特許 7080516 軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造又は遺伝子デリバリーシステムにおけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-27

(45)【発行日】2022-06-06

(54)【発明の名称】軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造又は遺伝子デリバリーシステムにおけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20220530BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220530BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220530BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220530BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105 ZNA

A61P19/02

A61P43/00 105

A61K48/00

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021000233

(22)【出願日】2021-01-04

(65)【公開番号】P2021108661

(43)【公開日】2021-08-02

【審査請求日】2021-01-04

(31)【優先権主張番号】202010008192.6

(32)【優先日】2020-01-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】521006266

【氏名又は名称】中国人民解放軍陸軍軍医大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】董 世武

(72)【発明者】

【氏名】曹 震

(72)【発明者】

【氏名】張 珠

(72)【発明者】

【氏名】康 菲

(72)【発明者】

【氏名】李 建美

(72)【発明者】

【氏名】陳 ▲ゆぇ▼▲ち▼

(72)【発明者】

【氏名】劉 川

【審査官】高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】Stem Cell Research & Therapy，2017年，Vol8:4，p.1-13

【文献】Funct Integr Genomics，2017年，Vol.17，p.739-749

【文献】International Journal of Molecular Sciences，2019年，Vol.20, No.4475，p.1-26

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

Ａ６１Ｋ ４８／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用であって、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の塩基配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される、ことを特徴とする軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項2】

前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８はＳｏｘ９遺伝子の発現を促進することができる、ことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項3】

前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８はｍｉＲ－１４５ａ－５ｐとｍｉＲ－５０９－５ｐに競合的に結合できる、ことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項4】

前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は軟骨細胞の肥大分化を抑制することができる、ことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項5】

前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は軟骨基質の変性を抑制することができる、ことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項6】

前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、軟骨細胞の肥大進行を抑制する植物抽出物の効果的なスクリーニングのためにマーカーとして用いることができる、ことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項7】

前記軟骨細胞は、正常な表現型の軟骨細胞及び間葉系幹細胞由来の軟骨細胞を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項8】

間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞又は臍帯間葉系幹細胞である、ことを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項9】

前記間葉系幹細胞は、１０～１４日の軟骨分化の誘導培養時間が必要であり、前記軟骨細胞の肥大分化から肥大分化の誘導培養時間は１０～１４日である、ことを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の使用。

【請求項10】

ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８を含む軟骨細胞の肥大分化抑制剤であって、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の塩基配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される、ことを特徴とする軟骨細胞の肥大分化抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組織工学の技術分野に属し、軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造又は遺伝子デリバリーシステムにおけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の応用に関する。

【背景技術】

【0002】

人体の軟骨組織は、軟骨細胞と細胞外基質で構成される。それらの中で、軟骨細胞は総組織体積のわずか１％を占めるが、成長中に軟骨形成を引き起こし、組織内の細胞外基質の代謝バランスを維持する。それでも、コラーゲン原線維は基質で組織の構造的枠組みであり、軟骨の引張強度を与える。関節軟骨は硝子軟骨の一種であり、そのコラーゲン原線維の主成分はＩＩ型コラーゲンたんぱく質であり、二次成分はＩＸ型コラーゲンたんぱく質とＸＩ型コラーゲンたんぱく質である。コラーゲン繊維ネットワークは、プロテオグリカンと糖たんぱく質をカプセル化するため、軟骨組織に機械的弾性を持たせる。軟骨細胞は代謝のために酸素を必要とするが、関節軟骨には血管がないため、栄養素やその他のサイトカインは関節滑膜液と軟骨下骨からのみ得ることができる。関節の動きと負荷は、栄養素の拡散を助けることができる。骨関節炎と外傷は、軟骨損傷を引き起こす２つの最も一般的な原因である。骨関節炎は関節軟骨の変性疾患である。病気の初期段階では、軟骨細胞が増殖して表面の軟骨欠損を修復するが、時間が経つにつれて、軟骨基質の合成速度は分解速度よりも徐々に遅くなり、軟骨表面が線維化し始め、その後、軟骨内部が損傷する。炎症が最高到達点を破ると、血管が軟骨に成長し、線維性軟骨の形成を引き起こし、最終的に軟骨機能の喪失を引き起こす。外傷性軟骨損傷は、微小損傷、軟骨骨折、骨軟骨骨折の３つのカテゴリーに分類される。微小損傷とは、骨関節炎の初期段階と同様に、関節面に影響を与えないように軟骨細胞と細胞外基質を破壊することを指す。軟骨骨折とは、軟骨下骨に侵入しないように関節面を破壊することを指す。マトリックス同化作用の増加は、損傷後約２週間観察され、最終的に正常レベルに戻る。骨軟骨骨折とは、損傷が最高到達点を破って軟骨下骨に到達することを指す。この場合、軟骨下骨の脈管構造が組織の炎症反応を活性化することがある。さらに、血管の間葉幹細胞はフィブリンネットワークに沈着し、最終的に線維軟骨を形成する。これは軟骨の機能に深刻な影響を及ぼす。無血管関節軟骨の修復能力は限られており、損傷後の関節軟骨の機能をどのように回復させるかが医療分野の大きな課題であることがわかる。

