロファージ貪食作用を誘導するには十分ではないことを述べている。全体として、これらの刊行物には、インビトロでの抗ヒトＳＩＲＰａの作用機序は抗ヒトＣＤ４７の作用機序とは異なることが示唆されており、ここでは、インビボ貪食効果が文献に広範に記載されている。
【0037】
上記から、抗体又は融合タンパク質によりＣＤ４７又はＳＩＲＰａを標的とする様々な遮断ＳＩＲＰａ‐ＣＤ４７相互作用戦略が個別の結果及び異なる効率を示し、各標的に対して個別の役割を示すことが明らかになっている。実際、ＣＤ４７抗原に対して向けられる抗体は、ＣＤ４７とそのすべてのリガンドとの相互作用を遮断する。そのＦｃを介して細胞に結合し、内因性ＣＤ４７経路を遮断し、その活性化を阻止するＳＩＲＰａ‐Ｆｃタンパク質を使用すると、抗‐ＳＩＲＰａ抗体とは逆に、内因性ＳＩＲａの活性を遮断できなくなる。免疫系の調節におけるＳＩＲＰａ経路の直接的な役割は、これまで、ＣＤ４７経路と比較して過小評価されてきた。先行技術の研究はいずれも、腫瘍逃避機序で重要な役割を担う（表現型レベル又は機能レベルのいずれかの）マクロファージ分極におけるＳＩＲＰａ経路の機能を示唆も説明もしていない。
【0038】
この文脈において、免疫環境の調節が多くの疾患、特に癌の治療において主要な成果を挙げることから、本発明者らは抗ＳＩＲＰａ化合物の使用における新たな知見を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0039】
【文献】国際公開第２０１０／１３００５３号
【文献】ＷＯ００／６６１５９
【文献】国際公開第２０１２／１７２５２１号
【文献】国際公開第２０１３／０５６３５２号
【文献】国際公開第２０１５／１３８６００号
【非特許文献】
【0040】
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【文献】Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｗ．Ｊ．，ＭｃＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｋ．Ａ．，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｌｉｎｄｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｘｉａｏ，Ｙ．Ｑ．，Ｏｌｄｈａｍ，Ｋ．Ｍ．，Ｖａｎｄｉｖｉｅｒ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｅｎｓｏｎ，Ｐ．Ｍ．，及びＧａｒｄａｉ，Ｓ．Ｊ．（２００８年）． Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｖｉａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＩＲＰ ａｌｐｈａ． Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７８，１５８～１６７．
【文献】Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．，及びＶａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｔ．Ｋ．（２０１４年ｂ）． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ（ＳＩＲＰａ） ａｎｄ ＣＤ４７：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ． Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，２５～５０．
【文献】Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ，Ｐ．Ａ．，Ｚｈｅｌｅｚｎｙａｋ，Ａ．，Ｆａｎｇ，Ｙ．Ｆ．，Ｌａｇｅｎａｕｒ，Ｃ．Ｆ．，Ｇｒｅｓｈａｍ，Ｈ．Ｄ．，及びＬｉｎｄｂｅｒｇ，Ｆ．Ｐ．（２０００年）． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４７ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｅｌｆ ｏｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８，２０５１～２０５４．
【文献】Ｚｈａｏ，Ｘ．Ｗ．，ｖａｎ Ｂｅｅｋ，Ｅ．Ｍ．，Ｓｃｈｏｒｎａｇｅｌ，Ｋ．，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｄｅｎ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｈｏｕｄｔ，Ｍ．，Ｏｔｔｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｆｉｎｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｖａｎ Ｅｇｍｏｎｄ，Ｍ．，Ｍａｔｏｚａｋｉ，Ｔ．，Ｋｒａａｌ，Ｇ．，ら（２０１１年）． ＣＤ４７‐ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ‐α（ＳＩＲＰａ） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒｍ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８，１８３４２～１８３４７．
【文献】Ｍａｊｅｔｉ，Ｒ．，Ｃｈａｏ，Ｍ．Ｐ．，Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．，Ｐａｎｇ，Ｗ．Ｗ．，Ｊａｉｓｗａｌ，Ｓ．，Ｇｉｂｂｓ，Ｋ．Ｄ．Ｊ．，ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｎ．，及びＷｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．（２００９年）． ＣＤ４７ ｉｓ ａｎ ａｄｖｅｒｓｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔ ｏｎ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １３８，２８６～２９９．
【文献】Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｓ．Ｂ．，Ｖｏｌｋｍｅｒ，Ｊ．‐Ｐ．，Ｇｅｎｔｌｅｓ，Ａ．Ｊ．，Ｓａｈｏｏ，Ｄ．，Ｄａｌｅｒｂａ，Ｐ．，Ｍｉｔｒａ，Ｓ．Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ‐Ｔｒｕｊｉｌｌｏ，Ｈ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｄ．，ら（２０１２年）． Ｔｈｅ ＣＤ４７‐ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ（ＳＩＲＰａ） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，６６６２～６６６７．
【文献】Ｃｈａｏ，Ｍ．Ｐ．，Ｔａｎｇ，Ｃ．，Ｐａｃｈｙｎｓｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｃｈｉｎ，Ｒ．， Ｍａｊｅｔｉ，Ｒ．，及びＷｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．（２０１１年）． Ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ‐Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＣＤ４７ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ‐ＣＤ４７ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｌｏｏｄ １１８，４８９０～４９０１．
【文献】Ｅｄｒｉｓ，Ｂ．，Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．，Ｖｏｌｋｍｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｖｏｌｋｍｅｒ，Ｊ．‐Ｐ．，Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｓ．Ｂ．， Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ‐Ｔｒｕｊｉｌｌｏ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｍａｊｅｔｉ，Ｒ．，Ｗｅｓｔ，Ｒ．Ｂ．，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．，ら（２０１２年）． Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ４７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，６６５６～６６６１．
【文献】Ｕｌｕcｋａｎ，Ｏ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｄｅｎｇ，Ｈ．，Ｚｏｕ，Ｗ．，Ｐｒｉｏｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｉｗｎｉｃａ‐Ｗｏｒｍｓ，Ｄ．，Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｗ．Ａ．，及びＷｅｉｌｂａｅｃｈｅｒ，Ｋ．Ｎ．（２００９年）． ＣＤ４７ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｏｎｅ ｍａｓｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｏ ｂｏｎｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９，３１９６～３２０４．
【文献】Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｚ．，Ｇｕｏ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈａｒｍａ，Ａ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｇ．Ｐ．，及びＨｕａｎｇ，Ｌ．（２０１３年）． Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ４７ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１，１９１９～１９２９．
【文献】Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．，Ｒｉｎｇ，Ａ．Ｍ．，Ｈｏ，Ｃ．Ｃ．Ｍ．，Ｖｏｌｋｍｅｒ，Ｊ．‐Ｐ．，Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｖｏｌｋｍｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｏｚｋａｎ，Ｅ．，Ｆｅｒｎｈｏｆｆ，Ｎ．Ｂ．，ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎ，Ｍ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，ら（２０１３年）． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰａ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１，８８～９１．
