(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-07
(45)【発行日】2022-06-15
(54)【発明の名称】細菌メタゲノム分析を通した前立腺疾患の診断方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20220608BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20220608BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALN20220608BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220608BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20220608BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6886 Z
C12N15/09 Z
C12N15/10 100Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2019535312
(86)(22)【出願日】2017-12-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-02-06
(86)【国際出願番号】 KR2017015576
(87)【国際公開番号】W WO2018124742
(87)【国際公開日】2018-07-05
【審査請求日】2019-08-23
(31)【優先権主張番号】10-2016-0181570
(32)【優先日】2016-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2017-0180014
(32)【優先日】2017-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】516348577
【氏名又は名称】エムディー ヘルスケア インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＤ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ユン－クン
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０９９０７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５０３８５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５０３８５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Archives of Medical Science，2015年，Vol.11, No.2 ，pp.385-394
【文献】Frontiers in Microbiology，2016年，Vol.7, Article 1489，pp.1-7
【文献】BMC Veterinary Research，2017年，13:65，pp.1-11
【文献】Journal of Medical Virology，2014年，Vol.86，pp.2042-2048
【文献】Experimental & Molecular Medicine，2016年，Vol.48, No.e208，pp.1-8
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８－１／７０
Ｃ１２Ｎ １５／０９－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと被検体サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して
正常ヒトに比べて被検体サンプルで、
アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が増加しており、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）およびリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が減少している場合、前立腺癌であると判定する段階；または
リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびメタノブレウィバクテル（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が増加しており、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）およびリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が減少している場合、前立腺肥大症であると判定する段階を含み、
前記被検体サンプルは、小便であることを特徴とする、メタゲノム解析を通した前立腺癌または前立腺肥大症の判定のための情報提供方法。
【請求項2】
前記段階（ｃ）の正常ヒトと被検体サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階で、正常ヒトに比べて被検体サンプルで、
アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が増加しており、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）およびリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が減少しており；
ユーリ古細菌（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、ゲンマティモナス門（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、アキドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびプランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
メタノバクテリア（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ヴェルコミクロビウム綱（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、アシディミクロビウム綱（Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｉａ）、スパルトバクテリア（Ｓｐａｒｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ゲンマティモナス綱（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、アキドバクテリウム綱（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、およびペドスパイラ（Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
メタノバクテリア目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、ヴェルコミクロビア目（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、粘液細菌目（Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、アシディミクロビウム目（Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、クトニオバクター目（Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、アキドバクテリウム目（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、およびペドスパイラ目（Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
メタノバクテリアセエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ヴェルコミクロビア科（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、リケネラセエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ウィクセラセエ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）、ストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ヘリコバクター科（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、クトニオバクター科（Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、およびコリバクテリアセアエ（Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、メタノブレウィバクテル（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）、ロドプラネス（Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ）、サーモアネロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダタスコリパクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ）、およびフレキスピラ（Ｆｌｅｘｉｓｐｉｒａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が増加している場合；または
テネリクテス（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、アルテロモナス目（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、およびナイセリア目（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エグジゴバクテリウム科（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、放線菌科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、セルロモナダシアエ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、フソバクテリアセエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ポルフィロモナダシアエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、フラボバクテリウム科（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ）、およびナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
