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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-26
(45)【発行日】2022-06-03
(54)【発明の名称】糖タンパク質ＶＩを標的とする抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220527BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220527BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220527BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220527BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220527BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220527BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220527BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220527BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220527BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220527BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20220527BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220527BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/28
A61K39/395 N
A61P43/00 111
A61P9/10
A61P7/02
C12P21/08
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020563942
(86)(22)【出願日】2019-05-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 EP2019062522
(87)【国際公開番号】W WO2019219765
(87)【国際公開日】2019-11-21
【審査請求日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】18172736.3
(32)【優先日】2018-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】316005432
【氏名又は名称】モルフォシス・アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウーラント ケルスティン
(72)【発明者】
【氏名】ノイゲバウアー ジュリア
(72)【発明者】
【氏名】ランツ ステファン
【審査官】天野 皓己
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０２１５３９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１３－５１４０７７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００ － １９／００
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ ７／０２
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、ｅ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｆ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｇ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｈ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項2】
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
を含む、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項3】
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む、請求項１又は２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項4】
ヒト、ヒト化、キメラ又は合成抗体又は抗体フラグメントである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項5】
単離抗体又は抗体フラグメントである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項6】
組み換え抗体又は抗体フラグメントである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項7】
モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項8】
一価抗体又は抗体フラグメントである、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項9】
前記一価抗体フラグメントがＦａｂである、請求項８に記載の抗体フラグメント。
【請求項10】
前記Ｆａｂが修飾重鎖定常領域を含み、該修飾重鎖定常領域が被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による該Ｆａｂの認識を防止又は阻害する、請求項９に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項11】
前記修飾重鎖定常領域がアミノ酸配列ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＥＶＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１３）からなる、請求項１０に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項12】
ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項13】
医薬に使用される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項14】
治療を必要とする被験体の治療に使用される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項15】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物。
【請求項16】
請求項１５に記載の核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物。
【請求項17】
請求項１６に記載のベクター組成物を含む宿主細胞。
【請求項18】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離抗体又は抗体フラグメントと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に結合する抗体又は抗体フラグメント（Ｆａｂ等）に関する。本開示は、上記抗体又は抗体フラグメントを発現することが可能な核酸、ベクター及び宿主細胞、上記抗体又は抗体フラグメントを含む医薬組成物、並びに特定の障害の治療のための上記抗体又は抗体フラグメントの使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
血小板活性化は、動脈血栓症及び心血管障害の発症において根本的に重要である。かかる障害を患う患者は一般に、血栓形成プロセスの後期事象を標的とすることにより血栓形成を妨げる抗血小板薬で治療される。これらの薬物の深刻な副作用は長引く出血であり、これによりその使用が制限される。
【0003】
ＧＰＶＩは、血小板及び巨核球のみで発現される主要なコラーゲン受容体である。コラーゲン（内皮下基質の最も重要な血栓形成成分の１つである（非特許文献１））へのＧＰＶＩの結合は、受容体クラスタリング及びその後の血小板活性化を誘導する。そのため、ＧＰＶＩは、血小板活性化の初期事象において最も重要であり、したがって、この機構を妨げるための主要標的となる（非特許文献２）。
【0004】
ＧＰＶＩの抗血小板効果及び抗血栓効果が、マウス及びヒトに由来する血小板を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ研究及びｉｎ ｖｉｖｏ研究において記載されている。例えば、ＧＰＶＩ欠損血小板は、コラーゲンに応答しない。さらに、ＧＰＶＩ欠損マウスは、特発性出血に対する感受性を高めることなく、損傷血管壁での動脈血栓形成の効果的な阻害を示した。これら全てのデータから、ＧＰＶＩがヒトにおける血栓性障害及び血管障害の治療の効果的かつ安全な標的であることが示される。
【0005】
ＧＰＶＩ－コラーゲン相互作用を妨げることが可能なＧＰＶＩに対する抑制又は中和モノクローナル抗体が従来技術において記載されている。例えば、特許文献１（特許文献２）（Nieswandt, Bernhard）、特許文献３（MILLENNIUM PHARMACEUTICALS）、特許文献４（CAMBRIDGE UNIVERSITY TECHNICAL SERVICES LTD、英国）、特許文献５（Procorde GmbH/GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundheit GmbH）、特許文献６（大塚製薬株式会社）、特許文献７（持田製薬株式会社、日本）、特許文献８（INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE（INSERM）、フランス）、特許文献９（SANOFI）を参照されたい。
【0006】
しかしながら、報告されているＧＰＶＩ特異抗体の大部分は、特にそれらの動物起源（抗体をヒト患者において免疫原性とする）、関連動物種に対する交差反応性の欠如、大幅に弱い親和性、短い半減期、又は血小板の表面からのＧＰＶＩ枯渇の誘導等の好ましくない機能特性のために、ヒトにおける臨床開発及び治療的使用に適さないようである。ＧＰＶＩ枯渇は、受容体活性化を示し得るが、制御することができず、不可逆的であることから回避する必要がある。
【0007】
現在、唯一のＧＰＶＩ特異モノクローナルＦａｂ抗体ＡＣＴ－０１７（特許文献１０を参照されたい）が虚血性脳卒中の治療のために臨床開発中であるようである。しかしながら、この抗体は、以前に開示された抗体９０１２．２（特許文献３を参照されたい）のヒト化型であるため、ｉｎ ｖｉｖｏ研究に一般に使用される関連モデルである齧歯類ＧＰＶＩに対する交差反応性を欠いている。加えて、ＡＣＴ－０１７は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端での構造のために患者の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体によって認識される危険性がある。かかる免疫応答は、血小板における二価ＧＰＶＩ結合及びＧＰＶＩ活性化の望ましくない回復をもたらし得る。
【0008】
このため、臨床開発及び治療的使用に適し、従来技術の中和抗体と比較してより良好な親和性、有効性及び安全性プロファイルをヒトにおいて示す、ＧＰＶＩに特異的な、更に改善された抗体又は抗体フラグメントが必要とされる。
【0009】
したがって、本開示は、従来技術で既知のＧＰＶＩ特異抗体よりも優れた新規の抗体及び抗体フラグメント（特にＦａｂフラグメント）を提供する。特に、本開示の抗体は、非ヒト霊長類（カニクイザル等）及び齧歯類（ラット及び／又はマウス等）ＧＰＶＩにも結合し、高い親和性を示し、これまで観察されなかった有利な機能特性及び安全性特性を併せ持つヒト抗体又は抗体フラグメントである。
【0010】
この点で、本開示のＧＰＶＩ特異抗体フラグメントは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端での修飾（例えば、修飾重鎖定常領域）も含み得る。本願の発明者らは、かかる修飾が、血小板の表面上のＧＰＶＩの架橋により血小板活性化を誘導するＦａｂの能力を、患者の血清中に存在する（既存の）抗Ｆａｂ抗体によるＦａｂの認識を防止することにより更に低下させ得ることを実証した。上記に概説されるように、かかる認識は、二価又は多価ＧＰＶＩ結合の回復をもたらし、コラーゲン等のその天然アゴニストリガンドの活性と同様に血小板の表面でのＧＰＶＩクラスタリングを引き起こす可能性がある。
【0011】
したがって、本開示のＧＰＶＩ特異抗体は、虚血性イベントの特定の安全な治療を提供する。
【0012】
これらの特徴により、本開示の抗体及び抗体フラグメントは、例えば血栓性障害及び血管障害を予防及び／又は治療する治療的使用にとって非常に望ましいものとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【文献】欧州特許出願公開第１２２４９４２号
【文献】欧州特許出願公開第１２２８７６８号
【文献】国際公開第２００１／０００８１０号
【文献】国際公開第２００３／０５４０２０号
【文献】欧州特許出願公開第１５３８１６５号
【文献】国際公開第２００５／１１１０８３号（欧州特許第１７４５０７６号）
【文献】国際公開第２００６／１１８３５０号（欧州特許第１８７６２４０号）
【文献】国際公開第２００８／０４９９２８号
【文献】国際公開第２０１１／０７３９５４号
【文献】国際公開第２０１７／０２１５３９号
【非特許文献】
【0014】
【文献】Lockyer S. et al, Thromb Res. 2006; 118(3):371-80
【文献】Nieswandt B and Watson SP, Blood. 2003 Jul 15; 102(2):449-61
【発明の概要】
【0015】
本開示は、新規の抗体又は抗体フラグメントを提供する。具体的に、本発明は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを提供し、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0016】
本発明は、本発明のＧＰＶＩ特異抗体又は抗体フラグメントの新規の配列中の修飾定常重鎖が、低下した免疫原性を有するヒト抗体又は抗体フラグメントをもたらすという認識に基づく。さらに、本明細書で開示される抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩに結合し、カニクイザル、マウス及びラットに由来するＧＰＶＩにも結合する。
【0017】
本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩの活性を中和する。
【0018】
加えて、開示の抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒト、マウス及びカニクイザルＧＰＶＩの結合を２７ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。好ましい実施の形態では、開示の抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒト、マウス及びカニクイザルＧＰＶＩの結合を９ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。加えて、開示の抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害する。
【0019】
本明細書で開示及び例示されるように、これらの抗体又は抗体フラグメントは、血栓症のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおいて効果的であることが証明された。
【0020】
したがって、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、有効性の点で優れ、例えば血栓性障害又は血管障害を患うヒトの治療によく適した有望な化合物をもたらす。
【0021】
本開示は、本明細書で開示される表１～表４によるＣＤＲ領域を有する、ヒトＧＰＶＩに結合する抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0022】
本開示は、本明細書で開示される表１～表４による可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を有する抗体又は抗体フラグメントも提供する。
【0023】
本開示は、本明細書で開示される表１～表４による重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を有する抗体又は抗体フラグメントも提供する。
【0024】
本開示は、Ｆａｂである、本開示による抗体又は抗体フラグメントも提供する。
【0025】
本開示は、本明細書で開示される修飾重鎖定常領域を含み、修飾重鎖定常領域が被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による上記抗体又は抗体フラグメントの認識を防止又は阻害する、Ｆａｂも提供する。
【0026】
本開示は、本明細書で開示されるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントと競合する抗体又は抗体フラグメントも提供する。
【0027】
本開示は、本明細書で開示されるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントも提供する。
【0028】
本開示は、医薬に使用される、本開示によるＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントも提供する。
【0029】
本開示は、被験体に有効量の本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを投与することにより血栓性障害又は血管障害等の障害を患う被験体を治療する方法も提供する。上記被験体又は患者は、ヒトであるのが好ましい。
【0030】
本開示は、本開示のＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
【0031】
本開示は、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸組成物も提供する。
【0032】
本開示は、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメント抗体をコードする核酸組成物を含むベクター組成物も提供する。
【0033】
本開示は、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードするベクター又は核酸組成物を含む宿主細胞も提供する。
【0034】
特許請求される抗体又は抗体フラグメントには有用性がある。さらに、かかる抗体又はフラグメントを特定する、特許請求される方法には有用性がある。特許請求される抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩの生物活性を変化させるために利用される。
【0035】
特に、特許請求される抗体又は抗体フラグメントは、血栓性障害又は血管障害の治療等の治療的使用のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】Ａ－Ｄ）最大３例のドナーに由来する多血小板血漿（ＰＲＰ）から得られたヒト、カニクイザル及びマウス血小板の細胞表面上で発現されたＧＰＶＩへのＦａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）の結合を示す図である。１例の例示ドナーについての結果（図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃ）又は３例のドナーの平均±標準偏差（ＳＤ）（図１Ｄ）を示す。
【図2】組み換えヒトコラーゲンＶｉｔｒｏＣｏｌ（Ａ）及びカニクイザル（cyno）大動脈コラーゲン（Ｂ）により誘導されるヒト血小板凝集の静止条件下でのＦａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を示す図である。血小板凝集は、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）装置において６分間の時間経過にわたるインピーダンスの上昇として測定した。４例～７例のドナーに由来する血液サンプルの平均値±ＳＤを示す。
【図3】ヒト動脈硬化性プラークにより誘導されるヒト血小板凝集の静止条件下でのＦａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を示す図である。血小板凝集は、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）装置において６分間の時間経過にわたるインピーダンスの上昇として測定した。６例のドナーに由来する血液サンプルの平均値±ＳＤを示す。
【図4】Ａ－Ｄ）ヒト動脈硬化性プラークにより誘導されるヒト血小板接着／凝集の流動条件下でのＦａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害；Ｅ）アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）及びチカグレロルの組合せによる阻害；Ｆ）陰性対照Ｆａｂによる阻害を示す図である。データ点を１フレーム／秒として記録した。１４例のドナーに由来する血液サンプルを用いた実験による各データ点についての平均値（黒色）＋ＳＤ（灰色）を示す。
【図5】３ｍｇ／ｋｇ ＩＶボーラス投与後の動脈血栓症のマウスモデル（結紮誘導血栓症モデル）におけるｉｎ ｖｉｖｏ血栓形成に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ Ｆａｂ＃３（修飾重鎖定常領域を含む）（図５Ａ）及び陰性対照Ｆａｂ（図５Ｂ）の効果を示す図である。血栓形成を、蛍光血小板を検出する生体内ビデオ顕微鏡法によって可視化し、１血管当たり２０分間記録した。異なる時点での１群当たり６匹のマウスについての結果を示す。
【図6】３ｍｇ／ｋｇ ＩＶボーラス投与後の動脈血栓症のマウスモデル（結紮誘導血栓症モデル）におけるｉｎ ｖｉｖｏ血栓形成に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ Ｆａｂ＃３（修飾ヒト重鎖定常領域を含む）（図６Ａ）及び陰性対照Ｆａｂ（図６Ｂ）の効果を示す図である。ｙ軸は、蛍光血小板の蛍光強度の関数としての血栓面積／血管面積（％）を示す。異なる時点での１群当たり６匹のマウスについての結果を示す。
【図7】ヒト血漿サンプル中に存在する既存の抗Ｆａｂ抗体によるＧＰＶＩ受容体活性化を誘導する能力についてのＦａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４のＦＡＣＳベースの特性評価を示す図である。野生型ヒト重鎖定常領域（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４）又は配列番号１１３を含む本開示による修飾ヒト重鎖定常領域（Ｆａｂ＃１ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃２ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃３ ｍｏｄ．ＨＣ及びＦａｂ＃４ ｍｏｄ．ＨＣ）のいずれかを有するＦａｂを試験した。血小板活性化は、ＰＢＳ対照のＣＤ６２Ｐ発現に対して正規化したヒト血小板上での相対ＣＤ６２Ｐ表面発現によって表される。５５例のドナーに由来するＰＲＰサンプルの平均値±ＳＤを示す。
【図8】出血時間に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４）により媒介されるＧＰＶＩ遮断の効果を示す図である。尾部出血を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて尾部の先端２ｍｍを外科用メスの刃で切断し、尾部を温かいＰＢＳに浸すことによって誘導した。出血時間を尾部の先端からの出血が止まり、３０秒以内に再開しない時点まで記録した。左パネルは、ＡＳＡを同時投与しない場合の出血時間を示す。右パネルは、ＡＳＡを同時投与した場合の出血時間を示す。１処理群当たり３匹～６匹のマウスの平均出血時間±ＳＤを示す。
【図9】Ａ－Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの１０ｍｇ／ｋｇ抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４）のｉ．ｖ．ボーラス投与後の血小板数に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂの効果を示す図である。１処理群当たり１匹～６匹のマウスによる異なる時点での平均血小板数±ＳＤを示す。
【図10】Ａ－Ｄ）ＣＤ－１マウスへの１０ｍｇ／ｋｇ抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾ヒト重鎖定常領域を含む）（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３又はＦａｂ＃４）のｉ．ｖ．ボーラス投与後のマウス血小板上でのＧＰＶＩ表面発現の評価を示す図である。１処理群当たり４匹～６匹のマウスの異なる時点での平均ＧＰＶＩコピー数±ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本開示は、ヒトＧＰＶＩを認識する多数の抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0038】
定義
「ＧＰＶＩ」という用語は、糖タンパク質ＶＩとして知られるタンパク質を指す。
「ＧＰＶＩ」という用語は、糖タンパク質ＶＩとして知られるタンパク質を指す。
【0039】
ヒトＧＰＶＩ－１Ａ（１～３３９）は、（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＨＣＮ６－１、ハプロタイプ「ａ」）のアミノ酸配列を有する：
【0040】
カニクイザルＧＰＶＩ（１～３１８）は、（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｂ０Ｉ１Ｔ７）のアミノ酸配列を有する：
【0041】
マウスＧＰＶＩ（１～３１３）は、（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０Ｃ１９１）のアミノ酸配列を有する：
【0042】
ヒトＧＰＶＩ－１Ａの細胞外ドメイン（位置２１～２６９）は、（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＨＣＮ６－１、ハプロタイプ「ａ」）のアミノ酸配列を有する：
【0043】
ヒトＧＰＶＩ－１Ｂの細胞外ドメイン（位置２１～２６９）は、（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＨＣＮ６－１、ハプロタイプ「ｂ」）のアミノ酸配列を有する：
【0044】
ヒトＧＰＶＩ－２Ａの細胞外ドメイン（位置２１～２５１）は、（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＨＣＮ６－２、ハプロタイプ「ａ」）のアミノ酸配列を有する：
【0045】
「ＧＰＶＩ－１」及び「ＧＰＶＩ－２」という用語は、公開されているＧＰＶＩのアイソタイプを指す。添え字「Ａ」及び「Ｂ」は、それぞれ記載の高頻度対立遺伝子「ａ」（アミノ酸Ｓ２１９、Ｋ２３７、Ｔ２４９を含む）及び低頻度対立遺伝子「ｂ」（アミノ酸Ｐｒｏ２１９、Ｇｌｕ２３７、Ａｌａ２４９を含む）を指す（Joutsi-Korhonen et al., 2003）。
【0046】
ヒトＧＰＶＩの細胞外ドメインは、ドメイン間ヒンジ（hinge-interdomain）によって連結された２つのＩｇ様Ｃ２型ドメイン、すなわちＤ１ドメイン及びＤ２ドメインから構成される。Ｄ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基２１～１０９を含む。Ｄ２ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基１１４～２０７を含む。
【0047】
カニクイザルＧＰＶＩの細胞外ドメイン（位置２１～２４９）は、（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｂ０Ｉ１Ｔ７）のアミノ酸配列を有する：
【0048】
マウスＧＰＶＩの細胞外ドメイン（位置２１～２６６）は、（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０Ｃ１９１）のアミノ酸配列を有する：
【0049】
ラットＧＰＶＩの細胞外ドメイン（位置２１～２６９）は、（Ｕｎｉｐｒｏｔ：ＸＰ＿００８７５７２４１．２）のアミノ酸配列を有する：
【0050】
ＧＰＶＩ－ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質の生成に使用されるヒトＩｇＧ１－Ｆｃドメイン（Ｋ１０５～Ｋ３３０）は、以下のアミノ酸配列を有する：
【0051】
数字に先行する「約」という用語は、該数字の値の±（plus or less）１０％を意味する。
【0052】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原と相互作用する、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が組み入れられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に更に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。「抗体」という用語は、例えばモノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（camelised）抗体及びキメラ抗体を含む。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。軽鎖及び重鎖の両方が構造的相同性及び機能的相同性の領域に分けられる。
【0053】
「抗体フラグメント」という表現は、本明細書で使用される場合、（例えば、結合、立体障害、安定化、空間分布により）抗原と特異的に相互作用する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を指す。結合フラグメントの例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域のＮ末端部分とからなる一価フラグメントであるＦａｂ’フラグメント；ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；並びに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、組み換え法を用いて、これらをＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426及びHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する単一タンパク質鎖とすることができる合成リンカーにより接合することができる。かかる一本鎖抗体も「抗体フラグメント」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、フラグメントを無傷抗体と同様に有用性についてスクリーニングする。抗体フラグメントをシングルドメイン抗体、マキシボディ（maxibodies）、ミニボディ（minibodies）、細胞内抗体、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）、テトラボディ（tetrabodies）、ｖ－ＮＡＲ及びｂｉｓ－ｓｃＦｖに組み込むこともできる（例えば、Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136を参照されたい）。抗体フラグメントは、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）等のポリペプチドをベースとする骨格にグラフトすることができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディ（monobodies）を記載している米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。抗体フラグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むことができる（Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062及び米国特許第５，６４１，８７０号）。
【0054】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する抗体重鎖の領域を含む。ヒンジ領域は、上部、中央及び下部ヒンジドメインの３つの異なるドメインに細分することができる（Roux et al., J. Immunol. 1998 161 :4083）。
【0055】
「ＣＨ１ドメイン」という用語は、可変ドメインをヒンジ領域に連結する抗体の重鎖定常ドメインを指す。「ＣＨ１ドメイン」という用語は、野生型ＣＨ１ドメイン及びその自然発生アロタイプの１つ、並びにその変異体を含む。
【0056】
「ヒト抗体」又は「ヒト抗体フラグメント」は、本明細書で使用される場合、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体及び抗体フラグメントを含む。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もかかる配列に由来する。ヒト起源には、例えばヒト生殖系列配列、又はヒト生殖系列配列の突然変異型、又は例えばKnappik et al., (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86に記載されるようなヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体が含まれる。免疫グロブリン可変ドメイン、例えばＣＤＲの構造及び位置は、既知のナンバリングスキーム、例えばＫａｂａｔナンバリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、又はＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの組合せを用いて定義することができる（例えば、Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.、Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948)、Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services、Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917、Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883、及びAl-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948を参照されたい）。ヒト抗体は、それぞれの系がフレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体をもたらす限りにおいて、合成ライブラリー又はトランスジェニックマウス（例えば、ゼノマウス（xenomouse））から単離することもできる。
【0057】
「キメラ抗体」又は「キメラ抗体フラグメント」という用語は、或る種に見られる配列に由来するか又はそれに相当する定常抗体領域と、別の種に由来する可変抗体領域とを有する抗体分子として本明細書で定義される。定常抗体領域がヒトに見られる配列に由来するか又はそれに相当し、可変抗体領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ又はＦＲ領域）が非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ウサギ又はハムスターに見られる配列に由来するのが好ましい。
【0058】