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【文献】Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．，Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．，Ｓｕｇｉｔａ，Ｄ．，Ｔａｋｅｕｒａ，Ｎ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ａ．，Ｌｏｎｇ，Ｇ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｋ．Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．Ｂ．，ら（２０１２年）． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ． Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ ２９，１６１４～１６２５．
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【文献】Ｚｈａｏ，Ｘ．Ｗ．，ｖａｎ Ｂｅｅｋ，Ｅ．Ｍ．，Ｓｃｈｏｒｎａｇｅｌ，Ｋ．，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｄｅｎ，Ｈ．，Ｖａｎ Ｈｏｕｄｔ，Ｍ．，Ｏｔｔｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｆｉｎｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｖａｎ Ｅｇｍｏｎｄ，Ｍ．，Ｍａｔｏｚａｋｉ，Ｔ．，Ｋｒａａｌ，Ｇ．，ら（２０１１年）． ＣＤ４７‐ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ‐α（ＳＩＲＰａ） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒｍ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８，１８３４２～１８３４７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0041】
以下の実験パートに記載しているように、本発明者らはここで、ＳＩＲＰａを新たなチェックポイント阻害剤として同定し、マクロファージ分極におけるその役割を実証した。マクロファージの炎症促進性プロファイルが２型マクロファージ（Ｍ２型高貪食活性＝Ｍ（ＩＬ４））を犠牲にして得られることから、本明細書で定義される抗ＳＩＲＰａ化合物は１型マクロファージ（Ｍ１炎症促進性＝Ｍ（ＩＦＮｇ））に関連するマクロファージの炎症促進機能を誘導し、腫瘍におけるＭ２型マクロファージの抑制活性を阻害することを本発明者らは実際に示している。この効果は、ＳＩＲＰａを標的にすることにより得られるが、貪食機能に関与するＣＤ４７では得られない。本発明の１つの利点は、抗ＳＩＰＲａ化合物を使用すると、抗ＣＤ４７化合物を使用する場合より副作用を少なくできることである。実際、ＣＤ４７は腫瘍細胞だけでなく、広範な細胞により発現し、数種のリガンドと相互作用する。ＳＩＲＰａの発現の方が限定的であるため、治療効果を腫瘍微小環境に向けやすくなる。従って、抗ＳＩＲＰａ化合物の使用は抗ＣＤ４７化合物の使用より毒性や有害性が少なくなる。更に、治療は腫瘍細胞ではなくマクロファージに向けられるため、腫瘍細胞に選択圧が掛からず、腫瘍逃避、及び治療に対する腫瘍耐性の発生を防止することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【0042】
従って本発明は、マクロファージ分極を改変するために、抗ＳＩＲＰａ抗体などの、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能な抗ＳＩＲＰａ化合物の使用に関する。従って、本発明の方法は抗ＳＩＲＰａ化合物の使用にあり、当該化合物はＭ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働く。
【0043】
特定の実施形態では、上記抗ＳＩＲＰａ化合物は、抗ＳＩＲＰａ抗体、特に抗ＳＩＲＰａアンタゴニスト抗体、このような化合物をコードする核酸、及びＳＩＲＰａタンパク質の発現を阻害可能な化合物、特にｓｉＲＮＡから成る群より選択されることが可能である。
【0044】
従って、抗ＳＩＲＰａ化合物、特に抗ＳＩＲＰａ特異的抗体は、炎症促進性マクロファージにより改善又は予防できる可能性が高い様々な状態、例えば癌、感染症、外傷、自己免疫疾患、ワクチン接種、神経疾患、脳及び神経障害、赤血球増加症、血色素症ならびに慢性炎症性疾患の治療に使用できる。癌は好ましい治療指標である。
【0045】
特定の実施形態では、本発明は、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能で、ＳＩＲＰａ陽性急性骨髄性白血病及び／又はＳＩＲＰａ陽性非急性骨髄性白血病及び／又はＳＩＲＰａ陽性非ホジキン白血病又はＳＩＲＰａ陽性血液癌を除く癌の治療に使用するための抗ＳＩＲＰａ化合物に関するものである。
【0046】
本発明の重要な態様は、分極を調節して腫瘍発生及び生存に有害な免疫環境を再現するためにマクロファージ上のＳＩＲＰａを標的とすることを意図している治療アプローチである。基本的に、抗腫瘍治療の成功は間接的な経路に基づいており、腫瘍細胞が抗ＳＩＲＰａ化合物に対して感受性があることを必要としない。従って、特定の実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるような、すなわち癌の治療において抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能な抗ＳＩＲＰａ化合物の使用に関するものであり、当該化合物はＳＩＲＰａ陰性腫瘍を示す患者に投与する。
【0047】
本明細書で定義される抗ＳＩＲＰａ化合物は、実験パートに記載されているように、単独療法において使用可能である。
【0048】
相乗効果が本発明者により実証されたことから、本明細書で定義される抗ＳＩＲＰａ化合物と他の治療薬、特に別の免疫チェックポイントを遮断する薬剤との併用も本発明の一部である。
【0049】
本発明の別の態様は、マクロファージを本明細書で定義される抗ＳＩＲＰａ化合物と共にインキュベートすることにより、炎症促進性Ｍ１型マクロファージを生体外で得る方法である。
【0050】
本発明はまた、患者から得た試料中のＭ２型マクロファージの存在を測定することにより、本明細書で定義される抗ＳＩＲＰａ化合物での治療から利益が得られる可能性が高い患者を選択する方法に関する。
【0051】
上記化合物により治療した個体から得た試料中で炎症促進性Ｍ１型マクロファージ及び／又は抗炎症性Ｍ２型マクロファージの存在を測定することによりその有効性を評価するための、本明細書で定義される抗ＳＩＲＰａ化合物での治療を経過観察する方法も本発明の一部である。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】ＧＭ‐ＣＳＦ＋Ｍ‐ＣＳＦプロトコルでの単球１型分極：ＳＩＲＰａ遮断の効果を示した図であり、ヒト単球を増殖因子Ｍ‐ＣＳＦ及びＧＭ‐ＣＳＦと共に培養してマクロファージを誘導し、Ｃｔｒｌ Ａｂ又は抗Ｓｉｒｐ抗体（抗ａ又はａｂ又はｂアイソタイプ）、又はＣＤ４７‐Ｆｃタンパク質、又は数種の抗‐ＣＤ４７抗体（Ｂ６Ｈ１２又はＣＣ２Ｃ６）で処理したもの、あるいは未処理のものを、１型マクロファージ表現型及び機能をＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡにより分析した結果を表していて、Ａ．は細胞表面マーカー分析：ＣＤ８６及びＣＣＲ７、Ｂ．は分泌されたサイトカイン／ケモカイン：ＩＬ６、ＩＬ１２ｐ４０、ＣＣＬ‐２及びＴＮＦ‐αを表しており、ＩＬ６、ｐ１２ｐ４０及びＣＣＬ‐２は、細胞を抗ＳＩＲＰａ抗体で処理すると有意に増加ことが分かる。
【図2】ＧＭ‐ＣＳＦ＋Ｍ‐ＣＳＦプロトコルでの単球２型分極：ＳＩＲＰａ遮断の効果を示した図であり、ヒト単球を増殖因子Ｍ‐ＣＳＦ及びＧＭ‐ＣＳＦと共に培養してマクロファージを誘導し、Ｃｔｒｌ Ａｂ又は抗Ｓｉｒｐ抗体（抗ａ又はａｂ又はｂアイソタイプ）、又はＣＤ４７‐Ｆｃタンパク質、又は数種の抗ＣＤ４７抗体（Ｂ６Ｈ１２又はＣＣ２Ｃ６）で処理したもの、あるいは未処理のものに、２型マクロファージ表現型及び機能分析をＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡにより行った結果を表しており、Ａ．は細胞表面のマーカー発現：ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ１１ｂを示し、Ｂ．は分泌されたケモカイン：ＣＣＬ‐１７を示す。
【図3】Ｍ‐ＣＳＦ及びＩＦＮγプロトコルでの単球１型分極：ＳＩＲＰａ遮断の効果を示した図であり、ヒト単球をＭ‐ＣＳＦと共に５～６日間培養し、次いでＩＦＮγと共に、またＣｔｒｌ Ａｂ又は抗Ｓｉｒｐ抗体（抗ａ又はａｂ又はｂ Ｓｉｒｐアイソタイプ）又はＣＤ４７‐Ｆｃタンパク質、又は数種の抗ＣＤ４７抗体（Ｂ６Ｈ１２又はＣＣ２Ｃ６）を添加して、あるいは添加せずに２日間培養し、Ｍ１分泌サイトカイン：ＩＬ６及びＩＬ１２ｐ４０を分析し統計分析を行った。
【図4】Ｍ‐ＣＳＧ＋ＩＦＮγ及びＬＰＳプロトコルでの単球１型分極：ｉＮＯＳ発現に対するＳＩＲＰａ遮断の効果を示した図であり、ヒト単球をＭ‐ＣＳＦと共に５～６日間培養し、次いでＩＦＮγ＋ＬＰＳと共に、またＳＩＲＰａ：ＳＥ７Ｃ２（Ａ．）又はＳＩＲＰａ／ｂ：ＳＥ５Ａ５（Ｂ．）又はＣＤ４７：Ｂ６Ｈ１２（Ｃ．）に対する抗体を添加、あるいは添加せずに２日間培養し、次いでｉＮＯＳ発現をＦＡＣＳにより分析したもので、３つのパネル上でＣｔｒｌ Ａｂは点線で表し、分極前の単球は白抜きの灰色線で表している。
【図5】Ｍ‐ＣＳＦ＋ＩＬ４プロトコルでの単球２型分極：抗体によるＳＩＲＰａ遮断の効果を示した図であり、ヒト単球をＭ‐ＣＳＦと共に５～６日間培養し、次いでＩＬ４と共に、またＣｔｒｌ Ａｂ又は抗Ｓｉｒｐ抗体（抗Ｓｉｒｐ ａ又はａｂ又はｂ）又はＣＤ４７‐Ｆｃ融合タンパク質、又は数種の抗ＣＤ４７抗体（Ｂ６Ｈ１２又はＣＣ２Ｃ６）を添加、あるいは添加せずに培養した場合の、Ａ．は細胞表面マーカー：ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ及びＣＤ１１ｂの発現を表し、Ｂ．は上清中のＩＬ６サイトカインの放出を表している。
【図6】Ｍ‐ＣＳＦ＋ＩＬ４プロトコルでの単球２型分極：ｓｉＲＮＡノックダウンアッセイによるｍＲＮＡレベルでのＳＩＲＰａ遮断の効果を示した図であり、ヒト単球をＭ‐ＣＳＦと共に５～６日間培養し、次いでＩＬ４と共に２日間培養し細胞をｎｕｌｌ‐ｓｉＲＮＡ又はＳＩＲＰａ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした：Ａ．は細胞表面マーカー：ＣＤ２０６及びＣＤ２００Ｒの発現を表し；Ｂ．は上清中のＩＬ６サイトカイン放出を表しており、抗‐ＳＩＲＰａ ＳｉＲＮＡはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手したものである。
【図7】Ｍ‐ＣＳＦ＋ＩＬ４処理後のＭ２再分極に対するＳＩＲＰａ遮断の効果を示した図であり、ヒト単球をＭ‐ＣＳＦと共に５～６日間培養し、次いでＩＬ４と共に２日間培養し、その後、Ｍ２マクロファージをＣｔｒｌ Ａｂ又は抗Ｓｉｒｐ抗体（抗Ｓｉｒｐ ａ又はａｂ又はｂ）、又はＣＤ４７‐Ｆｃ融合タンパク質、又は数種の抗ＣＤ４７抗体（Ｂ６Ｈ１２又はＣＣ２Ｃ６）で処理、あるいは未処理し、次いで、サイトカインＩＬ６及びＴＮＦ‐α放出を上清中で測定した。
【図8】肝細胞癌のインビボモデルに対する抗ＳＩＲＰａ＋抗ＣＤ１３７併用治療の効果を示した図であり、腫瘍接種から１週間後に、動物を３Ｇ８アイソタイプ対照抗体（Ｉｓｏ対照：黒い四角：ｎ＝３３）又は抗ＳＩＲＰａ抗体（クローンｐ８４：灰色の四角；ｎ＝３３）又は抗ＣＤ１３７抗体（４‐１ＢＢ ｍＡｂ：黒い三角；ｎ＝８）又は併用治療（抗ＳＩＲＰａ＋抗ＣＤ１３７：灰色の菱形；ｎ＝８）で週３回、４週間処理し、次いで全生存率を分析した。
【図9】肝細胞癌のインビボモデルに対する抗ＳＩＲＰａ＋抗ＰＤ‐Ｌ１併用治療の効果を示した図であり、腫瘍接種から１週間後に、動物を３Ｇ８アイソタイプ対照抗体（Ｉｓｏ対照：黒い四角：ｎ＝５）又は抗ＳＩＲＰａ抗体（クローンｐ８４：灰色の四角；ｎ＝５）又は抗ＰＤ‐Ｌ１抗体（１０Ｆ‐９Ｇ２ ｍＡｂ：黒い三角；ｎ＝８）又は併用治療（抗ＳＩＲＰａ＋抗ＰＤ‐Ｌ１：灰色の菱形；ｎ＝５）で週３回、４週間処理し、次いで全生存率を分析した。
【図10】黒色腫のインビボモデルに対する抗ＳＩＲＰａ＋抗ＰＤ‐Ｌ１併用治療の効果を示した図であり、腫瘍接種と同時に、動物をアイソタイプ対照抗体（Ｉｓｏ対照：星形：ｎ＝５）又は抗ＳＩＲＰａ抗体（クローンｐ８４：四角；ｎ＝５）又は抗ＰＤ‐Ｌ１抗体（１０Ｆ‐９Ｇ２ ｍＡｂ：三角；ｎ＝８）又は併用治療（抗ＳＩＲＰａ＋抗ＰＤ‐Ｌ１：丸；ｎ＝５）で処理した結果を表しており、Ａ．は全生存率を分析した結果を、Ｂ．ＣＭＨクラスＩＩ／ＣＤ１１ｂマーカーを用いてマクロファージ浸潤を分析するため、最初の接種の２週間後に数頭の動物を屠殺して得られた結果を表している。
