特許 7082218 ドロキシドパ製造のための酵素法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-30

(45)【発行日】2022-06-07

(54)【発明の名称】ドロキシドパ製造のための酵素法

(51)【国際特許分類】

   C12P 13/22 20060101AFI20220531BHJP

   C07C 229/36 20060101ALI20220531BHJP

   C07C 233/51 20060101ALI20220531BHJP

【ＦＩ】

C12P13/22 Z

C07C229/36

C07C233/51

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2020570937

(86)(22)【出願日】2019-06-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-10-21

(86)【国際出願番号】 EP2019064979

(87)【国際公開番号】W WO2019243087

(87)【国際公開日】2019-12-26

【審査請求日】2021-02-16

(31)【優先権主張番号】18179043.7

(32)【優先日】2018-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】514312790

【氏名又は名称】エッフェ・イ・エッセ － ファッブリカ・イタリアーナ・シンテテイチ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ

【氏名又は名称原語表記】Ｆ．Ｉ．Ｓ． － Ｆａｂｂｒｉｃａ Ｉｔａｌｉａｎａ Ｓｉｎｔｅｔｉｃｉ Ｓ．ｐ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】ステファーノ・フォガル

(72)【発明者】

【氏名】パオロ・スタービレ

(72)【発明者】

【氏名】ピエルルイージ・パドヴァン

(72)【発明者】

【氏名】マッテオ・デ・ポーリ

(72)【発明者】

【氏名】アンジェロ・レステッリ

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特許第２７７８１０３（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０３３５３５７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Journal of Organic Chemistry, 2012, Vol.77,pp.8797-8801

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １３／００

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式(Ｉ)

【化1】

のドロキシドパまたはその塩の製造方法であって、
Ａ) ケトレダクターゼ酵素を利用して、式(II)

【化2】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素またはＣ_１－Ｃ_４直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物を酵素還元して、式(III)

【化3】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は上記と同じ意味を有する；
。〕
の化合物を得て、
Ｂ) 工程ａ)で得た式(III)の化合物を変換して、式(Ｉ)のドロキシドパを得る
工程を含む、方法。

【請求項2】

ケトレダクターゼ酵素がKRED^{(登録商標)} 130である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

式(II)および式(III)の化合物において、Ｒ^３がエチルまたはメチルである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

式(II)および式(III)の化合物において、Ｒ^４がテルブチルカルバメート、ベンジルオキシカルボニル、メチルカルバメートまたはエチルカルバメートである、請求項１～３の何れかに記載の方法。

【請求項5】

式(II)および式(III)の化合物において、Ｒ^３がエチルであり、Ｒ^４がテルブチルカルバメートである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

工程Ｂ)がＲ^１および／またはＲ^２のアセチルから水素への変換の工程を含む、請求項１～５の何れかに記載の方法。

【請求項7】

工程Ｂ)がＲ^３のＣ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基から水素への変換の工程を含む、請求項１～６の何れかに記載の方法。

【請求項8】

工程Ｂ)がＲ^４のアミン保護基から水素への変換の工程を含む、請求項１～７の何れかに記載の方法。

【請求項9】

式(III)

【化4】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２が独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３が水素またはＣ_１－Ｃ_４直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４が水素またはアミン保護基である。〕
の化合物の製造方法であって、ケトレダクターゼ酵素を用いる、式(II)

【化5】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が上記と同じ意味を有する。〕
の化合物を酵素還元する工程を含む、方法。

【請求項10】

式(II)

【化6】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２が独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３が水素またはＣ_１－Ｃ_４直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４が水素またはアミン保護基である。〕
の化合物の、ケトレダクターゼ酵素を使用する、式(III)

【化7】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が上記と同じ意味を有する。〕
の化合物の製造
または式(Ｉ)

【化8】

のドロキシドパまたはその塩の製造における使用。

【請求項11】

ケトレダクターゼ酵素の、式(II)

【化9】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２が独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３が水素またはＣ_１－Ｃ_４直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４が水素またはアミン保護基である。〕
の化合物を酵素還元して、式(III)

【化10】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が上記と同じ意味を有する。〕
の化合物を得る
または式(Ｉ)

【化11】

のドロキシドパまたはその塩を得るための、使用。

【請求項12】

ケトレダクターゼ酵素がKRED^{(登録商標)} 130である、請求項１１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、酵素還元を用いるドロキシドパの製造法に関する。

【背景技術】

【0002】

背景技術
ドロキシドパは化学的に(２Ｓ,３Ｒ)－２－アミノ－３－(３,４－ジヒドロキシフェニル)－３－ヒドロキシプロパン酸として知られ、下式(Ｉ)により構造的に表される。それはまたＬ－ｔｈｒｅｏ－ジヒドロキシフェニルセリン、Ｌ－ｔｈｒｅｏ－ＤＯＰＳ、Ｌ－ＤＯＰＳとしても知られる。ドロキシドパは、経口投与用の１００mg、２００mgおよび３００mg用量のカプセルとしてNorthera^{(登録商標)}として商業的に入手可能である。

【化1】

【0003】

ドロキシドパは経口で活性な合成ノルエピネフリン前駆体であり、最初は１９８９年に日本でパーキンソン病に付随するすくみ足または立ち眩みの経口処置ならびにシャイドレーガー症候群に付随する起立性低血圧、失神または立ち眩みおよび家族性アミロイドポリニューロパチーの処置に対して上市された。

【0004】

２０１１年、本製品は米国で承認申請され、２０１４年にNorthera^{(登録商標)}は、原発性自律神経失調症、ドーパミンベータ－ヒドロキシラーゼ欠損および非糖尿病性自律神経系ニューロパチーが原因の症候性神経原性起立性低血圧を有する成人患者における起立性めまい、意識朦朧または「ブラックアウトしそうな予感」の処置について承認された。

【0005】

ドロキシドパは枯渇したノルエピネフリンを補給し、末梢神経系ニューロンへのノルエピネフリン再取り込みを可能とする。この再取り込みが、続いて、受容体を血管収縮させるように(far)刺激し、症候性神経原性起立性低血圧患者の生理学的改善をもたらす。

【0006】

うつ病などの他の疾患における有効性も示されている。

【0007】

ドロキシドパは、ドーパ脱炭酸酵素により、体中に広範に分布されるノルエピネフリンに直接代謝される合成アミノ酸アナログである。

【0008】

その化学調製は、一般に多工程合成を含む。

【0009】

ドロキシドパは、米国特許３,９２０,７２８(以後ＵＳ’７２８特許と称する)に開示されている。ＵＳ’７２８特許は、(ｉ)３,４－ジベンジルオキシベンズアルデヒドとグリシンの反応、続く酢酸ナトリウム三水和物およびジエチルアミンでの処理によりラセミｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ－３－(３,４－ジベンジルオキシフェニル)－セリンを得て；(ii)工程(ｉ)で得た化合物をカルボベンズオキシクロライドで処理してラセミｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ－３－(３,４－ジベンジルオキシフェニル)－Ｎ－カルボベンズオキシセリンを得て；(iii)工程(ii)で得た化合物をジシクロヘキシルアミンで処理してラセミｔｈｒｅｏ－３－(３,４－ジベンジルオキシフェニル)－Ｎ－カルボベンズオキシセリンジシクロヘキシルアミン塩を得て、これを、酢酸エチル存在下、ＨＣＩガスで処理してラセミｔｈｒｅｏ－３－(３,４－ジベンジルオキシフェニル)－Ｎ－カルボベンズオキシセリンを得て；(iv)工程(iii)で得た化合物を(＋)－エフェドリンで処理してＬ－ｔｈｒｅｏ－３－(３,４－ジベンジルオキシフェニル)－Ｎ－カルボベンズオキシセリンの(＋)－エフェドリン塩を得て；(ｖ)工程(iv)で得た化合物を加水分解してＬ－ｔｈｒｅｏ－３－(３,４－ジベンジルオキシフェニル)－Ｎ－カルボベンズオキシセリンを得て、そして(vi)工程(ｖ)で得た化合物をＰｄ／Ｃで還元して、Ｌ－ｔｈｒｅｏ－３－(３,４－ジベンジルオキシフェニル)－セリンを得る工程を含む、ドロキシドパの製造法も提供する。ＵＳ’７２８特許に開示の方法は、商業的製造のための複雑かつ長い方法である。また、ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ異性体を得るためのキラル分割は、５０％分の望ましくない異性体の喪失をもたらし、これは本方法の全体的収率に影響する。