「ヒト化抗体」又は「ヒト化抗体フラグメント」は、ヒト起源の配列に由来する定常抗体領域を有する抗体分子として本明細書で定義され、可変抗体領域又はその一部又はＣＤＲのみが別の種に由来する。例えば、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフト化されていてもよく、可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源に由来するが、可変ドメインの１つ以上のフレームワークがヒト起源であり、定常ドメイン（もしあれば）がヒト起源である。
【0059】
「単離された」という用語は、例えば異なる抗原特異性を有する他の抗体又は抗体フラグメントを実質的に含まない抗体又は抗体フラグメントであり得る化合物を指す。さらに、単離抗体又は抗体フラグメントは、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。このため、幾つかの実施形態では、提供される抗体又は抗体フラグメントは、異なる特異性を有する抗体から分離された単離抗体又は抗体フラグメントである。単離抗体は、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントであり得る。単離抗体又は抗体フラグメントは、組み換えモノクローナル抗体又は抗体フラグメントであり得る。しかしながら、標的のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合する単離抗体又は抗体フラグメントは、例えば他の種（例えば、種ホモログ）に由来する他の関連抗原に対して交差反応性を有し得る。
【0060】
「組み換え抗体」又は「組み換え抗体フラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在しない手段によって調製、発現、作製又は分離された全ての抗体又は抗体フラグメント、例えば抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから選択され、単離された抗体、及びヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全て又は一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製若しくは単離された抗体、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック若しくはトランスクロモソーマル（transchromosomal）である動物（例えば、マウス）、若しくはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体を含む。かかる組み換え抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有するのが好ましい。しかしながら、或る特定の実施形態では、かかる組み換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（又はヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）に供することができ、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在し得ない配列とする。組み換え抗体は、モノクローナル抗体であり得る。一実施形態では、本明細書で開示される抗体及び抗体フラグメントは、米国特許出願公開第１３／３２１，５６４号又は米国特許出願公開第１３／２９９，３６７号（どちらも引用することにより本明細書の一部をなす）に開示されるＹｌａｎｔｈｉａ（商標）抗体ライブラリーから単離される。
【0061】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体フラグメント」という用語は、それを作製する方法ではなく、任意の真核生物クローン、原核生物クローン又はファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体又は抗体フラグメントを指す。本明細書で開示されるモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975)に記載されるハイブリドーマ法によって作製するか、又は例えば本明細書に記載される技法を用いてファージライブラリーから単離することができる。それにより発現されたクローン細胞株及びモノクローナル抗体を調製する他の方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New Yorkを参照されたい）。
【0062】
本明細書で使用される場合、「に特異的に結合する」（"binds specifically to", "specifically binds to"）、「に特異的な」（is "specific to/for"）又は「を特異的に認識する」等の用語は、生体分子を含む分子の不均一集団の存在下で標的の存在を決定するような標的と抗体又は抗体フラグメントとの間の結合等の測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（抗原又は抗原のエピトープであり得る）に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントは、他の標的に結合する場合よりも大きな親和性、アビディティで、より容易に及び／又はより長い持続時間で、この標的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。或る特定の実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、異なる種に由来するタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、これを必要とする訳ではない。本明細書で開示される抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩに特異的に結合する。ヒトＧＰＶＩに特異的な開示の抗体又は抗体フラグメントは、マウス、ラット及び／又はカニクイザルに由来するＧＰＶＩ等の別の種のＧＰＶＩに特異的に結合するのが好ましい。更により好ましくは、本明細書で開示される抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的である。２つの分子が特異的に結合するかを決定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば標準ＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。スコア化は、標準的な発色（例えば、西洋ワサビペルオキシド（horseradish peroxide）を有する二次抗体及びテトラメチルベンジジンと過酸化水素）によって行うことができる。或る特定のウェルにおける反応は、例えば４５０ｎｍでの光学密度によってスコア化される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、０．１ＯＤであり得る。典型的な陽性反応は、１ＯＤであり得る。これは、陽性／陰性差が５倍超であり得ることを意味する。通例、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、３つ～５つの非関連抗原、例えば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン等のセットを用いて行われる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、単一部位でのポリペプチドとその標的との間の相互作用の強度を指す。各部位において、ポリペプチドの結合領域は、その標的と多数の部位で弱い非共有結合力によって相互作用する。相互作用が大きいほど親和性が強くなる。
【0064】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＫｄとＫａとの比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指し、モル濃度（Ｍ）として表される。例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分についてのＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立されている方法を用いて決定することができる。例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分のＫＤを決定する方法は、ＳＥＴ（可溶性平衡滴定（soluble equilibrium titration））、又はＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム等のバイオセンサーシステムを用いる表面プラズモン共鳴である。本開示では、ＧＰＶＩに特異的な抗体は通例、５×１０－２Ｍ未満、１×１０－２Ｍ未満、５×１０－３Ｍ未満、１×１０－３Ｍ未満、５×１０－４Ｍ未満、１×１０－４Ｍ未満、５×１０－５Ｍ未満、１×１０－５Ｍ未満、５×１０－６Ｍ未満、１×１０－６Ｍ未満、５×１０－７Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、５×１０－８Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、５×１０－９Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、５×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１０Ｍ未満、５×１０－１１Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満、５×１０－１２Ｍ未満、１×１０－１２Ｍ未満、５×１０－１３Ｍ未満、１×１０－１３Ｍ未満、５×１０－１４Ｍ未満、１×１０－１４Ｍ未満、５×１０－１５Ｍ未満若しくは１×１０－１５Ｍ未満、又はそれ以下の解離速度定数（ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する。
【0065】
本開示の組成物は、治療用途又は予防用途に使用することができる。したがって、本開示は、本明細書で開示される抗体又は抗体フラグメントと、その薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含有する医薬組成物を含む。関連の実施形態では、本開示は、血栓性障害又は血管障害を治療する方法を提供する。かかる方法は、それを必要とする被験体に、本明細書に記載されるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを含有する有効量の医薬組成物を投与する工程を含む。
【0066】
本開示は、かかる治療を必要とする被験体への治療有効量の本明細書で開示されるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの投与を含む治療方法を提供する。「治療有効量」又は「有効量」は、本明細書で使用される場合、所望の生物学的応答を引き起こすのに必要とされる、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの量を指す。本開示によると、治療有効量は、障害を治療及び／又は予防するのに必要とされる（例えば、予防的）、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの量である。
【0067】
「投与」及び「処置（treatment）」は、動物、ヒト、実験被験体、細胞、組織、器官又は体液に適用される場合、外因性の医薬品、治療剤、診断剤又は組成物の動物、ヒト、被験体、細胞、組織、器官又は体液への接触を指す。「投与」及び「処置」は、例えば治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法及び実験方法を指す場合もある。細胞の処置は、細胞への試薬の接触、及び細胞と接触している流体への試薬の接触を包含する。「投与」及び「処置」は、例えば試薬、診断組成物、結合組成物又は別の細胞による細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでの処置も意味する。「処置」は、ヒト、家畜（veterinary）又は研究被験体に適用される場合、治療処置、予防（prophylactic or preventative）措置、研究及び診断的適用を指す。「処置」は、ヒト、家畜若しくは研究被験体、又は細胞、組織若しくは器官に適用される場合、作用物質と動物被験体、細胞、組織、生理学的コンパートメント又は生理液との接触を包含する。「細胞の処置」は、作用物質が、例えば流体相又はコロイド相中のＰＩＬＲと接触する状況だけでなく、アゴニスト又はアンタゴニストが細胞又は受容体と接触しない状況も包含する。
【0068】
「被験体」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類を含む。指定のない限り、「患者」又は「被験体」という用語は、本明細書で区別なく使用される。
【0069】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で区別なく使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する自然発生アミノ酸の人工の化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに自然発生アミノ酸ポリマー及び非自然発生アミノ酸ポリマーに適用される。他に指示がない限り、特定のポリペプチド配列は、保存的に修飾された変異体も暗に包含する。
【0070】
「ＥＣ５０」という用語は、本明細書で使用される場合、アッセイにおいてベースラインと最大との間の中間の応答を誘導する抗体又は抗体フラグメントの濃度を指す。したがって、これは最大効果の５０％が観察される抗体濃度を表す。
【0071】
「ＩＣ５０」という用語は、本明細書で使用される場合、アッセイにおいて最大応答とベースラインとの間の中間の応答を阻害する抗体又は抗体フラグメントの濃度を指す。これは所与の応答を５０％低減する抗体濃度を表す。
【0072】
「阻害」又は「阻害する」又は「低減」又は「低減する」又は「中和」又は「中和する」という用語は、任意の表現型特性（結合、生物活性又は機能等）の減少若しくは停止、又はその特性の出現、程度若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。「阻害」、「低減」又は「中和」は、適切なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。幾つかの実施形態では、「低減する」又は「阻害する」は、２０％以上の減少を引き起こす能力を意味する。別の実施形態では、「低減する」又は「阻害する」は、５０％以上の減少を引き起こす能力を意味する。また別の実施形態では、「低減する」又は「阻害する」は、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。
【0073】
「アンタゴニスト」抗体又は抗体フラグメントという用語は、本明細書で使用される場合、ＧＰＶＩと相互作用し、ＧＰＶＩの生物活性若しくは機能、又は任意の他の表現型特性を部分的又は完全に阻害又は中和する抗体又は抗体フラグメントを指す。
【0074】
「交差競合する（Cross competes）」は、標準的な競合的結合アッセイにおいて特異抗原への他の抗体、抗体フラグメント又は抗原結合部分の結合を妨げる抗体若しくは抗体フラグメント、又は他の抗原結合部分の能力を意味する。抗体、抗体フラグメント又は他の抗原結合部分が特異抗原への別の抗体、抗体フラグメント又は抗原結合部分の結合を妨げることが可能な能力又は程度、したがって本発明により交差競合すると言えるかは、標準的な競合結合アッセイを用いて決定することができる。好適なアッセイの１つは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅ技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器（Biacore，Uppsala，Sweden）の使用による）の使用を伴う。交差競合を測定する別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを用いる。交差競合に基づく抗体の「エピトープビニング」のためのハイスループットプロセスは、国際公開第２００３／４８７３１号に記載されている。交差競合は、調査対象の抗体又は抗体フラグメントが表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントの１つのＧＰＶＩへの結合を６０％以上、具体的には７０％以上、より具体的には８０％以上低減する場合、また表１～表４に記載される抗体の１つが上記抗体又は抗体フラグメントのＧＰＶＩへの結合を６０％以上、具体的には７０％以上、より具体的には８０％以上低減する場合に存在する。
【0075】
「エピトープ」という用語は、抗体若しくはそのフラグメント、若しくはＴ細胞受容体によって特異的に認識されるか、又は他の形で分子と相互作用する任意のタンパク性領域を含む。概して、エピトープは、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基群（surface groupings）のものであり、概して特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有し得る。当業者に理解されるように、抗体が特異的に結合することができる実質的に全てのものがエピトープであり得る。
【0076】
「と同じエピトープに結合する」は、抗体を比較する同じエピトープマッピング法を用いた場合に特異抗原に結合し、例示の抗体と同じエピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントの能力を意味する。例示の抗体及び他の抗体のエピトープは、エピトープマッピング法を用いて決定することができる。エピトープマッピング法は、当該技術分野で既知である。例えば、立体構造エピトープは、例えば水素／重水素交換、ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴等によってアミノ酸の空間立体配座を決定することによって容易に特定される。
【0077】
「改変された」又は「修飾された」という用語は、本明細書で使用される場合、合成手段（例えば、組み換え法、ｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド合成、ペプチドの酵素若しくは化学カップリング、又はこれらの技法の幾つかの組合せ）による核酸又はポリペプチド分子の操作を含む。本開示の抗体又は抗体フラグメントは、例えばヒト化及び／又はキメラ抗体、並びに抗原結合、安定性／半減期、エフェクター機能、免疫原性、安全性等の１つ以上の特性を改善するように改変された抗体を含む、改変又は修飾された抗体又は抗体フラグメントであるのが好ましい。
【0078】
「野生型」タンパク質又はその部分は、天然に見られるタンパク質の型である。野生型タンパク質のアミノ酸配列、例えば重鎖定常領域は、天然に生じるタンパク質のアミノ酸配列である。アロタイプの差のために、野生型タンパク質について２つ以上のアミノ酸配列が存在し得る。例えば、自然発生ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の幾つかのアロタイプが存在する（例えば、Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1を参照されたい）。
【0079】
「アロタイプ」は、数個のアミノ酸が異なる、特定のアイソタイプ群内の自然発生変異体を指す（例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1を参照されたい）。本明細書に記載される抗体は、任意のアロタイプであり得る。
【0080】
本明細書で使用される場合、「既存の」抗体という用語は、被験体又は生物に通常存在する抗体を指すことを意図する。
【0081】
実施形態
配列
一実施形態では、本開示は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に特異的な抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に特異的な単離抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体のいずれか１つの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含む、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体のいずれか１つの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。
配列
一実施形態では、本開示は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に特異的な抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に特異的な単離抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体のいずれか１つの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含む、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体のいずれか１つの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0082】
一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体のいずれか１つのＫａｂａｔによって規定される６つのＣＤＲを含む、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体のいずれか１つの６つのＣＤＲを含む、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0083】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）領域、配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）領域、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）領域、配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）領域、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）領域、又は、
ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）領域、配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）領域、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）領域、配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）領域、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）領域、又は、
ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0084】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナルヒト抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖからなる群から選択される。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂである。
【0085】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0086】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナルヒト抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖからなる群から選択される。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂである。
【0087】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、 ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域を含み、配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬを更に含むか、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域を含み、配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを更に含むか、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域を含み、配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬを更に含むか、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域を含み、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを更に含む、
抗体又は抗体フラグメントに関する。
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域を含み、配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを更に含むか、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域を含み、配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬを更に含むか、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域を含み、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを更に含む、
抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0088】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナルヒト抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖからなる群から選択される。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂである。
【0089】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0090】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0091】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0092】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0093】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0094】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0095】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0096】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0097】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0098】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0099】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0100】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣからなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣからなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0101】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣからなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣからなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0102】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１の軽鎖（ＬＣ）、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１の軽鎖（ＬＣ）を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１の軽鎖（ＬＣ）からなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣからなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0103】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣからなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又はこれらの配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するが、該抗体若しくは抗体フラグメントと同じ活性を保持する配列を含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣを含む、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣからなる、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0104】
更なる実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0105】
一実施形態では、上述のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナルヒト抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖからなる群から選択される。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂである。
【0106】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含む。
【0107】
フォーマット
或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。
或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。
【0108】
本開示の一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントはヒト、ヒト化、キメラ又は合成抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、ヒト又はヒト化抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、ヒト抗体又は抗体フラグメントである。別の実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、キメラ抗体又は抗体フラグメントである。
【0109】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、組み換え抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。更なる実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、単離組み換え抗体又は抗体フラグメントである。更なる実施形態では、上記単離組み換えヒト抗体又は抗体フラグメントは、単離組み換えヒト抗体又は抗体フラグメントである。
【0110】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。
【0111】
一実施形態では、上記ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントはＩｇＧである。別の実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【0112】
一実施形態では、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントは完全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体フラグメントはＦａｂである。
【0113】
核酸－ベクター－細胞
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物であって、上記抗体又は抗体フラグメントが、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む、核酸組成物に関する。
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物であって、上記抗体又は抗体フラグメントが、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む、核酸組成物に関する。
【0114】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの重鎖配列及び／又は軽鎖配列をコードし、
ａ）配列番号５５のＨＣＤＲ１領域、配列番号５６のＨＣＤＲ２領域、配列番号５７のＨＣＤＲ３領域、配列番号５８のＬＣＤＲ１領域、配列番号５９のＬＣＤＲ２領域及び配列番号６０のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号６６のＨＣＤＲ１領域、配列番号６７のＨＣＤＲ２領域、配列番号６８のＨＣＤＲ３領域、配列番号６９のＬＣＤＲ１領域、配列番号７０のＬＣＤＲ２領域及び配列番号７１のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号７７のＨＣＤＲ１領域、配列番号７８のＨＣＤＲ２領域、配列番号７９のＨＣＤＲ３領域、配列番号８０のＬＣＤＲ１領域、配列番号８１のＬＣＤＲ２領域及び配列番号８２のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号８８のＨＣＤＲ１領域、配列番号８９のＨＣＤＲ２領域、配列番号９０のＨＣＤＲ３領域、配列番号９１のＬＣＤＲ１領域、配列番号９２のＬＣＤＲ２領域及び配列番号９３のＬＣＤＲ３領域、
を含む、単離核酸又は複数の核酸配列に関する。
ａ）配列番号５５のＨＣＤＲ１領域、配列番号５６のＨＣＤＲ２領域、配列番号５７のＨＣＤＲ３領域、配列番号５８のＬＣＤＲ１領域、配列番号５９のＬＣＤＲ２領域及び配列番号６０のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号６６のＨＣＤＲ１領域、配列番号６７のＨＣＤＲ２領域、配列番号６８のＨＣＤＲ３領域、配列番号６９のＬＣＤＲ１領域、配列番号７０のＬＣＤＲ２領域及び配列番号７１のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号７７のＨＣＤＲ１領域、配列番号７８のＨＣＤＲ２領域、配列番号７９のＨＣＤＲ３領域、配列番号８０のＬＣＤＲ１領域、配列番号８１のＬＣＤＲ２領域及び配列番号８２のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号８８のＨＣＤＲ１領域、配列番号８９のＨＣＤＲ２領域、配列番号９０のＨＣＤＲ３領域、配列番号９１のＬＣＤＲ１領域、配列番号９２のＬＣＤＲ２領域及び配列番号９３のＬＣＤＲ３領域、
を含む、単離核酸又は複数の核酸配列に関する。
【0115】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの重鎖配列及び／又は軽鎖配列をコードし、
