特許 7082489 希少造血器腫瘍の診断マーカー、検査方法、治療薬及びスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-05-31

(45)【発行日】2022-06-08

(54)【発明の名称】希少造血器腫瘍の診断マーカー、検査方法、治療薬及びスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20220601BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20220601BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20220601BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20220601BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220601BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220601BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220601BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20220601BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20220601BHJP

   A61K 31/55 20060101ALI20220601BHJP

   A61K 31/551 20060101ALI20220601BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALN20220601BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALN20220601BHJP

【ＦＩ】

G01N33/48 M

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

G01N33/50 P

C12Q1/04

A61P35/02

A61K45/00

A61P43/00 111

A61K31/4745

A61K31/517

A61K31/55

A61K31/551

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6886 Z

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2017566940

(86)(22)【出願日】2017-02-07

(86)【国際出願番号】 JP2017004298

(87)【国際公開番号】W WO2017138500

(87)【国際公開日】2017-08-17

【審査請求日】2020-01-30

(31)【優先権主張番号】P 2016023141

(32)【優先日】2016-02-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000173588

【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会

(74)【代理人】

【識別番号】100179431

【弁理士】

【氏名又は名称】白形 由美子

(72)【発明者】

【氏名】竹内 賢吾

(72)【発明者】

【氏名】坂本 佳奈

(72)【発明者】

【氏名】片山 量平

(72)【発明者】

【氏名】坂田 征士

【審査官】西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０２６８９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５０３３４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５２４３８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】RIAZ, W. et al.，Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm: Update on Molecular Biology, Diagnosis, and Therapy，Cancer Control，2014年10月，Vol.21/No.4，pp.279-289

【文献】MARTIN-MARTIN, L. et al.，Classification and clinical behavior of blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasms according to their maturation-associated immunophenotypic profile，Oncotarget，2015年05月25日，Vol.6/No.22，pp.19204-19216

【文献】河本啓介，他，t(6;8)(p21;q24)を伴ったBlastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN)の１例，日本リンパ網内系学会会誌，日本，日本リンパ網内系学会，2014年06月06日，Vol.54，pp.115

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ｂｌａｓｔｉｃ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｍ：ＢＰＤＣＮ）において、
腫瘍細胞における
ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ（免疫芽球様）の形態、８ｑ２４の再構成、ＭＹＣ発現の少なくともいずれか１つを検査することによって
ＢＰＤＣＮを細分類することを特徴とする検査方法。

【請求項2】

ＢＰＤＣＮにおいて、
ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ（免疫芽球様）の形態学的マーカー、
８ｑ２４の再構成、
ＭＹＣ発現の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とするＢＰＤＣＮを細分類する診断マーカー。

【請求項3】

前記診断マーカーがＭＹＣ発現であることを特徴とする請求項２記載のＢＰＤＣＮを細分類する診断マーカー。

【請求項4】

請求項２記載の診断マーカーを検出するためのプローブであって、
前記診断マーカーが８ｑ２４の再構成であり、
ＣＴＤ－２５２７Ｎ１２の配列中の少なくとも連続した２０ｂｐの配列を含み、かつＣＴＤ－２５２７Ｎ１２に特異的にハイブリダイズ可能なテロメア側のプローブと、
ＭＹＣ遺伝子の上流に位置するセントロメア側の領域の少なくとも連続した２０ｂｐの配列を含み、かつ該セントロメア側の領域に特異的にハイブリダイズ可能なプローブとを含むことにより８ｑ２４の再構成を検出するＦＩＳＨプローブ。

【請求項5】

ＢＰＤＣＮ治療薬をスクリーニングする方法であって、
候補化合物をＢＰＤＣＮ細胞株の培地に添加し、
請求項３記載の診断マーカーを測定し、
候補化合物による前記診断マーカーの発現の変化を指標とすることを特徴とする治療薬スクリーニング方法。

【請求項6】

ＢＰＤＣＮ治療薬をスクリーニングする方法であって、
前記ＢＰＤＣＮ細胞株がＣＡＬ－１細胞株であることを特徴とする請求項５記載の治療薬スクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は希少造血器腫瘍である芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ｂｌａｓｔｉｃ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｍ：ＢＰＤＣＮ）の診断マーカー、及び新規治療薬のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（以下、ＢＰＤＣＮと記載する。）は、未分化な形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ： ｐＤＣ）由来とされる稀な造血器腫瘍である。典型的には皮膚病変で発症し、当初は化学療法に反応することが多いものの早期に再発、白血化し、生存期間中央値が１２か月程度のアグレッシブで予後不良な疾患である。

【0003】

ＢＰＤＣＮは、１９９４年にＡｄａｃｈｉらによりＣＤ４とＣＤ５６が陽性でＴ細胞性マーカーが陰性の皮膚リンパ腫として報告されて以来（非特許文献１）、稀な疾患であることもあり、２００８年にＷＨＯ分類第４版ではＢＰＤＣＮという名称で急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）関連腫瘍に含まれる独立した疾患概念として掲載されるまで、疾患概念が一定せずその名称は何度も変わった。

【0004】

現在ではＢＰＤＣＮという独立した疾患であると認識されているものの、定まった診断基準は存在せず、疾患の希少性も相まって、実地診療において他の造血器腫瘍との鑑別が困難である。特にその細胞形態や免疫形質、臨床病態からはＡＭＬの皮膚浸潤との鑑別が最も問題となる（非特許文献２～４）。ＢＰＤＣＮの特徴的マーカーとして、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＬ１、ＢＤＣＡ２、ＣＤ２ＡＰ、ＢＣＬ１１Ａなどが知られている。しかしながら、ＢＰＤＣＮでもそれらのマーカーの一部が陰性となる症例も多く、一方、ＡＭＬなどの他疾患で陽性となる症例も多い（非特許文献５～８）。そのため、ＢＰＤＣＮを扱った研究や症例報告をみても、その免疫形質についての評価や診断基準は混沌としている。

【0005】

ＢＰＤＣＮは前述のごとく予後不良な疾患で標準治療も定まっておらず、ＡＬＬ（Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、急性リンパ性白血病）レジメン、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）レジメン、放射線治療単独など様々な治療法で処置されているのが現状である。ＢＰＤＣＮの有効な治療法の開発のためにも、その病態の分子病理学的理解が求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Adachi, M. et al., 1994, Am. J. Hematol., Vol.47,p.278-282.

【文献】Benet, C. et al., 2011, Am. J. Clin. Pathol.,Vol.135, p.278-290.

【文献】Cronin, D.M. et al., 2012, Am. J. Clin.Pathol., Vol.37, p.367-376.

【文献】Sangle, N.A. et al., 2014, Mod. Pathol., Vol.27,p.1137-1143.

【文献】Petrella, T. et al., 2010, Autoimmunity, Vol.43,p.210-214.