【0003】

組織工学は、継続的に発展している学際的分野であり、軟骨欠損修復のための新しい解決策を提供することが期待されている。細胞足場と生体材料と種子細胞は組織工学の３つの重要な要素であるが、種子細胞の選択は組織工学による軟骨を構成する焦点である。間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、容易に分離し、体外で急速に拡大し、骨髄、脂肪、滑膜、骨膜、臍静脈、胎盤などのさまざまな組織に由来し、骨形成、軟骨形成及び脂質生成のような多方向の分化の可能性があるため、現在、軟骨組織工学において最も潜在的な種子細胞になっている。しかし、組織工学による軟骨の構築中に、ＭＳＣｓ由来の軟骨細胞は、細胞外基質の代謝バランスを維持し難いため、一部の成熟軟骨細胞は、軟骨細胞の肥大マーカー遺伝子を発現し始め、それが軟骨細胞の恒常性を破壊する。細胞の微小環境の変化は、組織工学の再生された軟骨の細胞自然死とマトリックス分解を引き起こし、関節軟骨欠損の修復と機能的再建に深刻な影響を及ぼす。骨細胞肥大は、組織工学による軟骨の修復中に線維軟骨が発生する原因でもある。そのため、軟骨への分化後のＭＳＣｓ肥大の進行を抑制し、軟骨細胞基質の代謝バランスを維持することは、組織工学技術の軟骨修復への応用を改善するための最優先事項である。

【0004】

Ｓｏｘ９とＲｕｎｘ２は、軟骨細胞の分化肥大の過程における２つの重要な調節因子である。さまざまな信号経路は、Ｓｏｘ９とＲｕｎｘ２との相対的な転写活性を変えることにより、軟骨細胞の増殖又は肥大の進行を調節する。Ｗｎｔ経路では、ＬＥＦ ／ ＴＣＦ ／β－カテニン複合体がＲｕｎｘ２の発現を促進する可能性がある。ＴＧＦ－β信号経路は、リン酸化Ｓｍａｄ２／３を介してＳｏｘ９の発現を誘導して軟骨分化を促進するが、ＢＭＰ信号経路は、リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８を介して軟骨細胞の肥大を促進する。ＰＴＨｒＰは軟骨細胞の肥大の進行を抑制することができ、Ｉｈｈ信号経路はＲｕｎｘ２の転写活性を増加し、それによって軟骨細胞の肥大の進行を積極的に調節する。これらの信号経路間のバランスは、正常な軟骨細胞の分化と軟骨の成長の鍵である。過去１０年間で、軟骨細胞の分化と肥大の過程における信号経路と転写の調節ネットワークの研究に大きな進展が見られた。分子メカニズムを完全に理解することは、さまざまな骨疾患を予防し治療するための新薬の開発にとって非常に重要である。同時に、軟骨修復中の細胞肥大を回避することは重要な研究課題であるが、軟骨成長中の重要な経路と分子調節ネットワークを把握することは上記の問題を解決するための基礎である。

【0005】

ゲノミクスの発展に伴い、ディープシーケンシングなどの新しい技術により、ほとんどのＤＮＡヌクレオチド配列がＲＮＡに転写されることが示されている。ただし、ヒトゲノムの１～２％のみがたんぱく質をコードしているため、ＲＮＡはコーディングＲＮＡと非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）に分類される。過去、ｎｃＲＮＡは「進化的ゴミ」と見なされていたが、ｎｃＲＮＡが細胞のさまざまな生物学的挙動に重要な調節効果を有することを示す証拠がますます増えている。約２０ｎｔのサイズのマイクロＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）はｎｃＲＮＡの一種でもあり、これらの主な作用は、標的ｍＲＮＡに結合して、その分解を誘導したり、翻訳を抑制したりすることにより、遺伝子発現を負に調節することである。私たちの以前の研究では、ｍｉＲ－１４５－５ｐがＳｏｘ９を標的にして、転写後レベルで軟骨細胞の分化と肥大を調節できることがわかった。ｍｉｃｒｏＲＮＡと比較して、２００ｎｔより長いｎｃＲＮＡは長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）と呼ばれる。ＬｎｃＲＮＡは細胞内で転写率が高く、複雑な高レベルの構造に折り畳むことができるため、その生物学的機能はより複雑である。ＬｎｃＲＮＡは、転写因子と同様の役割を果たし、標的遺伝子に結合してそれらの発現を調節することができる。例えば、ｌｎｃＲＮＡ ＲＰ１１－７１４Ｇ１８．１は、近くの遺伝子ＬＲＰ２ＢＰに直接結合し、ＬＲＰ２ＢＰの発現を増加させ、最終的に内皮細胞の遊走を抑制することによってアテローム性動脈硬化症の硬化過程に影響を与えることができる。さらに、ｌｎｃＲＮＡは、競合内因性ＲＮＡ（ｃｅＲＮＡ）として特定のｍｉＲＮＡに結合して分離することにより、ターゲットｍＲＮＡを抑制から保護するために作用する。例えば、ｌｎｃＲＮＡ Ｇｍ１０７６８は分子スポンジとしてｍｉＲ－２１４に競合的に結合して、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）の抑制を減らし、肝臓の糖新生過程に影響を与える。上記の結果は、ｌｎｃＲＮＡがさまざまなメカニズムにより、転写レベル及び転写後レベルで標的遺伝子の発現を調節してさまざまな病態生理学的プロセスに影響を与えることを示唆している。しかし、軟骨細胞の生物学的挙動、特に軟骨細胞の肥大分化に対するｌｎｃＲＮＡの調節は現在不明である。さらに、軟骨細胞の肥大分化の研究へのｌｎｃＲＮＡの適用はまだ報告されてはない。

