ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人弘前大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 国立大学法人弘前大学の特許一覧 ▶ 国立大学法人長岡技術科学大学の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-02
(45)【発行日】2022-06-10
(54)【発明の名称】ムコン酸産生形質転換微生物及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20220603BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20220603BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220603BHJP
C12P 7/44 20060101ALI20220603BHJP
C12R 1/40 20060101ALN20220603BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
C12N15/52 Z
C12N1/21
C12P7/44
C12R1:40
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2017182566
(22)【出願日】2017-09-22
(65)【公開番号】P2018183131
(43)【公開日】2018-11-22
【審査請求日】2020-07-20
(31)【優先権主張番号】P 2017086589
(32)【優先日】2017-04-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業ＡＬＣＡ「糖質に依存しないムコン酸のバイオ生産」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504229284
【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学
(73)【特許権者】
【識別番号】304021288
【氏名又は名称】国立大学法人長岡技術科学大学
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】園木 和典
(72)【発明者】
【氏名】政井 英司
(72)【発明者】
【氏名】上村 直史
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１０６２５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００７－５３５９２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５２２９９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Appl. Microbiol. Biotechnol.，2015年，Vol.99，p.5217-5225
【文献】リグニン由来フェノール類を原料としたムコン酸生産，日本農芸化学会大会講演要旨集，2016年，発表番号2A028
【文献】Metabolic Engineering Communications，2016年，Vol.3，p.111-119
【文献】Metabolic Engineering，2015年，Vol.28，p.240-247
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ１／００－４１／００
Ｃ１２Ｎ１／００－７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子、該ｐｃａＧ遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、
挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、
形質転換微生物であって、
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子、挿入された前記ｐｃａＨ遺伝子及び前記ｐｃａＧ遺伝子は、宿主微生物の染色体に導入せずに、自律的に増幅するＤＮＡコンストラクトに含まれ、
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子は、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼを発現し、かつ配列番号４２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であり、
挿入された前記ｐｃａＨ遺伝子は、プロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼのβサブユニットを発現し、かつ配列番号３８のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であり、かつ
挿入された前記ｐｃａＧ遺伝子は、プロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼのαサブユニットを発現し、かつ配列番号３９のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子である、
前記形質転換微生物。
【請求項2】
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子と、挿入された前記ｐｃａＨ遺伝子及び前記ｐｃａＧ遺伝子とは、同一プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項3】
前記宿主微生物がさらに染色体上にｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を有するシュードモナス属微生物である、請求項１～２のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項4】
前記宿主微生物がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項5】
ｐ－ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を含む、ムコン酸の製造方法。
【請求項6】
前記工程が、溶存酸素濃度が１～１３％である条件下で、ｐ－ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程である、請求項５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ムコン酸が生産可能な形質転換微生物及び該形質微生物を利用したムコン酸の製造方法に関する。特に、本発明は、リグニン由来の芳香族化合物を単一炭素源として増殖及びムコン酸の生産が可能な形質転換微生物に関する。
【背景技術】
【0002】
リグニンは植物の維管束細胞壁成分として存在する無定形高分子物質であって、フェニルプロパン系の構成単位が複雑に縮合したものであり、メトキシ基を含有することが化学構造上の大きな特徴になっている。リグニンは木質化した植物細胞を相互に膠着し、組織を強化する働きをしており、木材中に約１８～３６％、草本中には約１５～２５％存在する。そこで、木材を有効利用するために、リグニンを分解し、有用化合物を得ようとする試みが種々なされている。
【0003】
一方、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸（以下、単にムコン酸とよぶ場合がある。）は、分子内に二重結合及びカルボキシ基が２個あることにより、反応性が高い化合物である。ムコン酸を出発物質とする種々のムコン酸誘導体が知られており、例えば、ラクトン、スルホン、ポリアミド、ポリエステル、チオエステル、付加ポリマーなどが挙げられる。このようなムコン酸誘導体は、様々な用途を有するものとして知られており、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などとして使用され得る。
【0004】
このように、ムコン酸は、ムコン酸誘導体の形で種々の用途に供されるところ、リグニンからムコン酸を製造することができれば、資源の再生が達成され、非常に有用である。そこで、リグニン又はリグニンに由来する物質から、ムコン酸を製造する方法が試みられている。特にこのような方法として、微生物を用いたバイオコンバージョンが研究されている。
【0005】
例えば、非特許文献１には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）を宿主微生物として、染色体上のｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子（以下、合わせてｐｃａＨＧ遺伝子とよぶ場合がある。）並びにｃａｔＲ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｃａｔＣ遺伝子およびｃａｔＡ遺伝子を破壊し、かつ、挿入したｃａｔＡ遺伝子とａｒｏＹ遺伝子とを、又はｃａｔＡ遺伝子とａｒｏＹ遺伝子とｅｃｄＢ遺伝子とを発現する形質転換微生物を作製し、該形質転換微生物をグルコースにより増殖させ、次いでｐ－クマル酸によりムコン酸を製造したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】C.W. Johnson et al., Metabolic Engineering Communications, 3, 111-119, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
確かに、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いることにより、ｐ－クマル酸からムコン酸を製造することができる。しかし、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、増殖のための炭素源として高価なグルコースを要求することから、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いるムコン酸の製造方法は経済性が悪いという問題がある。また、菌体増殖のためのグルコースと、ムコン酸生産の基質としてのｐ－クマル酸というように二種以上の炭素源が求められることから、これらの炭素源の総量を基準にして考えれば、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いるムコン酸の製造方法はムコン酸の収率が悪いという問題がある。
【0008】
そこで、本発明は、経済性が良好であり、かつ、収率が高いムコン酸の製造を可能にする微生物及び該微生物を利用したムコン酸の製造方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題の解決を試みようとして、まずは収率が高いムコン酸生産微生物について鋭意検討した。
【0010】
図１に、非特許文献１に記載の形質転換微生物の代謝経路を示す。図１に示すように、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、宿主微生物がプロトカテク酸・３，４－環開裂経路を経た分解を行うシュードモナス・プチダである。このことより、非特許文献１に記載の形質転換微生物によって効率よくムコン酸を製造しようとした場合、宿主微生物の染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を欠失させ、さらに挿入したａｒｏＹ遺伝子を発現させなければならない。こうすることによってはじめて、ｐ－クマル酸などのリグニン由来の芳香族化合物をプロトカテク酸に一旦は収束して、ムコン酸へと変換することができるようになる。
【0011】
しかし、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子を欠失していることから、微生物の増殖のために、グルコースなどのリグニン由来の芳香族化合物以外の基質を必要とする。したがって、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、外見上は、リグニン由来の芳香族化合物からムコン酸を製造する方法として収率が高い方法であるようにみえるが、実際の収率の計算では増殖用基質の量も加味しなければならず、結果として非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いる方法は、ムコン酸の製造方法として収率の低い方法である。
【0012】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を重ねたところ、宿主微生物の染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を破壊した後、別途、外来遺伝子として挿入したｐｃａＨＧ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を過剰発現する形質転換微生物を創作することに成功した。そして、驚くべきことに、本発明者らが作製した形質転換微生物は、グルコースを用いなくとも、リグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖しつつ、ムコン酸を製造し得ることを見出した。このようにして、本発明者らは、本発明者らが作製した形質転換微生物を用いて、リグニン由来の芳香族化合物からムコン酸を製造する方法を創作することに成功した。
【0013】
さらに驚くべきことに、本発明者らが作製した形質転換微生物を用いる方法は、リグニン由来の芳香族化合物を唯一の炭素源として用いながらも、グルコース及びリグニン由来の芳香族化合物を基質として必要とする非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いる方法と比べて、ムコン酸の収率について同程度又はそれ以上であることを見出した。
【0014】
リグニン由来の芳香族化合物は、廃資材などのバイオマスから得ることができ、グルコースと比べて非常に安価である。したがって、本発明者らが作製した形質転換微生物を用いるムコン酸の製造方法は、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いる方法と比べて経済的に有利な方法である。本発明は、これらの知見及び成功例に基づき完成された発明である。
【0015】
したがって、本発明の一態様によれば、以下の（１）～（４）の形質転換微生物が提供される。
（１）宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子、該ｐｃａＧ遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、
挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
（２）挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子と、挿入された前記ｐｃａＨ遺伝子及び前記ｐｃａＧ遺伝子とは、同一プロモーターの制御下にある、（１）に記載の形質転換微生物。
（３）前記宿主微生物がさらに染色体上にｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を有するシュードモナス属微生物である、（１）～（２）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
（４）前記宿主微生物がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
（１）宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子、該ｐｃａＧ遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、
挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
（２）挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子と、挿入された前記ｐｃａＨ遺伝子及び前記ｐｃａＧ遺伝子とは、同一プロモーターの制御下にある、（１）に記載の形質転換微生物。
（３）前記宿主微生物がさらに染色体上にｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を有するシュードモナス属微生物である、（１）～（２）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
（４）前記宿主微生物がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【0016】
本発明の別の一態様によれば、以下（５）及び（６）のムコン酸の製造方法が提供される。
（５）ｐ－ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、（１）～（４）のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程
を含む、ムコン酸の製造方法。
（６）前記工程が、溶存酸素濃度が１～１３％である条件下で、ｐ－ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程である、（５）に記載の製造方法。
（５）ｐ－ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、（１）～（４）のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程
を含む、ムコン酸の製造方法。
（６）前記工程が、溶存酸素濃度が１～１３％である条件下で、ｐ－ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、請求項１～４のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程である、（５）に記載の製造方法。
【0017】
本発明の別の一態様によれば、以下（７）の組換えベクターが提供される。
（７）ａｒｏＹ遺伝子と、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子とを含む組換えベクター。
（７）ａｒｏＹ遺伝子と、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子とを含む組換えベクター。
【発明の効果】
【0018】
本発明の一態様の形質転換微生物及び本発明の一態様のムコン酸の製造方法によれば、従前の微生物を用いる方法と比べて、安価かつ収率を維持又は改善して、ムコン酸を製造することができる。したがって、本発明の一態様の形質転換微生物及び本発明の一態様のムコン酸の製造方法によれば、リグニンを含むバイオマスの有効利用の一環として、工業的規模でのムコン酸の製造が期待できる。本発明の一態様の組換えベクターによれば、本発明の一態様の形質転換微生物の製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明の一態様である形質転換微生物、ムコン酸の製造方法及び組換えベクターの詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【0021】
（形質転換微生物の概要）
本発明の一態様である形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にある特定の遺伝子が欠失しており、かつ、外来遺伝子として挿入した特定の遺伝子を発現するように、宿主微生物を形質転換した微生物である。
本発明の一態様である形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にある特定の遺伝子が欠失しており、かつ、外来遺伝子として挿入した特定の遺伝子を発現するように、宿主微生物を形質転換した微生物である。
【0022】
本明細書における「遺伝子の欠失」は、遺伝子が正常に転写されないこと、遺伝子の発現によって産生されるべきタンパク質が正常に翻訳されないことなどのように、遺伝子が正常に機能せずに遺伝子の発現が妨げられていることを意味する。遺伝子の欠失は、例えば、遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、挿入などにより遺伝子の構造が変化することによって生じ得る。ただし、遺伝子の欠失は、遺伝子の構造に変化が生じずに、例えば、遺伝子の制御領域をブロックするなどの手段によって遺伝子の発現が抑えられることによっても生じ得る。
【0023】
本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質が本来の構造や活性を有する態様で生産されることを意味する。また、本明細書における「遺伝子の過剰発現」とは、遺伝子が挿入されたことにより、宿主微生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質が生産されることを意味する。
【0024】
（欠失又は挿入する遺伝子）
形質転換微生物について、宿主微生物は染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有する。これらの遺伝子のうち、形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失している。形質転換微生物について、宿主微生物は染色体上に本来有するｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子の両方が欠失していることが好ましいが、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子のいずれか一方が欠失していればよいという蓋然性がある。
形質転換微生物について、宿主微生物は染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有する。これらの遺伝子のうち、形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失している。形質転換微生物について、宿主微生物は染色体上に本来有するｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子の両方が欠失していることが好ましいが、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子のいずれか一方が欠失していればよいという蓋然性がある。
【0025】
ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子は、それぞれプロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼのβサブユニット及びαサブユニットを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、それぞれ配列番号２９及び３０の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【0026】
ｃａｔＢ遺伝子は、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸・サイクロイソメラーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３２の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【0027】
ｃａｔＡ遺伝子は、カテコール・１，２－ジオキシゲナーゼ（Ｃａｔｅｃｈｏｌ １，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３１の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。カテコール・１，２－ジオキシゲナーゼ（ＥＣ １．１３．１１．１）は、１，２－ジヒドロキシベンゼン・１，２－ジオキシゲナーゼなどともよばれる。カテコール・１，２－ジオキシゲナーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） ＫＴ２４４０株が保有し、カテコールからｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸を生成する反応を触媒する活性を有し、Ｆｅ３＋を補因子として要求する。
【0028】
カテコール・１，２－ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ８８Ｉ３５）中にＩｎｔｒａｄｉｏｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅドメインを有する。該ドメインは ［ＬＩＶＭＦ］－ｘ－Ｇ－ｘ－［ＬＩＶＭ］－ｘ（４）－［ＧＳ］－ｘ（２）－［ＬＩＶＭＡ］－ｘ（４）－［ＬＩＶＭ］－［ＤＥ］－［ＬＩＶＭＦＹＣ］－ｘ（６）－Ｇ－ｘ－［ＦＹ］（Ｐｒｏｓｉｔｅ ｅｎｔｒｙ ｎｏ．Ｐ０００８３）からなり、配列中のＹが補因子であるＦｅ３＋の結合に関わる。カテコール・１，２－ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列中のＬ１３７からＹ１６５が上記ドメインに相当する。
【0029】