ａ）配列番号５５の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号５６の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号５７の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号５８の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号５９の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号６０の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号６６の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号６７の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号６８の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号６９の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号７０の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号７１の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号７７の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号７８の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号７９の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号８０の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号８１の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号８２の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号８８の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号８９の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号９０の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号９１の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号９２の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号９３の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、単離核酸又は複数の核酸配列に関する。
ａ）配列番号５５の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号５６の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号５７の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号５８の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号５９の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号６０の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号６６の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号６７の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号６８の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号６９の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号７０の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号７１の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号７７の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号７８の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号７９の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号８０の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号８１の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号８２の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号８８の核酸配列を含むＨＣＤＲ１領域、配列番号８９の核酸配列を含むＨＣＤＲ２領域、配列番号９０の核酸配列を含むＨＣＤＲ３領域、配列番号９１の核酸配列を含むＬＣＤＲ１領域、配列番号９２の核酸配列を含むＬＣＤＲ２領域及び配列番号９３の核酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、単離核酸又は複数の核酸配列に関する。
【0116】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号６１のＶＨ及び／又は配列番号６２のＶＬ、又は配列番号６１のＶＨ及び配列番号６２のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0117】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号７２のＶＨ及び／又は配列番号７３のＶＬ、又は配列番号７２のＶＨ及び配列番号７３のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0118】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号８３のＶＨ及び／又は配列番号８４のＶＬ、又は配列番号８３のＶＨ領域及び配列番号８４のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0119】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号９４のＶＨ及び／又は配列番号９５のＶＬ、又は配列番号９４のＶＨ領域及び配列番号９５のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0120】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号６４のＨＣ及び／又は配列番号６３のＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号６５のＨＣ及び／又は配列番号６３のＬＣを含む、核酸又は複数の核酸配列に関する。
【0121】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号７５のＨＣ及び／又は配列番号７４のＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号７６のＨＣ及び／又は配列番号７４のＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0122】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号８６のＨＣ及び／又は配列番号８５のＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号８７のＨＣ及び／又は配列番号８５のＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0123】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号９７のＨＣ及び／又は配列番号９６のＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、配列番号９８のＨＣ及び／又は配列番号９６のＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0124】
別の実施形態では、本開示は、単離モノクローナル抗体又はフラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、表１～表４に開示される抗体のいずれか１つのＶＨ及び／又はＶＬを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0125】
別の実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される核酸配列又は複数の核酸配列のいずれか１つによってコードされる、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0126】
或る特定の実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントのいずれか１つをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を提供する。
【0127】
別の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的に結合する本開示による抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を提供する。
【0128】
別の実施形態では、本開示は、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列であって、表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントのいずれか１つのＨＣ及び／又はＬＣを含む、核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0129】
ベクター
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物に関する。
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物に関する。
【0130】
一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示されるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物に関する。
【0131】
一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物に関する。
【0132】
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【0133】
一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される核酸を含むベクターを提供する。
【0134】
一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【0135】
宿主細胞
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を含む宿主細胞に関する。
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を含む宿主細胞に関する。
【0136】
一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示されるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を含む宿主細胞に関する。
【0137】
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0138】
一実施形態では、本開示は、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【0139】
別の実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される核酸を含むベクターを含む単離宿主細胞を提供する。
【0140】
一実施形態では、上記宿主細胞は、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現することが可能である。更なる実施形態では、上記宿主細胞は単離細胞である。更なる実施形態では、上記単離宿主細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、上記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【0141】
本開示の或る特定の実施形態では、例えば本開示のＦａｂの発現若しくは精製を助けるため、又は本開示のＦａｂの安定性を高めるために付加的なアミノ酸残基、ポリペプチド又は部分を本開示の抗体又は抗体フラグメントに付加する。
【0142】
本開示の抗体又は抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖のコード配列は、遺伝子発現に必要とされる必須の発現制御領域（例えば、調節領域）にＤＮＡを操作可能に連結することによって発現ベクターに導入される組み換えＤＮＡ分子であり得る。重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを異なるベクター又は同じベクターにクローニングすることができることが当業者には認識される。好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオチドを同じベクターにクローニングする。ベクターは、当該技術分野で既知の方法によって原核（例えば、細菌）又は真核（例えば、酵母又は哺乳動物）細胞等の適切な宿主細胞に導入することができる（例えば、"Current Protocol in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds.), Greene Publishing Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989 and 1992を参照されたい）。多数のクローニングベクターが当業者に既知であり、適切なクローニングベクターの選択には選択の余地がある。遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）及び任意にオペレーター（本明細書で「制御」要素として総称される）の制御下に置き、この発現構成を有するベクターによって形質転換される宿主細胞において所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されるようにすることができる。コード配列は、シグナルペプチド又はリーダー配列を含有しても又は含有しなくてもよい。宿主細胞における発現により、本開示の抗体又は抗体フラグメントが得られる。これらの工程は、当業者に既知の種々の方法で達成することができる。概して、かかる工程は通例、好適な宿主細胞を、抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸又はベクター又は感染粒子で形質転換又はトランスフェクトすることを含む。さらに、かかる工程は通例、上記宿主細胞を該宿主細胞の増殖（繁殖、成長）に適した条件下で培養すること、及びコードされる抗体又は抗体フラグメントの産生（発現、合成）に適した条件下での培養工程を含む。増殖又は発現に適した条件下での宿主細胞の培養は通例、細胞の成長又は発現の誘導に適した成分を含む培地の存在下で達成される。特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントを作製する方法は、産生された抗体又は抗体フラグメントを宿主細胞又は培地から単離する工程を更に含む。選択される発現系及び宿主に応じて、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を対象のタンパク質が発現される条件下で成長させることによって産生される。次いで、タンパク質を宿主細胞から単離し、精製する。発現系によりタンパク質が成長培地中に分泌される場合、タンパク質を培地から直接精製することができる。タンパク質が分泌されない場合、細胞溶解物から単離するか又は細胞膜画分から回収する。適切な成長条件及び回収方法の選択は、当業者の技能の範囲内である。次いで、本開示の抗体又は抗体フラグメントを当業者に既知の多数の技法によって精製することができる。
【0143】
結合
一実施形態では、本開示は、ヒトＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントに関する。
一実施形態では、本開示は、ヒトＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0144】
一実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号４、配列番号５及び／又は配列番号６のアミノ酸配列を含むヒトＧＰＶＩのアイソフォーム及びハプロタイプに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列によってコードされるヒトＧＰＶＩに特異的である。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、配列番号４、配列番号５及び／又は配列番号６のアミノ酸配列によってコードされるヒトＧＰＶＩの細胞外ドメインに特異的である。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的である。一実施形態では、本開示は、配列番号１によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、配列番号１、配列番号４、配列番号５及び／又は配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体である。更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。
【0145】
一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩの細胞外ドメインに結合する。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩの細胞外ドメインのＤ１ドメインに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩの細胞外ドメインのＤ２ドメインに結合する。
【0146】
本開示の抗体又は抗体フラグメントは、カニクイザル及び齧歯類ＧＰＶＩ、例えばマウス又はラットＧＰＶＩに対して交差反応性である。一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、マウス、ラット及び／又はカニクイザルに由来するＧＰＶＩ等の別の種のＧＰＶＩと交差反応性である。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＩＶ及びラットＧＰＶＩに特異的である。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、カニクイザルＧＰＶＩに特異的である。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、マウスＧＰＶＩに特異的である。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、ラットＧＰＶＩに特異的である。
【0147】
一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩに特異的である。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩに特異的である。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ヒトＧＰＶＩ及びカニクイザルＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ヒトＧＰＶＩ及び齧歯類ＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、上記齧歯類ＧＰＶＩは、マウス及びラットＧＰＶＩである。
【0148】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＩＶ及びラットＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0149】
別の実施形態では、本開示は、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＩＶ及びラットＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0150】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0151】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0152】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。
【0153】
親和性
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、５×１０－２Ｍ未満、１×１０－２Ｍ未満、５×１０－３Ｍ未満、１×１０－３Ｍ未満、５×１０－４Ｍ未満、１×１０－４Ｍ未満、５×１０－５Ｍ未満、１×１０－５Ｍ未満、５×１０－６Ｍ未満、１×１０－６Ｍ未満、５×１０－７Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、５×１０－８Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、５×１０－９Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、５×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１０Ｍ未満、５×１０－１１Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満、５×１０－１２Ｍ未満、１×１０－１２Ｍ未満、５×１０－１３Ｍ未満、１×１０－１３Ｍ未満、５×１０－１４Ｍ未満、１×１０－１４Ｍ未満、５×１０－１５Ｍ未満又は１×１０－１５Ｍ未満の解離速度定数（ＫＤ）でＧＰＶＩに対して一価親和性を有する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、５×１０－２Ｍ未満、１×１０－２Ｍ未満、５×１０－３Ｍ未満、１×１０－３Ｍ未満、５×１０－４Ｍ未満、１×１０－４Ｍ未満、５×１０－５Ｍ未満、１×１０－５Ｍ未満、５×１０－６Ｍ未満、１×１０－６Ｍ未満、５×１０－７Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、５×１０－８Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、５×１０－９Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、５×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１０Ｍ未満、５×１０－１１Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満、５×１０－１２Ｍ未満、１×１０－１２Ｍ未満、５×１０－１３Ｍ未満、１×１０－１３Ｍ未満、５×１０－１４Ｍ未満、１×１０－１４Ｍ未満、５×１０－１５Ｍ未満又は１×１０－１５Ｍ未満の解離速度定数（ＫＤ）でＧＰＶＩに対して一価親和性を有する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0154】
或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、１×１０－７Ｍ、１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１２Ｍ又は１×１０－１３Ｍ未満の解離速度定数（ＫＤ）でＧＰＶＩに対して一価親和性を有する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0155】
或る特定の実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、更により好ましくは０．５ｎＭ以下の一価親和性でＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0156】
更なる実施形態では、本開示は、７０ｐＭ以下の一価親和性でヒトＧＰＶＩに結合する単離抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、９０ｐＭ以下の一価親和性でカニクイザルＧＰＶＩに結合する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、１００ｐＭ以下の一価親和性でヒトＧＰＶＩ及びカニクイザルＧＰＶＩに結合する。
【0157】
また更なる実施形態では、本開示は、３０ｎＭ以下、好ましくは９ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下の一価親和性でマウスＧＰＶＩに結合する単離抗体又は抗体フラグメントに関する。また更なる実施形態では、本開示は、１００ｐＭ以下の一価親和性でヒト及びカニクイザルＧＰＶＩに結合し、９０００ｐＭ以下、好ましくは１０００ｐＭ以下の一価親和性でマウスＧＰＶＩに結合する単離抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0158】
更なる実施形態では、本開示は、１００ｐＭ以下の一価親和性でヒトＧＰＶＩに結合し、１０００ｐＭ以下の一価親和性でマウスＧＰＶＩに結合する、本開示による単離抗体又は抗体フラグメントに関する。実施形態では、上記一価親和性は、Ｆａｂフォーマットで決定される。
【0159】
一実施形態では、上記単離抗体又は抗体フラグメントの一価親和性は、本明細書で実施例５に記載される溶液平衡滴定（Solution Equilibrium Titration；ＳＥＴ）によって、可溶性ＧＰＶＩを用いて決定される。
【0160】
一実施形態では、上記ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0161】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0162】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0163】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。
【0164】
或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0165】
或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される１０ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される、１ｎＭのＥＣ５０濃度でヒトＧＰＶＩ及びカニクイザルＧＰＶＩに結合し、１０ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でマウスＧＰＶＩに結合し、６０ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でラットＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。好ましい実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される、１ｎＭのＥＣ５０濃度でヒトＧＰＶＩ及びカニクイザルＧＰＶＩに結合し、５ｎＭ以下のＥＣ５０でマウスＧＰＶＩに結合し、２０ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でラットＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される１６ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。或る特定の実施形態では、本開示は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される２ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩに特異的に結合する、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0166】
更なる実施形態では、上記ＧＰＶＩをプレートの表面にコーティングする。
【0167】
一実施形態では、上記ＥＣ５０濃度は、本明細書で実施例３に記載されるＥＬＩＳＡアッセイによって、可溶性ＧＰＶＩ／Ｆｃを用いて決定される。
【0168】
一実施形態では、上記ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0169】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0170】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0171】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。
【0172】
或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される１５ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１３ｎＭ以下、１２ｎＭ以下、１１ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0173】
一実施形態では、上記ＥＣ５０濃度は、本明細書で実施例４に記載されるＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される。
【0174】
或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される１５ｎＭ以下、好ましくは６ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＶＰＩ及びマウスＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0175】
或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される、１ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でヒトＧＰＶＩに結合し、２ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でカニクイザルＧＰＶＩに結合し、６ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でマウスＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。或る特定の実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な単離抗体又は抗体フラグメントであって、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定される１５ｎＭ以下、好ましくは６ｎＭ以下のＥＣ５０濃度でマウスＧＰＶＩに結合する、抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【0176】
更なる実施形態では、上記ＧＰＶＩは、細胞の表面上に存在する。更なる実施形態では、上記ＧＰＶＩは、組み換え細胞の表面上に存在する。更なる実施形態では、上記ＧＰＶＩは、血小板の表面上に存在する。更なる実施形態では、上記ＧＰＶＩはヒト、カニクイザル又はマウス血小板の表面上に存在する。
【0177】
一実施形態では、上記ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0178】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0179】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0180】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。一実施形態では、上記ＦａｂはヒトＦａｂである。
【0181】
機能的実施形態
概して、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩとコラーゲンとの間の相互作用を防止又は阻害し、ＧＰＶＩにより媒介されるシグナル伝達経路を防止、阻害又は低減し、及び／又はＧＰＶＩが関与する生物学的経路及び機構を変調するために使用することができる。
概して、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩとコラーゲンとの間の相互作用を防止又は阻害し、ＧＰＶＩにより媒介されるシグナル伝達経路を防止、阻害又は低減し、及び／又はＧＰＶＩが関与する生物学的経路及び機構を変調するために使用することができる。
【0182】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントであって、ＧＰＶＩ媒介シグナル伝達を特異的に妨げることが可能である、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0183】
機能活性をアッセイする方法には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び当該技術分野で既知の他の方法等の結合アッセイを用いることができる（Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN)及びMaddox, D.E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216を参照されたい）。代替的には、アッセイにより、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでＧＰＶＩへの結合の結果として生物学的応答を引き起こす本開示の抗体又は抗体フラグメントの能力を試験することができる。かかるアッセイは、本明細書に記載される。他の好適なアッセイが当業者に既知である。コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を測定する方法は、特定の方法に限定されず、他の従来の方法によって行うこともできる。
【0184】
一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩ活性に拮抗する。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩ活性を中和する。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩシグナル伝達を阻害する。
【0185】
ＧＰＶＩ－コラーゲン結合の阻害
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩ結合を阻害することが可能である。一実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を阻害する。実施形態では、上記ＧＰＶＩは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩからなる群から選択される。
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩ結合を阻害することが可能である。一実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を阻害する。実施形態では、上記ＧＰＶＩは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩからなる群から選択される。
