特許 7080815 生体分子の溶液を処理するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-27

(45)【発行日】2022-06-06

(54)【発明の名称】生体分子の溶液を処理するための方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/34 20060101AFI20220530BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220530BHJP

   B01D 12/00 20060101ALN20220530BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20220530BHJP

   B01D 61/14 20060101ALN20220530BHJP

【ＦＩ】

C07K1/34

C12M1/00 A

B01D12/00

C12N15/10 100Z

B01D61/14 500

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2018535310

(86)(22)【出願日】2016-12-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-04-25

(86)【国際出願番号】 GB2016053981

(87)【国際公開番号】W WO2017118836

(87)【国際公開日】2017-07-13

【審査請求日】2019-11-19

(31)【優先権主張番号】1600290.9

(32)【優先日】2016-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】508236033

【氏名又は名称】フジフィルム・ダイオシンス・バイオテクノロジーズ ・ユーケイ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】ハイス，チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】ナギー，ティボー

【審査官】山内 達人

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／１６４５１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１３３９７２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開昭５８－１９０４４７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｍ

Ｂ０１Ｄ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

Ｊａｐｉｏ－ＧＰＧ／ＦＸ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体分子を含む液体をインライン液体交換するための装置であって、多重入口流量制御器を含み、少なくとも２つの液体を混合するための２つ以上の可変流量入口弁をさらに含む、混合のための手段を含み、前記可変流量入口弁は、液体が流れることができるままであるかまたは流れが阻止される第１の相対的に低い流量と、少なくとも第２のより高い流量とを達成する位置の間でサイクリングされるように調節され、前記混合のための手段は、シングルパスモードで構成されたタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口をも含む、前記装置。

【請求項2】

前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスからの保持液が、少なくとも２つの液体を混合するための第２の手段と流体連通しており、混合のための前記第２の手段は、シングルパスモードで構成された第２のタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口を含む、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記可変流量入口弁が間欠流量弁である、請求項１または２に記載の装置。

【請求項4】

生体分子を含む液体を液体交換するための装置であって、
ａ）ｉ）可変流量入口弁も含む、生体分子を含む第１の液体培地のための第１の入口、
ｉｉ）可変流量入口弁も含む、第２の液体培地のための少なくとも第２の入口
ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口
を含む多重入口流量制御器、
ｂ）前記流量制御器と前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスとを通した液体の流れを付与するための手段、および
ｃ）前記可変流量入口弁が、液体が流れることができるままであるかまたは流れが阻止される第１の相対的に低い流量と、少なくとも第２のより高い流量とを達成する位置の間でサイクリングされるように、前記可変流量入口弁を通した流れを調節するための手段
を含む、前記装置。

【請求項5】

前記流れを付与するための手段が、前記多重入口流量制御器の前記出口と前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスとの間に配置されたポンプを含む、請求項４に記載の装置。

【請求項6】

前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスの下流にリストリクターをさらに含む、請求項４または５に記載の装置。

【請求項7】

ｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスからの保持液と流体連通した第１の入口、
ｉｉ）第３の液体培地のための第２の入口、および
ｉｉｉ）第２のタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口
を含む第２の多重入口流量制御器をさらに含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の装置。

【請求項8】

前記第２の多重入口流量制御器がリストリクターとして機能する、請求項７に記載の装置。

【請求項9】

前記第２の多重入口流量制御器が２つ以上の可変流量入口弁をさらに含む、請求項７または８に記載の装置。

【請求項10】

生体分子を調製するための方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置を使用する液体交換によって前記生体分子を含む液体培地を処理することを含む、前記方法。

【請求項11】

少なくとも１０サイクルが使用される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

サイクル周波数が１００Ｈｚ未満である、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

サイクル周波数が０．０５～０．５Ｈｚである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記処理することが緩衝液交換を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法を含む、生体分子の産生のためのプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体分子、特に組換えポリペプチドおよび核酸の溶液を処理するための方法、ならびにそのような方法を実施するための装置に関する。

【背景技術】

【0002】

多くの生体分子、特に組換えポリペプチドおよび、プラスミド（ｐＤＮＡ）等の核酸は、特に治療用途において大いに注目されている。そのような生体分子は、一般に、所望の生体分子を発現するように操作された組換え宿主細胞を培養することによって産生される。次いで生体分子は、典型的には遠心分離、濾過およびクロマトグラフィーによる精製を含む方法によって培地から回収される。生体分子の回収は、一般に、その中に生体分子が溶解または懸濁している液体培地の性質および特性の調節を含む。この調節は、生体分子の不純物からの精製、および／または例えば使用までもしくは即使用可能な製剤への最終的な変換まで保存され得る培地中への生体分子の製剤化を容易にし得る。そのような調節は一般に、一般的には緩衝液である液体培地を別のものに置き換えることを含み、体積の変化を伴う場合も伴わない場合もあるが、いずれの場合も生体分子の濃度が変化する可能性がある。

【0003】

従来の液体交換は、生体分子を含む初期培地を、適当な大きさの分子量カットオフを有する多孔質フィルターを備えたタンジェンシャルフロー濾過デバイスに通過させることを含み、カットオフは、生体分子が保持液（retentate）中に保持されるが、その培地の少量成分の一部、例えば緩衝液、溶媒およびカットオフ値未満の分子量の溶質はフィルターを通過して透過液中に出ていくように選択される。保持液は保持タンクに再循環され、保持タンク中で保持液は代替液と混合され、再循環プロセスは生体分子を含む培地が所望の組成になるまで続けられる。そのようなプロセスの不利益な点は、生体分子の製造のスケールが大きくなると、必要な液体の体積が増大し、保存および混合用のタンクのスケールが増大して、装置の大きさおよび／またはコストが実施不可能になるほど増大することである。代替策として、透析を使用することができ、そこでは必要な分子量カットオフを有する多孔質バッグが大量の置換液体培地の中に保存されるが、これは同様の不利益を受ける。