テトラジェノコッカス属（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、モーガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、エグジゴバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オリバクテリウム（Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、放線菌属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、アドラークルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、およびパラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、前立腺癌であると判定することを特徴とする、請求項１に記載のメタゲノム解析を通した前立腺癌または前立腺肥大症の判定のための情報提供方法。
【請求項3】
前記段階（ｃ）の正常ヒトと被検体サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階で、正常ヒトに比べて被検体サンプルで、
リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびメタノブレウィバクテル（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が増加しており、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）およびリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が減少しており；
ユーリ古細菌（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）およびアキドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
メタノバクテリア（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびアキドバクテリウム綱（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
メタノバクテリア目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）およびアキドバクテリウム目（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、リケネラセエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、メタノバクテリアセエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、およびコリバクテリアセアエ（Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ビロフィラ（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）、およびクロモハロバクタ一属（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が増加している場合；または
ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、サプロスピラ目（Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ）、およびシュードモナダーレス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
エグジゴバクテリウム科（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フラボバクテリウム科（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、放線菌科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、およびモラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、前立腺肥大症であると判定することを特徴とする、請求項１に記載のメタゲノム解析を通した前立腺癌または前立腺肥大症の判定のための情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌メタゲノム分析を通して前立腺癌および前立腺肥大症などの前立腺疾患を診断する方法に関し、より具体的には、被検体由来サンプルを利用して細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することによって、前立腺疾患を診断する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
男性生殖器官の一部である前立腺は、精子と混ざって精液を作る液体を作る臓器である。前立腺肥大症は、前立腺が肥大化して、膀胱下部の尿が出る道を遮って、尿道の尿の流れが詰まったり減少した状態であり、陽性前立腺肥大症（ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｔｓｔａｔｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ、ＢＰＨ）は、男性排尿障害によって前立腺のサイズが増加して、排尿を困難にする疾患である。前立腺は、尿を膀胱から移動させる管（尿管）を取り囲んでおり、思春期の間に前立腺は均等に膨張し、年が取るほど腺の尿道の側方部に集中して前立腺肥大が進行される。陽性前立腺肥大症の原因は、まだ明確に明らかにされていないが、他の慢性疾患と同様に、様々な要因が作用すると知られている。前立腺は、男性ホルモン依存器官であるから、成長と機能を維持するためには、持続的な男性ホルモンが必要であり、去勢によって男性ホルモンが生成されなければ、前立腺は萎縮するなどの原因があり、遺伝的要因と家族歴等も、前立腺肥大症と関連があると知られている。
【0003】
前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、前立腺に発生する悪性腫瘍であって、大部分は、前立腺細胞で発生する腺癌（腺細胞の癌）である。前立腺癌の危険要因は、高齢（５０才以上）で急激に増加する。人種によっては、東洋人の発生率が最も低く、遺伝的素因、家族歴、男性ホルモン、糖尿病、肥満、西欧化した食生活（動物性脂肪摂取の増加）、感染などが危険要因と知られている。早期検診によって前立腺癌による死亡を予防することができるという明確な証拠はないが、一般的に、寿命が１０年以上残っていると予想される５０才以上の男性には、毎年血中（血清）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）測定検査と直腸指診検査を受けることを勧告している。しかし、現代西洋医学の多くの発展にも関わらず、まだ非侵襲的な方法で前立腺癌を予測する方法はなく、既存の診断方法では、前立腺癌などの固形癌が進行された場合に発見される場合が多いので、前立腺癌による医療費用と死亡を予防するためには、前立腺癌の発生および原因因子をあらかじめ予測して、高危険群において前立腺癌の発生を予防する方法を提供することが効率的な方法である。
【0004】
一方、人体に共生する微生物は、１００兆に達してヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を超えると知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた居住地に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と病気に大きい影響を及ぼすものと知られている。人体に共生する細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質などの情報を交換するためにナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成して、粘膜に共生する細菌である場合には粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズが大概１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通過して人体に吸収される。
【0005】
環境ゲノミクスとも呼ばれるメタゲノム学は、環境で採取したサンプルから得られたメタゲノム資料に対する分析学と言える（韓国特許公開第２０１１－００７３０４９号）。 最近、１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ）塩基配列を基盤とした方法でヒトの微生物叢の細菌構成をリスト化することが可能になり、１６ｓリボソームＲＮＡの遺伝子である１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）ｐｌａｔｆｏｒｍを利用して分析する。しかし、 前立腺肥大症および前立腺癌などの前立腺疾患の発病において、尿などの人体由来物から細菌由来小胞に存在するメタゲノム分析を通して前立腺疾患の原因因子を同定し、前立腺疾患の発病危険度を診断する方法については報告されたことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、前立腺肥大症および前立腺癌の原因因子をベースに前立腺疾患を診断するために、被検体由来サンプルである尿から細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、その結果、前立腺癌および前立腺肥大症などの前立腺疾患の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【0007】
これより、本発明は、細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を通して前立腺癌を診断するための情報提供方法を提供することを目的とする。また、本発明は、細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を通して前立腺肥大症患者において前立腺癌を診断するための情報提供方法を提供することを目的とする。また、本発明は、細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を通して前立腺肥大症を診断するための情報提供方法を提供することを目的とする。
【0008】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されてない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、前立腺疾患診断のための情報提供方法を提供する。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【0010】
また、本発明は、下記の段階を含む、前立腺疾患の診断方法を提供する。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【0011】
また、本発明は、下記の段階を含む、前立腺疾患の発病危険度の予測方法を提供する。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【0012】
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＴｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0013】