【0006】

現在、軟骨細胞の肥大を抑制する多くの方法がある。たんぱく質レベルでは、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとマトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤などは、細胞外基質の分解を減らし、細胞肥大の進行を遅らせることができる。遺伝子レベルでは、間葉系幹細胞の過剰発現によるＳｏｘ９やＮｋｘ３．２などの転写因子は、肥大機能たんぱく質の発現を低下させる可能性がある。培地にコンドロイチン硫酸塩を加えると、軟骨細胞の細胞外基質の合成が促進され、Ｘ型コラーゲンの発現を大幅に低下させる。さらに、低酸素環境と生体力学的刺激は、軟骨細胞の肥大に調節効果を引き起こす。広帯域ソースから得た多種多様な植物抽出物は、高効率、安全性、低い副作用という利点があり、生物学や医学の分野での研究と応用が徐々に注目されている。さまざまなソースからの植物抽出物はさまざまな有効成分を有しているため、さまざまな信号経路を介して細胞の成長と増殖を調節できる。さらに、一部の植物抽出物には、補体の活性化や抗炎症や老化の遅延や腫瘍増殖の阻害などの効果もある。現在、多くの学者が、植物抽出物が骨芽細胞と破骨細胞の分化に及ぼす影響を報告しており、例えば、クルクミンは軽度の小胞体ストレスを誘発することにより間葉系幹細胞由来骨の分化を促進することが報告されている。さらに、コーディセピンは、骨の喪失を防ぐために活性酸素を除去することにより、破骨細胞の形成を抑制することが報告されている。したがって、軟骨細胞の肥大を抑制する植物抽出物を探すことは、組織工学における線維軟骨の出現を減らすための新しい戦略を提供することができる。ｌｎｃＲＮＡは薬物スクリーニングのマーカーとして軟骨細胞の肥大分化の研究に適用されることも報告されてはない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

これらを考慮して、本発明の目的は、組織工学による軟骨を使用して欠陥を修復する場合、種子細胞にしばしば肥大分化が生じ、それが細胞表現型を維持しにくく、線維症を起こしやすく、修復の失敗を導くという問題に対して、間葉系幹細胞由来の軟骨細胞の肥大進行に関連するｌｎｃＲＮＡ－ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８をスクリーニングすることにより、その効果と分子メカニズムを研究し、幹細胞由来の軟骨細胞の肥大分化の進行を効果的に抑制できることを確認し、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８をマーカーとして軟骨細胞の肥大進行を抑制する植物抽出物のスクリーニングを行うことである。本発明は、軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造又は遺伝子デリバリーシステムにおける長鎖非コーディングＲＮＡ ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の応用を提供する。本発明は、以下の技術的解決策を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

軟骨細胞の肥大分化を抑制する薬物の製造又は遺伝子デリバリーシステムにおけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の応用は、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の塩基配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。

【0009】

さらに、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８はＳｏｘ９遺伝子の発現を促進することができる。

【0010】

さらに、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８はｍｉＲ－１４５ａ－５ｐとｍｉＲ－５０９－５ｐに競合的に結合できる。

【0011】

さらに、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は軟骨細胞の肥大分化を抑制することができる。

【0012】

さらに、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は軟骨基質の変性を抑制することができる。

【0013】

さらに、前記ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、軟骨細胞の肥大進行を抑制する植物抽出物の効果的なスクリーニングのためにマーカーとして用いることができる。

【0014】

さらに、前記遺伝子デリバリーシステムは、レンチウイルスパッケージングシステム、アデノウイルスパッケージングシステム、逆転写パッケージングシステム又は裸のプラスミドである。

【0015】

さらに、前記軟骨細胞は、正常な表現型の軟骨細胞及び間葉系幹細胞由来の軟骨細胞を含む。

【0016】

さらに、間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞又は臍帯間葉系幹細胞である。

【0017】

さらに、前記間葉系幹細胞は、１０～１４日の軟骨分化の誘導培養時間が必要であり、前記軟骨細胞の肥大分化から肥大分化の誘導培養時間は１０～１４日である。

【0018】

具体的な応用ステップは次のとおりである。
１、高発現のｌｎｃＲＮＡ－ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、軟骨細胞の肥大分化の段階でｌｎｃＲＮＡチップを介して同定される。

【0019】

間葉系幹細胞を軟骨誘導培地で１４日間処理した後、培地を肥大誘導培地に交換し、さらに１４日間処理する。合計期間は２８日である。０日目（非誘発群）、１４日目（軟骨群）、２８日目（肥大群）の３つの時点でサンプルを収集する。ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの発現と負の相関があり、大きな変化がある多数の候補ｌｎｃＲＮＡはスクリーニングされた後、生物情報学の分析を使用して候補ｌｎｃＲＮＡをｍｉＲ－１４５ａ－５ｐと比較し、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８とｍｉＲ－１４５ａ－５ｐに結合関係がある最高スコアが見つかる。ｑＰＣＲ検証により、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現は、軟骨分化段階で上昇し、軟骨肥大段階で低下する。