形質転換微生物は、挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現する。ただし、宿主微生物が染色体上に本来有するｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子の一方が欠失している場合は、その欠失した遺伝子を挿入して発現すればよいという蓋然性がある。形質転換微生物は、さらに挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する。
【0030】
ａｒｏＹ遺伝子は、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３３の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．６３）は、３，４－ジヒドロキシ安息香酸・カルボキシリアーゼ（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙ－ｌｙａｓｅ）ともよばれる。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼは、プロトカテク酸からカテコールを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。なお、３－Ｏ－メチルガリック酸から３－メトキシカテコールを生成する反応やガリック酸からピロガロールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素についても、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼとして使用できる可能性がある。また、バニリン酸脱炭酸酵素や４－ヒドロキシ安息香酸の脱炭酸酵素についても、プロトカテク酸を脱炭酸する可能性があることから、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼとして使用できる可能性がある。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼは、構造上は、ＵｂｉＤドメイン（Ｄｏｍａｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｈｔｕｒｅ ＩＤ １０４８７９５３）を含むタンパク質群（ＵｂｉＤスーパーファミリー）に分類される。
【0031】
プロトカテク酸・デカルボキシラーゼの具体例としては、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） Ａ１７０－４０株（ＡＴＣＣ ２５５９７株）に由来するタンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ４７９３８４；ＡＢ４７９３８４タンパク質）などが挙げられる。ＡＢ４７９３８４タンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＭＢＲＬ１０７７株由来のｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＭＪ７０６８６；配列同一性 ８７．２％）、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ ｅ１０２６株由来のｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＣＺＵ７６０２２；配列同一性 ８５．７％）などのｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅとして登録されているタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素は、補因子としてＭｎ２＋、プレニル化フラビン・モノヌクレオチド（ｐｒｅｎｙｌａｔｅｄ ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｐｒｅｎｙｌ－ＦＭＮ）を要求する一連の酵素群として特徴付けられる。
【0032】
形質転換微生物は、ｋｐｄＢ遺伝子を挿入したものであってもよい。ｋｐｄＢ遺伝子は、プロトカテク酸脱炭酸酵素の補因子であるプレニル－ＦＭＮの合成を行っていると想定されるタンパク質であり、一細胞内でプロトカテク酸脱炭酸酵素とともに発現することによってプレニル－ＦＭＮの供給が高まり、プロトカテク酸脱炭酸酵素活性が向上する蓋然性がある。そこで、ａｒｏＹ遺伝子とともにｋｐｄＢ遺伝子を発現させて脱炭酸活性を向上することができれば、ムコン酸の生産収率が上昇すると想定される。
【0033】
ｋｐｄＢ遺伝子は、フラビン・プレニルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有する４－ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢを発現する遺伝子であり、例えば、配列番号３４の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
【0034】
形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上に、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子に加えて、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の１種、２種又は３種全部の遺伝子を有することが好ましい。本明細書では、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子をまとめてｖａｎＡＢ遺伝子とよぶ場合がある。また、宿主微生物がｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及び／又はｖａｎＢ遺伝子を染色体上に有していない場合は、これらの遺伝子を発現するように形質転換微生物に挿入することが好ましい。さらに、形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上に、バニリン・デヒドロゲナーゼ（ｖｄｈ）遺伝子、ｐ－ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＰＰ＿１９４８）遺伝子及び／又はスフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ） ｓｐ．ＳＹＫ－６株由来のアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ｌｉｇＶ）遺伝子を有することが好ましい。また、宿主微生物がｖｄｈ遺伝子、ＰＰ＿１９４８遺伝子及び／又はｌｉｇＶ遺伝子を染色体上に有していない場合は、これらの遺伝子を発現するように形質転換微生物に挿入することが好ましい。
【0035】
ｐｏｂＡ遺伝子は、ｐ－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ（ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３５の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。ｐ－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ（ＥＣ １．１４．１３．２またはＥＣ １．１４．１３．３３）としては、例えば、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＰｏｂＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ８８Ｈ２８）などが挙げられる。
【0036】
ｖａｎＡ遺伝子は、バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３６の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【0037】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ＥＣ １．１４．１３．８２）としては、例えば、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ８８ＧＩ６）などが挙げられる。バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分は、Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔを介して供給されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子と、分子状酸素から供給される酸素原子とを利用して、バニリン酸のメチルエーテル結合を開裂し、プロトカテク酸、ホルムアルデヒド及び水を生成する。
【0038】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分は、そのアミノ酸配列中にＲｉｅｓｋｅ［２Ｆｅ－２Ｓ］ｉｒｏｎ－ｓｕｌｆｕｒ ｄｏｍａｉｎ（Ｗ７－Ｖ１０７，ＰＲＯＳＩＴＥ ｅｎｔｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１２９６）を有し、該ドメイン中のＣ及びＨ（Ｃ４７，Ｈ４９，Ｃ６６，Ｈ６９）がＦｅ－Ｓの結合に関わる。
【0039】
ｖａｎＢ遺伝子は、バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３７の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【0040】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分（ＥＣ １．１４．１３．８２）としては、例えば、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＢ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ８８ＧＩ５）などが挙げられる。バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子を抜き取り、酸素添加酵素（オキシゲナーゼ）へと伝達する酸化還元酵素の一つとして知られている。バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分はバニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分であるＶａｎＡにＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子を伝達する。
【0041】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、そのアミノ酸配列中に、２Ｆｅ－２Ｓ Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｔｙｐｅ ｉｒｏｎ－ｓｕｌｆｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（Ｇ２２９－Ｉ３１６、ＰＲＯＳＩＴＥ ｅｎｔｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１０８５）を有し、該アミノ酸配列中のＣ（Ｃ２６５、Ｃ２７０、Ｃ２７３、Ｃ３０３）がＦｅ－Ｓの結合に関わる。また、バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、そのアミノ酸配列中に、ＮＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（Ｌ１０９－Ｄ２０１，Ｐｆａｍ ｅｎｔｒｙ ｎｏ．ＰＦ００１７５）及びＦｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｔｙｐｅ ＦＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（Ｍ１－Ａ１０１、ＰＲＯＳＩＴＥ ｅｎｔｏｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１３８４）を有する。
【0042】
ｖｄｈ遺伝子はバニリン・デヒドロゲナーゼ（ｖａｎｉｌｌｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４３の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。バニリン・デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．６７）としては、例えば、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＶｄｈ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ８８ＨＪ９）などが挙げられる。
【0043】
ＰＰ＿１９４８遺伝子はｐ－ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４４の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。ｐ－ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．６４）としては、例えば、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のｐ－ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ８８ＬＩ４）、シュードモナス・プチダ ｍｔ－２株由来のｐ－ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＣ、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｐ４３５０３）などが挙げられる。
【0044】
ｌｉｇＶ遺伝子は、バニリン、ｐ－ヒドロキシベンズアルデヒド、シリンガアルデヒド、プロトカテクアルデヒド、ベンズアルデヒドなどの芳香族アルデヒド類を基質とするアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４５の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．－）としては、例えば、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ） ｓｐ．ＳＹＫ－６株由来のアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ２８７３３２）が挙げられる。
【0045】
挿入する遺伝子は、遺伝子を有する由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、少なくとも野生型遺伝子が発現するタンパク質（すなわち、野生型タンパク質）と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質を発現する遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどであってもよい。
【0046】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
【0047】
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
【0048】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ） 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社）、０．１％（ｗ／ｖ） Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
【0049】
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １－３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ場合がある。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
【0050】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【0051】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、野生型遺伝子の塩基配列において１から数個、好ましくは１から３００個、より好ましくは１から２００個、さらに好ましくは１から１００個、なおさらに好ましくは１から５０個、特に好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【0052】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ酵素活性を有するものである。
【0053】
野生型タンパク質と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１～１００個、好ましくは１～８０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【0054】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【0055】
野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
【0056】
（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
【0057】
２つの塩基配列やアミノ酸配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
【0058】
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版 ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０．１（ジェネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
【0059】
（挿入する遺伝子の由来）
挿入する遺伝子は、挿入する遺伝子を保有する微生物などに由来する。挿入する遺伝子の由来生物としては、例えば、プロトカテク酸からムコン酸を製造することができる微生物やプロトカテク酸を資化することによって増殖可能な微生物などが挙げられる。
挿入する遺伝子は、挿入する遺伝子を保有する微生物などに由来する。挿入する遺伝子の由来生物としては、例えば、プロトカテク酸からムコン酸を製造することができる微生物やプロトカテク酸を資化することによって増殖可能な微生物などが挙げられる。
【0060】
挿入する遺伝子の由来生物の具体例としては、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・アルカリゲネス、シュードモナス・シュードアルカリゲネス、シュードモナス・メンドシナ、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・セパシアといったシュードモナス属微生物やアシネトバクター・ベイリー、アシネトバクター・カルコアセチカスといったアシネトバクター属微生物など；ｃａｔＡ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・レイネケイといったシュードモナス属微生物やアシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・ラジオレシステンスといったアシネトバクター属微生物、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・ピリジニボラス、ロドコッカス・ロドクロウスなどロドコッカス属微生物など；ａｒｏＹ遺伝子についてはクレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・クアシニューモニエといったクレブシエラ属微生物やエンテロバクター・クロアカ、エンテロバクター・アエロゲネスといったエンテロバクター属微生物、セディメントバクター・ヒドロキシベンゾイカスなど；ｐｏｂＡ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・エルギノーサといったシュードモナス属微生物やアシネトバクター・ベイリー、アシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・バウマンニといったアシネトバクター属微生物、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・バリコラといったクレブシエラ属微生物など；ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・レジノボランス、シュードモナス・エルギノーサといったシュードモナス属微生物やコマモナス・テストステロニ、コマモナス・チオオキシダンスといったコマモナス属微生物、アセトバクタ―・パツツリアヌス、アセトバクタ―・アセチ、アセトバクタ―・トロピカリスといったアセトバクタ―属微生物など；ｖｄｈ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・シリンゲなどのシュードモナス属微生物、ロドコッカス・ジョスティ、ロドコッカス・エリスロポリスといったロドコッカス属微生物、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・セノセパシアといったバークホルデリア属微生物、スフィンゴビウム・スピーシーズといったスフィンゴビウム属微生物；ＰＰ＿１９４８遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・メンドシナ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・シリンゲなどのシュードモナス属微生物、スフィンゴビウム・ヤノイクヤエ、スフィンゴビウム・スピーシーズといったスフィンゴビウム属微生物、ロドコッカス・ジョスティ、ロドコッカス・エリスロポリスといったロドコッカス属微生物、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・セノセパシアといったバークホルデリア属微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
上記のとおり、挿入する遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換微生物において発現される遺伝子が宿主微生物の生育条件によって不活化せず、又は活性を示すために、遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主微生物や宿主微生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
【0062】
（遺伝子工学的手法による遺伝子のクローニング）
欠失及び挿入する遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主微生物に導入して、遺伝子を欠失した、又は遺伝子を挿入した形質転換体（形質転換微生物）を作製できる。欠失する遺伝子は野生型遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、挿入などにより遺伝子の構造が変化したものであることが好ましい。挿入する遺伝子は、野生型遺伝子と同一又は近似するタンパク質を発現する遺伝子であることが好ましい。
欠失及び挿入する遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主微生物に導入して、遺伝子を欠失した、又は遺伝子を挿入した形質転換体（形質転換微生物）を作製できる。欠失する遺伝子は野生型遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、挿入などにより遺伝子の構造が変化したものであることが好ましい。挿入する遺伝子は、野生型遺伝子と同一又は近似するタンパク質を発現する遺伝子であることが好ましい。
【0063】
欠失及び挿入する遺伝子の取得方法、これらの遺伝子の塩基配列やこれらの遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列に関する情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換微生物の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。欠失及び挿入する遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
【0064】
例えば、欠失又は挿入する遺伝子に関連する野生型遺伝子を有する由来生物や種々の微生物から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【0065】
例えば、挿入する遺伝子は、該遺伝子に関連する野生型遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。野生型遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、遺伝子の種類によって、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株及びクレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ Ａ１７０－４０株などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットなどが利用できる。本明細書において、染色体ＤＮＡとゲノムＤＮＡとは同義である。