【0186】
或る特定の実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ又はマウスＧＰＶＩの結合を阻害する。
【0187】
一実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を阻害する。更なる実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を阻害し、該ＧＰＶＩはマウスＧＰＶＩである。或る特定の実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を阻害し、該コラーゲンはヒトコラーゲン、ラット大動脈コラーゲン、ウサギ大動脈コラーゲン又はカニクイザル大動脈コラーゲンである。
【0188】
或る特定の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満、８０ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６０ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、９ｐＭ未満、８ｐＭ未満、７ｐＭ未満、６ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、２ｐＭ未満又は１ｐＭ未満のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0189】
実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を１５ｎＭ以下、更により好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。或る特定の実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0190】
或る特定の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのマウスＧＰＶＩの結合を３０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度、好ましくは１５ｎＭ以下のＩＣ５０濃度、好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0191】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満、８０ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６０ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、９ｐＭ未満、８ｐＭ未満、７ｐＭ未満、６ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、２ｐＭ未満又は１ｐＭ未満のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0192】
更なる実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を１５ｎＭ以下のＩＣ５０濃度、より好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。別の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンへのマウスＧＰＶＩの結合を１５ｎＭ以下のＩＣ５０濃度、より好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0193】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、１００％阻害する。
【0194】
一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を２００ｎＭの濃度で少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、１００％阻害する。
【0195】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を２００ｎＭの濃度で少なくとも９８％阻害する。
【0196】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を２００ｎＭの濃度で少なくとも９８％阻害する。
【0197】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに結合し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を少なくとも９８％阻害する。
【0198】
また別の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を２００ｎＭの濃度で少なくとも９８％阻害する。
【0199】
更なる実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を１５ｎＭ以下のＩＣ５０濃度、好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を少なくとも９８％阻害する。
【0200】
更なる実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を１５ｎＭ以下のＩＣ５０濃度、好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を２００ｎＭの濃度で少なくとも９８％阻害する。
【0201】
また別の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ及びマウスＧＰＶＩの結合を１５ｎＭ未満のＩＣ５０濃度、好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で少なくとも９８％阻害し、１０ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下の解離速度定数（ＫＤ）でＧＰＶＩに対して一価親和性を有する。
【0202】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0203】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0204】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0205】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。一実施形態では、上記ＦａｂはヒトＦａｂである。
【0206】
ＩＣ５０濃度及び／又は最大達成阻害効果は、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、ＦＡＣＳ又はＭＳＤ（Meso Scale Discovery）によって決定することができる。一実施形態では、ＩＣ５０濃度及び／又は最大達成阻害効果は、本明細書で実施例６に記載される受容体阻害アッセイにおいて決定される。一実施形態では、ＩＣ５０濃度及び／又は最大達成阻害効果は、本明細書で実施例６に記載される方法によって決定することができる。
【0207】
細胞接着
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲン等のＧＰＶＩのリガンドへのヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンコーティング表面に対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンコーティング表面に対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲン等のＧＰＶＩのリガンドへのヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンコーティング表面に対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンコーティング表面に対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を阻害する。
【0208】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンへのＧＰＶＩ発現細胞の接着を３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下又は１ｐＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0209】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンに対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を３ｎＭ以下、好ましくは２ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0210】
また別の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンに対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を３ｎＭ以下、好ましくは２ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害する。
【0211】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンに対するＧＰＶＩ発現細胞の接着を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、実質的に１００％阻害する。
【0212】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンに対するＧＰＶＩ発現細胞の接着を２００ｎＭの濃度で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、１００％阻害する。
【0213】
一実施形態では、本開示の上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンに対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を２００ｎＭの濃度で少なくとも８５％阻害する。
【0214】
また別の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンに対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を２００ｎＭの濃度で少なくとも８５％阻害する。
【0215】
また別の実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＧＰＶＩ、カニクイザルＧＰＶＩ、マウスＧＰＶＩ及びラットＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンに対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を３ｎＭ以下、好ましくは２ｎＭ以下のＩＣ５０濃度で阻害し、コラーゲンに対するヒトＧＰＶＩ発現細胞の接着を２００ｎＭの濃度で少なくとも８５％阻害する。
【0216】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0217】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0218】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0219】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。一実施形態では、上記ＦａｂはヒトＦａｂである。
【0220】
ＩＣ５０濃度及び／又は最大達成阻害効果は、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、ＦＡＣＳ又はＭＳＤ（Meso Scale Discovery）によって決定することができる。一実施形態では、ＩＣ５０濃度及び／又は最大達成阻害効果は、本明細書で実施例７に記載される細胞接着アッセイにおいて決定される。一実施形態では、ＩＣ５０濃度及び／又は最大達成阻害効果は、本明細書で実施例７に記載される方法によって決定することができる。
【0221】
凝集
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒト多血小板血漿及びヒト全血の両方においてコラーゲン等のＧＰＶＩリガンドによって誘導される血小板凝集を阻害することが可能である。
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒト多血小板血漿及びヒト全血の両方においてコラーゲン等のＧＰＶＩリガンドによって誘導される血小板凝集を阻害することが可能である。
【0222】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲン等のＧＰＶＩのリガンドに応答した血小板凝集を阻害する。一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害する。一実施形態では、上記コラーゲンはヒト、ウサギ又はカニクイザルコラーゲンである。
【0223】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、０．２５μｇ／ｍＬ以上、０．５μｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３．３μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上の濃度で使用した場合にコラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を阻害する。
【0224】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、１００％阻害する。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、少なくとも３．３μｇ／ｍｌの濃度で使用した場合にコラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、１００％阻害する。
【0225】
一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を１００％阻害する。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、１０μｇ／ｍＬ以上の濃度で使用した場合にコラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を実質的に１００％阻害する。
【0226】
一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、３．３μｇ／ｍＬの濃度で使用した場合にコラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を少なくとも７０％阻害する。
【0227】
一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、カニクイザル大動脈コラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を阻害する。更なる実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、少なくとも３．３μｇ／ｍＬ以上の濃度で使用した場合、好ましくは１０μｇ／ｍＬの濃度で使用した場合にカニクイザル大動脈コラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を阻害する。一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、１０μｇ／ｍＬの濃度で使用した場合にカニクイザル大動脈コラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集を少なくとも５０％阻害する。
【0228】
一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害するが、他の血小板凝集誘導物質（例えば、ＧＰＶＩの他のアゴニスト）、例えばＡＤＰ、ＴＲＡＰ又はＰＡＲ１によって誘導される血小板凝集には影響しない。
【0229】
さらに、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒト動脈硬化性プラーク物質により誘導される血小板凝集を阻害することもできる。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ヒト動脈硬化性プラークにより誘導されるヒト血小板凝集を実質的に１００％阻害する。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、２μｇ／ｍＬ以上の濃度で使用した場合にヒト動脈硬化性プラークにより誘導されるヒト血小板凝集を１００％阻害する。
【0230】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0231】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0232】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0233】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。一実施形態では、上記ＦａｂはヒトＦａｂである。
【0234】
凝集に対して達成される阻害効果は、本明細書で実施例９又は実施例１０に記載されるインピーダンス凝集測定法によって決定することができる。
【0235】
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、コラーゲンコーティング表面上で流動下の血小板凝集を阻害することもできる。さらに、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ヒト動脈硬化性プラークをコーティングした表面上で流動下のヒト血小板凝集を阻害することもできる。本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ヒト動脈硬化性プラークをコーティングした表面上で流動下の血小板凝集を阻害することもできる。本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ヒト動脈硬化性プラークによって誘導される流動下の血小板凝集を阻害することもできる。
【0236】
或る特定の実施形態では、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、流動下のヒト動脈硬化性プラークにより誘導される血小板凝集を少なくとも９５％阻害する。或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、２．０μｇ／ｍＬ以上の濃度で使用した場合に流動下のヒト動脈硬化性プラークにより誘導される血小板凝集を少なくとも９５％阻害する。或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、２．０μｇ／ｍＬ以上の抗体濃度で使用した場合に流動下のヒト動脈硬化性プラークにより誘導されるヒト血小板凝集を少なくとも９５％阻害する。或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、２．０μｇ／ｍＬ以上の抗体濃度で使用した場合に流動下の経時的なヒト動脈硬化性プラークにより誘導される血小板凝集を少なくとも９５％阻害する。
【0237】
或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、アセチルサリチル酸とチカグレロルとの組合せと比較して、流動下の経時的な動脈硬化性プラークにより誘導される血小板凝集の阻害により効果的である。或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、２．０μｇ／ｍＬの抗体濃度で使用した場合に、アセチルサリチル酸とチカグレロルとの組合せと比較して、流動下の経時的な動脈硬化性（arteriosclerotic）プラークにより誘導される血小板凝集の阻害により効果的である。
【0238】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0239】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0240】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0241】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。一実施形態では、上記ＦａｂはヒトＦａｂである。
【0242】
流動条件下での凝集に対して達成される阻害効果は、本明細書で実施例１１に記載されるように決定することができる。
【0243】
ｉｎ ｖｉｖｏ活性
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血栓形成（例えば、血小板凝集及び接着）を阻害又は防止することもできる。
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血栓形成（例えば、血小板凝集及び接着）を阻害又は防止することもできる。
【0244】
一実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏでコラーゲン結合に応答して血栓を形成する血小板の能力を阻害する。
【0245】
本明細書で実施例１２に記載される方法において、本開示による抗体フラグメントは、３ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．３ｍｇ／ｋｇ以下又は０．１ｍｇ／ｋｇ以下の抗体濃度でコラーゲンにより誘導される血小板の血栓形成を投与前の値又は対照値と比較して２０％、４０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上減少させる活性を有する。
【0246】
本明細書で実施例１２に記載される方法において、抗体フラグメントは、約３．３ｍｇ／ｋｇの抗体濃度で血小板の血栓形成を投与前の値又は対照値と比較して２０％相当、４０％以上、より好ましくは６０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上減少させるｉｎ ｖｉｖｏ活性を有する。
【0247】
本明細書で実施例１２に記載される方法において、抗体フラグメントは、約３．３ｍｇ／ｋｇの抗体濃度でｉｎ ｖｉｖｏでの血栓形成を実質的に完全に防ぐｉｎ ｖｉｖｏ活性を有する。
【0248】
安全性
出血
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、被験体における出血時間の増加を誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、被験体における出血時間を実質的又は顕著に延長しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、被験体における出血時間を延長しない。一実施形態では、被験体において出血時間を延長する本開示の抗体又は抗体フラグメントの能力は弱い。
出血
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、被験体における出血時間の増加を誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、被験体における出血時間を実質的又は顕著に延長しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、被験体における出血時間を延長しない。一実施形態では、被験体において出血時間を延長する本開示の抗体又は抗体フラグメントの能力は弱い。
【0249】
出血時間は、公に知られている方法によってアッセイすることができ、具体的には実施例１４に記載の方法が適用可能であり得る。
【0250】
一実施形態では、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、治療有効量、例えば０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで被験体における出血時間を実質的に延長しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で出血時間を実質的に延長しない。
【0251】
具体的には、出血時間は５倍以下、好ましくは３倍以下、２倍以下、１．５倍以下であるか、又は投与前の値、正常値若しくは対照と実質的に等しい。
【0252】
本開示の抗体又は抗体フラグメントは、アセチルサリチル酸単独での投与と比較して、アセチルサリチル酸と同時投与した場合に治療有効量で出血時間を実質的に延長しない。
【0253】
本開示の抗体又は抗体フラグメントは、アセチルサリチル酸単独での投与と比較して、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）と同時投与した場合に治療有効量、例えば０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで出血時間を延長しない。
【0254】
血小板数
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板数の減少を実質的に誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、被験体に投与した場合にｉｎ ｖｉｖｏで血小板数の減少を実質的に誘導しない。本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板数に対して活性を有しないのが好ましい。
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板数の減少を実質的に誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、被験体に投与した場合にｉｎ ｖｉｖｏで血小板数の減少を実質的に誘導しない。本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板数に対して活性を有しないのが好ましい。
【0255】
したがって、一実施形態では、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、被験体に投与した場合に血小板減少症を実質的に誘導しない。更なる実施形態では、本開示の上記抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板減少症を実質的に誘導しない。
【0256】
ｉｎ ｖｉｖｏでの血小板減少症は、本開示の抗体又は抗体フラグメントのｉｎ ｖｉｖｏ投与後に経時的に血液を採取し、血小板の数を従来の方法で算出し、その数を投与前の値又は対照としての個体の血小板の数と比較することによって決定することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの血小板減少症は、本開示の実施例１５に記載されるように決定することができる。
【0257】
一実施形態では、本開示のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合、例えば治療有効量で投与した場合に血小板数の減少、すなわち血小板減少症を誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与した場合に血小板数の減少、すなわち血小板減少症を誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与し、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した場合に血小板数の減少、すなわち血小板減少症を誘導しない。
【0258】
本開示の抗体又は抗体フラグメントによって低下した後の血小板数は、投与前の値又は対照値を１００％として設定した場合に、好ましくは５０％以上、７０％以上、９０％以上、又は上記抗体の投与前の血小板数若しくは対照と実質的に同じである。
【0259】
本開示の抗体又は抗体フラグメントによって低下した後の血小板数は、投与前の値又は対照値を１００％として設定し、抗体を例えば０．３ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは３ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した場合に５０％以上、７０％以上、９０％以上、又は好ましくは上記抗体の投与前の血小板数若しくは対照とほぼ同じである。
【0260】
細胞表面発現／脱落／内在化
ＧＰＶＩは下方制御するか、又は血小板膜若しくは表面から枯渇させることができる。このＧＰＶＩタンパク質レベルの変調は、リガンド（コラーゲン等）結合及びその後の受容体活性化によって誘発することができ、例えばＧＰＶＩの細胞外ドメインの切断（例えば、脱落）又はリガンドにより誘導されるＧＰＶＩ受容体内在化をもたらす。血小板活性化は、リガンドの機能を模倣するＧＰＶＩに特異的な抗体の関与によっても生じ得る。ＧＰＶＩに特異的な抗体がＧＰＶＩのアゴニストリガンドの機能を模倣する場合、その抗体をＧＰＶＩのアゴニストとみなすことができる。
ＧＰＶＩは下方制御するか、又は血小板膜若しくは表面から枯渇させることができる。このＧＰＶＩタンパク質レベルの変調は、リガンド（コラーゲン等）結合及びその後の受容体活性化によって誘発することができ、例えばＧＰＶＩの細胞外ドメインの切断（例えば、脱落）又はリガンドにより誘導されるＧＰＶＩ受容体内在化をもたらす。血小板活性化は、リガンドの機能を模倣するＧＰＶＩに特異的な抗体の関与によっても生じ得る。ＧＰＶＩに特異的な抗体がＧＰＶＩのアゴニストリガンドの機能を模倣する場合、その抗体をＧＰＶＩのアゴニストとみなすことができる。
【0261】
一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、血小板を実質的に活性化しない、好ましくは活性を有しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板を実質的に活性化しない、好ましくは活性を有しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、血小板の表面上のＧＰＶＩに結合し、血小板上でのＧＰＶＩ経路の活性化を防ぐ。
【0262】
一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板の表面からのＧＰＶＩの枯渇を誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、被験体に投与した場合に血小板表面からのＧＰＶＩの枯渇を誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板表面からＧＰＶＩを実質的に枯渇させない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで該抗体又は抗体フラグメントと血小板とを接触させた場合に血小板表面からＧＰＶＩを実質的に枯渇させない。
【0263】
一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合、例えば０．０１ｍｇ～５００ｍｇの範囲の治療有効量で投与した場合に血小板表面からのＧＰＶＩの枯渇を誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した場合に血小板表面からのＧＰＶＩの枯渇を誘導しない。
【0264】
一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、該抗体又は抗体フラグメントと血小板とを接触させた場合に、血小板ＧＰＶＩの脱落、特に血小板活性化に伴うメタロプロテアーゼ媒介切断による血小板ＧＰＶＩの脱落によって血小板表面からＧＰＶＩを実質的に枯渇させない。
【0265】
本開示の抗体又は抗体フラグメントは、血小板表面からのＧＰＶＩの脱落、特に血小板活性化に伴うメタロプロテアーゼ媒介切断による血小板からのＧＰＶＩの脱落を実質的に誘導しない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを血小板と接触させること、特に該抗体又は抗体フラグメントを血小板とｉｎ ｖｉｖｏで接触させることによって血小板表面からのＧＰＶＩの枯渇を誘導しない。
【0266】
かかる活性は、本開示の抗体又は抗体フラグメントを血小板と所与の時間にわたって接触させ、続いて血小板を単離し、表面上でのＧＰＶＩの発現レベルをアッセイすることによって確認することができる。ＧＰＶＩの発現レベルは、ＦＡＣＳ等を用いる従来の方法によって測定することができ、具体的な方法を実施例１６で説明する。
【0267】
本開示の抗体又は抗体フラグメントは、０．１ｍｇ／ｋｇ以上、０．３ｍｇ／ｋｇ以上、１ｍｇ／ｋｇ以上、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ以上の濃度で、血小板表面からのＧＰＶＩの枯渇を被験体への投与前の値又は対照値と比較して２０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上誘導しない。
【0268】
本開示の抗体又は抗体フラグメントは、血小板と本開示の抗体又は抗体フラグメントとを接触させることによって、血小板からのＧＰＶＩの内在化により血小板表面上のＧＰＶＩを実質的に枯渇させない。
【0269】
血小板活性化
抗体は、完全免疫グロブリンとして存在する場合、二価分子であるため、コラーゲン等のその天然のアゴニストリガンドと同様に、血小板の表面上でのＧＰＶＩ受容体クラスタリング、ひいては血小板活性化を誘導する可能性がある。これを回避するために、本開示の発明者らは、ＧＰＶＩに特異的な一価抗体又は抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを開発した。
抗体は、完全免疫グロブリンとして存在する場合、二価分子であるため、コラーゲン等のその天然のアゴニストリガンドと同様に、血小板の表面上でのＧＰＶＩ受容体クラスタリング、ひいては血小板活性化を誘導する可能性がある。これを回避するために、本開示の発明者らは、ＧＰＶＩに特異的な一価抗体又は抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを開発した。
【0270】
しかしながら、本来は免疫グロブリンの分解産物としてのみ存在するＦａｂは、依然として患者に特異的に血小板活性化を誘導する能力を示す。これは、被験体の血清中に存在する既存の抗体によって認識され、特異的に結合され得るエピトープを形成するＦａｂのＣ末端（C-terminal end (C-terminus)）に起因すると考えられる。次いで、これらの既存の抗体は、二価又は多価抗体分子の回復のために免疫応答を引き起こし、望ましくない血小板活性化をもたらす可能性がある。かかる抗Ｆａｂ抗体のエピトープを形成するアミノ酸配列は、自己抗原配列と称され得る（Kormeier et al. (1968) J. Immunol. 100(3); 612-21、Persselin and Stevens (1985) J. Clin. Invest. 76; 723-30）。したがって、「非自己抗原配列」という用語は、本明細書で使用される場合、被験体に存在する既存の抗体によって認識されるエピトープではない又はそれを形成しないアミノ酸配列を指す。
【0271】
アミノ酸配列が自己抗原配列として作用するかを決定するために、試験対象の特定の配列を含むペプチド構築物をヒト血清に曝露して、ペプチド構築物を認識し、それに特異的に結合する抗体が血清中に存在するかを決定することができる。より具体的には、免疫グロブリンの特定のアミノ酸配列が自己抗原配列であるかを特定するために、ＩｇＧ分子を、例えばプロテアーゼのパネルで切断し、Ｃ末端領域に種々の配列を有するＩｇＧフラグメントを得ることができる。代替的には、ペプチド及びポリペプチドは、ＩｇＧ Ｃ末端領域の配列に対してモデル化されるペプチド合成又は組み換えＤＮＡ技術によって作製することができる。いずれの場合にも、ヒト血清をスクリーニングして、それぞれ特定の露出Ｃ末端アミノ酸配列又は合成ペプチドに結合する既存の抗体が存在するかを決定することができる。