【文献】Knowles, D.M. et al., 2014, "Knowles'neoplastic hematopathology", Wolters Kluwer, Lippincott Williams & Wilkins.

【文献】Riaz, W. et al., 2014, Cancer Control, Vol.21,p.279-289.

【文献】Julia, F. et al., 2014, Am. J. Surg. Pathol.,Vol.38, p. 673-680.

【文献】Marafioti, T. et al., 2008, Blood, Vol.111,p.3778-3792.

【文献】Pulford, K. et al., 2006, Leukemia, Vol.20,p.1439-1441.

【文献】Maeda, T. et al., 2005, Int. J. Hematol. Vol.81(2), p.148-54.

【文献】Narita, M. et al., 2009, Leuk Res. Vol.33(9),p.1224-32.

【文献】Yang, D. et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, Vol.107(31), p.13836-13841.

【文献】Dauch, D. et al., 2016, Nat. Med.,Vol.22(7), p.744-753.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、いまだに診断基準が定まらないＢＰＤＣＮの新しい診断マーカーを探索することを課題とする。さらに、該診断マーカーによって、明確な診断基準を確立するとともに、新しい治療薬や治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、ＢＰＤＣＮの新たな診断マーカー、該診断マーカーに基づく検査方法や治療薬、及び治療薬のスクリーニング方法に関する。

【0009】

（１）芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ｂｌａｓｔｉｃ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｍ：ＢＰＤＣＮ）において、ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ（免疫芽球様）の形態、８ｑ２４の再構成、ＭＹＣ発現の少なくともいずれか１つを検査することによってＢＰＤＣＮを細分類することを特徴とする検査方法。
（２）ＢＰＤＣＮにおいて、ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ（免疫芽球様）の形態学的マーカー、８ｑ２４の再構成、ＭＹＣ発現の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とするＢＰＤＣＮを細分類する診断マーカー。
（３）ＢＰＤＣＮを治療するための医薬組成物であって、ＭＹＣの発現、機能、ＭＹＣが関与するシグナル伝達経路を直接的又は間接的に阻害する物質を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物。
（４）治療対象となるＢＰＤＣＮが、細胞形態がｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄである、８ｑ２４の再構成、又はＭＹＣ発現の少なくともいずれか１つのマーカーが陽性である症例を治療するためのものであることを特徴とする請求項３記載の医薬組成物。
（５）前記有効成分が、ＢＥＴ（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａ ｔｅｒｍｉｎａｌ）ブロモドメイン選択的阻害剤又はオーロラキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項３又は４記載の医薬組成物。
（６）前記ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤が、ＪＱ１、Ｉ－ＢＥＴ１５１、Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＯＴＸ０１５、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ－１又はこれらの類縁体化合物であり、前記オーロラキナーゼ阻害剤がアリセルチブ又はバラセルチブ又はこれらの類縁体化合物であることを特徴とする請求項５記載の医薬組成物。
（７）ＢＰＤＣＮを治療するための医薬組成物であって、有効成分が、ＨＤＡＣ阻害剤又はＢＣＬ２ファミリータンパク質阻害剤であることを特徴とする医薬組成物。
（８）前記ＨＤＡＣ阻害剤がボリノスタット、パノビノスタット又はこれらの類縁体化合物であり、前記ＢＣＬ２ファミリータンパク質阻害剤がベネトクラックス又はその類縁体化合物であることを特徴とする医薬組成物。
（９）（２）記載の診断マーカーを検出するためのプローブであって、前記診断マーカーが８ｑ２４の再構成であり、ＣＴＤ－２５２７Ｎ１２の配列中の少なくとも連続した２０ｂｐの配列を含み、かつＣＴＤ－２５２７Ｎ１２に特異的にハイブリダイズ可能なテロメア側のプローブと、ＭＹＣ遺伝子の上流に位置するセントロメア側の領域の少なくとも連続した２０ｂｐの配列を含み、かつ該セントロメア側の領域に特異的にハイブリダイズ可能なプローブとを含むことにより８ｑ２４の再構成を検出するＦＩＳＨプローブ。
（１０）ＢＰＤＣＮ治療薬をスクリーニングする方法であって、候補化合物をＢＰＤＣＮ細胞株の培地に添加し、候補化合物によるＭＹＣ発現の変化及び／又は細胞増殖を指標とすることを特徴とする治療薬スクリーニング方法。
（１１）ＢＰＤＣＮ治療薬をスクリーニングする方法であって、前記ＢＰＤＣＮ細胞株がＣＡＬ－１細胞株及び／又はＰＭＤＣ０５細胞株であることを特徴とする（１０）記載の治療薬スクリーニング方法。
（１２）ＢＰＤＣＮ治療薬をスクリーニングする方法であって、候補化合物によるＭＹＣ発現の変化を指標とすることを特徴とする治療薬スクリーニング方法。

【発明の効果】

【0010】

ＢＰＤＣＮを細分類する診断マーカーを見出したことにより、新しい治療薬を提供することが可能となった。また、新規治療薬のスクリーニングにも応用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＢＰＤＣＮの代表的な細胞形態を示す染色像。図１ＡはＩｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群、図１Ｂは典型例群、図１Ｃは典型例群のバリアントの染色像を示す。

【図2】ＢＰＤＣＮの免疫形質および遺伝子再構成を示す図。

【図3】ＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨプローブの設計及びＭＹＣ＋及びＭＹＣａ群症例におけるＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨシグナルパターンを示す図。

【図4】ＭＹＣ免疫染色を示す図。

【図5】ＳＵＰＴ３Ｈ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨプローブの設計及びＭＹＣ＋及びＭＹＣａ群症例におけるＳＵＰＴ３Ｈ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨシグナルパターンを示す図。

【図6】ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤による各種腫瘍細胞株の増殖抑制を示す図。

【図7】ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤処理後のＭＹＣ発現を示す免疫染色像。

【図8】ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤処理後のＭＹＣ発現を示すウェスタンブロッティング像。

【図9】ＪＱ１処理後のＭＹＣの発現とアポトーシス誘導を示すウェスタンブロッティング像。

【図10】オーロラキナーゼ阻害剤による各種腫瘍細胞株の増殖抑制を示す図。

【図11】ＨＤＡＣ阻害剤、ＢＣＬ２ファミリータンパク質阻害剤による各種腫瘍細胞株の増殖抑制を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明者らは、ＢＰＤＣＮを分子病理学的に詳細に研究したところ、ＢＰＤＣＮを少なくとも２つに細分類できるマーカーを見出した。以下に詳細に説明するが、現在、ＢＰＤＣＮとして診断されている腫瘍は、８ｑ２４の再構成、ＭＹＣの発現、細胞形態により２つに細分類できることが明らかとなった。

【0013】

ＢＰＤＣＮを細分類するマーカーの一つである８ｑ２４の再構成はＧ-バンド法や、ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨなど該当領域の再構成を検出できる方法であればどのような方法を用いてもよい。