【0066】
次いで、染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、挿入する遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。その例としては、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を増幅するものとして、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株のゲノム配列を参考として設計した配列番号９及び１０で表されるプライマーなどが挙げられる。なお、このようなプライマーを用いると、目的遺伝子全長が増幅できる。別の方法として、ショットガンライブラリーからの目的遺伝子クローンのスクリーニングや、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることなどができる。
【0067】
また、欠失又は挿入する遺伝子を取得する方法は、上記したとおりに特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて遺伝子を構築することが可能である。
【0068】
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）などの公知又は市販のキット；ｐＵＣ４Ｋ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９、ｐ２５９－２６８、１９８２を参照）、ｐＥＸ１８Ａｍｐ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７－８６，１９９８を参照）、ｐＰＳ８５８（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７－８６，１９９８を参照）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社）、ｐＪＢ８６６（Ｐｌａｓｍｉｄ，ｖｏｌ．３８，ｐ３５－５１，１９９７を参照）、ｐＭＣＬ２００（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１６２，ｐ１５７－１５８，１９９５を参照）、ｐＱＥ３０（キアゲン社）、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）などの公知又は市販のプラスミドベクター；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの公知又は市販のバクテリオファージベクターなどが使用できる。
【0069】
構築した組換え体ＤＮＡを大量に得たい場合は、組換え体ＤＮＡを、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌 ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌 ＤＨ５α株（タカラバイオ社）などに導入して形質転換し、次いで得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製することができる。
【0070】
組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３などを参照）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ－ＣＯＲ ＭＯＤＥＬ ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社）、ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を知り得る。
【0071】
（遺伝子を含む組換えベクターの構築）
欠失又は挿入する遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、欠失又は挿入する遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、遺伝子の欠失又は発現が可能な形で結合することにより構築することができる。なお、欠失する遺伝子の場合は、組換えベクターを宿主微生物に導入して、相同組換えによって、組換えベクター中の遺伝子が宿主微生物中の遺伝子に置き換わるために、組換えベクターは欠失する遺伝子の上流及び下流の領域を含むことが好ましい。
欠失又は挿入する遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、欠失又は挿入する遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、遺伝子の欠失又は発現が可能な形で結合することにより構築することができる。なお、欠失する遺伝子の場合は、組換えベクターを宿主微生物に導入して、相同組換えによって、組換えベクター中の遺伝子が宿主微生物中の遺伝子に置き換わるために、組換えベクターは欠失する遺伝子の上流及び下流の領域を含むことが好ましい。
【0072】
非限定的な例として挿入する遺伝子を含む組換えベクターを作製する方法は、例えば、適当な制限酵素で挿入する遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドベクターとを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などの市販の組換えベクター作製キットなどを用いて連結することにより構築することができる。または、プラスミドベクターと相同的な配列を両末端に付加した遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
【0073】
欠失又は挿入する遺伝子を含む組換えベクターは、欠失又は挿入する遺伝子とプラスミドベクター由来の遺伝子（塩基配列）とを少なくとも含む。組換えベクターの一例であり、かつ、本発明の別の一態様として、ａｒｏＹ遺伝子、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を含む組換えベクターなどが挙げられる。本発明の一態様の組換えベクターは、本発明の一態様の形質転換微生物を作製するために使用される。本発明の一態様の組換えベクターは、ａｒｏＹ遺伝子とｐｃａＨＧ遺伝子とに加えて、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡＢ遺伝子、ｖｄｈ遺伝子及びＰＰ＿１９４８遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種、２種、３種又は４種の遺伝子を含むことができる。また、本発明の一態様の組換えベクターは、上記した遺伝子以外の遺伝子を、本発明の課題解決を妨げない限りに含むものであってもよい。
【0074】
本発明の一態様の組換えベクターは、異種遺伝子又は異種核酸配列を含むことが好ましい。異種遺伝子は宿主微生物に本来的に存在しない（ｎｏｔ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｉｎｇ）遺伝子であれば特に限定されず、例えば、宿主微生物由来の核酸配列に依拠しない合成遺伝子、挿入する遺伝子と由来生物が相違する生物に由来する遺伝子、宿主微生物と相違する他の微生物、植物、動物、ウイルスなどの生物に由来する遺伝子などが挙げられる。宿主微生物がシュードモナス属微生物である場合の異種遺伝子の具体例としては、ｐＵＣ１１８由来のＤＮＡ断片、例えば、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）などが挙げられるが、これに限定されない。
【0075】
本発明の一態様の組換えベクターの具体的態様は、後述する実施例に記載があるｐＴＳ１１０プラスミドベクター及びｐＴＳ１１９プラスミドベクターなどであるが、これらに限定されない。
【0076】
（形質転換微生物の作製方法）
形質転換微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、遺伝子の欠失又は挿入が実現する態様で宿主微生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、挿入する遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、挿入する遺伝子を発現する形質転換微生物が得られる。又は、欠失する遺伝子並びに該遺伝子の上流及び下流の領域を含むＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、遺伝子を欠失する形質転換微生物が得られる。本明細書では、宿主微生物を形質転換するために作製された組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
形質転換微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、遺伝子の欠失又は挿入が実現する態様で宿主微生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、挿入する遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、挿入する遺伝子を発現する形質転換微生物が得られる。又は、欠失する遺伝子並びに該遺伝子の上流及び下流の領域を含むＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、遺伝子を欠失する形質転換微生物が得られる。本明細書では、宿主微生物を形質転換するために作製された組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【0077】
ＤＮＡコンストラクトを宿主微生物に導入する方法は特に限定されないが、例えば、当業者に知られているとおりである、導入したＤＮＡコンストラクトが自律的に増殖して遺伝子を発現するように宿主微生物に導入する方法；相同組換えを利用することによりＤＮＡコンストラクトを宿主微生物の染色体上に直接的に挿入する方法などが挙げられる。
【0078】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを宿主微生物に導入する方法として、相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主微生物のゲノム中に挿入することができる。
【0079】
形質転換微生物の作製に用いられるベクター－宿主系は、宿主微生物中において、挿入する遺伝子が発現し得る、又は染色体上の遺伝子が欠失し得る系であれば特に限定されないが、例えば、ｐＪＢ８６６－シュードモナス属微生物の系、ｐＫＴ２３０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１６，ｐ２３７－２４７，１９８１）－シュードモナス属微生物の系などが挙げられる。
【0080】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトは、宿主微生物の染色体に導入しない形で、自律的に増幅して、挿入する遺伝子を発現しても、宿主微生物の染色体に導入した形で挿入する遺伝子を発現しても、どちらでもよい。
【0081】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ゲンタマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カルベニシリンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。マーカー遺伝子は、欠失する遺伝子の途中に、又は欠失する遺伝子に置換するように含まれていてもよい。
【0082】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトは、遺伝子の種類によっては、宿主微生物中で遺伝子を発現することを可能にするプロモーター及びターミネーターに加えて、その他の制御配列（例えば、オペレーターなどの転写制御に関わるシス配列など）を含むことができる。
【0083】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、後述する実施例に記載があるｐＶＴＳ００７プラスミドベクター、ｐＴＳ１０８プラスミドベクター、ｐＴＳ１１０プラスミドベクター、ｐＴＳ１１９プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0084】
シュードモナス属微生物への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、エレクトロポレーション（電気穿孔）法、接合伝達法などによって実施できる。
【0085】
形質転換微生物を選択及び増殖させるための培地は、用いる宿主微生物とマーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主微生物としてシュードモナス・プチダを用い、マーカー遺伝子としてカナマイシン、ゲンタマイシン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子を用いた場合は、形質転換微生物の選択及び増殖は、例えば、形質転換微生物をこれらの薬剤を含むＬＢ培地で培養することなどによって実施できる。
【0086】
形質転換微生物が作製されたことの確認は、例えば、遺伝子の欠失した形質転換微生物のみが生存し得る条件や挿入する遺伝子を発現する形質転換微生物のみが生存し得る条件下で形質転換微生物を培養することなどにより達成し得る。また、形質転換微生物を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるムコン酸の量が、同じ条件下で培養した宿主微生物の培養物におけるムコン酸の量よりも大きいことを確認することなどにより、形質転換微生物が作製されたことを確認することができる。
【0087】
形質転換微生物が作製されたことの確認は、形質転換微生物から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることやＰＣＲ産物の特性や塩基配列を確認することなどにより行ってもよい。
【0088】
例えば、欠失又は挿入する遺伝子のプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【0089】
相同組換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
【0090】
（宿主微生物）
宿主微生物は、染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有するシュードモナス属微生物であれば特に限定されず、好ましくは染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子、ｖａｎＢ遺伝子、ｖｄｈ遺伝子及びＰＰ＿１９４８遺伝子を有する、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・エルギノーサといったシュードモナス属微生物であり、より好ましくはこれらの遺伝子を有し、かつ、プロトカテク酸からムコン酸を製造することができるシュードモナス・プチダである。
宿主微生物は、染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有するシュードモナス属微生物であれば特に限定されず、好ましくは染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子、ｖａｎＢ遺伝子、ｖｄｈ遺伝子及びＰＰ＿１９４８遺伝子を有する、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・エルギノーサといったシュードモナス属微生物であり、より好ましくはこれらの遺伝子を有し、かつ、プロトカテク酸からムコン酸を製造することができるシュードモナス・プチダである。
【0091】
（欠失又は挿入する遺伝子の具体例）
欠失又は挿入する遺伝子として、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の具体例は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株が保有するｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子であり、それぞれの塩基配列は配列番号２９～３２及び３５～３７に記載のものである。同様に、ａｒｏＹ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ Ａ１７０－４０株が保有するａｒｏＹ遺伝子であり、塩基配列は配列番号３３に記載のものである。ｋｐｄＢ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ ＮＢＲＣ１４９４０株が保有するｋｐｄＢ遺伝子であり、塩基配列は配列番号３４に記載のものである。また、これらの遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５～２８及び３８～４２に記載のものである。
欠失又は挿入する遺伝子として、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の具体例は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株が保有するｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子であり、それぞれの塩基配列は配列番号２９～３２及び３５～３７に記載のものである。同様に、ａｒｏＹ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ Ａ１７０－４０株が保有するａｒｏＹ遺伝子であり、塩基配列は配列番号３３に記載のものである。ｋｐｄＢ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ ＮＢＲＣ１４９４０株が保有するｋｐｄＢ遺伝子であり、塩基配列は配列番号３４に記載のものである。また、これらの遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５～２８及び３８～４２に記載のものである。
【0092】
シュードモナス・プチダやクレブシエラ・ニューモニエ以外の微生物から欠失又は挿入する遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株が保有するｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の塩基配列（配列番号２９～３２及び３５～３７）；クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ Ａ１７０－４０株が保有するａｒｏＹ遺伝子の塩基配列（配列番号３３）に基づいて、その他の微生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、上記塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、その他の微生物の総タンパク質を基に、上記遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２５～２８及び３８～４２）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質を発現する遺伝子を特定することにより得ることができる。得られた遺伝子が欠失又は挿入する遺伝子に相当することは、得られた遺伝子により由来生物を宿主微生物として形質転換し、宿主微生物に比してムコン酸の生産量が増強されていることで確認できる。
【0093】
シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス、及びシュードモナス・エルギノーサは生育条件が近似していることから、これらそれぞれが有する遺伝子を挿入することにより、相互に形質転換できる蓋然性がある。例えば、シュードモナス・プチダから得られた遺伝子を、宿主微生物としてシュードモナス・フルオレッセンスやシュードモナス・エルギノーサに導入して形質転換することができる。また、シュードモナス・プチダから得られた遺伝子を、宿主微生物としてクレブシエラ属微生物、エンテロバクター属微生物、大腸菌などに導入して、発現させることも可能である。なお、挿入する遺伝子は、宿主微生物に発現させるために、コドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化した遺伝子であってもよい。
【0094】
（形質転換微生物の一実施態様）
形質転換微生物の具体的一態様は、宿主微生物がシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス及びシュードモナス・エルギノーサからなる群から選ばれるシュードモナス属微生物であって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失し、挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。また、形質転換微生物の別の具体的一態様は、該形質転換シュードモナス属微生物において、挿入されたｐｏｂＡ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。
形質転換微生物の具体的一態様は、宿主微生物がシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス及びシュードモナス・エルギノーサからなる群から選ばれるシュードモナス属微生物であって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失し、挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。また、形質転換微生物の別の具体的一態様は、該形質転換シュードモナス属微生物において、挿入されたｐｏｂＡ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。
【0095】
このような形質転換微生物は、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失し、挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、挿入されたａｒｏＹ遺伝子が発現するという態様を少なくともとることにより、非特許文献１に記載の形質転換微生物では不可能である、バニリン酸やｐ－ヒドロキシ安息香酸などのリグニン由来の芳香族化合物を唯一の炭素源として、増殖及びムコン酸の製造が可能である。後述する実施例に記載があるとおり、リグニン由来の芳香族化合物の資化性を考えれば、形質転換微生物の好ましい態様は、挿入されたｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を過剰発現する形質転換微生物である。
【0096】
本発明の一態様の形質転換微生物の具体的態様は、後述する実施例に記載があるＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株及びＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株などであるが、これらに限定されない。
【0097】
（ムコン酸の製造方法）
本発明の一態様のムコン酸の製造方法は、バニリン酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸といったリグニン由来の芳香族化合物を、本発明の一態様の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を少なくとも含む。
本発明の一態様のムコン酸の製造方法は、バニリン酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸といったリグニン由来の芳香族化合物を、本発明の一態様の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を少なくとも含む。
【0098】
リグニン由来の芳香族化合物を形質転換微生物に作用させる方法は、リグニン由来の芳香族化合物と形質転換微生物とが接触して、形質転換微生物が有する酵素によってムコン酸が生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、リグニン由来の芳香族化合物を含有し、かつ、形質転換微生物の生育に適した培地を用いて、形質転換微生物に適した各種培養条件下で形質転換微生物を培養することによって、ムコン酸を製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。
【0099】
培地は、宿主微生物を培養する通常の培地、すなわち、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主微生物はシュードモナス属微生物であることから、後述する実施例に記載があるようなＭＭ培地などを利用することができるが、特に限定されない。炭素源は、リグニン由来の芳香族化合物、糖や有機酸などのその他の炭素源又はこれらの組み合わせを用いることができる。ただし、培地成分には、ムコン酸の製造に関与する酵素の活性化に必要な成分、例えば、Ｆｅ２＋が含まれることが好ましい。鉄イオン、マグネシウムイオンなどを化合物として培地に添加することができるが、ミネラル含有物として添加してもよい。