【0020】

２、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は軟骨細胞の肥大分化を調節する作用を有する。

【0021】

軟骨細胞の肥大に対するｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の調節作用を研究するために、そのｌｎｃＲＮＡでレンチウイルスに感染された軟骨前駆細胞を過剰発現し妨害する（軟骨分化を１４日間誘発している間葉幹細胞から）。軟骨前駆細胞を肥大誘導培地で１４日間処理した後、核酸レベルで、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８細胞群を妨害した肥大マーカーＲｕｎｘ２及びＣｏｌ１０ａ１の発現は対照群よりも高く、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を過剰発現したＲｕｎｘ２及びＣｏｌ１０ａ１の発現は対照群よりも低い。ＷＢの結果は、Ｒｕｎｘ２とＣｏｌ１０ａ１の発現を上昇ができるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現への妨害も示している。また、アルシアンブルー染色は細胞外基質の代謝を表しており、結果はＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を妨害した細胞外基質の分解代謝が強く、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を過剰発現した細胞外基質の分解代謝が弱いことを示している。上記のデータは、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８が軟骨細胞の肥大を抑制し、軟骨基質の分解を抑制できることを示している。

【0022】

３、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐ及びｍｉＲ－５０９－５ｐを標的にして調節し、Ｓｏｘ９の発現を調節する。

【0023】

ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８は、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システムでｍｉＲ－１４５ａ－５ｐ及びｍｉＲ－５０９－５ｐを直接標的にして調節することができる。２つのメカニズムは異なる。ここで、１）ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８を過剰発現した場合、対照群と比較して肥大マーカーＲｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０ａ１、及びＭｍｐ１３の発現が低下し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現により、Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０ａ１、及びＭｍｐ１３の発現が上昇する。さらに、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現は、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現によってＲｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０ａ１、及びＭｍｐ１３の発現に対する抑制作用の上昇に拮抗することができる。たんぱく質レベルでは、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現はＳｏｘ９の発現の上昇を引き起こし、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現はＳｏｘ９発現の低下を引き起こし、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現はｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現によってＳｏｘ９の発現に対する促進作用の上昇に拮抗する。Ｒｕｎｘ２の発現に対する影響は、Ｓｏｘ９のそれと正反対である。アルシアンブルー染色の結果は、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現が細胞外基質の分解を抑制し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現が細胞外基質の分解を促進し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現がｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現によって細胞外基質の分解に対する抑制作用の上昇に拮抗することを示している。２）Ｉｄ１はＢＭＰ信号経路の下流分子であり、転写レベルでＳｏｘ９の発現を調節できる。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システムにより、ｍｉＲ－５０９－５ｐとＩｄ１の間の直接的な標的関係を確認し、また、共発現実験は、Ｉｄ１がｍｉＲ－５０９－５ｐの過剰発現によって引き起こされるＳｏｘ９の発現の低下に拮抗できることを示す。ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現実験では、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８がｍｉＲ－５０９－５ｐに競合的に結合することによりＳｏｘ９の発現を調節して軟骨細胞の肥大を抑制することがわかる。

【0024】

４、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、バイオマーカーとして軟骨細胞の肥大を抑制する植物抽出物をスクリーニングすることができる。

【0025】

コーディセピン、クルクミン、キサントトキシン、ジヒドロアルテミシニン及びアントシアニンがＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を促進し、核酸及びたんぱく質レベルで軟骨細胞の肥大マーカー遺伝子の発現を抑制することが見出された。それに対応して、レスベラトロールはＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を抑制し、軟骨細胞の肥大進行を促進する。したがって、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、バイオマーカーとして軟骨細胞の肥大を抑制する植物抽出物をスクリーニングすることができる。

【0026】

本発明の有益な効果は次のとおりである。

【0027】

組織工学による軟骨を構成する過程においては、ＭＳＣｓ由来の軟骨細胞が細胞外基質の代謝バランスを維持し難いため、一部の成熟軟骨細胞は、軟骨細胞の肥大分化のマーカー遺伝子を発現し始め、軟骨細胞の恒常性を破壊する。細胞の微小環境の変化は、組織工学の再生された軟骨の細胞自然死とマトリックス分解を引き起こし、関節軟骨欠損の修復と機能的再建に深刻な影響を及ぼす。骨細胞肥大は、組織工学による軟骨の修復中に線維軟骨が発生する原因でもある。そのため、軟骨への分化後のＭＳＣｓ肥大の進行を抑制し、軟骨細胞基質の代謝バランスを維持することは、組織工学技術の軟骨修復への応用を改善するための解決すべき重要な問題である。本発明は、主に以下の有益な技術的効果を達成する。