【0010】

一般に、本合成における１以上の必須工程では、反応の標的部位以外の反応性部位を一時的に保護する必要がある。

【0011】

故に、ドロキシドパの合成は、一般に少なくとも１つの保護および付随する脱保護工程を含む。例えば、カテコール部分、アミン部分および／またはカルボキシル部分は、ドロキシドパの製造に使用する合成経路および反応剤により、保護および続く脱保護を必要とし得る。

【0012】

ドロキシドパへのいくつかの合成および酵素アプローチが文献に記載されている。

【0013】

その大部分は、ｔｈｒｅｏ－ＤＯＰＳのジアステレオマー的に富化された混合物を得るための、簡便に保護された３,４－ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンのカップリングを必要とする。

【0014】

このアプローチは、日本特許出願特開２００７－１９０００９(Ａ)に記載され、グリシンまたはその塩と、３,４－ジヒドロキシベンズアルデヒドのトレオニンアルドラーゼをカップリングさせて、対応するエナンチオー的に富化されたアミノ酸誘導体を形成させることを必要とする。

【0015】

別法が特許出願ＥＰ０１１２６０６Ａ１に記載されており、立体選択的ではなく、ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ混合物を分離するために分別結晶を利用する。

【0016】

保護されたｔｈｒｅｏ－ＤＯＰＳのジアステレオマー的に富化された混合物は、それぞれ、特許ＵＳ４３１９０４０およびＵＳ４４８０１０９に詳述のとおり、ｔｈｒｅｏ－２－(３,４－メチレンジオキシフェニル)－Ｎ－カルボベンジルオキシセリンまたはｔｈｒｅｏ－２－(３,４－ジベンジルオキシ－フェニル)－Ｎ－カルボベンジルオキシセリン、のラセミ混合物の光学的分割により、光学活性Ｄ－およびＬ－ｔｈｒｅｏ－ＤＯＰＳに変換され得る。所望のＬ－エナンチオマーを得るためのこれらラセミ混合物の光学分割後、ドロキシドパを得るために、メチレンジオキシ基またはベンジル基をカテコール部分から除去しなければならず、カルボベンジルオキシ(Ｃｂｚ)基をアミン基から除去しなければならない。

【0017】

米国特許４５６２２６３は、Ｌ－Ｎ－フタロイル－３－(３,４－メチレンジオキシフェニル)セリンを得るために、ストリキニン、シンコニジン、Ｌ－ノルエフェドリン、Ｓ－２－アミノ－１,１－ジフェニル－ｌ－プロパノールおよびＬ－３－ヒドロキシ－３－(４－ニトロフェニル)－２－アミノ－ｌ－プロパノールから選択される光学活性アミンを使用して、Ｎ－フタロイル－３－(３,４－メチレンジオキシフェニル)セリンを光学分割し、得られた化合物とルイス酸を反応させてＮ－フタロイル－３－(３,４－ジヒドロキシフェニル)－セリンを形成させ；次いで、これをヒドラジンを用いるフタロイル基の除去により脱保護して、Ｌ－ｔｈｒｅｏ－３－(３,４－ジヒドロキシフェニル)－セリンを得ることを含むドロキシドパの製造を記載する。この方法は、異性体分離のための錯化剤(complex agent)の使用を含み、また所望の異性体が＜５０％となる。また、フタロイル基の脱保護に使用されるヒドラジンは遺伝毒性であることが知られ、よって、最終生成物から微量のヒドラジンを除去することが必要である。

【0018】

特許出願ＥＰ２０１０３９Ａ１に記載の別アプローチによると、ｔｈｒｅｏ－２－(３,４－ジベンジルオキシ－フェニル)－Ｎ－アセチルセリンのラセミ混合物を、Ｌ－アミノアシラーゼ処理によりＬ－ｔｈｒｅｏ－２－(３,４－ジベンジルオキシ－フェニル)－セリンに変換できる。

【0019】

上記合成経路の全てと関連する欠点は、エナンチオマー的に純粋な最終生成物の到達可能な最大収率を５０％とする、エナンチオ選択的酵素または光学活性アミンを使用するラセミ出発物質の変換である。

【0020】

分割剤の使用は方法を高価なものとする。分割剤の一部リサイクルは実行可能ではあるが、このようなリサイクルは、付加的工程を必要とするため高価であり、廃棄物発生とも関連する。望ましくないエナンチオマーはリサイクルできず、廃棄される。

【0021】

この収率は、高キラル純度(＞９５％エナンチオマー過剰)の必要性によりさらに低下し得る。

【0022】

ドロキシドパの立体選択的製造のための別法は特許出願ＥＰ３７５５５４Ａ１に記載されている。これによると、２箇所の立体中心が野依型の動的速度論的分割を伴う不斉水素化(ＡＨ－ＤＫＲ)と同時に導入される。

【0023】

本工程は、不斉水素化に用いられる最も安価な遷移金属(ルテニウム)およびキラルホスフィン(Ｂｉｎａｐ)により触媒されるため、特に興味深い。

【0024】

しかしながら、１００バールの水素圧は通常の工業用容器の範囲外であり；報告される反応時間(ほぼ１週間)は非実際的であり；最良の溶媒は(環境的懸念のため避けるべきである)ジクロロメタンであり；そしてメチレンジオキシ部分の脱保護は大過剰のＡＩＣｌ_３またはＡｌＢｒ_３を必要とするため、提案される条件は、ドロキシドパの工業的製造に好都合に適するものではない。

【0025】

これら先行文献法は、それ故に、遺伝毒性剤の使用による反応工程の実現不可能性および所望の異性体を低収率で提供する、方法の複雑かつ長い性質により、商業的製造には不利である。

【0026】

故に、効率的かつより特異的方法で所望のＬ－ｔｈｒｅｏ異性体を提供する、良好な合成経路の開発が、明らかに必要とされる。

【0027】

故に、所望のＬ－ｔｈｒｅｏ異性体を得るためにキラル分割を含む合成過程を回避し、それにより、本発明の方法を単純で、効率的で、費用効果が高くかつ産業的に実行可能な方法とする、ドロキシドパの製造を開発する必要性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0028】

発明の概要
本発明が取り組む課題は、それ故に、エナンチオ選択的方法を介する、式(Ｉ)により表される化合物であるドロキシドパのＬ－ｔｈｒｅｏ異性体の製造のためのより良い方法の提供である。

【課題を解決するための手段】

【0029】

この課題は、添付する特許請求の範囲に示すドロキシドパの製造法により解決され、その定義は、本記載の必須部分である。

【0030】

特に、本発明は、式(II)

【化2】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素、アセチルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物の酵素還元を用いる活性成分ドロキシドパの製造法を提供する。

【0031】

好ましくは、該酵素還元は、KRED^{(登録商標)} 130なる名称のケトレダクターゼ酵素により実施される。

【0032】

さらなる態様において、本発明は、式(II)の化合物の酵素還元のためのケトレダクターゼの使用を提供する。

【0033】

本発明の目的は、危険な反応剤の使用を回避し、医薬使用に適切な純度で所望の化合物を提供する、高い収率および立体制御レベルにより特徴付けられる、ドロキシドパまたはその合成に有用な中間体を製造する化学酵素方法の提供である。