【0100】
リグニン由来の芳香族化合物は、グアイアシルリグニン及びｐ－ヒドロキシフェニルリグニンのいずれかのリグニン並びにこれらのリグニンから誘導し得る芳香族化合物であれば特に限定されないが、例えば、ｐ－ヒドロキシフェニルリグニンやグアイアシルリグニンの分解物に相当する化合物などが挙げられ、具体的には、ｐ－クマル酸、フェルラ酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、プロトカテク酸、バニリン、ｐ－ヒドロキシベンズアルデヒドなどが挙げられるが、フェノール、安息香酸、グアイアコールなどからのカテコールであってもよい。リグニン由来の芳香族化合物は、リグニンのモデル化合物とされている化合物、例えば、グアイアシルグリセロール－β－グアイアシルエーテルなどを含む。リグニン由来の芳香族化合物は、リグニンを含むバイオマスや該バイオマスを前処理に供して抽出したものであることが好ましいが、該バイオマスとは関係なく化学的に合成及び精製したものであってもよい。リグニン由来の芳香族化合物は、上記したものを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【0101】
リグニンを含むバイオマス（以下、リグノセルロースとよぶ場合がある。）は特に限定されないが、例えば、草や木などの天然物、これら天然物に処理を加えて得られるもの、農業廃棄物などが挙げられるが、具体的には広葉樹や針葉樹などの木質系のバイオマスなどが挙げられる。例えば、針葉樹は、ｐ－ヒドロキシフェニルリグニンやグアイアシルリグニンを多く含むことが知られている。
【0102】
リグノセルロースは、前処理の有無などによって、例えば、固体状、懸濁状、液体状などであり得る。例えば、リグノセルロースを粉砕したものを液体に加えて得られる懸濁液とすることもできる。
【0103】
リグノセルロースは、リグニン抽出物であってもよい。リグニン抽出物としては、例えば、リグノセルロースの粉末化したものを、０．１％Ｗ／Ｖ～５０％Ｗ／Ｖ、好ましくは１％Ｗ／Ｖ～２０％Ｗ／Ｖとなるように、リグニンの抽出に適した溶媒中に懸濁した懸濁液などが挙げられる。また、リグニン抽出物は、該懸濁液を１０℃～１５０℃、好ましくは２０℃～１３０℃、より好ましくは２０℃～８０℃で、数時間～数日間、好ましくは１時間～６日間の抽出処理に供し、次いで抽出処理液から固形分を除いた液体状のリグニン抽出物、又は液体状のリグニン抽出物から溶媒を留去し、乾固することにより得られる、固体状のリグニン抽出物などであってもよい。
【0104】
リグニン抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法などが挙げられる。すなわち、小型オートクレーブ装置（耐圧硝子工業株式会社、ポータブルリアクター ＴＶＳ－１）のステンレスベッセルに２Ｍ ＮａＯＨ ５０ｍＬ、脱脂スギ木粉 １．５ｇ、ニトロベンゼン ３ｍＬを入れ、５００ｒｐｍで攪拌しながら１７０℃で２．５時間処理する。６０℃以下まで放冷し、遠心分離（６，０００ｇ、１０ｍｉｎ）により上清を回収する。得られた上清を、ジエチルエーテル抽出を３回繰り返す（水層を回収）。水層を塩酸で酸性化した後、ジエチルエーテル抽出を３回繰り返す（エーテル層を回収）。エーテル層に硫酸ナトリウムを加え、冷蔵庫内で一晩脱水処理する。エーテル層を回収し、抽出物を減圧乾固する。エーテル抽出物を、水酸化ナトリウムを加えながらイオン交換水に溶解し（ｐＨ≒９）、スギリグニン由来の芳香族化合物溶液とする。
【0105】
リグニンの抽出や処理に適した溶媒は特に限定されず、例えば、水、ジオキサン、メタノール、イソプロパノールなどの低分子アルコール、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
【0106】
培養条件は、当業者により通常知られるシュードモナス属微生物の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、より好ましくは２～５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、通気をするなどして溶存酸素濃度が十分になるような条件で培養することが好ましく、溶存酸素濃度が０．１～１５％になるような条件で培養することがより好ましく、溶存酸素濃度が１～１３％になるような条件で培養することがさらに好ましく、溶存酸素濃度が２～１０％になるような条件で培養することがなおさらに好ましい。例えば、培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるとおりの、炭素源としてバニリン酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸及び／又はスギリグニン由来芳香族化合物水溶液を含有するＭＭ培地を用いた、３０℃、１８０ｒｐｍ、溶存酸素濃度が５～１０％での１～５日間の振盪培養や撹拌培養などが挙げられる。なお、炭素源その他の成分は、培養開始後に適宜追加することができる。
【0107】
培養終了後に培養物からムコン酸を取得する方法は特に限定されない。ムコン酸は培養液中に蓄積することから、培養物から濾過、遠心分離などの通常の固液分離操作により菌体と培養上清とを分離し、回収した培養上清からカラムを用いた固相抽出やムコン酸が可溶性のある溶媒を用いた溶媒抽出などによりムコン酸を抽出する。
【0108】
抽出溶媒はムコン酸が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒などが挙げられる。抽出温度は特に限定されないが、例えば、室温から１００℃に設定することができる。
【0109】
ムコン酸の抽出方法の具体的一態様としては、例えば、Ｖａｒｄｏｎらの方法（Ｇｒｅｅｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８，ｐ３３９７－３４１３，２０１６）や該方法を一部変更した方法などが挙げられる。具体的には、培養上清に活性炭（１２．５％（ｗ／ｖ）、１００メッシュ）を添加し、１時間攪拌する。吸引ろ過により活性炭を除去し、ろ液を回収する。回収したろ液に塩酸を加え、ｐＨ≒２に調製した後、４℃で一晩静置する。吸引ろ過により沈殿物を回収し、沈殿物はイオン交換水で洗浄した後、吸引ろ過により回収し、減圧乾燥する。乾燥した固体をエタノールに懸濁し、吸引ろ過により不要物を除去し、ろ液を回収する。ろ液をエバポレーターで減圧乾固して、精製ムコン酸を得る。
【0110】
ムコン酸の定性的又は定量的分析は特に限定されず、例えば、ＨＰＬＣなどにより行うことができる。ＨＰＬＣ分離条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
【0111】
形質転換微生物を用いれば、ムコン酸を高収率で得ることができる。例えば、５０ｍＭ バニリン酸を炭素源とした場合は４８時間の培養で２．７ｗｔ％の収率でムコン酸を得ることができ；５０ｍＭ ｐ－ヒドロキシ安息香酸を炭素源とした場合は５６時間の培養で１１．９ｗｔ％の収率でムコン酸を得ることができ；２５ｍＭ バニリン酸及び２５ｍＭ ｐ－ヒドロキシ安息香酸を炭素源とした場合は４８時間の培養で１７．７ｗｔ％の収率でムコン酸を得ることができ；スギリグニン由来フェノール類水溶液を炭素源とした場合は４８時間の培養で８．９～２４．２ｍｇ／Ｌのムコン酸を得ることができる。
【0112】
本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【0113】
（ムコン酸の用途）
本発明の一態様の形質転換微生物や製造方法を利用して得られたムコン酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などとしての利用が期待できるムコン酸誘導体の原料として利用することができる。具体的には、ムコン酸誘導体の一つであるアジピン酸は、ナイロン６６（ポリアミドの一つ）として現実に利用されている。
本発明の一態様の形質転換微生物や製造方法を利用して得られたムコン酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などとしての利用が期待できるムコン酸誘導体の原料として利用することができる。具体的には、ムコン酸誘導体の一つであるアジピン酸は、ナイロン６６（ポリアミドの一つ）として現実に利用されている。
【0114】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【0115】
［１．Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株の作製］
以下の手順により、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からプロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）及びｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸・サイクロイソメラーゼ遺伝子（ｃａｔＢ遺伝子）を破壊した変異株である、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を作製した。
以下の手順により、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からプロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）及びｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸・サイクロイソメラーゼ遺伝子（ｃａｔＢ遺伝子）を破壊した変異株である、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を作製した。
【0116】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１及び２のプライマー１及び２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、プロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼ・βサブユニット（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ ３，４－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ；ｐｃａＨ）遺伝子の上流領域約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで消化し、予めＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで消化したｐＥＸ１８ＡｍｐプラスミドＤＮＡ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７－８６，１９９８を参照）と連結することにより、ｐＶＴＳ００３プラスミドＤＮＡを得た。
【0117】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３及び４のプライマー３及び４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、プロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼ・αサブユニット（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ ３，４－ｄｉｏｙｇｅｎａｓｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ；ｐｃａＧ）遺伝子の下流約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、予めＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＶＴＳ００３プラスミドＤＮＡと連結することにより、ｐＶＴＳ００４プラスミドＤＮＡを得た。
【0118】
ｐＰＳ８５８（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７－８６，１９９８を参照）をＳａｃＩで消化して得られた約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片（ゲンタマイシン（Ｇｍ）耐性遺伝子を含む）を、予めＳａｃＩで消化したｐＶＴＳ００４プラスミドＤＮＡと連結することにより、ｐＶＴＳ００７プラスミドＤＮＡを得た。
【0119】
ｐＶＴＳ００７プラスミドＤＮＡを用いて、エレクトロポレーション法により、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株を形質転換した。形質転換体は、ナリジクス酸（Ｎａｌ） ２５ｍｇ／Ｌ及びＧｍ ５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上で生育可能であるＮａｌ－Ｇｍ耐性株として選抜した。得られたＮａｌ－Ｇｍ耐性株を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。
【0120】
培養液の一部を、新鮮なＮａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で１６時間振盪培養する操作をさらに２回繰り返した。次いで、得られた培養液を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ及びＧｍ ５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上に塗抹し、３０℃で一晩静置培養した。生育した複数のコロニーから、ゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、ＰＣＲ法及びサザンハイブリダイゼーション法により、ゲノムＤＮＡ上のｐｃａＧ遺伝子座及びｐｃａＨ遺伝子座にＧｍ耐性遺伝子を含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されている形質転換体を、プロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼ遺伝子破壊株としてスクリーニングした。
【0121】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１１００株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５及び６のプライマー５及び６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸・サイクロイソメラーゼ（ｃａｔＢ）遺伝子の一部を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、予めＰｓｔＩ及びＸｂａＩで消化したｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドＤＮＡ（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１４５、ｐ６９－７３、１９９４を参照）にＩｎｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０７３プラスミドＤＮＡを得た。
【0122】
ｐＵＣ４ＫプラスミドＤＮＡ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９、ｐ２５９－２６８、１９８２を参照）をＳａｌＩで消化し、カナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子を含む約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、予めＳａｌＩで消化したｐＴＳ０７３プラスミドＤＮＡと連結することにより、ｐＴＳ０７６プラスミドＤＮＡを得た。
【0123】
ｐＴＳ０７６プラスミドＤＮＡを用いて、プロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼ遺伝子破壊株を形質転換した。形質転換体は、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＫｍ ２５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上で生育可能であるＮａｌ－Ｇｍ－Ｋｍ耐性株として選抜した。得られたＮａｌ－Ｇｍ－Ｋｍ耐性株を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。
【0124】
培養液の一部を、新鮮なＮａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で１６時間振盪培養する操作をさらに２回繰り返した。得られた培養液を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＫｍ ２５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上に塗抹し、３０℃で一晩静置培養した。生育した複数のコロニーから、ゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、ＰＣＲ法及びサザンハイブリダイゼーション法により、ゲノムＤＮＡ上のｃａｔＢ遺伝子の中にＫｍ耐性遺伝子が挿入されている形質転換体をスクリーニングした。スクリーニングして得られた形質転換体は、プロトカテク酸・３，４－ジオキシゲナーゼ遺伝子及びｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸・サイクロイソメラーゼ遺伝子の両方が破壊された変異株であり、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株と命名した。
【0125】
［２ａ．ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株の作製及び評価］
以下の手順により、ｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１０８プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換し、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株を作製した。
以下の手順により、ｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１０８プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換し、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株を作製した。
【0126】
ｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号７及び８のプライマー７及び８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）を含む約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）によって、ｐＪＢ８６６プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩサイトにクローニングすることにより、ｐＴＳ０９３プラスミドＤＮＡを得た。
【0127】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９及び１０のプライマー９及び１０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、予めＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡにクローニングすることにより、ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡを得た。
【0128】
ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡをＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化することによって得られたｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐ ＤＮＡ断片を、ｐＴＳ０９３プラスミドＤＮＡのＳａｃＩ－ＢａｍＨＩサイトに連結することにより、ｐＴＳ１０８プラスミドＤＮＡを得た。
【0129】
ｐＴＳ１０８プラスミドＤＮＡを用いてＰ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換することにより、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株を作製した。
【0130】
［２ｂ．ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株の作製］
以下の手順により、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１１０プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換し、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を作製した。
以下の手順により、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１１０プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換し、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を作製した。
【0131】
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） Ａ１７０－４０株のゲノムＤＮＡの部分断片を鋳型として、配列番号１１及び１２のプライマー１１及び１２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によってプロトカテク酸・デカルボキシラーゼ（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ａｒｏＹ）遺伝子を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ＫｐｎＩで消化し、予めＫｐｎＩで消化したｐＭＣＬ２００プラスミドＤＮＡにクローニングすることにより、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡを得た。
【0132】
ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１３及び１４のプライマー１３及び１４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｒｏＹ遺伝子を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）によって、ｐＴＳ０９３プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩサイトにクローニングすることにより、ｐＴＳ１０９プラスミドＤＮＡを得た。ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡをＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＴＳ１０９プラスミドＤＮＡのＳａｃＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結することにより、ｐＴＳ１１０プラスミドＤＮＡを得た。
【0133】
得られたｐＴＳ１１０プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換することにより、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を作製した。
【0134】
［３．バニリン酸（ＶＡ）を炭素源としたｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸（ｃｃＭＡ）生産（１）］