【0004】

従来のプロセスのさらなる不利益は、プロセスが比較的遅く、したがって生体分子の処理が遅くなることである。さらに、プロセスが進行するにつれて生体分子がポンプヘッドを繰り返し通過し、広範な溶質および緩衝液の濃度にわたり剪断力を受けるので、凝集および変性等の生体分子の不安定性および／または不溶性が生じることがある。

【発明の概要】

【0005】

本発明の第１の態様によれば、生体分子を含む液体をインライン液体交換するための装置であって、多重入口流量制御器を含み、少なくとも２つの液体を混合するための２つ以上の可変流量入口弁をさらに含む、混合のための手段を含み、該流量制御器は、シングルパスモードで構成されたタンジェンシャルフロー濾過デバイス（ＴＦＦデバイス）と流体連通した出口をも含む、前記装置が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】本発明による装置の１つの例を図１に例示する。

【図2】本発明による装置の別の例を図２に例示する。

【図3】２つのＴＦＦデバイスを使用する本発明のさらなる例を図３に例示する。

【図4】２つのＴＦＦデバイスを使用する本発明のさらに別の例を図４に例示する。

【発明を実施するための形態】

【0007】

混合のための手段は好ましくはＴＦＦデバイスに直接取り付けられており、即ちその間に中間処理ステージは組み込まれない。
本発明の第１の態様の特定の実施形態では、ＴＦＦデバイスからの保持液は少なくとも２つの液体を混合するための第２の手段と流体連通している。他の実施形態では、多重入口流量制御器の多重入口の１つはＴＦＦデバイスからの保持液と流体連通しており、ＴＦＦデバイスは任意選択で少なくとも２つの液体を混合するための第２の手段からの出口によって供給される。いずれの実施形態も、混合のための第２の手段は混合のための第１の手段とは異なった種類でもよく、同じ種類でもよい。

【0008】

本発明の第１の態様のさらなる実施形態では、混合のための第２の手段は第２のＴＦＦデバイスと流体連通した出口を含む。第２のＴＦＦデバイスは第１のＴＦＦデバイスとは異なった種類でもよいが、多くの実施形態では第１のＴＦＦデバイスと第２のＴＦＦデバイスは同じ種類である。

【0009】

本発明の第１の態様のさらなる実施形態では、第２のＴＦＦデバイスからの保持液は、少なくとも２つの液体を混合するための第３の手段と流体連通している。混合のための第３の手段は、混合のための第１および第２の手段と異なった種類でもよく、それらのいずれかまたは両方と同じでもよい。混合のための第３の手段は第３のＴＦＦデバイスと流体連通した出口を含んでよい。第３のＴＦＦデバイスは第１および第２のＴＦＦデバイスと異なった種類でもよいが、多くの実施形態では第１、第２および第３のＴＦＦデバイスは同じ種類である。

【0010】

任意選択でＴＦＦデバイスと流体連通した出口を有する、少なくとも２つの液体を混合するためのさらなる手段も組み込んでよいことが認識されよう。
多くの実施形態では、使用されるそれぞれのＴＦＦデバイスはシングルパスモードで構成され、保持液は再循環されない。

【0011】

特定の実施形態では、装置には保持液を再循環タンジェンシャルフロー濾過ステップに供するための手段が含まれる。そのような手段には、保持容器（holding vessel）および再循環モードで作動するように構成された個別のＴＦＦデバイスが含まれてよい。いくつかの実施形態では、再循環モードで作動するように構成された個別のＴＦＦデバイスを備えた２つ以上の保持容器が使用される。いくつかの実施形態では、シングルパスモードの代替として、本発明による装置において使用される１つまたは複数のＴＦＦデバイスが再循環タンジェンシャルフロー濾過モードで操作されることを可能にする手段が提供される。そのような再循環タンジェンシャルフロー濾過ステップは、産生される生成物がｃＧＭＰ等の厳しい規制要件の対象となる場合に有利であり得る個別のバッチを画定するために有利であり得る。

【0012】

２つ以上のＴＦＦデバイスを使用する場合には、それぞれのＴＦＦデバイスは好ましくは直列に配置される。
多重入口流量制御器を含む混合のための手段には、好ましくは流量制御器を通る液体の流れを調節する２つ以上の可変流量、好ましくは間欠流量入口弁が含まれる。

【0013】

使用することができる混合のための第２のおよびさらなる手段には、２つのチューブの間の単純な合流を含むインラインミキサーが含まれ、チューブは同じかまたは異なる直径を有してよい。混合のための手段には、バッフルまたはボルテックスミキサーが含まれてもよい。それぞれのチューブには流れを付与するための手段、例えばポンプが取り付けられてもよい。流れを付与するための手段は、少なくとも２つの液体の異なった流量が得られるように、チューブの寸法と組み合わせて操作可能であり得る。多くの実施形態では、混合のための第２のおよび引き続く手段には多重入口流量制御器が含まれ、好ましくは流量制御器を通る液体の流れを調節する２つ以上の可変流量入口弁、好ましくは間欠流量入口弁が含まれる。