【0034】

実施態様の記載
本発明の目的は、式(Ｉ)

【化3】

のドロキシドパまたはその塩の製造方法であって、
Ａ) ケトレダクターゼ酵素を利用して、式(II)

【化4】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素またはＣ_１－Ｃ_４直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物を酵素還元して、式(III)

【化5】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は上記と同じ意味を有する。〕
の化合物を得て、
Ｂ) 工程ａ)で得た式(III)の化合物を変換して、式(Ｉ)のドロキシドパを得る
工程を含む、方法である。

【0035】

本発明によると、本方法は、式(Ｉ)

【化6】

のＬ－ｔｈｒｅｏ－３,４－ジヒドロキシフェニルセリンを提供する。

【0036】

式(Ｉ)の化合物は、２つのステレオジェン炭素、すなわち、ヒドロキシル基に結合したＣおよびアミノ基に結合したＣで、それぞれＲおよびＳの配置を有する。従って、(２Ｓ,３Ｒ)－３－(３,４－ジヒドロキシフェニル)－２－アミノ－３－ヒドロキシプロパン酸なる名称である。

【0037】

式(II)および(III)の化合物の別の実施態様において、Ｒ^１およびＲ^２は独立してメチル、ベンジルまたは一体となって環を形成するＣ_１－Ｃ_４アルキル基であり得る。

【0038】

好ましい実施態様において、式(II)および(III)の化合物において、Ｒ^３はエチルまたはメチルである。より好ましいＲ^３はエチルである。

【0039】

故に、直鎖または分枝鎖Ｃ_１－Ｃ_４アルキルの定義は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルも含む。

【0040】

Ｒ^４は、水素または、ベンジル、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、フェニルスルホニル、トリルスルホニル、メチルスルホニル、(ＣＯ)ＯＲ^５または(ＣＯ)Ｒ^５からなる群から選択されるアミン保護基であってよく、ここで、Ｒ^５はＣ_１－Ｃ_５直鎖または分枝鎖アルキルであるかまたはＲ^５はアリール－Ｃ_０－４アルキルまたはＣ_０－４アルキル－(非置換または置換アリール)である。

【0041】

Ｒ^５の直鎖または分枝鎖Ｃ_１－５アルキル基は、非置換であるかまたはヒドロキシルおよびＣ_１－５アルコキシから選択される１個、２個または３個の置換基で置換もされ得る。

【0042】

故に、直鎖または分枝鎖Ｃ_１－Ｃ_５アルキルの定義は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ネオペンチル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、１,１－ジメチルプロピル、１,２－ジメチルプロピル、２,２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピルを含む。

【0043】

好ましいＲ^４基は、ピバロイル、ｔ－ブチルオキシカルボニル(同義：ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、Ｂｏｃ、テルブチルカルバメート)、メチルカルバメート、エチルカルバメートまたはベンジルオキシカルボニル(ＺまたはＣｂｚ)である。より好ましいＲ^４基は、テルブチルカルバメート、メチルカルバメート、エチルカルバメートまたはベンジルオキシカルボニル(ＺまたはＣｂｚ)である。

【0044】

好ましい実施態様によると、式(II)および(III)の化合物において、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はテルブチルカルバメートである。

【0045】

ケトレダクターゼ酵素(略ＫＲＥＤ)により、ケト基の酵素還元と、側炭素の立体中心の同時の産生が実施できることが、実際驚くべきことに判明した。

【0046】

本酵素はさらにエナンチオ選択的還元であり、実際および驚くべきことに、アミノ基に結合する隣接炭素のエナンチオ選択を誘導する。

【0047】

本発明のある実施態様において、式(II)の化合物は、還元酵素、好ましくはケトレダクターゼ(ＫＲＥＤ)またはカルボニルレダクターゼなどのキラル還元剤を使用して、好ましくは式(III)の化合物に還元される。好ましくは、キラル還元剤はＫＲＥＤ酵素である。

【0048】

EC 1.1.1.184に属するＫＲＥＤ酵素は、対応するプロステレオメリ(pro-stereoisomeri)ケトン基質からのおよび対応するラセミケトン基質の立体特異的還元による光学活性アルコールの合成に有用である。

【0049】

ＫＲＥＤ酵素は、一般にケトン基質を対応するアルコール生成物に変換するが、逆反応である、アルコール基質の対応するケトン生成物への酸化も触媒し得る。ＫＲＥＤなどの酵素によるケトンの還元およびアルコールの酸化は、一般に補因子を必要とする。

【0050】

一般に、還元工程は、ケト還元のための補因子および所望により補因子再生系の存在下、式(II)の化合物とケトレダクターゼ酵素の存在下、実施される。

【0051】

ケトレダクターゼ酵素は、例えば、Codexis, Inc(USA)から商業的に入手可能である。

【0052】

ＫＲＥＤは、広範囲の細菌および酵母に見ることができ、レビューのために、Kraus and Waldman, Enzyme' catalysis in organic synthesis, Vols. 1 and 2.VCH Weinheim 1995; Faber, K., Biotransformations in organic chemistry, 4th Ed. Springer, Berlin Heidelberg New York. 2000; Hummel and Kuia, 1989, Eur. J. Biochem. 184: 1-13. Several KRED gene and enzyme sequences have been reported, e.g., Candida magnoliae (Genbank Ace. No. JC7338; GL 1 1360538) Candida parapsilosis (Genbank Ace. No. BAA24528. l; GI:2815409), Sporobolomyces salmonicolor (Genbank Ace. No. AF160799;GL653973)。

【0053】

ＫＲＥＤは野生型またはバリアント酵素であり得る。野生型およびバリアントＫＲＥＤ酵素の配列は、引用により本明細書に包含させるＷＯ２００５／０１７１３５に提供される。ＫＲＥＤ酵素は商業的に入手可能であり、例えば、Codexisから提供される。これらの例は、KRED-101、KRED-119、KRED-130、KRED-NADH-101、KRED.NAbff:.110、KRED-Pl-A04、KRED-Pl-B02、KRED-Pl-BOS、KRED-Pl-B05、KRED-Pl-B10、KRED-Pl-B12、KRED-Pl-COl、KRED-Pl-H08、KRED-Pl-HlO、KRED-P2-B02、KRED-P2-C02、KRED-P2-Cl 1、KRED-P2-D03、KRED-P2-Dl 1、KRED-P2-D12、KRED-P2-G03、KRED-P2-H07、KRED-P3-B03、KRED-P3-G09、KRED-P3-H12およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。最も好ましくは、酵素はKRED 130である。

【0054】

ある好ましい実施態様において、ＫＲＥＤはKRED^{(登録商標)} 130である。

【0055】

好ましい実施態様によると、本発明の酵素還元は、ケトレダクターゼKRED^{(登録商標)} 130により実施され、式(II)の化合物において、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はテルブチルカルバメートである。

【0056】

好ましくは、ケトレダクターゼは単離される。ケトレダクターゼは、哺乳動物、糸状菌、酵母および細菌などのあらゆる宿主から分離され得る。ＮＡＤＨ依存性ケトレダクターゼの単離、精製および特徴づけは、例えば、Kosjek et al., Purification and Characterization of a Chemotolerant Alcohol Dehydrogenase Applicable to Coupled Redox Reactions,. Biotechnology and Bioengineering, 86:55-62 (2004)に記載される。