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株及びＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株のそれぞれを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びテトラサイクリン（Ｔｃ） ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液 ５０μＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍＭ バニリン酸（ＶＡ）を含むＭＭ液体培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ １３．５６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ２ｇ／Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１００μＭ ＣａＣｌ２及び１８μＭ ＦｅＳＯ４） ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株及びＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株のそれぞれを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びテトラサイクリン（Ｔｃ） ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液 ５０μＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍＭ バニリン酸（ＶＡ）を含むＭＭ液体培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ １３．５６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ２ｇ／Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１００μＭ ＣａＣｌ２及び１８μＭ ＦｅＳＯ４） ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。
【0135】
培養開始後、一定時間毎に、培養液の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ）を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。ＯＤ測定には６００ｎｍの波長を使用し、ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ ５１８Ｒ（タイテック株式会社）を用いてＯＤ６００値を測定した。ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度は、高速液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ；アジレントテクノロジー株式会社）を用いて測定した。カラムはＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（径 ４．６ｍｍ、長さ １５０ｍｍ、粒径 ０．５μｍ）を使用し、４０℃で保温した。勾配（グラジエント）溶離モード（溶媒Ａ：５％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＯＯＨ、溶媒Ｂ：５０％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＯＯＨ）を使用し、溶媒Ａで平衡化した後、分析開始から８分かけて溶媒Ｂの割合を２０％まで上昇させ、その後５分かけて溶媒Ｂの割合を１００％まで上昇させた。移動相の流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、測定波長は２８０ｎｍとした。
【0136】
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株について、培養時間０、４８、５６及び７２時間後のＯＤ６００値、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表１ａに示す。また、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株について、培養時間０、２４、３２及び４８時間後のＯＤ６００値、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表１ｂに示す。
【0137】
【表1a】
【0138】
【表1b】
【0139】
表１ａ及び表１ｂが示すとおり、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株はＶＡを利用して増殖したがｃｃＭＡを生産しなかったのに対して、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株は、ＶＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は１．４ｗｔ％）。また、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株に対して、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株のＶＡの代謝速度及び比増殖度は非常に大きかった。なお、収率は、消費された基質（ＶＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。
【0140】
また、ＭＭ液体培地に含有させるＶＡの濃度を２５ｍＭから５０ｍＭに代えたこと以外は、上記と同様にして、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を培養した。培養時間０、２４、３２及び４８時間後のＯＤ６００値、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表１ｃに示す。
【0141】
【表1c】
【0142】
表１ｃが示すとおり、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株は、ＶＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを生産した（収率は２．７ｗｔ％）。
【0143】
［４．ｐ－ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）を炭素源としたｃｃＭＡ生産（１）］
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株及びＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株のそれぞれについて、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液 ５０μＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍＭ ＨＢＡを含むＭＭ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株及びＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株のそれぞれについて、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液 ５０μＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍＭ ＨＢＡを含むＭＭ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。
【0144】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のＨＢＡ及びｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定並びにＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。
【0145】
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株について、培養時間０、２４、４８及び５６時間後のＯＤ６００値、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表２ａに示す。また、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株について、培養時間０、２４、３２及び４８時間後のＯＤ６００値、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表２ｂに示す。
【0146】
【表2a】
【0147】
【表2b】
【0148】
表２ａ及び表２ｂが示すとおり、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株はＨＢＡを利用して増殖したがｃｃＭＡを生産しなかったのに対して、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株は、ＨＢＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は４．１ｗｔ％）。また、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１０８株に対して、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株のＨＢＡの代謝速度及び比増殖度は非常に大きかった。なお、収率は、消費された基質（ＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。
【0149】
また、ＭＭ液体培地に含有させるＨＢＡの濃度を２５ｍＭから５０ｍＭに代えたこと以外は、上記と同様にして、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を培養した。培養時間０、２４、３２、４８及び５６時間後のＯＤ６００値、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表２ｃに示す。
【0150】
【表2c】
【0151】
表２ｃが示すとおり、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株は、ＨＢＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを生産した（収率は１１．９ｗｔ％）。
【0152】
［５．ＶＡ及びＨＢＡの混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液 ５０μＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ ＶＡ及び２５ｍＭ ＨＢＡを含むＭＭ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液 ５０μＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ ＶＡ及び２５ｍＭ ＨＢＡを含むＭＭ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。
【0153】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のＶＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定並びにＶＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。
【0154】
培養時間０、２４、３２及び４８時間後のＯＤ６００値、ＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表３に示す。
【0155】
【表3】
【0156】
表３が示すとおり、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株は、ＶＡ及びＨＢＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は１７．７ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。
【0157】
［６．スギリグニン由来フェノール類を炭素源としたｃｃＭＡ生産（１）］
常法に従い、スギ木粉をアルコール－ベンゼン抽出処理に供し、次いで処理後のスギ木粉 １．５ｇをアルカリニトロベンゼン酸化分解処理及びジエチルエーテル抽出処理に供した（木質科学実験マニュアル、日本木材学会編、文永堂出版を参照）。ニトロベンゼン酸化分解後のアルカリ溶液をジエチルエーテル抽出処理し、得られた水層を酸性化処理に供し、さらにジエチルエーテル抽出処理に供した。エーテル層として得られたジエチルエーテル抽出物をスギリグニン由来芳香族化合物とし、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を唯一の炭素源として添加したＭＭ培地におけるｃｃＭＡ生産を評価した。
常法に従い、スギ木粉をアルコール－ベンゼン抽出処理に供し、次いで処理後のスギ木粉 １．５ｇをアルカリニトロベンゼン酸化分解処理及びジエチルエーテル抽出処理に供した（木質科学実験マニュアル、日本木材学会編、文永堂出版を参照）。ニトロベンゼン酸化分解後のアルカリ溶液をジエチルエーテル抽出処理し、得られた水層を酸性化処理に供し、さらにジエチルエーテル抽出処理に供した。エーテル層として得られたジエチルエーテル抽出物をスギリグニン由来芳香族化合物とし、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を唯一の炭素源として添加したＭＭ培地におけるｃｃＭＡ生産を評価した。
【0158】
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液 ５０μＬをＮａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＭＭ液体培地 ５ｍＬに接種し、炭素源としてスギリグニン由来フェノール類水溶液 ０．５ｍＬを添加し、３０℃で振盪培養した。培養開始２４時間後に、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液 ０．５ｍＬをさらに添加して、３０℃で振盪培養した。
【0159】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。
【0160】
培養時間０、２４及び４８時間後のＯＤ６００値及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表４に示す。
【0161】
【表4】
【0162】
表４が示すとおり、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株は、実バイオマスから得られたリグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した。
【0163】
［７．ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株の作製］
以下の手順により、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ａｒｏＹ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１１９プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換し、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株を作製した。
以下の手順により、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ａｒｏＹ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１１９プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換し、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株を作製した。
【0164】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１５及び１６のプライマー１５及び１６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によってカテコール・１，２－ジオキシゲナーゼ（ｃａｔｅｃｈｏｌ １，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｃａｔＡ）遺伝子を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化し、予めＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化したｐＵＣ１１８プラスミドにクローニングすることにより、ｐＮＩ００１プラスミドＤＮＡを得た。
【0165】
ｐＮＩ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１７及び１８のプライマー１７及び１８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって増幅することにより、ｃａｔＡ遺伝子を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ１０９プラスミドＤＮＡにＩｎｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ＨＤ ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ１１５プラスミドＤＮＡを得た。
【0166】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１９及び２０のプライマー１９及び２０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって増幅することにより、バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；ｖａｎＡ）遺伝子及びバニリン酸・デメチラーゼ・オキシドレダクターゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；ｖａｎＢ）遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩ及びＳｍａＩで消化し、予めＳａｃＩ及びＳｍａＩで消化してｐＱＥ３０プラスミドＤＮＡと連結することにより、ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを得た。
【0167】
ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号２１及び２２のプライマー２１及び２２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により増幅することによって、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ１１５プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ１１６プラスミドＤＮＡを得た。
【0168】
ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号２３及び２４のプライマー２３及び２４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅することにより、ｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴＳ１１６プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ１１９プラスミドＤＮＡを得た。
【0169】
得られたｐＴＳ１１９プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＩＤＰＣ株を形質転換することにより、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株を作製した。
【0170】
［８．スギリグニン由来芳香族化合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産（２）］
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株を用いた以外は上記６と同様にして、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を唯一の炭素源として添加したＭＭ培地におけるｃｃＭＡ生産を評価した。
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株を用いた以外は上記６と同様にして、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を唯一の炭素源として添加したＭＭ培地におけるｃｃＭＡ生産を評価した。
【0171】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。
【0172】
培養時間０、２４及び４８時間後のＯＤ６００値及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表５に示す。
【0173】
【表5】
【0174】
表５が示すとおり、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株は、実バイオマスから得られたリグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した。
【0175】
［９．ＶＡ及びＨＢＡの混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産（２）］
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 １０ｍＬに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液 １０ｍＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ ＶＡ及び２５ｍＭ ＨＢＡを含むＭＭ液体培地 １．０Ｌに接種し、３０℃、ｐＨ ７、２４～１００時間で、培養期間中の溶存酸素濃度（ＤＯ）を一定の範囲に保ちながら通気撹拌培養した。
ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１０株を、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地 １０ｍＬに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液 １０ｍＬを、Ｎａｌ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ ２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ ＶＡ及び２５ｍＭ ＨＢＡを含むＭＭ液体培地 １．０Ｌに接種し、３０℃、ｐＨ ７、２４～１００時間で、培養期間中の溶存酸素濃度（ＤＯ）を一定の範囲に保ちながら通気撹拌培養した。
【0176】
培養後のＶＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡ濃度について、上記３に記載の方法と同様に測定した。得られた測定結果より、消費された基質（ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により、ｃｃＭＡの収率を算出した。ｃｃＭＡの収率、通気量及びＤＯの値をまとめたものを表６に示す。
【0177】
【表6】
【0178】
表６が示すとおり、生産されるｃｃＭＡの収率は、通気量による影響はほとんどないものの、培養液中の溶存酸素濃度が５～１０％である条件下において良好な結果となった。なお、ＩＤＰＣ／ｐＴＳ１１９株を用いた場合は、生産されるｃｃＭＡの収率は、培養液中の溶存酸素濃度が２．５％及び５．０％である条件下において約３０％であった。
【0179】
配列表に記載の配列は以下のとおりである：
［配列番号１］プライマー１
ATGAATTCCTGATTCGTGCAGGGGTTAT
［配列番号２］プライマー２
GCTTCACCTCAGAAGAGCTCGGGCATGCCGGTTTCCTCTC
［配列番号３］プライマー３
GAGCTCTTCTGAGGTGAAGCTTGGG
［配列番号４］プライマー４
ATGGATCCTCCATCCTGTTCGTCATCAA
［配列番号５］プライマー５
ACAAGCTTGCATGCCGATGCACACCATGCAGCAG
［配列番号６］プライマー６
CCGGGGATCCTCTAGACAGCTCTGTACCCCAGGTG
［配列番号７］プライマー７
ATGTGAATTGCGGCCAGCGCCCAATACGCAAACC
［配列番号８］プライマー８
TCTGGTACCGCGGCCGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC
［配列番号９］プライマー９
ATGCGAGCTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGCCCGCCCAGGACAAC
［配列番号１０］プライマー１０
ATGCGGATCCCCCAAGCTTCACCTCAGAAG
［配列番号１１］プライマー１１
AGCTGGTACCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGCACCGATTCAG
［配列番号１２］プライマー１２
AGCTGGTACCTTATTTTGCGCTACCCTGGTT
［配列番号１３］プライマー１３
CATGATTACGCGGCCGCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGCACCGATT
［配列番号１４］プライマー１４
TCTGGTACCGCGGCCTTATTTTGCGCTACCCTGGTT
［配列番号１５］プライマー１５
ATGCGGTACCTTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGTGAAAATTTCCCA
［配列番号１６］プライマー１６
AGCTCCCGGGTCAGCCCTCCTGCAACGCCC
［配列番号１７］プライマー１７
CATGATTACGCGGCCGCTTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGTGA
［配列番号１８］プライマー１８
CTCTTTAATGCGGCCTCAGCCCTCCTGCAACGC
［配列番号１９］プライマー１９
ATGCGAGCTCATGTACCCCAAAAACACCT
［配列番号２０］プライマー２０
ATGCCCGGGTCAGATGTCCAGCACCAGCA
［配列番号２１］プライマー２１
CATGATTACGCGGCCATTAAAGAGGAGAAATTAAC
［配列番号２２］プライマー２２
CCTCTTTAAGCGGCCGCTCAGATGTCCAGCACCAG
［配列番号２３］プライマー２３
TCACCATGGGAAGCTATTAAAGAGGAGAAATTAACTAT
［配列番号２４］プライマー２４
TGGATCCACGAAGCTCCCAAGCTTCACCTCAGA
［配列番号２５］ＫｐｄＢ
MKLIIGMTGATGAPLGVALLQALRDMPEVETHLVMSKWAKTTIELETPWTAREVAALADFSHSPADQAATISSGSFRTDGMIVIPCSMKTLAGIRAGYAEGLVGRAADVVLKEGRKLVLVPREMPLSTIHLENMLALSRMGVAMVPPMPAYYNHPETVDDITNHIVTRVLDQFGLDYHKARRWNGLRTAEQFAQEIE
［配列番号２６］ＰｏｂＡ
MKTQVAIIGAGPSGLLLGQLLHKAGIDNIIVERQTAEYVLGRIRAGVLEQGTVDLLREAGVAERMDREGLVHEGVELLVGGRRQRLDLKALTGGKTVMVYGQTEVTRDLMQAREASGAPIIYSAANVQPHELKGEKPYLTFEKDGRVQRIDCDYIAGCDGFHGISRQSIPEGVLKQYERVYPFGWLGLLSDTPPVNHELIYAHHERGFALCSQRSQTRSRYYLQVPLQDRVEEWSDERFWDELKARLPAEVAADLVTGPALEKSIAPLRSLVVEPMQYGHLFLVGDAAHIVPPTGAKGLNLAASDVNYLYRILVKVYHEGRVDLLAQYSPLALRRVWKGERFSWFMTQLLHDFGSHKDAWDQKMQEADREYFLTSPAGLVNIAENYVGLPFEEVA
［配列番号２７］ＶａｎＡ
MYPKNTWYVACTPDEIATKPLGRQICGEKIVFYRARENQVAAVEDFCPHRGAPLSLGYVEDGNLVCGYHGLVMGCDGKTVSMPGQRVRGFPCNKTFAAVERYGFIWVWPGDQAQADPALIPHLEWAVSDEWAYGGGLFHIGCDYRLMIDNLMDLTHETYVHASSIGQKEIDEAPPVTTVTGDEVVTARHMENIMAPPFWRMALRGNGLADDVPVDRWQICRFTPPSHVLIEVGVAHAGKGGYHAEAQHKASSIVVDFITPESDTSIWYFWGMARNFAAHDQTLTDNIREGQGKIFSEDLEMLERQQQNLLAHPERNLLKLNIDAGGVQSRKVLERIIAQERAPQPQLIATSANPA
［配列番号２８］ＶａｎＢ
MIDAVVVSRNDEAQGICSFELAAADGSLLPAFSAGAHIDVHLPDGLVRQYSLCNHPEERHRYLIGVLNDPASRGGSRSLHEQVQAGARLRISAPRNLFPLAEGAQRSLLFAGGIGITPILCMAEQLSDSGQAFELHYCARSSERAAFVERIRSAPFADRLFVHFDEQPETALDIAQVLGNPQDDVHLYVCGPGGFMQHVLDSAKGLGWQEANLHREYFAAAPVDASNDGSFAVQVGSTGQVFEVPADRTVVQVLEENGIEIAMSCEQGICGTCLTRVLQGTPDHRDLFLTEEEQALNDQFTPCCSRSKTPLLVLDI
［配列番号２９］ｐｃａＨ遺伝子
ATGCCCGCCCAGGACAACAGCCGCTTCGTGATCCGTGATCGCAACTGGCACCCTAAAGCCCTTACGCCTGACTACAAGACCTCCGTTGCCCGCTCGCCGCGCCAGGCACTGGTCAGCATTCCGCAGTCGATCAGCGAAACCACTGGTCCGGACTTTTCCCATCTGGGCTTCGGCGCCCACGACCATGACCTGCTGCTGAACTTCAATAACGGTGGCCTGCCCATTGGCGAGCGCATCATCGTCGCCGGCCGTGTCGTCGACCAGTACGGCAAGCCTGTGCCGAACACTTTGGTGGAGATGTGGCAAGCCAACGCCGGCGGCCGCTATCGCCACAAGAACGATCGCTACCTGGCGCCCCTGGACCCGAACTTCGGTGGTGTTGGGCGGTGTCTGACCGACCGTGACGGCTATTACAGCTTCCGCACCATCAAGCCGGGCCCGTACCCATGGCGCAACGGCCCGAACGACTGGCGCCCGGCGCATATCCACTTCGCCATCAGCGGCCCATCGATCGCCACCAAGCTGATCACCCAGTTGTACTTCGAAGGTGACCCGCTGATCCCGATGTGCCCGATCGTCAAGTCGATCGCCAACCCGCAAGCCGTGCAGCAGTTGATCGCCAAGCTCGACATGAGCAACGCCAACCCGATGGACTGCCTGGCCTACCGCTTTGACATCGTGCTGCGCGGCCAGCGCAAGACCCACTTCGAAAACTGCTGA
［配列番号３０］ｐｃａＧ遺伝子
ATGCCAATCGAACTGCTGCCGGAAACCCCTTCGCAGACTGCCGGCCCCTACGTGCACATCGGCCTGGCCCTGGAAGCCGCCGGCAACCCGACCCGCGACCAGGAAATCTGGAACTGCCTGGCCAAGCCAGACGCCCCGGGCGAGCACATTCTGCTGATCGGCCACGTATATGACGGAAACGGCCACCTGGTGCGCGACTCGTTCCTGGAAGTGTGGCAGGCCGACGCCAACGGTGAGTACCAGGATGCCTACAACCTGGAAAACGCCTTCAACAGCTTTGGCCGCACGGCTACCACCTTCGATGCCGGTGAGTGGACGCTGCAAACGGTCAAGCCGGGTGTGGTGAACAACGCTGCTGGCGTGCCGATGGCGCCGCACATCAACATCAGCCTGTTTGCCCGTGGCATCAACATCCACCTGCACACGCGCCTGTATTTCGATGATGAGGCCCAGGCCAATGCCAAGTGCCCGGTGCTCAACCTGATCGAGCAGCCGCAGCGGCGTGAAACCTTGATTGCCAAGCGTTGCGAAGTGGATGGGAAGACGGCGTACCGCTTTGATATCCGCATTCAGGGGGAAGGGGAGACCGTCTTCTTCGACTTCTGA
［配列番号３１］ｃａｔＡ遺伝子
ATGACCGTGAAAATTTCCCACACTGCCGACATTCAAGCCTTCTTCAACCGGGTAGCTGGCCTGGACCATGCCGAAGGAAACCCGCGCTTCAAGCAGATCATTCTGCGCGTGCTGCAAGACACCGCCCGCCTGATCGAAGACCTGGAGATTACCGAGGACGAGTTCTGGCACGCCGTCGACTACCTCAACCGCCTGGGCGGCCGTAACGAGGCAGGCCTGCTGGCTGCTGGCCTGGGTATCGAGCACTTCCTCGACCTGCTGCAGGATGCCAAGGATGCCGAAGCCGGCCTTGGCGGCGGCACCCCGCGCACCATCGAAGGCCCGTTGTACGTTGCCGGGGCGCCGCTGGCCCAGGGCGAAGCGCGCATGGACGACGGCACTGACCCAGGCGTGGTGATGTTCCTTCAGGGCCAGGTGTTCGATGCCGACGGCAAGCCGTTGGCCGGTGCCACCGTCGACCTGTGGCACGCCAATACCCAGGGCACCTATTCGTACTTCGATTCGACCCAGTCCGAGTTCAACCTGCGTCGGCGTATCATCACCGATGCCGAGGGCCGCTACCGCGCGCGCTCGATCGTGCCGTCCGGGTATGGCTGCGACCCGCAGGGCCCAACCCAGGAATGCCTGGACCTGCTCGGCCGCCACGGCCAGCGCCCGGCGCACGTGCACTTCTTCATCTCGGCACCGGGGCACCGCCACCTGACCACGCAGATCAACTTTGCTGGCGACAAGTACCTGTGGGACGACTTTGCCTATGCCACCCGCGACGGGCTGATCGGCGAACTGCGTTTTGTCGAGGATGCGGCGGCGGCGCGCGACCGCGGTGTGCAAGGCGAGCGCTTTGCCGAGCTGTCATTCGACTTCCGCTTGCAGGGTGCCAAGTCGCCTGACGCCGAGGCGCGAAGCCATCGGCCGCGGGCGTTGCAGGAGGGCTGA
［配列番号３２］ｃａｔＢ遺伝子
ATGACAAGCGTGCTGATTGAACACATAGATGCAATTATCGTCGATCTCCCGACCATTCGCCCGCACAAGCTGGCGATGCACACCATGCAGCAGCAGACCCTGGTGGTATTGCGACTGCGCTGCAGCGATGGCGTGGAAGGCATCGGTGAAGCCACCACCATCGGTGGCCTGGCGTATGGCTACGAAAGCCCCGAAGGGATCAAGGCCAACATCGACGCGTACCTCGCCCCAGCGTTGATTGGCCTGCCGGCAGACAACATCAATGCCGCCATGCTCAAGCTGGACAAGCTGGCCAAGGGCAACACCTTCGCCAAGTCCGGCATCGAAAGCGCCTTGCTCGACGCCCAGGGCAAACGCCTGGGCCTGCCGGTCAGCGAACTGCTGGGTGGCCGCGTGCGTGACAGCCTGGAAGTGGCCTGGACCCTGGCCAGCGGCGACACCGCCCGCGACATCGCCGAAGCACAGCACATGCTGGACATTCGCCGGCACCGCGTGTTCAAGCTGAAAATCGGCGCCAACCCGGTGGCGCAGGACCTCAAGCACGTGGTCGCGATCAAGCGCGAGCTGGGTGACAGCGCCAGCGTGCGGGTCGACGTCAACCAGTACTGGGACGAGTCCCAGGCCATCCGCGCCTGCCAGGTATTGGGCGACAACGGCATCGACCTGATCGAGCAGCCGATTTCGCGCATCAACCGCGCTGGCCAGGTGCGCCTGAACCAGCGCAGTCCGGCTCCGATCATGGCCGATGAGTCGATCGAAAGCGTCGAGGACGCCTTCAGCCTGGCCGCCGACGGCGCCGCCAGCATCTTCGCCCTGAAAATCGCCAAGAATGGTGGCCCGCGCGCGGTTCTGCGCACTGCACAGATCGCCGAGGCCGCTGGCATCGCCTTGTACGGCGGCACCATGCTCGAAGGTTCGATCGGCACCCTGGCTTCGGCTCATGCATTCCTCACCCTGCGCCAGCTCACCTGGGGTACAGAGCTGTTCGGGCCGCTGCTGCTGACCGAGGAGATCGTCAACGAGCCGCCGCAATACCGCGACTTCCAGCTGCACATCCCCCACACCCCAGGCCTGGGCCTGACGTTGGACGAACAGCGCCTGGCGCGCTTCGCCCGTCGCTGA
［配列番号３３］ａｒｏＹ遺伝子
ATGACCGCACCGATTCAGGATCTGCGCGACGCCATCGCGCTGCTGCAACAGCATGACAATCAGTATCTCGAAACCGATCATCCGGTTGACCCTAACGCCGAGCTGGCCGGTGTTTATCGCCATATCGGCGCGGGCGGCACCGTGAAGCGCCCCACCCGCATCGGGCCGGCGATGATGTTTAACAATATTAAGGGTTATCCACACTCGCGCATTCTGGTGGGTATGCACGCCAGCCGCCAGCGGGCCGCGCTGCTGCTGGGCTGCGAAGCCTCGCAGCTGGCCCTTGAAGTGGGTAAGGCGGTGAAAAAACCGGTCGCGCCGGTGGTCGTCCCGGCCAGCAGCGCCCCCTGCCAGGAACAGATCTTTCTGGCCGACGATCCGGATTTTGATTTGCGCACCCTGCTTCCGGCGCCCACCAACACCCCTATCGACGCCGGCCCCTTCTTCTGCCTGGGCCTGGCGCTGGCCAGCGATCCCGTCGACGCCTCGCTGACCGACGTCACCATCCACCGCTTGTGCGTCCAGGGCCGGGATGAGCTGTCGATGTTTCTTGCCGCCGGCCGCCATATCGAAGTGTTTCGCCAAAAGGCCGAGGCCGCCGGCAAACCGCTGCCGATAACCATCAATATGGGTCTCGATCCGGCCATCTATATTGGCGCCTGCTTCGAAGCCCCTACCACGCCGTTCGGCTATAATGAGCTGGGCGTCGCCGGCGCGCTGCGTCAACGTCCGGTGGAGCTGGTTCAGGGCGTCAGCGTCCCGGAGAAAGCCATCGCCCGCGCCGAGATCGTTATCGAAGGTGAGCTGTTGCCTGGCGTGCGCGTCAGAGAGGATCAGCACACCAATAGCGGCCACGCGATGCCGGAATTTCCTGGCTACTGCGGCGGCGCTAATCCGTCGCTGCCGGTAATCAAAGTCAAAGCAGTGACCATGCGAAACAATGCGATTCTGCAGACCCTGGTGGGACCGGGGGAAGAGCATACCACCCTCGCCGGCCTGCCAACGGAAGCCAGTATCTGGAATGCCGTCGAGGCCGCCATTCCGGGCTTTTTACAAAATGTCTACGCCCACACCGCGGGTGGCGGTAAGTTCCTCGGGATCCTGCAGGTGAAAAAACGTCAACCCGCCGATGAAGGCCGGCAGGGGCAGGCCGCGCTGCTGGCGCTGGCGACCTATTCCGAGCTAAAAAATATTATTCTGGTTGATGAAGATGTCGACATCTTTGACAGCGACGATATCCTGTGGGCGATGACCACCCGCATGCAGGGGGACGTCAGCATTACGACAATCCCCGGCATTCGCGGTCACCAGCTGGATCCGTCCCAGACGCCGGAATACAGCCCGTCGATCCGTGGAAATGGCATCAGCTGCAAGACCATTTTTGACTGCACGGTCCCCTGGGCGCTGAAATCGCACTTTGAGCGCGCGCCGTTTGCCGACGTCGATCCGCGTCCGTTTGCACCGGAGTATTTCGCCCGGCTGGAAAAAAACCAGGGTAGCGCAAAATAA
［配列番号３４］ｋｐｄＢ遺伝子
ATGAAACTGATTATTGGGATGACGGGGGCCACCGGGGCACCGCTTGGGGTGGCATTGCTGCAGGCGCTGCGCGATATGCCGGAGGTGGAAACCCATCTGGTGATGTCGAAATGGGCCAAAACCACCATCGAGCTGGAAACGCCCTGGACGGCGCGCGAAGTGGCCGCGCTGGCGGACTTTTCCCACAGCCCGGCAGACCAGGCCGCCACCATCTCATCCGGTTCATTTCGTACCGACGGCATGATCGTTATTCCCTGCAGTATGAAAACGCTTGCAGGCATTCGCGCGGGTTATGCCGAAGGACTGGTGGGCCGCGCGGCGGACGTGGTGCTCAAAGAGGGGCGCAAGCTGGTGTTGGTCCCGCGGGAAATGCCGCTCAGCACGATCCATCTGGAGAACATGCTGGCGCTGTCCCGCATGGGCGTGGCGATGGTCCCGCCGATGTCAGCTTACTACAACCACCCGGAGACGGTTGACGATATCACCAATCATATCGTCACCCGGGTGCTGGATCAGTTTGGCCTCGACTATCACAAAGCGCGCCGCTGGAACGGCTTGCGCACGGCAGAACAATTTGCACAGGAGATCGAATAA
［配列番号３５］ｐｏｂＡ遺伝子
ATGAAAACTCAGGTTGCAATTATTGGTGCAGGTCCGTCTGGCCTGCTGCTGGGCCAGCTGCTGCACAAGGCCGGTATCGATAACATCATCGTCGAACGCCAGACTGCCGAGTACGTACTAGGCCGCATCCGCGCCGGGGTGCTAGAGCAAGGCACGGTCGACCTGCTGCGCGAGGCTGGCGTGGCCGAGCGCATGGACCGTGAAGGCCTGGTGCACGAGGGGGTTGAACTGCTGGTTGGCGGGCGCCGCCAGCGTCTGGATCTCAAAGCCCTGACCGGCGGCAAGACGGTGATGGTCTACGGCCAGACCGAAGTCACCCGTGACCTGATGCAGGCCCGCGAAGCCAGTGGTGCGCCGATCATTTATTCAGCCGCCAACGTTCAGCCGCATGAATTGAAAGGCGAGAAGCCCTACCTGACGTTCGAAAAGGATGGCCGGGTGCAGCGGATTGACTGCGACTATATCGCCGGCTGCGACGGCTTCCACGGTATCTCGCGGCAGAGCATCCCGGAGGGCGTGCTGAAACAGTATGAGCGGGTTTACCCGTTTGGCTGGCTGGGCCTGCTGTCGGACACACCGCCAGTCAATCACGAGTTGATCTACGCCCACCATGAGCGCGGTTTCGCGTTGTGTAGCCAACGCTCGCAAACACGCAGCCGCTACTACCTGCAGGTACCTTTGCAGGATCGGGTCGAGGAGTGGTCTGACGAGCGTTTCTGGGACGAACTGAAAGCCCGTCTGCCCGCCGAGGTGGCGGCGGACCTGGTCACAGGCCCCGCGTTGGAAAAAAGTATTGCGCCGCTGCGTAGCCTGGTGGTCGAACCCATGCAGTATGGTCACCTGTTCCTGGTGGGGGACGCGGCGCACATCGTCCCCCCTACGGGTGCCAAAGGCCTTAACCTGGCGGCCTCCGACGTCAACTACCTGTACCGCATTCTGGTCAAGGTGTACCACGAAGGGCGCGTCGACCTGCTTGCGCAATACTCGCCGCTGGCACTGCGCCGCGTGTGGAAGGGCGAGCGCTTCAGCTGGTTCATGACCCAACTGCTGCATGACTTCGGTAGCCACAAGGACGCCTGGGACCAGAAGATGCAGGAAGCTGACCGCGAGTACTTCCTGACCTCGCCGGCGGGCCTGGTGAACATTGCCGAGAACTATGTGGGGCTGCCGTTCGAGGAAGTTGCCTGA
［配列番号３６］ｖａｎＡ遺伝子
ATGTACCCCAAAAACACCTGGTACGTCGCCTGCACCCCCGATGAGATCGCCACCAAACCCCTGGGCCGGCAGATCTGCGGGGAAAAAATCGTGTTCTACCGCGCCCGCGAGAACCAAGTAGCCGCCGTCGAGGACTTCTGCCCGCACCGCGGCGCACCGTTGTCGTTGGGCTATGTCGAGGACGGCAACCTGGTGTGCGGCTACCACGGCCTGGTGATGGGTTGCGACGGCAAGACCGTGTCGATGCCGGGCCAACGGGTGCGTGGCTTCCCCTGCAACAAGACCTTTGCGGCCGTCGAGCGCTATGGCTTCATCTGGGTCTGGCCCGGTGACCAGGCGCAGGCCGACCCGGCGCTGATTCCGCATCTGGAATGGGCGGTGAGTGATGAGTGGGCCTACGGCGGCGGGCTGTTCCACATCGGTTGCGACTACCGCCTGATGATCGACAACCTCATGGACCTCACCCATGAAACCTATGTGCACGCCTCCAGCATCGGCCAGAAGGAGATCGACGAGGCACCGCCGGTCACCACCGTCACCGGCGACGAAGTGGTCACCGCCCGGCACATGGAAAACATCATGGCGCCACCGTTCTGGCGCATGGCCTTGCGTGGCAATGGCCTGGCCGACGATGTACCAGTGGACCGCTGGCAGATCTGCCGTTTCACCCCACCTAGCCATGTGCTGATCGAAGTGGGTGTAGCGCATGCCGGCAAGGGCGGCTACCACGCCGAGGCACAGCATAAGGCGTCGAGCATCGTGGTCGACTTCATCACCCCTGAGAGCGATACCTCTATCTGGTACTTCTGGGGCATGGCGCGCAACTTCGCTGCGCACGACCAGACCCTGACCGACAACATTCGTGAGGGCCAGGGCAAGATTTTCAGCGAAGACCTGGAAATGCTCGAACGCCAGCAGCAGAACCTGCTGGCCCACCCCGAGCGCAACTTGCTGAAGCTGAATATCGACGCCGGCGGCGTGCAGTCACGCAAAGTGCTGGAGCGGATCATCGCCCAAGAGCGTGCGCCGCAGCCGCAACTGATCGCCACCAGCGCCAACCCTGCCTGA
［配列番号３７］ｖａｎＢ遺伝子
ATGATCGATGCCGTAGTGGTATCCCGTAACGATGAAGCGCAGGGTATCTGCAGCTTCGAGCTGGCCGCGGCAGATGGCAGCCTGCTGCCGGCGTTCAGCGCCGGCGCCCATATCGACGTGCACCTGCCCGACGGGCTGGTGCGCCAGTATTCGCTGTGCAACCACCCCGAAGAACGCCATCGCTATCTGATTGGCGTACTCAACGACCCGGCTTCGCGGGGCGGTTCTCGTAGCCTGCACGAACAGGTGCAAGCCGGTGCCCGGCTGCGTATCAGTGCGCCGCGCAACCTGTTCCCGCTGGCCGAGGGTGCGCAGCGCAGTTTGCTGTTTGCTGGCGGTATCGGCATTACCCCAATCCTGTGCATGGCCGAGCAGCTGTCCGACAGCGGCCAGGCCTTCGAGCTGCACTACTGTGCCCGCTCCAGCGAGCGTGCGGCGTTTGTCGAGCGGATCCGCAGCGCGCCGTTCGCTGATCGGCTGTTCGTGCATTTTGACGAGCAGCCGGAAACGGCGCTGGACATCGCCCAGGTGCTGGGCAACCCGCAAGATGATGTGCACCTGTATGTATGCGGGCCCGGCGGGTTCATGCAGCATGTGCTGGACAGCGCGAAGGGGCTGGGCTGGCAGGAGGCCAACCTGCACCGCGAGTACTTCGCCGCAGCACCGGTGGATGCCAGCAACGATGGCAGTTTCGCGGTGCAGGTGGGCAGCACGGGACAGGTGTTCGAGGTGCCAGCCGACCGGACCGTGGTGCAGGTGCTGGAAGAGAATGGTATCGAGATCGCCATGTCGTGCGAGCAGGGTATTTGCGGCACCTGCCTGACACGCGTGCTGCAGGGCACACCGGACCATCGCGATCTGTTTCTCACCGAAGAGGAACAGGCCCTGAACGATCAGTTCACGCCCTGCTGCTCGCGCTCGAAGACGCCGCTGCTGGTGCTGGACATCTGA
［配列番号３８］ＰｃａＨ
MPAQDNSRFVIRDRNWHPKALTPDYKTSVARSPRQALVSIPQSISETTGPDFSHLGFGAHDHDLLLNFNNGGLPIGERIIVAGRVVDQYGKPVPNTLVEMWQANAGGRYRHKNDRYLAPLDPNFGGVGRCLTDRDGYYSFRTIKPGPYPWRNGPNDWRPAHIHFAISGPSIATKLITQLYFEGDPLIPMCPIVKSIANPQAVQQLIAKLDMSNANPMDCLAYRFDIVLRGQRKTHFENC
［配列番号３９］ＰｃａＧ
MPIELLPETPSQTAGPYVHIGLALEAAGNPTRDQEIWNCLAKPDAPGEHILLIGHVYDGNGHLVRDSFLEVWQADANGEYQDAYNLENAFNSFGRTATTFDAGEWTLQTVKPGVVNNAAGVPMAPHINISLFARGINIHLHTRLYFDDEAQANAKCPVLNLIEQPQRRETLIAKRCEVDGKTAYRFDIRIQGEGETVFFDF
［配列番号４０］ＣａｔＡ
MTVKISHTADIQAFFNRVAGLDHAEGNPRFKQIILRVLQDTARLIEDLEITEDEFWHAVDYLNRLGGRNEAGLLAAGLGIEHFLDLLQDAKDAEAGLGGGTPRTIEGPLYVAGAPLAQGEARMDDGTDPGVVMFLQGQVFDADGKPLAGATVDLWHANTQGTYSYFDSTQSEFNLRRRIITDAEGRYRARSIVPSGYGCDPQGPTQECLDLLGRHGQRPAHVHFFISAPGHRHLTTQINFAGDKYLWDDFAYATRDGLIGELRFVEDAAAARDRGVQGERFAELSFDFRLQGAKSPDAEARSHRPRALQEG
［配列番号４１］ＣａｔＢ