【0014】

本発明の第２の態様によれば、生体分子を含む液体を液体交換するための装置であって、
ａ）ｉ）生体分子を含む第１の液体培地のための第１の入口、
ｉｉ）第２の液体培地のための少なくとも第２の入口
ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過デバイス（ＴＦＦデバイス）と流体連通した出口
を含む多重入口流量制御器、および
ｂ）流量制御器とタンジェンシャルフロー濾過デバイスとを通した液体の流れを付与するための手段
を含む装置が提供される。

【0015】

液体の流れを付与するための手段は当技術分野で周知であり、液体にガス、特に窒素またはヘリウム等の不活性ガスの圧力を印加することを含む。好ましくは液体の流れを付与するための手段はポンプである。使用することができるポンプには蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプ、ローブポンプおよび遠心ポンプが含まれる。使い捨ておよび再使用可能のポンプデザインの両方を使用することができる。ポンプを使用する場合には、多くの好ましい実施形態で、ポンプは多重入口流量制御器の出口とＴＦＦデバイスとの間に配置される。同じかまたは異なる流量で作動することができる２つ以上のポンプを使用してもよい。特定の実施形態では、それぞれのポンプによって得られる同じ流量は、ポンプヘッドを物理的に連結して同じ内径のチューブを使用するか、外部制御を通して同じ流量を送達するようにポンプを同期化することによって達成することができる。

【0016】

装置に使用できるＴＦＦデバイスは当技術分野で周知であり（例えばＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、Ｔ．Ｈ．ＭｅｌｔｚｅｒおよびＭ．Ｗ． Ｊｏｒｎｉｔｚ編、１９９８年を参照されたい）、それらには、平板なシート、中空繊維、および環状に曲折したデバイスが含まれる。好ましくは、ＴＦＦデバイスは中空繊維濾過デバイスである。

【0017】

ＴＦＦデバイスは生体分子の性質に適したカットオフを有するように選択され、それにより、生体分子はバリアを通過せず、一方、液体のより小さい成分はバリアを通過して透過液中に出ていくことができる。

【0018】

多重入口流量制御器には、流量制御器を通る液体の流れを調節する２つ以上の可変流量入口弁、好ましくは間欠流量入口弁が含まれる。多重入口流量制御器は少なくとも２つの入口弁を含み、多くの場合に８個まで、例えば３、４、５、６または７個の入口弁を含む。入口弁はそれぞれ同じ寸法を有してもよく、入口弁の１つまたは複数は異なった寸法を有してもよい。特定の好ましい実施形態では、それぞれの入口弁から流量制御器の出口まで測定した体積はそれぞれの入口について同じであり、それぞれの入口弁から流量制御器の出口まで測定した体積と流路長の両方がそれぞれの入口について同じであることが非常に好ましい。

【0019】

本発明で使用される流量制御器はまた、少なくとも１つの出口を含み、２つ以上の出口が存在してもよいが、単一の出口を使用することが好ましい。
可変流量弁は、液体が流れることができるままである第１の相対的に低い流量と、少なくとも第２のより高い流量との間で流れを調節することができる。好ましい実施形態では、可変流量弁は間欠流量弁であり、第１の位置では流れを阻止するが、少なくとも第２の位置では流れを許容する。最も好ましくは、全ての弁が間欠流量弁である。

【0020】

好ましくは、可変流量弁は制御され、最も好ましくはプログラム可能な制御ユニットによって制御されて、多重入口流量制御器を流れるインプット液体の必要な相対量を達成するために、弁の開放と閉止を調節する。これは、好ましくは流量制御器の入口弁を通して所定の時間またはサイクル速度でサイクリングすること、および所望の組成を得るために必要なサイクルタイムの割合に従って弁の開放または閉止を調節することによって、達成される。サイクル速度は一定でも、変化させてもよい。最も好ましくは、間欠流量入口弁が使用され、操作において、任意の所与の時間にただ１つの弁のみが開いているように制御される。多くの実施形態では、多重入口流量制御器のサイクル速度は一定に保たれ、インプット液体の所望の相対量は一貫している。

【0021】

多くの実施形態では、複数のサイクルが使用される。使用されるサイクルの数は、多くの因子、例えば、そのプロセスの継続時間、濃縮される液体の体積、流量、装置の最大作動圧力、ＴＦＦデバイスの長さおよび／または面積、ならびにＴＦＦデバイスの分子量カットオフ等の多くの因子に依存することになる。特定の実施形態では、少なくとも１０サイクル、例えば少なくとも５０、１００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、５０００、７５００、１００００またはより多くのサイクルを使用することができる。

【0022】

様々なサイクル周波数を使用できることが認識されよう。多くの例では、周波数は、１００Ｈｚ未満、典型的には５０Ｈｚ未満、一般には１０Ｈｚ未満、好ましくは５Ｈｚ未満である。特定の好ましい実施形態では、周波数は２Ｈｚ以下、最も好ましくは１Ｈｚ以下、例えば０．０５～０．５Ｈｚである。