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｉａ、Ｓｐａｒｔｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ－６、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｅよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0014】
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＳｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ｉｉｉ１－１５、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｌｌｉｎ３２９、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0015】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＰｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓ２４－７、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、およびＫｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0016】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＲｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、ＳＭＢ５３、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ、およびＦｌｅｘｉｓｐｉｒａよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0017】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で前立腺肥大症患者由来サンプルと比較してＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0018】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で前立腺肥大症患者由来サンプルと比較してＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｅよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0019】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で前立腺肥大症患者由来サンプルと比較してＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、およびＥｌｌｉｎ３２９よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0020】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で前立腺肥大症患者由来サンプルと比較してＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0021】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で前立腺肥大症患者由来サンプルと比較してＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、およびＦｌｅｘｉｓｐｉｒａよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺癌を診断するものであってもよい。
【0022】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺肥大症を診断するものであってもよい。
【0023】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺肥大症を診断するものであってもよい。
【0024】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＳｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺肥大症を診断するものであってもよい。
【0025】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＥｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＫｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺肥大症を診断するものであってもよい。
【0026】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）で正常ヒト由来サンプルと比較してＲｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、ＳＭＢ５３、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して前立腺肥大症を診断するものであってもよい。
【0027】
本発明のさらに他の具現例において、前記サンプルは、尿であってもよい。
【発明の効果】
【0028】
環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて、癌の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、前立腺肥大症および前立腺癌は、症状が現れる前に早期診断が難しいため、効率的な治療が難しいのが現状であるから、本発明による人体由来サンプルを利用した細菌または細菌由来細胞外小胞のメタゲノム分析を通して前立腺肥大症および前立腺癌などの前立腺疾患発病の危険度をあらかじめ予測することによって、前立腺疾患の危険群を早期に診断および予測して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができるので、前立腺疾患の発病率を低下させ、治療効果を高めることができる。また、前立腺肥大症あるいは前立腺癌と診断された患者においてメタゲノム分析を通して原因因子を予測して、原因因子に対する露出を避けることによって、前立腺肥大症および前立腺癌の経過を良くしたり、再発を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1-2】図１は、体内で細菌由来細胞外小胞の分布様相を評価するためのものであって、図１ａは、マウスに腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および細菌由来小包（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別（０、５ｍｉｎ、３ｈ、６ｈ、および１２ｈ）にこれらの分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、マウスに腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）を口腔で投与し、１２時間後に尿および多様な臓器（心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、脂肪組織、および筋肉）を摘出して、前記細菌および細胞外小胞の分布様相を撮影した写真である。
【図8】図７は、前立腺癌患者および前立腺肥大症患者の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図10】図９は、前立腺癌患者および前立腺肥大症患者の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図11】図１０は、前立腺癌患者および前立腺肥大症患者の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図12】図１１は、前立腺癌患者および前立腺肥大症患者の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図13】図１２は、前立腺肥大症患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明は、細菌メタゲノム分析を通して前立腺肥大症および前立腺癌などの前立腺疾患を診断する方法に関し、本発明者らは、被検体由来サンプルを利用して細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、前立腺疾患の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定した。
【0031】
これより、本発明は、（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含む前立腺疾患診断のための情報提供方法を提供する。
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して前立腺肥大症患者と前立腺癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと前立腺肥大症患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含む前立腺疾患診断のための情報提供方法を提供する。
【0032】
本発明において使用される用語「前立腺癌診断」とは、患者に対して前立腺癌が発病する可能性があるか、前立腺癌が発病する可能性が相対的に高いか、または、前立腺癌がすでに発病したかどうかを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する前立腺癌の発病危険度が高い患者にとって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするのに使用することができる。また、本発明の方法は、前立腺癌を早期に診断して、最も適切な治療方式を選択することによって、治療を決定するために臨床的に使用することができる。
【0033】
本発明において使用される用語「前立腺肥大症診断」とは、患者に対して前立腺肥大症が発病する可能性があるか、前立腺肥大症が発病する可能性が相対的に高いか、または、前立腺肥大症がすでに発病したかどうかを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する前立腺肥大症の発病危険度が高い患者にとって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするのに使用することができる。また、本発明の方法は、前立腺肥大症を早期に診断して、最も適切な治療方式を選択することによって、治療を決定するために臨床的に使用することができる。
【0034】
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群遺伝体」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、かびなどを含む遺伝体の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、配列分析器を使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノムまたは遺伝体をいうものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝体であって、一種の混合遺伝体をいう。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、速い配列分析法を利用して、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を糾明する技法の対象である。本発明では、好ましくは血清から分離した細菌由来細胞外小胞を利用してメタゲノム分析を実施した。