MTSVLIEHIDAIIVDLPTIRPHKLAMHTMQQQTLVVLRLRCSDGVEGIGEATTIGGLAYGYESPEGIKANIDAYLAPALIGLPADNINAAMLKLDKLAKGNTFAKSGIESALLDAQGKRLGLPVSELLGGRVRDSLEVAWTLASGDTARDIAEAQHMLDIRRHRVFKLKIGANPVAQDLKHVVAIKRELGDSASVRVDVNQYWDESQAIRACQVLGDNGIDLIEQPISRINRAGQVRLNQRSPAPIMADESIESVEDAFSLAADGAASIFALKIAKNGGPRAVLRTAQIAEAAGIALYGGTMLEGSIGTLASAHAFLTLRQLTWGTELFGPLLLTEEIVNEPPQYRDFQLHIPHTPGLGLTLDEQRLARFARR
［配列番号４２］ＡｒｏＹ
MTAPIQDLRDAIALLQQHDNQYLETDHPVDPNAELAGVYRHIGAGGTVKRPTRIGPAMMFNNIKGYPHSRILVGMHASRQRAALLLGCEASQLALEVGKAVKKPVAPVVVPASSAPCQEQIFLADDPDFDLRTLLPAPTNTPIDAGPFFCLGLALASDPVDASLTDVTIHRLCVQGRDELSMFLAAGRHIEVFRQKAEAAGKPLPITINMGLDPAIYIGACFEAPTTPFGYNELGVAGALRQRPVELVQGVSVPEKAIARAEIVIEGELLPGVRVREDQHTNSGHAMPEFPGYCGGANPSLPVIKVKAVTMRNNAILQTLVGPGEEHTTLAGLPTEASIWNAVEAAIPGFLQNVYAHTAGGGKFLGILQVKKRQPADEGRQGQAALLALATYSELKNIILVDEDVDIFDSDDILWAMTTRMQGDVSITTIPGIRGHQLDPSQTPEYSPSIRGNGISCKTIFDCTVPWALKSHFERAPFADVDPRPFAPEYFARLEKNQGSAK
［配列番号４３］ｖｄｈ遺伝子
ATGTTGCAGGTGCCTTTGCTGATTGGCGGGCAGTCGCGCCCCGCCAGCGATGGACGAACCTTCGAGCGCTGTAACCCGGTGACTGGCGAGGTGGTGTCGCAGGCTGCCGCCGCCACACTGGCCGATGCCGATGCCGCGGTGGCTGCTGCCAGCGCGGCGTTTCCGGCCTGGGCCGCCCTGGCACCGGGCGAGCGGCGCAGCCGCTTGCTGGCAGGCGCTGATCTGTTGCAGGCGAGGGCCGCCGAGTTCATCGCCGCCGCCGGTGAAACCGGGGCCATGGCCAACTGGTATGGCTTCAACGTGAAGTTGGCCGCCAACATGCTGCGCGAGGCTGCAGCCATGACCACGCAGATCACCGGTGAAGTGATCCCCTCGGACGTTCCCGGCAGCTTCGCAATGGCCCTGCGCGCGCCCTGCGGCGTGGTGTTGGGCATCGCACCGTGGAACGCCCCGGTGATACTGGCCACGCGTGCCATTGCCATGCCGCTGGCCTGCGGCAACACCGTGGTGCTCAAGGCCTCGGAGCTGAGCCCGGCGGTCCATCGGCTGATCGGCCAGGTGCTGCACGATGCAGGCATCGGCGACGGCGTGGTCAATGTCATCAGCAATGCGCCGCAGGATGCCCCCGCCATCGTCGAGCGGCTGATCGCCAACCCTGCGGTACGCCGGGTCAACTTCACCGGTTCGACGCACGTCGGGCGCATCGTCGGCGAACTGGCGGCCCGCCATCTCAAGCCGGCCCTGCTCGAACTGGGCGGCAAGGCACCTTTGCTGGTGCTCGACGATGCCGACCTGGACGCCACGGTCGAAGCGGCGGCCTTCGGTGCCTACTTCAACCAGGGGCAGATCTGCATGTCCACCGAGCGCCTTGTGGTGGACAGCTGTATTGCCGACGCTTTCGTCGACAAGCTGGCGGTGAAGATCGCCGGGCTGCGTGCAGGTGATCCGCAAGCCAGCACCTCGGTGCTCGGCTCGCTGGTCAGCGCAGCGGCCGGCGAGCGCATCAAGGCACTGATCGACGATGCCGTGGCCAAGGGCGCGCGCCTGGTCAGCGGCGGCCAGCTGGAAGGCAGCATCCTGCAACCGACCTTGCTCGACAACGTCGATGCCAGCATGCGCCTGTACCGCGAGGAGTCCTTCGGCCCGGTGGCGGTGGTACTGCGCGCCGAAGGCGACGAAGCCTTGCTGCAGCTGGCCAACGACTCGGAGTTCGGTCTGTCATCGGCCATTTTCAGCCGCGACACCAGCCGCGCCCTGGCCTTGGCCCAACGGGTGGAGTCGGGTATCTGCCATATCAACGGCCCGACCGTTCACGATGAAGCGCAGATGCCGTTTGGCGGGGTCAAGTCCAGCGGCTATGGCAGCTTCGGCAGCCGCACGGCCATCGATCAGTTCACCCAGTTGCGCTGGGTCACCCTCCAGCACGGCCCGCGTCACTATCCCATCTAG
［配列番号４４］ＰＰ＿１９４８遺伝子
ATGGCGGTATTTGCCAGTGACTCTTTTGGCCAGCTGAAAGTGGAGAAAATTATGACTGCCCAGTGGAACCACTACATTAACGGGGAATACGTATCACCCGAATCTGAAGAGTATATCCACGAGTTCATCCCAACCACGGCTTTGCCGGGTGACTCAATCGCAAGGGGCTCGGCAGCTGACGTTGATAAGGCTGTTCGTGCCGCGGCAGCGGCTCAGCCTGCCTGGAATGCACGCAAGCCAATTGAGCGGGGTCGTATCCTTCTCGCCATAGCTCGTTTGGTTCGCGCCAACGCAGCGGCTTTCTGCGCCAAAGAAGCGGAAGAAACTGGCAAGCCTCTGAAGATGGCCGCCTTTGAGATCGAGGCATGTGCTCAGTACTTTGAGTATTACGGCGGTTTGGCGACAGCCATCCAGGGCGAAACCATCAACCTCGGCCCCAGCTACCACGCCTATACCACCCGAGAGCCATTTGGAGTGGTGGGGGTCATCCTGCCGTGGAATTCGCCACTGAACCAAGCTGGGCGAGCCATTGCCCCGGCATTGGTTAGCGGGAACACCGTGGTGGTCAAACCTTCAGAGTTCACCTCGGTGACGATGCTCCAGTTCGCGGAACTGGTTGTGAAAGAGGCAGGGTTGCCACCAGGCGTATTGAACGTGGTTACCGGCACCGGTAAGGAAACCGGTGAGCCTCTGGTTAAACACCCTCTGATCCGAAAGGTTGCTTTCACCGGTTCTGTCCGTGCCGGACGGGAGATCGGCAAGCTCGCCGCAGATCGCATCATTCCGCTGTCGCTCGAATTGGGCGGCAAATCCCCGAACATTGTCTTCGAAGACGCAGATCTGGATCGAGCTGTCGCGGGTAGCGTCTTTGCCTTCACCGTCAACACTGGTCAAGTCTGTCTCGCCGGGACCCGTTGCCTGGTGCATGAGTCGATTTTTGAAAAATTCTCCAAGAAGCTTGCCGGTGCTGTAGAGGCGCTTCAGTTCAGCGACGGCGAAAGCTTCGGTCTCGGCCCCCTAACGACCAAGGCTCAGTTTGAGCAGGTTCATCGTTACAACGAGCTGGCCATCCAGGAGGGGGCTCATTGCTTGGTCGGTGGGGAAGCTCCAAGTGACAAAACCGGCTGGTACGTACGACCCACCGTCTACACCAACGTCAACAACTCGATGCGGATTGCTCGGGAAGAAATTTTCGGACCCGTTCTGGTACTGATTCCGTTCAAGGACGAAAACGAGGCGGTGGCCATCGCGAATGACTCGGACTACGGGCTCGCGGCTGGCGTATGGACCACCGATCTGGCTCGCGCGCACCGCGTATCCGCTCAAATCGAAGCGGGCCAGGTGTACGTCAACGAATATCCATCAGGTGGCGTTGAGACTCCATTCGGCGGTTTCAAGCAAAGCGGCCATGGGCGCGAGAAGGGCATTGAAGCACTCCACCATTACACCCAAACAAAGACGACCATCATCCGCATTTGA
［配列番号４５］ｌｉｇＶ遺伝子
ATGGACTCAGCGCGGATCGCGCCAGACCAGGAGAGAGACAGAATGGAATTTACCCGGCTTAACCCCATGACCGGCGAAGTCGCTTCGTCGGCGCCCGCGCTCAAGGCGGGTGACATTCCCGCGATCGCCCGCAAGGCCCGCGAAGGCTTCACCGCCTGGTCGGTGATGGGCCCCAATGCGCGCCGCGCCGTGCTGATGAAAGCCGCGACGGCGCTGGAAGCCCGCGCGGACGCGTTCGTCGATGCGATGATGGGAGAGATCGGCGCCACCAAGGGCTGGGCTCTGTTCAATCTCGGACTGGCGGCCAGCATGGTGCGCGAGGCAGCGGCCCTGACGACGCAGATCAATGGCGAAGTCATCCCCTCCGACAAGCCCGGCTGCCTCGCCATGGCGCTGCGCGAACCGGTGGGCGTCATTCTCGGCATCGCGCCCTGGAATGCGCCGATCATCCTCGGCGTGCGCGCCATCGCCGTGCCGCTGGCTTGCGGCAACAGCGTGATCCTGAAGGCGAGCGAGACCTGCCCGCGCACCCATGCCCTCATCATCGAGGCATTCGCAGATGCGGGGTTCCCCGAGGGAGTCGTCAACGTCGTCACCAATGCGCCAGCCGATGCGGGCGAAGTGGTCGGCGCGCTGATCGACGCGCCGGAAGTCAAGCGGATCAATTTCACCGGCTCCACCGGGGTCGGCAAGATCATCGCCAAGCGTGCCGCCGAGCATCTCAAGCCCGTGCTGCTGGAGCTGGGTGGCAAAGCCCCGCTCATTGTCCTGGAGGACGCCGATCTGGATGAAGCCGTCAAGGCGGCCGCCTTCGGCGCTTTCATGAACCAGGGGCAGATCTGCATGTCCACGGAGCGGATCATCGTGGTGGATGCGGTGGCCGACGAATTCGCCGCCCGGTTCAAGGCAAAGGTTTCGGCCATGCCTGTTGGCGATCCCCGGCAGGGAAGCACGCCGCTGGGAGCGGTCGTCGACACCAAGACTGTCGCGCATTGCCTGTCCTTGATCGAGGATGCGCTTGGAAAGGGCGCGGAGCAGCTGACGGGCGGCGAGACGACGCAGAATGTGCTGATGCCGGCGCATGTGATCGACCGCGTCACGCCCGACATGAAGCTCTTCCGGGACGAGAGCTTCGGTCCTGTCGTGGGGATCATCCGCGCACGCGACGCCGAGCATGCGATCGAACTGGCCAACGACACCGAATATGGTCTCTCGGCCTCGGTCTTCACGCGCGACACGGCCAAGGGCCTCAGCGTCGCCCGGCGGATCGAATCCGGGATCTGCCATGTCAACGGGCCGACGGTCCATGACGAGGCGCAGATGCCCTTCGGCGGCGTGAAGGCTTCGGGCTATGGTCGTTTCGGCGGCAAGGCCGGCATCGACAGCTTCACGGAGCTGCGCTGGATCACCATCGAGACCCAGCCGGGACATTTCCCGATCTGA
［配列番号１］プライマー１
ATGAATTCCTGATTCGTGCAGGGGTTAT
［配列番号２］プライマー２
GCTTCACCTCAGAAGAGCTCGGGCATGCCGGTTTCCTCTC
［配列番号３］プライマー３
GAGCTCTTCTGAGGTGAAGCTTGGG
［配列番号４］プライマー４
ATGGATCCTCCATCCTGTTCGTCATCAA
［配列番号５］プライマー５
ACAAGCTTGCATGCCGATGCACACCATGCAGCAG
［配列番号６］プライマー６
CCGGGGATCCTCTAGACAGCTCTGTACCCCAGGTG
［配列番号７］プライマー７
ATGTGAATTGCGGCCAGCGCCCAATACGCAAACC
［配列番号８］プライマー８
TCTGGTACCGCGGCCGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC
［配列番号９］プライマー９
ATGCGAGCTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGCCCGCCCAGGACAAC
［配列番号１０］プライマー１０
ATGCGGATCCCCCAAGCTTCACCTCAGAAG
［配列番号１１］プライマー１１
AGCTGGTACCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGCACCGATTCAG
［配列番号１２］プライマー１２
AGCTGGTACCTTATTTTGCGCTACCCTGGTT
［配列番号１３］プライマー１３
CATGATTACGCGGCCGCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGCACCGATT
［配列番号１４］プライマー１４
TCTGGTACCGCGGCCTTATTTTGCGCTACCCTGGTT
［配列番号１５］プライマー１５
ATGCGGTACCTTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGTGAAAATTTCCCA
［配列番号１６］プライマー１６
AGCTCCCGGGTCAGCCCTCCTGCAACGCCC
［配列番号１７］プライマー１７
CATGATTACGCGGCCGCTTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGTGA
［配列番号１８］プライマー１８
CTCTTTAATGCGGCCTCAGCCCTCCTGCAACGC
［配列番号１９］プライマー１９
ATGCGAGCTCATGTACCCCAAAAACACCT
［配列番号２０］プライマー２０
ATGCCCGGGTCAGATGTCCAGCACCAGCA
［配列番号２１］プライマー２１
CATGATTACGCGGCCATTAAAGAGGAGAAATTAAC
［配列番号２２］プライマー２２
CCTCTTTAAGCGGCCGCTCAGATGTCCAGCACCAG
［配列番号２３］プライマー２３
TCACCATGGGAAGCTATTAAAGAGGAGAAATTAACTAT
［配列番号２４］プライマー２４
TGGATCCACGAAGCTCCCAAGCTTCACCTCAGA
［配列番号２５］ＫｐｄＢ
MKLIIGMTGATGAPLGVALLQALRDMPEVETHLVMSKWAKTTIELETPWTAREVAALADFSHSPADQAATISSGSFRTDGMIVIPCSMKTLAGIRAGYAEGLVGRAADVVLKEGRKLVLVPREMPLSTIHLENMLALSRMGVAMVPPMPAYYNHPETVDDITNHIVTRVLDQFGLDYHKARRWNGLRTAEQFAQEIE
［配列番号２６］ＰｏｂＡ
MKTQVAIIGAGPSGLLLGQLLHKAGIDNIIVERQTAEYVLGRIRAGVLEQGTVDLLREAGVAERMDREGLVHEGVELLVGGRRQRLDLKALTGGKTVMVYGQTEVTRDLMQAREASGAPIIYSAANVQPHELKGEKPYLTFEKDGRVQRIDCDYIAGCDGFHGISRQSIPEGVLKQYERVYPFGWLGLLSDTPPVNHELIYAHHERGFALCSQRSQTRSRYYLQVPLQDRVEEWSDERFWDELKARLPAEVAADLVTGPALEKSIAPLRSLVVEPMQYGHLFLVGDAAHIVPPTGAKGLNLAASDVNYLYRILVKVYHEGRVDLLAQYSPLALRRVWKGERFSWFMTQLLHDFGSHKDAWDQKMQEADREYFLTSPAGLVNIAENYVGLPFEEVA
［配列番号２７］ＶａｎＡ
MYPKNTWYVACTPDEIATKPLGRQICGEKIVFYRARENQVAAVEDFCPHRGAPLSLGYVEDGNLVCGYHGLVMGCDGKTVSMPGQRVRGFPCNKTFAAVERYGFIWVWPGDQAQADPALIPHLEWAVSDEWAYGGGLFHIGCDYRLMIDNLMDLTHETYVHASSIGQKEIDEAPPVTTVTGDEVVTARHMENIMAPPFWRMALRGNGLADDVPVDRWQICRFTPPSHVLIEVGVAHAGKGGYHAEAQHKASSIVVDFITPESDTSIWYFWGMARNFAAHDQTLTDNIREGQGKIFSEDLEMLERQQQNLLAHPERNLLKLNIDAGGVQSRKVLERIIAQERAPQPQLIATSANPA
［配列番号２８］ＶａｎＢ
MIDAVVVSRNDEAQGICSFELAAADGSLLPAFSAGAHIDVHLPDGLVRQYSLCNHPEERHRYLIGVLNDPASRGGSRSLHEQVQAGARLRISAPRNLFPLAEGAQRSLLFAGGIGITPILCMAEQLSDSGQAFELHYCARSSERAAFVERIRSAPFADRLFVHFDEQPETALDIAQVLGNPQDDVHLYVCGPGGFMQHVLDSAKGLGWQEANLHREYFAAAPVDASNDGSFAVQVGSTGQVFEVPADRTVVQVLEENGIEIAMSCEQGICGTCLTRVLQGTPDHRDLFLTEEEQALNDQFTPCCSRSKTPLLVLDI
［配列番号２９］ｐｃａＨ遺伝子
ATGCCCGCCCAGGACAACAGCCGCTTCGTGATCCGTGATCGCAACTGGCACCCTAAAGCCCTTACGCCTGACTACAAGACCTCCGTTGCCCGCTCGCCGCGCCAGGCACTGGTCAGCATTCCGCAGTCGATCAGCGAAACCACTGGTCCGGACTTTTCCCATCTGGGCTTCGGCGCCCACGACCATGACCTGCTGCTGAACTTCAATAACGGTGGCCTGCCCATTGGCGAGCGCATCATCGTCGCCGGCCGTGTCGTCGACCAGTACGGCAAGCCTGTGCCGAACACTTTGGTGGAGATGTGGCAAGCCAACGCCGGCGGCCGCTATCGCCACAAGAACGATCGCTACCTGGCGCCCCTGGACCCGAACTTCGGTGGTGTTGGGCGGTGTCTGACCGACCGTGACGGCTATTACAGCTTCCGCACCATCAAGCCGGGCCCGTACCCATGGCGCAACGGCCCGAACGACTGGCGCCCGGCGCATATCCACTTCGCCATCAGCGGCCCATCGATCGCCACCAAGCTGATCACCCAGTTGTACTTCGAAGGTGACCCGCTGATCCCGATGTGCCCGATCGTCAAGTCGATCGCCAACCCGCAAGCCGTGCAGCAGTTGATCGCCAAGCTCGACATGAGCAACGCCAACCCGATGGACTGCCTGGCCTACCGCTTTGACATCGTGCTGCGCGGCCAGCGCAAGACCCACTTCGAAAACTGCTGA
［配列番号３０］ｐｃａＧ遺伝子
ATGCCAATCGAACTGCTGCCGGAAACCCCTTCGCAGACTGCCGGCCCCTACGTGCACATCGGCCTGGCCCTGGAAGCCGCCGGCAACCCGACCCGCGACCAGGAAATCTGGAACTGCCTGGCCAAGCCAGACGCCCCGGGCGAGCACATTCTGCTGATCGGCCACGTATATGACGGAAACGGCCACCTGGTGCGCGACTCGTTCCTGGAAGTGTGGCAGGCCGACGCCAACGGTGAGTACCAGGATGCCTACAACCTGGAAAACGCCTTCAACAGCTTTGGCCGCACGGCTACCACCTTCGATGCCGGTGAGTGGACGCTGCAAACGGTCAAGCCGGGTGTGGTGAACAACGCTGCTGGCGTGCCGATGGCGCCGCACATCAACATCAGCCTGTTTGCCCGTGGCATCAACATCCACCTGCACACGCGCCTGTATTTCGATGATGAGGCCCAGGCCAATGCCAAGTGCCCGGTGCTCAACCTGATCGAGCAGCCGCAGCGGCGTGAAACCTTGATTGCCAAGCGTTGCGAAGTGGATGGGAAGACGGCGTACCGCTTTGATATCCGCATTCAGGGGGAAGGGGAGACCGTCTTCTTCGACTTCTGA
［配列番号３１］ｃａｔＡ遺伝子
ATGACCGTGAAAATTTCCCACACTGCCGACATTCAAGCCTTCTTCAACCGGGTAGCTGGCCTGGACCATGCCGAAGGAAACCCGCGCTTCAAGCAGATCATTCTGCGCGTGCTGCAAGACACCGCCCGCCTGATCGAAGACCTGGAGATTACCGAGGACGAGTTCTGGCACGCCGTCGACTACCTCAACCGCCTGGGCGGCCGTAACGAGGCAGGCCTGCTGGCTGCTGGCCTGGGTATCGAGCACTTCCTCGACCTGCTGCAGGATGCCAAGGATGCCGAAGCCGGCCTTGGCGGCGGCACCCCGCGCACCATCGAAGGCCCGTTGTACGTTGCCGGGGCGCCGCTGGCCCAGGGCGAAGCGCGCATGGACGACGGCACTGACCCAGGCGTGGTGATGTTCCTTCAGGGCCAGGTGTTCGATGCCGACGGCAAGCCGTTGGCCGGTGCCACCGTCGACCTGTGGCACGCCAATACCCAGGGCACCTATTCGTACTTCGATTCGACCCAGTCCGAGTTCAACCTGCGTCGGCGTATCATCACCGATGCCGAGGGCCGCTACCGCGCGCGCTCGATCGTGCCGTCCGGGTATGGCTGCGACCCGCAGGGCCCAACCCAGGAATGCCTGGACCTGCTCGGCCGCCACGGCCAGCGCCCGGCGCACGTGCACTTCTTCATCTCGGCACCGGGGCACCGCCACCTGACCACGCAGATCAACTTTGCTGGCGACAAGTACCTGTGGGACGACTTTGCCTATGCCACCCGCGACGGGCTGATCGGCGAACTGCGTTTTGTCGAGGATGCGGCGGCGGCGCGCGACCGCGGTGTGCAAGGCGAGCGCTTTGCCGAGCTGTCATTCGACTTCCGCTTGCAGGGTGCCAAGTCGCCTGACGCCGAGGCGCGAAGCCATCGGCCGCGGGCGTTGCAGGAGGGCTGA
［配列番号３２］ｃａｔＢ遺伝子
ATGACAAGCGTGCTGATTGAACACATAGATGCAATTATCGTCGATCTCCCGACCATTCGCCCGCACAAGCTGGCGATGCACACCATGCAGCAGCAGACCCTGGTGGTATTGCGACTGCGCTGCAGCGATGGCGTGGAAGGCATCGGTGAAGCCACCACCATCGGTGGCCTGGCGTATGGCTACGAAAGCCCCGAAGGGATCAAGGCCAACATCGACGCGTACCTCGCCCCAGCGTTGATTGGCCTGCCGGCAGACAACATCAATGCCGCCATGCTCAAGCTGGACAAGCTGGCCAAGGGCAACACCTTCGCCAAGTCCGGCATCGAAAGCGCCTTGCTCGACGCCCAGGGCAAACGCCTGGGCCTGCCGGTCAGCGAACTGCTGGGTGGCCGCGTGCGTGACAGCCTGGAAGTGGCCTGGACCCTGGCCAGCGGCGACACCGCCCGCGACATCGCCGAAGCACAGCACATGCTGGACATTCGCCGGCACCGCGTGTTCAAGCTGAAAATCGGCGCCAACCCGGTGGCGCAGGACCTCAAGCACGTGGTCGCGATCAAGCGCGAGCTGGGTGACAGCGCCAGCGTGCGGGTCGACGTCAACCAGTACTGGGACGAGTCCCAGGCCATCCGCGCCTGCCAGGTATTGGGCGACAACGGCATCGACCTGATCGAGCAGCCGATTTCGCGCATCAACCGCGCTGGCCAGGTGCGCCTGAACCAGCGCAGTCCGGCTCCGATCATGGCCGATGAGTCGATCGAAAGCGTCGAGGACGCCTTCAGCCTGGCCGCCGACGGCGCCGCCAGCATCTTCGCCCTGAAAATCGCCAAGAATGGTGGCCCGCGCGCGGTTCTGCGCACTGCACAGATCGCCGAGGCCGCTGGCATCGCCTTGTACGGCGGCACCATGCTCGAAGGTTCGATCGGCACCCTGGCTTCGGCTCATGCATTCCTCACCCTGCGCCAGCTCACCTGGGGTACAGAGCTGTTCGGGCCGCTGCTGCTGACCGAGGAGATCGTCAACGAGCCGCCGCAATACCGCGACTTCCAGCTGCACATCCCCCACACCCCAGGCCTGGGCCTGACGTTGGACGAACAGCGCCTGGCGCGCTTCGCCCGTCGCTGA
［配列番号３３］ａｒｏＹ遺伝子