【図11】マウスマクロファージ分極に対する抗ＳＩＲＰＡ抗体の効果を示した図であり、Ｍ２マーカーＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ及びＰＤ‐Ｌ１の発現の定量化に示されるように、マウスＭ２マクロファージ分極表現型は抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂにより阻害されるが、抗ＣＤ４７ ｍＡｂでは阻害されず、本実験では、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂはｐ８４クローンに対応し、抗ＣＤ４７ ｍＡｂはＭＩＡＰ３１０クローンに対応する。
【図12】ヒトＭ２マクロファージ分極に対する抗ＳＩＲＰａ抗体の効果を示した図であり、ヒトＭ２マクロファージ分極表現型は抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂにより阻害されるが、抗ＣＤ４７ ｍＡｂでは阻害されず、Ａ．はＭ２表面マーカー（ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ８０）の検出によってあらわされる図であり、Ｂ．は機能的レベルにあり、サイトカイン分泌（ＩＬ‐６）の評価によってあらわさる図で、本実験では、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂはＳＥ７Ｃ２又はＳＩＲＰ２９クローンに対応し、抗ＣＤ４７ ｍＡｂはＢ６Ｈ１２クローンに対応する。
【図13】ヒトＭ１貪食作用に対する抗ＳＩＰＲａ抗体の効果を示した図であり、ＣＤ４７＋腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）のヒトマクロファージ貪食作用はＣＤ４７標的化剤により増加するが、ＳＩＲＰａ標的化剤では増加せず、貪食作用の分析は、Ｍ１蛍光マクロファージでのゲーティングによるフローサイトメトリー、及びＭ１マクロファージへの標的（Ｒａｊｉ）細胞蛍光の分析により評価し、また本実験では、ＣＤ４７標的化剤は抗ＣＤ４７ ｍＡｂ Ｂ６Ｈ１２又はＣＣ２Ｃ６クローンに対応し、ＳＩＲＰａ標的化剤は抗ＳＩＲＰａクローンＳＥ７Ｃ２又はＣＤ４７‐Ｆｃタンパク質に対応する。
【図14】ラットＭ１／Ｍ２分極に対する抗ＳＩＲＰＡ抗体の効果を示した図であり、Ａ．はラットＭ２マクロファージは、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂの存在下で炎症促進性になり、炎症性サイトカイン（ＩＬ‐６及びＴＮＦ‐α）を分泌するが、抗ＣＤ４７ ｍＡｂでは分泌しないことを表しており、Ｂ．はＭ１ラットマクロファージ分極は、抗ＳＩＲＰａ又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂに改変されないことを表し、また本実験で使用した抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂはＥＤ９クローンに対応し、抗ＣＤ４７ ｍＡｂはＯＸ１０１クローンに対応する。
【図15】乳房腫瘍のマウスモデルに対する抗ＳＩＲＰａ抗体の効果を示した図であり、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂでの単独療法は、マウスの４Ｔ１乳癌モデルにいて腫瘍増殖を阻害しており、また本実験で用いた抗ＳＩＰＲａ ｍＡｂはクローンｐ８４に対応する。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本文書全体を通して、以下の定義を使用する：
【0054】
マクロファージ分極
用語「分極」は、本明細書では、マクロファージの表現型の特徴及び機能的特徴を指定するために用いる。表現型はマクロファージが発現する表面マーカーを介して定義できる。機能性は、例えば、マクロファージが発現した、特に分泌したケモカイン及び／又はサイトカインの性質及び量に基づいて定義できる。実際、マクロファージは、炎症促進性Ｍ１型マクロファージ又は抗炎症性Ｍ２型マクロファージのいずれかの状態に応じて、異なる表現型及び機能的特徴を示す。Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ‐Ｌ１及びＣＤ２００Ｒなどの表面マーカーの発現、次いでＣＣＬ１７などのサイトカインの分泌により特徴付けられる。Ｍ１型マクロファージは、ＣＤ８６及びＣＣＲ７などの表面マーカーの発現、ならびにＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α及びＩＬ１２ｐ４０などのサイトカインの分泌により定義付けできる。本発明の文脈において、抗ＳＩＰＲａ化合物は、Ｍ２型マクロファージを阻害し、また／あるいはＭ１型マクロファージに有利に働くことにより、マクロファージ集団の分極を調節可能にする。
用語「分極」は、本明細書では、マクロファージの表現型の特徴及び機能的特徴を指定するために用いる。表現型はマクロファージが発現する表面マーカーを介して定義できる。機能性は、例えば、マクロファージが発現した、特に分泌したケモカイン及び／又はサイトカインの性質及び量に基づいて定義できる。実際、マクロファージは、炎症促進性Ｍ１型マクロファージ又は抗炎症性Ｍ２型マクロファージのいずれかの状態に応じて、異なる表現型及び機能的特徴を示す。Ｍ２型マクロファージは、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ‐Ｌ１及びＣＤ２００Ｒなどの表面マーカーの発現、次いでＣＣＬ１７などのサイトカインの分泌により特徴付けられる。Ｍ１型マクロファージは、ＣＤ８６及びＣＣＲ７などの表面マーカーの発現、ならびにＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α及びＩＬ１２ｐ４０などのサイトカインの分泌により定義付けできる。本発明の文脈において、抗ＳＩＰＲａ化合物は、Ｍ２型マクロファージを阻害し、また／あるいはＭ１型マクロファージに有利に働くことにより、マクロファージ集団の分極を調節可能にする。
【0055】
外因性物質によるマクロファージの摂動の意味には、通常使用される用語「活性化」の意味が包含されている。マクロファージは、増殖因子（ＣＳＦ‐１及びＧＭ‐ＣＳＦ）、ならびに微生物、微生物生成物及びヌクレオチド誘導体などの外部刺激物質、抗体‐Ｆｃ受容体刺激、グルココルチコイド、貧食作用に応答して自己の分極状態を変化させる。
【0056】
抗ＳＩＲＰａ化合物
本明細書で使用される「抗‐ＳＩＲＰａ化合物」は、ＳＩＲＰａの細胞外ドメイン、又はこのような化合物をコードする核酸に特異的に結合する化合物、ならびにＳＩＲＰａタンパク質の発現を阻害することが可能な化合物を指す。このような化合物は、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能である。
本明細書で使用される「抗‐ＳＩＲＰａ化合物」は、ＳＩＲＰａの細胞外ドメイン、又はこのような化合物をコードする核酸に特異的に結合する化合物、ならびにＳＩＲＰａタンパク質の発現を阻害することが可能な化合物を指す。このような化合物は、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能である。
【0057】
抗ＳＩＲＰａ化合物は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）の細胞外ドメインに特異的に結合する化合物とすることが可能である。抗ＳＩＲＰａ化合物はまた、ＳＩＲＰａ遮断化合物とすることも可能である。好ましくは、抗ＳＩＲＰａ化合物はアンタゴニストペプチド又は抗ＳＩＲＰａ抗体、特に抗ＳＩＲＰａアンタゴニスト抗体である。
【0058】
本明細書中で使用しているように、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体には、組換え抗体、例えば、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体及びヒト化抗体が含まれるが、抗原結合部分も含まれる。本明細書中で使用しているように、抗体（又は単に「抗体部分」）の用語「抗原結合部分」は、本発明の抗体の１つ以上の断片を指し、当該断片（単数又は複数）は依然として上記で定義した結合親和性を有する。抗体の用語「抗原結合部分」によれば、結合断片の例にはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片及び単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）が挙げられる。「二重特異性抗体」などの他の形態の単鎖抗体も同様にここに含まれる。
【0059】
本明細書中で使用しているように、アンタゴニストペプチドは、ＳＩＲＰａとそのリ癌ドの１つ、特にＣＤ４７との相互作用を阻害することが可能なペプチドを指すか、又はＳＩＲＰａシグナル伝達経路を阻止もしくは減少させることが可能なペプチドを指す。
【0060】
抗ＳＩＲＰａ化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＳＩＲＰａタンパク質、又はｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡの発現を阻害できる化合物とすることも可能である。本発明によるマクロファージの分極を調節可能なｓｉＲＮＡの例は、実験パートに提供している。更に、そのような化合物の同定方法は当業者に公知である。
【0061】
特定の実施形態では、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能な抗ＳＩＲＰａは、下記実験パートに記載したプロトコルの１つを適用することにより同定できる。
【0062】
例えば、抗ＳＩＲＰａ Ｘ化合物の同定は以下のように行うことが可能である：
【0063】
単球をＭ‐ＣＳＦ（１００μｇ／ｍＬ）で５～６日間培養してＭ０マクロファージを得た後、上記化合物Ｘの存在下又は非存在下で、組換えｈＩＬ４（２０ｎｇ／ｍＬ）と共にインビトロで細胞を２日間培養する。抗ＳＩＲＰａ活性の陽性対照として、活性が既知である抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂを使用することが可能である。ＳＩＲＰａの細胞外ドメインを標的としない化合物であればどのような化合物でも陰性対照（例えば、抗ＳＩＲＰｂ抗体又はＣＤ４７‐Ｆｃ）として使用することが可能である。様々なサイトカイン、例えばＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α及びＩＬ１２ならびにケモカインＣＣＬ１７の分泌はＥＬＩＳＡで測定可能である。
【0064】
化合物Ｘは、もし、陽性対照のｍＡｂと同等に効率的に、又はそれより効率的に、（ｉ）Ｍ２マクロファージ特性の指標、特にＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ２００Ｒなどの表面マーカーの過剰発現ならびにＣＣＬ１７などの特定のサイトカインの分泌を阻害するのであれば、また／あるいは（ｉｉ）Ｍ１マクロファージ特性の指標、特にＣＤ８６及びＣＣＲ７などの表面マーカーの発現ならびにＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α、ＩＬ１２‐ｐ４０及び／又はＩＬ１２などのサイトカインの分泌を増加させるのであれば、「抗ＳＩＲＰａ化合物」に分類できる。
【0065】
特定の実施形態では、抗ＳＩＲＰａ化合物の効果は、１０μｇ／ｍＬの濃度で使用する特定の抗体ＳＥ７Ｃ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社のｓｃ－２３８６３）の効果と比較して評価することが可能である。試験の結果が、ＳＥ７Ｃ２と同等に効率的であるか、又はＳＥ７Ｃ２より効率的であることが示されれば、化合物Ｘは「抗ＳＩＲＰａ化合物」に分類される。
【0066】
このプロトコルに基づいて、陽性対照として基準の任意の抗ＳＩＲＰａ化合物と比較を行うことが可能である。
【0067】
癌、治療等
本明細書中で使用しているように、「癌」は全タイプの癌を意味する。特に、癌は固形癌でも非固形癌でもよい。癌の非限定的な例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌又は大腸癌、肉腫、リンパ腫、黒色腫、白血病、胚細胞癌及び芽細胞腫などの癌腫又は腺癌である。