【0023】

ＴＦＦデバイスの作動の間、通常、生体分子を含むゲル層がフィルター表面の保持液側に形成される。このゲル層は典型的には操作の最後にフラッシングを含ませることによってＴＦＦデバイスから除去され、そのようなフラッシングステップを本発明のプロセスにおいて使用することができる。操作の最後におけるフラッシングステップは、生体分子の濃度に著しい急上昇をもたらすことがあり、したがって予想より高い生体分子濃度をもたらし得る。本発明の特定の実施形態では、フラッシングステージは、プロセスを通して、間隔を置いて含められる。フラッシングステージは、液体が低圧でＴＦＦデバイスを通過する期間を延長することを含んでもよく、好ましくはフラッシングの継続時間の間、透過液ライン上の弁を閉止すること等によって、すべての流れが保持液へ進むように、透過液の流れを阻止することをさらに含んでもよい。フラッシングステージの継続時間は、しばしば、実質的に全てのゲル層の保持液への移送が達成されるように選択される。操作の最後におけるフラッシングステージは、５ＴＦＦデバイス体積までを通過させることを含み得る。プロセス中に間隔をおいて含められるフラッシングステージは、より少ないＴＦＦデバイス体積、例えば０．２５、０．５、０．７５または１ＴＦＦデバイス体積を通過させることを含み得る。いくつかの実施形態では、フラッシングステージは、１ＴＦＦデバイス体積、２ＴＦＦデバイス体積、５ＴＦＦデバイス体積、１０ＴＦＦデバイス体積またはそれを超える通過のためのサイクリングの操作の後に使用され、その後にサイクリングの操作に戻される。１つまたは複数のフラッシングステージが濃縮プロセスにおいて間隔を置いて組み込まれる多くの実施形態では、フラッシングステージには、好ましくはフラッシングの継続時間の間、透過液ラインの弁を閉止すること等によって透過液の流れを阻止することが伴う。

【0024】

装置は通常、ＴＦＦデバイスの下流に、流れ制限オリフィスまたはピンチ弁等のリストリクターを含む。リストリクターは流れを制限し、それにより液体およびＴＦＦデバイスの分子量カットオフより小さい分子量を有する溶質が膜を通って透過液へ通過するために背圧を生じるように構成されている。好ましくは、リストリクターは本発明の１つの態様によって制御可能であるピンチ弁を含む。特定の実施形態では、リストリクターは好ましくは可変流量弁を含む第２の多重入口流量制御器を含む。いくつかの実施形態では、リストリクターはＴＦＦデバイスへの流量よりも少ない流量で作動し、それにより背圧を発生するように構成されたポンプをＴＦＦデバイスの下流に含む。

【0025】

リストリクターが可変流量弁を含む第２の多重入口流量制御器を含む場合には、好ましくはサイクリングが使用される。使用されるサイクル時間および周波数は、可変流量弁を含む第１の多重入口流量制御器について上に述べた通りであってよい。

【0026】

本発明の第２の態様による装置は任意選択でインラインミキサーを含み、これは弁と濃縮器との間に配置されてもよく、好ましくは弁とポンプとの間に配置される。インラインミキサーの例は当技術分野で周知である。好ましいインラインミキサーは、バフルドミキサーおよびボルテックスミキサー等のスタティックミキサーである。ミキサーの寸法は、好ましくはインプット液体がＴＦＦデバイスに入る前に適切に混合されるように選択される。

【0027】

流量制御器を通して液体を合わせることによって第１の液体中の生体分子の濃度が希釈されることが認識されよう。この希釈の程度は入口を通過する液体の相対的体積によって制御され、これはさらに入口の相対的な寸法ならびに／または入口が高い流量および低い流量に保持される相対的な時間によって制御される。液体の混合によって影響される生体分子の希釈は、合わせた液体のＴＦＦデバイスの通過によって、少なくとも部分的に相殺することができ、完全に相殺してもよく、十二分に相殺してもよい。装置は、保持液としてＴＦＦデバイスを通過する合わせた液体の相対的部分が透過液中に通過する部分よりも多く、またはこれと同じく、またはこれより少なくなるように構成することができる。透過液中に通過する液体の体積と保持液として通過する体積の比が、第２の液体と追加の液体を合わせた体積と生体分子を含む第１の液体の体積の比に等しい場合には、保持液中の生体分子の濃度は、第１の液体中の初期濃度と同じになる。透過液と保持液の体積比を第２の液体および追加の液体の第１の液体との体積比よりも高くなるように増加させると、保持液中の生体分子の濃度は第１の液体中の濃度と比較して増加し、一方、透過液と保持液の体積比を第２の液体および追加の液体の第１の液体との体積比よりも低くなるように減少させると、生体分子の濃度は第１の液体中の濃度と比較して減少することになる。例えば、生体分子を含む第１の液体を、第１の液体と第２の液体の比を１：９として第２の液体で１０倍に希釈し、次いで透過液と保持液の体積比を９：１とすると、生体分子はもとの濃度に戻り、第１の液体の９０％の除去［（１０－１）／１０×１００］が達成される。第２ステップの交換でこのプロセスを繰り返すと、第１の液体の９９％が除去される［９（（１０×１０）－１）］／（１０×１０）×１００］が、もとの生体分子の濃度は保たれる。しかし、濃縮器における透過液と保持液の体積比が１９：１で希釈を１：９のままにすると、第１のステップで第１の液体の除去は同じく９０％で生体分子の濃度は２倍に増加し、第２のステップで第１の液体の除去は同じく９９％で生体分子の濃度は４倍に増加する一方、濃縮器における透過液と保持液の体積比が４：１で希釈を１：９のままにすると、第１のステップで第１の液体の除去は同じく９０％で生体分子の濃度は２分の１に減少し、第２のステップで第１の液体の除去は同じく９９％で生体分子の濃度は４分の１に減少することになる。

【0028】

多くの実施形態で、流量制御器を通る第２の液体およびそれに続く液体の第１の液体との体積比は、対象となる液体の流れを調節する制御可能な間欠流量弁の開放時間を制御することによって制御される。好ましくは、流量制御器の下流に配置されたポンプが流量制御器を通る流量を制御し、出口への弁の流路が同じ体積である場合には、相対的体積は弁の開放時間によって支配される。他の条件が全て同じであれば、他の弁と比較して第１の液体の弁が開いている時間が短くなると、第２の液体および追加の液体への交換が速くなる。