【0035】
本発明の実施例では、正常ヒト、前立腺肥大症患者、および前立腺癌患者の尿内細菌由来細胞外小胞に存在する遺伝子に対するメタゲノム分析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、および属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際に前立腺癌および前立腺肥大症の発生原因として作用できる細菌由来小胞を同定した。
【0036】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門細菌由来小胞が前立腺癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【0037】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｉａ、Ｓｐａｒｔｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ－６、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｅ綱細菌由来小胞が前立腺癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【0038】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ｉｉｉ１－１５、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｌｌｉｎ３２９、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ目細菌由来小胞が前立腺癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【0039】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓ２４－７、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、およびＫｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科細菌由来小胞が前立腺癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【0040】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、ＳＭＢ５３、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ、およびＦｌｅｘｉｓｐｉｒａ属細菌由来小胞が前立腺癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【0041】
本発明のさらに他の実施例では、前立腺肥大症患者と前立腺癌患者の尿内細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、および属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際に前立腺肥大症患者において前立腺癌の発生原因として作用できる細菌由来小胞を同定した。
【0042】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門細菌由来小胞が前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間に有意な差異があった（実施例５参照）。
【0043】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｅ綱細菌由来小胞が前立腺癌患者と前立腺肥大症患者の間に有意な差異があった（実施例５参照）。
【0044】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、およびＥｌｌｉｎ３２９目細菌由来小胞が前立腺癌患者と前立腺肥大症患者の間に有意な差異があった（実施例５参照）。
【0045】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科細菌由来小胞が前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との間に有意な差異があった（実施例５参照）。
【0046】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｆｌｅｘｉｓｐｉｒａ属細菌由来小胞が前立腺癌患者と前立腺肥大症患者の間に有意な差異があった（実施例５参照）。
【0047】
本発明のさらに他の実施例では、正常ヒトと前立腺肥大症患者の尿内細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、および属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際に喘息患者において前立腺癌の発生原因として作用できる細菌由来小胞を同定した。
【0048】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌由来小胞が前立腺肥大症患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例６参照）。
【0049】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ綱細菌由来小胞が前立腺肥大症患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例６参照）。
【0050】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌由来小胞が前立腺肥大症患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例６参照）。
【0051】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＫｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科細菌由来小胞が前立腺肥大症患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例６参照）。
【0052】
より具体的に、本発明の一実施例では、細菌由来メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、ＳＭＢ５３、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ属細菌由来小胞が前立腺肥大症患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例６参照）。
【0053】
本発明は、上記のような実施例結果を通じて、尿から分離した細菌由来細胞外小胞に対しメタゲノム分析を実施することによって、正常ヒトおよび前立腺肥大症患者と比較して前立腺癌患者において含量が有意に変化した細菌由来小胞を同定し、メタゲノム分析を通して前記各レベルで細菌由来小胞の含量増減を分析することによって、前立腺癌を診断することができることを確認した。
【0054】
また、本発明は、上記のような実施例結果を通じて、尿から分離した細菌由来細胞外小胞に対してメタゲノム分析を実施することによって、正常ヒトと比較して前立腺肥大症患者において含量が有意に変化した細菌由来小胞を同定し、メタゲノム分析を通して前記各レベルで細菌由来小胞の含量増減を分析することによって、前立腺肥大症を診断することができることを確認した。
【0055】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0056】
［実施例］
実施例１．腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管で投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図１ａに示したように、前記細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）である場合には、全身的に吸収されないか、細菌由来小胞（ＥＶ）である場合には、投与後に５分に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
実施例１．腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管で投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図１ａに示したように、前記細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）である場合には、全身的に吸収されないか、細菌由来小胞（ＥＶ）である場合には、投与後に５分に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
【0057】
腸内細菌と腸内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を前記の方法のように投与した後１２時間目にマウスから血液（Ｂｌｏｏｄ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝（Ｌｉｖｅｒ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、脂肪組織（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、および筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）を摘出した。前記摘出した組織で蛍光を観察した結果、図１ｂに示したように、前記腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）は、各臓器に吸収されていない反面、前記腸内細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）は、血液、心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、脂肪組織、および筋肉に分布することを確認した。
【0058】
実施例２．尿から小胞の分離およびＤＮＡ抽出
尿から小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌチューブに尿を入れ、遠心分離（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて上澄み液だけを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使用して前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を収得した。
尿から小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌチューブに尿を入れ、遠心分離（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて上澄み液だけを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使用して前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を収得した。