本明細書中で使用しているように、「癌」は全タイプの癌を意味する。特に、癌は固形癌でも非固形癌でもよい。癌の非限定的な例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌又は大腸癌、肉腫、リンパ腫、黒色腫、白血病、胚細胞癌及び芽細胞腫などの癌腫又は腺癌である。
【0068】
本明細書で使用しているように、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、癌、特に固形腫瘍の進行、重篤度及び／又は持続時間の軽減又は改善；例えば肝臓癌では、１つ以上の療法の施術に起因するそれらの１つ以上の症状の軽減を意味する。
【0069】
治療薬
本明細書で使用しているように、「治療手段」は、効果を生じさせることが可能なあらゆる有効な力又は物質を指す。従って治療手段には放射線、外科手術、プロバイオティクスならびに任意の種類の薬物が挙げられる。
本明細書で使用しているように、「治療手段」は、効果を生じさせることが可能なあらゆる有効な力又は物質を指す。従って治療手段には放射線、外科手術、プロバイオティクスならびに任意の種類の薬物が挙げられる。
【0070】
免疫チェックポイント遮断薬及び刺激剤
本文書では、「免疫チェックポイントを遮断する薬物」又は「免疫チェックポイント遮断薬」又は「免疫チェックポイント遮断薬物」又は「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントを遮断する任意の薬物、分子又は組成物を指す。特に、それは抗ＣＴＬＡ‐４抗体、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び抗ＳＩＲＰａ抗体を包含する。更に、２つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を併用して、適応免疫細胞及び自然免疫細胞の両方を標的とすることが可能となる。このアプローチは癌の治療において特に興味深い。この目的により、抗ＳＩＲＰａ化合物を抗ＰＤ‐Ｌ１化合物と併用することが可能になる。特に癌の治療では、このような併用を複数同時に個別に、又は連続的に使用可能である。
本文書では、「免疫チェックポイントを遮断する薬物」又は「免疫チェックポイント遮断薬」又は「免疫チェックポイント遮断薬物」又は「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントを遮断する任意の薬物、分子又は組成物を指す。特に、それは抗ＣＴＬＡ‐４抗体、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び抗ＳＩＲＰａ抗体を包含する。更に、２つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を併用して、適応免疫細胞及び自然免疫細胞の両方を標的とすることが可能となる。このアプローチは癌の治療において特に興味深い。この目的により、抗ＳＩＲＰａ化合物を抗ＰＤ‐Ｌ１化合物と併用することが可能になる。特に癌の治療では、このような併用を複数同時に個別に、又は連続的に使用可能である。
【0071】
対照的に、「免疫チェックポイント刺激剤」は、免疫チェックポイントを活性化する任意の薬物、分子又は組成物を指す。標的細胞活性化をもたらす共刺激分子を刺激するこのような分子又は薬物は例えば抗ＣＤ１３７抗体である。
【0072】
必要に応じて、他の定義を以下に特定する。
【0073】
本発明の第１の態様は、マクロファージ分極を改変することが可能で、特に抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能な抗ＳＩＲＰａ化合物の、それを必要とする個体（例えば、ヒト）における使用である。上記のように、マクロファージは組織内で成熟し、刺激の組み合わせに対して動的に応答して活性化され、特殊化された機能的表現型、特定の場合に個体に有害な表現型を獲得する。リンパ球系に関し、マクロファージ活性化について二分類法：従来的（Ｍ１）ｖｓ．代替的（Ｍ２）が提案されている。数種の中間的な機能状態が観察されているが、Ｍ１及びＭ２サブタイプは依然として、Ｍ１が最も炎症促進性の状態であり、Ｍ２がより炎症の低減に関連しているという一連のマクロファージ状態の極端な形態を説明することに適している。
【0074】
「マクロファージ分極を改変する」とは、本明細書では、化合物が、少なくとも表現型及び／又は機能レベルで、治療個体においてマクロファージの異なるサブタイプ間のバランスを改変することを意味する。従って、本発明によれば、個体を抗ＳＩＲＰａ化合物で処理することにより、個体のマクロファージが発現する表面マーカーのプロファイル（ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ２００Ｒ発現の減少、ならびにＣＤ８６及びＣＣＲ７発現の増加を含む）、ならびに個体のマクロファージが発現及び／又は分泌するケモカイン及びサイトカインのプロファイル（ＣＣＬ‐１７発現の減少、及びＩＬ６、ＴＮＦ‐α及びＩＬ１２ｐ４０発現の増加を含む）が改変される。
【0075】
本発明の特定の実施形態によれば、抗ＳＩＲＰａ化合物によるマクロファージ分極の改変には、Ｍ２型マクロファージ分極の阻害、及び／又は炎症促進性Ｍ１型マクロファージ分極の増加が含まれる。特に、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ２００Ｒなどの細胞マーカーを過剰発現し、また／あるいはＣＣＬ１７などのサイトカインを産生するマクロファージの割合を減少させるマクロファージのＭ２表現型分極の阻害が含まれ得る。同時に、抗ＳＩＲＰａ化合物は、Ｍ１表現型分極を示す更に多くのマクロファージの出現、ならびにＣＤ８６及びＣＣＲ７などの細胞マーカーを過剰発現し、また／あるいはＩＬ‐６、ＩＬ‐１２ｐ４０及び／又はＴＮＦ‐αなどのサイトカインを産生するマクロファージの割合増加を誘導できる。従って抗‐ＳＩＲＰａ化合物は、表現型レベル（細胞表面マーカーの発現）及び機能レベル（ケモカイン及びサイトカインの産生）の両方でマクロファージ分極を調節できる。
【0076】
本発明の好ましい実施形態によれば、マクロファージ分極を改変するために使用される化合物は抗‐ＳＩＲＰａ化合物である。本出願の意味において、所与の化合物が抗ＳＩＲＰａ化合物であるかどうかを決定するための例示的な試験は上記に記載している。
【0077】
本発明に従って使用できる化合物では、小型化学分子、ポリペプチド、アンタゴニストペプチド、抗体及びこれらの断片、特に以下に記載の実験で使用されるような抗ＳＩＲＰ抗体、多数の抗ＳＩＲＰａの市販抗体、又は任意の他の（新規な）抗ＳＩＲＰａアンタゴニスト抗体から選択される任意の他の抗体、抗体の断片、ＳＩＲＰａを標的とするアプタマー等が挙げられる。
【0078】
本発明は、それを必要とする個体においてＭ１炎症促進性マクロファージに有利に働くようにマクロファージ分極を改変するための、抗ＳＩＲＰａ化合物をコードする核酸（ｍＲＮＡ又はＤＮＡ）の使用にも関する。実際、患者の細胞により上記のように抗ＳＩＲＰａ化合物の発現をもたらす核酸を投与することは、マクロファージ分極に対する所望の効果を得るための１つの選択可能性である。当業者は、任意の調節要素を有する任意の発現カセット、及び任意のベクター（ポリマー、カチオン及び／もしくはリポソームなどの脂質ベクター、又はアデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）などのウイルスベクター）を自由に選択し、適切な数の患者細胞において適切なレベルで抗ＳＩＲＰａ化合物を発現できる。本発明の詳細な実施形態の以下の説明において、抗ＳＩＲＰａの発現を可能にする核酸が抗ＳＩＲＰａ化合物自体の代わりに使用できる旨は反復しないこととする。本明細書では、用語「抗ＳＩＲＰａ化合物」はこのような化合物のインビボ発現を可能にする核酸を包含すると考えられている。
【0079】
特に、抗ＳＩＲＰａ化合物は、アンタゴニストペプチド、抗ＳＩＲＰａ抗体、特に抗ＳＩＲＰａアンタゴニスト抗体、このような化合物をコードする核酸、ＳＩＲＰａタンパク質の発現を阻害し得る化合物、特にｓｉＲＮＡから成る群より選択される。好ましくは、抗ＳＩＲＰａ化合物は、アンタゴニストペプチド、又は抗ＳＩＲＰａ抗体、特に抗ＳＩＲＰａアンタゴニスト抗体である。
【0080】
Ｍ１炎症促進性細胞に有利に働くようにマクロファージ分極を改変することは、多数の病態又は状況において有用になり得る。上記のように、この改変は、癌の状況において、マクロファージの抗腫瘍活性を回復させ、また／あるいはＭ２型マクロファージの腫瘍促進活性を阻止するために特に有用である。実際、過剰なＭ２型マクロファージ分極による免疫応答は感染症、ワクチン接種、外傷及び慢性炎症性疾患においても生じる。
【0081】
マクロファージは修復や再構築機能を制御するために幹細胞又は前駆細胞と相互作用すると考えられている。マクロファージ系統由来の細胞は数種の神経保護効果を呈する。間葉細胞（ＭＳＣ）は組織修復及び免疫調節を促進するために標的にされる。ＭＳＣの注射は、軸索保存及び恐怖形成の減少といった脊髄損傷の機能回復のための利点と関連していた。神経保護効果は、ＭＳＣ（Ｎａｋａｊｉｍａら、２０１２年）によるＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの分極のシフトに起因し、このことは、抗ＳＩＲＰａ化合物など、このシフトを可能にする分子であればどのような分子でも神経保護効果を示し得ることを示している。
【0082】
マクロファージは、鉄恒常性が明らかに損なわれている血色素症などのいくつかの鉄欠乏症にも関与している。真性赤血球増加症又は基本的な１次性赤血球増加症は、赤血球増加症（赤血球数の大幅な増加）及び総細胞量の増加を特徴とする骨髄増殖性疾患である。赤血球はその後、血液中に入り、骨髄増殖性症候群に進行する可能性がある。抗ＣＤ４７で治療された患者は貧血を呈し、このことは、本発明の意味合いにおいてＣＤ４７の遮断が予想されるほど安全でないこと；抗ＳＩＲＰａ化合物を介してＳＩＲＰａを標的にするとこの副作用を回避できること、を示している。
【0083】
従って、本発明は癌、感染症、外傷、自己免疫疾患、神経疾患 脳損傷、神経損傷、赤血球増加症、血色素症又は慢性炎症性疾患に罹患した個体において、ならびに個体のワクチン接種の環境において、Ｍ１炎症促進性マクロファージに有利に働くようにマクロファージ分極を改変するための、抗ＳＩＲＰａ化合物の使用に関する。
【0084】
特定の実施形態によれば、抗ＳＩＲＰａ化合物は肺癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸癌、胸腺腫、神経膠腫、黒色腫及び血液癌から成る群より選択される癌の個体を治療するために使用する。
【0085】
特定の実施形態では、抗ＳＩＲＰａ化合物はＳＩＲＰａ陽性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を除くあらゆる癌の治療に使用される。従って実際、ＳＩＲＰａを発現するＡＭＬに関与する腫瘍細胞の治療は、腫瘍細胞を対象とし、すなわち腫瘍を直接に標的とすることにより行われる。よってこの治療戦略は本発明で提案した間接的アプローチとは異なる。より特有の実施形態では、抗ＳＩＲＰａ化合物は、ＳＩＲＰａ陽性急性骨髄性白血病及びＳＩＲＰａ陽性非急性骨髄性白血病を除くあらゆる癌の治療に使用する。別の特定の実施形態では、抗ＳＩＲＰａ化合物はＳＩＲＰａ陽性非ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫を除くあらゆる癌の治療に使用する。更なる特定の実施形態では、抗ＳＩＲＰａ化合物は、ＳＩＲＰａ陽性急性骨髄性白血病及び／又はＳＩＲａ陽性非急性骨髄性白血病及び／又は非ホジキンリンパ腫又は血液癌を除くあらゆる癌の治療に使用する。更なる実施形態では、抗ＳＩＲＰａ化合物は、ｉ）ＳＩＲＰａ陽性急性骨髄性白血病もしくは急性骨髄性白血病、及び／又はｉｉ）ＳＩＲＰａ陽性非急性骨髄性白血病又は非急性骨髄性白血病、及び／又はｉｉｉ）ＳＩＲＰａ陽性非ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫、又はｉｖ）ＳＩＲＰａ陽性血液癌もしくは血液癌を除くあらゆる癌の治療に使用する。更なる実施形態では、本明細書で後述しているように、抗ＳＩＲＰａ化合物はＳＩＲＰａ陰性腫瘍細胞による癌の治療に使用する。
【0086】
別の特定の実施形態では、抗ＳＩＲＰａ化合物は単独療法、特に乳癌、肝細胞癌又は黒色腫の治療において使用する。
【0087】