【0014】

また、ＭＹＣの発現増強に関しては、ＭＹＣ発現をタンパク質レベル、ＲＮＡレベルで検出可能な方法であればどのような方法を用いてもよい。タンパク質レベルで解析する方法としては、免疫染色、ウェスタンブロット法など、ＲＮＡレベルで解析する方法にはＲＴ-ＰＣＲ法、定量ＲＴ-ＰＣＲ法、ｃＤＮＡマイクロアレイ法、次世代シークエンサーを用いたＲＮＡシークエンス法などがあり、いずれの方法を用いてもよい。特に、得られる組織の量に限りがあること、細胞形態も併せて解析できることから、免疫染色法により解析することが好ましい。

【0015】

本マーカーを用いることによって、ＢＰＤＣＮを細分類できるだけではなく、ＭＹＣ陽性群（以下に詳述するが、ＭＹＣ免疫染色陽性かつＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ陽性群をＭＹＣ陽性群と定義し、ＭＹＣ＋群と記載することもある。）については、ＭＹＣ発現を抑制する薬剤によって、細胞増殖が低下することを見出した。したがって、ＢＰＤＣＮのＭＹＣ＋群については、ＭＹＣ発現を抑制する薬剤を投与することによって治療できる可能性がある。

【0016】

ＭＹＣ発現阻害剤としては、ＭＹＣの機能を抑制することができればどのような薬剤でもよい。すなわち、ＭＹＣ発現を直接的または間接的に抑制させることのできる薬剤や、ＭＹＣの下流のシグナル伝達系を阻害する薬剤であればＢＰＤＣＮ治療薬として使用できる可能性がある。また、ＭＹＣを機能的に阻害するような薬剤であっても構わない。例えば、ＭＹＣ発現を減少させる阻害剤としては、１００５８－Ｆ４、Ｃｕｒｃｕｍｉｎ、Ａｓａｒｉｎｉｎ、ＣＨＣ００４、ＣＨＣ００５、ＣＨＣ００８、ＣＨＣ０１１、および本発明で開示するＢＥＴ（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａ ｔｅｒｍｉｎａｌ）ブロモドメイン選択的阻害剤等がある。また、ＭＹＣシグナル伝達経路を阻害する薬剤としては、ＳＴＡＴ３阻害剤、Ｗｎｔ／β‐カテニン阻害剤などが挙げられる。

【0017】

ＢＰＤＣＮ治療薬としては、これら公知のＭＹＣ発現、又は機能を抑制する薬剤を用いることができるが、特に、ここでその顕著な抑制効果を示したＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤を効果的に用いることができる。ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤としては、以下でその効果を示すＪＱ１、Ｉ－ＢＥＴ１５１、Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＯＴＸ０１５、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ－１の他に、ＲＶＸ－２０８、ＧＳＫ２８０１、Ｂｒｏｍｏｓｐｏｒｉｎｅ等が挙げられる。さらに、その他のＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤であって、ＭＹＣ発現を抑制することができる医薬化合物も使用できることは言うまでもない。

【0018】

また、ＭＹＣの機能を制御すると考えられるオーロラキナーゼ阻害剤もＢＰＤＣＮ治療薬として用いることができる。オーロラＡキナーゼ選択的阻害剤であるアリセルチブ（Ａｌｉｓｅｒｔｉｂ）、オーロラＢキナーゼ選択的阻害剤であるバラセルチブ（Ｂａｒａｓｅｒｔｉｂ）、両者がＭＹＣ発現の認められるＢＰＤＣＮ細胞株の増殖抑制に効果が認められたことから、オーロラキナーゼ阻害剤をＢＰＤＣＮの治療に用いることができる可能性がある。

【0019】

本発明の新規化合物のスクリーニング方法は、候補化合物をＣＡＬ－１などＭＹＣ高発現のＢＰＤＣＮ細胞株やＰＭＤＣ０５などのＭＹＣ発現陰性の細胞株の培地に添加することによって行うことができる。候補化合物を添加後、細胞の生存率、ＭＹＣ高発現細胞株であればＭＹＣ発現の減少などをスクリーニングの指標として化合物を選択すればよい。ＭＹＣ発現を指標とするのであれば、ＢＰＤＣＮに由来する細胞株である必要はなく、ＭＹＣ発現が増強している細胞を用いればよい。例えば、ＭＹＣ発現の増強が認められる形質細胞性腫瘍ＫＭＳ１２ＰＥ細胞株などを用いてもよい。さらに、ＭＹＣ発現の有無にかかわらず、ＢＰＤＣＮ細胞株を用いて細胞増殖抑制等を指標として、治療薬のスクリーニングを行うことができる。ＢＰＤＣＮから樹立された細胞としては、ＣＡＬ－１、ＰＭＤＣ０５の他に、ＧＥＮ２．２等が知られているが、今後樹立される細胞株を使用できることは言うまでもない。

【0020】

また、ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤が有効であったことから、ＢＥＴファミリータンパク質に対して阻害効果のある化合物や、オーロラキナーゼ阻害剤、また、ＭＹＣの発現を減少することが知られている化合物を候補化合物とすれば、効率よくスクリーニングを行うことができる。また、ＭＹＣ発現の有無にかかわらずＢＰＤＣＮ細胞株に対して細胞増殖抑制効果を有していた化合物としてＨＤＡＣ阻害剤、ＢＣＬ２ファミリータンパク質阻害剤があった。したがって、これら阻害剤もＢＰＤＣＮ治療薬として作用する可能性が高い。
以下、具体的に本発明について説明する。

【0021】

１．対象
がん研究会の倫理審査委員会にて承認を受け、症例の収集、解析を行った。ＢＰＤＣＮあるいは以前の診断名であるｂｌａｓｔｉｃ ＮＫ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ（芽球型ＮＫ細胞リンパ腫）と診断された症例について、英語もしくは日本語の論文、学会発表等を行っている日本国内施設や、その他協力機関に協力を依頼し、各施設でＢＰＤＣＮと診断された症例の未染色標本、各施設で保存している場合には凍結検体、および臨床情報を収集した。最終的に５６施設から１５３例を収集した。

【0022】

収集した症例について、ＢＰＤＣＮの診断確認を行った。Ｊｕｌｉａらの報告に基づき、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＬ１、ＢＤＣＡ２の５マーカーのうち４マーカー以上が陽性であることを適格条件とした（非特許文献８）。この条件は、現段階では一番厳しいレベルのＢＰＤＣＮの診断確認条件であると考えられる。