【0057】

好ましくは、ケトレダクターゼは合成される。ケトレダクターゼは化学合成または組み換え手段を使用して合成され得る。ケトレダクターゼの化学的および組み換え産生は、例えば、ＥＰ０９１８０９０(Ａ２)に記載される。好ましくは、ケトレダクターゼは、大腸菌(Escherichia coli)における組み換え手段を使用して合成される。好ましくは、ケトレダクターゼは精製され、好ましくは約９０％以上の純度、より好ましくは約９５％以上の純度を有する。好ましくは、ケトレダクターゼは、実質的に無細胞である。

【0058】

ここで使用する用語「補因子」は、ケトレダクターゼ酵素と組み合わせて作動する非タンパク質化合物をいう。ケトレダクターゼ酵素との使用に適する補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート(ＮＡＤＰ＋)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート(ＮＡＤＰＨ)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ＋)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤＨ)を含むが、これらに限定されない。一般に、補因子の還元形態を、反応混合物に加える。

【0059】

ＫＲＥＤ酵素は、しばしば、リン酸化されたまたはリン酸化されていない補因子を使用し得る。

【0060】

ＫＲＥＤ酵素は、種々のケト化合物のキラルアルコール生成物への変換のための化学的方法の代わりに使用され得る。これらの生体触媒変換は、生体触媒ケトン還元のためにケトレダクターゼを発現する細胞全体または、特に細胞全体における複数のケトレダクターゼの存在が、エナンチオマー純度および所望の生成物の収率に悪影響を及ぼす場合、精製酵素を用いることができる。インビトロ適用のために、グルコースデヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ)およびギ酸デヒドロゲナーゼなどの補因子(ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ)再生酵素が、一般にケトレダクターゼと共に使用される。

【0061】

有用な化学的化合物の製造のための生体触媒過程における天然に存在するまたは改変ＫＲＥＤ酵素の使用を説明する例は、４－クロロアセトアセテートエステルの不斉還元(Zhou, J. Am. Chem. Soc. 1983 105:5925-5926; Santaniello, J. Chem. Res. (S) 1984:132-133; 米国特許５,５５９,０３０；米国特許５,７００,６７０および米国特許５,８９１,６８５)、ジオキソカルボン酸の還元(例えば、米国特許６,３９９,３３９)、ｔｅｒｔ－ブチル(Ｓ)－クロロ－５－ヒドロキシ－３－オキソヘキサノエートの還元(例えば、米国特許６,６４５,７４６およびＷＯ０１／４０４５０)、ピロロトリアジンベースの化合物の還元(例えば、米国出願２００６／０２８６６４６)；置換アセトフェノンの還元(例えば、米国特許６,８００,４７７)；およびケトチオランの還元(ＷＯ２００５／０５４４９１)を含む。

【0062】

数種のＫＲＥＤ遺伝子および酵素配列が報告されており、カンジダ・マグノリアエ(Candida magnoliae)(Genbank Ace. No. JC7338; GI: 11360538)；カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)(Genbank Ace. No. BAA24528.1; Gl:2815409)、 スポロボロミセス・サルモニカラー(Sporobolomyces salmonicolor)(Genbank Ace. No. AF160799; Gl:6539734); ラクトバチルス・ケフィア(Lactobacillus kefir)(Genbank Ace. No. AAP94029.1; GI: 33112056); ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(Genbank Ace. No. 1NXQ_A; GI: 30749782); イグジォバクテリウム・アセチリカム(Exiguobacterium acetylicum)(Genbank Ace. No. BAD32703.1)およびサーモアナエロバクター・ブロッキイ(Thermoanaerobium brockii)(Genbank Ace. No. P14941; GI: 1771790)を含む。

【0063】

化合物(II)から化合物(III)へのＫＲＥＤ触媒還元は、電子ドナーが溶液に存在することを必要とする。一般に、補因子がＫＲＥＤ還元反応で電子ドナーとして使用される。補因子は、本方法でＫＲＥＤおよび／またはグルコースデヒドロゲナーゼ(略ＧＤＨ)と組み合わせて作動される。適当な補因子は、ＮＡＤＰ＋(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート)、ＮＡＤＰＨ(ＮＡＤＰ＋の還元形態)、ＮＡＤ＋(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)およびＮＡＤＨ(ＮＡＤ＋の還元形態)を含むが、これらに限定されない。一般に、還元形態の補因子が反応混合物に加えられる。従って、ＮＡＤＰＨ補因子またはＮＡＤＨ補因子から選択される電子ドナーが存在する、本発明の方法が実施される。ある実施態様において、反応条件が、約０.０３～０.５ｇ／Ｌ、約０.０５～０.３ｇ／Ｌ、約０.１～０.２ｇ／Ｌ、約０.５ｇ／Ｌ、約０.１ｇ／Ｌまたは約０.２ｇ／ＬのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ補因子濃度を含む、方法が実施され得る。

【0064】

本方法のある実施態様において、補因子リサイクル系を、反応において産生されたＮＡＤＰ＋／ＮＡＤ＋から(form)補因子ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨの再生のために使用する。補因子リサイクル系は、酸化形態の補因子を還元し(例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ)、それによりＫＲＥＤ触媒の継続を可能とする一組の反応剤をいう。

【0065】

補因子リサイクル系は、第二の基質および、還元剤による酸化形態の補因子の還元を触媒する触媒、例えば、基質グルコースおよび酵素ＧＤＨをさらに含み得る。

【0066】

ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子リサイクル系は当分野で知られ、ここに記載する方法において使用され得る。用い得る適当な補因子リサイクル系の例は、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ)、ギ酸およびギ酸デヒドロゲナーゼ(ＦＤＨ)、グルコース－６－ホスフェートおよびグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、二級アルコールおよび第二アラルコールデヒドロゲナーゼ、亜リン酸および亜リン酸デヒドロゲナーゼ、分子水素およびヒドロゲナーゼなどを含むが、これらに限定されない。

【0067】

適当な二級アルコールは、低級二級アルコールおよびアリール－アルキルカルビノールを含む。低級二級アルコールの例は、イソプロパノール、２－ブタノール、３－メチル－２－ブタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、３,３－ジメチル－２－ブタノールなどを含む。特に好ましい実施態様において、二級アルコールはイソプロピルアルコール(ＩＰＡ)である。適当なアリール－アルキルカルビノールは非置換および置換１－アリールエタノールを含む。

【0068】

これらの系は、補因子としてＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨと組み合わせて使用し得る。

【0069】

ヒドロゲナーゼを使用する電気化学的再生も、補因子再生系として使用し得る。例えば、米国特許５,５３８,８６７および６,４９５,０２３参照(両者とも引用により本明細書に包含させる)。

【0070】

金属触媒および還元剤(例えば、分子水素またはギ酸)を含む化学的補因子再生系も、補因子としてＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨと組み合わせて使用し得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０００／０５３７３１参照(引用により本明細書に包含させる)。

【0071】

本発明のある実施態様において、補因子リサイクル系は、それぞれＤ－グルコース(デキストロース)およびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からグルコン酸およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変換を触媒するＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存的酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ)を含み得る。ここに記載する方法を実施に際する使用に適するＧＤＨ酵素は、天然に存在するＧＤＨおよび天然に存在しないＧＤＨの両者を含む。天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は文献に報告され、例えば、Bacillus subtilis 61297 GDH遺伝子、B. cereus ATCC 14579およびB. megateriumである。天然に存在しないＧＤＨは、例えば、変異誘発、指向性進化法などを使用して産生され、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０１８５７９およびＵＳ公開２００５／００９５６１９および２００５／０１５３４１７に提供される。

【0072】

ある実施態様において、補因子リサイクル系は、それぞれギ酸およびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変換を触媒するＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存的酵素である、ギ酸デヒドロゲナーゼ(ＦＤＨ)を含み得る。