調節マクロファージ分極は、癌の治療、特に癌の併用療法のための非常に魅力的なアプローチである。Ａｎｔｏｎｉａら（Ａｎｔｏｎｉａら、２０１４年）はチェックポイント阻害剤アプローチを用いた癌治療にとって興味深いものとなる可能性がある免疫腫瘍学的併用を定義した。免疫腫瘍学は、患者自身の免疫系を活かすように設計した免疫療法を含む進化しつつある治療法である。
【0088】
この文脈において、本発明の意味合いでは、抗ＳＩＲＰａ化合物は、臨床開発中又は既に市販されている薬剤により腫瘍免疫回避メカニズムを克服するためのいくつかの他の可能性ある戦略：
１‐例えば抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１又はＰＤ‐Ｌ１分子の使用による、適応免疫の阻害の制止（Ｔ細胞チェックポイント経路の遮断）；
２‐例えば抗ＣＤ１３７分子の使用による、適応免疫の切り替え（アゴニスト抗体を用いたＴ細胞共刺激受容体シグナル伝達の促進）；
３‐自然免疫細胞の機能の改善；
４‐例えばワクチンに基づく戦略による、免疫系の活性化（免疫細胞エフェクター機能の増強）
と併用することが可能である（（Ａｎｔｏｎｉａら、２０１４年）の表１参照）。
１‐例えば抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１又はＰＤ‐Ｌ１分子の使用による、適応免疫の阻害の制止（Ｔ細胞チェックポイント経路の遮断）；
２‐例えば抗ＣＤ１３７分子の使用による、適応免疫の切り替え（アゴニスト抗体を用いたＴ細胞共刺激受容体シグナル伝達の促進）；
３‐自然免疫細胞の機能の改善；
４‐例えばワクチンに基づく戦略による、免疫系の活性化（免疫細胞エフェクター機能の増強）
と併用することが可能である（（Ａｎｔｏｎｉａら、２０１４年）の表１参照）。
【0089】
最近、Ｚｉｔｖｏｇｅｌらは最適な治療的免疫調節における腸内微生物の重要性を力説している（Ｖｉａｕｄら、２０１４年；ＷＯ２０１５／０７５６８８）。本発明の枠組みにおいて、抗ＳＩＲＰａ化合物は抗癌免疫応答を改善するために微生物調節戦略と併用することも可能である。
【0090】
従って本発明の別の態様は、それを必要とする個体、特に癌患者を治療するための、第２の治療剤と併用した上記で定義したような抗ＳＩＲＰａ化合物の使用である。このような併用は、特に癌の治療において、同時に個別に、又は連続的に使用することが可能である。
【0091】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、第２の治療剤は化学療法剤、放射線療法、外科手術、免疫療法剤、抗生物質及びプロバイオティクスから成る群より選択される。特に、第２の治療剤は好都合にも、治療用ワクチン、例えば抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイント遮断薬、ならびに例えば抗ＣＤ１３７などの免疫チェックポイント活性化剤から成る群より選択することが可能である。下記の実験パートに例示されるように、これらの併用は相乗効果を生む。特に、本発明の１態様は、肝細胞癌又は黒色腫から選択する癌の治療において第２の免疫チェックポイント調節因子と併用した抗ＳＩＲＰａ化合物の使用にある。好ましい実施形態では、肝細胞癌の治療において抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂを抗ＣＤ１３７ ｍＡｂと併用する。本発明の別の態様では、黒色腫の治療において抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂを抗ＰＤ‐Ｌ１ ｍＡｂと併用する。
【0092】
本発明の別の態様は、マクロファージを上記のような抗ＳＩＲＰａ化合物と共にインキュベートする工程を含む、炎症促進性Ｍ１型マクロファージを生体外で得る方法である。この方法は、例えば細胞療法において、特に癌患者に有用になり得る。本文書はまた、上記患者からマクロファージを得る工程、その後の、抗ＳＩＲＰａ化合物とのインキュベーションによりＭ１関連炎症促進性機能に有利に働くようにそれらの分極を改変する工程、及び得られた炎症促進性細胞を患者に再投与する工程を含む、癌患者を治療する方法も報告している。当然ながら、このような方法には追加的な工程（細胞を増殖させ、Ｍ１型表現型を示す細胞を選択し、また／あるいはＭ２型表現型を示す細胞を対向選択する工程など）を導入することが可能である。
【0093】
その別の態様によれば、本発明は上記で定義した抗ＳＩＲＰａ化合物による治療の有効性をインビボで判定する方法に関するものであり、当該方法には、炎症促進性Ｍ１型マクロファージの存在を測定する工程、及び／又は上記化合物で治療した個体由来の試料中でＭ２型マクロファージの存在を測定する工程が含まれる。当該方法を実施する場合、炎症促進性マクロファージの存在は、例えば試料中に存在するマクロファージが分泌するＩＬ６、ＴＮＦ‐α及び／又はＩＬ１２ｐ４０のレベルを測定することにより測定できる。Ｍ２型マクロファージの存在は、例えばマクロファージ表面上のＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ２００Ｒの発現を測定することにより測定できる。
【0094】
抗ＳＩＲＰａ化合物での不要な治療を避けるため、このような治療から利益を受ける可能性の高い患者、すなわちこの治療が効率的である患者を正確に同定することが最重要である。高レベルのＭ２型マクロファージを呈する患者、特に多量の腫瘍浸潤性Ｍ２型マクロファージを有する癌患者は、本発明に従った抗ＳＩＲＰａでの治療に応答する可能性が最も高い患者である。
【0095】
本発明の１態様は、ＳＩＲＰａ陰性腫瘍を呈する患者を治療すること、すなわち腫瘍細胞がＳＩＲＰａを発現しない患者に抗ＳＩＲＰａ化合物の単独使用又は併用を提案することである。癌の治療が腫瘍細胞レベルで（特に貪食作用を誘導することにより）ＳＩＲＰａ‐ＣＤ４７相互作用の阻害に依存していると先行技術が教示しているように、この治療アプローチはこれまで想定できなかった。これに対して、本発明者らは、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂは貪食作用を誘導せず、個別の経路に作用することを実証した。彼らは、抗ＳＩＰＲａ化合物がＭ２型マクロファージを標的とし、このマクロファージ集団をＭ１型マクロファージに再分極させることを実証した。従って、提案された発明は、以前に報告されていない「新たな臨床状況」にも対応する。請求した発明と先行技術の教示との間に更に差を付けることとして、本発明の抗‐ＳＩＲＰα化合物は、自然免疫系を標的とする間接的アプローチにより、特に腫瘍環境における炎症の阻害を阻止することにより、より具体的には、抗炎症性Ｍ２型マクロファージを阻害することにより癌を治療する。
【0096】
従って、本発明の目的は癌治療における抗ＳＩＲＰａ化合物の使用にあり、ここではＳＩＲＰａ陰性腫瘍を呈する患者に当該化合物を投与する。本明細書中で使用しているように、「ＳＩＲＰａ陰性腫瘍」は、ＳＩＲＰａ陰性細胞集団を含む腫瘍に相当する。しかし腫瘍の異種性を考慮すると、この用語は、ＳＩＲＰａ陰性細胞から成る腫瘍と、ＳＩＲＰａ陽性腫瘍細胞及びＳＩＲＰａ陰性腫瘍細胞の混合集団を含み得る腫瘍との両方を包含している。特定の実施形態では、本発明はまた、患者の腫瘍がＳＩＲＰａ陽性細胞及びＳＩＲＰａ陰性細胞の両方を含む腫瘍細胞の混合集団を含む癌を治療するための上記化合物の使用に関する。
【0097】
本発明はまた、抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能な抗ＳＩＲＰａ化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む癌治療方法を提供する。
【0098】
特定の実施形態では、本発明はまた、癌治療に使用するための
― 抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能であり、特に、当該抗ＳＩＲＰａ化合物は、アンタゴニストペプチド、抗ＳＩＲＰａ抗体、特に抗ＳＩＲＰａアンタゴニスト抗体、このような化合物をコードする核酸、及びＳＩＲＰａタンパク質の発現を阻害可能な化合物、特にｓｉＲＮＡの群より選択される、少なくとも１種の抗ＳＩＲＰａ化合物；ならびに
― 特に、抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４及び抗ＣＤ１３７から成る群より選択される別の免疫チェックポイント化合物である第２の治療剤；
を含む混成生成物に関する。特定の実施形態では、当該混成生成物はＳＩＲＰａ陽性急性骨髄性白血病を除く癌を治療するために使用する。
― 抗炎症性Ｍ２型マクロファージの分極を阻害し、また／あるいは炎症促進性Ｍ１型マクロファージに有利に働くことが可能であり、特に、当該抗ＳＩＲＰａ化合物は、アンタゴニストペプチド、抗ＳＩＲＰａ抗体、特に抗ＳＩＲＰａアンタゴニスト抗体、このような化合物をコードする核酸、及びＳＩＲＰａタンパク質の発現を阻害可能な化合物、特にｓｉＲＮＡの群より選択される、少なくとも１種の抗ＳＩＲＰａ化合物；ならびに
― 特に、抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４及び抗ＣＤ１３７から成る群より選択される別の免疫チェックポイント化合物である第２の治療剤；
を含む混成生成物に関する。特定の実施形態では、当該混成生成物はＳＩＲＰａ陽性急性骨髄性白血病を除く癌を治療するために使用する。
【0099】
有利な実施態様は上記で定義した通りである。
【0100】
従って本発明はまた、本発明の意味合いにおいて抗ＳＩＲＰａ化合物による治療に対して個体が良好な応答者である可能性があるか否かをインビボで判定する方法に関するものであり、当該方法には、例えば試料中に存在するマクロファージの表面上のＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ２００Ｒの発現を測定することにより上記個体由来の試料におけるＭ２型マクロファージの存在を測定する工程が含まれる。
【0101】
上記の方法を実施する場合、抗ＳＩＲＰａ化合物による治療に対して個体が良好な応答者である可能性があるか否かを評価するために、又はそのような治療の有効性を判定するために使用される試料は、血液試料、組織試料、腫瘍由来試料、滑液の試料とすることが可能である。
【実施例】
【0102】
以下に開示される実験パート全体にわたって、使用される用語はマクロファージについて研究している科学団体に従う（Ｍｕｒｒａｙら、２０１４年）。
実験結果は以下に示す材料及び方法により得た。
実験結果は以下に示す材料及び方法により得た。
【0103】
ヒト血中単球細胞単離
Ｃｏｕｌａｉｓら（Ｃｏｕｌａｉｓら、２０１２年）が使用し、報告したプロトコルにより、遠心分離向流洗浄（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ＣＩＣＢＴ０５０３、Ｄｒ．Ｍ．Ｇｒｅｇｏｉｒｅ、Ｎａｎｔｅｓ）を利用してＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離し、精製した。
Ｃｏｕｌａｉｓら（Ｃｏｕｌａｉｓら、２０１２年）が使用し、報告したプロトコルにより、遠心分離向流洗浄（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ＣＩＣＢＴ０５０３、Ｄｒ．Ｍ．Ｇｒｅｇｏｉｒｅ、Ｎａｎｔｅｓ）を利用してＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離し、精製した。
【0104】
遮断抗体
実験において試験した全ての遮断分子を１０μｇ／ｍＬで使用した。
ＳＩＲＰａ ｍＡｂｓ：ＳＥ７Ｃ２（２３８６３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）又はクローンｐ８４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）；Ｓｉｒｐ α／β ｍＡｂｓ：ＳＥ５Ａ５（ＢＬＥ３２３８０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）；抗ＣＤ４７：Ｂ６Ｈ１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １４‐０４７９‐８２）又はＣＣ２Ｃ６（ＢＬＥ３２３１０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）；ＣＤ４７‐Ｆｃ：ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製１２２８３‐Ｈ０２Ｈ；抗ＣＤ１３７抗体（自家製クローン３Ｈ３）及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製１０Ｆ‐９Ｇ２）。