【0023】

免疫染色については，がん研究所における染色結果，または検体提供施設での染色結果を採用した。非典型的な症例、ＡＭＬとの鑑別が問題となった症例では適宜ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＭＰＯ）などの免疫染色を行った。臨床情報は、自施設症例は電子カルテ、他施設症例は調査票および発表論文から収集した。初回治療開始前までに出現した病変を初発時病変とし、治療がなされなかった症例については診断確定時までに出現した病変とした。皮膚病変の性状は、腫瘤、紅斑・局面、混在性（腫瘤と紅斑・局面の混在）の３つに分類した。皮膚病変の分布は、全身性（体の２つ以上のエリアに病変が存在する）、局所性（孤立性もしくは、胸部など体の１つのエリア内に複数の病変が存在する）に分類した。

【0024】

５６施設で、ＢＰＤＣＮ又は類縁疾患と診断された１５３症例のうち、今回の適格基準（ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＬ１、ＢＤＣＡ２の５マーカーのうち４マーカー以上が陽性、以下４／５マーカー陽性と記載する。）を満たし、ＢＰＤＣＮと診断が確認された症例は１１６例であった。検体提供元施設ではＢＰＤＣＮと診断されたものの、本研究の適格基準を満たさずＢＰＤＣＮではないと判断された症例（ｏｔｈｅｒ症例群とする）が３７例あった。４／５マーカー陽性であった症例の細胞形態を再度評価したところ、うち１例で核形態の切れ込みや不整が目立ちＡＭＬが疑われた。この症例はＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ１２３が陽性、ＴＣＬ１陰性、ＢＤＣＡ２部分陽性であったが、ｌｙｓｏｚｙｍｅ強陽性であったので、ｏｔｈｅｒ群とした。結果、ＢＰＤＣＮとした症例１１５例、ｏｔｈｅｒ群が３８例となった。

【0025】

ＢＰＤＣＮの診断基準をみたさず、ｏｔｈｅｒ群と判定された症例３８例の生検部位は、皮膚２１検体、骨髄１０検体、リンパ節９検体、その他６検体であった。組織像、マーカー所見、臨床経過などから推定された診断としては、骨髄単球系への分化傾向を示すＡＭＬもしくはｍｙｅｌｏｉｄ ｓａｒｃｏｍａが２３例，ｌｉｎｅａｇｅ不明のｉｍｍａｔｕｒｅな造血器腫瘍が２例，Ｔ細胞性リンパ腫が２例，ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａが１例で、その他分類不能の症例が１０例であった。

【0026】

４／５マーカー陽性としてＢＰＤＣＮと確定診断された症例群については、初発時病変部位は、皮膚が最も多く１０６例（９５％）でみられ、皮膚病変のない症例は６例のみであった。骨髄病変は６０例（６３％）で認められ、３８例（３８％）で末梢血浸潤がみられた。同時あるいは先行して存在する骨髄異形成はデータの得られた６５例中１３例（２０％）で認められた。皮膚病変の性状としては、腫瘤性が５３例（５５％）で最も多かった。皮膚病変の分布としては、全身性が４９例（４９％）、限局性が５０例（５１％）でほぼ同数であった。

【0027】

２．細胞形態
まず、ＢＰＤＣＮと確定された１１５症例についての細胞形態の解析結果を示す。細胞形態は、ＨＥ染色により評価した。図１に示すように、クロマチン繊細で中等大の不整形核と少量から中等量の細胞質を持ち、核小体は無いか小さいものが単独か複数みられるという教科書的典型例群（以下、ｃｌａｓｓｉｃａｌ群という。図１（Ｂ））および、それとは大きく異なり、類円形空胞状の核、好塩基性で中等量の細胞質と光輝性の大きな中心性核小体を持つ免疫芽球（ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔ）に似るがクロマチンが繊細なｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌを主体とする症例群（以下、ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群という。図１（Ａ））が認められた。

【0028】

Ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌのような中心性核小体の目立つ大型細胞が存在しても２０％未満であればｃｌａｓｓｉｃａｌ群とした。ｃｌａｓｓｉｃａｌ群にも幅があり、ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ（図１（Ｃ-1））、ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ（図１（Ｃ-２））、ｍｏｎｏｃｙｔｏｉｄ（図１（Ｃ-３））と呼称しうる細胞形態のバリアントが存在した。

【0029】

従来、ＢＰＤＣＮの細胞形態は、上述したｃｌａｓｓｉｃａｌ群の形態とされており、解析を行った１１５症例でも６３例がこれに該当していた。しかしながら、類円形の核と１つの中心性核小体を持つ特徴的な形態を示すｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群も３８例、すなわち全体の約３０％の割合で存在することがわかった。これまでに、ＢＰＤＣＮで、図１Ａに示すようなｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ様の細胞形態が存在することについて系統的にまとまった報告はない。

【0030】

３．免疫染色
次に、免疫染色の結果を示す。ホルマリン固定パラフィン包埋検体を４μｍに薄切し、ＢＰＤＣＮの診断適格基準として採用したＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＬ１、ＢＤＣＡ２の抗体の他、ＭＹＣ、ＣＤ２ＡＰ、Ｂｃｌ１１Ａ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅに対して免疫染色を行った。評価はおもに陽性腫瘍細胞数で行い、染色強度は考慮しないこととした。

【0031】

抗体は、以下の抗体を用いた。ＣＤ４：ニチレイバイオサイエンス社製、クローン４Ｂ１２、ＣＤ５６：ライカバイオシステムズ社製、クローン１Ｂ６、ＣＤ１２３：ＢＤ バイオサイエンス社製、クローン７Ｇ３、ＴＣＬ１：アブカム社製、クローンＥＰＲ３９４９、ＢＤＣＡ２：ＤＥＮＤＲＩＴＩＣＳ社製、クローン１２４Ｂ３．１３、ＭＹＣ：アブカム社製、クローンＹ６９、ＣＤ２ＡＰ：サンタクルズバイオオテクノロジー社製、クローンＢ－４、Ｂｃｌ１１Ａ：Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製、ウサギポリクローナル抗体、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ：ニチレイバイオサイエンス社製、ウサギポリクローナル抗体、Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ダコ社製、ウサギポリクローナル抗体。

【0032】

図２に診断適確基準に用いた５つのマーカーの染色結果を示す。各カラムは各患者を示し、各染色結果が陽性であったものは黒で、陰性であったものは白で示す。また、薄い灰色で示したものは、部分的に陽性であったもの、濃い灰色で示したものは評価できなかったことを示す。

【0033】

ＢＰＤＣＮの診断基準として用いたＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ２、ＴＣＬ１の５マーカーについて検討した例では、５マーカー陽性例が８９例、４マーカー陽性例が１５例、４マーカーについて検討した例では、４マーカー陽性例が１１例であった。ＣＤ４は１１１例（９７％）、ＣＤ５６は１０８例（９４％）、ＣＤ１２３は１１３例（９９％）、ＢＤＣＡ２は１０５例（９８％）、ＴＣＬ１は１１２例（９９％）でそれぞれ陽性であり、陰性例は順にそれぞれ４、７、１、２、および１例あった。