【0073】

ここで使用する用語「ギ酸」は、ギ酸アニオン(ＨＣＯＯ－)、ギ酸(ＨＣＯＯＨ)およびこれらの混合物をいう。

【0074】

ここに記載するＫＲＥＤ触媒反応で補因子再生系として使用するのに適するＦＤＨは、天然に存在するおよび天然に存在しないギ酸デヒドロゲナーゼを含む。適当なギ酸デヒドロゲナーゼはＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０１８５７９に記載される。

【0075】

ギ酸は、塩、一般にアルカリまたはアンモニウム塩(例えば、ＨＣＯ_２Ｎａ、ＫＨＣＯ_２、ＮＨ_４ＨＣＯ_２など)の形態で、ギ酸、一般に水性ギ酸の形態でまたはこれらの混合物で提供され得る。塩基または緩衝液を使用して、所望のｐＨを提供し得る。

【0076】

ある実施態様において、補因子再生系は、化合物(II)から化合物(III)への還元を触媒するのと同じＫＲＥＤ酵素を含み得る。このような実施態様において、化合物(II)から化合物(III)への還元をを触媒する同じＫＲＥＤは、二級アルコールの酸化(例えば、イソプロパノールからアセトン酸化)も触媒し、それ故に、同時にＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに還元する。従って、ある実施態様において、化合物(II)から化合物(III)へのＫＲＥＤ触媒変換は、二級アルコール(例えば、ＩＰＡ)の存在下、何らＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ補因子リサイクルのためのコエンザイム(例えば、ＧＤＨ)を用いず、溶液中で実施され得る。このような実施態様において、適当な反応条件は、ＩＰＡ濃度約５５～７５％(ｖ／ｖ)、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ補因子負荷約０.０３～０.５ｇ／Ｌを含み、ここで、ＫＲＥＤ自体以外の補因子リサイクル酵素は存在しない。

【0077】

ある実施態様において、補因子リサイクル系およびＮＡＤＰＨ補因子に結合したＫＲＥＤ酵素を、化合物(III)を得るための(II)の還元に使用する。(II)から化合物(III)へのＫＲＥＤ触媒還元のための適当な反応条件は下におよび実施例に提供される。

【0078】

酵素還元工程は水性溶媒中で実施される。

【0079】

酵素還元工程は、好ましくは水性溶媒および共溶媒中で実施される。

【0080】

共溶媒は、水溶解度が低い化合物の溶解度の増強を助け、それにより、反応の全体的速度を増加させる。適当な共溶媒は、有機溶媒、例えばメタノール、ＩＰＡ、１－オクタノール、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル、ヘプタン、オクタン、メチルｔ－ブチルエーテル(ＭＴＢＥ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、２－メチルテトラヒドロフラン(Ｍｅ－ＴＨＦ)、トルエンなど(これらの混合物を含む)およびイオン性液体、例えば１－エチル－４－メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートなどを含む。

【0081】

ある実施態様において、水および水性共溶媒系を含む水性溶媒が使用され得る。

【0082】

共溶媒系の水対有機溶媒比は、一般に約９０：１０～約９５：０５(ｖ／ｖ)水対有機溶媒の範囲である。好ましくは、溶媒は反応溶液の総体積の５％を超えない。

【0083】

水性溶媒(水または水性共溶媒系)は、ｐＨが緩衝化されていても、緩衝されていなくてもよい。一般に、還元は約１０以下、通常約５～約１０の範囲のｐＨで実施され得る。ある実施態様において、還元は約９以下、通常約５～約９の範囲のｐＨで実施される。ある実施態様において、還元は約８以下、しばしば、約５～約８の範囲および通常約６～約８の範囲のｐＨで実施される。還元は約７.８以下または７.５以下のｐＨでも実施され得る。好ましい実施態様において、還元は中性ｐＨ、すなわち約７で実施される。

【0084】

還元反応中、反応混合物のｐＨは変わり得る。反応混合物のｐＨは、反応中、酸または塩基を加えることにより、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲に維持し得る。あるいは、ｐＨを、緩衝剤を含む水性溶媒の使用により制御し得る。

【0085】

所望のｐＨ範囲に維持するための適当な緩衝液は当分野で知られ、例えば、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液などを含む。緩衝剤と酸または塩基付加の組み合わせも使用し得る。

【0086】

好ましい実施態様によると、本発明の方法は、リン酸緩衝液存在下、ｐＨ７で実施され得る。

【0087】

上記反応の実施に使用し得る他の緩衝液は、例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩緩衝液などである。

【0088】

中和のための適当な塩基は、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなどおよび無機塩基；例えば、水酸化物塩(例えば、ＮａＯＨ)、重炭酸塩(例えばＮａＨＣＯ_３)、炭酸塩(例えばＫ_２ＣＯ_３)、塩基性リン酸塩(例えばＫ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４)などである。

【0089】

ｐＨ維持のために反応中に加えるのに適当な酸は、有機酸、例えばカルボン酸、スルホン酸、リン酸など、鉱酸、例えばハロゲン化水素酸(例えば塩酸)、硫酸、リン酸など、酸性塩、例えばリン酸二水素塩(例えば、ＫＨ_２ＰＯ_４)、重硫酸塩(例えば、ＮａＨＳＯ_４)などを含む。ある実施態様はギ酸を使用し、ギ酸濃度および溶液のｐＨ両者が維持される。

【0090】

還元工程は、一般に約０℃～約７５℃の温度範囲で実施される。好ましくは、還元工程は、約１０℃～約５５℃の温度範囲で実施される。さらに他の実施態様において、約２０℃～約４５℃の温度範囲で実施される。特に好ましい実施態様において、反応は周囲条件下または室温で実施される。

【0091】

本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^１および／またはＲ^２のアセチルから水素への変換の工程ｂ－１)を含み得る。

【0092】

別の実施態様において、本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^１およびＲ^２のメチルまたはベンジルまたは一体となって環を形成するＣ_１－Ｃ_４アルキル基から水素への変換を含む工程ｂ－１)を含み得る。

【0093】

本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^１のアセチル、メチル、ベンジル、一体となって環を形成するＣ_１－Ｃ_４アルキル基から水素への変換、
すなわち式(IV)

【化7】

の化合物を得るための、工程ｂ－１ａ)を含んでよい。

【0094】

本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^２のアセチル、メチル、ベンジル、一体となって環を形成するＣ_１－Ｃ_４アルキル基から水素への変換、
すなわち式(Ｖ)

【化8】

の化合物を得るための、工程ｂ－１ｂ)を含んでよい。

【0095】

本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^１およびＲ^２のアセチル、メチル、ベンジル、一体となって環を形成するＣ_１－Ｃ_４アルキル基から水素への変換、
すなわち式(VI)

【化9】

の化合物を得るための、工程ｂ－１)を含んでよい。

【0096】

本発明の工程ｂ－１)は、Ｒ^１およびＲ^２がアセチルであるとき、エステル基の加水分解の工程であり得る。

【0097】

本発明の工程ｂ－１)は、Ｒ^１およびＲ^２の水素への変換の工程であってよく、Ｒ^１およびＲ^２の性質によって、当業者の技術常識を使用して、種々に実施でき、その根拠は、表題“Protective Groups in Organic Synthesis” (3rt edition 1999)なるTheodora W Greeneの教科書または表題“Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Activating Agents and Protecting Groups”なるAnthony J. Pearsonの教科書に見ることができる。

【0098】

本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^３のＣ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基から水素への変換、すなわち式(VII)

【化10】

の化合物を得るための、工程ｂ－２)を含んでよい。

【0099】

本発明の工程ｂ－２)は、Ｒ^３から水素への変換(すなわちエステル基の加水分解)の工程であってよい、Ｒ^３の性質によって、当業者の技術常識を使用して、種々に実施でき、その証拠は、“Protective Groups in Organic Synthesis”なる表題のTheodora W Greeneの教科書または表題“Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Activating Agents and Protecting Groups”なるAnthony J. Pearsonの教科書に見ることができる。