ATGACCGCACCGATTCAGGATCTGCGCGACGCCATCGCGCTGCTGCAACAGCATGACAATCAGTATCTCGAAACCGATCATCCGGTTGACCCTAACGCCGAGCTGGCCGGTGTTTATCGCCATATCGGCGCGGGCGGCACCGTGAAGCGCCCCACCCGCATCGGGCCGGCGATGATGTTTAACAATATTAAGGGTTATCCACACTCGCGCATTCTGGTGGGTATGCACGCCAGCCGCCAGCGGGCCGCGCTGCTGCTGGGCTGCGAAGCCTCGCAGCTGGCCCTTGAAGTGGGTAAGGCGGTGAAAAAACCGGTCGCGCCGGTGGTCGTCCCGGCCAGCAGCGCCCCCTGCCAGGAACAGATCTTTCTGGCCGACGATCCGGATTTTGATTTGCGCACCCTGCTTCCGGCGCCCACCAACACCCCTATCGACGCCGGCCCCTTCTTCTGCCTGGGCCTGGCGCTGGCCAGCGATCCCGTCGACGCCTCGCTGACCGACGTCACCATCCACCGCTTGTGCGTCCAGGGCCGGGATGAGCTGTCGATGTTTCTTGCCGCCGGCCGCCATATCGAAGTGTTTCGCCAAAAGGCCGAGGCCGCCGGCAAACCGCTGCCGATAACCATCAATATGGGTCTCGATCCGGCCATCTATATTGGCGCCTGCTTCGAAGCCCCTACCACGCCGTTCGGCTATAATGAGCTGGGCGTCGCCGGCGCGCTGCGTCAACGTCCGGTGGAGCTGGTTCAGGGCGTCAGCGTCCCGGAGAAAGCCATCGCCCGCGCCGAGATCGTTATCGAAGGTGAGCTGTTGCCTGGCGTGCGCGTCAGAGAGGATCAGCACACCAATAGCGGCCACGCGATGCCGGAATTTCCTGGCTACTGCGGCGGCGCTAATCCGTCGCTGCCGGTAATCAAAGTCAAAGCAGTGACCATGCGAAACAATGCGATTCTGCAGACCCTGGTGGGACCGGGGGAAGAGCATACCACCCTCGCCGGCCTGCCAACGGAAGCCAGTATCTGGAATGCCGTCGAGGCCGCCATTCCGGGCTTTTTACAAAATGTCTACGCCCACACCGCGGGTGGCGGTAAGTTCCTCGGGATCCTGCAGGTGAAAAAACGTCAACCCGCCGATGAAGGCCGGCAGGGGCAGGCCGCGCTGCTGGCGCTGGCGACCTATTCCGAGCTAAAAAATATTATTCTGGTTGATGAAGATGTCGACATCTTTGACAGCGACGATATCCTGTGGGCGATGACCACCCGCATGCAGGGGGACGTCAGCATTACGACAATCCCCGGCATTCGCGGTCACCAGCTGGATCCGTCCCAGACGCCGGAATACAGCCCGTCGATCCGTGGAAATGGCATCAGCTGCAAGACCATTTTTGACTGCACGGTCCCCTGGGCGCTGAAATCGCACTTTGAGCGCGCGCCGTTTGCCGACGTCGATCCGCGTCCGTTTGCACCGGAGTATTTCGCCCGGCTGGAAAAAAACCAGGGTAGCGCAAAATAA
［配列番号３４］ｋｐｄＢ遺伝子
ATGAAACTGATTATTGGGATGACGGGGGCCACCGGGGCACCGCTTGGGGTGGCATTGCTGCAGGCGCTGCGCGATATGCCGGAGGTGGAAACCCATCTGGTGATGTCGAAATGGGCCAAAACCACCATCGAGCTGGAAACGCCCTGGACGGCGCGCGAAGTGGCCGCGCTGGCGGACTTTTCCCACAGCCCGGCAGACCAGGCCGCCACCATCTCATCCGGTTCATTTCGTACCGACGGCATGATCGTTATTCCCTGCAGTATGAAAACGCTTGCAGGCATTCGCGCGGGTTATGCCGAAGGACTGGTGGGCCGCGCGGCGGACGTGGTGCTCAAAGAGGGGCGCAAGCTGGTGTTGGTCCCGCGGGAAATGCCGCTCAGCACGATCCATCTGGAGAACATGCTGGCGCTGTCCCGCATGGGCGTGGCGATGGTCCCGCCGATGTCAGCTTACTACAACCACCCGGAGACGGTTGACGATATCACCAATCATATCGTCACCCGGGTGCTGGATCAGTTTGGCCTCGACTATCACAAAGCGCGCCGCTGGAACGGCTTGCGCACGGCAGAACAATTTGCACAGGAGATCGAATAA
［配列番号３５］ｐｏｂＡ遺伝子
ATGAAAACTCAGGTTGCAATTATTGGTGCAGGTCCGTCTGGCCTGCTGCTGGGCCAGCTGCTGCACAAGGCCGGTATCGATAACATCATCGTCGAACGCCAGACTGCCGAGTACGTACTAGGCCGCATCCGCGCCGGGGTGCTAGAGCAAGGCACGGTCGACCTGCTGCGCGAGGCTGGCGTGGCCGAGCGCATGGACCGTGAAGGCCTGGTGCACGAGGGGGTTGAACTGCTGGTTGGCGGGCGCCGCCAGCGTCTGGATCTCAAAGCCCTGACCGGCGGCAAGACGGTGATGGTCTACGGCCAGACCGAAGTCACCCGTGACCTGATGCAGGCCCGCGAAGCCAGTGGTGCGCCGATCATTTATTCAGCCGCCAACGTTCAGCCGCATGAATTGAAAGGCGAGAAGCCCTACCTGACGTTCGAAAAGGATGGCCGGGTGCAGCGGATTGACTGCGACTATATCGCCGGCTGCGACGGCTTCCACGGTATCTCGCGGCAGAGCATCCCGGAGGGCGTGCTGAAACAGTATGAGCGGGTTTACCCGTTTGGCTGGCTGGGCCTGCTGTCGGACACACCGCCAGTCAATCACGAGTTGATCTACGCCCACCATGAGCGCGGTTTCGCGTTGTGTAGCCAACGCTCGCAAACACGCAGCCGCTACTACCTGCAGGTACCTTTGCAGGATCGGGTCGAGGAGTGGTCTGACGAGCGTTTCTGGGACGAACTGAAAGCCCGTCTGCCCGCCGAGGTGGCGGCGGACCTGGTCACAGGCCCCGCGTTGGAAAAAAGTATTGCGCCGCTGCGTAGCCTGGTGGTCGAACCCATGCAGTATGGTCACCTGTTCCTGGTGGGGGACGCGGCGCACATCGTCCCCCCTACGGGTGCCAAAGGCCTTAACCTGGCGGCCTCCGACGTCAACTACCTGTACCGCATTCTGGTCAAGGTGTACCACGAAGGGCGCGTCGACCTGCTTGCGCAATACTCGCCGCTGGCACTGCGCCGCGTGTGGAAGGGCGAGCGCTTCAGCTGGTTCATGACCCAACTGCTGCATGACTTCGGTAGCCACAAGGACGCCTGGGACCAGAAGATGCAGGAAGCTGACCGCGAGTACTTCCTGACCTCGCCGGCGGGCCTGGTGAACATTGCCGAGAACTATGTGGGGCTGCCGTTCGAGGAAGTTGCCTGA
［配列番号３６］ｖａｎＡ遺伝子
ATGTACCCCAAAAACACCTGGTACGTCGCCTGCACCCCCGATGAGATCGCCACCAAACCCCTGGGCCGGCAGATCTGCGGGGAAAAAATCGTGTTCTACCGCGCCCGCGAGAACCAAGTAGCCGCCGTCGAGGACTTCTGCCCGCACCGCGGCGCACCGTTGTCGTTGGGCTATGTCGAGGACGGCAACCTGGTGTGCGGCTACCACGGCCTGGTGATGGGTTGCGACGGCAAGACCGTGTCGATGCCGGGCCAACGGGTGCGTGGCTTCCCCTGCAACAAGACCTTTGCGGCCGTCGAGCGCTATGGCTTCATCTGGGTCTGGCCCGGTGACCAGGCGCAGGCCGACCCGGCGCTGATTCCGCATCTGGAATGGGCGGTGAGTGATGAGTGGGCCTACGGCGGCGGGCTGTTCCACATCGGTTGCGACTACCGCCTGATGATCGACAACCTCATGGACCTCACCCATGAAACCTATGTGCACGCCTCCAGCATCGGCCAGAAGGAGATCGACGAGGCACCGCCGGTCACCACCGTCACCGGCGACGAAGTGGTCACCGCCCGGCACATGGAAAACATCATGGCGCCACCGTTCTGGCGCATGGCCTTGCGTGGCAATGGCCTGGCCGACGATGTACCAGTGGACCGCTGGCAGATCTGCCGTTTCACCCCACCTAGCCATGTGCTGATCGAAGTGGGTGTAGCGCATGCCGGCAAGGGCGGCTACCACGCCGAGGCACAGCATAAGGCGTCGAGCATCGTGGTCGACTTCATCACCCCTGAGAGCGATACCTCTATCTGGTACTTCTGGGGCATGGCGCGCAACTTCGCTGCGCACGACCAGACCCTGACCGACAACATTCGTGAGGGCCAGGGCAAGATTTTCAGCGAAGACCTGGAAATGCTCGAACGCCAGCAGCAGAACCTGCTGGCCCACCCCGAGCGCAACTTGCTGAAGCTGAATATCGACGCCGGCGGCGTGCAGTCACGCAAAGTGCTGGAGCGGATCATCGCCCAAGAGCGTGCGCCGCAGCCGCAACTGATCGCCACCAGCGCCAACCCTGCCTGA
［配列番号３７］ｖａｎＢ遺伝子
ATGATCGATGCCGTAGTGGTATCCCGTAACGATGAAGCGCAGGGTATCTGCAGCTTCGAGCTGGCCGCGGCAGATGGCAGCCTGCTGCCGGCGTTCAGCGCCGGCGCCCATATCGACGTGCACCTGCCCGACGGGCTGGTGCGCCAGTATTCGCTGTGCAACCACCCCGAAGAACGCCATCGCTATCTGATTGGCGTACTCAACGACCCGGCTTCGCGGGGCGGTTCTCGTAGCCTGCACGAACAGGTGCAAGCCGGTGCCCGGCTGCGTATCAGTGCGCCGCGCAACCTGTTCCCGCTGGCCGAGGGTGCGCAGCGCAGTTTGCTGTTTGCTGGCGGTATCGGCATTACCCCAATCCTGTGCATGGCCGAGCAGCTGTCCGACAGCGGCCAGGCCTTCGAGCTGCACTACTGTGCCCGCTCCAGCGAGCGTGCGGCGTTTGTCGAGCGGATCCGCAGCGCGCCGTTCGCTGATCGGCTGTTCGTGCATTTTGACGAGCAGCCGGAAACGGCGCTGGACATCGCCCAGGTGCTGGGCAACCCGCAAGATGATGTGCACCTGTATGTATGCGGGCCCGGCGGGTTCATGCAGCATGTGCTGGACAGCGCGAAGGGGCTGGGCTGGCAGGAGGCCAACCTGCACCGCGAGTACTTCGCCGCAGCACCGGTGGATGCCAGCAACGATGGCAGTTTCGCGGTGCAGGTGGGCAGCACGGGACAGGTGTTCGAGGTGCCAGCCGACCGGACCGTGGTGCAGGTGCTGGAAGAGAATGGTATCGAGATCGCCATGTCGTGCGAGCAGGGTATTTGCGGCACCTGCCTGACACGCGTGCTGCAGGGCACACCGGACCATCGCGATCTGTTTCTCACCGAAGAGGAACAGGCCCTGAACGATCAGTTCACGCCCTGCTGCTCGCGCTCGAAGACGCCGCTGCTGGTGCTGGACATCTGA
［配列番号３８］ＰｃａＨ
MPAQDNSRFVIRDRNWHPKALTPDYKTSVARSPRQALVSIPQSISETTGPDFSHLGFGAHDHDLLLNFNNGGLPIGERIIVAGRVVDQYGKPVPNTLVEMWQANAGGRYRHKNDRYLAPLDPNFGGVGRCLTDRDGYYSFRTIKPGPYPWRNGPNDWRPAHIHFAISGPSIATKLITQLYFEGDPLIPMCPIVKSIANPQAVQQLIAKLDMSNANPMDCLAYRFDIVLRGQRKTHFENC
［配列番号３９］ＰｃａＧ
MPIELLPETPSQTAGPYVHIGLALEAAGNPTRDQEIWNCLAKPDAPGEHILLIGHVYDGNGHLVRDSFLEVWQADANGEYQDAYNLENAFNSFGRTATTFDAGEWTLQTVKPGVVNNAAGVPMAPHINISLFARGINIHLHTRLYFDDEAQANAKCPVLNLIEQPQRRETLIAKRCEVDGKTAYRFDIRIQGEGETVFFDF
［配列番号４０］ＣａｔＡ
MTVKISHTADIQAFFNRVAGLDHAEGNPRFKQIILRVLQDTARLIEDLEITEDEFWHAVDYLNRLGGRNEAGLLAAGLGIEHFLDLLQDAKDAEAGLGGGTPRTIEGPLYVAGAPLAQGEARMDDGTDPGVVMFLQGQVFDADGKPLAGATVDLWHANTQGTYSYFDSTQSEFNLRRRIITDAEGRYRARSIVPSGYGCDPQGPTQECLDLLGRHGQRPAHVHFFISAPGHRHLTTQINFAGDKYLWDDFAYATRDGLIGELRFVEDAAAARDRGVQGERFAELSFDFRLQGAKSPDAEARSHRPRALQEG
［配列番号４１］ＣａｔＢ
MTSVLIEHIDAIIVDLPTIRPHKLAMHTMQQQTLVVLRLRCSDGVEGIGEATTIGGLAYGYESPEGIKANIDAYLAPALIGLPADNINAAMLKLDKLAKGNTFAKSGIESALLDAQGKRLGLPVSELLGGRVRDSLEVAWTLASGDTARDIAEAQHMLDIRRHRVFKLKIGANPVAQDLKHVVAIKRELGDSASVRVDVNQYWDESQAIRACQVLGDNGIDLIEQPISRINRAGQVRLNQRSPAPIMADESIESVEDAFSLAADGAASIFALKIAKNGGPRAVLRTAQIAEAAGIALYGGTMLEGSIGTLASAHAFLTLRQLTWGTELFGPLLLTEEIVNEPPQYRDFQLHIPHTPGLGLTLDEQRLARFARR
［配列番号４２］ＡｒｏＹ
MTAPIQDLRDAIALLQQHDNQYLETDHPVDPNAELAGVYRHIGAGGTVKRPTRIGPAMMFNNIKGYPHSRILVGMHASRQRAALLLGCEASQLALEVGKAVKKPVAPVVVPASSAPCQEQIFLADDPDFDLRTLLPAPTNTPIDAGPFFCLGLALASDPVDASLTDVTIHRLCVQGRDELSMFLAAGRHIEVFRQKAEAAGKPLPITINMGLDPAIYIGACFEAPTTPFGYNELGVAGALRQRPVELVQGVSVPEKAIARAEIVIEGELLPGVRVREDQHTNSGHAMPEFPGYCGGANPSLPVIKVKAVTMRNNAILQTLVGPGEEHTTLAGLPTEASIWNAVEAAIPGFLQNVYAHTAGGGKFLGILQVKKRQPADEGRQGQAALLALATYSELKNIILVDEDVDIFDSDDILWAMTTRMQGDVSITTIPGIRGHQLDPSQTPEYSPSIRGNGISCKTIFDCTVPWALKSHFERAPFADVDPRPFAPEYFARLEKNQGSAK
［配列番号４３］ｖｄｈ遺伝子
ATGTTGCAGGTGCCTTTGCTGATTGGCGGGCAGTCGCGCCCCGCCAGCGATGGACGAACCTTCGAGCGCTGTAACCCGGTGACTGGCGAGGTGGTGTCGCAGGCTGCCGCCGCCACACTGGCCGATGCCGATGCCGCGGTGGCTGCTGCCAGCGCGGCGTTTCCGGCCTGGGCCGCCCTGGCACCGGGCGAGCGGCGCAGCCGCTTGCTGGCAGGCGCTGATCTGTTGCAGGCGAGGGCCGCCGAGTTCATCGCCGCCGCCGGTGAAACCGGGGCCATGGCCAACTGGTATGGCTTCAACGTGAAGTTGGCCGCCAACATGCTGCGCGAGGCTGCAGCCATGACCACGCAGATCACCGGTGAAGTGATCCCCTCGGACGTTCCCGGCAGCTTCGCAATGGCCCTGCGCGCGCCCTGCGGCGTGGTGTTGGGCATCGCACCGTGGAACGCCCCGGTGATACTGGCCACGCGTGCCATTGCCATGCCGCTGGCCTGCGGCAACACCGTGGTGCTCAAGGCCTCGGAGCTGAGCCCGGCGGTCCATCGGCTGATCGGCCAGGTGCTGCACGATGCAGGCATCGGCGACGGCGTGGTCAATGTCATCAGCAATGCGCCGCAGGATGCCCCCGCCATCGTCGAGCGGCTGATCGCCAACCCTGCGGTACGCCGGGTCAACTTCACCGGTTCGACGCACGTCGGGCGCATCGTCGGCGAACTGGCGGCCCGCCATCTCAAGCCGGCCCTGCTCGAACTGGGCGGCAAGGCACCTTTGCTGGTGCTCGACGATGCCGACCTGGACGCCACGGTCGAAGCGGCGGCCTTCGGTGCCTACTTCAACCAGGGGCAGATCTGCATGTCCACCGAGCGCCTTGTGGTGGACAGCTGTATTGCCGACGCTTTCGTCGACAAGCTGGCGGTGAAGATCGCCGGGCTGCGTGCAGGTGATCCGCAAGCCAGCACCTCGGTGCTCGGCTCGCTGGTCAGCGCAGCGGCCGGCGAGCGCATCAAGGCACTGATCGACGATGCCGTGGCCAAGGGCGCGCGCCTGGTCAGCGGCGGCCAGCTGGAAGGCAGCATCCTGCAACCGACCTTGCTCGACAACGTCGATGCCAGCATGCGCCTGTACCGCGAGGAGTCCTTCGGCCCGGTGGCGGTGGTACTGCGCGCCGAAGGCGACGAAGCCTTGCTGCAGCTGGCCAACGACTCGGAGTTCGGTCTGTCATCGGCCATTTTCAGCCGCGACACCAGCCGCGCCCTGGCCTTGGCCCAACGGGTGGAGTCGGGTATCTGCCATATCAACGGCCCGACCGTTCACGATGAAGCGCAGATGCCGTTTGGCGGGGTCAAGTCCAGCGGCTATGGCAGCTTCGGCAGCCGCACGGCCATCGATCAGTTCACCCAGTTGCGCTGGGTCACCCTCCAGCACGGCCCGCGTCACTATCCCATCTAG
［配列番号４４］ＰＰ＿１９４８遺伝子
ATGGCGGTATTTGCCAGTGACTCTTTTGGCCAGCTGAAAGTGGAGAAAATTATGACTGCCCAGTGGAACCACTACATTAACGGGGAATACGTATCACCCGAATCTGAAGAGTATATCCACGAGTTCATCCCAACCACGGCTTTGCCGGGTGACTCAATCGCAAGGGGCTCGGCAGCTGACGTTGATAAGGCTGTTCGTGCCGCGGCAGCGGCTCAGCCTGCCTGGAATGCACGCAAGCCAATTGAGCGGGGTCGTATCCTTCTCGCCATAGCTCGTTTGGTTCGCGCCAACGCAGCGGCTTTCTGCGCCAAAGAAGCGGAAGAAACTGGCAAGCCTCTGAAGATGGCCGCCTTTGAGATCGAGGCATGTGCTCAGTACTTTGAGTATTACGGCGGTTTGGCGACAGCCATCCAGGGCGAAACCATCAACCTCGGCCCCAGCTACCACGCCTATACCACCCGAGAGCCATTTGGAGTGGTGGGGGTCATCCTGCCGTGGAATTCGCCACTGAACCAAGCTGGGCGAGCCATTGCCCCGGCATTGGTTAGCGGGAACACCGTGGTGGTCAAACCTTCAGAGTTCACCTCGGTGACGATGCTCCAGTTCGCGGAACTGGTTGTGAAAGAGGCAGGGTTGCCACCAGGCGTATTGAACGTGGTTACCGGCACCGGTAAGGAAACCGGTGAGCCTCTGGTTAAACACCCTCTGATCCGAAAGGTTGCTTTCACCGGTTCTGTCCGTGCCGGACGGGAGATCGGCAAGCTCGCCGCAGATCGCATCATTCCGCTGTCGCTCGAATTGGGCGGCAAATCCCCGAACATTGTCTTCGAAGACGCAGATCTGGATCGAGCTGTCGCGGGTAGCGTCTTTGCCTTCACCGTCAACACTGGTCAAGTCTGTCTCGCCGGGACCCGTTGCCTGGTGCATGAGTCGATTTTTGAAAAATTCTCCAAGAAGCTTGCCGGTGCTGTAGAGGCGCTTCAGTTCAGCGACGGCGAAAGCTTCGGTCTCGGCCCCCTAACGACCAAGGCTCAGTTTGAGCAGGTTCATCGTTACAACGAGCTGGCCATCCAGGAGGGGGCTCATTGCTTGGTCGGTGGGGAAGCTCCAAGTGACAAAACCGGCTGGTACGTACGACCCACCGTCTACACCAACGTCAACAACTCGATGCGGATTGCTCGGGAAGAAATTTTCGGACCCGTTCTGGTACTGATTCCGTTCAAGGACGAAAACGAGGCGGTGGCCATCGCGAATGACTCGGACTACGGGCTCGCGGCTGGCGTATGGACCACCGATCTGGCTCGCGCGCACCGCGTATCCGCTCAAATCGAAGCGGGCCAGGTGTACGTCAACGAATATCCATCAGGTGGCGTTGAGACTCCATTCGGCGGTTTCAAGCAAAGCGGCCATGGGCGCGAGAAGGGCATTGAAGCACTCCACCATTACACCCAAACAAAGACGACCATCATCCGCATTTGA
［配列番号４５］ｌｉｇＶ遺伝子
ATGGACTCAGCGCGGATCGCGCCAGACCAGGAGAGAGACAGAATGGAATTTACCCGGCTTAACCCCATGACCGGCGAAGTCGCTTCGTCGGCGCCCGCGCTCAAGGCGGGTGACATTCCCGCGATCGCCCGCAAGGCCCGCGAAGGCTTCACCGCCTGGTCGGTGATGGGCCCCAATGCGCGCCGCGCCGTGCTGATGAAAGCCGCGACGGCGCTGGAAGCCCGCGCGGACGCGTTCGTCGATGCGATGATGGGAGAGATCGGCGCCACCAAGGGCTGGGCTCTGTTCAATCTCGGACTGGCGGCCAGCATGGTGCGCGAGGCAGCGGCCCTGACGACGCAGATCAATGGCGAAGTCATCCCCTCCGACAAGCCCGGCTGCCTCGCCATGGCGCTGCGCGAACCGGTGGGCGTCATTCTCGGCATCGCGCCCTGGAATGCGCCGATCATCCTCGGCGTGCGCGCCATCGCCGTGCCGCTGGCTTGCGGCAACAGCGTGATCCTGAAGGCGAGCGAGACCTGCCCGCGCACCCATGCCCTCATCATCGAGGCATTCGCAGATGCGGGGTTCCCCGAGGGAGTCGTCAACGTCGTCACCAATGCGCCAGCCGATGCGGGCGAAGTGGTCGGCGCGCTGATCGACGCGCCGGAAGTCAAGCGGATCAATTTCACCGGCTCCACCGGGGTCGGCAAGATCATCGCCAAGCGTGCCGCCGAGCATCTCAAGCCCGTGCTGCTGGAGCTGGGTGGCAAAGCCCCGCTCATTGTCCTGGAGGACGCCGATCTGGATGAAGCCGTCAAGGCGGCCGCCTTCGGCGCTTTCATGAACCAGGGGCAGATCTGCATGTCCACGGAGCGGATCATCGTGGTGGATGCGGTGGCCGACGAATTCGCCGCCCGGTTCAAGGCAAAGGTTTCGGCCATGCCTGTTGGCGATCCCCGGCAGGGAAGCACGCCGCTGGGAGCGGTCGTCGACACCAAGACTGTCGCGCATTGCCTGTCCTTGATCGAGGATGCGCTTGGAAAGGGCGCGGAGCAGCTGACGGGCGGCGAGACGACGCAGAATGTGCTGATGCCGGCGCATGTGATCGACCGCGTCACGCCCGACATGAAGCTCTTCCGGGACGAGAGCTTCGGTCCTGTCGTGGGGATCATCCGCGCACGCGACGCCGAGCATGCGATCGAACTGGCCAACGACACCGAATATGGTCTCTCGGCCTCGGTCTTCACGCGCGACACGGCCAAGGGCCTCAGCGTCGCCCGGCGGATCGAATCCGGGATCTGCCATGTCAACGGGCCGACGGTCCATGACGAGGCGCAGATGCCCTTCGGCGGCGTGAAGGCTTCGGGCTATGGTCGTTTCGGCGGCAAGGCCGGCATCGACAGCTTCACGGAGCTGCGCTGGATCACCATCGAGACCCAGCCGGGACATTTCCCGATCTGA
【産業上の利用可能性】
【0180】
本発明の一態様の形質転換微生物やムコン酸の製造方法によって、リグニン由来の芳香族化合物やリグニンを含むバイオマスから、ムコン酸が得られる。ムコン酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などの用途があるムコン酸誘導体の原料として利用することができる。
【図1】
【配列表】