【0034】

ＭＹＣ免疫染色（図２、ＭＹＣ ＩＨＣ）については、腫瘍細胞の７０％以上が染色された場合を陽性、２０％以上７０％未満の場合をｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ、２０％未満であった場合を陰性と判定した。その結果、陽性例（図２黒で示す。）は３８例、陰性例（図２、白で示す。）は６２例、ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ（図２、薄い灰色で示す。）は８例認められた。なお、評価不能症例は７例認められた（図２、濃い灰色で示す。）。

【0035】

４．ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨによる解析
４μｍ厚にスライスしたホルマリン固定パラフィン包埋検体未染色切片に対し、ＦＩＳＨ解析を行った。Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）クローンから作製したＤＮＡプローブを用いた。ハイブリダイズさせたスライドは、４'，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で対比染色を行い、蛍光顕微鏡 ＢＸ５１（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。判定が可能な腫瘍細胞の７０％以上でシグナルのスプリットが認められた場合を陽性、１０％以上７０％未満の場合をｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ、１０％未満であった場合を陰性とした。８ｑ２４に遺伝子座を持つＭＹＣ、６ｐ２１に遺伝子座を持つＳＵＰＴ３Ｈに着目してプローブを設計した。なお、ＳＵＰＴ３Ｈは、８ｑ２４再構成のパートナーとして一例報告されている遺伝子である。使用したＢＡＣクローンは下記のとおりである。

【0036】

ＭＹＣ（緑）：ＲＰ１１－１５３Ｂ５、ＲＰ１１－７３９Ｇ１５、ＣＴＤ－２５３０Ｅ１２、ＣＴＤ－２３１３Ｌ９、ＣＴＤ－３０６６Ｄ１
ＭＹＣ（赤）：ＣＴＤ－２３６９Ｊ１４、ＲＰ１１－１６１Ｂ１９、ＲＰ１１－１９５Ｇ１８、ＲＰ１１－６９Ｈ６、ＣＴＤ－２３８４Ｇ１２、ＲＰ１１－４２０Ｅ２０、ＣＴＤ－３０８９Ｄ１５、ＣＴＤ－２５２７Ｎ１２
ＳＵＰＴ３Ｈ（緑）：ＲＰ１１－３４２Ｈ９、ＲＰ４－６６９Ｆ６
ＳＵＰＴ３Ｈ（青）：ＲＰ１１－３１５Ｃ４、ＣＴＣ－３２８Ａ８
ＳＵＰＴ３Ｈ（赤）：ＲＰ１１－２１３Ｉ１８、ＲＰ１－２４４Ｆ２４、ＣＴＤ－２５１５Ｋ５

【0037】

図３中央に斜線で示した５つの領域は、本発明で用いた上記ＭＹＣ（緑）のプローブの位置、黒で示した８つの領域は上記ＭＹＣ（赤）のプローブの８ｑ２４染色体上の位置を示す。図３の上にはアボット社（Ｖｙｓｉｓ）、ダコ社（Ｄａｋｏ）から販売されているＦＩＳＨプローブのおおよその位置を示している。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅはゲノム上の切断点を、Ｆはゲノム上の欠失領域を示す。

【0038】

ＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨのシグナルパターンは症例ごとに様々であり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに切断点を持つもの、Ｆに欠失を持つものが見られた。ＰＶＴ１遺伝子内に８ｑ２４上のゲノム切断点をもつと考えられる症例（ｐａｔｔｅｒｎ Ｃ）が１７例で最も多かったものの、推定される８ｑ２４における切断点は症例によって異なり、ＭＹＣ遺伝子座の上流・下流のどちらにも認められた。

【0039】

現在、ＭＹＣのＦＩＳＨプローブは、アボット社、ダコ社の２社から販売されている。しかしながら、図３に示すように、ＢＰＤＣＮ症例では、少なくともダコ社のプローブでは検出できない再構成が含まれていた。８ｑ２４の再構成をＢＰＤＣＮ細分類に寄与する診断マーカーとして使用する場合には、広い領域をカバーするプローブを使用する必要がある。すなわち、ここで用いた最もテロメア側のプローブであるＣＴＤ－２５２７Ｎ１２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｏｎｅ／５７２５４／より配列情報等は入手可能である。）を用いることが、ＢＰＤＣＮの８ｑ２４染色体の再構成を検出するためには必要である。プローブとしては、ＣＴＤ－２５２７Ｎ１２の配列の全長を用いる必要はなく、少なくともＣＴＤ－２５２７Ｎ１２の連続した２０ｂｐを含む配列であって、ＣＴＤ－２５２７Ｎ１２と特異的にハイブリダイズする核酸であればよい。

【0040】

また、セントロメア側のプローブとしては、ＭＹＣ遺伝子の上流側の領域に位置するものであれば、どのようなプローブを用いてもよい。そのようなプローブとしては、ここで用いた５つのプローブ、ＲＰ１１－１５３Ｂ５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｏｎｅ／２２１３８３／より配列情報等は入手可能である。）、ＲＰ１１－７３９Ｇ１５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｏｎｅ／２８３７６９／より配列情報は入手可能である。）、ＣＴＤ－２５３０Ｅ１２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｏｎｅ／５８０９４／より配列情報は入手可能である。）ＣＴＤ－２３１３Ｌ９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｏｎｅ／２５１７５／より配列情報等は入手可能である。）、ＣＴＤ－３０６６Ｄ１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｏｎｅ／１２９３３２／より配列情報は入手可能である）の領域内の連続した２０ｂｐを含む任意の配列を用いてもよいし、よりセントロメア側に位置する領域をプローブとして用いてもよい。

【0041】

ＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ陽性例は４１例、陰性例は６３例、ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ例は３例であった（図２、ＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ、参照）。

【0042】

５．ＭＹＣ総合分類と細胞形態との相関
ＭＹＣに関する総合分類（ＭＹＣ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として、ＭＹＣ免疫染色陽性かつ、ＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ陽性の場合をＭＹＣ陽性（ＭＹＣ＋）群、ＭＹＣ免疫染色陰性かつＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ陰性の場合をＭＹＣ陰性（ＭＹＣ－）群と定義した。どちらにもあてはまらない症例は、ＭＹＣ ａｔｙｐｉｃａｌ（ＭＹＣａ）群とした。

【0043】

１１５例中９例では残余検体の不足によりＭＹＣについては評価不能であった。評価可能であった１０６例では、ＭＹＣ＋群が３８例（３６％）、ＭＹＣ－群が５９例（５６％）、ＭＹＣａ群が９例（８％）であった（図２、ＭＹＣ ｃｌａｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、参照。）。