【0100】

Ｒ^３除去(すなわちＲ^３から水素への変換)に適当な方法は、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基であるとき、加水分解である。この方法は、式(III)の化合物の、水またはアルコール性溶媒またはそれらの混合物中の塩基溶液(例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ)での処理を必要とする。

【0101】

本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^４のアミン保護基から水素への変換、
すなわち式(VIII)

【化11】

の化合物を得るための、工程ｂ－３)を含んでよい。

【0102】

本発明の方法の工程ｂ－３)は、アミン保護基の開裂の工程であり得る。

【0103】

本発明の方法の工程ｂ－３)は、Ｒ^４から水素への変換(すなわちアミン保護基の開裂)の工程を含んでよく、Ｒ^４の性質によって、当業者の技術常識を使用して、種々に実施でき、その証拠は、表題“Protective Groups in Organic Synthesis” (3^rd ed. 1999)なるTheodora W Greeneの教科書または表題“Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Activating Agents and Protecting Groups” (1999)なるAnthony J. Pearsonの教科書に見ることができる。

【0104】

好ましい実施態様によると、工程ｂ－１)、ｂ－２)およびｂ－３)は、どのような組み合わせ順でも実施し得る。

【0105】

好ましい実施態様によると、本発明の方法の工程Ｂ)は、同時のエステル基の加水分解およびアミン保護基の開裂の工程を含み得る。

【0106】

好ましい実施態様によると、本発明の方法の工程Ｂ)は、Ｒ^３のＣ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基から水素およびＲ^４のアミン保護基から水素への同時の変換の工程；
すなわち、式(IX)

【化12】

の化合物を得るための、工程を含んでよい。

【0107】

好ましい実施態様によると、本発明の方法の工程Ｂ)は、同時の：
・Ｒ^１およびＲ^２のアセチル、メチル、ベンジル、一体となって環を形成するＣ_１－Ｃ_４アルキル基から水素への変換；
・Ｒ^３のＣ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基から水素への変換；
すなわち式(Ｘ)

【化13】

の化合物を得るための、工程により特徴づけられる。

【0108】

好ましい実施態様によると、本発明の方法の工程Ｂ)は、同時の：
・Ｒ^１およびＲ^２のアセチル、メチル、ベンジル、一体となって環を形成するＣ_１－Ｃ_４アルキル基から水素への変換；
・Ｒ^４のアミン保護基から水素への変換；
すなわち式(XI)

【化14】

の化合物を得るための、工程により特徴づけられる。

【0109】

好ましい実施態様によると、本発明の方法の工程Ｂ)は同時の：
・Ｒ^１およびＲ^２のアセチルから水素への変換；
・Ｒ^３のＣ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基から水素への変換；
すなわち、式(Ｘ)の化合物を得るための、工程により特徴づけられる。

【0110】

好ましい実施態様によると、本発明の方法の工程Ｂ)は、同時の：
・Ｒ^１およびＲ^２のアセチルから水素への変換；
・Ｒ^４のアミン保護基から水素への変換；
すなわち式(XI)の化合物を得るための、工程により特徴づけられる。

【0111】

好ましい実施態様によると、本発明の方法の工程Ｂ)は、同時の：
・Ｒ^１およびＲ^２のアセチルから水素への変換；
・Ｒ^３のＣ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基から水素への変換；
・Ｒ^４のアミン保護基から水素への変換；
すなわち式(Ｉ)

【化15】

の化合物を得るための、工程により特徴づけられる。

【0112】

本発明の方法の工程Ｂ)は、結晶化による精製または分割の１以上の工程を含み得る。

【0113】

好ましい実施態様によると、工程Ｂ)は、式(III)または(IV)または(Ｖ)または(VI)または(VII)または(VIII)または(IX)または(Ｘ)または(XI)の化合物の精製または分割の工程ｂ－４)を含み、エナンチオマー過剰の点で効率的富化するための望ましくない異性体の効率的パージを可能とする。

【0114】

本発明の方法は、故に、工程Ｂ)の最後に、高光学純度を有するドロキシドパ、すなわち、ＨＰＬＣ Ａ／Ａ％で表して、一般に９９.０％(ｅ.ｅ.)より高い、すなわち９９.５％より高い光学純度を有するドロキシドパを提供する。

【0115】

好ましくは、本発明の方法は、高光学純度を有するドロキシドパ、すなわち、一般に９９.４％(ｅ.ｅ.)より高い、すなわち９９.７％より高いＨＰＬＣ Ａ／Ａ％光学純度を有するドロキシドパを提供する。

【0116】

エナンチオマー過剰または省略形「ｅ.ｅ.」もしくは「ｅｅ」は、２つのエナンチオマー間のモル分率の絶対的差として定義され、しばしば、エナンチオマー過剰パーセント、％ｅｅとして表され、これは次の計算％ｅｅ＝｜Ｒ－Ｓ｜／｜Ｒ＋Ｓ｜×１００％により得て、ここで、一エナンチオマーの量はしばしばキラルクロマトグラフィーにより測定され得る。

【0117】

明らかにおよび所望により、本発明の方法を、既に光学精製されているドロキシドパに再適用し、１００％の光学純度を有するドロキシドパを製造し得る。

【0118】

５０：５０～９９：１の光学異性体ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ間の比率は、重量比として意図され、いずれにせよ、ＨＰＬＣ Ａ／Ａ％により決定された量に対応する。

【0119】

本発明の方法の好ましい実施態様によると、式(Ｉ)の化合物は、５０／５０～９０／１０、より好ましくは５０／５０～７０／３０を含むｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ間(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ)のジアステレオ異性比を有する。

【0120】

本発明の方法のより好ましい実施態様によると、式(Ｉ)の化合物は、ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ間(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ)のジアステレオ異性比７０／３０を有する。

【0121】

本発明の好ましい実施態様によると、工程ｂ－４)において、化合物(III)または(IV)または(Ｖ)または(VI)または(VII)または(VIII)または(IX)または(Ｘ)または(XI)の光学異性体比は７５：２５～８５：１５であり、なぜならこの異性体比が、本発明の酵素還元法で一般に達成されるものであるからである。

【0122】

当業者の技術常識を使用する、結晶化方法による精製または分割する例の根拠は、日本特許出願特開昭５０－０４９２５２、特開昭５４－０３６２３３、特開昭５６－０２９５５１および特開昭５１－０３２５４０；欧州特許０８４９２８；１２８６８４；米国特許３９２０７２８に見ることができる。

【0123】

本発明の方法の好ましい実施態様によると、式(Ｉ)の化合物を得るための式(II)の化合物の反応は、２０％～少なくとも９５％の範囲からなる変換で起こる。

【0124】

特に、反応をＫＲＥＤであるKRED^{(登録商標)} 130を用いて行うとき、変換は少なくとも９５％である。

【0125】

特に、式(Ｉ)の化合物は、式(II)の化合物の反応をＫＲＥＤであるKRED^{(登録商標)} 130を用いて実施したとき、ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ間(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ)ジアステレオ異性比７０／３０を有する。

【0126】

本発明の方法の好ましい実施態様によると、式(Ｉ)の化合物は、(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ)ジアステレオ異性比少なくとも７５／３０および用いたＫＲＥＤであるKRED^{(登録商標)} 130を有する。

【0127】

本発明の方法の好ましい実施態様によると、式(III)の化合物を得るための式(II)の化合物の反応の実施は、２０％～少なくとも９５％の範囲を含む変換となる。

【0128】

特に、反応をＫＲＥＤであるKRED^{(登録商標)} 130を用いて行うとき、変換は少なくとも９５％である。

【0129】

本発明の方法の好ましい実施態様によると、式(III)の化合物は、５０／５０～９０／１０、より好ましくは５０／５０～７０／３０を含む、ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ間のジアステレオ異性比(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ)を有する。