【0272】
虚血性イベントの治療のための安全な治療法を提供するために、Ｆａｂ等の開発された抗体フラグメントのこの活性化能が存在しないか又は非常に弱いことを確実にする必要がある。したがって、一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的なＦａｂは血小板を実質的に活性化せず、好ましくは活性を有しない。血小板の活性化は、既知の方法によって測定することができ、血小板表面抗原、好ましくはＣＤ６２Ｐの発現レベルを指標として用いることができる。
【0273】
例えば、一価抗体又は抗体フラグメントを投与した被験体から所与の期間の後に血小板を単離し、ＣＤ６２Ｐの発現レベルを従来の方法によって測定する方法、本開示によるＧＰＶＩに特異的な一価抗体又は抗体フラグメントを被験体から単離された血小板と接触させ、所与の期間の後にＣＤ６２Ｐの発現レベルを従来の方法によってアッセイする方法等が含まれる。具体的な方法を実施例１３に示す。
【0274】
したがって、一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的なＦａｂは、被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による該Ｆａｂの認識のために血小板を実質的に活性化することがない。更なる実施形態では、本開示のＧＰＶＩに特異的なＦａｂは、ＣＤ６２Ｐ等の血小板上の細胞表面活性化マーカーの発現を実質的に誘導しない。
【0275】
本願の発明者らは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端での修飾が、血小板活性化を誘導するかかるＦａｂの能力を、例えば被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による上記ＧＰＶＩに特異的なＦａｂの認識を防止することによって更に低減、防止又は阻害し得ることを実証した。
【0276】
本明細書で「による認識の防止」又は「の結合の防止」は、本開示によるＧＰＶＩに特異的なＦａｂが、被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体の存在のために血小板表面上のＧＰＶＩを架橋し、ＧＰＶＩシグナル伝達を活性化することがないことを意味する。かかる架橋は、天然のリガンド（コラーゲン等）の活性を模倣し、ＧＰＶＩ受容体活性化をもたらすことができる。言い換えると、本開示のＦａｂは、アンタゴニストとして作用する代わりにアゴニストとして作用することができる。ＧＰＶＩ受容体機能を中和するアンタゴニストＧＰＶＩ特異抗体若しくは抗体フラグメント、又はＧＰＶＩの機能を活性化するアゴニストＧＰＶＩ特異抗体若しくは抗体フラグメントは、ＧＰＶＩの機能を反映するｉｎ ｖｉｖｏマーカーをアッセイすることによって評定することができる。
【0277】
したがって、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的な抗体フラグメントを提供する。一実施形態では、上記抗体フラグメントはＦａｂである。かかる重鎖定常領域の修飾は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端での又はＣ末端への１つ以上のアミノ酸残基の付加又は置換を含む。
【0278】
したがって、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、修飾重鎖定常領域が被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による該Ｆａｂの認識を防止又は阻害する、Ｆａｂを提供する。
【0279】
本開示の一実施形態では、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂの重鎖定常領域は、１つ以上のアミノ酸の付加又は置換、好ましくは２つ以上のアミノ酸、例えばアミノ酸配列（例えば、ポリペプチド）の付加又は置換によって修飾することができる。かかる付加又は置換されるポリペプチドは、本開示のＦａｂ中に導入された場合に非自己抗原配列を構成することができ、ＧＰＶＩへの該Ｆａｂの結合を妨げない限りにおいて任意のアミノ酸配列であり得る。
【0280】
本明細書で使用される場合、「改変された」又は「修飾された」は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にアミノ酸伸長（例えば、付加）又は置換を含有するように遺伝的に改変されたＦａｂを指す。
【0281】
一実施形態では、ポリペプチドをＦａｂ重鎖のＣ末端に付加する。一実施形態では、ポリペプチドをＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端に付加する。代替的には、存在する場合にＦａｂ重鎖のＣ末端のヒンジ部分をポリペプチドで置換する。一実施形態では、上記Ｆａｂのヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣ（配列番号１０１）を含むか又はそれからなる。
【0282】
そのため、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、本開示によるＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、修飾重鎖定常領域がＮ末端からＣ末端に向かって順にＣＨ１ドメインと非自己抗原配列を構成することが可能なポリペプチドとを含み、該修飾重鎖定常領域が被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による該Ｆａｂの認識を防止又は阻害する、Ｆａｂを提供する。
【0283】
一実施形態では、上記被験体はヒトである。一実施形態では、上記ＣＨ１ドメインはヒトＣＨ１ドメインである。
【0284】
一実施形態では、上記ポリペプチドは、非自己抗原配列を構成する。一実施形態では、上記ポリペプチドは、１個～１００個のアミノ酸、１個～５０個のアミノ酸、１個～２０個のアミノ酸、１個～１５個のアミノ酸、又は１個～１０個のアミノ酸、又は１個～５個のアミノ酸、又は１個のアミノ酸を含む。
【0285】
一実施形態では、上記ポリペプチドは、Ｆａｂの重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合の形成を可能にし、分子を安定化するシステインを１つのみ含む。特定の実施形態では、上記システインは、本開示のＦａｂの修飾重鎖定常領域の最後のアミノ酸残基である。本開示の更なる実施形態では、システインは、第１のＦａｂ分子の重鎖定常領域と第２のＦａｂ分子の重鎖定常領域との間のジスルフィド結合の形成を可能にしない。本開示の更なる実施形態では、非自己抗原配列は、（Ｆａｂ）２分子の形成を防ぐ。本開示の更なる実施形態では、上記ポリペプチドは、１つ以下のシステインを含有する。
【0286】
一実施形態では、非自己抗原配列を構成することが可能なポリペプチドは、アミノ酸配列ＥＲＲＸ２Ｘ３ＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０２）を含み、ここで、Ｘ２及びＸ３は、システイン以外の任意の自然発生アミノ酸残基であり得る。一実施形態では、上記ポリペプチドは、ＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０３）、ＥＥＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０４）、ＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０５）及びＶＰＲＥＣ（配列番号１０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態では、上記ポリペプチドは、アミノ酸配列ＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０５）からなる。非自己抗原配列を構成することが可能な上記ポリペプチドが、例えば作製される本開示のＦａｂ中に存在する潜在的翻訳後修飾部位又は潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するために付加的なアミノ酸置換を含み得ることが本開示の範囲内である。
【0287】
そのため、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、本開示によるＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、修飾重鎖定常領域がＮ末端からＣ末端に向かって順にＣＨ１ドメインと該ＦａｂのＣ末端に付加する場合に非自己抗原配列を構成することが可能なポリペプチドとを含み、該ポリペプチドがアミノ酸配列ＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０５）からなり、上記修飾重鎖定常領域が被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による上記Ｆａｂの認識を防止又は阻害する、Ｆａｂを提供する。
【0288】
一実施形態では、上記ＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインからなる群から選択される。一実施形態では、上記ＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。実施形態では、上記ＣＨ１ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインの任意のアロタイプであるか、又は野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【0289】
或る特定の実施形態では、上記修飾重鎖定常領域は、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＥＣ（配列番号１０７）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０８）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＥＫＫＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０９）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＧＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１０）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＥＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１１）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＥＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１２）、及び、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＥＶＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１３）、
又は配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２若しくは配列番号１１３と多くとも１０個のアミノ酸が異なるか、又はこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＥＣ（配列番号１０７）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０８）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＥＫＫＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１０９）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＧＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１０）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＥＶＥＲＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１１）、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＥＲＮＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１２）、及び、
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＥＶＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１３）、
又は配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２若しくは配列番号１１３と多くとも１０個のアミノ酸が異なるか、又はこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【0290】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、本明細書で開示されるＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、該修飾重鎖定常領域がアミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＥＶＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１３）からなる、Ｆａｂを提供する。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＥＶＥＲＲＱＧＧＩＧＨＫＣ（配列番号１１３）からなる、Ｆａｂを提供する。
【0291】
或る特定の実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域と、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、並びに、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬの組合せとを含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、上記修飾重鎖定常領域が配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Ｆａｂを提供する。一実施形態では、上記修飾重鎖定常領域は、配列番号１１３からなる。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、並びに、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬの組合せとを含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、上記修飾重鎖定常領域が配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Ｆａｂを提供する。一実施形態では、上記修飾重鎖定常領域は、配列番号１１３からなる。
【0292】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、並びに、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬの組合せを含み、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を更に含む、Ｆａｂを提供する。好ましい実施形態では、上記修飾重鎖定常領域は、配列番号１１３からなる。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、並びに、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
からなる群から選択されるＶＨ及びＶＬの組合せを含み、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を更に含む、Ｆａｂを提供する。好ましい実施形態では、上記修飾重鎖定常領域は、配列番号１１３からなる。
【0293】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号２１の重鎖及び配列番号１９の軽鎖を含む、Ｆａｂに関する。
【0294】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号３２の重鎖及び配列番号３０の軽鎖を含む、Ｆａｂに関する。
【0295】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号４３の重鎖及び配列番号４１の軽鎖を含む、Ｆａｂに関する。
【0296】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号５４の重鎖及び配列番号５２の軽鎖を含む、Ｆａｂに関する。
【0297】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号２１の重鎖及び配列番号１９の軽鎖からなる、Ｆａｂに関する。
【0298】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号３２の重鎖及び配列番号３０の軽鎖からなる、Ｆａｂに関する。
【0299】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号４３の重鎖及び配列番号４１の軽鎖からなる、Ｆａｂに関する。
【0300】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、配列番号５４の重鎖及び配列番号５２の軽鎖からなる、Ｆａｂに関する。
【0301】
更なる実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂに関し、該Ｆａｂは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0302】
一実施形態では、本開示は、修飾重鎖定常領域を含む、本開示によるＧＰＶＩに特異的なＦａｂであって、修飾重鎖定常領域がＮ末端からＣ末端に向かって順にＣＨ１ドメインと非自己抗原配列を構成することが可能なポリペプチドとを含み、該修飾重鎖定常領域が被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による該Ｆａｂの認識を防止又は阻害し、該Ｆａｂが配列番号４３の重鎖及び配列番号４１の軽鎖からなる、Ｆａｂを提供する。
【0303】
したがって、本開示は、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂを使用する場合に被験体の血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体による血小板活性化を防ぐ方法であって、
（ａ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂを準備することと、
（ｂ）非自己抗原を構成することが可能なポリペプチドを上記Ｆａｂの重鎖定常領域のＣ末端に付加又は置換することと、
を含む、方法も提供する。
（ａ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂを準備することと、
（ｂ）非自己抗原を構成することが可能なポリペプチドを上記Ｆａｂの重鎖定常領域のＣ末端に付加又は置換することと、
を含む、方法も提供する。
【0304】
交差競合／エピトープ
実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントと交差競合する抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、表１～表４に開示される抗体の１つのＫａｂａｔによって規定される６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントと交差競合する抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、表１～表４に開示される抗体の１つのＫａｂａｔによって規定される６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0305】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合し、ＨＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号１４のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１５のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号１７によるＶＨ及び配列番号１８によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0306】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合し、ＨＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２３のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２４のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号２５のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号２６のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号２７のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２８によるＶＨ及び配列番号２９によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0307】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合し、ＨＣＤＲ１が配列番号３４のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号３４のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３５のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号３６のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号３７のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号３８のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３９によるＶＨ及び配列番号４０によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0308】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合し、ＨＣＤＲ１が配列番号４４のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号４５のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号４６のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号４７のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号４８のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号４９のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５０によるＶＨ及び配列番号５１によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと交差競合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0309】
別の実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントと交差競合し、ＥＬＩＳＡベースの交差競合アッセイにおいてＧＰＶＩへの表１～表４に開示される抗体のいずれか１つの結合を少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％低減する抗体又は抗体フラグメントに関する。或る特定の実施形態では、表１～表４に開示される抗体又は抗体フラグメントと交差競合する抗体又は抗体フラグメントは、実施例１７によるＥＬＩＳＡベースの交差競合アッセイにおいてＧＰＶＩへの表１～表４に記載される抗体の１つの結合を少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％低減する。
【0310】
別の実施形態では、本開示は、（例えば、結合、安定化、空間分布により）表１～表４に開示される抗体の１つと同じエピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントに関する。更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、（例えば、結合、安定化、空間分布により）表１～表４に開示される抗体の１つのＫａｂａｔによって規定される６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合する。また別の実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、（例えば、結合、安定化、空間分布により）表１～表４に開示される抗体の１つのＫａｂａｔによって規定される６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと同じＧＰＶＩのエピトープに結合する。また別の実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、（例えば、結合、安定化、空間分布により）表１～表４に開示される抗体の１つのＫａｂａｔによって規定される６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと同じ、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのエピトープに結合する。
【0311】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合し、ＨＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号１４のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１５のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号１７によるＶＨ及び配列番号１８によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0312】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合し、ＨＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２３のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号２４のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号２５のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号２６のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号２７のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号２８によるＶＨ及び配列番号２９によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0313】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合し、ＨＣＤＲ１が配列番号３４のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号３４のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号３５のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号３６のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号３７のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号３８のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号３９によるＶＨ及び配列番号４０によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0314】
別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、６つのＣＤＲを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合し、ＨＣＤＲ１が配列番号４４のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ２が配列番号４５のアミノ酸配列であり、ＨＣＤＲ３が配列番号４６のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ１が配列番号４７のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ２が配列番号４８のアミノ酸配列であり、ＬＣＤＲ３が配列番号４９のアミノ酸配列である、抗体又は抗体フラグメントに関する。別の実施形態では、本開示は、抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号５０によるＶＨ及び配列番号５１によるＶＬを含む抗体又は抗体フラグメントと同じエピトープに結合する、抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0315】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該技術分野で既知の様々なエピトープマッピング法を用いて特定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、エピトープは、例えばタンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、ペプチドを支持体に付着させたままでペプチドと抗体とを反応させることによって決定することができる。かかる技法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号、Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002、Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182、Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715に記載されている。同様に、エピトープは、例えば水素／重水素交換、ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴等によってアミノ酸の空間立体配座を決定することによって容易に特定される。例えば、Epitope Mapping Protocols（上掲）を参照されたい。タンパク質の抗原性領域は、例えばOxford Molecular Groupから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを用いて算出されるもの等の標準的な抗原性及び疎水性プロットを用いて特定することもできる。このコンピュータプログラムには、抗原性プロファイルを決定するＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828）及び疎水性プロットのためのＫｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法（Kyte et al., (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132）が用いられる。
【0316】
或る特定の実施形態では、本開示の抗体と同じＧＰＶＩ上のエピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントは、ヒトモノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。或る特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントと同じＧＰＶＩ上の直線状エピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントは、ヒトモノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。或る特定の実施形態では、本開示の抗体と同じＧＰＶＩ上の立体構造エピトープに結合する抗体又は抗体フラグメントは、ヒトモノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。かかるヒトモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、本明細書に記載されるように調製し、単離することができる。
【0317】
治療方法
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する血栓性障害又は血管障害又は病態の予防法又は治療に用いることができる。
本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する血栓性障害又は血管障害又は病態の予防法又は治療に用いることができる。
【0318】
一実施形態では、本開示は、医薬に使用される本開示による抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、治療を必要とする被験体の治療に使用される、本開示による抗体又は抗体フラグメントに関する。一実施形態では、本開示は、薬剤の調製に使用される、本開示による抗体又は抗体フラグメントに関する。実施形態では、本明細書で開示される方法は、それを必要とする被験体に本開示による抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む。本開示は、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態の治療及び／又は予防法のための薬剤の調製に使用される、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの使用にも関する。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態の予防法又は治療のための方法を提供する。
【0319】
或る特定の実施形態では、本開示は、被験体における血栓性障害又は血管障害の予防法又は治療のための方法を提供する。
【0320】
ＧＰＶＩに関連する血栓性又は血管（例えば、心血管）障害又は病態としては、例えばアテローム血栓症を含む動脈血栓症、虚血性イベント、急性冠動脈症候群、心筋梗塞（心臓発作）、急性脳血管虚血（脳卒中）、経皮冠動脈インターベンション、ステント留置血栓症（stenting thrombosis）、虚血性再狭窄、虚血（急性及び慢性）、大動脈及びその分岐の障害（大動脈瘤、血栓症等）、末梢動脈障害、静脈血栓症、急性静脈炎及び肺塞栓症、癌関連血栓症（トルソー症候群）、炎症性血栓症、並びに感染に関連する血栓症を挙げることができるが、これらに限定されない。ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する更なる障害又は病態は、出血性障害又は病態（例えば、出血傾向及び／又は出血時間延長等）、例えば血小板減少症、例えば特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は免疫性血小板減少症であり得るが、これらに限定されない。また別の実施形態では、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態は、炎症及び／又は癌を含み得る。