【0029】

特定の実施形態では、好ましくは本発明に従って構成された第２のＴＦＦデバイスが第１のＴＦＦデバイスの下流に配置される。そのような場合の多くでは、第２のＴＦＦデバイスの多重入口流量制御器が第１のＴＦＦデバイスのリストリクターとして働く。好ましくは本発明に従って構成されたさらなるＴＦＦデバイスを第２のＴＦＦデバイスの下流に配置してもよい。本発明に従って構成された第２のまたはさらなるＴＦＦデバイスを使用する場合には、多重入口流量制御器の入口はＴＦＦデバイスの上流からの保持液と流体連通、好ましくは直接連通している。本発明に従って構成された第２のまたはさらなるＴＦＦデバイスについては、対応する第２の液体培地のための入口は第１のＴＦＦデバイスのための液体培地と同じ液体培地のための入口を含んでよく、異なった液体培地のための入口を含んでもよい。

【0030】

本発明による装置は、生体分子の溶液または懸濁液を調整するため、例えば供給流を調整するため、例えば電導度および／またはｐＨの変更、緩衝液の交換、成分溶質の変更、ならびに下流における単位操作の処理時間、例えばクロマトグラフィーの装荷時間を変更し、好ましくは短縮するための、体積の変更のために、使用することができる。ある場合には、本発明による装置はポリペプチドのリフォールディングまたはｐＤＮＡの抽出のために使用することができる。

【0031】

本発明による装置を使用することによって、保持液を再循環させずに液体交換を達成することができる。
本発明において使用される液体は、精製法（例えばクロマトグラフィーカラム、従来のＴＦＦステップ、濾過および清澄化ステップ、遠心分離上清／遠心分離液またはスラリー、コンディショニング／希釈ステップ）からの溶出液、バイオリアクターおよび発酵槽からの産出物、および細胞破壊プロセスからの産出物であってよい。

【0032】

本発明の装置およびプロセスによって生産される液体は、さらなる処理なしに「そのまま」使用することができ、あるいは精製または処理ステップ等の１つまたは複数のさらなる処理ステップ、例えばアフィニティークロマトグラフィー、アニオンおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーステップ；および／またはさらなる濾過、清澄化、コンディショニング、希釈または他の製剤化ステップに供してもよい。

【0033】

本発明による装置は、生体分子、例えばｐＤＮＡ、封入体、特にポリペプチド、特に組換えポリペプチドを含む封入体を含む液体の濃縮のために使用することができる。
ｐＤＮＡは、スーパーコイル、直鎖状および開環状（すなわち、ニックの入ったまたはほどかれた）アイソフォームなどの複数の形態の１つまたは複数であってよい。スーパーコイルｐＤＮＡアイソフォームは、共有結合で閉環した形態を有しており、そのｐＤＮＡは、宿主酵素系の作用により、宿主細胞中で負のスーパーコイルとなっている。開環状アイソフォームでは、ｐＤＮＡ二重鎖のうちの１本の鎖が１つまたは複数の箇所で切断されている。

【0034】

ｐＤＮＡの産生のための方法は当技術分野で周知である。ｐＤＮＡは天然でもよく、人工的、例えば、外来のＤＮＡ挿入物を担持するクローニングベクターでもよい。多くの実施形態では、ｐＤＮＡは、１キロベース～５０キロベースの範囲の大きさである。例えば、発現した干渉ＲＮＡをコードするｐＤＮＡは、典型的には、３キロベース～４キロベースの範囲の大きさである。

【0035】

ポリペプチド、特に組換えポリペプチドは、サイトカイン、成長因子、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様ポリペプチド、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、ケモカイン、受容体、受容体断片、キナーゼ、ホスファターゼ、イソメラーゼ、ヒドロリアーゼ、転写因子および融合ポリペプチドを含む、治療用タンパク質およびペプチドを含む。

【0036】

抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および生物学的活性を有する抗体断片を含み、それらのいずれかの多価の形態および／または多特異的な形態を含む。
天然に存在する抗体は、典型的には４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互に連結された２つの同一の重（Ｈ）鎖および２つの同一の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は可変領域（Ｖ_Ｈ）および定常領域（Ｃ_Ｈ）を含み、Ｃ_Ｈ領域はその天然型において３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、可変領域（Ｖ_Ｌ）および１つのドメインを含む定常領域Ｃ_Ｌを含む。

【0037】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分けることができる。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。

【0038】

発現し得る抗体断片は、インタクトな抗体の一部を含み、前記一部は所望の生物学的活性を有する。抗体断片は、一般に、少なくとも１つの抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｃ_Ｌ、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインを有するＦａｂ断片、（ｉｉ）Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有し、２つのＦａｂ誘導体の間でジスルフィド架橋によって二価の断片を形成することができるＦａｂ’断片等のＦａｂ誘導体、（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインを有するＦｄ断片、（ｉｖ）Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦｄ誘導体等のＦｄ誘導体、（ｖ）抗体の単一のアームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインを有するＦｖ断片、（ｖｉ）Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインが共有結合で連結された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体等の一本鎖抗体分子、（ｖｉｉ）定常領域ドメインを有するかまたは有しない別の可変ドメイン（Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインポリペプチド）に連結された、定常領域ドメインを有しないＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインポリペプチド（例えばＶ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、またはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ）、（ｖｉｉｉ）Ｖ_ＨドメインまたはＶ_Ｌドメインからなる断片および、単離されたＣＤＲ領域等のＶ_ＨドメインまたはＶ_Ｌドメインのいずれかの抗原結合断片等のドメイン抗体断片、（ｉｘ）２つの抗原結合部位を含む、いわゆる「ダイアボディ」、例えば同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、ならびに（ｘ）相補性軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメントを含む、いわゆる直鎖状抗体が含まれる。