【0130】

本発明の方法のより好ましい実施態様によると、式(III)の化合物は、ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ間(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ)のジアステレオ異性比７０／３０を有する。

【0131】

特に、式(III)の化合物は、式(II)の化合物の反応をＫＲＥＤであるKRED^{(登録商標)} 130を用いて行うとき、ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ間(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏ)のジアステレオ異性比７０／３０を有する。

【0132】

本発明の方法の好ましい実施態様によると、式(III)の化合物は、ジアステレオ異性比少なくとも７５／３０(ｔｈｒｅｏ／ｅｒｙｔｈｒｏおよび用いたＫＲＥＤであるKRED^{(登録商標)} 130を有する。

【0133】

ジアステレオ異性比は、ｔｈｒｅｏ異性体モル分率とｅｒｙｔｈｒｏ異性体モル分率の間の絶対的比として定義され、これは、次の計算比＝｜Ｔｈｒｅｏ｜／｜Ｅｒｙｔｈｒｏ｜により得られ、ここで、一エナンチオマーの量はしばしばキラルクロマトグラフィーにより測定され得る。

【0134】

式(III)

【化16】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物は、故に、
式(II)

【化17】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は上記と同じ意味を有する。〕
の化合物の、ケトレダクターゼ酵素を用いる酵素還元の工程を含む方法により、製造できる。

【0135】

式(II)

【化18】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物は、式(III)

【化19】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は上記と同じ意味を有する。〕
の化合物の製造に；
または式(Ｉ)

【化20】

のドロキシドパまたはその塩の製造に使用され得る。

【0136】

ケトレダクターゼを、このように、式(II)

【化21】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物の酵素還元の実施に使用し、式(III)

【化22】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は上記と同じ意味を有する。〕
の化合物を提供する
または式(Ｉ)

【化23】

のドロキシドパまたはその塩を提供することができる。

【0137】

故に、好ましい実施態様によると、式(II)の化合物の酵素還元の実施に使用するケトレダクターゼはKRED^{(登録商標)} 130である。

【0138】

本発明の方法は、それ故に、また新規中間体、すなわち、式(II)

【化24】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物も提供する。

【0139】

本発明の方法は、故に、中間体、すなわち式(III)

【化25】

〔Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１－Ｃ_４直鎖または分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
の化合物を提供するが、
－ Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^４が水素であり、Ｒ^３がメチルである；
－ Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^４が水素であり、Ｒ^３がエチルである；
－ Ｒ^１およびＲ^２が水素、アセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４がアセチルである；
－ Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^４がアセチルであり、Ｒ^３はエチルである
化合物は例外とする。

【0140】

さらに、酵素還元法は、有機金属系キラル触媒が先行技術で使用されている点で、先行技術と比較して、環境的にも有利である。還元剤としての酵素の使用は、有機金属系キラル触媒の使用と比較して安価である。さらに、既知方法によるキラルアミンを使用する分割は、５０％分の望ましくない異性体の喪失をもたらし、故に産業的に適当ではない。

【実施例】

【0141】

実験セクション
ケトレダクターゼ酵素は、商業的に広く利用可能であり、例えば、Codexis(USA)については、例えばCodexis(登録商標) KREDスクリーニングキットがある。

【0142】

下式：

【化26】

〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２は独立して水素またはアセチルであり、Ｒ^３は水素またはＣ_１－Ｃ_４直鎖もしくは分枝鎖アルキル基であり、Ｒ^４は水素またはアミン保護基である。〕
を有する出発物質式(II)の化合物は、既知の先行技術合成法により製造される。

【0143】

式(II)の化合物の製造に関していくつかの方法が、例えば、Kazuishi Makino at all in Journal of the American Chemical Society (2005), 127, (16), 5784-5785; Brinton Seashore-Ludlow at all in Organic Letters (2010), 12, (22), 5274-5277; Zheng Long-Sheng at all in Chemical Communications, 54(3), 283-286; 2018; Guan, Yu-Qing at all in Chemical Communications, 53(58), 8136-8139; 2017; Seashore-Ludlow, Brinton at all in Chemistry A European Journal, 18(23), 7219-7223, 2012に記載されている。

【0144】

体積は、生成物の単位あたりの溶媒体積を意味し、故に、例えば、１体積は、１リットル／１キロまたは１mL／１グラムまたは１マイクロリットル／１マイクログラムである。故に、１０体積は、例えば１０リットル／１キログラムの物質を意味する。

【0145】

実施例１：Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢｏｃである式(II)の化合物の酵素還元におけるCodexis(登録商標) KREDキットの使用。

【化27】

反応を、１mlでバイアル中で実施し、イソプロパノール依存的酵素について一夜、室温で振盪し、反応条件は１１５.２mM リン酸ナトリウム緩衝液、１.５３mM 硫酸マグネシウム、１mM ＮＡＤＰ＋、１０％ｖ／ｖ イソプロパノール、１０mg／mlの式(II)の化合物(式中、Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢｏｃである)、１０mg／mlの酵素、ｐＨ７であった。
グルコース依存的酵素について、反応条件は１２８mM リン酸ナトリウム、１.７mM 硫酸マグネシウム、１.１mM ＮＡＤＰ＋１.１mM ＮＡＤ＋、８０mM Ｄ－グルコース、４.３Ｕ／ml グルコースデヒドロゲナーゼ、１０mg／mlの式(II)の化合物(式中、Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢｏｃである)、ｐＨ７であった。
反応物をＨＰＬＣ－ＭＳで分析して、所望の生成物質量を確認した。キラル純度もＨＰＬＣで評価し、ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ形態間で観察した。

【0146】

実施例２：Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢｏｃである式(II)の化合物の酵素還元による式(Ｉ)のドロキシドパＢＯＣの合成。

【化28】

１ｇの式(II)の化合物(式中、Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢｏｃである)に、５０mlの１００mM リン酸緩衝液中、２０mgのＭｇＳＯ_４、５０mgのＣＤＸ－９０１(補因子再生酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ)、２００mgのＫＲＥＤ－１３０、５０mgのＮＡＤＰ＋、１ｇのグルコース、ｐＨ７に加えた。反応を２５℃で実施し、自動滴定により０.５Ｍ ＮａＯＨを加えて、ｐＨ７に維持した。６４時間反応後、分析により約８０Ａ％のドロキシドパＢＯＣが得られた。１００mlのＥｔＯＡｃおよび１ｇのダイカライトを加えて反応停止させ、酵素を除くために濾過し、有機層を分離した。水層を１００mlのＥｔＯＡｃで２回洗浄した。合わせた有機層を蒸留して、０.７ｇの粗製のドロキシドパＢＯＣを得た。生成物をＨＰＬＣ－ＭＳ分析により分析した。

【0147】

実施例３：Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢｏｃである式(II)の化合物の酵素還元による式(Ｉ)のドロキシドパＢＯＣの合成。

【化29】

３.０ｇの式(II)の化合物(式中、Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢＯＣである)に、１５０mlの１００mM リン酸緩衝液中、６０mgのＭｇＳＯ_４、１５０mgのＣＤＸ－９０１(補因子再生酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ)、６００mgのＫＲＥＤ－１３０、１５０mgのＮＡＤＰ＋、３ｇのグルコース、ｐＨ７の溶液を加えた。反応混合物を２５℃で撹拌し、自動滴定により０.５Ｍ ＮａＯＨを加えて、ｐＨ７に維持した。反応１５時間および２４時間後、１５０mgのＮＡＤＰ＋および１５０mgのＣＤＸ－９０１を加えた。反応変換をＨＰＬＣによりモニターし、１２０時間後、１００mlのＥｔＯＡｃおよび１ｇのダイカライトで反応停止させ、次いで、懸濁液を濾過して酵素を除去し、有機層を分離した。水層を５０mlのＥｔＯＡｃで２回洗浄した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸留して、３.０ｇの粗製のドロキシドパＢＯＣを得て、これは自然に結晶化した。単離結晶ドロキシドパＢＯＣの分析は、約６０Ａ％であった。