【0044】

細胞形態による分類と、ＭＹＣによる分類について表１にまとめた。ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群はＭＹＣ評価不能の２例を除いて全例ＭＹＣ＋群（３６／３６、１００％）であった。一方、ｃｌａｓｓｉｃａｌ群はＭＹＣａであった３例以外全例ＭＹＣ－群であり（５４／５７、９５％）、ＭＹＣの異常の有無と細胞形態は強く相関していた（Ｐ＜０．０００１）。細胞形態が ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ群であった１４例については、２例がＭＹＣ＋、５例がＭＹＣ－、６例がＭＹＣａ、１例がＭＹＣ評価不能であった。図４にＭＹＣ＋（ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ）群、ＭＹＣ－（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）群の典型的なＨＥ染色像、及びＭＹＣ免疫染色像を示す。

【0045】

【表1】

【0046】

表１、図２に示すように、ＨＥ染色でｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群に分類された検体のうち、ＭＹＣの総合評価が可能であった３６症例はすべてＭＹＣ＋群であった。一方、ＨＥ染色でｃｌａｓｓｉｃａｌ群に分類された５７症例は、３例を除きＭＹＣ－群であった。

【0047】

ＭＹＣａ群に分類された９例の内訳を示す。ＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ陽性だがＭＹＣ免疫染色はｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓであった症例が３例で、うち２例はｃｌａｓｓｉｃａｌ ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ、１例はｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙを示していた。ＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ解析およびＭＹＣ免疫染色においてｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓであった症例が３例あり、２例がｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ、１例がａｔｙｐｉｃａｌ ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙを示した。３例はＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨは陰性だがＭＹＣ免疫染色で２０から３０％の腫瘍細胞が陽性となった症例で、いずれも細胞形態はｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅであった。

【0048】

上記解析結果をまとめると、ＢＰＤＣＮでは、ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ様の細胞形態、ＭＹＣ発現の増強、８ｑ２４の染色体再構成が非常によく相関していることが明らかとなった（図２参照。）。

【0049】

６．ＭＹＣ＋群とＭＹＣ－群の比較検討
ＭＹＣ＋群とＭＹＣ－群の年齢、性別、初回治療（化学療法、放射線治療）、病変部位、皮膚病変の正常、分布、末梢血所見などの患者背景を比較したところ、年齢、肝臓病変の有無、ヘモグロビン値、皮膚病変の性状、造血幹細胞移植の施行率に有意な差が見られた（表２）。年齢中央値を比較すると、ＭＹＣ＋群が７１歳（３７～８３歳）、ＭＹＣ－群が６４歳（３～８８歳）とＭＹＣ＋群の方が有意に高かった（Ｐ＝０．０２２）。１８歳未満の小児例はＭＹＣ－群に５例含まれたが、ＭＹＣ＋群にはみられなかった。このように、ＭＹＣ＋群とＭＹＣ－群の間では患者年齢にも違いがあることが明らかとなった。

【0050】

また、ＭＹＣ＋群とＭＹＣ－群で予後を比較した場合、生存期間に有意差を認めないものの、初回治療による寛解到達率に有意差が認められた。今回のコホートには臨床経過について不明な症例も含まれており、ＢＰＤＣＮと分類した１１５例のうち初回治療内容が判明していたのは９７例、治療効果が判明していたのは８５例であった。生存期間は９８例で判明しており、生存期間中央値は３６６日、２年生存率は５３．３％であった。初回治療で部分寛解（ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＰＲ）以上となった症例が６９例（８１％）、完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＣＲ）となった症例が５０例（５９％）であった。ＰＲ以上となったものの再発した症例が３８例（３８／６５例、５８％）で、診断から再発までの日数が判明していた３２例での中央値は２０３日（７７－３６５０日）であった。造血幹細胞移植を施行された症例は有意に生存期間が長く（Ｐ＜０．０００１）、移植可能な症例は長期予後が期待できると考えられた。

【0051】

ＭＹＣ＋群とＭＹＣ－群とで生存期間を比較すると有意差は認められなかった。しかし、ＣＲ到達の有無が判明していた症例はＭＹＣ＋群で３０例、ＭＹＣ－群で３８例あり、ＣＲ到達例はそれぞれ１４例（４７％）、２８例（７４％）で、ＭＹＣ＋群に比してＭＹＣ－群ではＣＲ到達率が有意に高かった（Ｐ＝０．０２７）。ＰＲ到達率もＭＹＣ＋群で２０／３０例（６６％）、ＭＹＣ－群で３７／４２例（８８％）と、ＭＹＣ－群で有意に高かった（Ｐ＝０．０３９）。

【0052】

【表2】

【0053】

また、病変部位は肝臓以外には有意な違いはなかったが、ＭＹＣ+群では、３３症例中、肝臓病変は１例も見られなかったのに対し、ＭＹＣ－群では４７症例中６例で肝臓に病変が見られた。ヘモグロビン値は、ＭＹＣ＋群で中央値１３．５ｇ／ｄｌ（１０～１５．７ｇ/ｄｌ）であるのに対し、ＭＹＣ－群では、１２．２ｇ／ｄｌ（４．７～１６．３ｇ／ｄｌ）とより低い傾向にあった。その他の末梢血所見に有意差はみられなかった。

【0054】

さらに、ＭＹＣ＋群と－群で皮膚病変の性状・分布に違いが認められた。皮膚病変の性状は、ＭＹＣ＋群は腫瘤性病変が２９例（８１％）と多かったのに対し、ＭＹＣ－群では紅斑・局面のみあるいは混在性の症例が半数以上認められた（Ｐ＝０．００１７）。皮膚病変の分布にも違いがみられ、ＭＹＣ＋群は局所性病変が２９例（７８％）で多かったのに対し、ＭＹＣ－群は全身性病変が３０例（６５％）で多かった（Ｐ＝０．０００１）。経過中に造血幹細胞移植を受けた症例は、ＭＹＣ＋群では３例（８．８％）であったのに対し、ＭＹＣ－群では１５例（３３％）で有意にＭＹＣ－群に多かった（Ｐ＝０．０１５）。

【0055】

細胞形態が通常と異なるｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ群では、ＢＰＤＣＮの診断を確認するため、ＢＰＤＣＮに特異性の高いマーカーとして知られているＣＤ２ＡＰ（非特許文献９）、ＢＣＬ１１Ａ（非特許文献１０）についても一部の症例で評価したが、検索した全例で２マーカーとも陽性であった（ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群で７例、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ群で４例確認）。その他、ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｒｋｅｒであるＣＤ３、ＣＤ２０、ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＭＰＯ）、ｌｙｓｏｚｙｍｅ陽性例は認めなかった。

【0056】

免疫組織学的マーカーについてＭＹＣ＋群とＭＹＣ－群で比較すると、ＭＹＣ－群ではＣＤ５６が５８／５９例（９８％）陽性であったのに対し、ＭＹＣ＋群では３２／３８例（８４％）の陽性率にとどまり、有意差を認めた（Ｐ＝０．０１４）。また、ＭＹＣ＋群ではＣＤ１０が１０／２９例（３４％）で陽性であったのに対し、ＭＹＣ－群では２／３１例（６％）のみが陽性であった（Ｐ＝０．００９３）。詳細な結果を表３にまとめた。