【0039】

封入体は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌細胞の細胞質中で形成される、最も一般的にはポリペプチド、特に組換えポリペプチドを含む、不溶性凝集物を含む。
目標の生体分子に加えて、生体分子を含む液体の他の成分は、緩衝塩を含む塩、培地および供給液成分、溶媒、一般的には水、プロピレングリコールおよびソルビトール等のＣ_１－６ポリオール等の共溶媒、イオン性液体、双性イオン界面活性剤（zwittergen）、界面活性剤、イミダゾールまたは他の競合的リガンド結合剤、アミノ酸、尿素等のカオトロピック剤、還元剤、酸化剤、ＰＥＧ化コンジュゲーション反応物（基質、副生成物および活性化剤）、糖、脂質、核酸、代謝産物および小さいポリペプチドを含んでもよい。第１の生体分子を含む液体に混合される液体は目標の生体分子を含まず、多くの実施形態ではタンパク質および核酸を含まない。生体分子を含む液体に混合される液体の成分には一般に、緩衝塩を含む塩、培地および供給成分、溶媒、一般的には水、プロピレングリコールおよびソルビトール等のＣ_１－６ポリオール等の共溶媒、イオン性液体、双性イオン界面活性剤、界面活性剤、イミダゾールまたは他の競合的リガンド結合剤、アミノ酸、尿素等のカオトロピック剤、還元剤、酸化剤および糖が含まれる。

【0040】

本発明による装置の１つの例を図１に例示する。ＴＦＦデバイス１は多重入口可変流量制御器２、スタティックミキサー３、およびポンプ４の下流に配置されており、ポンプ４はＴＦＦデバイス１に供給液を供給する。多重入口可変流量制御器２は生体分子を含む第１の液体５、および第２の液体６のＴＦＦデバイス１への供給を制御する。リストリクター７がＴＦＦデバイス１からの保持液ラインに配置されている。多重入口可変流量制御器２の閉止位置と開放位置との間のそれぞれの間欠流量弁のサイクリングにより、生体分子の希釈が起こる。ＴＦＦデバイス１の通過に際して、ポンプ４およびリストリクター７の作用で起こされる圧力によって、ＴＦＦデバイス１の分子量カットオフ未満の液体の一部が透過液８の中に通過し、それにより保持液９の中の生体分子の濃度が増加する。

【0041】

本発明による装置の別の例を図２に例示する。ＴＦＦデバイス１０はポンプ１１の下流に配置されており、ポンプ１１はＴＦＦデバイス１０に供給液を供給し、多重入口可変流量制御器１２、スタティックミキサー１３、および第２のポンプ１４の上流に配置されている。ＴＦＦデバイス１０の通過に際して、ポンプ１１および多重入口可変流量制御器１２の作用で起こされる圧力によって、ＴＦＦデバイス１０の分子量カットオフ未満の液体の一部が透過液１５の中に通過し、それにより多重入口可変流量制御器１２に入る生体分子の濃度が増加する。多重入口可変流量制御器１２の間欠流量弁が生体分子を含む第１の液体１６、および第２の液体１７の供給を制御する。多重入口可変流量制御器１２の閉止位置と開放位置との間のそれぞれの間欠流量弁のサイクリングは、ＴＦＦデバイス１０からの保持液ライン１８上に配置された第２のポンプ１４の作用を通じて、濃縮された生体分子の希釈を引き起こす。第２のポンプ１４の上流にあるスタティックミキサー１３によって、保持液１８が第２の液体および生体分子の組成に関して均一であることが保証される。

【0042】

２つのＴＦＦデバイスを使用する本発明のさらなる例を図３に例示する。第１のＴＦＦデバイス１９は第１の多重入口可変流量制御器２０、スタティックミキサー２１、およびポンプ２２の下流に配置されており、ポンプ２２は第１のＴＦＦデバイス１９に供給液を供給する。第２の多重入口可変流量制御器２３が第１のＴＦＦデバイス１９からの保持液ラインの下流に配置されている。第１の多重入口可変流量制御器２０は生体分子を含む第１の液体２４、および第２の液体２５のＴＦＦデバイス１９への供給を制御する。多重入口可変流量制御器２０の閉止位置と開放位置との間のそれぞれの間欠流量弁のサイクリングにより、生体分子の希釈が起こる。第１のＴＦＦデバイス１９の通過に際して、ポンプ２２および第２の多重入口可変流量制御器２３の作用で起こされる圧力によって、第１のＴＦＦデバイス１９の分子量カットオフ未満の液体の一部が透過液２６の中に通過し、それにより第２の多重入口可変流量制御器２３に入る生体分子の濃度が増加する。多重入口可変流量制御器２３の第２の間欠流量弁が第１のＴＦＦデバイス１９からの濃縮された生体分子および第３の液体２７の供給を制御する。第２の多重入口可変流量制御器２３の閉止位置と開放位置との間のそれぞれの間欠流量弁のサイクリングは、第２のスタティックミキサー２９と第２の多重入口可変流量制御器２３の出口の両方の下流に配置された第２のポンプ２８の作用を通じて、濃縮された生体分子の希釈を引き起こす。第２のポンプ２８は下流にある第２のＴＦＦデバイス３０に供給液を供給する。リストリクター３１はこの第２のＴＦＦデバイス３０からの保持液ラインに配置されている。第２のＴＦＦデバイス３０の通過に際して、第２のポンプ２８およびリストリクター３１の作用で起こされる圧力によって、ＴＦＦデバイス３０の分子量カットオフ未満の液体の一部が透過液３２の中に通過し、それにより保持液３３の中の生体分子の濃度が増加する。