【0028】

１）修復中に一部の組織工学による軟骨は線維性変化を示し、その線維性修復組織は、圧縮ストレスに耐えるのに必要な生体力学的特性を欠いているが、線維軟骨の形成の主な理由は、軟骨細胞の肥大分化である。肥大軟骨細胞は、Ｘ型コラーゲンと、細胞外基質を分解したマトリックスメタロプロテアーゼ１３を分泌し、軟骨修復の効果に深刻な影響を及ぼす。さらに、軟骨細胞の肥大は骨関節炎の重要な病理学的特徴の１つでもあり、細胞外基質が分解するにつれて、硝子軟骨が線維化し、この線維軟骨は通常、時間とともに劣化する。間葉系幹細胞由来の軟骨細胞の分化と後続の軟骨細胞の肥大は、組織工学による軟骨の修復と骨関節炎の発生及び発症に影響を与える重要なプロセスである。本発明の方法を使用することにより、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８はｍｉＲ－１４５ａ－５ｐ及びｍｉＲ－５０９－５ｐに直接結合でき、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８はｍｉｃｒｏＲＮＡと共に標的部位に競合的に結合することによりＳｏｘ９の発現を促進し、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を増加させることにより、軟骨基質の分解を減少させ、それにより間葉系幹細胞由来の軟骨細胞の肥大分化を抑制することができる。

【0029】

２）ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、軟骨細胞の表現型とマトリックスの代謝バランスを維持する上で重要な役割を果たしているため、マーカーとして組織工学における線維性軟骨の出現を防ぐ戦略をより迅速に見つけることができる。本発明は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８をバイオマーカーとして軟骨細胞の肥大を抑制する植物抽出物をスクリーニングする。コーディセピン、クルクミン、キサントトキシン、ジヒドロアルテミシニン及びアントシアニンがＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を促進し、核酸及びたんぱく質レベルで軟骨細胞の肥大マーカー遺伝子の発現を抑制することが見出された。それに対応して、レスベラトロールはＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を抑制し、軟骨細胞の肥大進行を促進する。したがって、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、バイオマーカーとして軟骨細胞の肥大を抑制する植物抽出物をスクリーニングすることができる。ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現の上昇に基づいてスクリーニングされた植物抽出物は、さまざまな分子メカニズムで軟骨細胞の肥大進行を抑制できる。これは、軟骨の表現型と安定状態を維持するための新しい方法を迅速かつ便利に発見するのに役立ち、骨関節炎の治療のための新薬を発見し開発するために使用できる。また、組織工学による軟骨の臨床応用問題を解決するための優れた戦略を見つけるのにも使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

本発明の目的、技術的解決策及び有益な効果をより明確にするために、以下の図面を参照して本発明を説明する。

【図1】図１は、ｑＰＣＲ検証によるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の経時的な変化の結果を示す。ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現は、軟骨分化段階で上昇し、軟骨肥大段階で低下する。

【図2】図２は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の妨害及び過剰発現実験でＬｎｃＲＮＡ－３２５９８が軟骨細胞の肥大を抑制する結果を示す。

【図3】図３は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８がｍｉＲ－１４５ａ－５ｐに競合的に結合する結果を示す。

【図4】図４は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８がｍｉＲ－５０９－５ｐに競合的に直接結合する可能性を示す。

【図5】図５は、ＭｉＲ－５０９－５ｐ がＩｄ１を標的にしてＳｏｘ９の発現を調節する結果を示す。

【図6】図６は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８がｍｉＲ－１４５ａ－５ｐに競合的に結合することにより軟骨細胞の肥大を調節する結果を示す。

【図7】図７は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８がｍｉＲ－５０９－５ｐに競合的に結合することにより軟骨細胞の肥大を調節する結果を示す。

【図8】図８は、植物抽出物がｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の軟骨細胞の発現に影響を与える結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。好ましい実施形態において特定の条件が記載されていない場合、実験方法は、通常、従来の条件に従って、又は試薬製造業者が推奨する条件に従って実行される。

【0032】

実施例１：ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の軟骨内骨形成システムに基づく組織工学による骨の構成
１、骨髄ＭＳＣｓの培養及びＭＳＣ由来の軟骨細胞の肥大分化の誘導モデルの確立
ヒト骨髄ＭＳＣをリンパ球分離溶液で培養し、遠心分離後の軟膜単核細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し（１０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離）、上清を廃棄する。細胞は、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ－Ｌ完全培地に再懸濁してから、細胞密度１×１０^６／ｍＬで培養フラスコに接種し、初代として記録し、３７℃、５％ＣＯ_２の恒温インキュベーターで培養する。３日ごとに液体を交換し、液体を交換した後、倒立顕微鏡で細胞増殖を観察する。細胞は融合に近づくと、０．２５％トリプシンで消化され、１：２から１：３の比率で継代される。基本的な培地処方は次のとおりである：８９％ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、１０％ＦＢＳ、１％二重抗体（１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン／ １００Ｕ／ｍｌペニシリン）。上記の培養された骨髄ＭＳＣｓが約８０％融合したら、ＭＳＣｓ細胞を消化し遠心分離し、軟骨誘導培地に細胞を再懸濁してカウントする。次に、細胞（２．５×１０^５）を１５ｍｌの遠心チューブに滴下し、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞を凝集させた後、遠心チューブを遠心チューブラックに慎重に挿入して３７℃の恒温インキュベーターに入れて培養する。さらに、単層培養のために細胞を細胞培養プレート（６ウェルプレート、８×１０^４ ／ウェル）に均一に接種する。間葉系幹細胞由来の軟骨の分化誘導時間は１４日であり、誘導培地は３日ごとに交換される。間葉系幹細胞由来の軟骨の分化誘導の１４日間後、培地を肥大誘導培地に交換し、１４日間培養を続ける。合計期間は２８日であった。誘導培地を３日ごとに交換する必要がある。軟骨誘導培地の処方は次のとおりである：ＤＭＥＭ高グルコース培地、５％ＦＢＳ、１％二重抗体（１００ ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン／ １００Ｕ／ｍｌペニシリン）、１％ＩＴＳ混合物、４０μｇ／ｍｌプロリン、 １００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０ ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－β３。肥大誘導培地の処方は次のとおりである：ＤＭＥＭ高グルコース培地、５％ＦＢＳ、１％二重抗体（１００ ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン／ １００ Ｕ／ｍｌペニシリン）、１％ＩＴＳ混合物、４０μｇ／ ｍｌプロリン 、１ ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ ｍｌアスコルビン酸、１００ ｎｇ／ＬＴ３。