【0059】
前記方法によって尿から分離した小胞１００μｌを１００℃で沸かして、内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷に５分間冷ました。次に、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液だけを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを利用してＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
【0060】
【表1】
【0061】
実施例３．尿内小胞から抽出したＤＮＡを利用したメタゲノム分析
前記実施例２の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用してＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を利用してＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐｓ以上であるものだけを利用し（Ｓｉｃｋｌｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）、結果分析のために、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを利用してシークエンス類似度によってクラスタリングを行った。具体的に、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シークエンス類似度を基準としてクラスタリングをし、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＤＮＡシークエンス データベース（１０８、４５３シークエンス）を利用して９７％以上のシークエンス類似度を有するバクテリアを分析した（ＱＩＩＭＥ）。
前記実施例２の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用してＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を利用してＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐｓ以上であるものだけを利用し（Ｓｉｃｋｌｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）、結果分析のために、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを利用してシークエンス類似度によってクラスタリングを行った。具体的に、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シークエンス類似度を基準としてクラスタリングをし、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＤＮＡシークエンス データベース（１０８、４５３シークエンス）を利用して９７％以上のシークエンス類似度を有するバクテリアを分析した（ＱＩＩＭＥ）。
【0062】
実施例４．正常ヒトと前立腺癌患者の尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤前立腺癌診断模型
前記実施例３の方法で、前立腺癌患者５３人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト１５９人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
前記実施例３の方法で、前立腺癌患者５３人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト１５９人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
【0063】
尿内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ門細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表２および図２参照）。
【0064】
【表2】
【0065】
尿内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｉａ、Ｓｐａｒｔｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ－６、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｅ綱細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表３および図３参照）。
【0066】
【表3】
【0067】
尿内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ｉｉｉ１－１５、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｌｌｉｎ３２９、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ目細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表４および図４参照）。
【0068】
【表4】
【0069】
尿内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓ２４－７、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、およびＫｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表５および図５参照）。
【0070】
【表5】
【0071】
尿内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、ＳＭＢ５３、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ、およびＦｌｅｘｉｓｐｉｒａ属細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表６および図６参照）。
【0072】
【表6】
【0073】
実施例５．前立腺肥大症患者と前立腺癌患者の尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤前立腺癌診断模型
前記実施例３の方法で、前立腺癌患者５３人と前立腺肥大症患者５５人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
前記実施例３の方法で、前立腺癌患者５３人と前立腺肥大症患者５５人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
【0074】
尿内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ門細菌をバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表７および図７参照）。
【0075】
【表7】
【0076】
尿内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、およびＰｅｄｏｓｐｈａｅｒａｅ綱細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表８および図８参照）。
【0077】
【表8】
【0078】
尿内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、およびＥｌｌｉｎ３２９目細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表９および図９参照）。
【0079】
【表9】
【0080】
尿内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１０および図１０参照）。
【0081】
【表10】
【0082】
尿内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、およびＦｌｅｘｉｓｐｉｒａ属細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１１および図１１参照）。
【0083】
【表11】
【0084】
実施例６．正常ヒトと前立腺肥大症の尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤前立腺肥大症診断模型
前記実施例３の方法で、前立腺癌患者５５人と正常ヒト１５９人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
前記実施例３の方法で、前立腺癌患者５５人と正常ヒト１５９人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
【0085】
尿内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺肥大症に対する診断的性能が有意に現れた（表１２および図１２参照）。
【0086】
【表12】
【0087】
尿内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ綱細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺肥大症に対する診断的性能が有意に現れた（表１３および図１３参照）。
【0088】
【表13】
【0089】
尿内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺肥大症に対する診断的性能が有意に現れた（表１４および図１４参照）。
【0090】
【表14】
【0091】
尿内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＫｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺肥大症に対する診断的性能が有意に現れた（表１５および図１５参照）。
【0092】
【表15】
【0093】
尿内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、ＳＭＢ５３、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ属細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、前立腺肥大症に対する診断的性能が有意に現れた（表１６および図１６参照）。
【0094】
【表16】
【0095】
上記に記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明による人体由来サンプルを利用した細菌由来細胞外小胞に存在する遺伝子に対してメタゲノム分析を通して前立腺癌および前立腺肥大症の発病危険度をあらかじめ予測することによって、前立腺疾患の危険群を早期に診断および予測して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、前立腺肥大症あるいは前立腺癌の発病後にも早期診断することができるので、前立腺疾患の発病率を低下させ、治療効果を高めることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】