【0057】

【表3】

【0058】

７．染色体構造異常について
次に染色体解析（Ｇ分染法）の結果をまとめた。染色体解析の結果は５７例で得られており、ＭＹＣ＋群では１７／２０例（８５％）、ＭＹＣ－群では１１／３０例（３７％）、ＭＹＣａでは１／４例（２５％）、ＭＹＣ評価不能例では２／３例、合計３１例（５４％）で何らかの異常が検出された。５７例の染色体解析結果を表４に示す。なお、Ｇ分染法は常法により行っている。

【0059】

【表4】

【0060】

染色体異常が検出された症例の割合について、ＭＹＣ＋群とＭＹＣ－群の間で有意差がみられた（Ｐ＝０．００１２）。検出された染色体異常について集計すると、１２ｐ１１．１の付加染色体が７例（７／５７、１２％）で最も多く検出され、１３番染色体欠失，９番染色体欠失，１５番染色体欠失、ｔ（６；８）（ｐ２１；ｑ２４）（もしくは６ｐ２１と８ｑ２４の付加染色体）がそれぞれ６例（６／５７、１１％）でそれに続いた。ＭＹＣ＋群では結果の得られた１９例中１２例でＭＹＣの遺伝子座である８ｑ２４を含む異常が検出されていた。これら１２例で８ｑ２４と再構成を起こしている染色体に注目すると、ｔ（６；８）（ｐ２１；ｑ２４）あるいは双方の付加染色体を含む症例が６例で最も多く、ｔ（８；９）（ｑ２４；ｑ３４）を含む症例が２例、ｔ（６；８）（ｐ１２；ｑ２４）とｔ（８；２２）（ｑ２４；ｑ１１．２）を含む症例がそれぞれ１例認められた。

【0061】

８ｑ２４の切断点は前述のごとく一定していなかったが、その最頻融合パートナーである６ｐ２１の切断点も一定でなかった。ＳＵＰＴＨ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨの解析結果を図５に示す。図５中、斜線で示した２つの領域は、本発明で用いたＳＵＰＴＨ（緑）のプローブの位置、白で示した２つの領域はＳＵＰＴＨ（青）のプローブの位置、黒で示した３つの領域はＳＵＰＴＨ（赤）のプローブの位置を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅはゲノム上の切断点を示す。

【0062】

ＭＹＣ＋群のうち３６例でＳＵＰＴ３Ｈ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ解析を行ったところ、染色体解析でｔ（６；８）（ｐ２１；ｑ２４）を認めた６例の他、ｔ（６；８）（ｐ１２；ｑ２４）を認めた１例、染色体解析結果が得られなかった１０例、再構成の相手が不明であった２例でＳＵＰＴ３Ｈ ｓｐｌｉｔ陽性であった。よって、合計１９例がＳＵＰＴ３Ｈ ｓｐｌｉｔ陽性（１９／３６、５３％）であった。なお、ＭＹＣ－群でも８ｑ２４を含む染色体異常は３例で認めたが、いずれもＭＹＣ ｓｐｌｉｔ ＦＩＳＨ陰性であったことからＭＹＣ遺伝子とは関連しないものと考えられた。ＭＹＣａ症例では１例、１６／２０細胞で８ｑ２４への付加染色体を認め、９ｑ３４への付加染色体も伴っていた。

【0063】

８．ＭＹＣ発現を抑制する薬剤の効果
ＢＰＤＣＮが、ＭＹＣ発現によって、大別されることから、ＭＹＣ発現を抑制することによって、ＢＰＤＣＮのＭＹＣ＋群（細胞形態ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄ群）の増殖が抑制できる可能性がある。そこで、ＭＹＣ高発現のＢＰＤＣＮ培養細胞を用いて解析を行った。

【0064】

用いた細胞株は、ＢＰＤＣＮ細胞株であるＣＡＬ－１（ＭＹＣ＋群、非特許文献１１、長崎大学より入手）、ＰＭＤＣ０５（ＭＹＣ－群、非特許文献１２、新潟大学より入手）、陽性コントロールとしてＭＹＣ発現が増強している形質細胞性腫瘍ＫＭＳ１２ＰＥ（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）、陰性コントロールとしてＭＹＣ遺伝子再構成が見られない白血病細胞株Ｋ５６２（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）の４種である。

【0065】

ＣＡＬ－１、ＰＭＤＣ０５、ＫＭＮ１２ＰＥ細胞は、４０００細胞／ｗｅｌｌ、Ｋ５６２は１０００細胞／ｗｅｌｌとなるように９６穴細胞培養プレートに播種し、ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地にＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤であるＪＱ１（アブカム社製）、Ｉ－ＢＥＴ１５１（ＣｈｅｍｉｅＴｅｋ社製）、Ｉ－ＢＥＴ７６２（ＣｈｅｍｉｅＴｅｋ社製）、ＯＴＸ０１５（セレック社製）を６．２５ｎＭ～６４００ｎＭまで、ＣＰＩ２０３（ケイマンケミカル社製）、ＰＦＩ－１（ケイマンケミカル社製）を１ｎｍ～１００００ｎＭまで添加して４８時間後の細胞の生存率を解析した。細胞生存率はＣＴＧ試薬を用いた細胞増殖アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ、プロメガ社製）により測定した。

【0066】

図６に示すように、ＭＹＣ＋群に属するＢＰＤＣＮ細胞株ＣＡＬ－１はＪＱ１を添加した場合、１５０ｎＭを超すと生存率が急激に減少する。これに対し、ＭＹＣ－群に属するＰＭＤＣ０５は陰性コントロールであるＫ５６２同様、１０００ｎＭ以上の高濃度のＪＱ１を添加しても高い生存率を示す。Ｉ－ＢＥＴ１５１、Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＯＴＸ０１５、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ－１を用いた場合も、ＣＡＬ－１細胞株ではＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤であるこれら化合物の添加に伴って鋭敏な生存率の低下が生じる。一方、ＰＭＤＣ０５は高濃度のＩ－ＢＥＴ１５１、Ｉ－ＢＥＴ７６２、ＯＴＸ０１５、ＣＰＩ２０３、ＰＦＩ－１を添加しても高い生存率を示した。

【0067】

ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤の添加がＭＹＣ発現を減少させていることを確認するために、ＣＡＬ－１細胞にＪＱ１を４００ｎＭ添加してＭＹＣ発現の程度を免疫染色法により時間経過を追って解析した。図７に示すように、ＭＹＣ発現が時間経過に伴って低下するのが観察された。ＪＱ１添加時（０時間）、６時間後、２４時間後、４８時間後にＭＹＣ陽性を示す細胞の割合は、夫々約９５％、６０％、１５％、０％であった。細胞生存率の低下とＭＹＣ発現量の低下は良い相関が見られた。