【0033】

２． ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、軟骨肥大の分化段階で低下する。
ＭＳＣｓを軟骨誘導培地で１４日間処理した後、培地を肥大誘導培地に交換し、さらに１４日間処理した。合計期間は２８日であった。０日目（非誘発群）、１４日目（軟骨群）、２８日目（肥大群）の３つの時点でサンプルを収集する。軟骨細胞の分化及び肥大分化におけるＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現はｑＰＣＲによって検出した。その結果を図１に示す。結果は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８（ＮＣＢＩ配列ＮＲ＿０４５４２０．２に対応）の発現が軟骨分化の段階で上昇し、軟骨肥大の段階で低下することを示す。これは、Ａｒｒａｙｓｔａｒ Ｍｏｕｓｅ ｌｎｃＲＮＡ ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＶ３．０によって検出されたｌｎｃＲＮＡチップの発現プロファイリング結果と一致している。生物情報学の分析と比較を使用すると、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８とｍｉＲ－１４５ａ－５ｐのスコアが最も高いことがわかる。

【0034】

ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の遺伝子配列は、次の通りである。
５’－ＡＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡＡＣＴＡＣＧＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＴＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＧＡＧＴＧＣＴＣＴＴＡＡＣＣＡＣＴＧＡＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＡＣＣＣＣ
ＡＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＧＡＣＣＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＧＡＣＴＧＴＡＡＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＡＡＧＣＡＣＧＴＣＴＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＣＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＣＴＣＧＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＣＴＡＧＣＴＧＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＣＧＡＡＴＧＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）

【0035】

実施例２：軟骨細胞の肥大と軟骨基質の分解を抑制するＬｎｃＲＮＡ－３２５９８

【0036】

軟骨細胞の肥大に対するＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の調節効果を検出するために、レンチウイルスに感染した軟骨前駆細胞をＬｎｃＲＮＡで過剰発現し妨害する（軟骨を１４日間誘導分化したＭＳＣｓ細胞）。ｑＰＣＲによってＬｎｃＲＮＡ－３２５９８に過剰発現され妨害された軟骨前駆細胞株の確立に成功したことを確認した（図２Ａ）。核酸レベルで、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８細胞群を妨害した肥大マーカーＲｕｎｘ２及びＣｏｌ１０ａ１の発現は対照群よりも高く、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を過剰発現したＲｕｎｘ２及びＣｏｌ１０ａ１の発現は対照群よりも低い（図２Ｂ、Ｃ）。ＷＢの結果は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を妨害したＲｕｎｘ２とＣｏｌ１０ａ１の発現が上昇し、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を過剰発現したＲｕｎｘ２とＣｏｌ１０ａ１の発現が低下することを示している（図２Ｄ）。アルシアンブルー染色は細胞外基質の代謝を表しており、結果はＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を妨害した細胞外基質の分解代謝が強く、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を過剰発現した細胞外基質の分解代謝が弱いことを示している（図２Ｅ）。また、Ｃｏｌ１０ａ１の免疫化学的染色により、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を妨害したＣｏｌ１０ａ１の発現は対照群よりも高く、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群を過剰発現したＣｏｌ１０ａ１の発現は対照群よりも低いことを示している（Ｅ）。

【0037】

上記のデータは、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８が軟骨細胞の肥大と軟骨基質の分解を抑制することを示している。

【0038】

実施例３：ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐとｍｉＲ－５０９に競合的に結合して軟骨細胞の肥大を抑制することにより、Ｓｏｘ９の発現を調節する。

【0039】

１、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐ及びｍｉＲ－５０９－５ｐｍを標的にして調節する。

【0040】

ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８に妨害され過剰発現された細胞を形成し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの発現具合をｑＰＣＲによって検出し、その結果を図３に示す。妨害群のｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの発現が対照群よりも高く、過剰発現群のｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの発現が対照群よりも低いことが示された（図３Ａ）。ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８とｍｉＲ－１４５ａ－５ｐとの直接的な標的関係は、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システムによってさらに検証される。野生型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドと変異型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１４５の前駆体又は対照をそれぞれ添加する。結果は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの前駆体と野生型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドをコトランスフェクトされた細胞サンプルで検出された蛍光強度が大幅に減少し、ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１４５の前駆体と変異型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドをコトランスフェクトされた細胞サンプルで検出された蛍光強度が対照群と異ならないことを示している（図３Ｂ）。