実験において試験した全ての遮断分子を１０μｇ／ｍＬで使用した。
ＳＩＲＰａ ｍＡｂｓ：ＳＥ７Ｃ２（２３８６３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）又はクローンｐ８４（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）；Ｓｉｒｐ α／β ｍＡｂｓ：ＳＥ５Ａ５（ＢＬＥ３２３８０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）；抗ＣＤ４７：Ｂ６Ｈ１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １４‐０４７９‐８２）又はＣＣ２Ｃ６（ＢＬＥ３２３１０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）；ＣＤ４７‐Ｆｃ：ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製１２２８３‐Ｈ０２Ｈ；抗ＣＤ１３７抗体（自家製クローン３Ｈ３）及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製１０Ｆ‐９Ｇ２）。
【0105】
インビトロＭ‐ＣＳＦ＋（ＩＦＮｇ又はＩＬ４）マクロファージ分極アッセイ（Ｍ１又はＭ２型）
２４ウェルプレートにおいて単球を、完全ＲＰＭＩ中、４．１０５細胞個／ウェルで Ｍ‐ＣＳＦ（１００μｇ／ｍＬ‐Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）中に５～６日間培養して従来の分化法（Ｚａｊａｃら、２０１３年）を行い、Ｍ０マクロファージを誘導した。２日間かけて、ｒｈＩＬ‐４（２０ｎｇ／ｍＬ‐ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）によりＭ２分極を誘導してＭ２抗炎症性マクロファージを生成するか、又はｒｈＩＦＮｇ＋／－ＬＰＳ（それぞれ２０ｎｇ／ｍＬ‐Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社；１００ｎｇ／ｍＬ‐Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりＭ１炎症促進性マクロファージを生成し、その後、細胞を採取し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
２４ウェルプレートにおいて単球を、完全ＲＰＭＩ中、４．１０５細胞個／ウェルで Ｍ‐ＣＳＦ（１００μｇ／ｍＬ‐Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）中に５～６日間培養して従来の分化法（Ｚａｊａｃら、２０１３年）を行い、Ｍ０マクロファージを誘導した。２日間かけて、ｒｈＩＬ‐４（２０ｎｇ／ｍＬ‐ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）によりＭ２分極を誘導してＭ２抗炎症性マクロファージを生成するか、又はｒｈＩＦＮｇ＋／－ＬＰＳ（それぞれ２０ｎｇ／ｍＬ‐Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社；１００ｎｇ／ｍＬ‐Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりＭ１炎症促進性マクロファージを生成し、その後、細胞を採取し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
【0106】
インビトロＣＳＦ＋ＧＭ‐ＣＳＦマクロファージ分極アッセイ（Ｍ１及びＭ２型）
同一ウェル内でのＭ１／Ｍ２分化は、ＧＭ‐ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ‐ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）を含む完全ＲＰＭＩ中、４．１０５細胞個／ウェルで、２４ウェルプレート中に単球を３日間培養し、次いでＧＭ‐ＣＳＦ及びＭ‐ＣＳＦ（それぞれ２ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）と共に更に３日間培養して実施した（Ｈａｅｇｅｌら、２０１３年）。抗体を０日目及び３日目に添加した。６日目に、細胞を採取し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
分泌されたサイトカインをＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）により滴定した。
同一ウェル内でのＭ１／Ｍ２分化は、ＧＭ‐ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ‐ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）を含む完全ＲＰＭＩ中、４．１０５細胞個／ウェルで、２４ウェルプレート中に単球を３日間培養し、次いでＧＭ‐ＣＳＦ及びＭ‐ＣＳＦ（それぞれ２ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）と共に更に３日間培養して実施した（Ｈａｅｇｅｌら、２０１３年）。抗体を０日目及び３日目に添加した。６日目に、細胞を採取し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
分泌されたサイトカインをＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）により滴定した。
【0107】
フローサイトメトリーによるマクロファージ表現型
インビトロマウスマクロファージ分化は、マウスＭ‐ＣＳＦ（１００μｇ／ｍＬ－ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を補充し、完全ＲＰＭＩ中、０、５．１０６細胞個／ｍＬで、２４ウェルプレート中に骨髄由来細胞を４日間培養して実施し、Ｍ０マクロファージを誘導した。２４時間かけて、マウスＩＬ‐４（２０ｎｇ／ｍＬ‐ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）によりＭ２分極を誘導してＭ２抗炎症性マクロファージを生成する。表現型変化の分析は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製抗体を用いてフローサイトメトリー染色により行った。
マクロファージの発現マーカーを、下記表に示す蛍光色素として使用し、フローサイトメトリーにより分析した。
インビトロマウスマクロファージ分化は、マウスＭ‐ＣＳＦ（１００μｇ／ｍＬ－ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を補充し、完全ＲＰＭＩ中、０、５．１０６細胞個／ｍＬで、２４ウェルプレート中に骨髄由来細胞を４日間培養して実施し、Ｍ０マクロファージを誘導した。２４時間かけて、マウスＩＬ‐４（２０ｎｇ／ｍＬ‐ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）によりＭ２分極を誘導してＭ２抗炎症性マクロファージを生成する。表現型変化の分析は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製抗体を用いてフローサイトメトリー染色により行った。
マクロファージの発現マーカーを、下記表に示す蛍光色素として使用し、フローサイトメトリーにより分析した。
【0108】
【表1】
【0109】
多重ナノフレアによるｉＮＯＳ測定
ｉＮＯＳ発現はＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（商標）技術により明らかにされた（Ｐｒｉｇｏｄｉｃｈら、２０１２年）。簡潔には、単球又はマクロファージを回収し、ｉＮＯＳプローブ（最終濃度１ｎＭ）と共に４℃で２時間インキュベートし、洗浄し、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ社）で分析した。
ｉＮＯＳ発現はＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（商標）技術により明らかにされた（Ｐｒｉｇｏｄｉｃｈら、２０１２年）。簡潔には、単球又はマクロファージを回収し、ｉＮＯＳプローブ（最終濃度１ｎＭ）と共に４℃で２時間インキュベートし、洗浄し、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ社）で分析した。
【0110】
ｓｉＲＮＡ実験
内因性ＳＩＲＰａをコードするｓｉＲＮＡをマクロファージ（Ｍ‐ＣＳＦにより事前に分極したＭ０マクロファージ）にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡの３配列（参照番号：１１２３２８、１１２３２７及び１０９９４４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を選択し、貯蔵し、ＳＩＲＰａ発現を下方制御した。２４ウェルプレートにおいて、９０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ‐ＳＩＲＰａ（各ｓｉＲＮＡ‐ＳＩＲＰａの３×３０ｐｍｏｌ）を、血清を含まない１００μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地で希釈し、静かに混合した。次いで、１μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（参照番号１３７７８‐１５０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を混合し、室温で２０分間インキュベートした。Ｍ２を、ＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）＋／－１００μｌのｓｉＲＮＡ‐リポフェクタミン複合体を含む５００μｌの完全増殖培地に１００，０００細胞個／ｍｌで播種した。Ｎｕｌｌ‐ｓｉＲＮＡをトランスフェクションの対照として使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間インキュベートした。
内因性ＳＩＲＰａをコードするｓｉＲＮＡをマクロファージ（Ｍ‐ＣＳＦにより事前に分極したＭ０マクロファージ）にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡの３配列（参照番号：１１２３２８、１１２３２７及び１０９９４４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を選択し、貯蔵し、ＳＩＲＰａ発現を下方制御した。２４ウェルプレートにおいて、９０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ‐ＳＩＲＰａ（各ｓｉＲＮＡ‐ＳＩＲＰａの３×３０ｐｍｏｌ）を、血清を含まない１００μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地で希釈し、静かに混合した。次いで、１μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（参照番号１３７７８‐１５０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を混合し、室温で２０分間インキュベートした。Ｍ２を、ＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）＋／－１００μｌのｓｉＲＮＡ‐リポフェクタミン複合体を含む５００μｌの完全増殖培地に１００，０００細胞個／ｍｌで播種した。Ｎｕｌｌ‐ｓｉＲＮＡをトランスフェクションの対照として使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間インキュベートした。
【0111】
Ｅｌｉｓａによる機能アッセイ
上清中に放出されたサイトカイン及びケモカインを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社の材料（参照番号は下記参照）を用いてＥｌｉｓａにより分析した。上清を１／２００に希釈した。