【0043】

２つのＴＦＦデバイスを使用する本発明のさらに別の例を図４に例示する。第１のＴＦＦデバイス３４は２つの供給ポンプ、３５および３６、ならびにスタティックミキサー３７の下流に配置されており、スタティックミキサー３７は第１のＴＦＦデバイス３４に供給液を供給する。第１のポンプ３５は生体分子を含む第１の液体３８の、また第２のポンプ３６は第２の液体３９の、第１のＴＦＦデバイス３４への供給を制御する。２つのポンプ３５および３６の作用により、生体分子の希釈が起こる。多重入口可変流量制御器４０が第１のＴＦＦデバイス３４からの保持液ラインの下流に配置されている。第１のＴＦＦデバイス３４の通過に際して、ポンプ３５および３６、ならびに多重入口可変流量制御器４０の作用で起こされる圧力によって、第１のＴＦＦデバイス３４の分子量カットオフ未満の液体の一部が透過液４１の中に通過し、それにより多重入口可変流量制御器４０に入る生体分子の濃度が増加する。多重入口可変流量制御器４０の間欠流量弁がＴＦＦデバイス３４からの濃縮された生体分子および第３の液体４２の供給を制御する。第２の多重入口可変流量制御器４０の閉止位置と開放位置との間のそれぞれの間欠流量弁のサイクリングは、第２のスタティックミキサー４４と多重入口可変流量制御器４０の出口の両方の下流に配置された第３のポンプ４３の作用を通じて、濃縮された生体分子の希釈を引き起こす。第３のポンプ４３は下流にある第２のＴＦＦデバイス４５に供給液を供給する。リストリクター４６はこの第２のＴＦＦデバイス４５からの保持液ラインに配置されている。第２のＴＦＦデバイス４５の通過に際して、第２のポンプ４３およびリストリクター４６の作用で起こされる圧力によって、ＴＦＦデバイス４５の分子量カットオフ未満の液体の一部が透過液４７の中に通過し、それにより保持液４８の中の生体分子の濃度が増加する。

【0044】

本出願を、これらに限定されないが、以下の実施例によって説明する。

【実施例】

【0045】

略語
ＤＶ 透析用量
ｍＰＥＳ 変性ポリエチレンスルホン
ｒｈラクトフェリン 組換えヒトラクトフェリン
ＴＦＦ タンジェンシャルフロー濾過
タンパク質モデル：
ｐＨ７．５で５０ｍＭのリン酸ナトリウム中、初期濃度１ｍｇ／ｍＬの精製されたｒｈラクトフェリンを実験研究に使用した。
緩衝液（Ａ）５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０
緩衝液（Ｂ）５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５
緩衝液（Ｃ）５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０％ソルビトール、ｐＨ７．０
緩衝液（Ｄ）５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０％ソルビトール、６％プロパン－１，２－ジオール、ｐＨ７．０
実施例１
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ^ＴＭ ＥｘｐｌｏｒｅｒシステムのＢ１ポンプで２５％勾配のｒｈラクトフェリンを使用し、Ａ１ポンプ（７５％）で１５ｍＬ／分の一定流量で緩衝液（Ａ）を供給することによって、少なくとも４００ｍＬのｐＨ７．５の１ｍｇ／ｍＬのｒｈラクトフェリンのストック液を緩衝液（Ａ）で４倍体積に希釈した。次いで希釈したｒｈラクトフェリンをＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ２弁の位置２を通してダウンフローモードで、表面積３７０ｃｍ^２、長さ６５ｃｍ、１０ｋＤａ ｍＰＥＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ ＭｉｄｉＫｒｏｓ^ＴＭ中空繊維に流した。次に中空繊維の保持液ラインは下流の多重入口可変流量制御器に直接連結した。多重入口可変流量制御器は、内径２ｍｍの孔を有する単一の出口を備える特製の（Ｇｅｍｕ）プラスチック製２弁マニフォールドを含み、マニフォールドを通る液体の流れを制御するＲａｓｐｂｅｒｒｙ Ｐｉミニコンピューターに制御される高速作動ソレノイドアクチュエーターを有している。マニフォールドは弁から出口まで同じ流路体積を有するように構成されている。多重入口可変流量制御器のサイクルタイムを２秒に設定し、保持液制御弁をサイクルの２５％は開いているようにして、ｒｈラクトフェリン溶液の初期開始体積を得るために必要な４倍の体積濃縮係数が得られるようにした。緩衝液（Ｂ）による中空繊維保持液の第２の４倍希釈が可能になるように、第１の弁が閉じているときには多重入口流量制御器の第２の弁の位置がサイクルの７５％は開いているようにした。多重入口可変流量制御器からの出口は長さ１０ｃｍ、直径５ｍｍのスタティックミキサーを通り、その後でＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒの弁Ｖ３、位置２に戻り、電導度、ｐＨおよび２８０ｎｍの吸光度のデータが得られた。ＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒの弁Ｖ４からのＦ８出口ラインを、これも１５ｍＬ／分で運転される第２のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ^ＴＭ ＥｘｐｌｏｒｅｒシステムのＡ１ポンプのＡ１１供給ラインに連結した。次いでこのシステムを、これも位置２にあるＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒカラムの弁Ｖ２を通して、表面積３７０ｃｍ^２、長さ６５ｃｍ、１０ｋＤａ ｍＰＥＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ ＭｉｄｉＫｒｏｓ^ＴＭの第２の中空繊維に連結した。中空繊維の保持液は、第２の内径１０ｍｍの多重入口可変流量制御器に直接供給した。この弁は１０秒のサイクルタイムを使用し、保持液制御弁をサイクルの４％は開いているようにして、ｒｈラクトフェリン溶液の初期開始体積を再び得るために体積濃縮係数を４倍とした。多重入口可変流量制御器からの出口は長さ１０ｃｍ、直径５ｍｍの第２のスタティックミキサーを通り、その後でＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒの弁Ｖ３、位置２に戻り、電導度、ｐＨおよび２８０ｎｍの吸光度のデータが得られた。インラインで緩衝液が交換されたｒｈラクトフェリン溶液を、ＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒの弁Ｖ４の出口ラインＦ８を通して収集した。第１のＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムのデータはインラインシステムを使用する迅速な緩衝液交換が成功したことを実証した一方、第２のＡＫＴＡ^ＴＭ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムの記録は供給液に比較してタンパク質濃度が保たれていたことを示した。