【0321】
一実施形態では、本明細書で開示される方法は、被験体に治療有効量の本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを投与する工程を含む。一実施形態では、上記被験体はヒトである。代替的な実施形態では、上記被験体は、ラット又はマウス等の齧歯類である。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態の治療に使用される、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントに関する。
【0322】
本開示は、ＧＰＶＩ受容体機能及び下流のシグナル伝達を阻害し、それによりＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態を予防又は治療する方法であって、本開示による抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与することを含む、方法に更に関する。
【0323】
本開示は、血小板数、血小板表面のＧＰＶＩの存在又は出血時間に影響を及ぼすことなくＧＰＶＩ受容体機能及び下流のシグナル伝達を阻害する方法に関する。
【0324】
本開示は、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を防止又は阻害し、それによりＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態を治療又は予防する方法であって、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与することを含む、方法に更に関する。一実施形態では、コラーゲンへのＧＰＶＩの結合を防止又は阻害する方法は、被験体における血小板数、血小板表面のＧＰＶＩの存在又は出血時間に影響を及ぼさない。
【0325】
本開示は、コラーゲンへの血小板接着を阻害又は防止し、それによりＧＰＶＩ関連病態を治療する方法であって、本開示による抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与することを含む、方法に更に関する。一実施形態では、コラーゲンへのＧＰＶＩの接着を防止又は阻害する方法は、被験体における血小板数、血小板表面のＧＰＶＩの存在又は出血時間に影響を及ぼさない。
【0326】
別の実施形態では、本開示による抗体又は抗体フラグメントは、血小板凝集の阻害に使用される。このため、本開示は、コラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害又は防止し、それによりＧＰＶＩ関連病態を治療する方法であって、本開示による抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与することを含む、方法に更に関する。一実施形態では、コラーゲンにより誘導される血小板凝集を防止又は阻害する方法は、被験体における血小板数、血小板表面のＧＰＶＩの存在又は出血時間に影響を及ぼさない。
【0327】
本開示は、血小板活性化を阻害又は防止し、それによりＧＰＶＩ関連病態を治療する方法であって、本開示による抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与することを含む、方法に更に関する。一実施形態では、血小板活性化を防止又は阻害する方法は、被験体における血小板数、血小板表面のＧＰＶＩの存在又は出血時間に影響を及ぼさない。
【0328】
本開示は、被験体におけるコラーゲン結合に応答した血栓形成を防止又は阻害する方法であって、本開示による抗体又は抗体フラグメントを被験体に投与することを含む、方法に更に関する。一実施形態では、被験体におけるコラーゲン結合に応答した血栓形成を防止又は阻害する方法は、被験体における血小板数、血小板表面のＧＰＶＩの存在又は出血時間に影響を及ぼさない。
【0329】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、血小板と本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントとを接触させることを含む。
【0330】
一実施形態では、被験体は、ＧＰＶＩと関連する障害又は病態、好ましくは血栓性又は血管障害及び／又はイベントの影響を受ける、好ましくはそれと診断される。一実施形態では、被験体は、ＧＰＶＩと関連する障害又は病態、好ましくは血栓性又は血管障害及び／又はイベントを発症するリスクがある。リスクの例としては、家族歴（例えば、遺伝性素因等）、民族性、年齢、たばこ曝露、高血圧（high blood pressure (hypertension)）、高コレステロール、肥満、身体的機能低下、糖尿病（特に２型糖尿病）、不健康な食事及び有害なアルコール使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0331】
一実施形態では、本明細書に開示される方法で投与される、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
ａ）配列番号１１のＨＣＤＲ１領域、配列番号１２のＨＣＤＲ２領域、配列番号１３のＨＣＤＲ３領域、配列番号１４のＬＣＤＲ１領域、配列番号１５のＬＣＤＲ２領域及び配列番号１６のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｂ）配列番号２２のＨＣＤＲ１領域、配列番号２３のＨＣＤＲ２領域、配列番号２４のＨＣＤＲ３領域、配列番号２５のＬＣＤＲ１領域、配列番号２６のＬＣＤＲ２領域及び配列番号２７のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｃ）配列番号３３のＨＣＤＲ１領域、配列番号３４のＨＣＤＲ２領域、配列番号３５のＨＣＤＲ３領域、配列番号３６のＬＣＤＲ１領域、配列番号３７のＬＣＤＲ２領域及び配列番号３８のＬＣＤＲ３領域、又は、
ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１領域、配列番号４５のＨＣＤＲ２領域、配列番号４６のＨＣＤＲ３領域、配列番号４７のＬＣＤＲ１領域、配列番号４８のＬＣＤＲ２領域及び配列番号４９のＬＣＤＲ３領域、
を含む。
【0332】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
ａ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１８のＶＬ、又は、
ｂ）配列番号２８のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、又は、
ｃ）配列番号３９のＶＨ及び配列番号４０のＶＬ、又は、
ｄ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、又は、
配列番号１７、２８、３９若しくは５０のＶＨ及び配列番号１８、２９、４０若しくは５１のＶＬに対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ、
を含む。
【0333】
更なる実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
ａ）配列番号２０のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｂ）配列番号２１のＨＣ及び配列番号１９のＬＣ、又は、
ｃ）配列番号３１のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｄ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３０のＬＣ、又は、
ｅ）配列番号４２のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｆ）配列番号４３のＨＣ及び配列番号４１のＬＣ、又は、
ｇ）配列番号５３のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、又は、
ｈ）配列番号５４のＨＣ及び配列番号５２のＬＣ、
を含む。
【0334】
一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、単離モノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記抗体又は抗体フラグメントは、一価抗体又は抗体フラグメントである。一実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記一価抗体又は抗体フラグメントはＦａｂである。
【0335】
組成物
本開示の組成物は、血栓性障害又は血管障害の予防法又は治療のための本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントと薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物であるのが好ましい。かかる担体、希釈剤及び賦形剤は、当該技術分野で既知であり、当業者であれば、本開示のＧＰＶＩ抗体又は抗体フラグメントによる被験体の治療に最適な配合物及び投与経路が分かる。
本開示の組成物は、血栓性障害又は血管障害の予防法又は治療のための本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントと薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物であるのが好ましい。かかる担体、希釈剤及び賦形剤は、当該技術分野で既知であり、当業者であれば、本開示のＧＰＶＩ抗体又は抗体フラグメントによる被験体の治療に最適な配合物及び投与経路が分かる。
【0336】
一実施形態では、本開示は、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントと薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【0337】
これらの組成物に使用することができる薬学的に許容可能な賦形剤としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、ホスフェート等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【0338】
一実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な上記抗体又は抗体フラグメントは、薬学的又は治療的に有効な量で存在する。
【0339】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態の治療に使用される、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを含む医薬組成物に関する。別の実施形態では、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する上記病態は、血栓性障害又は血管障害である。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態の治療のための薬剤の調製における、本明細書で開示されるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを含む上記医薬組成物の使用に関する。別の実施形態では、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する上記障害又は病態は、血栓性障害又は血管障害である。一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害又は病態の治療への上記医薬組成物の使用に関する。別の実施形態では、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する上記障害又は病態は、血栓性障害又は血管障害である。
【0340】
別の実施形態では、被験体における血栓性障害又は血管障害を治療する方法であって、治療有効量の本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む、方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、被験体は、治療を必要とする被験体である。好ましい実施形態では、上記被験体はヒトである。代替的な実施形態では、上記被験体は、ラット又はマウス等の齧歯類である。一実施形態では、本開示は、表１～表４に開示される、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントと薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。一実施形態では、上記医薬組成物は、血栓性障害又は血管障害の治療又は予防法のためのものである。
【0341】
別の実施形態では、本開示は、被験体における血栓性障害又は血管障害の予防法のための方法であって、血栓性障害又は血管障害の治療のための本開示の抗体若しくは抗体フラグメント、又はかかる抗体若しくは抗体フラグメントと薬学的に許容可能な担体若しくは賦形剤とを含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【0342】
「予防法」は、これに関連して使用される場合、障害の発症を防ぐことを目的とするか又は障害の発症を遅らせる方法を指す。幾つかの実施形態では、上記被験体はヒトである。代替的な実施形態では、上記被験体は、ラット又はマウス等の齧歯類である。
【0343】
本明細書で使用される「投与」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、髄腔内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技法を含む。
【0344】
一実施形態では、本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを含む本開示の組成物は、静脈内投与される。治療有効量の本開示の抗体又は抗体フラグメントを、それを必要とする被験体に投与するのが好ましい。
【0345】
本開示の抗体若しくは抗体フラグメント、本開示の組成物、医薬組成物又は薬剤の一日総使用量が、主治医によって正しい医学的判断の範囲内で決定されることが理解される。任意の特定の患者についての具体的な治療上効果的な用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定のタンパク質の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、全身状態、性別及び食生活；投与時期、投与経路及び用いられる特定のタンパク質の排出率；治療期間；用いられる特定のタンパク質と組み合わせて又は同時に使用される薬物を含む様々な要因、並びに医学分野において既知の同様の要因によって決まる。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで開始し、投与量を所望の効果が達成されるまで徐々に増大することが十分に当業者の技能の範囲内である。しかしながら、抗体又は抗体フラグメントの一日投与量は、１被験体当たり１日０．０１ｍｇ～５００ｍｇの広い範囲にわたって変化し得る。組成物は、治療対象の患者に対する投与量の対症調整（symptomatic adjustment）のために１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ又は５００ｍｇの活性成分を含有するのが好ましい。薬剤は通例、０．０１ｍｇ～１０００ｍｇの活性成分、好ましくは１ｍｇ～５００ｍｇの活性成分を含有する。
【0346】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩの望ましくない存在と関連する障害若しくは病態、又はＧＰＶＩ関連病態の治療及び／又は予防及び／又は予防法及び／又は療法において同時、別々又は順次に使用される医薬品の製造への本開示によるＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを含む組成物の使用に関する。好ましい実施形態では、本開示の組成物は、ＧＰＶＩに特異的なＦａｂを含む医薬組成物であるのが好ましい。
【0347】
特定方法
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的なアンタゴニスト抗体又は抗体フラグメントを特定する方法であって、
ａ）哺乳動物の多血小板血漿とＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントとを接触させる工程と、
ｂ）コラーゲンの添加によって血小板の凝集を開始させる工程と、
ｃ）工程（ｂ）において決定される凝集と、工程（ａ）のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを添加せずに多血小板血漿にコラーゲンを添加した場合に得られる凝集とを比較する工程と、
を含み、工程（ａ）において記載される抗体又は抗体フラグメントの存在下での血小板の凝集の減少が、該抗体又は抗体フラグメントが本開示によるＧＰＶＩの阻害剤又はアンタゴニストであることを示す、方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、ＧＰＶＩに特異的なアンタゴニスト抗体又は抗体フラグメントを特定する方法であって、
ａ）哺乳動物の多血小板血漿とＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントとを接触させる工程と、
ｂ）コラーゲンの添加によって血小板の凝集を開始させる工程と、
ｃ）工程（ｂ）において決定される凝集と、工程（ａ）のＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントを添加せずに多血小板血漿にコラーゲンを添加した場合に得られる凝集とを比較する工程と、
を含み、工程（ａ）において記載される抗体又は抗体フラグメントの存在下での血小板の凝集の減少が、該抗体又は抗体フラグメントが本開示によるＧＰＶＩの阻害剤又はアンタゴニストであることを示す、方法を提供する。
【0348】
一実施形態では、血小板の凝集の減少は、工程（ａ）に記載の抗体又は抗体フラグメントの存在下で少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少する。
【0349】
診断
本開示は、生体サンプル中のＧＰＶＩの検出への本開示によるヒトＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの使用に更に関する。本開示の抗体又は抗体フラグメントを用いることができるアッセイの例としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＲＣＳ、組織の免疫組織化学、ウエスタンブロット及び免疫沈降が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、診断又は検出目的で標識することができる。本明細書で標識されたとは、化合物が化合物の検出を可能にするために付着した少なくとも１つの要素、同位体又は化学化合物を有することを意味する。
本開示は、生体サンプル中のＧＰＶＩの検出への本開示によるヒトＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントの使用に更に関する。本開示の抗体又は抗体フラグメントを用いることができるアッセイの例としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＲＣＳ、組織の免疫組織化学、ウエスタンブロット及び免疫沈降が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本開示の抗体又は抗体フラグメントは、診断又は検出目的で標識することができる。本明細書で標識されたとは、化合物が化合物の検出を可能にするために付着した少なくとも１つの要素、同位体又は化学化合物を有することを意味する。
【0350】
本開示の一実施形態では、ＧＰＶＩに特異的な抗体又は抗体フラグメントは、ＧＰＶＩ発現の変化の診断に使用することができる。血小板表面上のＧＰＶＩの発現の変化、並びに血漿中の可溶性ＧＰＶＩ（ＧＰＶＩの切断型細胞外ドメイン）の発限度及び濃度が急性冠動脈症候群、一過性虚血発作又は脳卒中等の病態生理学的状態と関連し得ることが記載されている（Bigalke B, et al., Eur J Neurol., 2009 Jul 21、Bigalke B. et al., Semin Thromb Hemost. 2007 Mar;33(2): 179-84)）。
【0351】
このため、これらのパラメーターの測定は、抗血栓治療を必要とし、おそらくは特に抗ＧＰＶＩ治療に感受性がある、上述の病態のリスクがある被験体を特定するために用いられ得る。したがって、本明細書に記載される抗体及び抗体フラグメントは、診断ツールとして使用することができ、血小板表面上及び血漿サンプル中のＧＰＶＩの存在及び定量的変化を決定する診断キットの一部とすることができる。
【0352】
被験体におけるＧＰＶＩ変化を診断するかかる方法は、
ａ）上記患者の血小板又は血漿サンプルと本開示による抗体又は抗体フラグメントとを接触させることと、
ｂ）上記サンプル中に存在する細胞への上記抗体又は抗体フラグメントの結合を測定することと、
ｃ）工程（ｉｉ）において測定される結合と正常参照被験体又は標準の結合とを比較することと、
を含み得る。
ａ）上記患者の血小板又は血漿サンプルと本開示による抗体又は抗体フラグメントとを接触させることと、
ｂ）上記サンプル中に存在する細胞への上記抗体又は抗体フラグメントの結合を測定することと、
ｃ）工程（ｉｉ）において測定される結合と正常参照被験体又は標準の結合とを比較することと、
を含み得る。
【0353】
本開示の別の目的は、本開示の少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメントを含むキットである。「キット」は、ＧＰＶＩの発現を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬、すなわち、例えば抗体又は抗体フラグメントを含む任意の製品（例えば、パッケージ又は容器）を意図する。キットは、本発明の方法を行うユニットとして販売促進、分配又は販売することができる。さらに、キットの試薬のいずれか又は全てを、それらを外的環境から保護する容器、例えば密閉容器内で提供することができる。キットは、キット及びその使用方法を説明する添付文書を含んでいてもよい。
【0354】
抗体配列
【0355】
【表1】
【0356】
【表2】
【0357】
【表3】
【0358】
【表4】
【0359】
【表5】
【実施例】
【0360】
実施例１：抗原生成及び品質管理
ヒト、カニクイザル、マウス及びラットに由来するＧＰＶＩのアミノ酸配列を公開ソース（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ）から検索し、社内で作製した。
ヒト、カニクイザル、マウス及びラットに由来するＧＰＶＩのアミノ酸配列を公開ソース（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ）から検索し、社内で作製した。
【0361】
組み換え可溶性細胞外ドメイン
可溶性ＧＰＶＩは、そのＣ末端でヒトＦｃ配列に融合したＧＰＶＩの細胞外ドメインに相当する。この可溶性ＧＰＶＩは、ＧＰＶＩ－Ｆｃと称される場合もある。
可溶性ＧＰＶＩは、そのＣ末端でヒトＦｃ配列に融合したＧＰＶＩの細胞外ドメインに相当する。この可溶性ＧＰＶＩは、ＧＰＶＩ－Ｆｃと称される場合もある。
【0362】
ヒトＧＰＶＩ－１Ａ（配列番号４）、ヒトＧＰＶＩ－１Ｂ（配列番号５）、ヒトＧＰＶＩ－２Ａ（配列番号６）、カニクイザルＧＰＶＩ（配列番号７）、マウスＧＰＶＩ（配列番号８）及びラットＧＰＶＩ（配列番号９）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶを用いて発現ベクターｐＭＡＸ＿ｖｋ＿Ｆｃ２（Ｋ１０５～Ｋ３３０）にクローニングし、Ｃ末端Ｆｃ２（Ｋ１０５～Ｋ３３０）融合構築物を得た。Ｆｃ２（Ｋ１０５～Ｋ３３０）は、配列番号１０に開示されるアミノ酸配列を有する。
【0363】
ヒト、カニクイザル、マウス又はラットＧＰＶＩの細胞外ドメインのコード化ＤＮＡを、Ｎ末端Ｖκリーダー配列及びＣ末端ヒトＩｇＧ Ｆｃタグとインフレームで、ｐｃＤＮＡ３．１（Thermo Fisher）をベースとする修飾発現ベクターであるｐＭＡＸ発現ベクターにクローニングした。ＨＫＢ１１ ＃５２（親クローン：米国特許第６，１３６，５９９号。J. Biomed. Sci. 2002;9:631-638）細胞を、３７℃及び６％ＣＯ２の加湿ＣＯ２インキュベーターにおいて２．０ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、０．１％ＰＦ－６８を含有するＭＡＣ１．０培地中で維持した。ＨＫＢ１１ ＃５２細胞を、播種の翌日にＦｅｃｔｏＰｒｏ（商標）及びＦｅｃｔｏＰｒｏ（商標） Ｂｏｏｓｔｅｒ（Polyplus）を用い、製造業者の説明書に従って一過性にトランスフェクトした。細胞を３日間培養し、馴化細胞培養上清を遠心分離によって採取し、続いて滅菌濾過した。抗原を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（GE Healthcare）を用いるプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。結合及び洗浄の後、タンパク質を１００ｍＭグリシン（Glycin）（ｐＨ３．０）で溶出させた。全てのアフィニティークロマトグラフィー工程を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ（GE Healthcare）クロマトグラフィーシステムを用いて行った。サンプルを続いて中和し（３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を用いる）、ＰＤ１０カラム（GE Healthcare）を用いてＰＢＳにバッファー交換した。サンプルの品質を変性、還元又は非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰ－ＳＥＣ及びＤＬＳによって分析した。
【0364】
ＧＰＶＩを過剰発現する組み換え細胞
ＣＨＯ細胞にヒトＧＰＶＩ（配列番号１）、カニクイザルＧＰＶＩ（配列番号２）又はマウスＧＰＶＩ（配列番号３）のいずれかを安定にトランスフェクトした。
ＣＨＯ細胞にヒトＧＰＶＩ（配列番号１）、カニクイザルＧＰＶＩ（配列番号２）又はマウスＧＰＶＩ（配列番号３）のいずれかを安定にトランスフェクトした。
【0365】
Ｆｌｐ－Ｉｎ ＣＨＯ細胞（Invitrogen）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen）をトランスフェクション試薬として用いてヒト、カニクイザル又はマウスＧＰＶＩの完全長タンパク質をコードするｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯベクターを安定にトランスフェクトした。細胞を、下記のフルオロサイトメトリーによってＧＰＶＩを一様に発現する細胞集団が観察されるまでハイグロマイシンＢ（Roth）を含有する選択培地中で培養した。細胞バンクを生成し、その後の実験に使用した。
【0366】
ラット好塩基性ＲＢＬ－２Ｈ３細胞（ＡＣＣ ３１２、DSMZ）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen）をトランスフェクション試薬として用いて完全長ヒトＧＰＶＩをコードするｐｃＤＮＡ３．１ベクターを安定にトランスフェクトした。細胞を、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Gibco）を含有する選択培地中で４週間培養した。高いＧＰＶＩ発現を有する細胞の単一クローン選択を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａセルソーター（BD Biosciences）を用いて行った。単一クローンを選択培地中で増殖させ、フルオロサイトメトリーによってＧＰＶＩ発現レベルを確認した。最も強いＧＰＶＩ発現を有する細胞クローンを細胞バンク生成のために選択し、更なる実験で使用した。
【0367】
トランスフェクト細胞のＧＰＶＩ発現レベルのフルオロサイトメトリー評価のために、細胞をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Thermo Scientific）中でブロッキングし、続いてＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで５μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈したＧＰＶＩ特異Ｆａｂと共に氷上で６０分間インキュベートした。３％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び０．０２％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳで洗浄した後、細胞をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで希釈したＰＥコンジュゲート抗Ｆ（ａｂ’）２検出抗体（Jackson Immuno Research）と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、細胞をＦＡＣＳ Ａｒｒａｙ（BD Biosciences）において評価した。
【0368】
実施例２：MorphoSysのＹｌａｎｔｈｉａ（商標）ライブラリーからのＧＰＶＩ特異抗体の選択
抗体生成のために、MorphoSysのＹｌａｎｔｈｉａ（商標）ライブラリーを用いてＧＰＶＩに対するＦａｂフラグメントを選択した。MorphoSysのＹｌａｎｔｈｉａ（商標）ライブラリー（Tiller et al. mAbs 5:3, 1-26; May/June (2013)及び米国特許第８，７２８，９８１号）は、市販のファージミドライブラリーであり、Ｆａｂをファージ表面上に提示させるＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いる（Lohning et al.、国際公開第２００１／０５９５０号）。
抗体生成のために、MorphoSysのＹｌａｎｔｈｉａ（商標）ライブラリーを用いてＧＰＶＩに対するＦａｂフラグメントを選択した。MorphoSysのＹｌａｎｔｈｉａ（商標）ライブラリー（Tiller et al. mAbs 5:3, 1-26; May/June (2013)及び米国特許第８，７２８，９８１号）は、市販のファージミドライブラリーであり、Ｆａｂをファージ表面上に提示させるＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いる（Lohning et al.、国際公開第２００１／０５９５０号）。
【0369】
ＧＰＶＩ特異抗体を特定するために、種々のパニング戦略を用いた。各パニング戦略は、実施例１に記載の異なる種に由来する様々なＧＰＶＩ抗原（可溶性ＥＣＤ－Ｆｃ融合体として又はＣＨＯ細胞上で過剰発現される）に対する少なくとも３回の個々のパニングを含むものであった。単離及び特定されたクローンを成熟させ、親和性、機能性及び安全性が増大するように改変した。したがって、数百個のクローンをスクリーニングし、機能性を、例えば、
ＥＬＩＳＡ、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ及び／又は溶液平衡滴定（ＳＥＴ）によって決定されるヒト、カニクイザル、マウス及びラットＧＰＶＩへの結合、
種々のＧＰＶＩコラーゲン基質へのＧＰＶＩの結合の阻害、
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて厳密に試験した。
ＥＬＩＳＡ、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ及び／又は溶液平衡滴定（ＳＥＴ）によって決定されるヒト、カニクイザル、マウス及びラットＧＰＶＩへの結合、
種々のＧＰＶＩコラーゲン基質へのＧＰＶＩの結合の阻害、
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて厳密に試験した。
【0370】
最後に、４つのリード分子（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４）を選択した。これらを下記で概説される実施例において更に説明する。
【0371】
４つのリードＦａｂ分子の各々を、野生型ヒトＦａｂ重鎖定常領域又は配列番号１１３による修飾ヒト重鎖定常領域のいずれかを有することにより２つの変異体で生成し、産生させた。
【0372】
哺乳動物産生のために、ヒトＦａｂフラグメントをサブクローニング手順によって細菌から哺乳動物のＦａｂフォーマットに変換した。抗体をコードするベクターを酵素的に消化し、得られるベクター骨格をＹｌａｎｔｈｉａ（商標）哺乳動物発現カセットとライゲートし、それぞれの哺乳動物ヒトＦａｂベクターに更にサブクローニングした。
【0373】
本開示による修飾重鎖定常領域の生成のために、設計した重鎖定常領域全体をコードするＤＮＡを二本鎖ＤＮＡフラグメントとして合成した。相同重複配列を有する修飾重鎖定常領域を含む、得られる合成線状ＤＮＡフラグメントを、続いて親Ｆａｂ重鎖定常領域を置き換えることによって対応する哺乳動物ヒトＦａｂベクターにシームレスにクローニングした。
【0374】
発現及び精製のために、真核生物ＨＫＢ１１細胞にＦａｂの重鎖及び軽鎖の両方をコードするｐＹＭｅｘ１０真核生物発現ベクターＤＮＡをトランスフェクトした。細胞培養上清をトランスフェクションの３日後に採取し、抗体精製のためにＣａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１アフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ、GE Healthcare）に供した。全サンプルを滅菌濾過した（０．２μｍの細孔径）。Ｆａｂの純度を、Ｌａｂｃｈｉｐシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ＧＸＩＩ、Perkin Elmer）を用いて又はＳＤＳ－ＰＡＧＥにて変性、還元及び非還元条件下で分析した。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法によって決定し、ＩｇＧ調製物を未変性状態で分析するためにＨＰ－ＳＥＣを行った。
【0375】
参照対照抗体ＲｅｆＦａｂ＃１：
特許文献９（SANOFI）に開示されるヒト化ＧＰＶＩ抗体のＶＨ（配列番号９９）及びＶＬ（配列番号１００）をコードするヌクレオチド配列を、社内で又は外部供給者により適切な隣接領域（例えば、好適な制限酵素認識部位、リンカー配列）を有する線状ＤＮＡフラグメントとして遺伝子合成した。合成した全てのＤＮＡフラグメントを、標準的な分子生物学方法を用い、グリシン－セリン（glycin-serin）リンカー（Ｇ４Ｓ）２をＦａｂ重鎖のＣ末端に更に付加して、適切な哺乳動物Ｆａｂ発現ベクター（上記）にクローニングした。
特許文献９（SANOFI）に開示されるヒト化ＧＰＶＩ抗体のＶＨ（配列番号９９）及びＶＬ（配列番号１００）をコードするヌクレオチド配列を、社内で又は外部供給者により適切な隣接領域（例えば、好適な制限酵素認識部位、リンカー配列）を有する線状ＤＮＡフラグメントとして遺伝子合成した。合成した全てのＤＮＡフラグメントを、標準的な分子生物学方法を用い、グリシン－セリン（glycin-serin）リンカー（Ｇ４Ｓ）２をＦａｂ重鎖のＣ末端に更に付加して、適切な哺乳動物Ｆａｂ発現ベクター（上記）にクローニングした。
【0376】
実施例３：ＥＬＩＳＡによって決定されるヒト、カニクイザル、マウス及びラットＧＰＶＩへの一価Ｆａｂの結合
材料及び方法