【0148】

実施例４：Ｂｏｃ Ｎ－保護基の化学的開裂による式(Ｉ)のドロキシドパエチルエステルの合成。

【化30】

実施例３で得た７０mgのドロキシドパＢＯＣを１mlのジクロロメタンに溶解した。２５℃で１mlのＴＦＡを加え、ＨＰＬＣにより変換をモニターした。ＢＯＣ開裂完了後、生成物ドロキシドパエチルエステルを、窒素流で濃縮することにより単離した。

【0149】

実施例５：エチルであるＲ^３の化学的加水分解による式(Ｉ)のドロキシドパの合成。

【化31】

実施例４で得た２５mgの単離ドロキシドパエチルエステルに１mlの３Ｍ ＮａＯＨを加えた。反応物を２時間、室温で撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。加水分解完了後、反応物を１０％ ＨＣｌ溶液で中和し、粗製ドロキシドパを窒素流による溶液の濃縮により単離した。単離ドロキシドパをＨＰＬＣでジアステレオ異性純度について分析し、ここで、ｔｈｒｅｏドロキシドパ形態とｅｒｙｔｈｒｏドロキシドパ形態間で７０：３０Ａ％比が観察された。

【0150】

実施例６：Ｂｏｃ Ｎ－保護基の化学的開裂による式(Ｉ)のドロキシドパエチルエステルの合成。

【化32】

実施例３で得た１ｇの粗製ドロキシドパＢＯＣを１０mlのジクロロメタンに溶解した。２５℃で１,５mlのＴＦＡを加え、変換をＨＰＬＣによりモニターした。ＢＯＣ開裂完了後、ＮａＨＣＯ_３飽和溶液を加えて、ｐＨを中和した。生成物を濃縮により単離して、約１.３ｇの粗製ドロキシドパエチルエステルを得た。単離生成物をＨＰＬＣ－ＭＳにより分析して、質量を確認した(Ｍｗ ２４１)。またジアステレオ異性純度をＨＰＬＣにより評価し、ここで、ｔｈｒｅｏおよびｅｒｙｔｈｒｏ形態間で７２：２８Ａ％比を観察した。

【0151】

実施例７：エチルであるＲ^３の化学的加水分解による式(Ｉ)のドロキシドパの合成。

【化33】

実施例６からの１００mgの単離ドロキシドパエチルエステルに１mlの水を加えた。次いで、１００μlの１０Ｍ ＮａＯＨを加え、３０分間混合した。反応をＨＰＬＣによりモニターした。加水分解完了後、反応物を１０％ ＨＣｌ溶液で中和し、粗製ドロキシドパを、窒素流による濃縮により単離した。単離生成物、約１００mgを、ＨＰＬＣによりジアステレオ異性純度を評価するため分析した。ｔｈｒｅｏドロキシドパ形態とｅｒｙｔｈｒｏドロキシドパ形態の間で７０：３０Ａ％の比が観察された。

【0152】

実施例８：Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢｏｃである式(II)の化合物の酵素還元による式(Ｉ)のドロキシドパＢＯＣの合成。

【化34】

ｐＨ７の７５mlの５０mM リン酸緩衝液に、２０mgのＭｇＳＯ_４、２５mgのＣＤＸ－９０１(補因子再生酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ)、２００mgのＫＲＥＤ－１３０、７５mgのＮＡＤＰ＋、１.３ｇのグルコースを加えた。懸濁液を３０℃で混合し、ｐＨを０.５Ｍ ＮａＯＨで７に調節した。その後、３.２５mlのＤＭＳＯに溶解した１.５ｇの式(II)の化合物(式中、Ｒ^１およびＲ^２はアセチルであり、Ｒ^３はエチルであり、Ｒ^４はＢＯＣである)からなる溶液を、１０分間で懸濁液に加えた。３０℃で反応させ、自動滴定により０.５Ｍ ＮａＯＨを加えて、ｐＨ７に維持した。反応９時間および１７時間後、７５mgのＮＡＤＰ＋および２５mgのＣＤＸ－９０１を加えた。反応変換をＨＰＬＣによりモニターし、２２後、反応物を濾過して、不溶性物質を除去した。母液に、５０mlのＥｔＯＡｃおよび１,５ｇのダイカライトを加え、３０分間混合し、次いで濾過し、濾液を５０mlのＥｔＯＡｃで洗浄した。得られた溶液に２０mlのＮａＣｌを加え、有機層を分離した。水層を２０mlのＥｔＡｃで抽出し、合わせた有機層を３０mlの水で洗浄した。有機層を蒸留して残渣を得て、３０mlのＤＣＭで２回洗浄(stripped)した。最後に０.９ｇのドロキシドパＢＯＣを得て、分析した。

【0153】

実施例９：Ｂｏｃ Ｎ－保護基の化学的開裂による式(Ｉ)のドロキシドパエチルエステルの合成。

【化35】

実施例８で得た０.９ｇのドロキシドパＢＯＣを１０mlのジクロロメタンに溶解した。次いで、得られた溶液に、２５℃で１,５mlのＴＦＡを１０分間添加した。得られた反応混合物を２５℃で１時間撹拌した。変換をＨＰＬＣによりモニターした。ＢＯＣ開裂完了後、ＮａＨＣＯ_３飽和溶液を加えて、ｐＨを中和した。生成物を蒸発により単離して、約０.９ｇの粗製ドロキシドパエチルエステルを得た。単離生成物をＨＰＬＣ－ＭＳにより分析して、質量を確認した(Ｍｗ ２４１)。またジアステレオ異性純度をＨＰＬＣにより評価し、推定ｔｈｒｅｏ形態とｅｒｙｔｈｒｏ形態の７２：２８Ａ％比が観察された。

【0154】

実施例１０：エチルであるＲ^３の化学的加水分解による式(Ｉ)のドロキシドパの合成。

【化36】

実施例９で得た０.５mgの単離ドロキシドパエチルエステルに６ml ３Ｍ ＮａＯＨを加えた。反応混合物を１時間、２５℃で撹拌し、変換をＨＰＬＣによりモニターした。加水分解完了後、反応物を１０％ ＨＣｌ溶液で中和し、粗製ドロキシドパを窒素流により溶液の濃度により単離した。単離生成物、約０.５ｇをＨＰＬＣによりジアステレオ異性体純度評価のために分析し、ｔｈｒｅｏドロキシドパ形態とｅｒｙｔｈｒｏドロキシドパ形態の間の７２：２８Ａ％比が観察された。

【0155】

実施例１１：反応生成物を分析するための分析方法。
ＨＰＬＣによる純度、ジアステレオ異性純度の決定およびアッセイ：
クロマトグラフィー条件：
カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８(２) １００Å、１５０×４.６mm、３.０μm
移動相Ａ：１.０ｇの１－ヘプタンスルホン酸ナトリウムおよび１.３６ｇのリン酸二水素カリウムを１０００mLの水に溶解し、リン酸でｐＨを２.０に調節した。９３０mLのこの溶液に、７０mLのアセトニトリルを加えた。
検出器：２２０nmのＵＶ
流速：１.０mL／分
カラム温度：２５℃
注入体積：５０μL
ランタイム：３５分間
希釈剤：MilliQ水。