【0046】

インラインで緩衝液が交換されたｒｈラクトフェリンの吸光度、電導度およびｐＨの記録は、４倍希釈および濃縮を２回行なうことによって、緩衝液（Ａ）を緩衝液（Ｂ）と約９５％交換できることを実証している。緩衝液（Ｂ）の電導度は６．９ｍＳ／ｃｍ、ｐＨは７．４７であり、最終の緩衝液交換ラクトフェリンの電導度７．２ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．４３とよく一致している。タンパク質濃度は約４５ｍＡＵに保たれていた。

【0047】

実施例２～８
実施例１の方法を繰り返したが、表１に記載したように条件を変更して、緩衝液の交換を逆にすること、または緩衝液の粘度を変える緩衝液成分（１０％ソルビトールおよび／または６％プロパン－１，２－ジオール）を加えることによる、操作時間および第１と第２の濃縮器の間の異なった濃度／希釈比に対する影響を検討した。実施例２および３では希釈剤として緩衝液（Ａ）を使用し、実施例４では緩衝液（Ｂ）、実施例５、６および７では緩衝液（Ｃ）、実施例８では緩衝液（Ｄ）を使用した。

【0048】

表１に示された結果から、逐次希釈および濃縮によって、従来の再循環バッチＴＦＦシステムに対して３透析用量までに相当する緩衝液交換ができることが分かる。実施例６および７で見られるように、より大きな希釈倍率で操作することによって、より高い緩衝液交換効率が得られる。

【0049】

【表1】

発明の態様
［態様１］生体分子を含む液体をインライン液体交換するための装置であって、多重入口流量制御器を含み、少なくとも２つの液体を混合するための２つ以上の可変流量入口弁をさらに含む、混合のための手段を含み、前記混合のための手段は、シングルパスモードで構成されたタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口をも含む、前記装置。
［態様２］前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスからの保持液が、少なくとも２つの液体を混合するための第２の手段と流体連通しており、混合のための前記第２の手段は、シングルパスモードで構成された第２のタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口を含む、請求項１に記載の装置。
［態様３］前記可変流量入口弁が間欠流量弁である、態様１または２に記載の装置。
［態様４］生体分子を含む液体を液体交換するための装置であって、
ａ）ｉ）生体分子を含む第１の液体培地のための第１の入口、
ｉｉ）第２の液体培地のための少なくとも第２の入口
ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口
を含む多重入口流量制御器、および
ｂ）前記流量制御器と前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスとを通した液体の流れを付与するための手段
を含む、前記装置。
［態様５］前記流れを付与するための手段が、前記多重入口流量制御器の前記出口と前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスとの間に配置されたポンプを含む、態様４に記載の装置。
［態様６］前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスの下流にリストリクターをさらに含む、態様４または５に記載の装置。
［態様７］ｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスからの保持液と流体連通した第１の入口、
ｉｉ）第３の液体培地のための第２の入口、および
ｉｉｉ）第２のタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口
を含む第２の多重入口流量制御器をさらに含む、態様４から６のいずれかに記載の装置。
［態様８］前記第２の多重入口流量制御器がリストリクターとして機能する、態様７に記載の装置。
［態様９］前記第２の多重入口流量制御器が２つ以上の可変流量入口弁をさらに含む、態様７または８に記載の装置。
［態様１０］生体分子を調製するための方法であって、態様１から９のいずれかに記載の装置を使用する液体交換によって前記生体分子を含む液体培地を処理することを含む、前記方法。
［態様１１］前記可変流量入口弁が、液体が流れることができるままであるかまたは流れが阻止される第１の相対的に低い流量と、少なくとも第２のより高い流量とを達成する位置の間でサイクリングされる、態様１０に記載の方法。
［態様１２］少なくとも１０サイクルが使用される、態様１１に記載の方法。
［態様１３］サイクル周波数が１００Ｈｚ未満、好ましくは０．０５～０．５Ｈｚである、態様１１または１２に記載の方法。
［態様１４］前記処理することが緩衝液交換を含む、態様１０から１３のいずれかに記載の方法。
［態様１５］態様１０から１４のいずれかに記載の方法を含む、生体分子の産生のためのプロセス。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】