０．５ｎＭ～２ｎＭの組み換えＧＰＶＩ－Ｆｃ融合タンパク質（実施例１に記載）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートに４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を添加したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、続いてＰＢＳで希釈した５％スキムミルク粉末（ＭＰＢＳ）により室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄した後、５％スキムミルク粉末を含むＰＢＳＴ（ＭＰＢＳＴ）で６００ｎＭ～１ｐＭの範囲の濃度に段階希釈したＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）をＲＴで１時間添加した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。結合したＦａｂを、ＭＰＢＳＴで希釈した、ヒトＦ（ａｂ’）２フラグメントに対するアルカリホスファターゼコンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）を用いて検出した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を添加したＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄した後、ｄｄＨ２Ｏで希釈したＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（Roche）を添加し、蛍光強度をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏリーダーで測定した。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad）を用いて算出した。
材料及び方法
０．５ｎＭ～２ｎＭの組み換えＧＰＶＩ－Ｆｃ融合タンパク質（実施例１に記載）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートに４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を添加したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、続いてＰＢＳで希釈した５％スキムミルク粉末（ＭＰＢＳ）により室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄した後、５％スキムミルク粉末を含むＰＢＳＴ（ＭＰＢＳＴ）で６００ｎＭ～１ｐＭの範囲の濃度に段階希釈したＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）をＲＴで１時間添加した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。結合したＦａｂを、ＭＰＢＳＴで希釈した、ヒトＦ（ａｂ’）２フラグメントに対するアルカリホスファターゼコンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）を用いて検出した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を添加したＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄した後、ｄｄＨ２Ｏで希釈したＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（Roche）を添加し、蛍光強度をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏリーダーで測定した。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad）を用いて算出した。
【0377】
ヒト、カニクイザル、マウス及びラットＧＰＶＩの細胞外ドメインに用いられる配列を配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９に記載する。
【0378】
結果及び結論
表５に示されるように、全てのＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）がヒトＧＰＶＩアイソフォーム及びハプロタイプに結合し、カニクイザルＧＰＶＩと交差反応性であった。本開示によるＦａｂ＃１～Ｆａｂ＃４とは対照的に、ＲｅｆＦａｂ＃１は、組み換えマウス及びラットＧＰＶＩに結合しなかった。
表５に示されるように、全てのＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）がヒトＧＰＶＩアイソフォーム及びハプロタイプに結合し、カニクイザルＧＰＶＩと交差反応性であった。本開示によるＦａｂ＃１～Ｆａｂ＃４とは対照的に、ＲｅｆＦａｂ＃１は、組み換えマウス及びラットＧＰＶＩに結合しなかった。
【0379】
【表6】
【0380】
実施例４：Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡによって決定される組み換え細胞の細胞表面上で発現されるヒト、カニクイザル又はマウスＧＰＶＩへの一価Ｆａｂの結合
材料及び方法
ヒト、カニクイザル又はマウスＧＰＶＩ（それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３；実施例１に記載される）を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、９６ウェル高結合プレート（Meso Scale Discovery）にて５０００細胞／ウェルの密度で成長培地に播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩培養した。細胞を、５％ＢＳＡを添加した（supplied）ＰＢＳでブロッキングした後、０．５％ＢＳＡを添加したＰＢＳで３００ｎＭ～５ｐＭの濃度に段階希釈したＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）と共にインキュベートした。洗浄後に、結合したＦａｂをヒトＦ（ａｂ’）２フラグメントに対するＥＣＬコンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）を用いて検出した。ＭＳＤリードバッファー（Meso Scale Discovery）を細胞に添加した後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００（Meso Scale Discovery）で読み取った。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad）を用いて算出した。
材料及び方法
ヒト、カニクイザル又はマウスＧＰＶＩ（それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３；実施例１に記載される）を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、９６ウェル高結合プレート（Meso Scale Discovery）にて５０００細胞／ウェルの密度で成長培地に播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩培養した。細胞を、５％ＢＳＡを添加した（supplied）ＰＢＳでブロッキングした後、０．５％ＢＳＡを添加したＰＢＳで３００ｎＭ～５ｐＭの濃度に段階希釈したＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）と共にインキュベートした。洗浄後に、結合したＦａｂをヒトＦ（ａｂ’）２フラグメントに対するＥＣＬコンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）を用いて検出した。ＭＳＤリードバッファー（Meso Scale Discovery）を細胞に添加した後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００（Meso Scale Discovery）で読み取った。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad）を用いて算出した。
【0381】
結果及び結論
表６に示されるように、Ｆａｂ＃１～Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）は、細胞上で発現されたヒト及びカニクイザルＧＰＶＩを認識し、細胞表面で発現されたマウスＧＰＶＩへの結合を示した。ＥＬＩＳＡにおいて観察されるように、ＲｅｆＦａｂ＃１は、マウスＧＰＶＩを発現する細胞に結合しなかった。
表６に示されるように、Ｆａｂ＃１～Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）は、細胞上で発現されたヒト及びカニクイザルＧＰＶＩを認識し、細胞表面で発現されたマウスＧＰＶＩへの結合を示した。ＥＬＩＳＡにおいて観察されるように、ＲｅｆＦａｂ＃１は、マウスＧＰＶＩを発現する細胞に結合しなかった。
【0382】
【表7】
【0383】
実施例５：溶液平衡滴定（ＳＥＴ）によって決定されるＧＰＶＩに対する一価Ｆａｂの親和性決定
材料及び方法
ＫＤ決定のために、分析ＳＥＣによって分析される少なくとも９０％のモノマー含量を有するＦａｂタンパク質のモノマー画分を用いた。溶液中での親和性決定は、基本的に文献（Friguet et al. 1985）に記載されるように行った。ＳＥＴ法の感度及び精度を改善するために、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技術（Haenel et al. 2005）に移行した。
材料及び方法
ＫＤ決定のために、分析ＳＥＣによって分析される少なくとも９０％のモノマー含量を有するＦａｂタンパク質のモノマー画分を用いた。溶液中での親和性決定は、基本的に文献（Friguet et al. 1985）に記載されるように行った。ＳＥＴ法の感度及び精度を改善するために、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技術（Haenel et al. 2005）に移行した。
【0384】
１ｍｇ／ｍＬヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２フラグメント特異抗体（Dianova）を、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ ＴＡＧ（商標） ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA）で製造業者の説明書に従って標識した。実験を、ポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて０．５％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（GIBCO １４１９０、ｐＨ７．０～７．２）をアッセイバッファーとして行った。非標識ヒトＧＰＶＩ－Ｆｃ（配列番号４）、カニクイザルＧＰＶＩ－Ｆｃ（配列番号７）及びマウスＧＰＶＩ－Ｆｃ（配列番号８）（実施例１において調製される）の段階希釈物を、予想ＫＤより少なくとも１０倍高い濃度から始めて調製した。抗原を含まないウェルをＢｍａｘ値の決定に用い、アッセイバッファーのみを含有するウェルをバックグラウンドの決定に用いた。適切な量の結合剤（予想ＫＤと同様又はそれを下回る抗体濃度、最終容量６０μＬ）を添加した後、混合物をＲＴで一晩インキュベートした。ＭＳＤプレートを、それぞれ標準及びストレプトアビジンプレートにて抗原又はビオチン化抗原でコーティングした（３０μＬ／ウェル）。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳでプレートを洗浄した後、平衡化したサンプルをプレートに移し、２０分間インキュベートした。インキュベーション後に、３０μＬ／ウェルのＭＳＤ－Ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識検出抗体（抗ヒト（Ｆａｂ）２、通例２０００倍の最終希釈率）を洗浄したＭＳＤプレートに添加し、エッペンドルフシェーカー（７００ｒｐｍ）にてＲＴで３０分間インキュベートした。ＭＳＤプレートを洗浄し、界面活性剤を含む３０μＬ／ウェルのＭＳＤリードバッファーＴを添加した後、電気化学発光シグナルをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA）を用いて検出した。データを、専用適合モデルを適用するＸＬｆｉｔ（IDBS）ソフトウェアを用いて評価した。ＦａｂのＫＤ決定のために、Abraham et al.に従って修正したHaenel et al. 2005による適合モデルを用いた。
【0385】
結果及び結論
結果を表７にまとめる。本開示の試験した全てＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）が２桁のピコモル範囲でヒト及びカニクイザルＧＰＶＩに対して親和性を示した。Ｆａｂ＃１及びＦａｂ＃２は、それぞれ２８ｎＭ及び７ｎＭの適度なより弱い親和性でマウスＧＰＶＩに結合したが、Ｆａｂ＃４及びＦａｂ＃３は、マウスＧＰＶＩに対してナノモル以下の親和性を示した。ＲｅｆＦａｂ＃１について、マウスＧＰＶＩに対する親和性は、ＥＬＩＳＡ及びｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにおいて確認される結合の欠如のために決定されなかった。
結果を表７にまとめる。本開示の試験した全てＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）が２桁のピコモル範囲でヒト及びカニクイザルＧＰＶＩに対して親和性を示した。Ｆａｂ＃１及びＦａｂ＃２は、それぞれ２８ｎＭ及び７ｎＭの適度なより弱い親和性でマウスＧＰＶＩに結合したが、Ｆａｂ＃４及びＦａｂ＃３は、マウスＧＰＶＩに対してナノモル以下の親和性を示した。ＲｅｆＦａｂ＃１について、マウスＧＰＶＩに対する親和性は、ＥＬＩＳＡ及びｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにおいて確認される結合の欠如のために決定されなかった。
【0386】
【表8】
【0387】
実施例６：ＦＡＣＳによって決定されるヒト、カニクイザル又はマウス血小板の細胞表面上で発現されたＧＰＶＩへの一価Ｆａｂの結合
材料及び方法
最大４例のドナーに由来する多血小板血漿（ＰＲＰ）を、連続的な（without brake）１５０×ｇで１５分間のクエン酸全血の遠心分離によって調製した。得られる上清を、下層の白血球に富んだ中間相を乱すことなくＰＲＰとして新たなサンプル管に移した。プロスタサイクリンＩ２（ＰＧＩ２；Epoprostenol-Rotexmedica）を添加したタイロードバッファー（Tyrode's buffer）で慎重に洗浄した後、血小板をタイロード／ＰＧＩ２に再懸濁し、９６ウェルＶ字底マイクロタイタープレートに移した。血小板に、タイロード／ＰＧＩ２で０．０１５μｇ／ｍｌ～３０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈したＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）を加え、ＲＴで３０分間インキュベートした。血小板を慎重に洗浄して結合していないＦａｂを除去した後、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）と共にＲＴで３０分間インキュベートした。ＲＴで３０分間のインキュベーション後に、血小板をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（Becton Dickinson）でフローサイトメトリーによって分析した。ＰＥが直接コンジュゲートしたＦａｂの場合（図１Ｄ）、検出抗体とのインキュベーションを省いた。ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてデータを評価した。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad）を用いて算出した。
材料及び方法
最大４例のドナーに由来する多血小板血漿（ＰＲＰ）を、連続的な（without brake）１５０×ｇで１５分間のクエン酸全血の遠心分離によって調製した。得られる上清を、下層の白血球に富んだ中間相を乱すことなくＰＲＰとして新たなサンプル管に移した。プロスタサイクリンＩ２（ＰＧＩ２；Epoprostenol-Rotexmedica）を添加したタイロードバッファー（Tyrode's buffer）で慎重に洗浄した後、血小板をタイロード／ＰＧＩ２に再懸濁し、９６ウェルＶ字底マイクロタイタープレートに移した。血小板に、タイロード／ＰＧＩ２で０．０１５μｇ／ｍｌ～３０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈したＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）を加え、ＲＴで３０分間インキュベートした。血小板を慎重に洗浄して結合していないＦａｂを除去した後、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）と共にＲＴで３０分間インキュベートした。ＲＴで３０分間のインキュベーション後に、血小板をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（Becton Dickinson）でフローサイトメトリーによって分析した。ＰＥが直接コンジュゲートしたＦａｂの場合（図１Ｄ）、検出抗体とのインキュベーションを省いた。ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてデータを評価した。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad）を用いて算出した。
【0388】
結果及び結論
例示的な１ドナーに由来する血小板上で本開示の４つ全てのＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）について得られた結果を図１Ａ～図１Ｃに示す。３人のヒトドナーに由来する血小板に対して試験したＰＥ直接コンジュゲートとしての抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃３及びＦａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）についての付加的な結果を図１Ｄに示す。
例示的な１ドナーに由来する血小板上で本開示の４つ全てのＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）について得られた結果を図１Ａ～図１Ｃに示す。３人のヒトドナーに由来する血小板に対して試験したＰＥ直接コンジュゲートとしての抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃３及びＦａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）についての付加的な結果を図１Ｄに示す。
【0389】
Ｆａｂ＃１～Ｆａｂ＃４は、ヒト、カニクイザル及びマウス血小板の細胞表面上で発現されたＧＰＶＩに対し、特異的であるが、ドナーに依存した結合を示した。Ｆａｂ＃１～Ｆａｂ＃４とは対照的に、ＲｅｆＦａｂ＃１についてマウス血小板上のＧＰＶＩへの結合は観察されなかった。これはＥＬＩＳＡ及びｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにおける先の結果と一致する。
【0390】
実施例７：一価Ｆａｂの競合的結合 － ＥＬＩＳＡによって決定される種々のコラーゲン基質へのヒト、カニクイザル及びマウスＧＰＶＩの結合阻害
材料及び方法
１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌの組み換えＧＰＶＩコラーゲン基質（架橋コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ－ＸＬ（Anaspec, Inc.）、ラット尾部コラーゲン（Enzo Life Sciences）又はＶｉｔｒｏＣｏｌ（Advanced BioMatrix, Inc.）をＭＳＤプレートに４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０及び３％スキムミルク粉末を添加したＰＢＳによりＲＴで１時間ブロッキングし、続いて再びＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳで希釈した精製組み換えＧＰＶＩ抗原（実施例１で調製されるヒト、カニクイザル又はマウスＧＰＶＩ）及びＰＢＳで希釈した様々な濃度（２００μｇ／ｍｌ～０．３μｇ／ｍｌの最終濃度範囲）のＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）をポリプロピレンプレートにおいてＲＴで３０分間インキュベートした。Ｆａｂ／ＧＰＶＩ－Ｆｃ混合物を、コーティングしたコラーゲン基質にＲＴで１時間添加した。ＰＢＳＴで洗浄した後、異なる種に由来する結合ＧＰＶＩを、ヒトＦｃに対するＥＣＬコンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）を用いてＲＴで１時間検出した。ＭＳＤリードバッファー（Meso Scale Discovery）を添加した後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Meso Scale Discovery）で読み取った。ＦａｂによるＧＰＶＩ／リガンド相互作用の阻害は、シグナルの減少を生じた。
材料及び方法
１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌの組み換えＧＰＶＩコラーゲン基質（架橋コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ－ＸＬ（Anaspec, Inc.）、ラット尾部コラーゲン（Enzo Life Sciences）又はＶｉｔｒｏＣｏｌ（Advanced BioMatrix, Inc.）をＭＳＤプレートに４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０及び３％スキムミルク粉末を添加したＰＢＳによりＲＴで１時間ブロッキングし、続いて再びＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳで希釈した精製組み換えＧＰＶＩ抗原（実施例１で調製されるヒト、カニクイザル又はマウスＧＰＶＩ）及びＰＢＳで希釈した様々な濃度（２００μｇ／ｍｌ～０．３μｇ／ｍｌの最終濃度範囲）のＦａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）をポリプロピレンプレートにおいてＲＴで３０分間インキュベートした。Ｆａｂ／ＧＰＶＩ－Ｆｃ混合物を、コーティングしたコラーゲン基質にＲＴで１時間添加した。ＰＢＳＴで洗浄した後、異なる種に由来する結合ＧＰＶＩを、ヒトＦｃに対するＥＣＬコンジュゲート検出抗体（Jackson Immuno Research）を用いてＲＴで１時間検出した。ＭＳＤリードバッファー（Meso Scale Discovery）を添加した後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Meso Scale Discovery）で読み取った。ＦａｂによるＧＰＶＩ／リガンド相互作用の阻害は、シグナルの減少を生じた。
【0391】
結果及び結論
結果を表８（ヒトＧＰＶＩ）、表９（カニクイザルＧＰＶＩ）及び表１０（マウスＧＰＶＩ）にまとめる。種々のＧＰＶＩコラーゲン基質に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）のＩＣ５０値及び最大達成阻害効果を示す。
結果を表８（ヒトＧＰＶＩ）、表９（カニクイザルＧＰＶＩ）及び表１０（マウスＧＰＶＩ）にまとめる。種々のＧＰＶＩコラーゲン基質に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）のＩＣ５０値及び最大達成阻害効果を示す。
【0392】
試験した全てのＦａｂについて、マウスＧＰＶＩを除く各ＧＰＶＩ／基質の組合せに対して同等のＩＣ５０値が得られた。ここで、種々の基質への結合を、マウス交差反応性の欠如のためにＲｅｆＦａｂ＃１によって遮断することができなかった。
【0393】
ＧＰＶＩ／基質結合の最大阻害に関して、Ｆａｂ＃２及びＦａｂ＃３は、種々のコラーゲン基質へのＧＰＶＩの結合を２００ｎＭで完全に阻害し、Ｆａｂ＃１及びＦａｂ＃４は、完全阻害に達しなかった。最も大きな差がＣＲＰ－ＸＬを使用した場合に見られ、このＧＰＶＩへの基質の結合は、Ｆａｂ＃１及びＦａｂ＃４によって４７％～７７％阻害された。
【0394】
【表9】
【0395】
【表10】
【0396】
【表11】
【0397】
実施例８：細胞接着アッセイ
材料及び方法
炭酸バッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で希釈した組み換えＧＰＶＩ基質（１μｇ／ｍｌ架橋コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ－ＸＬ（Anaspec, Inc.）又は１０μｇ／ｍｌ ＶｉｔｒｏＣｏｌ（Advanced BioMatrix, Inc.））を９６ウェルマイクロタイターＭａｘｉｓｏｒｐプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳで洗浄した後、２％ＢＳＡを添加したＰＢＳでウェルをブロッキングした。ヒトＧＰＶＩを安定にトランスフェクトしたラット好塩基性ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を培養フラスコから分離し、接着バッファー（０．５％ＢＳＡ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＯｐｔｉＭＥＭ）で洗浄し、２．５μｇ／ｍｌ Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Molecular Probes）を用いて３７℃で３０分間染色した。細胞を、接着バッファーで希釈した（１００ｎＭ～１０ｐＭの最終濃度範囲）、抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）と共に９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて暗所にてＲＴで３０分間振盪してインキュベートした。コーティング及びブロッキングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳで洗浄し、細胞－抗体混合物と共にＲＴで３０分間、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。更に軽く洗浄した後、結合した細胞をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏリーダーにおいて蛍光強度（４８５ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光）を測定することによって評定した。細胞接着の阻害は、非処理対照細胞と比較してシグナルの低下をもたらす。
材料及び方法
炭酸バッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で希釈した組み換えＧＰＶＩ基質（１μｇ／ｍｌ架橋コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ－ＸＬ（Anaspec, Inc.）又は１０μｇ／ｍｌ ＶｉｔｒｏＣｏｌ（Advanced BioMatrix, Inc.））を９６ウェルマイクロタイターＭａｘｉｓｏｒｐプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳで洗浄した後、２％ＢＳＡを添加したＰＢＳでウェルをブロッキングした。ヒトＧＰＶＩを安定にトランスフェクトしたラット好塩基性ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を培養フラスコから分離し、接着バッファー（０．５％ＢＳＡ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＯｐｔｉＭＥＭ）で洗浄し、２．５μｇ／ｍｌ Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Molecular Probes）を用いて３７℃で３０分間染色した。細胞を、接着バッファーで希釈した（１００ｎＭ～１０ｐＭの最終濃度範囲）、抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）と共に９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて暗所にてＲＴで３０分間振盪してインキュベートした。コーティング及びブロッキングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳで洗浄し、細胞－抗体混合物と共にＲＴで３０分間、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。更に軽く洗浄した後、結合した細胞をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏリーダーにおいて蛍光強度（４８５ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光）を測定することによって評定した。細胞接着の阻害は、非処理対照細胞と比較してシグナルの低下をもたらす。
【0398】
結果及び結論
結果を、ヒトＧＰＶＩを発現するＲＢＬ－２Ｈ３細胞並びに組み換えコラーゲン基質ＣＲＰ－ＸＬ及びＶｉｔｒｏＣｏｌについて表１１にまとめる。ＩＣ５０値及び２００ｎＭの抗体濃度での抗ＧＰＶＩ Ｆａｂフラグメントの最大達成阻害効果を示す。
結果を、ヒトＧＰＶＩを発現するＲＢＬ－２Ｈ３細胞並びに組み換えコラーゲン基質ＣＲＰ－ＸＬ及びＶｉｔｒｏＣｏｌについて表１１にまとめる。ＩＣ５０値及び２００ｎＭの抗体濃度での抗ＧＰＶＩ Ｆａｂフラグメントの最大達成阻害効果を示す。
【0399】
Ｆａｂ＃１～Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）は、コーティングしたＶｉｔｒｏＣｏｌへの細胞結合を０．５７ｎＭ～１．１７ｎＭの範囲の同等の半最大濃度で強力に阻害した。ＣＲＰ－ＸＬについては、Ｆａｂ＃２及びＦａｂ＃３で同様の結果が得られたが、Ｆａｂ＃１及びＦａｂ＃４は、この基質への細胞結合に対して関連効果を有しなかった。
【0400】
有効性に関して、Ｆａｂ＃２及びＦａｂ＃３は、ＣＲＰ－ＸＬ及びＶｉｔｒｏＣｏｌへの細胞結合を、それぞれ完全に（１００％）及びほぼ完全に（９１％～９３％）阻害した。ＶｉｔｒｏＣｏｌに対するＦａｂ＃１及びＦａｂ＃４の最大阻害効果は、それぞれ５５％及び５９％であった。
【0401】
【表12】
【0402】
実施例９：コラーゲンにより誘導されるヒト血小板凝集の阻害 － Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）インピーダンス凝集測定法
材料及び方法
ヒルジン抗凝固処理血液を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）標準試験セル（Roche）において０．９％ＮａＣｌで１：１希釈し、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌ及び０．３７μｇ／ｍｌに予め希釈した抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）を加え、撹拌しながら３７℃で３分間プレインキュベートした。続いて、種々の血小板アゴニスト基質（ＣＲＰ－ＸＬ（１μｇ／ｍｌ；Anaspec, Inc.）、ＶｉｔｒｏＣｏｌ（１００μｇ／ｍｌ；Advanced BioMatrix, Inc.）、ウサギ大動脈コラーゲン（４μｇ／ｍｌ；AdvanceCor）、カニクイザル大動脈コラーゲン（７．４μｇ／ｍｌ；AdvanceCor）、ＴＲＡＰ-６（８μＭ；ＴＲＡＰｔｅｓｔ、Roche）、ＡＤＰ（６．５μＭ；ＡＤＰｔｅｓｔ、Roche））の添加によって血小板凝集を誘導した。血小板自身に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂの内因性アゴニスト能を評価するために、Ｆａｂの効果をアゴニストの非存在下でも調査した。次いで、血小板凝集を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）装置（Roche）において撹拌を続けながら３７℃で６分間、血小板の凝集によって誘導される試験セルのセンサーワイヤ間のインピーダンスの上昇を経時的に測定することによって決定した。
材料及び方法
ヒルジン抗凝固処理血液を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）標準試験セル（Roche）において０．９％ＮａＣｌで１：１希釈し、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌ及び０．３７μｇ／ｍｌに予め希釈した抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）を加え、撹拌しながら３７℃で３分間プレインキュベートした。続いて、種々の血小板アゴニスト基質（ＣＲＰ－ＸＬ（１μｇ／ｍｌ；Anaspec, Inc.）、ＶｉｔｒｏＣｏｌ（１００μｇ／ｍｌ；Advanced BioMatrix, Inc.）、ウサギ大動脈コラーゲン（４μｇ／ｍｌ；AdvanceCor）、カニクイザル大動脈コラーゲン（７．４μｇ／ｍｌ；AdvanceCor）、ＴＲＡＰ-６（８μＭ；ＴＲＡＰｔｅｓｔ、Roche）、ＡＤＰ（６．５μＭ；ＡＤＰｔｅｓｔ、Roche））の添加によって血小板凝集を誘導した。血小板自身に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂの内因性アゴニスト能を評価するために、Ｆａｂの効果をアゴニストの非存在下でも調査した。次いで、血小板凝集を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）装置（Roche）において撹拌を続けながら３７℃で６分間、血小板の凝集によって誘導される試験セルのセンサーワイヤ間のインピーダンスの上昇を経時的に測定することによって決定した。
【0403】
結果及び結論
表１２に、ＧＰＶＩ依存性及びＧＰＶＩ非依存性アゴニストによって誘導される血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃１～Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）の阻害活性を示す。ＧＰＶＩアゴニストであるＶｉｔｒｏＣｏｌ及びカニクイザル大動脈コラーゲンについての詳細な結果を図２Ａ及び図２Ｂにそれぞれまとめる。
表１２に、ＧＰＶＩ依存性及びＧＰＶＩ非依存性アゴニストによって誘導される血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃１～Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む）の阻害活性を示す。ＧＰＶＩアゴニストであるＶｉｔｒｏＣｏｌ及びカニクイザル大動脈コラーゲンについての詳細な結果を図２Ａ及び図２Ｂにそれぞれまとめる。
【0404】
要するに、結果から、本開示によるＧＰＶＩ特異ＦａｂがＧＰＶＩ依存性コラーゲンアゴニストによって誘導される血小板凝集を阻害したことが実証される。阻害の程度は、使用するＦａｂ及びアゴニストによって異なっていた。Ｆａｂ＃２及びＦａｂ＃３は、ヒトコラーゲン基質ＣＲＰ－ＸＬ及びＶｉｔｒｏＣｏｌによって誘導されるヒト血小板の凝集に対して最も強力な用量依存的阻害活性を示し、１０μｇ／ｍｌのＦａｂ濃度でヒト血小板の凝集を完全に阻害する能力を有していた。ＲｅｆＦａｂ＃１に対するこれら２つのＦａｂの機能的優位性を、試験した全てのコラーゲン基質について示すことができた。ＧＰＶＩ非依存性アゴニストであるＴＲＡＰ及びＡＤＰについては阻害効果を観察することができず、ＧＰＶＩ特異的な効果が示された。さらに、試験したＦａｂのいずれもアゴニストの非存在下で血小板凝集を誘導しなかったため、Ｆａｂの内因性アゴニスト活性が除外された。
【0405】
【表13】
【0406】
実施例１０：ヒト動脈硬化性プラークにより誘導されるヒト血小板凝集の阻害 － Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）インピーダンス凝集測定法
材料及び方法
関連疾患状況を反映するヒト血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）の阻害活性を評定するために、動脈硬化性プラークにより誘導される血小板凝集を、以前に記載されているように（Toth et al., Thromb Haemost, 2006）、近年修正されたプロトコル（Bampalis et al., J Thromb Haemost, 2012）に従い、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）装置を用いた多重電極凝集測定法（ＭＥＡ）によって静止系において測定した。ヒト動脈硬化性プラーク物質は、高度頸動脈狭窄のために動脈内膜切除術を受けた患者から得られた。