上清中に放出されたサイトカイン及びケモカインを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社の材料（参照番号は下記参照）を用いてＥｌｉｓａにより分析した。上清を１／２００に希釈した。
【0112】
【表2】
【0113】
アイソタイプ対照抗体として、ＰＫ１３６抗ＮＫ１．１（マウスｍＡｂ ＩｇＧ２ａ）及びＳＦ１－１．１抗Ｈ２Ｋｄ（マウスｍＡｂ ＩｇＧ１）を用いた。
【0114】
ヒトマクロファージの貪食活性の評価
貪食作用を誘導する抗ＳＩＲＰａ抗体の能力を主張するため、前述したようにヒトＭ１炎症促進性マクロファージを生成し、蛍光色素で染色した。ＣＤ４７発現Ｒａｊｉ細胞を別の蛍光色素で染色し、Ｍ１染色したマクロファージと共に３７℃で２時間インキュベートした。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、貪食作用の分析は、Ｍ１蛍光マクロファージでのゲーティングによるフローサイトメトリー、及びＭ１マクロファージへの標的（Ｒａｊｉ）細胞蛍光の分析により評価した。
貪食作用を誘導する抗ＳＩＲＰａ抗体の能力を主張するため、前述したようにヒトＭ１炎症促進性マクロファージを生成し、蛍光色素で染色した。ＣＤ４７発現Ｒａｊｉ細胞を別の蛍光色素で染色し、Ｍ１染色したマクロファージと共に３７℃で２時間インキュベートした。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、貪食作用の分析は、Ｍ１蛍光マクロファージでのゲーティングによるフローサイトメトリー、及びＭ１マクロファージへの標的（Ｒａｊｉ）細胞蛍光の分析により評価した。
【0115】
インビボマウス肝細胞癌モデル
上述したように、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、門脈を介して１００μＬ中２．５×１０６個のＨｅｐａ１．６マウス肝癌細胞を接種した（Ｇａｕｔｔｉｅｒら、２０１４年）。腫瘍接種の４日後及び８日後に、１００μｇのラット抗４‐１ＢＢ ｍＡｂ（自家製クローン３Ｈ３）、もしくは３００μｇの抗マウスＳＩＲＰａモノクローナル抗体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製クローンＰ８４）もしくはその両方、又は無関係の対照抗体（クローン３Ｇ８）を週３回、４週間腹腔内注射し、あるいは２００μｇの抗ＰＤ‐Ｌ１ ｍＡｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製クローン１０Ｆ‐９Ｇ２）、又は両抗体（抗Ｓｉｒｐａ＋抗ＰＤＬ１）を４週間注射した。
上述したように、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、門脈を介して１００μＬ中２．５×１０６個のＨｅｐａ１．６マウス肝癌細胞を接種した（Ｇａｕｔｔｉｅｒら、２０１４年）。腫瘍接種の４日後及び８日後に、１００μｇのラット抗４‐１ＢＢ ｍＡｂ（自家製クローン３Ｈ３）、もしくは３００μｇの抗マウスＳＩＲＰａモノクローナル抗体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製クローンＰ８４）もしくはその両方、又は無関係の対照抗体（クローン３Ｇ８）を週３回、４週間腹腔内注射し、あるいは２００μｇの抗ＰＤ‐Ｌ１ ｍＡｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製クローン１０Ｆ‐９Ｇ２）、又は両抗体（抗Ｓｉｒｐａ＋抗ＰＤＬ１）を４週間注射した。
【0116】
インビボマウス黒色腫モデル
８週齢のＣ５７Ｂ１／６Ｊ雄マウスの側腹部に２×１０６個のＢ１６‐Ｏｖａマウス黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種０日目から、マウスに３００μｇの無関係な対照抗体（クローン３Ｇ８）又は抗マウスＳＩＲＰａモノクローナル抗体（クローンＰ８４）を週３回、もしくは２００μｇの抗ＰＤ‐Ｌ１ ｍＡｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製クローン１０Ｆ‐９Ｇ２）を週２回、のいずれかで腹腔内投与するか、又は両抗体（抗Ｓｉｒｐａ及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体）を４週間投与した。腫瘍接種後２週間目に数頭の動物を屠殺し、フローサイトメトリーにより腫瘍白血球浸潤を特徴付けた。全生存率を分析した。
８週齢のＣ５７Ｂ１／６Ｊ雄マウスの側腹部に２×１０６個のＢ１６‐Ｏｖａマウス黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種０日目から、マウスに３００μｇの無関係な対照抗体（クローン３Ｇ８）又は抗マウスＳＩＲＰａモノクローナル抗体（クローンＰ８４）を週３回、もしくは２００μｇの抗ＰＤ‐Ｌ１ ｍＡｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製クローン１０Ｆ‐９Ｇ２）を週２回、のいずれかで腹腔内投与するか、又は両抗体（抗Ｓｉｒｐａ及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体）を４週間投与した。腫瘍接種後２週間目に数頭の動物を屠殺し、フローサイトメトリーにより腫瘍白血球浸潤を特徴付けた。全生存率を分析した。
【0117】
インビボマウス乳癌モデル
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスの乳腺に０、２５×１０６個の４Ｔ１（乳癌）細胞を５０μＬ注射した。腫瘍接種後４日目から、マウスに３００μｇの無関係な対照抗体（クローン３Ｇ８）又は抗マウスＳＩＲＰａ遮断抗体（クローンＰ８４）を週３回、４週間腹腔内投与した。腫瘍接種から６週間後にマウスを安楽死させた。腫瘍の測定を２～３日毎に行い、腫瘍体積を計算：長さ×幅×Ｐｉ／６（ｍｍ３）に従って求めた。
８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスの乳腺に０、２５×１０６個の４Ｔ１（乳癌）細胞を５０μＬ注射した。腫瘍接種後４日目から、マウスに３００μｇの無関係な対照抗体（クローン３Ｇ８）又は抗マウスＳＩＲＰａ遮断抗体（クローンＰ８４）を週３回、４週間腹腔内投与した。腫瘍接種から６週間後にマウスを安楽死させた。腫瘍の測定を２～３日毎に行い、腫瘍体積を計算：長さ×幅×Ｐｉ／６（ｍｍ３）に従って求めた。
【0118】
実施例１：マクロファージ分極（Ｍ１及びＭ２）のインビトロ試験及びＳＩＲＰａ経路の遮断
１．１． Ｓｉｒｐαの選択的遮断は２型（Ｍ２）ではヒトマクロファージ分極を阻止するが、１型（Ｍ１）では阻止しない
図１Ａは、Ｍ１細胞表面マーカー（ＣＤ８６及びＣＣＲ７）の発現が対照条件と比較して改変されていないため、ＳＩＲＰ分子又はＣＤ４７に対する抗体がＧＭ‐ＣＳＦ＋Ｍ‐ＣＳＦに誘導されるＭ１マクロファージ分極を阻止していないことを示す。対照的に、ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ１１ｂ及びＰＤ‐Ｌ１の過剰発現（Ｍ２マクロファージ表現型の指標）は選択的な抗ＳＩＲＰα ｍＡｂ（図２Ａ及び図１１）では有意に阻害されたが、対照抗体（抗ＳＩＲＰａ／ｂ又はＳｉｒｐｂ）、ＣＤ４７‐Ｆｃ組換えタンパク質又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（クローンＢ６Ｈ１２及びＣＣ２Ｃ６）では阻害されなかった。特に図１１から、モノクローナル抗体によるＳＩＲＰａの遮断が、ＩＬ‐４に誘導されるＭ２マクロファージ表現型の獲得を阻止し、実際にＭ２マーカー（ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ及びＰＤ‐Ｌ１）の発現は上昇しなかったが、アイソタイプ対照条件では上昇が観察されたことが分かる。マクロファージの抗炎症状態のこの阻止は、ＳＩＲＰａ（ＣＤ４７）の同種リガンドがモノクローナル抗体で遮断された場合には観察されなかった。
１．１． Ｓｉｒｐαの選択的遮断は２型（Ｍ２）ではヒトマクロファージ分極を阻止するが、１型（Ｍ１）では阻止しない
図１Ａは、Ｍ１細胞表面マーカー（ＣＤ８６及びＣＣＲ７）の発現が対照条件と比較して改変されていないため、ＳＩＲＰ分子又はＣＤ４７に対する抗体がＧＭ‐ＣＳＦ＋Ｍ‐ＣＳＦに誘導されるＭ１マクロファージ分極を阻止していないことを示す。対照的に、ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ１１ｂ及びＰＤ‐Ｌ１の過剰発現（Ｍ２マクロファージ表現型の指標）は選択的な抗ＳＩＲＰα ｍＡｂ（図２Ａ及び図１１）では有意に阻害されたが、対照抗体（抗ＳＩＲＰａ／ｂ又はＳｉｒｐｂ）、ＣＤ４７‐Ｆｃ組換えタンパク質又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（クローンＢ６Ｈ１２及びＣＣ２Ｃ６）では阻害されなかった。特に図１１から、モノクローナル抗体によるＳＩＲＰａの遮断が、ＩＬ‐４に誘導されるＭ２マクロファージ表現型の獲得を阻止し、実際にＭ２マーカー（ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ及びＰＤ‐Ｌ１）の発現は上昇しなかったが、アイソタイプ対照条件では上昇が観察されたことが分かる。マクロファージの抗炎症状態のこの阻止は、ＳＩＲＰａ（ＣＤ４７）の同種リガンドがモノクローナル抗体で遮断された場合には観察されなかった。
【0119】
サイトカイン及びケモカイン分泌の測定から、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂはＣＣＬ‐１７分泌（Ｍ２分泌の指標となるケモカイン）を阻止する一方で、Ｍ１マクロファージが分泌した炎症促進性サイトカイン（ＩＬ‐６、ＩＬ１２ｐ４０、ＴＮＦ‐α）及びケモカイン（ＣＣＬ‐２）は増加させることが分かった（図１Ｂ及び２Ｂ）。従って、抗ＳＩＲＰａはＭ２分極の阻止及びマクロファージの炎症促進機能の役割を担っていると思われる。Ｍ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４プロトコルに従って単球をＭ２（Ｍ１でない）マクロファージにおいてのみ高分化させた場合、抗ＳＩＲａ ｍＡｂのみによるＭ２マクロファージ分極の選択的阻害が確認されたが、一方、単球をＭ‐ＣＳＦ＋ＩＦＮγで処理した場合、Ｍ１分極は改変されなかった（データなし）。ここでもまた、ＳＩＲＰａ ｍＡｂ（他の抗ＳＩＲＰ分子ｍＡｂ又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂではなく）のみが、Ｍ２（ＣＤ２０６及びＣＤ２００Ｒ）に特有の表面マーカーの過剰発現を阻止し、同時にＩＬ‐６炎症促進性サイトカイン分泌を増加させた（図５Ｂ）。次に、ｓｉＲＮＡカクテルを用いてＳＩＲＰａ阻害を伴う転写レベルでＭ２分極に対するＳＩＲＰａの役割を調べた。図６Ａに示す結果から、ＳＩＲＰａの阻害により細胞のＭ２分極（ＣＤ２０６及びＣＤ２００Ｒ発現）が阻害されることが確認できた。
【0120】
まとめると、これらの結果から、抗ＳＩＲＰａ抗体を用いるが抗ＣＤ４７抗体は用いずにＳＩＰＲａ‐ＣＤ４７相互作用を阻害することにより、Ｍ２型マクロファージを阻害できることが実証されている。更に、表現型レベル（Ｍ２特異的表面マーカーの発現の阻害）及び機能レベル（Ｍ２特異的サイトカイン分泌の阻害）の両方において、Ｍ２表現型の阻害が観察される。
【0121】
１．２． ＳＩＲＰａの選択的遮断は炎症促進因子、特徴的なＭ１マクロファージの分泌を増加させる
本発明者らは、ＧＭ‐ＣＳＦ＋Ｍ‐ＣＳＦを用いたＭ１＋Ｍ２分極下で選択的抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂが炎症性サイトカイン分泌（ＩＬ６、ＩＬ１２ｐ４０、ＣＣＬ２及びＴＮＦα）を増加させることを観察した（図１Ｂ）。この特性はＭ‐ＣＳＦ＋ＩＦＮｇ＋／－ＬＰＳに誘導される従来のＭ１（のみの）マクロファージ分極アッセイにおいて確認され（図３）、上清中のＩＬ６及びＩＬ１２ｐ４０の増加が示されている。最大／高度Ｍ１分極は、Ｍ‐ＣＳＦ＋ＩＦＮｇ＋ＬＰＳを用いて達成され、結果的にＭ１マクロファージの全ての指標、特にｉＮＯＳ発現をもたらす。図４は様々な遮断抗体で処理した、又は処理していないＭ１分極細胞におけるｉＮＯＳの発現を示す。この図に示すように、抗体でＳＩＲＰａを遮断することによりｉＮＯＳの発現が増加した。しかし、抗ＳＩＲＰβ又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂはｉＮＯＳ発現プロファイルにおいていかなる改変も誘導しなかった。これらの結果から、ＳＩＲＰａの遮断により、Ｍ１型などの炎症促進状態においてマクロファージ機能が改変されることが確認された。しかし、試験したＭ１表面マーカーは対照と比較して改変されていなかった。