【0068】

次に、ＭＹＣ+群に属するＢＰＤＣＮ細胞株ＣＡＬ－１、ＭＹＣ－群に属するＰＭＤＣ０５を用い、ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤添加後のＭＹＣ発現をウェスタンブロット法により解析した。

【0069】

ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤であるＪＱ１（４００ｎＭ）、Ｉ－ＢＥＴ１５１（１０００ｎＭ）、Ｉ－ＢＥＴ７６２（２０００ｎＭ）、ＯＴＸ０１５（１０００ｎＭ）をそれぞれ添加して２時間培養した細胞でのＭＹＣの発現量をウェスタンブロット法にて確認した。

【0070】

１次抗体は抗ｃＭｙｃラビットモノクローナル（アブカム社製）、コントロールとして抗ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体（ミリポア社製）、２次抗体は、ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（ロバ、アマシャム社製）を用いた。発色はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （ピアス サーモサイエンティフィック社製）を用いた。結果を図８に示す。

【0071】

ＣＡＬ－１において４種のＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤のいずれにおいてもＭＹＣの著しい減少が確認された。なお、ＰＭＤＣ０５細胞ではＪＱ１未処理の時点からＭＹＣの発現が確認できないレベルであった。

【0072】

上述のように、ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤を培地に添加することによって細胞増殖が抑制されることを示したが、次にどのような機構で細胞増殖が抑制されるか解析を行った。ＣＡＬ－１、ＰＭＤＣ０５、ＫＭＳ１２ＰＥ、Ｋ５６２細胞にＪＱ１を添加し、２４時間後に細胞を回収し、ＭＹＣ発現、及びアポトーシスによる細胞死の指標であるＰＡＲＰの切断をウェスタンブロット法により解析した。抗ＰＡＲＰ抗体はセルシグナリング社より得た。

【0073】

図９に示すように、ＪＱ１を４００ｎＭ添加２４時間後には、ＣＡＬ－１、ＫＭＳ１２ＰＥ細胞では未処理の細胞に比べＭＹＣの発現が著しく減少しており、アポトーシスによる細胞死の指標であるＰＡＲＰ切断の増加が認められた。一方で、ＪＱ１感受性の低いＰＭＤＣ０５細胞やＫ５６２細胞ではＰＡＲＰ切断の増加は認められなかった。すなわち、ＭＹＣ+群に属するＢＰＤＣＮ細胞株ＣＡＬ－１ではアポトーシスが誘導され、細胞死が惹起されていることが明らかとなった。

【0074】

以上、示したようにＭＹＣ＋のＢＰＤＣＮ細胞では、ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤によって、ＭＹＣの発現低下が起こり、アポトーシスが誘導され、細胞の生存率の低下が生じた。これは、ＢＥＴブロモドメイン選択的阻害剤を用いることによって、ＭＹＣ+群、すなわち、８ｑ２４の再構成、ＭＹＣ発現、ｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｏｉｄの形態学的マーカーを示すＢＰＤＣＮ症例を治療できる可能性を示している。また、図６～９に示すように、ＭＹＣ発現の低下に呼応して、細胞生存率が低下していることは、ＭＹＣ発現を低下させることができる他の薬剤、あるいは、ＭＹＣの機能やシグナル伝達経路を阻害する他の薬剤も使用できることを示唆している。

【0075】

９．他の薬剤の効果
オーロラキナーゼの発現亢進は、白血病などの造血器腫瘍で認められており、ＭＹＣの過剰発現を認める腫瘍細胞でＭＹＣ過剰発現とオーロラキナーゼ阻害薬の合成致死性を示す報告（非特許文献１３）や、肝細胞癌においてＭＹＣとオーロラＡキナーゼのタンパク質相互作用をオーロラＡ阻害薬で阻害するとＭＹＣの分解と細胞死が誘導されることが示されている（非特許文献１４）。

【0076】

ＭＹＣ発現を直接抑制する薬剤ではないが、オーロラキナーゼ阻害剤の効果について解析を行った。オーロラＡキナーゼ選択的阻害剤であるアリセルチブ（セレック社製）、オーロラＢキナーゼ選択的阻害剤であるバラセルチブ（アドーク バイオサイエンス社製）の効果を、上記と同様にＢＰＤＣＮ細胞株であるＣＡＬ－１（ＭＹＣ＋群）、ＰＭＤＣ０５（ＭＹＣ－群）、ＭＹＣ発現が増強している形質細胞性腫瘍ＫＭＳ１２ＰＥ（陽性コントロール）、ＭＹＣ遺伝子再構成が見られない白血病細胞株Ｋ５６２（陰性コントロール）の４種を用いて解析した。各細胞の培地に各阻害剤を１ｎｍ～１００００ｎＭまで添加し、４８時間後の細胞の生存率を解析した（図１０）。

【0077】

アリセルチブ、バラセルチブともに、ＰＭＤＣ０５細胞株に比べ、ＭＹＣ高発現細胞であるＣＡＬ－１細胞株に対して高い増殖抑制阻害作用を示した。したがって、オーロラキナーゼ阻害剤をＢＰＤＣＮの治療に用いる場合には、ＭＹＣ発現や染色体の再構成がオーロラキナーゼ阻害剤に対する反応性を判断するバイオマーカーになると考えられる。

【0078】

さらに、ＢＰＤＣＮ細胞株の増殖抑制に対して効果を示す薬剤に対する検討を行った。ＨＤＡＣ阻害剤であるボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ、セレック社製）、パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ、セレック社製）、ＢＣＬ２ファミリータンパク質阻害剤であるベネトクラックス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＬＫＴ ラボラトリーズ社製）について検討を行った。上記４種の細胞株に各阻害剤を１ｎｍ～１００００ｎＭまで添加し、４８時間後の細胞の生存率を解析した（図１１）。いずれの阻害剤もＭＹＣ発現の有無とは相関しないものの、ＢＰＤＣＮ細胞株に対して強い阻害効果を示すことが明らかとなった。これら薬剤は現在治療法が限られているＢＰＤＣＮに対する治療薬となる可能性を有している。

【0079】

本発明者らは、独立した疾患であると考えられていたＢＰＤＣＮが、細胞の形態、８ｑ２４の再構成、ＭＹＣ発現によって、細分化し得る疾患であることを明らかにした。また、ＭＹＣ発現群の腫瘍に対しては、ＭＹＣ発現を直接的又は間接的に阻害する阻害剤が治療薬となることから、細胞の形態等、新たなバイオマーカーを診断基準とし治療を行うことが可能となった。また、ＭＹＣ異常の有無にかかわらず、ＢＰＤＣＮでＨＤＡＣ阻害剤、ＢＣＬ２ファミリータンパク質阻害剤が有効であることも示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】