材料及び方法
関連疾患状況を反映するヒト血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）の阻害活性を評定するために、動脈硬化性プラークにより誘導される血小板凝集を、以前に記載されているように（Toth et al., Thromb Haemost, 2006）、近年修正されたプロトコル（Bampalis et al., J Thromb Haemost, 2012）に従い、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）装置を用いた多重電極凝集測定法（ＭＥＡ）によって静止系において測定した。ヒト動脈硬化性プラーク物質は、高度頸動脈狭窄のために動脈内膜切除術を受けた患者から得られた。
【0407】
抗体を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（商標）キュベットにおいて０．３ｍｌの生理食塩水で希釈した０．３ｍｌの抗凝固処理血液中２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌの濃度にて３７℃で３分間インキュベートした後、ヒトのプールしたプラークホモジネート（３３３μｇ／ｍｌ）を加えることによって凝集を誘導した。電気インピーダンスの上昇を６分間続けて記録した。抗ＧＰＶＩ抗体の特異性を、ＧＰＶＩ非依存性アゴニストＡＤＰ（０．５μＭ～２μＭ）及びＰＡＲ－１アゴニストＴＲＡＰ（２μＭ～１０μＭ）による凝集の誘導によって評定した。
【0408】
結果及び結論
図３に、ヒトのプールしたプラークホモジネートによって誘導される血小板凝集に対する本開示の抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む；表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）の阻害活性を示す。結果から、試験した全てのＦａｂについてヒトプラークにより誘導されるヒト血小板の凝集に対する強い用量依存的阻害活性が確認され、２μｇ／ｍｌのＦａｂ濃度でほぼ完全な又は完全な凝集の阻害が見られる。
図３に、ヒトのプールしたプラークホモジネートによって誘導される血小板凝集に対する本開示の抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む；表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）の阻害活性を示す。結果から、試験した全てのＦａｂについてヒトプラークにより誘導されるヒト血小板の凝集に対する強い用量依存的阻害活性が確認され、２μｇ／ｍｌのＦａｂ濃度でほぼ完全な又は完全な凝集の阻害が見られる。
【0409】
実施例１１：流動条件下でのヒト動脈硬化性プラークにより誘導されるヒト血小板凝集の阻害 － フローチャンバー
材料及び方法
ガラスカバースリップを、高度頸動脈狭窄のために動脈内膜切除術を受けた患者から得られたプールしたプラークホモジネート（ＰＢＳ中２０倍希釈）でコーティングした。カバースリップを、４％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加したＰＢＳでブロッキングした０．１ Ｌｕｅｒスティッキースライド（ｉｂｉｄｉ（商標））を用いて平行板フローチャンバーに取り付けた。フローチャンバーを、インキュベーションチャンバー（３７℃）を備えるＴＥ２０００－Ｅ蛍光顕微鏡（株式会社ニコン）のステージに載せた。プラークでコーティングしたフローチャンバーにＰＢＳを灌流させ、続いて４％ＨＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングした。ヒルジン添加（hirudinzed）ヒト全血中の血小板を１μＭ ＤｉＯＣ６で染色し、２μｇ／ｍｌ抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）、Ｐ２Ｙ１２アンタゴニストであるチカグレロル又は対照と共に１０分間インキュベートした。指定の場合には１ｍＭ ＡＳＡを採血中に血液に添加した。血液を６００／秒のずり速度でフローチャンバーを通して灌流させた。標識した血小板の接着及び凝集を、１０倍対物レンズ及びＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱ２ ＣＣＤカメラを用いてリアルタイムで６分間続けて記録した（１フレーム／秒）。血小板占有率（coverage）を、ＮＩＳ－ｅｌｅｍｅｎｔ ３．２ソフトウェアパッケージ（株式会社ニコン）を用いて２値蛍光面積率を定量化することによって分析した。
材料及び方法
ガラスカバースリップを、高度頸動脈狭窄のために動脈内膜切除術を受けた患者から得られたプールしたプラークホモジネート（ＰＢＳ中２０倍希釈）でコーティングした。カバースリップを、４％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加したＰＢＳでブロッキングした０．１ Ｌｕｅｒスティッキースライド（ｉｂｉｄｉ（商標））を用いて平行板フローチャンバーに取り付けた。フローチャンバーを、インキュベーションチャンバー（３７℃）を備えるＴＥ２０００－Ｅ蛍光顕微鏡（株式会社ニコン）のステージに載せた。プラークでコーティングしたフローチャンバーにＰＢＳを灌流させ、続いて４％ＨＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングした。ヒルジン添加（hirudinzed）ヒト全血中の血小板を１μＭ ＤｉＯＣ６で染色し、２μｇ／ｍｌ抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）、Ｐ２Ｙ１２アンタゴニストであるチカグレロル又は対照と共に１０分間インキュベートした。指定の場合には１ｍＭ ＡＳＡを採血中に血液に添加した。血液を６００／秒のずり速度でフローチャンバーを通して灌流させた。標識した血小板の接着及び凝集を、１０倍対物レンズ及びＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱ２ ＣＣＤカメラを用いてリアルタイムで６分間続けて記録した（１フレーム／秒）。血小板占有率（coverage）を、ＮＩＳ－ｅｌｅｍｅｎｔ ３．２ソフトウェアパッケージ（株式会社ニコン）を用いて２値蛍光面積率を定量化することによって分析した。
【0410】
結果及び結論
図４Ａ～図４Ｄに、生理的流動条件下でのヒトのプールしたプラークホモジネートによって誘導される血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃１～Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む；表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）の阻害活性を示す。
図４Ａ～図４Ｄに、生理的流動条件下でのヒトのプールしたプラークホモジネートによって誘導される血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃１～Ｆａｂ＃４（修飾重鎖定常領域を含む；表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）の阻害活性を示す。
【0411】
結果から、Ｆａｂ＃１～Ｆａｂ＃４が２μｇ／ｍｌの濃度にてヒトプラーク物質の存在下で血小板活性化／凝集をほぼ完全に阻害することが可能であったことが強く示唆される。さらに、全てのＦａｂが標準治療であるＡＳＡとチカグレロルとの組合せよりも明らかに優れていた（図４Ｅ）。
【0412】
実施例１２：ｉｎ ｖｉｖｏ有効性 － 動脈血栓症のマウスモデルにおけるＧＰＶＩ特異一価Ｆａｂの効果 － 結紮誘導血栓症モデル
材料及び方法
生体内蛍光顕微鏡検査を以前に記載されるように行った（Seizer et al., 2015）。簡潔に述べると、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンドの遺伝子改変マウス（「ＲＯＳＡ」系統）を血栓形成の画像化に用いた。マウスは、緑色蛍光血小板を有する「野生型」マウスであった。マウスにミダゾラム（５ｍｇ／ｋｇ（体重））、メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ（体重））及びフェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重））の注射によって麻酔をかけた。総頸動脈を解離させ、続いて標準的な５分間の強い結紮によって損傷した（Seizer et al., 2015）。結紮の前に３．３ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ又は対照Ｆａｂを尾静脈にｉ．ｖ．投与した。損傷の前及び直後に血栓形成、すなわち損傷血管壁への蛍光血小板の接着及び凝集をｉｎ ｖｉｖｏビデオ顕微鏡法によって可視化した。１血管当たりの記録時間は２０分間とした。分析を、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Carl Zeiss）を用いて指定の時点での全損傷面積に対する血栓被覆面積の割合を決定することによって行った。全ての動物実験が実験動物の管理及び使用に関するドイツの法律に従って行われ、地方自治体によって承認された。
材料及び方法
生体内蛍光顕微鏡検査を以前に記載されるように行った（Seizer et al., 2015）。簡潔に述べると、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンドの遺伝子改変マウス（「ＲＯＳＡ」系統）を血栓形成の画像化に用いた。マウスは、緑色蛍光血小板を有する「野生型」マウスであった。マウスにミダゾラム（５ｍｇ／ｋｇ（体重））、メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ（体重））及びフェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重））の注射によって麻酔をかけた。総頸動脈を解離させ、続いて標準的な５分間の強い結紮によって損傷した（Seizer et al., 2015）。結紮の前に３．３ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ又は対照Ｆａｂを尾静脈にｉ．ｖ．投与した。損傷の前及び直後に血栓形成、すなわち損傷血管壁への蛍光血小板の接着及び凝集をｉｎ ｖｉｖｏビデオ顕微鏡法によって可視化した。１血管当たりの記録時間は２０分間とした。分析を、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Carl Zeiss）を用いて指定の時点での全損傷面積に対する血栓被覆面積の割合を決定することによって行った。全ての動物実験が実験動物の管理及び使用に関するドイツの法律に従って行われ、地方自治体によって承認された。
【0413】
結果及び結論
図５及び図６に、陰性対照Ｆａｂと比較した、７つの異なる時点及び６匹の試験動物での血栓形成に対する抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃３（修飾重鎖定常領域を含む；配列番号４３の重鎖配列及び配列番号４１の軽鎖配列）の阻害活性を示す。血栓形成が陰性対照Ｆａｂで処理した全ての動物について観察されたが、３．３ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃３の静脈内ボーラス投与は、６匹の動物のうち５匹で血栓形成を顕著に阻害した。Ｆａｂ＃３で処理した６匹の動物のうち１匹で初期血栓形成が生じたが、長時間持続はしなかった。
図５及び図６に、陰性対照Ｆａｂと比較した、７つの異なる時点及び６匹の試験動物での血栓形成に対する抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃３（修飾重鎖定常領域を含む；配列番号４３の重鎖配列及び配列番号４１の軽鎖配列）の阻害活性を示す。血栓形成が陰性対照Ｆａｂで処理した全ての動物について観察されたが、３．３ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ ＦａｂであるＦａｂ＃３の静脈内ボーラス投与は、６匹の動物のうち５匹で血栓形成を顕著に阻害した。Ｆａｂ＃３で処理した６匹の動物のうち１匹で初期血栓形成が生じたが、長時間持続はしなかった。
【0414】
実施例１３：血小板活性化 － ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ６２Ｐ表面発現
材料及び方法
受容体活性化及びその後の下流のシグナル伝達を血小板活性化マーカーＣＤ６２Ｐの細胞表面発現の蛍光分析評定によって評価した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を、クエン酸全血を連続的な５００×ｇ、ＲＴで１５分間の遠心分離によって生成した。得られる上清を、下層の白血球に富んだ中間相を乱すことなくＰＲＰとして新たなサンプル管に移した。ＰＲＰ中の血小板を、９６ウェルＶ字底プレートにおいて、ＰＢＳで希釈し、ＲＴで３０分間インキュベートした修飾又は野生型ヒト重鎖定常領域のいずれかを有する１０μｇ／ｍｌの抗ＧＰＶＩ Ｆａｂと共にインキュベートした。続いて、ＣＤ６２Ｐに対するフィコエリトリンコンジュゲート抗体（BD Pharmingen）を添加した後、ＲＴで２０分間遮光してインキュベートした。細胞を１％ホルムアルデヒド溶液により４℃で少なくとも３０分間固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（商標） ＩＩ（BD Biosciences）を用いて分析した。基礎ＣＤ６２Ｐ発現を、Ｆａｂの代わりにＰＢＳとインキュベートすることによって決定した。Ｆａｂにより誘導されるＧＰＶＩ活性化を、ＰＢＳの存在下での基礎発現レベルに対して正規化したＦａｂの存在下での活性化マーカー発現のレベルとして表す。
材料及び方法
受容体活性化及びその後の下流のシグナル伝達を血小板活性化マーカーＣＤ６２Ｐの細胞表面発現の蛍光分析評定によって評価した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を、クエン酸全血を連続的な５００×ｇ、ＲＴで１５分間の遠心分離によって生成した。得られる上清を、下層の白血球に富んだ中間相を乱すことなくＰＲＰとして新たなサンプル管に移した。ＰＲＰ中の血小板を、９６ウェルＶ字底プレートにおいて、ＰＢＳで希釈し、ＲＴで３０分間インキュベートした修飾又は野生型ヒト重鎖定常領域のいずれかを有する１０μｇ／ｍｌの抗ＧＰＶＩ Ｆａｂと共にインキュベートした。続いて、ＣＤ６２Ｐに対するフィコエリトリンコンジュゲート抗体（BD Pharmingen）を添加した後、ＲＴで２０分間遮光してインキュベートした。細胞を１％ホルムアルデヒド溶液により４℃で少なくとも３０分間固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（商標） ＩＩ（BD Biosciences）を用いて分析した。基礎ＣＤ６２Ｐ発現を、Ｆａｂの代わりにＰＢＳとインキュベートすることによって決定した。Ｆａｂにより誘導されるＧＰＶＩ活性化を、ＰＢＳの存在下での基礎発現レベルに対して正規化したＦａｂの存在下での活性化マーカー発現のレベルとして表す。
【0415】
結果及び結論
結果を図７に示す。修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃２ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃３ ｍｏｄ．ＨＣ及びＦａｂ＃４ ｍｏｄ．ＨＣ）は、一価結合の結果としてのＧＰＶＩ架橋の欠如のために抗ＧＰＶＩ ＩｇＧと比較してはるかに弱い程度でＣＤ６２Ｐ発現を誘導した。残存血小板活性化が、潜在的にヒト血清中に存在する既存の抗Ｆａｂ抗体によるＧＰＶＩに結合したＦａｂの架橋によって生じた。修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃２ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃３ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃４ ｍｏｄ．ＨＣ）を用いることで、非修飾ヒトＦａｂ重鎖定常領域を含むＦａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４）と比較した場合に、血小板活性化マーカーＣＤ６２Ｐの発現が更に低減し、修飾がこれらのＦａｂへのヒト血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体の結合を効率的に防止することが示唆された。この効果は、ＲｅｆＦａｂ＃１について記載したようにグリシン－セリンリンカーをＦａｂ重鎖Ｃ末端に付着させた場合には観察されなかった。
結果を図７に示す。修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃２ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃３ ｍｏｄ．ＨＣ及びＦａｂ＃４ ｍｏｄ．ＨＣ）は、一価結合の結果としてのＧＰＶＩ架橋の欠如のために抗ＧＰＶＩ ＩｇＧと比較してはるかに弱い程度でＣＤ６２Ｐ発現を誘導した。残存血小板活性化が、潜在的にヒト血清中に存在する既存の抗Ｆａｂ抗体によるＧＰＶＩに結合したＦａｂの架橋によって生じた。修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃２ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃３ ｍｏｄ．ＨＣ、Ｆａｂ＃４ ｍｏｄ．ＨＣ）を用いることで、非修飾ヒトＦａｂ重鎖定常領域を含むＦａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４）と比較した場合に、血小板活性化マーカーＣＤ６２Ｐの発現が更に低減し、修飾がこれらのＦａｂへのヒト血清中に存在する抗Ｆａｂ抗体の結合を効率的に防止することが示唆された。この効果は、ＲｅｆＦａｂ＃１について記載したようにグリシン－セリンリンカーをＦａｂ重鎖Ｃ末端に付着させた場合には観察されなかった。
【0416】
【表14】
【0417】
【表15】
【0418】
実施例１４：ｉｎ ｖｉｖｏ出血時間 － マウス尾部クリッピングモデル
材料及び方法
出血時間に対するＦａｂ媒介ＧＰＶＩ遮断の効果をマウス尾部クリッピングモデルにおいて評価した。尾部出血を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて尾部の先端２ｍｍを外科用メスの刃で切断し、尾部を温かいＰＢＳに浸すことによって誘導した。マウスを尾部切断のおよそ１０分前にメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（商標） ０．５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ（商標） ５ｍｇ／ｋｇ）及びフェンタニル（Ｆｅｎｔａｎｙｌ Ｂ．Ｂｒａｕｎ ０．０５ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内麻酔した。抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇ）又は対照を尾部切断の３０分前に尾静脈にｉ．ｖ．適用した。指定の場合にはＡＳＡを尾部切断の６０分前にｉ．ｖ．注射した。出血時間を切断の直後に記録し、尾部の先端からの出血が止まり、３０秒以内に再開しない時点まで続けた。研究の終了時に、麻酔をかけた動物を頸椎脱臼によって屠殺した。実験は、実験動物の管理及び使用に関するドイツの法律に従って行われ、地方自治体によって承認された。
材料及び方法
出血時間に対するＦａｂ媒介ＧＰＶＩ遮断の効果をマウス尾部クリッピングモデルにおいて評価した。尾部出血を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて尾部の先端２ｍｍを外科用メスの刃で切断し、尾部を温かいＰＢＳに浸すことによって誘導した。マウスを尾部切断のおよそ１０分前にメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（商標） ０．５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ（商標） ５ｍｇ／ｋｇ）及びフェンタニル（Ｆｅｎｔａｎｙｌ Ｂ．Ｂｒａｕｎ ０．０５ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内麻酔した。抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（修飾重鎖定常領域を含む）（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇ）又は対照を尾部切断の３０分前に尾静脈にｉ．ｖ．適用した。指定の場合にはＡＳＡを尾部切断の６０分前にｉ．ｖ．注射した。出血時間を切断の直後に記録し、尾部の先端からの出血が止まり、３０秒以内に再開しない時点まで続けた。研究の終了時に、麻酔をかけた動物を頸椎脱臼によって屠殺した。実験は、実験動物の管理及び使用に関するドイツの法律に従って行われ、地方自治体によって承認された。
【0419】
結果及び結論
図８に示されるように、修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４）（表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）は単独で、マウス尾部クリッピングモデルにおいて出血時間の延長を引き起こさなかった。さらに、抗ＧＰＶＩ ＦａｂとＡＳＡとの組合せは、アスピリン単独と比較して出血時間を更に増加させなかった。これらの結果から、抗ＧＰＶＩ Ｆａｂによる処理が出血リスクの増加をもたらさないことが示唆される。
図８に示されるように、修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４）（表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）は単独で、マウス尾部クリッピングモデルにおいて出血時間の延長を引き起こさなかった。さらに、抗ＧＰＶＩ ＦａｂとＡＳＡとの組合せは、アスピリン単独と比較して出血時間を更に増加させなかった。これらの結果から、抗ＧＰＶＩ Ｆａｂによる処理が出血リスクの増加をもたらさないことが示唆される。
【0420】
実施例１５：血小板数
材料及び方法
血小板数に対する影響を評定するために、修飾重鎖定常領域を含む１０ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４）（表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）又は対照をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈にｉ．ｖ．適用した。化合物の注射の直前及び３０分後に、薬物適用に用いた静脈の反対側の尾静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプルをエンドツーエンドキャピラリー２５μｌ容Ｋ２Ｅ管（Sanguis Counting）に採取し、タイロードバッファー（ｐＨ７．３）で５０倍希釈した。希釈血液サンプルを、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４１抗体（Biolegend）を用いてＲＴで１０分間、暗所で染色し、タイロードバッファー（ｐＨ７．３）で更に５０倍希釈し、続いてＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（商標） ＩＩ（BD Biosciences）において分析した。２５μｌのＣＤ４１陽性イベントを記録した。血小板数を式：イベント×２５００／２５＝イベント×１００（血小板／μｌ）に従って決定した。
材料及び方法
血小板数に対する影響を評定するために、修飾重鎖定常領域を含む１０ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４）（表１２による重鎖及び軽鎖配列を有する）又は対照をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈にｉ．ｖ．適用した。化合物の注射の直前及び３０分後に、薬物適用に用いた静脈の反対側の尾静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプルをエンドツーエンドキャピラリー２５μｌ容Ｋ２Ｅ管（Sanguis Counting）に採取し、タイロードバッファー（ｐＨ７．３）で５０倍希釈した。希釈血液サンプルを、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４１抗体（Biolegend）を用いてＲＴで１０分間、暗所で染色し、タイロードバッファー（ｐＨ７．３）で更に５０倍希釈し、続いてＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（商標） ＩＩ（BD Biosciences）において分析した。２５μｌのＣＤ４１陽性イベントを記録した。血小板数を式：イベント×２５００／２５＝イベント×１００（血小板／μｌ）に従って決定した。
【0421】
結果及び結論
図９に示されるように、修飾重鎖定常領域を含む１０ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３又はＦａｂ＃４）の投与の４８時間後又は７２時間後に血小板減少症の兆候は観察されなかった。これにより、本開示の抗ＧＰＶＩ Ｆａｂによる処理が、恒常性に対して有害な影響を有さず、上記（実施例１３）で観察された出血時間延長の欠如と一致することが示される。
図９に示されるように、修飾重鎖定常領域を含む１０ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３又はＦａｂ＃４）の投与の４８時間後又は７２時間後に血小板減少症の兆候は観察されなかった。これにより、本開示の抗ＧＰＶＩ Ｆａｂによる処理が、恒常性に対して有害な影響を有さず、上記（実施例１３）で観察された出血時間延長の欠如と一致することが示される。
【0422】
実施例１６：血小板上でのＧＰＶＩ表面発現
材料及び方法
抗ＧＰＶＩ抗体での血小板の処理は、化合物のアゴニスト活性、ひいては望ましくない血小板活性化を示唆し得るＧＰＶＩの内在化又は血小板表面からのその脱落を誘導する可能性がある。これを除外するために、１０ｍｇ／ｋｇの修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４）（表１２による重鎖及び軽鎖配列を含む）及び対照をＣＤ－１マウスの尾静脈にｉ．ｖ．注射した。化合物の注射の直前及びその後の或る特定の時点で、薬物適用に用いた静脈の反対側の尾静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプルをエンドツーエンドキャピラリー３０μｌ容Ｋ２Ｅ管（Sanguis Counting）に採取した。血液を即座にキャピラリーから１μｌの３０倍凝固及び血小板阻害剤ミックス（５４ｍｇ／ｍｌ Ｋ２－ＥＤＴＡ、１０ｍｇ／ｍｌアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、１６７μｇ／ｍｌチカグレロル及び３μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２）を含む管に移した。血液を、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４１抗体（Biolegend）及びＰＥコンジュゲート非競合抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（社内）を含有するタイロードバッファー（ｐＨ７．３）で２０倍希釈し、ＲＴで１０分間、暗所でインキュベートした。続いて、サンプルをＰＢＳで更に２５倍希釈し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（商標） ＩＩ（BD Biosciences）において分析した。ＣＤ４１陽性集団のＰＥシグナルを、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標） ＰＥ蛍光定量キット（BD Biosciences）を用いて１血小板当たりのＧＰＶＩ分子の絶対数に変換した。
材料及び方法
抗ＧＰＶＩ抗体での血小板の処理は、化合物のアゴニスト活性、ひいては望ましくない血小板活性化を示唆し得るＧＰＶＩの内在化又は血小板表面からのその脱落を誘導する可能性がある。これを除外するために、１０ｍｇ／ｋｇの修飾重鎖定常領域を含む抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３及びＦａｂ＃４）（表１２による重鎖及び軽鎖配列を含む）及び対照をＣＤ－１マウスの尾静脈にｉ．ｖ．注射した。化合物の注射の直前及びその後の或る特定の時点で、薬物適用に用いた静脈の反対側の尾静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプルをエンドツーエンドキャピラリー３０μｌ容Ｋ２Ｅ管（Sanguis Counting）に採取した。血液を即座にキャピラリーから１μｌの３０倍凝固及び血小板阻害剤ミックス（５４ｍｇ／ｍｌ Ｋ２－ＥＤＴＡ、１０ｍｇ／ｍｌアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、１６７μｇ／ｍｌチカグレロル及び３μｇ／ｍｌ ＰＧＩ２）を含む管に移した。血液を、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４１抗体（Biolegend）及びＰＥコンジュゲート非競合抗ＧＰＶＩ Ｆａｂ（社内）を含有するタイロードバッファー（ｐＨ７．３）で２０倍希釈し、ＲＴで１０分間、暗所でインキュベートした。続いて、サンプルをＰＢＳで更に２５倍希釈し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（商標） ＩＩ（BD Biosciences）において分析した。ＣＤ４１陽性集団のＰＥシグナルを、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標） ＰＥ蛍光定量キット（BD Biosciences）を用いて１血小板当たりのＧＰＶＩ分子の絶対数に変換した。
【0423】
結果及び結論
図１０に示されるように、１０ｍｇ／ｋｇの修飾重鎖定常領域を含むＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４）の投与は、Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２及びＦａｂ＃３の投与４８時間又は７２時間以内に血小板表面上のＧＰＶＩを減少させなかった。Ｆａｂ＃４で処理したマウスに由来する血小板は、２４時間後及び４８時間後に細胞表面での約２０％のＧＰＶＩコピー数の僅かな減少を示した。これは、試験したＦａｂがＧＰＶＩの脱落又は内在化を全く又は僅かにしか誘導しないことを示す。ＣＤ６２Ｐ血小板活性化ＦＡＣＳにおいて観察された結果（実施例１３）と一致して、これにより試験したＦａｂが内因性アゴニスト血小板活性化能を有しないことが更に確認される。
図１０に示されるように、１０ｍｇ／ｋｇの修飾重鎖定常領域を含むＧＰＶＩ Ｆａｂ（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４）の投与は、Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２及びＦａｂ＃３の投与４８時間又は７２時間以内に血小板表面上のＧＰＶＩを減少させなかった。Ｆａｂ＃４で処理したマウスに由来する血小板は、２４時間後及び４８時間後に細胞表面での約２０％のＧＰＶＩコピー数の僅かな減少を示した。これは、試験したＦａｂがＧＰＶＩの脱落又は内在化を全く又は僅かにしか誘導しないことを示す。ＣＤ６２Ｐ血小板活性化ＦＡＣＳにおいて観察された結果（実施例１３）と一致して、これにより試験したＦａｂが内因性アゴニスト血小板活性化能を有しないことが更に確認される。
【0424】
実施例１７：ＥＬＩＳＡベースの交差競合アッセイ
ＧＰＶＩに特異的な抗体若しくは抗体フラグメント、又は別のＧＰＶＩ結合剤の交差競合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用い、以下の標準手順に従って検出することができる。
ＧＰＶＩに特異的な抗体若しくは抗体フラグメント、又は別のＧＰＶＩ結合剤の交差競合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用い、以下の標準手順に従って検出することができる。
【0425】
ＥＬＩＳＡアッセイの一般的原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェルへのＧＰＶＩＰ特異抗体又は抗体フラグメント（Ｆａｂ＃１、Ｆａｂ＃２、Ｆａｂ＃３、Ｆａｂ＃４等）のコーティングを含む。次いで、過剰量のＧＰＶＩに特異的な第２の潜在的に交差競合性の抗体を溶液中に添加する（すなわち、ＥＬＩＳＡプレートに結合しない）。続いて限定量のＧＰＶＩ－Ｆｃをウェルに添加する。
【0426】
ウェルにコーティングした抗体及び溶液中の抗体は、限定数のＧＰＶＩ分子の結合について競合する。次いで、プレートを洗浄して、コーティングした抗体に結合しなかったＧＰＶＩ分子を除去し、第２の溶液相抗体及び第２の溶液相抗体とＧＰＶＩとの間で形成された任意の複合体も除去する。次いで、結合したＧＰＶＩの量を、適切なＧＰＶＩ検出試薬を用いて測定する。したがって、ＧＰＶＩを適切なタグ特異的な作用物質により検出することができるタグ、例えばＦｃ、Ｆｌａｇ等と融合してもよい。
【0427】
コーティングした抗体と交差競合性である溶液中の抗体は、コーティングした抗体が第２の溶液相抗体の非存在下で結合し得るＧＰＶＩ分子の数に対して、コーティングした抗体が結合し得るＧＰＶＩ分子の数を減少させることが可能である。
【0428】
このアッセイを、Ａｂ－Ｘ及びＡｂ－Ｙと称される２つの抗体について下記に更により詳細に説明する。Ａｂ－Ｘが固定化抗体として選ばれる場合、Ａｂ－ＸをＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングした後、続いて添加する試薬の非特異的結合を最小限に抑えるためにプレートを好適なブロッキング溶液でブロッキングする。次いで、１ウェル当たりのＡｂ－Ｙ ＧＰＶＩ結合部位のモル数が、ＥＬＩＳＡプレートのコーティング中に使用される１ウェル当たりのＡｂ－Ｘ ＧＰＶＩ結合部位のモル数よりも少なくとも１０倍高くなるように、過剰量のＡｂ－ＹをＥＬＩＳＡプレートに添加する。１ウェル当たりの添加するＧＰＶＩのモル数が、各ウェルのコーティングに使用されるＡｂ－Ｘ ＧＰＶＩ結合部位のモル数よりも少なくとも２５倍低くなるようにＧＰＶＩを添加する。好適なインキュベーション期間の後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＧＰＶＩ抗原に特異的な検出試薬を添加して、ＧＰＶＩに特異的なコーティングした抗体（この場合、Ａｂ－Ｘ）が特異的に結合したＧＰＶＩ分子の量を測定する。アッセイのバックグラウンドシグナルは、コーティングした抗体（この場合、Ａｂ－Ｘ）、第２の溶液相抗体（この場合、Ａｂ－Ｙ）、バッファーのみ（すなわち、ＧＰＶＩなし）及び検出試薬を含むウェルにおいて得られたシグナルとして規定する。アッセイの陽性対照シグナルは、コーティングした抗体（この場合、Ａｂ－Ｘ）、第２の溶液相抗体バッファーのみ（すなわち、第２の溶液相抗体なし）、ＧＰＶＩ検出試薬を含むウェルにおいて得られるシグナルとして規定する。ＥＬＩＳＡアッセイは、陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍となるように行う必要がある。
【0429】
コーティング抗体として使用する抗体及び第２の（競合）抗体として使用する抗体の選択によって生じる任意のアーチファクト（例えば、ＩＬ－１７Ｃに対してＡｂ－ＸとＡｂ－Ｙとで顕著に異なる親和性）を回避するために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットで行う必要がある：１）フォーマット１は、Ａｂ－ＸがＥＬＩＳＡプレートにコーティングする抗体であり、Ａｂ－Ｙが溶液中の競合抗体である場合であり、２）フォーマット２は、Ａｂ－ＹがＥＬＩＳＡプレートにコーティングする抗体であり、Ａｂ－Ｘが溶液中の競合抗体である場合である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】