本発明者らは、ＧＭ‐ＣＳＦ＋Ｍ‐ＣＳＦを用いたＭ１＋Ｍ２分極下で選択的抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂが炎症性サイトカイン分泌（ＩＬ６、ＩＬ１２ｐ４０、ＣＣＬ２及びＴＮＦα）を増加させることを観察した（図１Ｂ）。この特性はＭ‐ＣＳＦ＋ＩＦＮｇ＋／－ＬＰＳに誘導される従来のＭ１（のみの）マクロファージ分極アッセイにおいて確認され（図３）、上清中のＩＬ６及びＩＬ１２ｐ４０の増加が示されている。最大／高度Ｍ１分極は、Ｍ‐ＣＳＦ＋ＩＦＮｇ＋ＬＰＳを用いて達成され、結果的にＭ１マクロファージの全ての指標、特にｉＮＯＳ発現をもたらす。図４は様々な遮断抗体で処理した、又は処理していないＭ１分極細胞におけるｉＮＯＳの発現を示す。この図に示すように、抗体でＳＩＲＰａを遮断することによりｉＮＯＳの発現が増加した。しかし、抗ＳＩＲＰβ又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂはｉＮＯＳ発現プロファイルにおいていかなる改変も誘導しなかった。これらの結果から、ＳＩＲＰａの遮断により、Ｍ１型などの炎症促進状態においてマクロファージ機能が改変されることが確認された。しかし、試験したＭ１表面マーカーは対照と比較して改変されていなかった。
【0122】
１．３． ＳＩＲＰａの選択的遮断は炎症細胞においてヒトＭ２マクロファージを再分極する
分極したＭ１／Ｍ２マクロファージの表現型及び機能は、これら細胞の可塑性によりインビトロ又はインビボで、ある程度制止されている（Ｓｉｃａ及びＭａｎｔｏｖａｎｉ、２０１２年）。本発明者らは、ＳＩＲＰａを遮断することにより、炎症促進性Ｍ１型へのＭ２型の再分極の問題に取り組んだ。そのために、Ｍ２高度分極を誘導するＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４と共に単球を培養した。その後、Ｍ２細胞を異なる遮断抗体で処理した。図７に示す結果から、ＩＬ６及びＴＮＦ‐αサイトカイン（Ｍ１マクロファージの指標サイトカイン）が誘導されたので、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂはＭ２マクロファージをＭ１炎症促進性マクロファージに再分極させ得ることが分かる。この効果は、抗Ｓｉｒｐβ、ＣＤ４７‐Ｆｃ又は抗ＣＤ４７抗体で細胞を処理した場合には観察されなかった。上記で説明したように、細胞表面マーカーは改変されなかった。同様に、図１２の結果から、２種の異なる抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂにより、表面マーカーＣＤ２００Ｒ及びＣＤ８０（Ａ）の発現を伴う表現型レベルとＩＬ‐６（Ｂ）分泌を伴う機能レベルとの両方においてＭ２型マクロファージに有利に働くマクロファージの分極を誘導することが可能になると分かる。更に、図１４の結果から、ＣＤ４７ではなくＳＩＲＰａの選択的遮断はＭ２分極（Ｂ）を阻止し、Ｍ１分極（Ａ）に影響を及ぼさないことが分かる。実際、炎症促進性Ｍ１型マクロファージの分極中はラットＳＩＲＰａの特異的モノクローナル抗体を添加しても抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を添加しても、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ‐６及びＴＮＦ‐ａ）の分泌は影響されない。対照的に、ラットマクロファージのＭ２分極中のＳＩＲＰａの特異的遮断（抗ＣＤ４７によるものではない）により、マクロファージのサイトカインプロファイルはＩＬ‐６及びＴＮＦ‐αが分泌される（Ｍ１マクロファージのような）炎症プロファイルへと切り替わる。
分極したＭ１／Ｍ２マクロファージの表現型及び機能は、これら細胞の可塑性によりインビトロ又はインビボで、ある程度制止されている（Ｓｉｃａ及びＭａｎｔｏｖａｎｉ、２０１２年）。本発明者らは、ＳＩＲＰａを遮断することにより、炎症促進性Ｍ１型へのＭ２型の再分極の問題に取り組んだ。そのために、Ｍ２高度分極を誘導するＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４と共に単球を培養した。その後、Ｍ２細胞を異なる遮断抗体で処理した。図７に示す結果から、ＩＬ６及びＴＮＦ‐αサイトカイン（Ｍ１マクロファージの指標サイトカイン）が誘導されたので、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂはＭ２マクロファージをＭ１炎症促進性マクロファージに再分極させ得ることが分かる。この効果は、抗Ｓｉｒｐβ、ＣＤ４７‐Ｆｃ又は抗ＣＤ４７抗体で細胞を処理した場合には観察されなかった。上記で説明したように、細胞表面マーカーは改変されなかった。同様に、図１２の結果から、２種の異なる抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂにより、表面マーカーＣＤ２００Ｒ及びＣＤ８０（Ａ）の発現を伴う表現型レベルとＩＬ‐６（Ｂ）分泌を伴う機能レベルとの両方においてＭ２型マクロファージに有利に働くマクロファージの分極を誘導することが可能になると分かる。更に、図１４の結果から、ＣＤ４７ではなくＳＩＲＰａの選択的遮断はＭ２分極（Ｂ）を阻止し、Ｍ１分極（Ａ）に影響を及ぼさないことが分かる。実際、炎症促進性Ｍ１型マクロファージの分極中はラットＳＩＲＰａの特異的モノクローナル抗体を添加しても抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を添加しても、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ‐６及びＴＮＦ‐ａ）の分泌は影響されない。対照的に、ラットマクロファージのＭ２分極中のＳＩＲＰａの特異的遮断（抗ＣＤ４７によるものではない）により、マクロファージのサイトカインプロファイルはＩＬ‐６及びＴＮＦ‐αが分泌される（Ｍ１マクロファージのような）炎症プロファイルへと切り替わる。
【0123】
これらの結果から、ＳＩＲＰａは単球のＭ２分極にとって重要であり、この経路を遮断することは、マクロファージがＭ２状態で遮断されている癌又は感染症など、それを必要とする病態を治療するための炎症促進性プロファイルを有するマクロファージを産生する良い機会であることが分かった。
【0124】
まとめると、これら全ての結果から、これらの実験において試験した抗ＳＩＲＰａ抗体全ては（ヒト、マウス又はラットＳＩＲＰａのどれに向けているかに関わらず）、Ｍ２型マクロファージ表現型を阻害することによりマクロファージ分極を調節できることが分かる。逆に、抗ＣＤ４７抗体はマクロファージ分極に効果がない。
【0125】
１．４ 抗ＳＩＲＰａ抗体はＣＤ４７を発現する腫瘍細胞上でヒトマクロファージ貪食作用を増加させない
貪食作用を誘導する抗ＳＩＲＰａ抗体（クローンＳＥ７Ｃ２）の能力をヒトマクロファージ上で評価した。図１３から、文献に記載されているように、Ｍ１マクロファージにより２つの異なる抗ＣＤ４７ ｍＡｂがＣＤ４７＋腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）の貪食作用を増加させることが分かる。対照的に、抗ＳＩＲｐａ ｍＡｂ又は組換えＣＤ４７‐Ｆｃ融合タンパク質によるＳＩＲＰａの選択的遮断はＭ１マクロファージの貪食活性の増加に影響しない。これらの結果から、ＣＤ４７＋腫瘍細胞の貪食作用はＳＩＲＰａ／ＣＤ４７相互作用では誘導されないが、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞貪食作用）機序により誘発されることが示唆される。更に、これらの結果から、抗ＳＩＲＰａ化合物は腫瘍細胞の貪食作用を誘導できないことが確認できる。
貪食作用を誘導する抗ＳＩＲＰａ抗体（クローンＳＥ７Ｃ２）の能力をヒトマクロファージ上で評価した。図１３から、文献に記載されているように、Ｍ１マクロファージにより２つの異なる抗ＣＤ４７ ｍＡｂがＣＤ４７＋腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）の貪食作用を増加させることが分かる。対照的に、抗ＳＩＲｐａ ｍＡｂ又は組換えＣＤ４７‐Ｆｃ融合タンパク質によるＳＩＲＰａの選択的遮断はＭ１マクロファージの貪食活性の増加に影響しない。これらの結果から、ＣＤ４７＋腫瘍細胞の貪食作用はＳＩＲＰａ／ＣＤ４７相互作用では誘導されないが、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞貪食作用）機序により誘発されることが示唆される。更に、これらの結果から、抗ＳＩＲＰａ化合物は腫瘍細胞の貪食作用を誘導できないことが確認できる。
【0126】
実施例２：ＳＩＲＰａ遮断効果のインビボ試験
２．１． 肝細胞癌のインビボモデルにおけるＳＩＲＰａ遮断効果
図８は、肝細胞癌を接種し、抗ＣＤ１３７、抗ＳＩＲＰａ、又はその両方で４週間処理した動物の全生存率を示す。抗Ｓｉｒｐａ単独療法で処理した動物の２０％は２５日以上生存し、抗ＣＤ１３７単独療法で処理した動物の２５％は３０日以上生存した。しかし、抗Ｓｉｒｐ＋抗ＣＤ１３７を併用投与した動物の１００％は８０日後に以前として生存し、他の条件と比較して２種の分子の相乗効果が示された。
２．１． 肝細胞癌のインビボモデルにおけるＳＩＲＰａ遮断効果
図８は、肝細胞癌を接種し、抗ＣＤ１３７、抗ＳＩＲＰａ、又はその両方で４週間処理した動物の全生存率を示す。抗Ｓｉｒｐａ単独療法で処理した動物の２０％は２５日以上生存し、抗ＣＤ１３７単独療法で処理した動物の２５％は３０日以上生存した。しかし、抗Ｓｉｒｐ＋抗ＣＤ１３７を併用投与した動物の１００％は８０日後に以前として生存し、他の条件と比較して２種の分子の相乗効果が示された。
【0127】
図９は、肝細胞癌を接種し、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＳＩＲＰａ、又はその両方で４週間処理した動物の全生存率を示す。結果から、各分子単独の場合と比較して、両分子で動物を治療した場合、（抗ｓｉｒｐａ処理の２０日後の２０％の生存数と、抗ＰＤ‐Ｌ１処理での１２％の生存数とを比較して）非常に興味深い生存率が示された。この結果は、癌モデルにおける抗ＳＩＲＰａ抗体と抗ＰＤ‐Ｌ１抗体との相乗効果を示している。
【0128】
２．２． 黒色腫のインビボモデルにおけるＳＩＲＰａ遮断効果
図１０は、黒色腫細胞を接種し、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＳＩＲＰａ、又はその両方で４週間処理した動物の全生存率を示す。各分子単独での処理と比較して、その併用の有効性は良好であった。図１０Ｂは、抗ＳＩＲＰａで処理した動物におけるマクロファージ浸潤を示し、腫瘍へ浸潤するマクロファージ数の増加が確認できる。
図１０は、黒色腫細胞を接種し、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＳＩＲＰａ、又はその両方で４週間処理した動物の全生存率を示す。各分子単独での処理と比較して、その併用の有効性は良好であった。図１０Ｂは、抗ＳＩＲＰａで処理した動物におけるマクロファージ浸潤を示し、腫瘍へ浸潤するマクロファージ数の増加が確認できる。
【0129】
２つの異なる癌モデルに関するインビボ実験から、特に他の免疫療法と併用した場合、ＳＩＲＰａは癌治療にとって興味深い標的となることが示され、またＳｉｒｐは、炎症促進性腫瘍環境を再構築する目的での遮断に重要である新たなチェックポイント阻害剤であることが示唆されている。
【0130】
２．３． 乳癌のインビボモデルにおけるＳＩＲＰａ遮断効果
図１５から、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂ（クローンＰ８４）を用いた単独療法はマウスの同系かつ同所性の三重陰性乳房モデルにおいて腫瘍形成を阻害することが分かる。腫瘍接種後２週間から実験終了まで、抗ＳＩＲＰａ処理マウスの腫瘍体積は有意に減少している。
図１５から、抗ＳＩＲＰａ ｍＡｂ（クローンＰ８４）を用いた単独療法はマウスの同系かつ同所性の三重陰性乳房モデルにおいて腫瘍形成を阻害することが分かる。腫瘍接種後２週間から実験終了まで、抗ＳＩＲＰａ処理マウスの腫瘍体積は有意に減少している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