【0041】

ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８に妨害され過剰発現された細胞を形成し、ｍｉＲ－５０９－５ｐの発現具合をｑＰＣＲによって検出し、その結果を図４に示す。妨害群のｍｉＲ－５０９－５ｐの発現が対照群よりも高く、過剰発現群のｍｉＲ－５０９－５ｐの発現が対照群よりも低いことが示された（図４Ａ）。野生型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドと変異型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ｍｉＲ－５０９－５ｐの前駆体又は対照をそれぞれ添加する。結果は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの前駆体と野生型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドをコトランスフェクトされた細胞サンプルで検出された蛍光強度が大幅に減少し、ｍｉＲ－５０９－５ｐの前駆体と変異型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドをコトランスフェクトされた細胞サンプルで検出された蛍光強度が対照群と異ならないことを示している（図３Ｂ）。

【0042】

２、ＭｉＲ－５０９－５ｐ はＩｄ１を標的にしてＳｏｘ９の発現を調節する。

【0043】

実験は、ｍｉＲ－５０９－５ｐがＳｏｘ９の発現を抑制することを示しているが、図５に示すように、生物情報学の分析は、ｍｉＲ－５０９－５ｐはＳｏｘ９の発現を直接標的にして調節することができず、Ｉｄ１の発現を直接標的にして調節することを示唆している。

【0044】

図５Ａは、生物情報学の分析であり、ｍｉＲ－５０９－５ｐがＩｄ１の発現を直接標的にして調節することを示唆している。

【0045】

図５ＢはＷＢの結果であり、ｍｉＲ－５０９－５ｐの発現を妨害する時、Ｉｄ１の発現が対照群と比較して上昇し、ｍｉＲ－５０９－５ｐを過剰発現する時、Ｉｄ１の発現が対照群と比較して低下することを示している。これは、ｍｉＲ－５０９－５ｐがＩｄ１の発現を調節できることを示唆している。

【0046】

図５Ｃは、ｍｉＲ－５０９－５ｐの前駆体と変異型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドをコトランスフェクトされた細胞サンプルで検出された蛍光強度であり、蛍光強度の大幅な低下を示している。ｍｉＲ－５０９－５ｐの前駆体と変異型Ｌｎｃ３'－ＵＴＲプラスミドをコトランスフェクトされた細胞サンプルで検出された蛍光強度は対照群と異なっておらず、ｍｉＲ－５０９－５ｐがＩｄ１を直接標的にして調節する可能性を示す。

【0047】

Ｉｄ１はＢＭＰ信号経路の下流分子であり、転写レベルでＳｏｘ９の発現を調節できる。推測を検証するために、細胞はさまざまな成分を含む培地で７日間処理した。実験を次のようにグループ化した：Ａｎｔｉ－ｍｉＲ ＮＣ群、Ａｎｔｉ ｍｉＲ－５０９－５ｐ群、Ｐｒｅ－ｍｉＲ ＮＣ群及びＰｒｅｍｉＲ－５０９－５ｐ群。

【0048】

Ｉｄ１によりＳｏｘ９に対するｍｉＲ－５０９－５ｐの調節関係をさらに検証するために、Ｉｄ１の過剰発現及び対照レンチウイルスを構成し、細胞を感染し、ｍｉＲ－５０９－５ｐ前駆体又は対照を含む培地で上記の細胞株を７日間処理した。実験は次のようにグループ化した：対照群、ｍｉＲ－５０９－５ｐ群、Ｉｄ１群及び共発現群。図５Ｄに示すＷＢの結果は、ｍｉＲ－５０９－５ｐを単独で過剰発現する場合、Ｉｄ１とＳｏｘ９の発現が対照群と比較して低下することを示しており、これは以前の結果と一致している。Ｉｄ１を単独で過剰発現する場合、Ｉｄ１とＳｏｘ９の発現が対照群と比較して上昇し、Ｉｄ１を過剰発現するウイルスが有効であることを示している。さらに、図５Ｄに示した共発現群の結果は、Ｉｄ１がｍｉＲ－５０９－５ｐの過剰発現によって引き起こされるＳｏｘ９の発現の低下に拮抗できることを示している。上記のデータは、ｍｉＲ－５０９－５ｐがＩｄ１を直接標的にしてＳｏｘ９の発現を調節することを示している。

【0049】

３、 ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐ及びｍｉＲ－５０９を介してＳｏｘ９の発現を調節して軟骨細胞の肥大分化を抑制する。

【0050】

軟骨細胞の肥大を調節するＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の核外メカニズムをさらに検証するために、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現及び対照軟骨前駆細胞を構成し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐを含む前駆体又は対照の肥大誘導培地で１４日間処理した。実験は次のようにグループ化した。対照群、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐ群及び共発現群。結果を図６に示す。

【0051】

図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃは、ｑＰＣＲ がｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現を検出した場合、肥大マーカーＲｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０ａ１及びＭｍｐ１３の発現が対照群と比較して低下することを示しており、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現は、Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０ａ１及びＭｍｐ１３発現の上昇を引き起こすことができる。

【0052】

図６Ｄは、たんぱく質レベルで、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現がＳｏｘ９の発現の上昇を引き起こし、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現がＳｏｘ９の発現の低下を引き起こすことを示し、Ｒｕｎｘ２の発現に対する影響は、Ｓｏｘ９のそれと正反対である。

【0053】

図６Ｅは、アルシアンブルー染色及び免疫化学的染色の結果が、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現が細胞外基質の分解を抑制し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現が細胞外基質の分解を促進し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現がｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現によって細胞外基質の分解に対する抑制作用の上昇に拮抗することを示す。免疫化学的染色の結果は、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現がＣｏｌ１０ａ１合成を抑制し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現がＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現によってＣｏｌ１０ａ１合成に対する抑制作用の上昇に拮抗することを示す。

【0054】

要約すると、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐに競合的に結合することにより、Ｓｏｘ９の発現を調節して軟骨細胞の肥大と軟骨基質の分解を抑制する。

【0055】

正常に構築されたＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現及び対照軟骨前駆細胞を、ｍｉＲ－５０９－５ｐ前駆体又は対照を含む肥大誘導培地で１４日間処理した。実験は次のようにグループ化した。対照群、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８群、ｍｉＲ－５０９－５ｐ群及び共発現群。検出方法と指標はｍｉＲ－１４５ａ－５ｐと同じである。

【0056】

図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、ｑＰＣＲ がｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現を検出した場合、肥大マーカーＲｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０ａ１及びＭｍｐ１３の発現が対照群と比較して低下することを示し、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現は、Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０ａ１及びＭｍｐ１３発現の上昇を引き起こすことができる。

【0057】

図７Ｄは、たんぱく質レベルで、ｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の過剰発現がＳｏｘ９の発現の上昇を引き起こし、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐの過剰発現がＳｏｘ９の発現の低下を引き起こすことを示し、Ｒｕｎｘ２の発現に対する影響は、Ｓｏｘ９のそれと正反対である。

【0058】

図７Ｅにおいて、アルシアンブルー染色及び免疫化学的染色の結果は、ｍｉＲ－５０９－５ｐの過剰発現がｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現によって細胞外基質の分解に対する抑制作用の上昇に拮抗することを示す。

【0059】

したがって、ｍｉＲ－１４５ａ－５ｐに加えて、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、ｍｉＲ－５０９－５ｐに競合的に結合することにより、Ｓｏｘ９の発現を調節して軟骨細胞の肥大と軟骨基質の分解を抑制する。

【0060】

実施例４：ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８は、バイオマーカーとして軟骨細胞の肥大分化を抑制する植物抽出物をスクリーニングすることができる。

【0061】

軟骨細胞の肥大分化の体外誘導モデルの確立は上記と同じである。アルシアンブルー又はトルイジンブルー染色では、細胞外基質の代謝を評価する。ｑＰＣＲ法では、軟骨細胞の肥大分化に関連する遺伝子とＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を検出する。実験では、配列番号２及び配列番号３に示すように、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８遺伝子のプライマー配列を検出する必要がある。ＧＡＰＤＨの発現を内部コントロールとして、Ｄｅｌｔａ Ｃｔを使用して遺伝子の相対的な発現量を分析した。ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８遺伝子のプライマー配列は次のとおりである。

【0062】

下流：５’－ＧＧＧＧＡＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＧＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）；
上流：５’－ＧＧＡＧＧＴＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＧＧ－３’（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）。

【0063】

選択した抗炎症性植物抽出物の安全な濃度はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を使用して決定され、軟骨誘導の１４日後のＡＴＤＣ５細胞をさまざまな植物抽出物で７２時間処理し、ＲＮＡを収集し、ｑＰＣＲによって細胞内のＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を検出した。図８に示す結果は、対照群と比較して、コーディセピン（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）、クルクミン（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、キサントトキシン（Ｘａｎｔｈｏｔｏｘｉｎ，ＸＡＴ）、ジヒドロアルテミシニン（Ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ，ＤＨＡ）及びシアニジン（Ｃｙａｎｉｄｉｎ）はｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を促進するが、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）はｌｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を抑制し、軟骨細胞の肥大マーカー遺伝子の発現を核酸及びたんぱく質レベルで抑制することを示す。また、レスベラトロールはＬｎｃＲＮＡ－３２５９８の発現を抑制し、軟骨細胞の肥大分化を促進することができる。上記の結果は、本発明が、ＬｎｃＲＮＡ－３２５９８をバイオマーカーとして軟骨細胞の肥大を抑制する植物抽出物をスクリーニングすることを示している。

【0064】

最後に、説明すべきことは、上記の好ましい実施形態は、本発明の技術的解決策を説明するためにのみ使用され、それを限定するものではないことである。本発明は、上記の好ましい実施形態を通じて詳細に説明してきたが、当業者は、本発明の特許請求の範囲によって定義される範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更を行うことができることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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